INSTITUTO OSWALDO CRUZ - Livros Grátislivros01.livrosgratis.com.br/cp127314.pdf · INSTITUTO OSWALDO CRUZ Doutorado em Biologia Celular e Molecular DIAGNÓSTICO MOLECULAR DIFERENCIAL

INSTITUTO OSWALDO CRUZ

Doutorado em Biologia Celular e Molecular

DIAGNÓSTICO MOLECULAR DIFERENCIAL DAS PRINCIPAIS

DOENÇAS NEUROMUSCULARES DEGENERATIVAS EM CRIANÇAS DA

POPULAÇÃO DO RIO DE JANEIRO.

VIVIANNE GALANTE RAMOS

Rio de Janeiro

2009

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

ii


Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular


Diagnóstico Molecular Diferencial das Principais Doenças Neuromusculares Degenerativas

em Crianças da População do Rio de Janeiro.

Orientador (es): Prof. Dr. Pedro Hernán Cabello

Prof. Dra. Alexandra Prufer de Queiroz Campos Araújo

Rio de Janeiro 2009

Tese apresentada ao Instituto Oswaldo Cruz como

parte dos requisitos para a obtenção do Título de

Doutor em Biologia Celular e Molecular, na área de

Genética Molecular Humana.

iii

Ficha Catalográfica elaborada pela

Biblioteca de Manguinhos / CICT / FIOCRUZ – RJ

Ramos, Vivianne Galante


em Crianças da População do Rio de Janeiro / Vivianne Galante Ramos - Rio de Janeiro,

2009

Tese (doutorado) - Instituto Oswaldo Cruz, Biologia Celular e Molecular, 2009

Bibliografia: f.

1. Distrofia Muscular de Duchenne. 2. Atrofia Muscular Espinhal. 3. Diagnóstico

Molecular. 4. Reação em Cadeia da Polimerase. 5. SMN. 6. NAIP. 7. DMD. 8.

DMB. 9. Fluxograma. I. Título

CDD:

iv


Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular


DIAGNÓSTICO MOLECULAR DIFERENCIAL DAS PRINCIPAIS

DOENÇAS NEUROMUSCULARES DEGENERATIVAS EM CRIANÇAS

DA POPULAÇÃO DO RIO DE JANEIRO.

Orientador (es): Prof. Dr. Pedro Hernán Cabello

Prof. Dra. Alexandra Prufer de Queiroz Campos Araújo

Aprovada em:

EXAMINADORES:

Dra. Maria da Graça Pereira Dutra (IOC/FIOCRUZ) - Presidente

Profa. Dra. Silvia Regina Sampaio Freitas (INCOR/USP)

Profa. Dra. Georgina Severo Ribeiro (UFF)

Rio de Janeiro

2009

v



em Crianças da População do Rio de Janeiro.

Resumo

TESE DE DOUTORADO

Vivianne Galante Ramos

Dentre o grande número de doenças de origem genética conhecidas e que afetam os seres humanos, existem algumas que são degenerativas e que acometem tecidos importantes. Neste trabalho foram estudadas as doenças neuromusculares mais freqüentes na população mundial: Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) e Becker (DMB) e Atrofia Muscular Espinhal (AME). A Distrofia Muscular de Duchenne, que afeta aproximadamente 1 /3.500 homens, é a mais comum e a mais grave das distrofias hereditárias e sua herança é recessiva ligada ao cromossomo X. O gene da distrofina tem aproximadamente 2,3 milhões de pares de bases distribuídos em 79 éxons, tornando-se o maior gene conhecido em seres humanos. A Distrofia Muscular de Becker, que difere clinicamente da DMD pela evolução lenta, trata-se de uma afecção mais benigna, de início tardio. A clonagem destes genes mostrou que as duas doenças são de fato causadas por mutações diferentes no mesmo locus. Com uma prevalência de 1/10.000 nascimentos, as Atrofias Musculares Espinhais, são doenças hereditárias do segundo neurônio motor, que causam fraqueza muscular progressiva: a AME I (Werdnig-Hoffmann), a forma mais grave, a Intermediária ou tipo II e a Juvenil ou tipo III. Elas são diferentes com relação à idade de início, à gravidade e aos músculos afetados. Dois genes foram associados, o gene de sobrevivência do neurônio motor (SMN) e o da proteína inibitória de apoptose neuronal (NAIP). Este trabalho teve por objetivo principal o estudo do diagnóstico molecular diferencial dessas doenças tendo em vista a grande dificuldade em estabelecer o diagnóstico clínico correto, já que essas desordens apresentam um quadro clínico bastante semelhante entre si. A metodologia utilizada foi baseada em técnicas de Biologia Molecular, sobretudo o PCR-multiplex e Nested-PCR. Dos 48 pacientes com suspeita clínica de DMD e DMB, 13 não apresentaram confirmação molecular para essa doença e dos 36 pacientes com suspeita clínica de AME, 18 foram confirmados pelo diagnóstico molecular. Com isso foi formulado um algoritmo com o intuito de direcionar o diagnóstico molecular tornando-o mais eficiente e econômico, já que caracterização molecular de cada doença específica, no menor tempo possível, propicia a escolha do tratamento mais adequado, acarretando uma melhora na qualidade de vida do paciente.

vi


Molecular Differential Diagnosis of Main Neuromuscular Degenerative Disease in Children

Population of Rio de Janeiro. Abstract

TESE DE DOUTORADO

Vivianne Galante Ramos

Among the large amount of known genetic diseases that affect human beings, there are some that are degenerative and affect important tissues. Here, we studied the most frequent neuromuscular diseases in the world population: Duchenne Muscular Dystrophy (DMD), Becker Muscular Dystrophy (DMB), and Spinal Muscular Atrophy (AME). Duchenne Muscular Dystrophy is the most common and serious of the heritage dystrophies, affecting 1/3.500 men. Its heritage is recessive and linked to the X chromosome. The DMD gene has approximately 2.3 million base pairs distributed in 79 exons, being the largest known human gene. The Becker Muscular Dystrophy differs from DMD because of its slow progression and is a more benign disease, with a later onset. Cloning of this gene showed that there are different mutations at the same locus. With a 1/10.000 birth prevalence, the Spinal Muscular Atrophies, are hereditary diseases from the second motor neuron that cause progressive muscular weakness: AMEI (Werdnig-Hoffmann) is the most severe; the intermediary or type II, and juvenile or type III. The different types have different onset age, severity and affected muscles. Two genes have been associated with it: the motor neuron survival gene (SMN), and neuron apoptosis inhibitory protein (NAIP). This work's main aim was to study the molecular diagnosis of these diseases, since the correct clinic diagnosis is very hard to achieve since the diseases have very similar clinic characteristics. The methodology used is based on Molecular Biology techniques, mainly multiplex-PCR and nested-PCR. Out of 48 patients clinically diagnosed as DMD/ DMB, 13 didn't have their diagnosis molecularly confirmed. Out of the 36 patients clinically diagnosed as AME, 18 had their diagnostic molecularly confirmed. Based on these findings, we were able to propose an algorithm in order to direct the molecular diagnostic in becoming more efficient and economic. Molecular characterizing of the disease in a short period of time leads to the choice of the best treatment and a better life quality for the patient.

vii

Dedico essa tese a minha pequena Giovanna

AGRADECIMENTOS

viii

AGRADECIMENTOS

Agradeço a todos que contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste

trabalho.

Aos meus orientadores que me ensinaram a arte da pesquisa científica. Ao Pedro pelo

constante apoio, amizade, paciência e ajuda na difícil tarefa de orientar. A Alexandra, pela

valiosa colaboração como neuropediatra, na triagem dos pacientes e contribuição nos

trabalhos.

À Dra. Andrea Henriques Pons, pela gentileza de revisar a tese e pelos comentários

pertinentes, que contribuíram para melhora do trabalho.

Aos colegas de trabalho do Laboratório de Genética Humana, pelo companheirismo,

convivência agradável e apoio durante todos esses anos.

À Flávia pela incansável ajuda na execução das análises laboratoriais e por sua amizade.

Á Silvia e Simone, pelas revisões, pelo estímulo e carinho.

Aos amigos Adriana, Christiane Giselle e Hélio, que apesar da distância sempre torceram por

mim.

Ao pessoal da coordenação de Pós-Graduação pelo apoio acadêmico.

Aos meus pais, meu marido e minha filha que me deram o colo nos momentos de crise,

estímulo nos momentos de dúvida, amor a vida toda. Vocês são a razão da minha luta, da

minha vontade de ser sempre melhor e fazer sempre mais por mim, por nós e pelos demais.

Àquele que nos momentos de fraqueza sussurrou em meu ouvido “estou segurando firme a

sua mão”. Obrigada Deus.

Agradeço pelo suporte financeiro: FAPERJ, CNPq, PAPES/Fiocruz, POM do Laboratório.

LISTA DE ABREVIATURAS

ix


A ADP Difosfato de adenosina

AME Atrofia muscular espinhal

AME I Atrofia muscular espinhal do tipo I

AME II Atrofia muscular espinhal do tipo II

AME III Atrofia muscular espinhal do tipo III

ATP Trifosfato de adenosina

AV Ácido valpróico

AVE Acidente vascular encefálico

C ºC Graus Celsius

CK Creatino quinase

cM Centimorgan

Ca++ Íon de cálcio

cDNA Ácido desoxirribonucléico complementar

CEP Comitê de ética e pesquisa

CONEP Comissão nacional de ética em pesquisa

χ2 Qui-quadrado

D dATP Desoxiadenosina trifosfato

dCTP Desoxicitidina trifosfato

dGTP Desoxiguanosina trifosfato

dTTP Desoxitimidina trifosfato

dNTP Desoxirribonucleotídeos-trifosfato

DAG Complexo multimérico composto distroglicano

DAPs Complexo de glicoproteínas

DEL Deleção

DMB Distrofia muscular de Becker

DMC Distrofia muscular de cinturas

DMD Distrofia muscular de Duchenne

DMP Distrofia muscular progressiva

DMS Distrofia miotônica de Steinert

DNA Ácido desoxirribonucléico

DNMD Doença neuromuscular degenerativa

E EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético

ENMG Eletroneuromiografia

G G Grama (unidade de medida)


x

Gl Graus de liberdade

H H-W Hardy-Weinberg

I IAP Proteína inibitória de apoptose

IPPMG Instituto de Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira

K Kb Quilobase

KCl Cloreto de potássio

KDa Quilodalton

KHCO3 Monocarbonato de potássio

M M Molar

MC Miopatia congênita

Mg Miligramas

MgCl2 Cloreto de magnésio

mRNA RNA mensageiro

µl Microlitro

µg Micrograma

Ml Mililitro

mM Milimolar

N Na+ Íon de sódio

NaCl Cloreto de sódio

Nh4Cl Cloreto de amônia

NAIP Gene da proteína inibitória de apoptose neuronal

NAIP Proteína inibitória de apoptose neuronal

Ng Nanograma

P P Probabilidade

PA Produto amplificado

PB Par de bases

PCR Reação em cadeia da polimerase

pH Potencial hidrogeniônico

Q QI Quociente de inteligência

R RFLP Polimorfismo de tamanho de fragmento de restrição

RJ Rio de Janeiro

RM Retardo mental

RNA Ácido ribonucléico

RPM Rotações por minuto

S SDS Dodecil sulfato de sódio

SMN Proteína de sobrevivência do neurônio motor

SMN Gene de sobrevivência do neurônio motor


xi

SMN1 ou SMNt Gene de sobrevivência do neurônio motor telomérico

SMN2 ou SMNC Gene de sobrevivência do neurônio motor centromérico

SNC Sistema nervoso central

SNP Sistema nervoso periférico

SPSS Statistical product and service solutions

T TBE Tampão tris-ácidobórico-edta

TCE Traumatismo cranioencefálico

TCLE Termo de Consentimento Livre Esclarecido

TE Tampão tris-edta

U U Unidade

UFRJ Universidade Federal do Rio de Janeiro

V V Volts

Y YACs Yeast Artificial Chromosomes

Z Zn2++ Zinco

LISTA DE FIGURAS

xii

LISTA DE FIGURAS Figura 1

Distribuição das doenças na população brasileira no período de 1930 a

2003. 01

Figura 2 Desenho esquemático da medula espinhal, onde estão representados os

neurônios motores, o corno anterior, o nervo espinhal, a raiz anterior e a

fibra muscular.

04

Figura 3 Microscopia eletrônica de um neurônio motor. 08

Figura 4 Desenho esquemático de um neurônio motor. 09

Figura 5 Desenho esquemático da contração muscular. 10

Figura 6 Recém-nascido com AME I (Werdnig-Hoffmann) mantido sob

ventilação mecânica. 16

Figura 7 Paciente hipotônica apresentando dificuldade de ficar em pé. 18

Figura 8 Irmãos com atrofia muscular espinhal do tipo III. 19

Figura 9 Representação esquemática dos genes SMN1 e SMN2. 22

Figura 10 Representação da estrutura cristalografada do complexo smn humano. 25

Figura 11 Baculoviral inibitória de apotose (IAP). 26

Figura 12 Mapa físico do cromossomo 5. 27

Figura 13 Manobra de gowers realizada por uma criança com dmd. 43

Figura 14 Complexo glicoprotéico. 46

Figura 15 Gel de poliacrilamida 12%, éxon 7 do gene SMN. 61

Figura 16 Gel de poliacrilamida 12%, éxon 8 do gene SMN. 62

Figura 17 Gel de agarose 2% do pcr-multiplex para os éxons 5 e 6 do gene NAIP. 64

Figura 18 Esquema de amplificação para os éxons analisados em pacientes com

DMD ou DMB. 66

Figura 19 Gel de agarose 2,5% do PCR-multiplex (éxons 4, 8, 12, 17, 19, 44, 45,

48 e 51). 67

LISTA DE TABELAS E GRÁFICOS

xiii

LISTA DE TABELAS E GRÁFICOS Tabela 01

Marcos na história da atrofia muscular espinhal. 13

Tabela 02 Critérios clínicos para diagnóstico da ame. 29

Tabela 03 Valores normais de creatino-quinase de acordo com a idade e o sexo do

indivíduo. 30

Tabela 04 AMEs x doenças com características clínicas similares. 35

Tabela 05 Principais doenças neuromusculares. 35

Tabela 06 Marcos na história da distrofia muscular. 41

Tabela 07 Resumo dos oligonucleotídeos utilizados para análise do gene SMN (1ª fase). 60

Tabela 08 Resumo dos oligonucleotídeos utilizados para análise do gene SMN (2ª fase). 60

Tabela 09 Resumo dos oligonucleotídeos (primers) utilizados para análise do gene NAIP. 63

Tabela 10 Resumo dos oligonucleotídeos (primers) utilizados para análise do gene DMD. 65

Tabela 11 Sexo, suspeita clínica e idade dos primeiros sintomas em todos os pacientes. 68

Tabela 12 Suspeita clínica e sexo nos pacientes com suspeita clínica de DMD/B e AME. 69

Tabela 13 Idade dos primeiros sintomas em pacientes com suspeita clínica de DMD/B e

AME. 69

Tabela 14 Histórico de pseudo-hipertrofia nos pacientes analisados. 70

Tabela 15 Histórico de pseudo-hipertrofia em pacientes com suspeita clínica de DMD/B e

AME. 70

Tabela 16 Suspeita clínica e movimentos intra-uterinos. 71

Tabela 17 Suspeita clínica e o marco motor: sustentar a cabeça. 71

Tabela 18 Marco motor: sustentar a cabeça em pacientes com suspeita clínica de DMD/B

e AME. 72

Tabela 19 Suspeita Clínica e o Marco Motor: Sentar. 72

Tabela 20 Marco motor: sentar em pacientes com suspeita clínica de DMD/B e AME. 72

Tabela 21 Suspeita clínica e o marco motor: ficar em pé. 73

Tabela 22 Marco motor: ficar em pé em pacientes com suspeita clínica de DMD/B e

AME. 73

Tabela 23 Suspeita clínica e o marco motor: andar. 74

Tabela 24 Marco motor: andar em pacientes com suspeita clínica de DMD/B e AME. 74

Tabela 25 Suspeita clínica e história familiar. 75

Tabela 26 Suspeita clínica e consangüinidade. 75

Tabela 27 Suspeita clínica e atrofia. 76

Tabela 28 Histórico de atrofia em pacientes com suspeita clínica de DMD/B e AME. 76

Tabela 29 Suspeita clínica e tônus muscular. 77

LISTA DE TABELAS E GRÁFICOS

xiv

Tabela 30 Observação de tônus muscular em pacientes com suspeita clínica de DMD/B e

AME. 77

Tabela 31 Suspeita clínica e reflexos. 78

Tabela 32 Observação dos reflexos em pacientes com suspeita clínica de DMD/B e AME. 78

Tabela 33 Suspeita clínica e fasciculações. 79

Tabela 34 Observação de fasciculações em pacientes com suspeita clínica de DMD/B e

AME. 79

Tabela 35 Observação de miotonia em todos os pacientes analisados. 80

Tabela 36 Observação de alterações de nervos cranianos em todos os pacientes

analisados. 81

Tabela 37 Eletroneuromiografia nos pacientes analisados. 81

Tabela 38 Eletroneuromiografia em pacientes com suspeita clínica de DMD/B e AME. 81

Tabela 39 Pacientes com AME confirmados pelo diagnóstico molecular, distribuídos por

sexo. 82

Tabela 40 Pacientes com DMD/B confirmados pelo diagnóstico molecular, distribuídos

por sexo. 82

Gráfico 1 Distribuição DMD/B x número de deleções. 83

Gráfico 2 Distribuição de DMD/B x exon deletado. 84

Gráfico 3 Combinação dos éxons deletados em pacientes com AME. 85

Gráfico 4 Frequência das Combinações dos éxons deletados em pacientes com AME. 86

SUMÁRIO

xv

SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO......................................................................................................................... 01

1.1. Aspectos Gerais do Sistema Nervoso..................................................................... 04

1.2. Aspectos Gerais do Tecido Muscular..................................................................... 09

1.3. Atrofia Muscular Espinhal Proximal (AME)......................................................... 12

1.3.1. Caracterização Clínica da Atrofia Muscular Espinhal tipo I........................ 14

1.3.2. Caracterização Clínica da Atrofia Muscular Espinhal tipo II....................... 17

1.3.3. Caracterização Clínica da Atrofia Muscular Espinhal tipo III...................... 18

1.3.4. Caracterização Genético-Molecular da Atrofia Muscular Espinhal.............. 21

1.3.5. Herança da AME Proximal........................................................................... 27

1.3.6. Critérios Diagnósticos para AMEs................................................................ 29

1.3.6.1. Critérios Clínicos................................................................................... 29

1.3.6.2. Critérios Laboratoriais........................................................................... 29

1.3.7. Epidemiologia da AME................................................................................ 32

1.3.8. Estudos da AME no Brasil............................................................................ 32

1.4. Diagnóstico Diferencial......................................................................................... 34

1.5. Ações Terapêuticas................................................................................................ 36

1.6. Estudos Moleculares.............................................................................................. 37

1.7. Distrofia Muscular de Duchenne........................................................................... 39

1.7.1. Diagnóstico Clínico da DMD....................................................................... 43

1.7.2. Caracterização Genético Molecular da Distrofia Muscular de Duchenne.... 44

1.7.3. Aspectos Físicos- Clínicos na Distrofia Muscular de Duchenne.................. 47

1.7.4. Aspectos Clínico-Laboratoriais..................................................................... 48

1.7.5. Retardo Mental na DMD............................................................................... 49

1.7.6. Ações Terapêuticas........................................................................................ 51

1.8. Distrofia Muscular de Becker (DMB).................................................................... 51

1.9. Relevância do Presente Estudo............................................................................... 52

2. OBJETIVOS............................................................................................................................. 54

2.1. Objetivo Geral......................................................................................................... 54

2.2. Objetivos Específicos.............................................................................................. 54

3. MATERIAL & MÉTODOS....................................................................................................... 55

3.1. Avaliação do Projeto Pelo Comitê de Ética Em Pesquisa...................................... 55

3.2. Amostra de Estudo................................................................................................. 56

3.2.1. Critérios De Inclusão / Exclusão................................................................... 56

3.3. Avaliação Clínica................................................................................................... 56

3.4. Análise Laboratorial.............................................................................................. 57

SUMÁRIO

xvi

3.4.1. Extração de DNA Genômico........................................................................ 57

3.4.2. Estimativa da Concentração de DNA........................................................... 58

3.4.3. Determinação Molecular.............................................................................. 59

3.4.3.1. Investigação Molecular do Gene SMN................................................. 59

3.4.3.2. Investigação Molecular do Gene NAIP................................................ 62

3.4.3.3. Investigação Molecular do Gene da Distrofina.................................... 65

4. RESULTADOS........................................................................................................................ 68

4.1. Sexo e Idade dos Primeiros Sintomas.................................................................... 68

4.2. Pseudo-Hipertrofia e Movimentos Intrauterinos.................................................... 70

4.3. Marcos Motores...................................................................................................... 71

4.4. Histórico Familiar e Consangüinidade.................................................................. 74

4.5. Ausência de Tonus muscular e de Reflexos........................................................... 76

4.6. Fasciculações.......................................................................................................... 79

4.7. Miotonia.................................................................................................................. 80

4.8. Alterações nos Nervos Cranianos........................................................................... 80

4.9. A Eletroneuromiografia.......................................................................................... 81

4.10. Testes Moleculares............................................................................................... 82

4.11. Diagnóstico Diferencial entre as Distrofias e Atrofias......................................... 87

4.11.1. Algoritmo DisAME...................................................................................... 87

5. DISCUSSÃO............................................................................................................................. 90

6. CONCLUSÕES....................................................................................................................... 100

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................................................ 101

8. ANEXOS................................................................................................................................ 121

8.1. Anexo 1................................................................................................................ 121

8.2. Anexo 2................................................................................................................ 122

8.3. Anexo 3................................................................................................................ 123

8.4. Anexo 4................................................................................................................. 124

8.5. Anexo 5................................................................................................................. 126

8.6. Anexo 6................................................................................................................. 127

8.7. Anexo 7................................................................................................................. 128

9. APÊNDICE............................................................................................................................... 131

INTRODUÇÃO

1

11.. IINNTTRROODDUUÇÇÃÃOO

No atual estágio de desenvolvimento científico, dispomos de um grande arsenal de

recursos que nos capacitam a identificar e entender os aspectos relevantes da dinâmica das

condições da saúde nas populações humanas. Na primeira metade do século passado mais de

40% dos brasileiros adoeciam e morriam de doenças infecciosas e parasitárias, como

sarampo, poliomielite e malária (http://www.agencia.fapesp.br/materia/8529/noticias/panorama-

das-doencas.htm). Essa tendência epidemiológica se inverteu com o passar dos anos,

acompanhado de uma melhora na qualidade de vida e a partir da década de 70 a maior parte

da população começou a padecer de doenças crônicas não transmissíveis, como pode ser

observado na figura 1.

Figura 1. Distribuição das Doenças na População Brasileira no período de 1930 a 2003. (http://portal.saude.gov.br/SAUDE/visualizar_texto.cfm?idtxt=24421 - 11/08/2009

INTRODUÇÃO

2

As doenças parasitárias e infecciosas apresentam nítidas tendências decrescentes, por

outro lado houve um aumento significativo da participação das doenças crônico degenerativas

na composição da mortalidade (Carmo et al., 2003). Surgindo assim a necessidade de estudos

sobre doenças condicionadas por fatores genéticos, dentre as quais as neuromusculares e as

neurodegenerativas, que se apresentam como desordens de relevante importância tanto pela

sua complexidade como pela sua expressiva frequência na população mundial.

Nos últimos anos as maiores surpresas da revolução molecular surgiram de

investigações de doenças neuromusculares. Primeiro veio a descoberta do gene da distrofina

na Distrofia Muscular de Duchenne (Prior et al., 1989), posteriormente as expansões

trinucleotídicas da Síndrome de Kennedy, X-Frágil e Distrofia Miotônica, entre outras

(Caskey et al., 1992). As Atrofias Musculares Espinhais (AMEs), ainda o maior enigma das

desordens neuromusculares genéticas, podem em breve contribuir para esta lista de surpresas.

As doenças neuromusculares caracterizam-se por situações decorrentes de problemas

localizados na parte anterior da medula, nos nervos periféricos, nas placas mioneurais ou nos

músculos (Fallon et al., 1999).

O Diagnóstico Molecular é um emergente campo na área de análises clínicas

laboratoriais. Basicamente, utiliza técnicas de Biologia Molecular para o estudo do

DNA/RNA de agentes infecciosos ou de alterações genéticas do próprio organismo,

auxiliando no diagnóstico e prognóstico de doenças infecciosas, genéticas e câncer.

O desenvolvimento do Diagnóstico Molecular possibilitou uma grande evolução nas análises

de rotina de laboratórios clínicos e industriais. Organismos de cultivo difícil ou impossível

tornaram-se passíveis de serem analisados. Exames citogenéticos convencionais estão sendo

substituídos pela ferramenta molecular. Determinação de predisposição para certos tipos de

câncer e doenças cardiovasculares têm se tornado realidade. Em poucos anos, o diagnóstico

molecular evoluiu de uma mera curiosidade tecnológica para um campo vasto e complexo,

com o potencial para revolucionar a ciência e a prática da medicina e áreas correlatas.

INTRODUÇÃO

3

Atualmente considera-se irreversível a tendência mundial desta área obter um lugar de

destaque nos laboratórios de análises clínicas e patológicas humanas ou de sanidade animal.

Dentre o grande número de doenças humanas com traço genético, destacamos os

distúrbios degenerativos devido a sua complexidade clínica, o que aumenta a relevância da

investigação molecular para o seu diagnóstico. Até o momento são descritas cerca de 40

doenças neuromusculares, classificadas em grupos, conforme o tecido afetado e a coexistência

ou não de neuropatias ou apenas miopatias. Dentre estas, podemos encontrar as distrofias

musculares, as miopatias inflamatórias, as metabólicas, as resultantes de anormalidades

endócrinas e outras (Reed, 2002).

As atrofias em geral são caracterizadas pela redução do volume do tecido muscular

que podem ser decorrentes de diversas causas; algumas reversíveis e não necessariamente

progressivas. Podem ser ocasionadas por comprometimentos em vários locais do sistema

nervoso e da unidade motora (conjunto constituído do segundo neurônio-nervo periférico

motor-músculo). Já a distrofia é uma atrofia progressiva em um determinado tecido, causada

por destruição deste mesmo tecido, sendo, portanto necessariamente progressiva, em níveis

variáveis de evolução.

O grupo de doenças denominado de Atrofias Musculares Espinhais (AME) tem

origem genética e se caracteriza pela atrofia muscular secundária à degeneração de neurônios

motores localizados no corno anterior da medula espinhal (figura 2).

As atrofias musculares espinhais e as distrofias musculares são exemplos de doenças

neuromusculares de origem genética. Não é raro ocorrer confusão entre esses dois

diagnósticos, uma vez que apesar de existir aspectos típicos que as diferenciam, nem sempre

essas características típicas são encontradas, pois estas dependem do estágio da doença que

cada indivíduo se encontra ao ser avaliado.

INTRODUÇÃO

4

Figura 2. Desenho Esquemático da Medula Espinhal, onde estão representados os neurônios motores, o corno

anterior, o nervo espinhal, a raiz anterior e a fibra muscular.

(Fonte: www.sarah.br - 11/08/2009)

1.1. ASPECTOS GERAIS DO SISTEMA NERVOSO

O Sistema Nervoso é dividido em Sistema Nervoso Central (SNC), composto pelo

encéfalo e pela medula espinhal, localizados na cavidade craniana e no canal vertebral,

respectivamente, e o Sistema Nervoso Periférico (SNP), constituído por nervos, gânglios e

receptores.

Os neurônios são as células responsáveis pela recepção e transmissão dos estímulos do

meio, possibilitando ao organismo a execução de respostas adequadas para a manutenção da

homeostase. Os neurônios classificam-se em três categorias principais: (1) sensoriais, que

transportam os impulsos dos receptores ao SNC; (2) motores, que transportam impulsos do

SNC às células efetoras (figuras 3 e 4); e centrais (3) que constituem uma grande rede

INTRODUÇÃO

5

intermediária situada entre os neurônios sensoriais e os motores, chamados também de

interneurônios. Para exercerem suas funções, contam com duas propriedades fundamentais: a

irritabilidade (também denominada excitabilidade ou responsividade) e a condutibilidade.

Irritabilidade é a capacidade que permite a uma célula responder a estímulos, sejam eles

internos ou externos. Portanto, irritabilidade não é uma resposta, mas a propriedade que torna

a célula apta a responder. Essa propriedade é inerente aos vários tipos celulares do organismo.

No entanto, as respostas emitidas pelos tipos celulares distintos também diferem umas das

outras. A resposta emitida pelos neurônios assemelha-se a uma corrente elétrica transmitida

ao longo de um fio condutor: uma vez excitados pelos estímulos, os neurônios transmitem

essa onda de excitação - chamada de impulso nervoso - por toda a sua extensão em grande

velocidade e em um curto espaço de tempo. Esse fenômeno deve-se à propriedade de

condutibilidade.

O neurônio é composto de um corpo celular (onde está o núcleo, o citoplasma e o

citoesqueleto), e de finos prolongamentos celulares denominados neuritos, que podem ser

subdivididos em dendritos e axônios.

Os dendritos são prolongamentos geralmente muito ramificados e que atuam como

receptores de estímulos. Os axônios são prolongamentos longos que atuam como condutores

dos impulsos nervosos. Todos os axônios têm um início (cone de implantação), um meio (o

axônio propriamente dito) e um fim (terminal axonal ou botão terminal). O terminal axonal é

o local onde o axônio entra em contato com outros neurônios e/ou outras células e passa a

informação (impulso nervoso) para eles. A região de passagem do impulso nervoso de um

neurônio para a célula adjacente chama-se sinapse. O axônio está envolvido por um dos tipos

celulares seguintes: célula de Schwann (encontrada apenas no SNP) ou oligodendrócito

(encontrado apenas no SNC). Em muitos axônios, esses tipos celulares determinam a

formação da bainha de mielina - invólucro principalmente lipídico, que atua como isolante

térmico e facilita a transmissão do impulso nervoso. Em axônios mielinizados existem regiões

http://www.afh.bio.br/nervoso/nervoso2.asp#oligoden

INTRODUÇÃO

6

de descontinuidade da bainha de mielina, que acarretam a existência de uma constrição

(estrangulamento) denominada nódulo de Ranvier. No caso dos axônios mielinizados

envolvidos pelas células de Schwann, a parte celular da bainha de mielina, onde estão o

citoplasma e o núcleo desta célula, constitui o chamado neurilema.

A membrana plasmática do neurônio transporta alguns íons ativamente, do líquido

extracelular para o interior da fibra, e outros, do interior, de volta ao líquido extracelular.

Assim funciona a bomba de sódio e potássio, que bombeia ativamente o sódio para fora,

enquanto o potássio é bombeado ativamente para dentro. Porém esse bombeamento não é

eqüitativo: para cada três íons sódio bombeados para o líquido extracelular, apenas dois íons

potássio são bombeados para o líquido intracelular. Somando-se a esse fato, em repouso a

membrana da célula nervosa é praticamente impermeável ao sódio, impedindo que esse íon se

mova a favor de seu gradiente de concentração (de fora para dentro); porém, é muito

permeável ao potássio, que, favorecido pelo gradiente de concentração e pela permeabilidade

da membrana, se difunde livremente para o meio extracelular.

Como a saída de sódio não é acompanhada pela entrada de potássio na mesma

proporção, estabelece-se uma diferença de cargas elétricas entre os meios intra e extracelular:

há déficit de cargas positivas dentro da célula e as faces da membrana mantêm-se

eletricamente carregadas. O potencial eletronegativo criado no interior da fibra nervosa

devido à bomba de sódio e potássio é chamado potencial de repouso da membrana, ficando o

exterior da membrana positivo e o interior negativo. Dizemos, então, que a membrana está

polarizada.

Ao ser estimulada, uma pequena região da membrana torna-se permeável ao sódio

(abertura dos canais de sódio). Como a concentração desse íon é maior fora do que dentro da

célula, o sódio atravessa a membrana no sentido do interior da célula. A entrada de sódio é

acompanhada pela pequena saída de potássio. Esta inversão vai sendo transmitida ao longo do

axônio, e todo esse processo é denominado onda de despolarização. Os impulsos nervosos ou

INTRODUÇÃO

7

potenciais de ação são causados pela despolarização da membrana além de um limiar (nível

crítico de despolarização que deve ser alcançado para disparar o potencial de ação). Os

potenciais de ação assemelham-se em tamanho e duração e não diminuem à medida que são

conduzidos ao longo do axônio, ou seja, são de tamanho e duração fixos. A aplicação de uma

despolarização crescente a um neurônio não tem qualquer efeito até que se cruze o limiar e,

então, surja o potencial de ação.

Imediatamente após a onda de despolarização ter-se propagado ao longo da fibra

nervosa, o interior da fibra torna-se carregado positivamente, porque um grande número de

íons sódio se difundiu para o interior. Essa positividade determina a parada do fluxo de íons

sódio para o interior da fibra, fazendo com que a membrana se torne novamente impermeável

a esses íons. Por outro lado, a membrana torna-se ainda mais permeável ao potássio, que

migra para o meio interno. Devido à alta concentração desse íon no interior, muitos íons se

difundem, então, para o lado de fora. Isso cria novamente eletronegatividade no interior da

membrana e positividade no exterior, este processo é chamado de repolarização, pelo qual se

reestabelece a polaridade normal da membrana. A repolarização normalmente se inicia no

mesmo ponto onde se originou a despolarização, propagando-se ao longo da fibra. Após a

repolarização, a bomba de sódio bombeia novamente os íons sódio para o exterior da

membrana, criando um déficit extra de cargas positivas no interior da membrana, que se torna

temporariamente mais negativo do que o normal. A eletronegatividade excessiva no interior

atrai íons potássio de volta para o interior (por difusão e por transporte ativo). Assim, o

processo traz as diferenças iônicas de volta aos seus níveis originais.

Para transferir informação de um ponto para outro no sistema nervoso, é necessário

que o potencial de ação, uma vez gerado, seja conduzido ao longo do axônio. Um potencial de

ação iniciado em uma extremidade de um axônio apenas se propaga em uma direção, não

retornando pelo caminho já percorrido. Conseqüentemente, os potenciais de ação são

unidirecionais - ao que chamamos condução ortodrômica. Uma vez que a membrana axonal é

INTRODUÇÃO

8

excitável ao longo de toda sua extensão, o potencial de ação se propagará sem decaimento. A

velocidade com a qual o potencial de ação se propaga ao longo do axônio depende de quão

longe a despolarização é projetada à frente do potencial de ação, o que, por sua vez, depende

de certas características físicas do axônio: a velocidade de condução do potencial de ação

aumenta com o diâmetro axonal. Axônios com menor diâmetro necessitam de uma maior

despolarização para alcançar o limiar do potencial de ação. Nesses de axônios, presença de

bainha de mielina acelera a velocidade da condução do impulso nervoso. Nas regiões dos

nódulos de Ranvier, a onda de despolarização vai diretamente de um nódulo para outro, não

acontecendo em toda a extensão da região mielinizada (a mielina é isolante). O percurso do

impulso nervoso no neurônio é sempre no sentido dendrito, corpo celular e axônio.

Figura 3. Microscopia eletrônica de um Neurônio Motor. D: dendrito (do inglês:

dendrite), S: Soma, P: extensão da célula (do inglês: podite) e a seta indica o axônio.

(Fonte: www.faculty.fortlewis.edu 10/06/2009)

http://www.faculty.fortlewis.edu/

INTRODUÇÃO

9

Figura 4. Desenho Esquemático de um Neurônio Motor.

(Fonte: Junqueira LC, Carneiro J, 1980).

Figura 4. Desenho Esquemático de um Neurônio Motor.

(Fonte: Junqueira LC, Carneiro J, 1980).

As células nervosas do SNP ligam a periferia do corpo ao encéfalo e à medula

espinhal. Todos os neurônios motores que vão para os músculos esqueléticos originam-se no

sistema nervoso central (Ross & Romrell, 1993).

1.2. ASPECTOS GERAIS DO TECIDO MUSCULAR

O tecido muscular constitui os músculos, e está relacionado ao mecanismo de

locomoção e ao processo de movimentação de substâncias internas do corpo, decorrente à

INTRODUÇÃO

10

capacidade contrátil das fibras musculares em resposta a estímulos nervosos, utilizando

energia fornecida pela degradação da molécula de ATP (figura 5). As células desse tecido são

caracterizadas pelo seu formato alongado e têm como função a contração e distensão dos

numerosos filamentos protéicos de actina (miofilamentos finos) e miosina (miofilamentos

grossos). O grau de contração muscular depende de dois fatores: o primeiro relacionado à

intensidade do estímulo e o segundo à quantidade de fibras estimuladas. Dessa forma,

somente ocorrerá contração quando o estímulo nervoso tiver intensidade suficiente para

excitar um número significativo de fibras, uma ação de contração mediada por substâncias

neurotransmissoras, emitidas nas sinapses neuromusculares (contato neurônio-músculo),

sinalizando o deslizamento dos miofilamentos finos sobre os grossos.

Figura 5. Desenho Esquemático da Contração Muscular.

(Fonte: http://www.cabuloso.com/Anatomia-Humana/Sistema-de-Sustentacao/foto/musculo5.gif) (10/06/2009)

Há três tipos de tecidos musculares: tecido muscular liso, tecido muscular estriado

esquelético e tecido estriado cardíaco, cada um com suas particularidades. A musculatura lisa

(necessariamente com contração involuntária) é formada por células mononucleadas com

http://www.cabuloso.com/Anatomia-Humana/Sistema-de-Sustentacao/foto/musculo5.gif

INTRODUÇÃO

11

estrias longitudinais e está presente nos órgãos viscerais internos (esôfago, intestino, vasos

sangüíneos e útero), e é responsável pelo peristaltismo.

A musculatura estriada esquelética responsável é pela contração voluntária e é

composta por células multinucleadas com estrias longitudinais e transversais; formam os

músculos, órgãos ligados à estrutura óssea, permitindo a movimentação do corpo.

A musculatura estriada cardíaca, envolvida na contração involuntária é formada pelas

constitui as células miocárdicas (musculatura do coração), unidas por discos intercalares. Esta

configuração anatômica permite o aumento da adesão entre as células, fator importante para

manutenção da circulação sangüínea, sobretudo a contração coordenada para o batimento

cardíaco. Um aspecto interessante com relação às fibras musculares estriadas é o estado

parcial de contração passiva, da ordem de milionésimos de segundos alternado entre as fibras

musculares (Ross & Romrell, 1993).

A intereção entre as moléculas de miosina e actina está associada à molécula de ATP.

A miosina, como tem um sítio para unir-se ao ATP, comporta-se como uma ATPase e a actina

como um ativador. Desta forma a energia da hidrólise do ATP é convertida em traballho

mecânico para a contração muscular (Hitomi et al., 2005). Os músculos esqueléticos de

mamíferos co-expressam diferentes tipos de miosina e somente um tipo de actina, sugerindo

que a diversidade entre os tipos de fibras musculares seja pelo menos em parte resultado da

diferença dos tipos de miosina.

A molécula de miosina é formada por duas cadeias pesadas e dois pares regulatórios

de cadeia leve. A cadeia pesada de miosina (MHC) é uma das principais proteínas

sarcoméricas e tem sido utilizada como um marcador de diferenciação de células musculares,

que junto com outras proteínas estruturais formam as primeiras estruturas do sarcômero

(Muller et al., 2001). No músculo esquelético dos mamíferos são encontradas sete isoformas

de MHC, quatro dessas no músculo esquelético adulto e uma adicional predominando no

músculo cardíaco (Weiss et al., 1996).

INTRODUÇÃO

12

Os diferentes tipos de fibras musculares funcionam basicamente de modo semelhante.

Contudo, os músculos não contêm fibras com as mesmas capacidades metabólicas e

funcionais (Takemassa et al., 2004). As fibras musculares esqueléticas são classificadas em

dois grupos: tipo I ou fibras de contração lenta e tipo II ou fibras de contração rápida que se

distinguem por propriedades fisiológicas e bioquímicas. Logo a composição da fibra muscular

determina a velocidade de contração e a fadiga de um músculo esquelético em particular

(Hitomi et al., 2005). Os músculos são constituídos por uma mistura de aproximadamente

50% de fibras de contração lenta e 50% de fibras de contração rápida. No entanto existem

múculos específicos que são considerados como predominantemente do tipo I ou II.

1.3. ATROFIA MUSCULAR ESPINHAL PROXIMAL (AME)

A atrofia muscular espinhal proximal ou simplesmente AME é uma doença

autossômica recessiva, secundária à degeneração dos motoneurônios do corno anterior da

medula espinhal e dos núcleos motores de alguns nervos cranianos, levando-os à apoptose;

manifesta-se clinicamente por hipotonia e fraqueza muscular progressiva (Deymeer et al.,

1997; Wang et al., 2002; Tiziano et al., 2009).

As AMEs representam a segunda maior desordem autossômica recessiva fatal, depois

da Fibrose Cística (1:6000), afetando aproximadamente 1 em 10.000 nascimentos, com uma

freqüência de doentes de 1 em 40 portadores (DiDonato et al., 1994). Casais que tiveram uma

criança afetada têm 25% de risco de recorrência em cada gravidez subsequente (Fallon et al.,

1999). Embora a maior parte dos casos seja de herança autossômica recessiva e decorra de

mutações do gene SMN (gene de sobrevivência do neurônio motor), a classificação oficial das

doenças neuromusculares de acordo com a World Federation of Neurolog cataloga subtipos

com diferentes tipos de herança, isolados ou associados a outras afecções sistêmicas (Reed,

2005).

INTRODUÇÃO

13

Do ponto de vista histórico, houve um grande avanço no conhecimento genético da

AME (Pearn, 1990), como pode ser observado na tabela abaixo.

Tabela 1. Marcos na História da Atrofia Muscular Espinhal.

1860 Foi demonstrado que a doença do neurônio motor era devido à degeneração das células do corno

anterior da medula espinhal (Luys, 1860)

1883 Relatado o primeiro caso de AME, entretanto esse autor não é reconhecido como o primeiro a

descrever a doença. (Bennet, 1883)

1891 Descrição pela primeira vez da forma grave da AME, em um estudo realizado com dois irmãos cuja

fraqueza muscular iniciou-se aos 10 meses e que faleceram com 3 e 6 anos, respectivamente. Na

autópsia de ambos afetados foi encontrada degeneração das células do corno anterior (Werdnig,

1891).

1893 Foram descritos mais sete casos semelhantes, cujas manifestações clínicas surgiram após um ano de

idade, corroborando assim os estudos de Werdnig sobre a forma mais grave (Hoffmann, 1893).

1898 Foi sugerida a existência de diferentes formas de AME (Haushalter, 1898).

1899 Foi descrita pela primeira vez a forma letal da AME (Silvestre, 1899).

1900 Introdução do termo “miotonia congênita” (Oppenheim, 1900).

1902 Foi relatada a diminuição de movimentos fetais nos afetados durante o período gestacional (Beevor,

1902).

1908 Substituição do termo “miotonia congênita” por “amiotonia congênita” (Collier & Wilson, 1908).

1956 Foi definida por Kugelberg Welander a forma intermediária da AME, através da descrição do

quadro clínico em 12 crianças (Kostova et al. 2007)

Até recentemente, havia muita confusão na terminologia da AME. A maioria das

AMEs com instalação no período de lactância ficou conhecida por doença de Werdnig-

Hoffmann. Vale ressaltar, entretanto, que os casos descritos inicialmente por Werdnig-

Hoffmann não correspondiam à forma infantil fatal e sim à forma intermediária da AME.

Desde 1954, a denominação Síndrome de Kugelberg-Welander tem sido utilizada para a

forma mais tardia e leve da doença.

Em 1988, o Comitê Internacional de Neurologia em Doenças Neuromusculares

determinou a mudança do termo “amiotrofia” para doença neurogênica, diferenciando assim

INTRODUÇÃO

14

estas doenças das miopatias primárias. A classificação mais usada é a de Dubowitz (1978) que

divide as AMEs em forma grave, intermediária e leve (tipo I, II e III, respectivamente).

A degeneração dos neurônios motores, com paralisia e atrofia muscular ocorre nas

diferentes formas de AME, que se distinguem pela apresentação clínica, idade de início dos

sintomas, distribuição da fraqueza muscular e pela associação com outros sinais clínicos. Com

base nestas evidências, destacam-se três subtipos da doença: (1) AME I (também conhecida

como Werdnig-Hoffmann), é a forma de início precoce e mais grave da doença; (2) AME II é

a forma intermediária e (3) AME III (também conhecida como Kugelberg-Welander), é a

forma mais tardia e com leve comprometimento muscular. Chama a atenção o fato de que

apesar do comprometimento físico a maioria dos pacientes com AME I, II e III tem

inteligência normal.

A alteração bioquímica dessas diferentes formas clínicas ainda continua desconhecida.

A idade em que a AME se manifesta, parece ser o principal fator que difere o tipo infantil

(Werdnig-Hoffmann) e o tipo intermediário da forma juvenil (Kugelberg-Welander),

(Lefebvre, 1995).

Becker, em 1964, sugeriu um modelo de alelos múltiplos para o desenvolvimento das

diferentes formas clínicas da AME, porém essa hipótese foi rejeitada por Muller et al. (1992),

através da segregação de marcadores, sugerindo que outros genes ou fatores ambientais

deveriam determinar a gravidade da doença.

1.3.1. CARACTERIZAÇÃO CLÍNICA DA ATROFIA MUSCULAR ESPINHAL TIPO I

A AME I, também conhecida pelo nome de doença de Werdnig-Hoffmann, é

caracterizada por uma importante fraqueza muscular e hipotonia generalizada ao nascimento

ou até nos três primeiros meses de vida, apresenta uma evolução muito rápida, envolvendo

INTRODUÇÃO

15

difusamente toda musculatura do indivíduo. Foi inicialmente descrita por Guido Werdnig e

Johan Hoffmann em 1891.

Inúmeros sintomas secundários são comumente observados na AME I, tais como:

1. Movimentos fetais diminuídos ou fracos, sugerindo a existência de

anormalidade no feto mesmo antes do nascimento (Pearn, 1973a; Chong,

2001).

2. Anomalias esqueléticas tais como, luxação de quadril e deformidade nos

dedos das mãos, observadas em 25% dos recém-nascidos afetados.

3. Assimetria torácica, decorrente da degeneração precoce da musculatura

dessa região, tornando o tórax progressivamente estreito e desproporcional

com a evolução clínica (Pascual-Castroviejo, 1984).

4. Os músculos faciais também são acometidos pelo processo de denervação, o

que resulta em uma face inexpressiva, embora apresentem olhos alertas e

responsivos. A cabeça tende a cair para um lado, como um “boneco de pano”

devido à ausência de sustentação. A criança afetada é sempre hipotônica e

incapaz de sentar-se sem apoio. Estas características são observadas por

volta dos 4 meses em 95% dos acometidos pela doença.

5. Nota-se que o choro é fraco e a sucção e deglutição são deficientes. As

fasciculações são frequentemente visíveis, principalmente na língua.

6. Os membros superiores encontram-se semifletidos ao nível dos cotovelos,

com ausência de movimentos na cintura escapular e discretos movimentos

de tremor nas mãos. Os membros inferiores mantêm-se em posição passiva

de rotação e abdução, semifletidos, semelhantes à “posição de rã”. Os

reflexos tendinosos estão abolidos.

7. Os pacientes evoluem com dificuldade respiratória, em virtude de um

comprometimento progressivo da musculatura torácica. Ocorre retração dos

INTRODUÇÃO

16

espaços intercostais e do esterno e a respiração passa a ser

predominantemente diafragmática e com isso há necessidade da utilização de

ventilação mecânica (figura 6).

Figura 6. Recém-nascido com AME I (Werdnig-Hoffmann) mantido sob ventilação mecânica.

(Fonte: Chong, 2001).

Apesar desta série de alterações morfofisiológicas, os pacientes com AME I possuem a

percepção de estímulos táteis dolorosos e o desenvolvimento social e emocional é

correspondente à idade cronológica. Entretanto, a progressão do quadro clínico é rápida e a

pneumonia é a causa mais freqüente de óbito dos pacientes e consequentemente leva a uma

subnotificação da AME. A sobrevida média é de sete meses e 95% dos pacientes morrem

antes de completar 18 meses de idade. Raramente os pacientes sobrevivem além dos dois

primeiros anos de vida (Pearn & Wilson, 1973).

INTRODUÇÃO

17

1.3.2. CARACTERIZAÇÃO CLÍNICA DA ATROFIA MUSCULAR ESPINHAL TIPO II

Trata-se de uma forma intermediária e com evolução mais leve que a do tipo I. Com

raras exceções, os movimentos fetais são geralmente referidos como normais pelas mães

(Munsat et al., 1969).

A criança afetada pode não manifestar nenhum sintoma característico durante o

primeiro ano de vida. Entre 6 e 18 meses, a criança começa a manifestar fraqueza simétrica

dos músculos proximais, principalmente dos membros inferiores, o que impede de ficar em pé

sem apoio. A hipotonia é precoce.

Alguns afetados podem apresentar paresia generalizada e estes frequentemente

apresentam lordose, escoliose e contraturas articulares. Podem estar presentes fasciculações

na língua ou nas mãos. Os reflexos profundos estão abolidos. Os músculos intercostais são

acometidos tardiamente, não havendo dificuldade respiratória precoce na maioria dos casos.

A progressão desta enfermidade é lenta, com um longo período de aparente remissão.

A atrofia surge com o passar dos anos e predomina nos mesmos locais da fraqueza muscular.

Os pacientes conseguem sentar-se sem apoio, mas geralmente não conseguem andar sem

ajuda (Budney & Lovelace, 1975) (figura 7).

Há grande variabilidade na manifestação clínica, tanto no início dos sintomas como no

acometimento da habilidade motora e na época do óbito. A maioria dos pacientes consegue

sobreviver por mais de dois anos e alguns podem atingir a idade adulta até a 3ª ou 4ª década

de vida.

INTRODUÇÃO

18

Figura 7. Paciente hipotônica apresentando dificuldade de ficar em pé.


1.3.3. CARACTERIZAÇÃO CLÍNICA DA ATROFIA MUSCULAR ESPINHAL TIPO III

Esta classe é amplamente conhecida como AME juvenil ou do adulto ou, ainda,

doença de Kugelberg-Welander. Trata-se da forma mais tardia e com menor

comprometimento físico do paciente.

O início da sintomatologia pode variar desde dos 18 meses até a 3ª década de vida.

Entre as três formas de AME, esta é a que apresenta maior variabilidade na manifestação e na

progressão clínica (Brooke, 1986). Nesta forma, o indivíduo afetado chega a andar

normalmente ou com pequeno atraso, mas sempre atinge este marco do desenvolvimento. A

dificuldade para subir uma escada ou para levantar-se do chão pode ser a primeira queixa

clínica.

A fraqueza e a atrofia muscular são relativamente simétricas, com tônus diminuído. Há

comprometimento da cintura pélvica e da coxa. Os pacientes podem apresentar deformidade

torácica e cifoescoliose acentuada. Os braços também são acometidos, porém em menor grau.

Os movimentos de mãos e dedos costumam ser mantidos, mesmo na fase avançada da doença.

INTRODUÇÃO

19

As fasciculações são encontradas em 30 a 50% dos pacientes, predominantemente na língua,

ombros e músculos dos braços. Os reflexos tendinosos estão diminuídos ou ausentes,

particularmente em membros inferiores.

Cerca de um terço dos pacientes manifestam fraqueza da musculatura facial. Podem

apresentar disfagia moderada, disartria, voz anasalada, fraqueza facial, fraqueza do

esternocleidomastóideo, pescoço e do trapézio, ptose e oftalmoplegia (Gardner-Medwin et al.,

1967; Aberfeld & Namba, 1969; Namba et al., 1970; Wallar & Reece, 1978; Gruber et al.,

1983; Barois et al., 1989).

Geralmente, a progressão clínica é lenta, com longo período estático, permitindo

manter a deambulação, ainda que com dificuldade, após 10 a 30 anos de evolução. A maioria

dos pacientes fica, no entanto, confinada à cadeira de rodas em torno dos 30 anos (figura 8). A

sobrevida varia muito e depende principalmente do acometimento da musculatura respiratória.

Figura 8. Irmãos com Atrofia Muscular Espinhal do tipo III.


Por causa da grande heterogeneidade clínica da AME III, esta é dividida em dois

subgrupos que mostram diferenças estatisticamente significantes quanto à época do

prognóstico: grupo IIIa (início, dos 18 meses até os três anos de idade) e IIIb (início entre três

e trinta anos), este último configurando menor gravidade. Considerando casuísticas extensas,

INTRODUÇÃO

20

entre esses dois subtipos há uma grande diferença na probabilidade de continuar

deambulando, porém, em relação a casos isolados não é possível estabelecer o prognóstico

por ocasião do diagnóstico, pois existem pacientes tipo IIIa com curso estável durante décadas

(Zerres et al., 1997; Reed, 2002). Além disso, foi documentado que não há progressão da

fraqueza muscular, porém há deterioração das habilidades funcionais de acordo com o

crescimento corporal (Zerres et al.,1995; Russman et al.,1996 e Iannaccone et al., 2000).

Assim, muitas crianças com AME III podem perder a habilidade de andar de forma

independente. Essa progressão ocorre por causa da perda das unidades motoras, que aparenta

ser mais rápida nas fases iniciais da doença. Conceitualmente, a referida perda pode ser

dividida em três fases: pré-clínica, subaguda e crônica. Durante a fase pré-clínica, embora as

crianças pareçam normais, já ocorre perda das unidades motoras que pode ainda não ter

atingido um limiar crítico. Esta fase pode ser curta ou até mesmo não existir nos pacientes

com AME I, enquanto que nos tipos II e III pode durar meses ou anos. A fase subaguda é

associada à perda de unidades motoras que já alcançam o limiar crítico. Após o período

subagudo segue a fase crônica e a perda das unidades motoras estabiliza. A criança que está

na fase crônica demonstra habilidades funcionais relativamente estáveis, por outro lado no

período subagudo ocorre um declínio funcional mais evidente.

Armand et al., 2005, realizaram uma comparação da marcha entre dois pacientes com

AME III e dois com DMD. Ambas as patologias causam fraqueza mais proximal do que distal

e mais proeminente na musculatura extensora do que na flexora, além de afetar mais os

membros inferiores do que os superiores, o que resulta na perda da deambulação. Nos

pacientes com acometimento neuromuscular, preservar a autonomia da marcha é um dos

maiores objetivos do tratamento, e o diagnóstico correto da doença possibilita a adequada

abordagem terapêutica do paciente. Existem evidências que sugerem a relação do número de

cópias do SMN2 e os diferentes tipos de AME.

INTRODUÇÃO

21

1.3.4. CARACTERIZAÇÃO GENÉTICO-MOLECULAR DA ATROFIA MUSCULAR

ESPINHAL

O aprimoramento das ferramentas da genética molecular, permitiu a identificação do

locus cromossômico do gene da AME no braço longo do cromossomo 5, quase

simultaneamente em 1990 por três grupos independentes de pesquisadores (Brzustowicz et

al., 1990; Melki et al. 1990 e Gilliam et al. 1990).

Brzustowicz et al. (1990) realizaram estudos de ligação em 13 famílias de pacientes

com AME (7 com AME II/III e 6 com AME I) utilizando inicialmente 115 marcadores

aleatórios ao longo do genoma. Os autores detectaram ligação entre os marcadores LM4,

p105-153Ra, p105-798Rb e 227, situados na região 5q11.2-13.3. e os genes da AME II e

AME III, indicando assim que os referidos genes estavam localizados na mesma região

cromossômica.

Melki et al.(1990) demonstraram que os três tipos de AME (I, II e III), estavam

ligados a marcadores pertencentes à região 5q12-q14. Daniels et al. (1992b) usando a

hibridação in situ, com auxílio do marcador D5S6, refinaram a região de localização do gene

responsável pela AME para a região 5q12.2-q13. Em 1992 Brzustowicz identificou 2 loci

flanqueadores da região alvo, MAP1B e D5S6. No ano seguinte Wirth e colaboradores (1993)

diminuíram para uma região de 4cM e definiram uma nova fronteira genética pelo locus

D5S125. No mesmo ano, Gilliam et al., detectaram ligação entre os marcadores do

cromossomo 5 na região 5q11.2-13.3 em duas das quatro famílias com AME I.

Desde então, vários outros estudos de ligação foram realizados na tentativa de isolar,

mapear e delimitar melhor a localização do gene da AME. Para isso, foram utilizados

diferentes marcadores de DNA próximos ao provável locus gênico na região 5q11-13 (Sheth

et al., 1991; Lien et al., 1991; Brzustowicz et al., 1992; Daniels et al., 1992b; Morrisson et

al., 1992; Soares et al., 1993; Wirth et al., 1993; Clermont et al., 1994; Burghes et al.,

1994b).

INTRODUÇÃO

22

Uma das dificuldades encontradas pelos pesquisadores no estudo do gene das AMEs é

a instabilidade da região cromossômica de interesse devido à presença de grande número de

repetições de nucleotídeos (Kleyn et al., 1993; Burghes et al., 1994a; McLean et al., 1994;

Wang et al., 1995). Vários YACs (do inglês, Yeast Artificial Chromosomes) contendo a região

5q13 foram construídos com o propósito de mapear os genes da AME e essas tentativas foram

prejudicadas pela presença de sequências repetitivas na região (Kleyn et al., 1993; Francis et

al., 1993; Melki et al., 1994; Burghes et al., 1994a).

Lefebvre et al (1995) localizaram com maior precisão esse gene que denominaram

SMN (do inglês, Survival Motor Neuron - Gene de Sobrevivência do Neurônio Motor) na

região 5q13. Nesta região, em um intervalo de cerca de 500Kb, foram reconhecidas duas

cópias de repetições virtualmente idênticas, uma na região centromérica (SMN2) e outra na

região telomérica (SMN1) (figura 9).

Figura 9. Representação esquemática dos genes SMN1 e SMN2. A. Indivíduo sem deleção. B. Deleção

homozigótica do gene SMN1 em pacientes com AME. C. Deleção homozigótica do gene SMN2

(encontrada em aproximadamente em 5% dos controles, sem fenótipo clínico).

A diferença entre estas formas homólogas é de apenas 2 pares de bases nos éxons 7 e 8

(Fallon et al., 1999). Elas apresentam cinco nucleotídeos de diferença localizados entre o

íntron 6 e o éxon 8 (Hahnen & Wirth, 1996). O gene SMN corresponderia à cópia da região

INTRODUÇÃO

23

telomérica constituída por 8 éxons distribuídos por uma região de 20Kb de extensão. As

mutações associadas à doença correspondem a deleções nos éxons 7 e 8 do locus SMN1.

Os genes SMN telomérico (SMN1) e o SMN centromérico (SMN2) são praticamente

idênticos, mas podem ser distinguidos por mudanças de base simples nos éxons 7 e 8 (Parsons

et al. 1998). O éxon 7 do gene SMN1 não é detectável em aproximadamente 95% dos

pacientes de AME, devido à deleção no SMN ou à conversão de sequências do SMN1 para

SMN2 (Ogino & Wilson, 2002). A perda do gene centromérico (SMN2) não causa AME;

entretanto um número aumentado de cópias do SMN2, que pode ser causada pela conversão

de SMN1 para SMN2, está associado a um fenótipo brando da AME (Pieri et al., 2009). O fato

do éxon 7 do gene SMN1, ser homozigoticamente ausente na grande maioria dos pacientes de

AME, possibilitou o desenvolvimento de um teste efetivo baseado em PCR para o diagnóstico

molecular da AME.

O mecanismo molecular da AME pode ser assim resumido: o gene SMN possui uma

cópia telomérica e uma cópia centromérica, que pode faltar em 5 a 10% da população normal,

porém está sempre presente nos pacientes com AME. A maior parte da proteína SMN vem do

gene SMN1 porque durante a transcrição do gene SMN2 o éxon 7 é frequentemente excluído,

o que codifica uma proteína truncada, que perde 16 aminoácidos codificados pelo éxon 7, e se

torna rapidamente degradável (Sumner, 2007). O gene SMN2 possui diversas cópias e pelo

mecanismo da dosagem gênica o número destas determina os diferentes fenótipos no

indivíduo afetado:

Uma ou duas cópias: AME tipo I

Três cópias: forma intermediária

Três a quatro cópias: AME III

Cinco cópias: parentes portadores

A organização genômica entre SMN1 e SMN2 é idêntica sugerindo uma duplicação

recente. As análises indicaram que o gene telomérico é o gene ancestral (SMN). O

INTRODUÇÃO

24

seqüenciamento de RNAs sugere que ambos os genes são expressos, apesar de não estar claro,

se os dois são traduzidos em proteínas funcionais. Fósseis moleculares e dados de relógio

molecular sugeriram que essa duplicação ocorreu a 3 milhões de anos atrás (Rochete et al.,

2001).

O gene SMN codifica uma pequena proteína de 294 aminoácidos (figura 10) cuja

função ainda é desconhecida (Lefebvre et al., 1995), acreditando-se que ela esteja envolvida

no processo de amadurecimento tanto do neurônio motor como do músculo. Essa proteína

está localizada principalmente no citoplasma de sistemas neuronais específicos e

particularmente presente nos neurônios motores inferiores de recém-nascidos e adultos, que

está indiretamente ligada ao processamento de RNA devido sua localização sub-nuclear

(Battaglia et al., 1997). Quando os níveis dessa proteína são muito reduzidos, os neurônios

motores são as primeiras células a se degenerar, deixando os principais grupos musculares

sem o estímulo necessário.

Para atuar, a proteína interage com várias outras na célula, ajudando-as a criar algumas

das máquinas moleculares críticas que produzem o RNA mensageiro e várias proteínas. A

proteína SMN faz parte de um complexo macromolecular que inclui pelo menos outras seis

proteínas chamadas geminas. Estas são expressas em todas as células, tanto no citoplasma

como no núcleo, onde recebem a denominação de gemas. Sugere-se que o complexo SMN

seja regulado por duas destas geminas e desempenhe papel essencial na formação e

agrupamento de pequenas proteínas ribonucleares, localizadas no núcleo e implicadas não só

na integridade do neurônio motor como de outras células (Gubitz et al., 2004; Feng et al.,

2005). A compreensão do mecanismo molecular e da função da proteína SMN bem como a

viabilidade de novos agentes farmacológicos permitiu a abertura de um novo campo para

testes clínicos (Iannaccone, 2002). Várias drogas estão sendo testadas em diferentes países, na

tentativa de encontrar um possível tratamento para essa doença (Bertini et al., 2005).

INTRODUÇÃO

25

Figura 10. Representação da Estrutura Cristalografada do Complexo SMN Humano.

(Fonte: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=Structure/;14-12-2004)

Simultaneamente, a descoberta do gene SMN por Lefebrve et al. (1995) e Roy et al.

(1995) identificaram um outro gene, NAIP (do inglês, Neuronal Apoptosis Inhibitory Protein -

Proteína Inibitória de Apoptose Neuronal), este teria no mínimo 16 éxons e se estenderia por

mais de 60 kb. Os dois grupos de pesquisadores encontraram deleções nestes genes em

pacientes afetados pela AME, porém com uma frequência bem maior no gene SMN. Esses

achados foram extremamente importantes e vários grupos no mundo inteiro, começaram

estudar esses genes em pacientes. Entretanto, o mecanismo que leva à degeneração neuronal

permanece desconhecido. Portanto estudos de correlação genótipo-fenótipo são fundamentais

para melhorar a compreensão acerca dos mecanismos moleculares responsáveis pelas AMEs.

O gene NAIP codifica uma proteína maior, de 1232 aminoácidos que mostra

homologia com aqueles que codificam proteínas baculovirais (IAP) (figura 11) que inibem

apoptose celular. Sugeriram que as mutações no locus do NAIP ocasionam uma falha da

inibição de apoptose do neurônio motor, resultando no fenótipo da AME (Romanish et al.,

2009).

INTRODUÇÃO

26

Figura 11. Proteína Baculoviral Inibitória de Apotose.

(Fonte: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=Structure/; 29-02-2008)

Quando o gene da NAIP não está completo o evento de apoptose celular pode ser

maior, por destruição da maioria dos neurônios motores, o que dificulta as conexões entre o

músculo esquelético e a medula espinhal, levando eventualmente a atrofia dos músculos. Foi

visto que a NAIP parece suprimir a apoptose e que essa proteína está expressa nos neurônios

motores, mas não nos sensoriais (Ameisen, 2002; Damiani, 2004).

Ambos os genes (SMN e NAIP), são adjacentes numa região altamente polimórfica do

cromossomo 5 (figura 12), onde as duplicações e deleções são frequentes. Nesta região

cromossômica foram encontradas duplicações extensas em posição invertida. Algumas destas

funcionam como pseudogenes, isto é, agem como genes autênticos com transcrição

semelhante, mas que não conseguem elaborar um produto funcional adequado (Theodosiou et

al., 1994; Selig et al., 1995).

Esta complexidade da organização genômica dificultou muito a identificação dos

genes da AME. São necessários ainda estudos complementares para se estabelecerem as

correlações genótipo-fenótipo e o papel de cada um desses na patogênese das AMEs. Porém

estudos sugerem que o NAIP seja um modificador na gravidade da atrofia muscular espinhal

(Romanish et al., 2009).

INTRODUÇÃO

27

Figura 12. Mapa Físico do Cromossomo 5.

(Fonte: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi)

1.3.5. HERANÇA DA AME PROXIMAL

As doenças degenerativas neuromusculares apresentam diferentes mecanismos de

hereditariedade; algumas são recessivas (Fibrose Cística, Distrofia Muscular de Cinturas,

entre outras) a maior parte dominante (Distrofia Miotônica, Miopatia Congênita, entre outras),

podendo estar localizadas em cromossomos autossômicos ou ligadas ao cromossomo sexual X

As principais formas de AME apresentam herança autossômica recessiva e o

estabelecimento do seu mecanismo de herança é extremamente importante para o

aconselhamento genético, já que casais que tiveram uma criança afetada têm 25% de risco de

recorrência em cada gravidez subsequente (Fallon et al., 1999). Os caracteres hereditários

autossômicos recessivos ocorrem com igual frequência nos homens e nas mulheres. Quando o

traço é raro, quase todos os indivíduos têm pais normais, porém ambos heterozigotos. Os

caracteres autossômicos recessivos são transmitidos por ambos os progenitores.

Nos casamentos consanguíneos, há uma probabilidade maior de nascerem filhos com

caráter recessivo, pois indivíduos aparentados possuem uma maior probabilidade do que os

INTRODUÇÃO

28

não parentes, de compartilharem do mesmo alelo. Desta forma, há uma proporção maior de

casamentos consanguíneos entre os progenitores de afetados por um caráter recessivo, do que

entre progenitores de pessoas normais (McKusick, 1971).

Entretanto, há vários relatos familiares de transmissão autossômica dominante em

casos de manifestação tardia, particularmente na AME III, indicando existência de

heterogeneidade genética na AME (Tsukagoshi et al., 1966).

Através da análise clínica de 141 pacientes com AME II e III, Pearn (1978b), observou

a forma autossômica recessiva em mais de 90% dos afetados e uma pequena proporção de

casos da forma autossômica dominante, provavelmente decorrente de mutação nova.

Pelo quadro clínico não é possível distinguir a forma recessiva da dominante.

Observa-se, porém, que pacientes acometidos pela versão dominante da doença, apresentam

uma progressão clínica mais lenta e benigna da doença, devido a um menor comprometimento

muscular do que na forma recessiva (Lugaresi et al., 1966; Bundey & Lovelace, 1975).

Dentro de uma mesma família, é muito comum a concordância do quadro clínico,

particularmente na AME I, e tem sido relatada similaridade de quadro clínico entre gêmeos

monozigóticos (Brandt, 1950; Leyrer, 1954; Marquardt et al., 1962; Zellweger et al., 1969).

A variabilidade clínica intrafamiliar pode ser encontrada principalmente na AME III e

a ocorrência de AMEs de diferentes tipos na mesma família tem sido descrita ocasionalmente

(Dubowitz, 1964; Hausmanowa-Petruzewicz, 1970; Zellwegger, 1971; Zerres & Grim, 1983;

Bouwsma & Leschot, 1986).

Enquanto não houver tratamento específico para as AMEs, a prevenção de novos

casos, através do aconselhamento genético dos casais em risco e o diagnóstico pré-natal, são

de fundamental importância.

INTRODUÇÃO

29

1.3.6. CRITÉRIOS DIAGNÓSTICOS PARA AMES

Munsat & Davies (1992) propuseram critérios de inclusão e exclusão diagnóstica das

AMEs baseados no quadro clínico (Tabela 2) e laboratorial. Esta classificação obteve

consenso entre os participantes do Encontro Internacional sobre AMEs realizado em 1992

(Munsat & Davies, 1994). Está apresentado o resumo dos critérios clínicos laboratoriais

utilizados pelos autores citados, critérios estes hoje internacionalmente aceitos.

1.3.6.1. Critérios Clínicos

Tabela 2: Critérios clínicos para diagnóstico da AME.

Forma Início da Manifestação Habilidade Motora Óbito

AME I 0 a 6 meses Não senta sem apoio Antes dos dois anos

AME II Antes dos 18 meses Não anda sem apoio Após dois anos

AME III Após os 18 meses Fica de pé e anda Na idade adulta

1.3.6.2. Critérios Laboratoriais

A identificação do gene da AME (Lefebvre et al., 1995; Roy et al., 1995) possibilitou

o diagnóstico específico da doença através de estudo molecular. A detecção da deleção do

éxon 7 e do éxon 8 do gene SMN possibilitou o diagnóstico pré-natal com maior precisão para

os casais de risco pela análise de DNA obtido após punção vilo corial. Além do estudo

genético, o método bioquímico de dosagem sérica da creatino-quinase, a eletromiografia e a

biópsia muscular constituem exames complementares importantes para a investigação e

diagnósticos clínicos.

INTRODUÇÃO

30

A) CREATINO-QUINASE (CK)

A dosagem sérica da atividade da enzima que se expressa em fibras musculares a

creatino quinase (CK) na forma grave da AME encontra-se invariavelmente normal;

ocasionalmente pode estar elevada na forma intermediária e freqüentemente na forma tardia

(Dubowitz, 1964; Tsukagoshi et al., 1966; Hausmanowa-Petrusewicz, 1970).

Em geral, esse aumento de CK é discreto ou moderado, e não de forma pronunciada

como ocorre nas distrofias musculares e outras miopatias (Zatz et al., 1991). Se o valor da

enzima for superior a dez vezes o limite normal, exclui-se a possibilidade da AME. Os valores

de CK variam de acordo com a idade e o sexo, como observado na tabela 3.

Tabela 3: Valores normais de creatino-quinase de acordo com a idade e o

sexo do indivíduo.

Idade Valor Normal de CK

1-3 anos 60-305 U/l 4-6 anos 75-230 U/l 7-9 anos 60-365 U/l 10-11 anos 55-215 U/l (homens) 80-230 U/l (mulheres) 12-13 anos 60-330 U/l (homens) 50-295 U/l (mulheres) 14-15 anos 60-335 U/l (homens) 50-240 U/l (mulheres)

16 em diante 55-370 U/l (homens) 45-230 U/l (mulheres)

B) ELETRNEUROMIOGRAFIA (ENMG)

A realização da eletroneuromiografia (ENMG) é fundamental para o diagnóstico

diferencial entre o processo neurogênico das AMEs e as condições miopáticas, bem como

para diferenciar as AMEs dos processos neurogênicos que acometem segmentos medulares

diferentes (Karlström & Wohlfart, 1939 e Buchtal & Clemmesen, 1941).

Potenciais de ação de unidades motoras de grande amplitude e longa duração são

encontrados em processos neurogênicos, enquanto unidades de baixa amplitude, complexas e

polifásicas são mais freqüentemente encontradas em processos miopáticos. Podem ser notadas

INTRODUÇÃO

31

também fasciculações e fibrilações associadas à denervação generalizada (Buchtal & Olsen,

1970). A velocidade de condução do nervo motor geralmente é normal (Munsat et al., 1969;

Hausmanowa-Petrusewicz, 1970). No entanto, ela pode estar levemente diminuída na AME I

(Moosa & Dubowitz, 1976; Imai et al., 1980). Se inferior a 70% do valor normal pode-se

excluir o diagnóstico de AME.

C) BIÓPSIA MUSCULAR

Em geral, o quadro clínico, a dosagem sérica de CK e a eletroneuromiografia são

suficientes para fazer o diagnóstico clínico de AME, sendo a biópsia muscular desnecessária

na maioria dos pacientes.

Porém, nos casos duvidosos em que o paciente apresenta valores séricos de CK

elevados e/ou ENMG inconclusivo, está indicada a biópsia muscular. O padrão histológico

básico observado na biópsia muscular de pacientes com AME consiste na atrofia muscular por

processo neurogênico. Este achado é semelhante em todos os tipos de AME, diferindo apenas

nas alterações decorrentes da cronicidade da doença. O exame histopatológico do músculo

esquelético mostra aspectos de denervação caracterizados por atrofia muscular em pequenos e

grandes grupos, agrupamento de fibras de um mesmo tipo e presença de sacos nucleares. No

processo miopático há diminuição do tamanho das fibras musculares e degeneração acentuada

com necrose e fagocitose das fibras musculares.

Na AME I, as atrofias musculares envolvem tanto as fibras do tipo I como as do tipo II

e formam agrupamentos extensos intercalados com as fibras hipertrofiadas também agrupadas

de tamanho 3 a 4 vezes superior ao normal. As alterações degenerativas com necrose celular

são raramente observadas na AME I, mas são frequentemente encontradas na AME II e III, o

que causa dificuldades no diagnóstico diferencial.

INTRODUÇÃO

32

Na AME III, as fibras atrofiadas encontram-se agrupadas em pequenas áreas, com

predomínio das fibras tipo II e as fibras hipertrofiadas são raramente encontradas (Dubowitz,

1985).

1.3.7. EPIDEMIOLOGIA DA AME

Na Inglaterra, a incidência estimada para as formas crônicas de AME II e AME III é

de 1: 24.000 nativivos (Pearn, et al., 1973b). No Norte da Inglaterra, a incidência é de 1:

25.000 nativivos e calcula-se que a frequência de portadores do gene seja 1: 80 (Pearn,

1978d). Em uma comunidade fechada de egípcios vivendo em Israel, observou-se uma alta

frequência de AME I: quatro casos em 1600 crianças (Fried & Mundel, 1977).

Pascalet-Guidon et al. (1984) relataram uma alta frequência de AME I numa área

limitada de uma Ilha no Oceano Índico. Todos os 19 afetados pertenciam a 13 irmandades que

descendiam de um mesmo ancestral.

Spiegler et al. (1990) observaram num estudo epidemiológico realizado na Polônia, de

AME forma infantil e crônica, que havia uma freqüência aproximada de 1: 10.000 sendo 1: 35

a freqüência de portadores do gene. Na Hungria, a incidência estimada de AME I é de 1 em

cada 10.000 nativivos (Czeizel & Hamula, 1989; Czeizel, 1991). Já Burd et al. (1991)

encontraram em Dakota do Norte, Estados Unidos, uma incidência de 1: 6720 nascidos vivos.

Em uma população italiana, Mostaccinolo et al. (1992) encontraram a freqüência de

AME I, II, III de 7,8: 100.000 nativivos; a freqüência de AME I foi 4,1: 100.000 nativivos. Os

autores calcularam a freqüência do heterozigoto como sendo de 1: 57.

1.3.8. ESTUDOS DA AME NO BRASIL

Esperon et al. (1988) relataram um caso de AME I, cuja debilidade muscular

manifestou-se precocemente nas primeiras semanas de vida. Os autores destacaram a

INTRODUÇÃO

33

importância do diagnóstico pelo pediatra, considerando que o paciente teve dois irmãos

falecidos aos 4 meses de idade, com diagnóstico de broncopneumonia, que pela história

retrospectiva, apresentaram quadro clínico idêntico. A importância do diagnóstico é ressaltada

pelos autores, visando o aconselhamento genético dos pais.

Fontana et al. (1990) em Porto Alegre, descreveram 12 casos de AME I. O diagnóstico

foi realizado por exame clínico, dosagem sérica de enzimas musculares, eletromiografia e

biópsia muscular. Foram analisados os aspectos clínicos da doença, sua evolução e a

investigação laboratorial.

Em 1990, Canado et al., relataram um caso esporádico de atrofia espinhal crônica

proximal juvenil. O diagnóstico foi comprovado pela eletroneuromiografia, porém as

características clínicas, laboratoriais e histológicas eram sugestivas de distrofia muscular. Os

autores alertaram que as AMEs de longa evolução (AME II e AME III) podem ser

erroneamente diagnosticadas como distrofia muscular.

O conjunto de marcadores desta região cromossômica 5q11.2-13.3 foi então testado

por Whittle em 1991, para o estudo das famílias brasileiras afetadas. Das cinco famílias

estudadas, em duas observou-se ligação com os marcadores do cromossomo 5. Em uma das

famílias a biópsia foi de difícil interpretação e não confirmou o diagnóstico de AME. O autor

discute a probabilidade de serem estas duas famílias afetadas pela forma autossômica

dominante da AME III.

Chong (1996) fez um estudo com 72 pacientes com AME, do Hospital Universitário

da Faculdade de Medicina de São Paulo, no qual encontrou deleção do éxon 7 e/ou 8 do gene

SMN em 13/16 (81%) dos pacientes AME I, 17/20 (85%) dos AME II e 16/36 (44%) dos

AME III, não encontrando deleção desses éxons em nenhum dos progenitores ou irmãos

assintomáticos, assim como no grupo controle de indivíduos normais.

No estudo realizado por nós em 2003, com 33 pacientes com AME do Instituto de

Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira da Universidade Federal do Rio de Janeiro foi

INTRODUÇÃO

34

observado deleção do éxon 7 e/ou 8 do gene SMN em 100% dos pacientes com AME I e II e

77% com AME III.

1.4. DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL

Uma das principais dificuldades no diagnóstico das AMEs é distingui-las das outras

doenças que cursam com quadro de hipotonia e prejuízo no desenvolvimento motor.

Atualmente são reconhecidas mais de duas centenas de síndromes genéticas em que essas

manifestações clínicas estão presentes com nítida relevância, apesar de em geral, estarem

acompanhadas de outros sinais (Araújo & Fontenelle, 2001). A hipotonia muscular no período

neonatal pode ser uma manifestação clínica consequente a vários processos patogênicos. As

principais patologias que apresentam características similares a AME I são: distrofia muscular

congênita, miopatias estruturais, distrofia miotônica, doença de Pompe e síndrome miastênica

neonatal. A tabela 4 mostra a relação dos diferentes tipos de AMEs com outras doenças com

sintomatologia semelhante e na tabela 5 as principais doenças neuromusculares são

apresentadas.

Alguns pacientes têm sido descritos como portadores de ‘’variantes’’ da AME infantil,

devido à associação de anomalias como hipoplasia cerebelar, degeneração pontocerebelar ou

cerebelo tálamo-espinhal, fraturas ósseas, paralisia diafragmática com dificuldade respiratória

precoce e defeito cardíaco congênito. Não está esclarecido ainda se essas condições seriam

distintas da AME I.

INTRODUÇÃO

35

Tabela 4. AMEs x Doenças com Características Clínicas Similares.

Atrofia Muscular Espinhal Tipo I

Síndromes Miastênicas

Distrofia Muscular Congênita

Miopatias Estruturais

Distrofia Miotônica Congênita

Doença de Pompe

“Variantes da AME Infantil”

Atrofia Muscular Espinhal Tipo II

Neuropatias Hereditárias Sensitivas Motoras

Distrofia Muscular Progressiva tipo Duchenne

Distrofia Muscular Progressiva tipo Cinturas

Distrofia Miotônica

Atrofia Muscular Espinhal Tipo III

Neuropatias Hereditárias Sensitivas Motoras

Distrofia Muscular Progressiva tipo Duchenne

Distrofia Muscular Progressiva tipo Becker

Distrofia Muscular Progressiva tipo Cinturas

Distrofia Muscular Progressiva tipo Fascio-Escápulo-Humeral


Tabela 5. Principais Doenças Neuromusculares.

Doenças do Nervo Periférico Neuropatias Hereditárias Sensitivas Motoras

Doenças da Placa Motora Síndromes Miastênicas

Doenças do Músculo

Distrofia Muscular Congênita

Miopatias Estruturais

Distrofias Musculares Progressivas


Miopatias Metabólicas

Doenças do 2º Neurônio Motor

Paralisia Bulbar Progressiva

Atrofia Muscular Espinhal Proximal (tipos: I, II e III)

Atrofia Muscular Espinhal Fascio-Escápulo-Humeral

Atrofia Muscular Juvenil Bulbar Proximal

Atrofia Muscular Espinhal Esporádica

Esclerose Lateral Amiotrófica Juvenil

“Variantes” da AME Infantil

INTRODUÇÃO

36

1.5. AÇÕES TERAPÊUTICAS

O ácido valpróico (AV), droga amplamente utilizada para o tratamento da epilepsia,

inclusive no Brasil, mostrou em cultura de fibroblastos de pacientes com AME a propriedade

de ativar o promotor do gene SMN2, aumentando o nível da proteína SMN2 e, possivelmente,

induzindo a inclusão do éxon 7 no transcrito SMN2 (Andreassi et al., 2001, 2004; Miller et

al., 2001; Sumner et al., 2003).

Para verificar a eficácia do AV e de outras possíveis drogas torna-se imprescindível o

uso de instrumentos avaliativos eficazes para testes. Entretanto, não há estudos que definam e

uniformizem quais os melhores métodos de avaliação. Portanto, em vista dos protocolos de

tratamento que estão sendo desenvolvidos, torna-se necessário testar e, possivelmente, definir

uma forma de avaliação da eficácia de um determinado tipo de tratamento que seja de fácil

aplicação no paciente ambulatorial.

Ainda não existe um tratamento efetivo para as AMEs, porém existem cuidados não

efetivos que dependem de atendimento multidisciplinar e objetivam a prevenção de

complicações, bem como a melhora na qualidade de vida dessas crianças.

O prognóstico e a abordagem terapêutica das AMEs dependem do reconhecimento da

gravidade da doença, sendo a principal causa de morbidade e mortalidade a insuficiência

respiratória restritiva de caráter progressivo. O tórax em forma de sino na AME I, referido por

Dubowitz et al., 1995, resulta na discrepância entre a paralisia dos músculos intercostais e a

manutenção da função do diafragma. Na inspiração as costelas colapsam, criando a

atelectasia. Problemas respiratórios durante o sono são tipicamente observados antes dos

sintomas da insuficiência respiratória e atualmente são tratados precocemente por meio de

ventilação não invasiva. Nos pacientes com AME I, é freqüente a falha no fluxo respiratório,

normalmente como resultado de fraqueza bulbar e aspiração ou refluxo. Essa falha deve ser

tratada imediatamente porque exacerba qualquer fraqueza pré-existente. Pacientes com AME

II apresentam tipicamente constipação intestinal por causa da hipotonia da musculatura

INTRODUÇÃO

37

abdominal e da imobilidade, podendo ser tratados pela adesão a uma dieta rica em fibras e

água. Pacientes com AME III apresentam tendência de serem mais magros devido à alta

exigência calórica necessária para manter sua mobilidade. Muitas crianças também

apresentam problemas ortopédicos. Algumas nascem com deformidades congênitas nos pés e

têm grande probabilidade de desenvolver escoliose congênita, o que dificulta o tratamento.

Resumindo, preconiza-se um cuidado de fisioterapia motora e respiratória, prevenção de

infecções respiratórias com vacinas disponíveis, acompanhamento nutricional a fim de

garantir uma qualidade de vida, objetivando a maior independência para as atividades e

inserção mais ampla quanto possível na vida social.

1.6. ESTUDOS MOLECULARES

Estima-se que temos entre 25 e 30 mil genes responsáveis por nossas características

normais e patológicas (Huttenhower et al., 2009). Esses genes estão espalhados ao longo dos

23 pares de cromossomos.

A grande maioria dos genes é constituída de regiões não codificadoras, chamadas de

íntrons, que são transcritos em RNA, mas posteriormente eliminados, antes que o RNA

mensageiro (mRNA) seja traduzido em uma proteína. Os íntrons alternam-se com as

seqüências codificadoras, chamadas de éxons, que codificam as seqüências de aminoácidos.

Na maioria dos genes, o comprimento acumulativo dos íntrons constitui uma proporção bem

maior do que aquele coberto pelos éxons e o tamanho dos genes pode variar muito

(Thompson et al., 1993).

A análise de ligação constitui um método fundamental para mapeamento dos genes e

baseia-se na tendência de dois genes sintênicos segregarem juntos (Guyer & Collins, 1993).

Sabe-se que os genes que estão no mesmo cromossomo são herdados juntos, no entanto,

devido aos eventos de recombinação genética ocorridos na meiose, genes ou marcadores que

estavam no mesmo cromossomo na geração dos pais podem localizar-se em diferentes

INTRODUÇÃO

38

cromossomos nos descendentes. A frequência de recombinação entre dois marcadores,

situados no mesmo cromossomo, está diretamente relacionada à distância entre eles. Assim

sendo, quanto menor a distância entre dois marcadores, maior a probabilidade de que eles

segreguem juntos. Inversamente, quanto maior a distância entre eles, menor a chance de

segregarem juntos (Botstein et al., 1980).

Entretanto, foi só a partir do final dos anos 70 e início dos anos 80 que a análise de

ligação tornou-se mais viável, dado o desenvolvimento de vários conceitos e tecnologias de

DNA recombinante. O mais importante foi o reconhecimento de que alterações pequenas nas

sequências de DNA entre diferentes indivíduos poderiam não resultar em nenhuma alteração

fenotípica, mas poderiam ser utilizadas como marcadores genéticos. Essas sequências

variáveis, os chamados polimorfismos, são a base da variabilidade humana.

Com o advento das técnicas modernas de biologia molecular, surgiram diversos

métodos de detecção de polimorfismo genético diretamente em nível de DNA. Inicialmente, a

utilização de enzimas de restrição permitiu a análise de polimorfismo de comprimento de

fragmentos de restrição de DNA (Restriction Fragment Length Polymorphism - RFLP). Mais

recentemente, o desenvolvimento do processo de amplificação em cadeia utilizando uma

DNA polimerase (PCR) levou à descrição de outras classes de marcadores moleculares.

Aliadas às técnicas de clonagem e sequenciamento de DNA, estas metodologias têm

possibilitado um rápido acúmulo de informações sobre a estrutura do genoma de eucariotos.

A disseminação de seu uso contribuiu para a descoberta e estudo de diversas classes de

sequências repetitivas de DNA, chamadas mini e microssatélites, outra fonte de polimorfismo

genético. Hoje um número virtualmente ilimitado de marcadores moleculares altamente

polimórficos pode ser obtido em qualquer organismo vivo, através de diversas técnicas.

A determinação molecular de doenças genéticas tem se mostrado bastante vantajosa,

podendo ser aplicada nas mais diversas situações. Ao se conhecer a mutação responsável por

uma doença, pode-se analisar o gene visando determinar se a mutação está presente ou não.

INTRODUÇÃO

39

Nos casos em que o gene não foi identificado, pode-se fazer o uso da análise de ligação a

partir de RFLP. Estes últimos também podem ser utilizados na detecção de portadores

(heterozigotos) assintomáticos, auxiliando no aconselhamento genético.

Assim, testes moleculares, como a associação de Southern Bloting e PCR pode se

tornar um excelente método de diagnóstico para a identificação de indivíduos com história

familiar sugestiva. Em doenças hereditárias como a AME, o diagnóstico pré-natal permite que

casais com risco reduzam sua chance de iniciar uma gravidez problemática. Wirth et al.

(1995) apresentaram sua experiência com diagnoses pré-natais, realizadas em famílias com

risco de AME pelo uso de microssatélites polimórficos na região 5q11.2-q13.3.

Posteriormente, Lo et al. (1994) analisaram 25 gestações de risco para AME tipo I,

usando como marcadores cinco microssatélites polimórficos. Os autores diagnosticaram três

fetos como afetados sendo os outros vinte e dois fetos normais. Estes resultados reforçaram a

utilidade de análise de ligação para o diagnóstico pré-natal.

1.7. DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE (DMD)

A forma mais comum das doenças musculares degenerativas em crianças é a distrofia

muscular de Duchenne, foi originalmente descrita por um inglês, Edward Meryon, num

evento da Real Sociedade Médica e Cirúrgica (Inglaterra) em 1851, esse trabalho foi

publicado posteriormente num artigo dessa Sociedade. Ele descreveu em detalhes a

apresentação clínica dessa desordem, que aparece no início da infância e leva à morte na

adolescência. Ele demonstrou que a doença era hereditária e afetava apenas meninos; e mais

importante, ele demonstrou através da necropsia que a medula espinhal mantinha-se normal.

Portanto, essa era uma doença muscular (miogênica) e não uma consequência da degeneração

celular do corno anterior da medula. Além disso, seus estudos histológicos detalhados

permitiram concluir que a membrana muscular ou sarcolema estavam destruídos. Essa

INTRODUÇÃO

40

observação é singularmente importante, pois se sabe que o defeito primário reside no

sarcolema. Entretanto as observações de Meryon foram negligenciadas por anos por várias

razões e a doença acabou sendo associada ao francês Guillaume Benjamin Amand Duchenne,

que detalhou as características clínicas e histológicas alguns anos depois (Emery et al., 2002).

Auxiliando no diagnóstico, W. R. Gowers forneceu informações pertinentes quanto às

características sintomáticas do afetado por essa doença.

Especula-se que a distrofia muscular de Duchenne pode ter afligido o homem desde o

início de sua história. Isto porque existem pinturas egípcias, datadas de 1500 A.C., que

retratam indivíduos com anormalidades físicas, as quais poderiam representar a distrofia

muscular (Poch e Becker, 1955). A primeira descrição clínica da distrofia que se tem

conhecimento, só aparece no início do século XIX, em uma publicação feita por Sir Charles

Bell (1830), (Tabela 6) na qual é descrito um paciente de 18 anos com um quadro clínico

compatível com essa distrofia muscular. Neste período foram relatados vários casos

semelhantes, no entanto, a primeira descrição completa deve ser creditada ao Dr. Edward

Meryon em 1852, que descreveu oito meninos afetados pertencentes a três famílias. Neste

estudo ele conclui que a doença afeta primariamente o tecido muscular e não o sistema

nervoso. Posteriormente, Duchenne em 1868, faz uma revisão mais detalhada, na qual

acrescenta mais doze casos, incluindo meninas (Duchenne, 1868). Assim, a doença foi

denominada distrofia Muscular tipo Duchenne caracterizada por progressiva perda dos

movimentos (inicialmente afetando os membros inferiores e posteriormente os membros

superiores), gradual aumento de tamanho de vários músculos afetados (hipertrofia), aumento

intersticial do tecido conjuntivo em vários músculos afetados (com abundância de fibrose e

tecido adiposo em estágios mais avançados) e início das manifestações clínicas na infância.

Neste período da história ficou evidente que a doença afetava inicialmente o músculo

esquelético e era hereditária. No entanto, nem todos os casos apresentavam as mesmas

características clínicas.

INTRODUÇÃO

41

Em 1884, o neurologista Wilhelm Heinrich Erb, através de seus estudos patológicos

concluiu que a doença era devida a uma degeneração do tecido muscular e chamou-a de

distrofia muscular progressiva, termo que tem sido usado desde então (Erb, 1884). Ele

também foi o primeiro a observar que a doença pertencia a um grupo heterogêneo, realizando

a primeira classificação da doença (Erb, 1891). A partir desse momento muitos pesquisadores

contribuíram para uma classificação das distrofias musculares, tendo como critério o tipo de

musculatura preferencialmente afetada, idade de início dos sintomas clínicos, a progressão e o

tipo de herança.

Tabela 6. Marcos na História da Distrofia Muscular.

Século XIX A DMD é reconhecida clinicamente como doença específica (Bell, 1830; Conte

e Gioja, 1836; Meryon, 1852; Duchenne, 1861 e 1868; Gowers, 1879).

1955 A DMB é reconhecida como uma forma de distrofia muscular distinta da

distrofia muscular ligada ao cromossomo X (Becker e Kiene, 1955).

1959-1960 A enzima creatino quinase (CK) está aumentada nos pacientes (Ebashi et al.,

1959; Dreyfus et al., 1960) e nas mulheres portadoras (Shapira et al., 1960).

1978- 1983 O gene da DMD é mapeado em Xp21 através dos estudos de mulheres com

quadro clínico típico de Duchenne e translocação equilibrada X/autossomo

(Verellen et.al., 1978; Lindenbaum et al., 1979; Zatz et al., 1981) e por

marcadores de DNA (RFLP) (Murray et al., 1982; Davies et AL., 1983).

1983- 1984 É demonstrado que a DMD é alélica à DMB (Kingston et al., 1983; 1984).

1985 Sondas específicas da DMD: PERT (Kunkel et al., 1985) e XJ (Ray et al.,

1985) detectam deleções no gene da DMD (Mônaco et al., 1985).

1987-1988 Clonagem, e sequencimento do cDNA (Koenig et al., 1987; 1988).

Identificação da proteína distrofina (Hoffman et al.,1987).

Localização da distrofina na célula e início dos estudos de sua função (Sugita et

al., 1988; Zubrzycka-Gaarn et al.,1988).

1989-1990 Experimentos de transferência de mioblastos em camundongos (Patridge et al.,

1989) e humanos (Karpati 1990;Law et al., 1990).

1990-1991 Transferência direta do gene em camundongos (Wolff et al.,1990; Dickson et

al., 1991)

1991- 1993 Construção de vetores virais (adenovírus e retrovírus) com o mini gene da

distrofina (Wells et al., 1992; Ragot et al., 1993)

INTRODUÇÃO

42

Essa desordem afeta aproximadamente 1 /3.500 homens (Moser, 1984; Sura et al.,

2008), e este dado de prevalência é similar em todos os grupos étnicos estudados até agora.

É a mais comum e a mais grave das distrofias hereditárias em crianças e sua herança é

recessiva ligada ao cromossomo X (Lin et al., 2009).

O fato de a doença afetar somente meninos incitou os cientistas a iniciarem as

procuras pela localização genética da causa da doença no cromossomo X. Análises

citogenéticas de diversos pacientes permitiram que os pesquisadores encontrassem

anormalidades no braço curto deste cromossomo. A partir destes estudos, testes de

desequilíbrio de ligação confirmaram a localização do gene da distrofina (Kingston et al.,

1984).

O cDNA completo do gene foi clonado em 1987, auxiliando os pesquisadores a

encontrarem as causas desta doença debilitante (Koenig et al., 1987). Após a clonagem do

cDNA, foi possível utilizar regiões do próprio gene como sonda para examinar

especificamente todos os éxons por análise de Southern Blot (Beggs & Kunkel, 1990)

demonstrando que aproximadamente 65% dos pacientes DMD tinham deleções/duplicações

em um ou mais éxons deste gene

A evolução clínica está muito bem estabelecida e é previsível. No primeiro ano de vida

pode não haver qualquer alteração clinicamente aparente, ou mostrar um atraso no

desenvolvimento psicomotor. Os primeiros sintomas iniciam-se na maioria ao redor de 3 a 5

anos de idade, com quedas frequentes. Ao se levantar do chão, a criança o faz com

dificuldade, apoiando-se nos joelhos e coxas (manobra de Gowers, observada na figura 13),

devido à fraqueza dos músculos extensores do joelho e quadril (Emery, 2002). A marcha é do

tipo anserina, com hiperlordose lombar. Há atrofia precoce dos grupos musculares da cintura

pélvica e observa-se um sinal importante de pseudo-hipertrofia dos músculos da panturrilha

(resultado da infiltração do músculo por gordura e tecido conjuntivo), em geral vista desde

cedo no curso da doença. Todos os músculos esqueléticos eventualmente degeneram e a

INTRODUÇÃO

43

maioria dos pacientes é confinada à cadeira de rodas por volta dos 11 anos. A musculatura

cardíaca e respiratória torna-se prejudicada e a morte em geral resulta de insuficiência

respiratória ou cardíaca. A sobrevida além dos 25 anos é incomum e não há tratamento efetivo

para esta doença.

Figura 13. Manobra de Gowers realizada por uma criança com DMD.

(Adaptado de: www.sonderpaed-online.de/behind/progmd/progmd .htm , 07/08/2009)

A falta da proteína distrofina também afeta o cérebro e a retina, apresentando um

espectro grande de anormalidades desde o retardo mental severo, ou sem comprometimento

algum em relação à função intelectual. Com relação à retina, podem ocorrer alterações nas

eletroretinografias ou a visão ser normal (Muntoni, Torelli & Ferlini, 2003).

1.7.1. DIAGNÓSTICO CLÍNICO DA DMD

Boland et al. (1996) observaram que a idade média do diagnóstico de DMD foi de 4,6

anos. A dependência de cadeira de rodas surgiu em média aos 10 anos de idade. Houve

falência do músculo cardíaco em 15% dos pacientes com média de 21,5 anos. Disfunção do

http://www.sonderpaed-online.de/behind/progmd/progmd .htm

INTRODUÇÃO

44

músculo liso do trato urinário ou digestório ocorreu em 6% e 21% dos pacientes

respectivamente, em uma idade média de 15 anos. Nesse estudo a morte dos pacientes ocorreu

em média aos 17 anos.

A característica mais distintiva da DMD é uma distrofia muscular proximal

progressiva e pseudo-hipertrofia das panturrilhas. Os músculos bulbares (extra-oculares) são

poupados, mas o miocárdio é afetado. Há uma maciça elevação dos níveis de creatino quinase

e mudanças miopáticas na eletromiografia. Alterações cardíacas aparecem em alta

porcentagem nos pacientes de DMD por volta dos 6 anos, essas complicações estão presentes

em 95% dos casos nos últimos anos de vida (Kaspar et al., 2009).

Pneumonia associada a problemas cardíacos é a principal causa mortis, que

geralmente acontece no final da primeira década ou início da segunda década de vida. Porém,

com uma maior atenção aos cuidados respiratórios e formas de ventilação assistida (inclusive

traqueostomia) muitos indivíduos afetados vivem muito além disso.

1.7.2. CARACTERIZAÇÃO GENÉTICO-MOLECULAR DA DISTROFIA MUSCULAR

DE DUCHENNE

Até o gene responsável pela DMD ter sido isolado e clonado em 1986, pouco se sabia

sobre o mecanismo responsável pela deterioração muscular nesta doença. A clonagem do

gene e a identificação de seu produto protéico levaram a um grande avanço dos

conhecimentos. O gene DMD tem aproximadamente 2,3 milhões de pares de bases, tornando-

o maior gene conhecido em seres humanos. Contém pelo menos 79 éxons que produzem um

mRNA de 14 kb na isoforma do músculo esquelético. O mRNA é traduzido em uma proteína

final com 3.865 aminoácidos. O grande tamanho do gene DMD ajuda a explicar sua alta taxa

de mutação, cerca de 10-4. Em termos evolutivos, o gene é considerado altamente conservado

quanto à homologia de seqüências, número de éxons e tamanho do locus gênico (Davies et

al., 1983).

INTRODUÇÃO

45

As deleções intragênicas de um ou mais éxons do gene da distrofina, correspondem a

65% das mutações responsáveis pela DMD (den Dunnen et al., 1989). As deleções localizam-

se preferencialmente próximas ao centro do gene (éxons 44-52), e em menor número

próximas à extremidade 5’ do gene da distrofina (éxons 1-16). Esta distribuição não

randômica das deleções, além de facilitar a detecção das mesmas, leva a crer que existam

regiões de quebra preferencial.

Quanto à origem, é provável que as deleções sejam resultantes de recombinação

desigual entre cromátides homólogas (Winter & Pembrey, 1982). No entanto, este mecanismo

geraria o mesmo número de deleções e duplicações, mas como apresenta um número

extraordinariamente maior de deleções, foram sugeridos outros mecanismos responsáveis

pelas deleções, sem originar duplicações concomitantes. Um destes meios é o processamento,

que corresponde a uma perda de éxons na transcrição (Lehrman et al., 1985), 5% do pacientes

com DMD apresentam duplicação parcial do gene (den Dunnen et al., 1987) e em 30% dos

pacientes, que não apresentam deleções ou duplicações detectáveis, estão descritas mutações

de ponto, pequenas deleções, duplicações ou inserções. Até o presente momento sabe-se que

estas mutações estão localizadas ao acaso ao longo do gene da distrofina, sem mostrar um

agrupamento preferencial como acontece com as deleções.

O produto protéico, chamado de distrofina, era desconhecido antes da clonagem do

gene DMD. A distrofina contribui com apenas cerca de 0,002% da massa de proteínas de um

músculo estriado. Embora sua função ainda esteja sendo explorada, ela está provavelmente

envolvida na manutenção da integridade estrutural do citoesqueleto da célula e do sarcolema.

A amina terminal da proteína liga-se à F-actina, uma importante proteína do citoesqueleto. A

carboxila terminal da distrofina liga-se a um complexo de glicoproteínas conhecido como

complexo distroglicana-sarcoglicana (DGC), encontrado na membrana celular e liga-se a

proteínas extracelulares (figura 14). A distrofina liga-se, portanto a estes dois componentes

celulares e tem função importante na manutenção da integridade estrutural da célula muscular.

INTRODUÇÃO

46

Não tendo distrofina funcional, as células musculares dos pacientes com DMD gradualmente

morrem à medida que são estressadas pelas contrações do músculo (Ibraghimov-Beskrovnaya,

Ervast & Leveille, 1992).

Figura 14. Complexo Glicoprotéico. No músculo, a distrofina liga a matriz extracelular ao

citoesqueleto de actina. A distrofina interage com um complexo multimérico composto de

distroglicano (DAG), sacoglicanas, sintrofinas e distrobrevina formando um complexo

glicoprotéico. O complexo α,β-distroglicano é um receptor de laminina e agrinina na matriz

extracelular.

Os estudos sobre a sequência de aminoácidos da proteína distrofina permitiram

evidenciar uma divisão da mesma em quatro domínios (Koening et al., 1988), classificados

como A-D (Koening & Kunkel, 1990). O éxon 1 correspondente ao terminal 5’ e codifica os

11 primeiros aminoácidos da proteína; o domínio A é N-terminal, corresponde aos éxons 2 –

8 (Hamonds, 1987); o domínio B é central, composto de 25 repetições (Koening & Kunkel,

1990), com cerca de 2800 aminoácidos, que provavelmente conferem a forma alongada à

distrofina. A molécula contém ainda quatro segmentos articulares responsáveis pela

flexibilidade da membrana; o domínio C é rico em cisteína, contendo 2 sítios de cálcio (Ca2+),

possui 280 aminoácidos, e o domínio D é terminal, constituído por cerca de 420 aminoácidos

(Koening et al., 1988). Este domínio é responsável por isomorfos da distrofina tecido-

INTRODUÇÃO

47

específicos devido a processamentos alternativos (Feener et al., 1989). A distrofina é

pertencente à superfamília das espectrinas, tem 427 kDa de peso molecular. Possui ainda uma

variedade de isoformas codificadas a partir do mesmo gene, como por exemplo, três

isoformas completas que possuem o mesmo número de éxons, mas são derivadas de três

promotores independentes no cérebro, músculo e neurônios cerebelares de Purkinje (Mehler,

2000; Bies et al., 1992) . Uma isoforma adicional em linfócitos foi também descrita (Nishio et

al., 1994), porém, outros estudos sugeriram que este dado pode representar um artefato,

tornando seu papel funcional duvidoso (Wheway et al., 2003). Além dessas isoformas o gene

da dsitrofina produz diversas outras, geradas através de processamento alternativo e esses

variantes podem se formar pela exclusão de alguns éxons do transcrito primário ou pela

subversão da ordem dos éxons (Surono et al., 1999; Mokri & Engel, 1998).

A distrofina está localizada principalmente no sub-sarcolema (Sugita et al., 1988),

sendo oposta à superfície citoplasmática da membrana. Estudos mostraram que a distrofina

tem ligação muito mais forte com a superfície da membrana do que com o domínio interno

das fibras do músculo esquelético (Zubrzycka et al., 1991). Normalmente, a distrofina está

ausente, ou quase ausente, no músculo de pacientes com DMD.

Quanto à real função da distrofina, estudos indicam que essa proteína localiza e/ou

estabiliza um complexo de proteínas a ela associadas (DAPs) (Yoshida et al., 1993). Na

ausência da distrofina, este complexo não se organiza de modo adequado provocando o

rompimento da ligação matriz extracelular (sub-sarcolema) e, consequentemente, a necrose do

músculo (Ozawa et al., 1995).

1.7.3 ASPECTOS FÍSICO-CLÍNICOS NA DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE

O músculo afetado pela DMD em estágio pré-clínico já apresenta aspectos

histológicos anormais, o que também tem sido verificado em tecidos musculares de fetos

portadores da DMD. Apesar dos sinais patológicos já estarem presentes no feto, e do aumento

INTRODUÇÃO

48

de creatinofosfoquinase poder ser verificado logo após o nascimento, o início dos sinais

clínicos é observado posteriormente.

Os pacientes afetados pela DMD apresentam as seguintes características:

a) Início dos sinais clínicos do final do primeiro ano de vida aos 5 anos de idade;

b) Início da deambulação mais tardio: 50% dos meninos com DMD andam após 18

meses de idade enquanto que apenas 3% dos meninos normais andam após esta

idade;

c) Fraqueza da musculatura dos membros inferiores e da cintura pélvica;

d) Dificuldade em subir escadas e levantar característico do chão conhecido como

manobra de Gowers;

e) Andar basculante;

f) Hipertrofia de panturrilhas;

g) Envolvimento e fraqueza muscular simétricos com progressão ascendente (início

nos membros inferiores evoluindo para os membros superiores);

h) Incapacidade para andar entre 7 e 12 anos, com idade média de 9 anos e meio;

i) Aparecimento de contraturas nos joelhos, pulsos, cotovelos e quadril, (geralmente

após a parada da deambulação), além de deformidade da coluna decorrentes da má

postura;

j) Morte frequentemente causada por insuficiência respiratória crônica e problemas

cardíacos, geralmente antes da terceira década de vida.

1.7.4. ASPECTOS CLÍNICO-LABORATORIAIS

As enzimas creatino quinase e piruvato quinase catalisam a transferência reversível de

um grupamento fosfato para o ADP (difosfato de adenosina) para formar o ATP (trifosfato de

adenosina). Os níveis dessas enzimas estão extremamente elevados (dez a cem vezes) no soro

sanguíneo de pacientes com DMD em relação aos indivíduos normais (Shapira et al., 1960;

1963, Zatz, 1973, Alberts e Samaha, 1974, Dubowitz, 1978; Zatz et al., 1978, Pennington,

1980, Zatz et al., 1991). No entanto, como a doença é progressiva, o nível enzimático decai,

chegando a valores próximos ao normal em estágios tardios da doença. É a explicação para o

nível elevado dessas enzimas na DMD é que estas escapam do músculo para o soro sanguíneo

INTRODUÇÃO

49

devido ao processo de degeneração do tecido muscular. O nível mais baixo em estágios

tardios da doença se dá pela diminuição do tecido muscular e da atividade física.

Um nível extremamente elevado dessas enzimas não ocorre somente na DMD, mas

também em estágios iniciais da DMB (DMB) (Emery & Skinner, 1976), na necrose muscular

aguda e, ocasionalmente, em fases agudas de polimiosite (Thompson, 1971). Níveis

moderadamente elevados podem ocorrer em outras formas de Distrofia do tipo Cinturas.

O nível elevado da enzima CK no soro, além de confirmar o diagnóstico de DMD e

DMB, também detecta cerca de 50 a 70% das portadoras (Zatz et al., 1976; Emery, 1983;

Thompson, 1986).

1.7.5. RETARDO MENTAL NA DMD

O retardo mental (RM) tem sido descrito em 30 a 50% dos afetados pela DMD (Allen

& Rodgin, 1960, Worden & Vignos, 1962; Schorer, 1964; Dubowitz 1965; Zellweger &

Niedermeyer, 1965; Cohen et al., 1968; Desai et al.,1969; Leibowitz & Dubowitz, 1981;

Bortolini et al.,1983). Por outro lado, pacientes com DMB em geral apresentam um quociente

de inteligência (QI) normal (Karagan & Sorensen, 1981; Emery, 1993). A média de QI dos

meninos com DMD é menor do que a média da população.

A diminuição do QI dos pacientes com DMD é geralmente moderada e a maioria das

mães portadoras do gene da DMD apresenta QI normal (Prosser et al.,1969). Entretanto,

Murphy et al, (1965), Bortolini & Zatz (1986) e Zatz et al.(1987) mostraram que o

comprometimento intelectual pode ocorrer em portadoras do gene com manifestações clínicas

e/ou níveis séricos altos de CK.

Wilcox et al. (1986) estudaram dois primos afetados pela DMD que, apesar de

apresentarem, aparentemente, a mesma deleção molecular, eram discordantes quanto ao RM,

sendo um deles gravemente comprometido, enquanto que o outro apresentava um atraso

INTRODUÇÃO

50

intelectual moderado. Os pacientes não manifestavam outras doenças ligadas ao cromossomo

X, além do comprometimento mental e da baixa estatura.

Entretanto, de acordo com Emery (1993), a diminuição do QI na DMD poderia ser um

efeito pleiotrópico do gene mutante. Tal evento é corroborado pelo fato de irmãos normais de

pacientes com DMD terem inteligência normal enquanto que os QIs de irmãos afetados

geralmente se apresentam correlacionados.

Nudel et al. (1989) estudando células de cérebro e músculo de camundongo,

demonstraram que o gene da DMD se expressa de uma maneira específica para cada tecido.

Foram encontrados níveis significantes de RNAm do gene da DMD no cérebro, porém, o

transcrito e a região amino-terminal da proteína traduzida nesse tecido diferem daqueles

observados no músculo. Segundo esses autores, esta observação sugere que dois promotores

diferentes, um cerebral e um muscular, seriam ativados nos diferentes tecidos, produzindo

dois tipos de RNAm. No caso de pacientes com DMD, uma deleção no gene da distrofina

afetaria tanto a distrofina muscular quanto a cerebral, podendo este evento explicar a alta

freqüência de RM na DMD.

Assim, Jorde et al., (2000) observaram que uma forma ligeiramente alterada da

distrofina é normalmente encontrada nas células cerebrais. Sua ausência nos pacientes de

DMD ajuda explicar porque aproximadamente 25% têm quociente intelectual (QI) abaixo de

75. Nas células cerebrais o sítio de início da transcrição fica mais adiante no gene, sendo

usado um promotor diferente. Assim, o mRNA transcrito, e o produto gênico resultante,

diferem do produto gênico encontrado nas células musculares. Um terceiro promotor foi

identificado para os transcritos de DMD expressos nas células de Purkinje cerebelares. Este é

um exemplo de um único gene gerando produtos diferentes como resultados de transcrição

modificada.

INTRODUÇÃO

51

1.7.6. AÇÕES TERAPÊUTICAS

A terapia paliativa vigente para DMD baseia-se na reabilitação, na corticoterapia e na

orientação nutricional e caracteriza-se por assistência multidisciplinar. É de fundamental

importância a prevenção das deformidades ortopédicas e das complicações clínicas que se

acompanham as restrições físicas consequentes da moléstia. A corticoterapia com

prednisolona ou deflazacort (mostra menos efeitos colaterais), está sendo universalmente

empregada com o objetivo de diminuir o ritmo de perda da força muscular, retardar a época

do confinamento à cadeira de rodas, e, portanto a rápida progressão da escoliose (Parreira,

2005).

1.8. DISTROFIA MUSCULAR DE BECKER (DMB)

Outra forma de distrofia clinicamente semelhante à DMD, porém com um

desenvolvimento mais lento, na qual os pacientes sobrevivem frequentemente até meia idade,

foi descrita por Becker & Kiener (1955). Denominada como distrofia muscular tipo Becker,

em consideração ao Dr. Peter Emil Becker, que descreveu a DMB como uma doença clínica e

geneticamente distinta.

A DMB se inicia mais tardiamente, em média aos 11 anos, variando de 2,5 a 21 anos

de idade (England et al., 1990; Beggs et al., 1991). Cerca de 90% dos casos de DMD ficam

confinados a cadeira de rodas antes dos 11 anos de idade, enquanto que 90% dos casos de

DMB ficam confinados após esta idade. Entretanto, existem relatos na literatura de pacientes

que não apresentaram perda da capacidade de locomoção. A DMB é consideravelmente

menos frequente que a DMD, afetando apenas cerca de 1 /18.000 meninos.

Por algum tempo, suspeitou-se que o gene responsável pela DMB estivesse situado

perto do DMD no cromossomo X. Entretanto, não estava claro se as duas doenças eram

causadas por loci distintos ou por mutações diferentes no mesmo locus. A clonagem do gene

INTRODUÇÃO

52

mostrou que as duas doenças são de fato causadas por mutações diferentes no mesmo locus e

representam um exemplo de heterogeneidade alélica. Em geral, ambas as doenças resultam de

deleções (65% dos casos de DMD e 85% dos casos de DMB) ou duplicações (6 a 7% dos

casos de DMD e DMB). Porém, embora a grande maioria das deleções de DMD e duplicações

produzam mudanças de matriz de leitura, a maioria das mutações na DMB são alterações in-

frame (um múltiplo de três bases é deletado ou duplicado). (Kingston et al., 1983, 1984).

As consequências destas mutações diferentes podem ser observadas no produto

gênico. Enquanto a distrofina está ausente em quase todos os pacientes de DMD, ela está

geralmente presente em quantidade reduzida (ou uma forma encurtada da proteína) nos

pacientes de DMB. Assim, a triagem de distrofina pode ajudar a distinguir ambas as doenças

de outras formas de distrofia muscular, pois várias destas formas de membros e cinturas

resultam de mutações em gene que codificam proteínas do complexo distroglicana-

sarcoglicana, enquanto a distrofina parece ser afetada apenas na DMD e DMB.

1.9. RELEVÂNCIA DO PRESENTE ESTUDO

A multiplicidade de tipos de distúrbios e a variabilidade individual nas manifestações

clínicas fazem com que o diagnóstico clínico seja difícil e nem sempre feito corretamente

devido à similaridade sintomática entre doenças de origem genética diferente. Portanto, a

caracterização molecular de cada doença específica no menor tempo possível pode gerar

grandes benefícios, na escolha do tratamento mais adequado, acarretando uma melhora na

qualidade de vida dos pacientes.

Uma das principais dificuldades no diagnóstico das AMEs é diferenciá-las de outras

doenças que cursam um quadro clínico bastante semelhante, com hipotonia e prejuízo no

desenvolvimento motor. Já que a hipotonia muscular no período neonatal pode ser uma

manifestação clínica consequente a vários processos patogênicos, inclusive na Distrofia

Muscular de Duchenne e Distrofia Miotônica.

INTRODUÇÃO

53

O diagnóstico molecular representa mais um exame de escolha para AME devido à

simplicidade da coleta de sangue. No futuro é possível que este tipo de teste venha evitar que

outras crianças com problemas semelhantes sejam submetidas a outros exames que causam

desconforto como a eletroneuromiografia e biópsia muscular.

É importante salientar que embora ainda não exista cura, muitos tratamentos podem

ser utilizados para melhorar a qualidade de vida, tais como a fisioterapia e a ventilação

assistida.

OBJETIVOS

54

22.. OOBBJJEETTIIVVOOSS

2.1. OBJETIVO GERAL

Fazer a análise molecular dos genes relacionados ao desenvolvimento das doenças

neuromusculares degenerativas (DNMD) em crianças na população do Rio de Janeiro.

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Análise epidemiológica dos genes envolvidos com a Distrofia Muscular de Duchenne,

Distrofia Muscular de Becker e Atrofia Muscular Espinhal.

2. Descrição das características clínicas da população em estudo (marcos do

desenvolvimento motor, história familiar, exame físico, exame complementar de

creatinofosfoquinase, eletroneuromiografia e biópsia muscular).

3. Determinação da freqüência de cada uma destas doenças neuromusculares nas diferentes

faixas etárias e de acordo com os primeiros sintomas.

4. Corroborar ou confrontar a suspeita diagnóstica do médico com o resultado do diagnóstico

molecular.

5. Utilizar as características clínicas dos pacientes para construção de um algoritmo e

fluxograma para direcionar o diagnóstico molecular, tornando-o mais eficiente e

econômico.

MATERIAL & MÉTODOS

55

33.. MMAATTEERRIIAALL && MMÉÉTTOODDOOSS

3.1. AVALIAÇÃO DO PROJETO PELO COMITÊ DE ÉTICA EM

PESQUISA

O projeto de pesquisa foi encaminhado para análise pelo Comitê de Ética e Pesquisa

(CEP) da Universidade Federal do Rio de Janeiro. Após sua aprovação (anexo 1), o projeto

foi enviado para avaliação pela Comissão Nacional de Ética em Pesquisa (CONEP), que

também emitiu parecer favorável (anexo 2).

Com a aprovação do projeto de pesquisa, a equipe multidisciplinar do setor de

Neuropediatria do Instituto de Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira (IPPMG) da

Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ) contatou os pacientes cadastrados para uma

revisão clínica. Nesse momento, os pacientes e seus familiares foram informados do estudo e

os que se mostraram interessados assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

(TCLE), autorizando a investigação genética (anexo 3). Novos casos foram sendo convidados

a participar do estudo à medida que eram encaminhados ao Setor de Neuropediatria do

IPPMG/UFRJ e apresentassem os critérios de elegibilidade.

Este Setor de Neuropediatria apresenta um afluxo importante de crianças com doenças

neuromusculares, por poder oferecer o exame de biopsia muscular por imunohistoquímica e

pelo fato de um de seus membros ser referência para atendimentos de crianças com AME e

distrofia muscular pelas associações reginonais e nacionais de portadores destas doenças.

Também houve o convite para que diferentes serviços de neuropediatria do Estado do Rio de

Janeiro, ou encaminhassem os casos suspeitos de doença neuromuscular, ou mediante

contatos pudessem ter os mesmos incluídos no estudo caso apresentassem os critérios de

elegibilidade e os responsáveis assim o autorizassem.

MATERIAL & MÉTODOS

56

3.2. AMOSTRA DE ESTUDO

Para o desenvolvimento do presente estudo, foram utilizadas 117 amostras de sangue

periférico coletados de pacientes acompanhados em diferentes serviços de neuropediatria do

estado do Rio de Janeiro, sendo a sua maioria do Serviço de Neurologia do Instituto de

Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira da Universidade Federal do Rio de Janeiro.

3.2.1. CRITÉRIOS DE INCLUSÃO/ EXCLUSÃO As alterações clínicas necessárias para a inclusão dos pacientes no presente estudo

foram: 1) atraso no desenvolvimento de marcos motores (não sustentar a cabeça após 4 meses,

ou não sentar sem apoio após 7 meses, ou não andar após 15 meses); e 2) queixa de fraqueza

muscular (dificuldade para correr, pular, subir escadas) por um período superior a 3 meses.

Os critérios de exclusão adotados neste estudo basearam-se nos seguintes parâmetros:

1) diagnóstico de neuropatia periférica ou presença de sintomas ou sinais de distúrbios de

sensibilidade; 2) diagnóstico de doença de placa motora ou flutuação dos sintomas sugestiva

de doença de placa motora; e 3) diagnóstico de doença do sistema nervoso central que curse

com paresia muscular crônica (paralisia cerebral, acidente vascular encefálico-AVE, sequela

de traumatismo cranioencefálico-TCE, seqüela de meningoencefalite, esclerose múltipla,

paraparesia espástica, esclerose lateral amiotrófica) ou presença de sinais de acometimento de

sistema nervoso central como sinais piramidais ou extrapiramidais.

3.3. AVALIAÇÃO CLÍNICA

Todos os pacientes com suspeita de doença neuromuscular foram avaliados pela

equipe de neuropediatras, chefiada pela Dra. Alexandra Prufer de Queiroz Campos Araújo,

que selecionaram os participantes com base nos critérios de elegibilidade do presente estudo.

Em seguida, os responsáveis receberam o termo de consentimento livre e esclarecido,

convidando seu (sua) filho (a) a participar da pesquisa e tiveram eventuais dúvidas em relação

MATERIAL & MÉTODOS

57

à mesma, que foram sanadas pelo médico assistente. O médico assistente (neuropediatra)

preencheu o formulário de coleta de dados que continha as principais informações sobre os

sintomas e sinais de seu paciente, algumas informações sobre exames complementares e

dados familiares. Este formulário bem como a cópia do termo de consentimento livre e

esclarecido permaneceu no poder de um dos orientadores, sendo as informações do formulário

repassadas somente ao término da pesquisa.

Ao término da avaliação clínica, os participantes do estudo foram submetidos a

exames bioquímicos necessários para avaliação clínica. Neste momento foram coletados 5 ml

de sangue periférico para a investigação molecular. O material coletado foi enviado a para o

Laboratório de Genética Humana - IOC/ FIOCRUZ, sem que a pesquisadora principal

conhecesse a suspeita clínica. Todas as amostras foram testadas para as doenças relacionadas

ao projeto (AME, DMD / DMB).

3.4. ANÁLISE LABORATORIAL

3.4.1. EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO

A extração e purificação do DNA genômico compreendem várias etapas que incluem a

lise das células, extração de proteínas e do RNA e precipitação do DNA. A extração foi feita a

partir da camada de leucócitos de uma alíquota de aproximadamente 5ml de sangue

periférico, seguindo o protocolo salino descrito por Miller et al., (1998).

Para um volume de 5ml de sangue total, eram adicionados 10ml do tampão de lise de

hemácias (NH4Cl 155mM; KHCO3 10mM; EDTA 1mM, pH 7.4). e após a homogeneização

por inversão, os tubos foram centrifugados a 1.000rpm durante 4 minutos em centrífuga

clínica (Excelsa 2, Modelo 205 – N [FANEM]). Ao término deste período, o sobrenadante foi

descartado e adicionaram-se 5ml de tampão de lise de hemácias ao precipitado (células

nucleadas). O material foi homogeneizado suavemente e centrifugado por mais 4 minutos à

mesma velocidade. Esta etapa foi repetida por uma ou duas vezes, até que ocorresse a lise

MATERIAL & MÉTODOS

58

total das hemácias (precipitado claro). As células brancas purificadas foram ressuspensas em

1ml de tampão de lise de núcleo (Tris-HCl 10mM; NaCl 400mM; EDTA 2mM; pH 8.2). Em

seguida foram adicionados 50μl de dodecil sulfato de sódio 10% e 34μl de proteinase K

(20mg/ml). Após a homogeneização, essa solução foi encubada por 20 horas em banho de

aquecimento a 37°C (Banho-maria, B.M. 60 [TempTherm]). Após a digestão das proteínas, a

cada amostra foram adicionados 400μl de NaCl saturado (5,6M) e o homogeneizado foi

centrifugado por 10 minutos a 5.000 rpm (Excelsa 2, Modelo 205 – N [FANEM]). O

sobrenadante foi transferido para um novo tubo, onde foram acrescentados dois volumes de

etanol absoluto gelado para precipitação das fibras de DNA e após a formação da molécula, o

DNA foi transferido para um microtubo e centrifugado por 4 minutos a 14.000 rpm

(Microcentrifuga 5414C [Eppendorf]). O sobrenadante foi descartado e ao DNA foi

adicionado cerca de 1ml de etanol 75% gelado. Centrifugou-se DNA por igual período.

Posteriormente, descartou-se o sobrenadante e o DNA foi ressuspenso em 500μl de TE 1X

(Tris-HCl 10mM; EDTA 1mM; pH 7.4).

As amostras foram mantidas em banho de aquecimento (banho-maria com circulação,

NT-248 [Nova Técnica]) a 55°C por 30 minutos para a solubilização do DNA. Após essa

etapa, as amostras de DNA foram armazenadas em geladeira, a uma temperatura de 4°C.

3.4.2. ESTIMATIVA DA CONCENTRAÇÃO DE DNA: Para avaliar a quantidade do material extraído e estimar a concentração das amostras

de DNA, estas foram submetidas à eletroforese em gel de agarose 0,8% (GIBCO BRL)

diluída em tampão TBE 1X (Tris 89mM [AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH], ácido

bórico 89 mM [ISOFAR], EDTA 2mM [GIBCO BRL]). No preparo das amostras, 1μl da

alíquota de DNA foi adicionado a 1μl de corante de corrida (azul de bromofenol 0,025%

[SIGMA], xileno-cianol 0,025% [MERK], glicerol 30% [MERK]) e 8μl de água Milli-Q. A

eletroforese foi realizada a 60V por uma hora em cuba horizontal (Horizon 58 – GIBCO

MATERIAL & MÉTODOS

59

BRL), usando-se como tampão de corrida o TBE 1X. O gel foi corado em solução de brometo

de etídeo 10μg/ml (SIGMA) por 10 minutos e visualizado em um transiluminador de luz

ultravioleta (ImagenMaster® VDS – PHARMACIA BIOTECH).

A quantidade de DNA foi estimada através da comparação de sua intensidade com a

de um marcador de peso molecular λ-DNA (GIBCO BRL).

3.4.3. DETERMINAÇÃO MOLECULAR

3.4.3.1. Investigação Molecular do gene SMN

Para a análise dos éxons 7 e 8 do gene SMN foi utilizada a técnica de Nested PCR

(Fallon et al., 1999). Para a primeira fase de PCR, utilizou-se o protocolo de amplificação que

incluiu 10ng de DNA genômico, tampão de reação 1X (10mM Tris-HCl, 50mM KCl

[BIOTOOLS], 1,5mM MgCl2 (BIOTOOLS), 0,2mM de dNTP (1mM de dATP, 1mM de

dTTP, 1mM de dGTP e 1mM de dCTP, [INVITROGEN], 3µM de cada um dos

oligonucleotídeos (tabela 7) e 0,3U de Taq DNA polimerase (BIOTOOLS) em um volume

final de 40µl. As amostras foram processadas no termociclador PTC-100 Programmable

Thermal Controller. As condições de ciclagem estabelecidas incluíram uma desnaturação

inicial a 96ºC por oito minutos, seguida por quatro ciclos com três etapas: desnaturação a

96ºC, por três minutos, pareamento dos oligonucleotídeos a 52ºC, por dois minutos, e

extensão a 72ºC, por um minuto , seguidos por 28 ciclos com tempo de desnaturação

diminuído 1 minuto por ciclo. A extensão final foi conduzida a 72ºC por 5 minutos. Dez

microlitros do produto amplificado foram misturados com 2µl de corante de corrida e

posteriormente submetidos à eletroforese em gel de agarose 1,5%. Os géis foram corados com

brometo de etídio por cinco minutos e os produtos visualizados em transluminador de luz

ultra-violeta ImagenMaster.

MATERIAL & MÉTODOS

60

Tabela 7. Resumo dos oligonucleotídeos utilizados

para análise do gene SMN (1ª fase).

Com a constatação de amplificação da região-alvo, na 1º fase, os produtos de PCR

foram submetidos a uma segunda etapa de amplificação. Nesta fase utilizamos os

oligonucleotídeos descritos por Fallon et al., 1999 que permitiram a amplificação das

sequências genômicas referentes aos éxons 7 e 8 do gene SMN (tabela 8).

Tabela 8. Resumo dos oligonucleotídeos (primers) utilizados para análise do gene SMN (2ª

fase).

Região Alvo Seqência de Oligonucleotídeos Produto

Amplificado (pb)

R111: 5' AGA CTA TCA ACT TAA TTT CTG ATC A 3' Éxon 7

X7DRA: 5' CCT TCC TTC TTT TTG ATT TTG TTT 3' 190

541C960: 5' GTA ATA ACC AAA TGC AAT GTG AA 3' Éxon 8

541C1120: 5' CTA CAA CAC CCT TCT CAC AG 3' 192

As condições de amplificação para o éxon 7 seguiram o seguinte protocolo:

desnaturação inicial a 94°C por 5 minutos, seguido de 33 ciclos com três etapas: desnaturação

a 94°C por um minuto, pareamento dos oligonucleotídeos a 56°C durante um minuto e

extensão a 72°C por um minuto. A extensão final teve duração de 5 minutos a 72°C. Ao

término desta etapa quatro microlitros do produto amplificado foram submetidos à digestão

enzimática com 5U da enzima Dra I por 1 hora a 37ºC, de acordo com as instruções do

Óligos Seqência de Oligonucleotídeos

R111FO 5' AGA CTA TCA ACT TAA TTT CTG ATC 3' X7RO 5' CTT AAT TTA AGG AAT GTG AGC ACC 3' SMX8FO 5' TGG AAT GGG TAA CTC TTC TTG 3' SMX8RO 5' TTG CCA CAT ACG CCT CAC 3' AMXY1 5' CCC CTT TGA AGT GGT ACC AGA G 3' AMXY2 5' ACG GGG ATG ATT TGG TGG TG 3' DYZy1.1 5' TCC ACT TTA TTC CAG GCC TGT 3' DYZy1.2 5' TTG AAT GGA ATG GGA ACG AAT GG 3'

MATERIAL & MÉTODOS

61

fabricante (INVITROGEN). Após a obtenção dos fragmentos de estudo, o produto digerido

foi aplicado em gel de poliacrilamida 12%. Após a eletroforese, os géis foram corados com

brometo de etídio e os perfis de digestão foram visualizados sob luz ultravioleta. As imagens

dos géis foram capturadas pelo sistema ImagenMaster-VDS.

A figura 15 apresenta o gel de poliacrilamida 12%, com padrão de digestão do

fragmento com a enzima Dra I. Nessa figura, a coluna 1 corresponde ao marcador de peso

molecular, a coluna 2 a um indivíduo normal, a coluna 3 mostra a deleção do éxon 7, a coluna

4 é referente ao material não digerido e as colunas 5, 6 e 7 mostram ausência de deleção.

Del (Deleção) ↓

1 2 3 4 5 6 7

Figura 15. Gel de Poliacrilamida 12 %, éxon 7 do gene SMN.

As condições para amplificação do éxon 8 foram: desnaturação inicial a 94°C, por

cinco minutos, seguida de 30 ciclos com três etapas: desnaturação a 94°C por um minuto,

pareamento dos oligonucleotídeos a 59°C por um minuto, extensão por um minuto. Ao

término dos 30 ciclos seguiu-se a extensão final a 72°C durante cinco minutos.

Posteriormente, quatro microlitros do produto amplificado foram submetidos à digestão

enzimática pela enzima Dde I. As condições de digestão enzimática foram as mesmas

MATERIAL & MÉTODOS

62

descritas para o éxon 7. Após a obtenção dos fragmentos de estudo, o produto digerido foi

aplicado em gel de poliacrilamida 12%. Após a eletroforese, os géis foram corados com

brometo de etídio e os perfis de digestão foram visualizados sob luz ultravioleta. As imagens

dos géis foram capturadas pelo sistema ImagenMaster-VDS. A figura 16 apresenta o gel de

poliacrilamida 12% com padrão de digestão do fragmento com enzima Dde I

Del (Deleção) ↓ ↓

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Figura 16. Gel de Poliacrilamida 12 %, éxon 8 do gene SMN.

Na figura 16, a coluna 1 corresponde ao marcador de peso molecular (pBR/Hae III), as

colunas 2, 3 e 4 mostram ausência de deleção do éxon 8, as colunas 5 e 6 mostram presença

de deleção, as colunas 7, 8 e 9 mostram também ausência de deleção do éxon 8 e a coluna 10

é referente ao material não digerido.

3.4.3.2. Investigação Molecular do Gene NAIP

Para a investigação molecular do gene NAIP foram utilizados dois pares de

oligonucleotídeos que permitiram a amplificação diferencial das regiões que compreendem os

éxons 5 e 6 (tabela 9). Os oligonucleotídeos utilizados foram descritos por Roy et al., 1995.

MATERIAL & MÉTODOS

63

Tabela 9. Resumo dos oligonucleotídeos (primers) utilizados para análise do gene NAIP.

Região Alvo Seqência de Oligonucleotídeos Produto Amplificado (pb) 1863: 5' CTC TCA GCC TGC TCT TCA GAT 3'

Éxon 5 1864: 5' AAA GCC TCT GAC GAG AGG ATC 3' 435

1857: 5' CAT TTG GCA TGT TCC TTC CAA G 3'

Éxon 6 1910: 5' TGC CAC TGC CAG GCA ATC TAA 3' 241

As reações de amplificação incluíram 10ng de DNA genômico, tampão de reação 1X

(10mM Tris-HCl, 50mM KCl [BIOTOOLS]); 1,5mM MgCl2 (BIOTOOLS); 0,2mM de dNTP

(1mM dATP, 1mM dTTP, 1mM dGTP e 1mM de dCTP [INVITROGEN]); 1µM de cada

oligonucleotídeo e 0,3U de Taq DNA polimerase (BIOTOOLS) em um volume final de 40µl.

As amostras foram processadas no termociclador PTC-100 Programmable Thermal

Controller. As condições de ciclagem que foram estabelecidas incluíram uma desnaturação

inicial a 94ºC, por cinco minutos, seguida de 30 ciclos com três etapas: desnaturação a 94ºC,

por um minuto, pareamento dos oligonucleotídeos a 60ºC, por um minuto, e extensão a 72ºC,

por um minuto. A extensão final foi conduzida a 72ºC, por 10 minutos. Dez microlitos do

produto da amplificação foram adicionados a 2µl de corante de corrida e posteriormente

submetidos à eletroforese em gel de agarose 2%. Os géis foram corados com brometo de

etídio e os produtos visualizados sobre luz ultravioleta.

A figura 17 apresenta o resultado de uma corrida eletroforética com o padrão de

amplificação dos éxons 5 e 6 investigados.

MATERIAL & MÉTODOS

64

Del (Deleção)

↓ ↓ ↓

11 22 33 44 55 66 77 88

Figura 17. Gel de Agarose 2% do PCR-multiplex para os éxons 5 e 6 do gene NAIP.

Na figura 17, a coluna 1 apresenta o marcador de peso molecular, a coluna 2: o

controle interno, a coluna 3: deleções dos éxons 5 e 6, as colunas 4 e 5: ausência de deleções

nos éxons 5 e 6, a coluna 6: deleções nos éxons 5 e 6, a coluna 7: ausência de deleções e a

coluna 8: deleções nos éxons 5 e 6.

435 pb (éxon 5) controle interno

241 pb (éxon 6)

MATERIAL & MÉTODOS

65

3.4.3.3. Investigação Molecular do Gene da Distrofina

Para a investigação molecular do gene da distrofina foram utilizados dezoito pares de

oligonucleotídeos que permitiram a amplificação diferencial das regiões que compreendem os

éxons listados na tabela 10.

Tabela 10. Resumo dos oligonucleotídeos (primers) utilizados para análise do gene DMD.

(Beggs et al., 1990; Chamberlain et al., 1988).

Região Alvo

Sequência dos Oligonucleotídeos Produto

Amplificado (pb)

1F: 5’ GAA GAT CTA GAC AGT GGA TAC ATA ACA AAT GCA TG 3’ Éxon 1 1R: 5’ TTC TCC GAA GGT AAT TGC CTC CCA GAT CTG AGT CC 3’

535

3F: 5’ TCA TCC ATC ATC TTC GGC AGA TTA A 3’ Éxon 3 3R: 5’ CAG GCG GTA GAG TAT GCC AAA TGA AAA TCA 3’

410

6F: 5’ CCA CAT GTA GGT CAA AAA TGT AAT GAA 3’ Éxon 6 6R: 5’ GTC TCA GTA ATC TTC TTA CCT ATG ACT ATG A 3’

202

13F: 5’ AAT AGG AGT ACC TGA GAT GTA GCA GAA AT 3’ Éxon 13 13R: 5’ CTG ACC TTA AGT TGT TCT TCC AAA GCA G 3’

238

43F: 5’ GAA CAT GTC AAA GTC ACT GGA CTT CAT GG 3’ Éxon 43 43R: 5’ ATA TAT GTG TTA CCT ACC CTT GTC GGT CC 3’

357

47F: 5’ CGT TGT TGC ATT TGT CTG TTT CAG TTA C 3’ Éxon 47 47R: 5’ GTC TAA CCT TTA TCC ACT GGA GAT TTG 3’

181

50F: 5’ CAC CAA ATG GAT TAA GAT GTT CAT GAA T 3’ Éxon 50 50R: 5’ TCT CTC TCA CCC AGT CAT CAC TTC ATA G 3’

271

52F: 5’ AAT GCA GGA TTT GGA ACA GAG GCG TCC 3’ Éxon 52 52R: 5’ TTC GAT CCG TAA TGA TTG TTC TAG CCT C 3’

113

60F: 5’ AGG AGA AAT TGC GCC TCT GAA AGA GAA CG 3’ Éxon 60 60R: 5’ CTG CAG AAG CTT CCA TCT GGT GTT CAG G 3’

139

4F: 5’ TTG TCG GTC TCT GCT GGT CAG TG 3’ Éxon 4 4R: 5’ CCA AGC CCT CAC TCA AAC ATG AAG C 3’

196

8F: 5’ GGC CTC ATT CTC ATG TCT AAT TAG 3’ Éxon 8 8R: 5’ GTC CTT TAC ACA CTT TAC CTG TTG AG 3’

360

12F: 5’ GAT AGT GGG CTT TAC TTA CAT CCT TC 3’ Éxon 12 12R: 5’ GAA AGC ACG CAA CAT AAG ATA CAC CT 3’

331

17F: 5’ GAC TTT CGA TGT TGA GAT TAC TTT CCC 3’ Éxon 17 17R: 5’ AAG CTT GAG ATG CTC TCA CCT TTT CC 3’

416

19F: 5’ GAT GGC AAA AGT GTT GAG AAA AAG TC 3’ Éxon 19 19R: 5’ TTC TAC CAC ATC CCA TTT TCT TCC A 3’

459

44R: 5’ CTT GAT CCA TAT GCT TTT ACC TGC A 3’ Éxon 44 44F: 5’ TTC ATC ACC CTT CAG AAC CTG ATC T 3’

268

45F: 5’ AAA CAT GGA ACA TCC TTG TGG GGA C 3’ Éxon 45 45R: 5’ CAT TCC TAT TAG ATC TGT CGC CCT AC 3’

547

48F: 5’ TTG AAT ACA TTG GTT AAA TCC CAA CAT G 3’ Éxon 48 48R: 5’ CCT GAA TAA AGT CTT CCT TAC CAC AC 3’

506

51F: 5’ GAA ATT GGC TCT TTA GCT TGT GTT TC 3’ Éxon 51 51R: 5’ GGA GAG TAA AGT GAT TGG TGG AAA ATC 3’

388

Para cada reação de amplificação foi preparada uma solução de 50μl contendo: 250 ng

DNA genômico; 200μM de dNTPs; 1μM de cada iniciador; 1X de tampão de PCR (Perkin

MATERIAL & MÉTODOS

66

Elmer), 2,5mM de MgCl2 (Perkin Elmer); e 0.3U de Ampli Taq Gold (Perkin Elmer). Foi

utilizado o termociclador PTC-100 Programmable Thermal Controlleer (Peltier-Effeci

Cycling; Mj Research, Inc.) programado para uma desnaturação inicial de 94°C por 7

minutos, seguido de 25 ciclos de 94°C por 30 segundos, 65°C por 4 minutos, 72°C por 10

minutos e um ciclo final de 4 minutos por 72°C. Dez microlitros dos produtos da PCR foram

misturados com 2µl de corante de corrida e posteriormente submetidos à eletroforese em gel

de agarose 2,5%. A eletroforese ocorreu em cuba horizontal, usando-se como tampão de

corrida TBE 1X. Ao término da corrida eletroforética, o gel foi retirado da cuba e imerso em

solução de brometo de etídeo, por 5 minutos. Após a coloração, o gel foi colocado sob um

transluminador, que permitiu a visualização dos fragmentos obtidos pela PCR. Os géis foram

fotografados pelo sistema ImagenMaster VDS.

A figura 18 apresenta o esquema de amplificação de uma corrida eletroforética dos

éxons 4, 8, 12, 17, 19, 44, 45, 48 e 51 (Chamberlain et al., 1988) e dos éxons 1, 3, 6, 13, 43,

47, 50, 52 e 60 (Beggs et al., 1990) .

Figura 18. Esquema de Amplificação para os éxons analisados em pacientes com DMD ou DMB.

(Beggs et al, 1990 e Chamberlain et al, 1988)

MATERIAL & MÉTODOS

67

Del (Deleção)

↓

Figura 19. Gel de Agarose 2,5% do PCR-Multiplex

(éxons 4, 8, 12, 17, 19, 44, 45, 48, 51) do gene da distrofina.

Na figura 19, a coluna 1 apresenta o marcador de peso molecular (100pb), as colunas

2, 3, 4 e 6 não mostram deleção dos éxons analisados, na coluna 5, os éxons 8 e 12 estão

ausentes (pacientes com DMD/B).

RESULTADOS

68

44.. RREESSUULLTTAADDOOSS 4.1. SEXO E IDADE DOS PRIMEIROS SINTOMAS

Os resultados provenientes das avaliações clínicas e moleculares, realizadas nos

pacientes estão sumarizados nas tabelas a seguir. Todos os dados foram analisados, utilizando

o programa estatístico SPSS (Statistical Package for the Social Sciences, versão 12.0) que

permite ao usuário contagens de freqüência, ordenar dados, reorganizar a informação e serve

também como um mecanismo de entrada dos dados, com rótulos para pequenas entradas.

No nosso trabalho foram analisados 117 pacientes, sendo 33 do sexo feminino, 82 do

sexo masculino e 2 sem informação sobre sexo (identificados apenas pelo nome da mãe) .

Todos os pacientes com suspeita clínica de DMD ou DMB são do sexo masculino e a maioria

deles apresentou o início dos sintomas na última faixa etária da tabela (acima de 12 meses).

Já a maioria dos pacientes com suspeita clínica de AME apresentou o início dos sintomas

mais precocemente (primeira faixa etária), sendo estes de ambos os sexos (tabela 11).

Tabela 11. Sexo, Suspeita Clínica e Idade dos Primeiros Sintomas em Todos os Pacientes.

0-6 meses 7-12 meses acima de 12 Sem InformaçãoNão determinado 0 0 0 12 12AME 13 1 4 0 18MC 1 0 0 0 1AME ou DM 1 0 0 0 1Sem Informação 0 0 0 1 1Total 15 1 4 13 33Não determinado 0 0 0 12 12DMD 3 6 28 0 37DMB 0 0 3 0 3AME 9 1 6 0 16MC 2 1 0 0 3DMD ou B 0 0 7 0 7DMD ou AME 0 0 1 0 1AME ou DM 1 0 0 0 1AME ou DC 0 0 1 0 1Sem Informação 0 0 0 1 1Total 15 8 46 13 82

Sem Informação 0 0 0 2 2Total 30 9 50 28 117

* AME: Atrofia muscular espinhal/ MC: Miopatia congênita; DM: Distrofia miotônica; DMD: Distrofia muscular de Duchenne; DMB: Distrofia muscular de Becker; DC: Distrofia de cinturas

Suspeita Clínica*

Feminino

Masculino

TotalSexo Idade dos Primeiros Sintomas

RESULTADOS

69

Os 117 pacientes foram submetidos ao diagnóstico molecular para Distrofia Muscular

de Duchenne ou Becker e Atrofia Muscular Espinhal; por tal razão, na tabela 12, foi elaborada

com base aos 74 pacientes com suspeita clínica de DMD, DMB e AME. Reforçando o que

mostrou a tabela 11, todos os pacientes com suspeita de DMD ou DMB são do sexo

masculino, um resultado sem surpresas devido ao tipo de herança (ligada ao X) dessas

doenças. Já em relação à AME não foi obseravada nenhuma diferença estatística significativa

em relação ao sexo (χ2 = 0,117; p = 0,53).

Tabela 12. Suspeita Clínica e Sexo nos Pacientes com Suspeita Clínica de DMD/B e AME.

Suspeita Clínica Sexo DMD DMB AME

Total

Feminino 0 0 18 18

Masculino 37 3 16 56

Total 37 3 34 74

Qui-quadrado: 27,98 gl (graus de liberdade): 2 p: 0,000

Podemos observar na tabela 13, que a maioria dos pacientes com suspeita clínica de

AME, apresentou o início dos sintomas mais cedo, o que reforça a característica do grupo, já

os pacientes com suspeita clínica de DMD ou DMB, em geral, apresentam os primeiros

sintomas mais tardiamente.

Tabela 13. Idade dos Primeiros Sintomas em Pacientes com Suspeita Clínica de DMD/B e AME.

Suspeita Clínica Idade Primeiros Sintomas DMD DMB AME

Total

0-6 meses 3 0 22 25 7-12 meses 6 0 2 8

Acima de 12 28 3 10 41 Total 37 3 34 74

Qui-Quadrado: 27,91 gl: 4 p: 0,000

RESULTADOS

70

4.2. PSEUDO-HIPERTROFIA E MOVIMENTOS INTRAUTERINOS

Dos 117 pacientes analisados, 40 apresentaram pseudo-hipertrofia das panturrilhas,

sendo destes, 39 com suspeita clínica de DMD ou DMB, enquanto que outros 7 suspeitos de

DMD e os 34 pacientes suspeitos de AME não apresentaram essa característica (tabelas 14 e

15).

Tabela 14. Histórico de Pseudo-Hipertrofia nos Pacientes Analisados.

Pseudo-hipertrofia Suspeita Clínica

Não Sim Sem Informação

Total

Não Determinado 0 0 26 26 DMD 7 30 0 37 DMB 0 3 0 3 AME 34 0 0 34 MC 3 1 0 4 DMD-B 1 6 0 7 DMD-AME 1 0 0 1 AME-DM 2 0 0 2 AME-DC 1 0 0 1 Sem Informação 0 0 2 2 Total 49 40 28 117

Tabela 15. Histórico de Pseudo-Hipertrofia em Pacientes com Suspeita

Clínica de DMD ou DMB e AME.

Suspeita Clínica Pseudo Hipertrofia DMD DMB DMD ou

DMB AME Total

Sim 30 3 6 0 39 Não 7 0 0 34 41

Total 37 3 6 34 80

Qui-Quadrado 57,28 gl: 3 p: 0,000

Apenas 4 pacientes relataram ausência de movimentos-intra-uterinos, essa

característica é mais marcante em pacientes com Atrofia Muscular Espinhal do tipo I, 35

RESULTADOS

71

pacientes não souberam responder essa informação e 78 confirmaram a presença dos

movimentos (tabela 16).

Tabela 16. Suspeita Clínica e Movimentos Intra-Uterinos.

Movimentos Intra-Uterinos Suspeita Clínica


Total


4.3. MARCOS MOTORES

Todos os pacientes que não sustentaram a cabeça no tempo proposto pelo médico

especialista (4 meses) foram diagnosticados clinicamente com atrofia muscular espinhal. Dos

117 pacientes, 49 pacientes sustentaram a cabeça no tempo correspondente para este marco

(tabelas 17 e 18).

Tabela 17. Suspeita Clínica e o Marco Motor: Sustentar a Cabeça.

Sustentar a Cabeça Suspeita Clínica


Total

Não determinado 0 0 26 26 DMD 0 23 14 37 DMB 0 3 0 3 AME 9 16 9 34 MC 0 3 1 4 DMD-B 0 3 4 7 DMD-AME 0 1 0 1 AME-DM 2 0 0 2 AME-DC 0 0 1 1 Sem Informação 0 0 2 2 Total 11 49 57 117

RESULTADOS

72

Tabela 18. Marco Motor: Sustentar a Cabeça em Pacientes

com Suspeita Clínica de DMD ou DMB e AME.

Suspeita Clínica Sustentar a Cabeça DMD DMB AME

Total

Sim 23 3 16 42 Não 0 0 9 9

Total 23 3 25 51


Todos os pacientes que não sentaram no tempo normal (7 meses) foram

diagnosticados clinicamente com atrofia muscular espinhal. Dos 117 pacientes, 58 pacientes

sentaram no tempo correspondente para este marco, esses dados sugerem que os pacientes

com suspeita clínica de DMD ou DMB, apresentam os marcos motores no tempo correto,

mostrando que na AME o aparecimento dos sintomas é mais precoce (tabelas 19 e 20).

Tabela 19. Suspeita Clínica e o Marco Motor: Sentar.

Sentar Suspeita Clínica


Total

Não Determinado 0 0 26 26 DMD 0 27 10 37 DMB 0 3 0 3 AME 13 18 3 34 MC 0 3 1 4

DMD-B 0 5 2 7 DMD-AME 0 1 0 1 AME-DM 2 0 0 2 AME-DC 0 1 0 1

Sem Informação 0 0 2 2 Total 15 58 44 117

Tabela 20. Marco Motor: Sentar em Pacientes com Suspeita Clínica de DMD ou DMB e AME.

Suspeita Clínica Sentar DMD DMB AME

Total

Sim 27 3 18 48 Não 0 0 13 13

Total 27 3 31 61


RESULTADOS

73

Como pode ser observado nas tabelas 21 e 22, a grande maioria dos pacientes com

suspeita clínica de atrofia muscular espinhal não ficou em pé no prazo correspondente para

este marco motor (72%) diferentemente do que ocorre na DMD ou na DMB (4,5%).

Tabela 21. Suspeita Clínica e o Marco Motor: Ficar em Pé.

Ficar em pé Suspeita Clínica


Total


Tabela 22. Marco Motor: Ficar em Pé em Pacientes

com Suspeita Clínica de DMD ou DMB e AME.

Suspeita Clínica Ficar em pé DMD DMB AME

Total

Sim 19 3 8 22 Não 1 0 21 30

Total 20 3 29 52


Nas tabelas 23 e 24 observamos que a grande maioria dos pacientes com suspeita

clínica de atrofia muscular espinhal não andou antes dos 14 meses, tempo considerado normal

para esta característica (de acordo com a escala de Denver II, anexo 5).

RESULTADOS

74

Tabela 23. Suspeita Clínica e o Marco Motor: Andar antes dos 14 meses.

Andar Suspeita Clínica


Total


Tabela 24. Marco Motor: Andar em Pacientes

com Suspeita Clínica de DMD/B e AME.

Suspeita Clínica Andar DMD DMB AME

Total

Sim 31 3 10 44 Não 2 0 23 25

Total 33 3 33 69


4.4. HISTÓRICO FAMILIAR E CONSANGUINIDADE

Dentro de uma mesma família, é muito comum a concordância do quadro clínico

particularmente na AME I e tem sido relatada similaridade de quadro clínico entre gêmeos

monozigóticos (Brandt, 1950; Leyrer, 1954; Marquardt et al., 1962; Zellweger et al., 1969).

RESULTADOS

75

Tabela 25. Suspeita Clínica e História Familiar.

História Familiar Suspeita Clínica


Total


Nos casamentos consangüíneos há uma probabilidade maior de nascerem filhos com

caráter recessivo, pois indivíduos aparentados têm maior probabilidade do que os não

parentes, de serem heterozigotos para o mesmo gene mutante. Desta forma, há uma proporção

maior de casamentos consangüíneos entre os progenitores de afetados por um caráter

recessivo, do que entre progenitores de pessoas normais (McKusick, 1971). Como o principal

objetivo do presente trabalho era utilizar características que ajudavam na diferenciação da

DMD/B e AME, a consanguinidade e a história familiar (tabelas 25 e 26), não foram

utilizadas nessa diferenciação, e sim na avaliação individual de cada doença. Observamos 7

crianças nascidas de casamentos consanguíneos, 5 dos quais com suspeita clínica de AME.

Tabela 26. Suspeita Clínica e Consangüinidade.

Consangüinidade Suspeita Clínica


Total


RESULTADOS

76

Como era de se esperar a presença de atrofia é uma característica mais evidente em

pacientes com suspeita clínica de AME (tabelas 27 e 28)

.

Tabela 27. Suspeita Clínica e Atrofia.

Atrofia Suspeita Clínica


Total


Tabela 28. Histórico de Atrofia em Pacientes com Suspeita Clínica de DMD/B e AME.

Suspeita Clínica Atrofia DMD DMB AME

Total

Sim 5 0 20 47 Não 32 3 12 25

Total 37 3 32 72


4.5. AUSÊNCIA DE TONUS MUSCULAR E DE REFLEXOS

O tônus muscular é um estado de tensão permanente do músculo estriado, mesmo quando

em repouso, ou seja, é a resistência encontrada ao movimento passivo dos membros. Essa

característica de ausência de tonus foi mais presente em pacientes com suspeita de DMD

(tabelas 29 e 30).

RESULTADOS

77

Tabela 29. Suspeita Clínica e Tonus Muscular.

Tônus Muscular Suspeita Clínica


Total


Tabela 30. Observação de Tônus Muscular em Pacientes

com Suspeita Clínica de DMD/B e AME.

Suspeita Clínica Tonus Muscular DMD DMB AME

Total

Sim 25 3 30 58 Não 12 0 4 16

Total 37 3 34 74


Nos dois grupos (suspeita clínica de DMD/B e AME) foram observados alterações nos

reflexos, no entanto a hiporreflexia se mostrou mais característico nos pacientes com DMD/ B

enquanto que a ausência de reflexos (arreflexia) é mais comum nos pacientes com AME

(tabelas 31 e 32).

RESULTADOS

78

Tabela 31. Suspeita Clínica e Reflexos.

Reflexos Suspeita Clínica

Normal Hiporreflexia Arreflexia Sem Informação

Total

Não Determinado 0 0 0 26 26 DMD 0 26 9 2 37 DMB 0 2 1 0 3 AME 1 7 24 2 34 MC 0 2 2 0 4

DMD-B 0 2 5 0 7 DMD-AME 0 0 1 0 1 AME-DM 0 0 2 0 2 AME-DC 0 0 0 1 1

Sem Informação 0 0 0 2 2 Total 1 39 44 33 117

Tabela 32. Observação dos Reflexos em Pacientes com Suspeita Clínica de DMD/B e AME.

Suspeita Clínica Reflexos DMD DMB AME

Total

Normal 0 0 1 1 Hiporreflexia 26 2 7 35 Arreflexia 9 1 25 35 Total 35 3 33 71


RESULTADOS

79

4.6. FASCICULAÇÕES

As fasciculações são contrações visíveis, finas e rápidas, algumas vezes vermiculares,

espontâneas e intermitentes das fibras musculares. Estas são frequentemente observadas no

grupo de pacientes com suspeita clínica de AME (tabelas 33 e 34).

Tabela 33. Suspeita Clínica e Fasciculações.

Fasciculações Suspeita Clínica


Total


Tabela 34. Observação de Fasciculações em Pacientes com Suspeita Clínica de DMD/B e AME.

Suspeita Clínica Fasciculações DMD DMB AME

Total

Não 37 3 17 57 Sim 0 0 17 17

Total 37 3 34 74

Qui-Quadrado 25,96 gl: 2 p: 0

RESULTADOS

80

4.7. MIOTONIA

A miotonia se caracteriza pela falência prolongada do relaxamento muscular após

contração. Essa característica clínica não foi observada em nenhum dos grupos (tabela 35).

Em geral a miotonia está presente nos pacientes com Distrofia Miotônica Steinert.

Tabela 35. Observação de Miotonia em Todos os Pacientes Analisados.

Miotonia Suspeita Clínica

Não Sem Informação

Total

Não Determinado 0 26 26 DMD 37 0 37 DMB 3 0 3 AME 34 0 34 MC 4 0 4 DMD-B 7 0 7 DMD-AME 1 0 1 AME-DM 2 0 2 AME-DC 1 0 1 Sem Informação 0 2 2 Total 89 28 117

4.8. ALTERAÇÕES NOS NERVOS CRANIANOS

O processamento neural da informação sensitiva (percepção) possibilita a experiência

consciente dos objetos e acontecimentos do mundo externo. É possível examinar a função dos

12 pares de nervos cranianos com um simples exame neurológico. Um nervo craniano pode

ser afetado em qualquer ponto de seu trajeto em decorrência de lesões tumorais, infecções,

processos inflamatórios, traumatismos ou mesmo doenças degenerativas. Por essa razão, é

necessário que seja determinada com exatidão o sítio da lesão. Na nossa casuística apenas

dois pacientes com suspeita clínica de atrofia muscular espinhal apresentaram alterações de

nervos cranianos (tabela 36).

RESULTADOS

81

Tabela 36. Observação de Alterações de Nervos Cranianos em

Todos os Pacientes Analisados.

Alterações de Nervos Cranianos Suspeita Clínica


Total


4.9. A ELETRONEUROMIOGRAFIA A eletroneuromiografia é um exame diagnóstico da função dos nervos e músculos. O perfil

miopático se mostrou comum nos pacientes com DMD e o neurogênico nos pacientes com AME, já

que no primeiro o comprometimento é muscular e no segundo no neurônio motor (tabelas 36 e 37).

Tabela 37. Eletroneuromiografia nos Pacientes Analisados.

ENMG Suspeita Clínica Normal Miopático Neurogênico Sem

Informação Total

DMD 1 10 0 26 37 DMB 0 0 0 3 3 AME 3 3 6 22 34 MC 0 3 0 1 4 DMD-B 0 2 0 5 7 DMD-AME 0 0 1 0 1 AME-DM 0 0 0 2 2 AME-DC 0 1 0 0 1 Sem Informação 0 0 0 2 2 Total 4 19 7 61 91

Tabela 38. Eletroneuromiografia em Pacientes com Suspeita Clínica de DMD/B e AME.

Suspeita Clínica ENMG DMD AME

Total

Normal 1 3 4 Miopática 10 3 13 Neurogênica 0 6 6 Total 11 12 23


RESULTADOS

82

4.10. TESTES MOLECULARES

Foram confirmados pelo diagnóstico molecular 31 pacientes com Atrofia Muscular Espinhal.

Tabela 39. Pacientes com AME confirmados pelo

diagnóstico Molecular, distribuídos por sexo.

Sexo Número de Pacientes (AME)

Feminino 20

Masculino 10

Não Determinado 1

Total 31

Foram confirmados pelo diagnóstico molecular 39 pacientes com Distrofia Muscular de

Duchenne/ Becker (tabela 40).

Tabela 40. Pacientes com DMD/B confirmados pelo

diagnóstico Molecular, distribuídos por sexo.

Sexo Número de Pacientes (DMD)

Feminino 0

Masculino 39

Não Determinado 0

Total 39

No gráfico 1 pode ser observado que 13 dos 48 pacientes com suspeita clínica de Distrofia

Muscular de Duchenne/ Becker não foram confirmados pelo diagnóstico molecular. Além disso, esse

gráfico mostra a distribuição de pacientes de acordo com o número de éxons ausentes. No gráfico 2

podemos observar um panorama de distribuição dos éxons ausentes nos pacientes que apresentaram

confirmação pelo diagnóstico molecular de Distrofia Muscular de Duchenne/ Becker. No que se refere

RESULTADOS

83

à distribuição, onde se observou a maior frequência de deleções foram nos éxons 48, 45 e 52,

respectivamente.

Distribuição DMD/B x Número de Deleções

13

45

11

5 5

2 21

0

2

4

6

8

10

12

14

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Número de deleções

Gráfico 1. Distribuição DMD/B x Número de Deleções.

RESULTADOS

84

Distribuição de DMD/B x Exon Deletado

1012

1

96 6

3 35

75

15

3

20

1210

13

10

5

10

15

20

25

Exon 01

Exon 03

Exon 04

Exon 06

Exon 08

Exon 12

Exon 13

Exon 17

Exon 19

Exon 43

Exon 44

Exon 45

Exon 47

Exon 48

Exon 50

Exon 51

Exon 52

Exon 60

Gráfico 2. Distribuição de DMD/B x Exon Deletado.

RESULTADOS

85

No gráfico 3 podemos observar que 18 dos 36 pacientes com suspeita clínica de Atrofia

Muscular Espinhal apresentaram diagnóstico molecular confirmado para essa patologia. Além disso,

mostra a combinação dos éxons 7 e 8 do gene SMN e dos éxons 5 e 6 do gene NAIP nos pacientes. A

combinação de deleção dos éxons 7 e 8 é a mais frequente entre os pacientes, isso corrobora com

dados da literatura que mostram que o gene SMN é determinante para essa doença.

Distribuição dos Pacientes x Haplótipos

18

1 1 2 1

12

1

02468

101214161820

0000 0011 0100 1000 1011 1100 1111Combinação Haplotípica*

Gráfico 3. Combinação Haplotípica dos Pacientes com Suspeita Clínica com AME.

[*Primeira Posição do Haplótipo - Del no éxon 7 de SMN; Segunda Posição do Haplótipo - Del

no éxon 8 de SMN; Terceira Posição do Haplótipo - Del no éxon 5 de NAIP; Quarta Posição do

Haplótipo - Del no éxon 6 de NAIP ( 0 = Ausência da Deleção; 1 = Presença da Deleção)]

Dentre os 36 indivíduos clinicamente suspeitos de apresentar Atrofia Muscular Espinhal, 18

foram confirmados molecularmente, dentre estes observamos que 66% apresentam deleções em ambos

os éxons 7 e 8 do gene SMN (Gráfico 4).

RESULTADOS

86

Distribuição de AME x Combinações de deleções

5,56 5,5611,11

5,56

66,67

5,56

0

10

20

30

40

50

60

70

0011 0100 1000 1011 1100 1111

Gráfico 4. Frequência das Combinações dos Éxos Deletados em Pacientes com AME.

No presente trabalho, todos os pacientes com suspeita de doença neuromuscular foram

avaliados pela equipe de neuropediatras, que selecionaram os participantes com base nos

critérios de elegibilidade do estudo. O material coletado foi enviado a para o Laboratório de

Genética Humana - IOC/ FIOCRUZ, sem indicação da suspeita clínica, com isso todos os

pacientes foram testados para DMD/B e AME. A partir desse estudo, com o intuito de

direcionar o diagnóstico molecular, tornando-o mais eficiente e econômico, formulamos um

algoritmo, um fluxograma e um programa computacional, usando as características clínicas

analisadas e apresentadas nas tabelas anteriores. Desta forma, essa ferramenta poderá ser para

utilizada pelos especialistas, proporcionando ao paciente um diagnóstico mais rápido.

RESULTADOS

87

4.11. DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL ENTRE DISTROFIAS E ATROFIAS

Um algoritmo é uma sequência finita de instruções bem definidas e não ambíguas,

cada uma das quais pode ser executada mecanicamente num período de tempo finito e com

uma quantidade de esforço finita. Um algoritmo não representa, necessariamente, um

programa de computador, e sim os passos necessários para realizar uma tarefa. Sua

implementação pode ser feita por um computador ou mesmo por um ser humano. Diferentes

algoritmos podem realizar a mesma tarefa usando um conjunto diferenciado de instruções em

mais ou menos tempo, espaço ou esforço do que outros. Tal diferença pode ser reflexo da

complexidade computacional aplicada, que depende de estruturas de dados adequadas ao

algoritmo.

4.11.1. ALGORITMO “DISAME”

1. Faça SA = 0 SA = (Somatório AME)

2. Faça SD = 0 SD = (Somatório DMD/B)

3. Sexo: Se feminino, faça SA = SA + 1 e continue

4. Se apresenta Pseudo-Hipertrofia, faça SD = SD + 1

5. Se CK > 10 x Normal, faça SD = SD + 1 e continue

6. Se apresenta Hipotonia, faça SA = SA + 1 e continue

7. Se a idade dos Primeiros sintomas é < 6 meses, faça SA = SA + 1 e continue

8. Se sustenta a cabeça, faça SD = SD + 1 e continue

9. Se tiver atrofia, faça SA = SA + 1 e continue

10. Se apresenta fasciculações, faça SD = SD + 1 e continue

11. Se apresentar ENMG Normal ou não tiver informação, vá para 13

12. Se apresentar ENMG Neurogênico, faça SA = SA + 1 e continue

13. Se tiver reflexos normais ou não tiver informação vá para 15

http://pt.wikipedia.org/wiki/Instru%C3%A7%C3%A3o

http://pt.wikipedia.org/wiki/Programa_de_computador

http://pt.wikipedia.org/wiki/Computador

http://pt.wikipedia.org/wiki/Complexidade_computacional

http://pt.wikipedia.org/wiki/Estrutura

RESULTADOS

88

14. Se apresenta Hiporeflexia, faça SD = SD + 1 e continue

15. Se apresenta problemas relacionados a nervos craniais, faça SA = SA + 1 e

continue

16. Se não apresentou Movimentos Intra-Uterinos durante a gravidez, faça SA = SA +

1 e continue

17. Se não sentou a tempo, faça SA = SA + 1 e continue

18. Se não ficou em pé, faça SA = SA + 1 e continue

19. Se andou, faça SD =SD +1 e continue

20. Se SD < SA, vá para 23

21. Testar para DMD/B

22. Se DMD/B (+) vá para 26

23. Testar para AME

24. Se AME (+) vá para laudo

25. Testar outras doenças

26. Emitir laudo

27. Fim

Baseado neste algoritmo foi elaborado o fluxograma que é um tipo de diagrama e pode

ser entendido como uma representação esquemática de um processo, muitas vezes feito

através de gráficos que ilustram de forma descomplicada a transição de informações entre os

elementos que o compõem. Podemos entendê-lo, na prática, como a documentação dos passos

necessários para a execução de um processo qualquer. A construção desse fluxograma tem

como objetivo principal facilitar a escolha do diagnóstico molecular a ser realizado, visando a

otimização do tempo e menor gasto de recursos.

http://pt.wikipedia.org/wiki/Diagrama

http://pt.wikipedia.org/wiki/Processo

RESULTADOS

89

Avaliação preliminar do Paciente

SEXO FEMININO ?

Recebimento das informações do

paciente

PSEUDOHIPERTROFIA ?

SA = SA + 1

S

SA = 0SD = 0

SD = SD + 1

CK > 10 X SD = SD + 1

HIPOTONIA ? SA = SA + 1

ID 1º SINTOMAS< 6 MESES SA = SA + 1

SUSTENTACABEÇA ? SD = SD + 1

ATROFIA ? SA = SA + 1

FASCIC ? SD = SD + 1

ENMGANORMAL ?

REFLEXOANORMAL ?

HIPOREFLEX ? SD = SD + 1

PROB NERVCRAN SA = SA + 1

MOV INTRAUTER ? SA = SA + 1

Ñ SENTOUA TEMPO ? SA = SA + 1

FICOU EM PÉA TEMPO ? SA = SA + 1

ANDOU ? SD = SD + 1

SA = SA + 1

C

SD < SA TESTAR AME

AMEPOSITIVO ?

TESTAR OUTROS

LAUDO

FIM

TESTAR DMD / B

DMD / BPOSITIVO ?

TESTAR OUTROS

N

S

S

S

S

S

S

S

N

N

N

N

N

N

N

N

N

S

S

S

S

S

S

S

S

N

N

N

N

N

N

N

N

N

S

S

S

Legenda:

SA = somatório AME, SD = somatório DMD/B, S = sim, N = não, CK = creatino quinase, ID = idade,

Fascic = fasciculações, ENMG = eletroneuromiografia, Hiporeflex = hiporreflexia, Prob Nerv Cran =

problemas nos nervos cranianos, Mov Intra Uter = movimentos intra-uterinos.

DISCUSSÃO

90

55.. DDIISSCCUUSSSSÃÃOO

Os aspectos clínicos utilizados para estabelecer o diagnóstico diferencial de doenças

neuromusculares, bem como entre estas e as causas de hipotonia muscular, em um grupo de

117 pacientes serviram como base para a formulação de um algoritmo e um programa

computacional que permitiria ao médico especialista ter uma ferramenta que facilite a escolha

do teste molecular adequado. A ênfase deste trabalho está voltada para o diagnóstico

diferencial através de técnicas de Biologia Molecular, inicialmente para Distrofia Muscular de

Duchenne/Becker e Atrofia Muscular Espinhal e posteriormente deverá ser estendido para

outras doenças neuromusculares, observamos que quanto maior o número de evidências

clínicas coletadas pelo especialista, melhor será a escolha de qual doença deve ser testada

primeiramente.

O diagnóstico definitivo proporcionado pelo teste molecular visa minimizar o tempo, o

custo e principalmente determinar quais os procedimentos ou tratamento mais adequados para

o paciente.

Na década passada, inúmeros avanços na área da genética molecular vieram facilitar o

diagnóstico e o aconselhamento genético, incluindo técnicas de diagnóstico fetal. Espera-se

que tais avanços contribuam para a implantação de técnicas de terapia gênica, aparentemente

a única perspectiva de tratamento para parte das doenças neuromusculares hereditárias da

infância. Até o presente momento estas doenças vêm sendo tratadas com métodos paliativos

de reabilitação motora e cirurgias ortopédicas corretivas para deformidades esqueléticas.

Ainda assim, o diagnóstico precoce traz grandes benefícios para os pacientes, pois os mesmos

podem fazer tratamentos específicos que retardam o progresso da patologia e

consequentemente melhora a qualidade de vida.

Nas crianças, a maior parte das afecções neuromusculares é geneticamente

determinada, sendo as mais comuns, a Distrofia Muscular de Duchenne, a Atrofia Muscular

DISCUSSÃO

91

Espinhal, a Distrofia Muscular Congênita, a Distrofia Miotônica de Steinert, e as Miopatias

Congênitas, estruturais ou não estruturais (Reed, 2002). No presente trabalho estudamos a

Distrofia Muscular de Duchenne/Becker e Atrofia Muscular Espinhal (as mais frequentes em

crianças que procuram o IPPMG) por uma necessidade apontada pela equipe de neurologia do

Instituto de Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira, em função de sua maior prevalência.

A idade e a forma de instalação das manifestações clínicas são fatores importantes no

diagnóstico diferencial entre as doenças neuromusculares das crianças. Essa informação é

corroborada por nossos dados, onde foi observado que em pacientes com Distrofia Muscular

de Duchenne o início dos sintomas começou depois do que os dos pacientes com Atrofia

Muscular Espinhal. Além de possibilitar o diagnóstico diferencial, a idade dos primeiros

sintomas, associada a outras características podem distinguir as diferentes formas da mesma

doença, como ocorre com a AME.

No recém-nascido, observa-se essencialmente a síndrome da criança hipotônica, que

compreende dois grupos semiológicos: o decorrente do acometimento primário da unidade

motora (doenças neuromusculares), e o decorrente de afecções do sistema nervoso central, ou

de causas sistêmicas não-neurológicas. No primeiro grupo, a hipotonia muscular, associa-se a

déficit motor e a hiporreflexia ou ausência dos reflexos profundos, entretanto permanecendo

em um estado de alerta normal. No segundo grupo frequentemente observa-se um grau de

alerta precário, resposta pobre a estímulos auditivos e visuais, sucção e deglutição não

coordenadas, crises epilépticas, ou ainda antecedentes pré e perinatais que sugerem

sofrimento cerebral. Tanto os pacientes com DMD e AME, fazem parte do primeiro grupo e a

hipotonia, em geral, é uma característica presente, assim como reflexos anormais; porém a

grande maioria dos pacientes com DMD/B apresenta hiporreflexia, enquanto que a maioria

dos pacientes com AME tem como característica a arreflexia, ou seja, ausência de reflexos.

Todas essas manifestações devem ser abordadas para que o fluxograma se aproxime da

realidade, ou seja, a construção consciente dessa ferramenta, certamente ajudará na melhor

DISCUSSÃO

92

escolha do teste molecular. Vale à pena ressaltar que a mesma doença pode ter uma grande

variabilidade de manifestações, mas de um modo geral, existem evidências que são bem

peculiares de cada patologia, por isso se faz necessário a análise de um conjunto de

características clínicas.

Dependendo do tipo de doença neuromuscular, além da hipotonia e o retardo ou não

aquisição das etapas do desenvolvimento motor, algumas crianças podem apresentar ainda,

falta de resistência a movimentação passiva, além da dificuldade para sugar e deglutir, bem

como insuficiência respiratória. Grande parte dos pacientes com AME apresenta atraso nos

marcos motores, além do comprometimento nos nervos cranianos, levando a características

como a disartria e disfagia.

Nas crianças com doença neuromuscular de acometimento mais tardío, é peculiar a

manifestação da síndrome de cinturas, que consiste de déficit motor e hipotrofia na cintura

escapular e/ou pélvica. Nas fases iniciais dos processos distróficos, é comumente referido o

andar deambulante, além de quedas frequentes, dificuldade para correr e subir escadas, e

alterações da marcha. O comprometimento preferencialmente proximal, afetando a

musculatura das coxas, da bacia e da coluna, acarreta acentuação da lordose lombar e o

característico sinal do levantar miopático (manobra de Gowers). A manobra de Gowers é

observada na grande maioria dos pacientes com DMD/B, razão pela qual torna-se difícil o

diagnóstico clínico diferencial entre estes dois grupos.

Existem outras manifestações que em qualquer idade, são altamente sugestivas de

doença neuromuscular, e constituem dados importantes para o diagnóstico diferencial, entre

elas, dimorfismo facial, palato em ogiva, comprometimento da musculatura facial e ocular,

sobretudo ptose palpebral.

As fasciculações são contrações involuntárias das fibras musculares de unidades

motoras, que podem ser observadas espontaneamente ou provocadas pela contração muscular,

sobretudo nas musculaturas da língua e do peito, são comuns em pacientes com Atrofia

DISCUSSÃO

93

Musculares Espinhal e na Distrofia Miotônica. Nos nossos pacientes, as fasciculações estão

presentes no grupo com AME.

Ainda na avaliação da criança com doença neuromuscular, é preciso estar atento à

possível associação com alterações sistêmicas, sobretudo hepáticas ou cardíacas. Entre as

entidades que compõem o grupo da distrofia muscular progressiva (DMP), em geral o quadro

é muscular puro, ocasionalmente acompanhado de acometimento cardíaco, exceto na forma

mais comum e mais grave (Distrofia Muscular de Duchenne), que frequentemente pode

evoluir com deficiência mental e alterações cardíacas.

Ao tentar estabelecer o diagnóstico diferencial das doenças neuromusculares, vale

lembrar que a maioria destas entidades pode exibir um curso clínico altamente variável quanto

ao espectro de gravidade. Esta grande variabilidade pode ser observada tanto dentro como

entre os grupos de doenças, dificultando ainda mais a compreensão da relação genótipo-

fenótipo.

As causas da hipotonia são classicamente avaliadas através da determinação das

enzimas musculares, principalmente CK, da ENMG, da biópsia muscular e ainda através de

marcadores moleculares. Na investigação das doenças neuromusculares os níveis de CK

podem ajudar a diferenciar o comprometimento muscular miopático do neurogênico. A

ENMG permite distinguir se o acometimento é do neurônio motor, de raízes ou nervos

periféricos, auxiliando no possível diagnóstico da Atrofia Muscular Espinhal. A biópsia

muscular é particularmente importante para o diagnóstico das diferentes formas de miopatias

congênitas. No entanto a biópsia em um procedimento invasivo, e às vezes por se tratar de

crianças muito pequenas, deve-se avaliar o benefício da realização.

Por isso a caracterização molecular é essencial para confirmação diagnóstica da

maioria das doenças neuromusculares, tendo como vantagem a simplicidade da coleta de

sangue e sua especificidade.

DISCUSSÃO

94

Com relação a proporção sexual e a gravidade do quadro clínico Smith & Patel (1965),

Pearn (1978c) e Emery et al. (1976) encontraram predomínio do sexo masculino entre os

afetados com AME. Outros autores como Brandt, 1950 e Windsor et al., 1971 não

observaram diferença de prevalência entre sexos.

Pearn (1978a), no estudo de 141 casos (67 masculinos e 74 femininos) de AME II e

III, não observou diferença na prevalência de afetados de acordo com o sexo, porém

encontrou quadro clínico mais grave em afetados masculinos. No presente estudo observamos

20 pacientes com AME do sexo feminino e 10 do sexo masculino. Apesar do número de

pacientes femininos ser o dobro dos masculinos esta diferença não foi estatisticamente

significante (χ2 = 3,33; gl = 1) o que confirma a maior parte dos trabalhos feitos neste sentido

(Brandt, 1950; Windsor et al., 1971; Pearn, 1978a).

A Distrofia Muscular de Duchenne em geral afeta meninos, por ter sua herança ligada

ao X, com isso a maioria das portadoras não exibe qualquer manifestação clínica. Há

exemplos raríssimos de meninas com DMD (Boland et al. 1996). No nosso estudo, todos os

pacientes com DMD ou DMB confirmados pelo diagnóstico molecular são do sexo

masculino.

No presente estudo não pudemos calcular a média das idades materna e paterna, pois

não tínhamos esses dados, logo esse fator não foi avaliado, em um estudo realizado por Ferraz

(1993), encontrou-se a idade média materna de 23,4 anos na análise de 1382 gestantes de

baixo risco, de sete hospitais, de diferentes regiões brasileiras. Esses dados estão de acordo

com o estudo de Pearn (1978a), que mostrou que a faixa etária dos progenitores não tem

relação com a AME.

A maioria dos pacientes por nós estudados nasceu de primeira gestação, o que reforça

ainda mais a importância do diagnóstico correto para o aconselhamento genético nas futuras

gestações do casal. Durante a gestação dos afetados, a maioria das mães não percebeu

anormalidades nos movimentos fetais (Pearn, 1973a; Chong, 2001).

DISCUSSÃO

95

Em geral, como dito anteriormente, a ausência de movimentos intra-uterinos está

relacionada a Atrofia Muscular Espinhal do tipo I. Essa anormalidade nos movimentos não foi

observada nos pacientes com DMD.

A expectativa de vida dos pacientes acometidos pela AME varia muito e depende

basicamente do acometimento da musculatura respiratória (Pearn et al., 1978a).

Na AME I, raramente os pacientes sobrevivem além dos dois primeiros anos (Pearn &

Wilson, 1973). Segundo Bundey & Lovelace (1975) os pacientes afetados pela AME II

conseguem sentar-se sem apoio, mas geralmente não conseguem deambular sem auxílio e

raramente o faz após os 10 anos. A sobrevida dos pacientes com AME II é muito variável. Há

relatos de vários casos que sobreviveram até a 3ª ou 4ª década de vida (Dubowitz, 1964;

Gamstorp, 1967; Gardner-Medwin et al., 1967; Munsat et al., 1969; Fried & Emery, 1971;

Pearn, 1973a; Pearn & Wilson, 1973).

A maioria dos nossos pacientes com AME apresentou níveis séricos de CK normais ou

levemente aumentados (Dubowitz, 1964; Tsukagoshi et al., 1966; Hausmanowa-Petrusewicz,

1970). Os valores de CK geralmente são normais ou discretamente aumentados. Se o valor da

enzima for superior a 10 vezes o limite normal pode-se excluir a possibilidade de AME.

Na Distrofia Muscular de Duchenne os primeiros sinais clínicos manifestam-se em

geral entre os 3 e os 5 anos, na forma de quedas freqüentes, dificuldade para subir escadas,

correr, levantar do chão e hipertrofia das panturrilhas. O comprometimento muscular é

simétrico e inicia pelos músculos da cintura pélvica (quadril e pernas), atingindo mais tarde os

membros superiores. Ocorre uma acentuação da lordose lombar e uma marcha anserina.

Contraturas e retrações dos tendões levam alguns pacientes a andar na ponta dos pés. A

debilidade muscular agrava progressivamente, levando à incapacidade de andar dentro de dez

anos a partir do início dos sintomas. O óbito deve ocorrer antes dos 20 anos de idade. O

retardo mental ocorre em pelo menos 30% dos casos.

DISCUSSÃO

96

Apesar do melhor entendimento sobre a DMD na atualidade e da melhora das

ferramentas diagnósticas, uma pesquisa, publicada em 1999 por Bushby et al., sugere que a

média de idade para o diagnóstico da DMD no Reino Unido é de 4 anos e 10 meses,

virtualmente idêntica à idade em que era realizado o diagnóstico no início dos anos oitenta.

Num estudo realizado no Brasil com 78 crianças com DMD, foi observado que a idade média

da percepção do início dos sintomas pela família foi de 2 anos e a idade do diagnóstico

definitivo de 7 anos, próxima à época da perda da marcha. Isto demonstra que, apesar de uma

melhora de técnicas de diagnóstico, como por exemplo, a pesquisa da deleção por amostras

sangüíneas, não houve uma redução significativa no tempo do diagnóstico definitivo no Brasil

(Araújo et al., 2004). Estas características serviram como base para a montagem do algoritmo

e programa DisAme (anexo 7) cujo objetivo foi verificar se estes eram capazes de discriminar

as distrofias das atrofias musculares. A aplicação deste algoritmo sobre os dados clínicos dos

117 pacientes mostrou que ele é capaz de discriminar com razoável segurança as atrofias das

distrofias, pois todos os 36 pacientes com suspeita clínica de AME foram indicados como

negativos para DMD/B e todos os 48 DMD/B foram negativos para AME.

Por outro lado, os testes moleculares diagnosticaram 31 indivíduos com AME, sendo

que, 18 destes tinham sido previamente suspeitos clinicamente para esta desordem (50% dos

indivíduos clinicamente suspeitos) e 13 não tinham diagnóstico clínico.

Em relação a DMD/B, 48 pacientes tinham essa suspeita clínica, dos quais 35 (73%)

foram confirmados molecularmente.Além disso, outros 4 indivíduos (sem suspeita clínica

prévia) foram diagnosticados como DMD/B pelos testes moleculares.

Estes resultados nos mostram que o algoritmo gerado tem poder discriminatório,

porém não é uma ferramenta conclusiva, ela pode ser utilizada para auxiliar ou direcionar o

estudo molecular que sim tem caráter de definição. É claro que o aperfeiçoamento do

algoritmo pode ser obtido com a introdução de um maior número de dados acerca do paciente

DISCUSSÃO

97

e até possibilitando sua extensão para a discriminação de um grupo maior de doenças

neuromusculares.

Discute-se a possibilidade que deleções no SMN associadas a deleções no NAIP,

possam explicar a variabilidade clínica encontrada em pacientes com a mesma deleção no

gene SMN. Além disso, outros mecanismos genéticos podem estar envolvidos na variabilidade

clínica na AME. A elucidação da função do produto final do gene deve ser fundamental para a

compreensão da patogênese da doença (Burlet et al., 1996; Rodrigues et al., 1996; Velasco et

al., 1996). Resta ainda muito a esclarecer quanto à correlação genótipo-fenótipo na AME, mas

é tentador sugerir uma hipótese que o NAIP, em conjunto com genes próximos ao SMN,

modificam o fenótipo da AME, assim justificando os diferentes subtipos da doença.

O DMD é o maior gene humano conhecido e apresenta diferentes tipos de mutações,

mais comumente deleções, e mais raramente, inserções-duplicações ou mutações de ponto,

evidenciáveis em 70% dos casos de DMD e 75% dos casos de DMB. As deleções que

ocorrem na posição central e não alteram o quadro de leitura, resultam em uma proteína de

tamanho reduzido e parcialmente funcional, o que leva a um quadro mais brando e mais

tardio, que corresponde a DMB (Parreira, 2005).

O exame molecular consiste em analisar os 18 éxons (segmentos ou partes da

seqüência codificadora de um gene) mais freqüentemente deletados, o que permite identificar

98% das deleções do gene.

Infelizmente ainda não foi possível estabelecer uma relação direta do tipo ou da

extensão da deleção com a gravidade da doença, casos familiais e esporádicos e níveis de

inteligência em diversos países (Franco et al., 2007).

Com relação ao histórico familiar e consanguinidade, a análise de genealogias

relatadas na literatura mostra que existe aumento de consangüinidade nas famílias de afetados

por AMEs. Brandt (1949) encontrou uma taxa de consangüinidade em 6%, entre as 70

famílias estudadas, um valor considerado 8 vezes superior ao observado para o grupo

DISCUSSÃO

98

controle. Pearn (1973b) observou uma taxa de consangüinidade em torno de 2 a 3% na AME.

Burlet et al. (1996) no estudo de 106 pacientes encontraram uma taxa de consangüinidade de

24% sendo 14/44 com AME I, 3/31 com AME II e 9/31 com AME III.

A realização do teste molecular para DMD/B é importante para a confirmação do

diagnóstico clínico e é fundamental para a estimativa precisa dos riscos de repetição na futura

prole dos pais ou parentes do afetado. Uma vez detectada uma deleção em um afetado, pode-

se identificar quais mulheres de sua família são portadoras da deleção. As mulheres

portadoras têm um risco de 50% de transmitir o gene mutado para a sua prole: 50% dos filhos

são afetados e 50% das filhas, portadoras assintomáticas.

Neste estudo somente 89 pacientes forneceram informação sobre a consangüinidade e

histórico familiar da doença. Dentre estes, 7,9% eram filhos de casamento consangüíneo e

28,1% apresentaram histórico familiar. Estudos prévios mostram uma variação heterogênea

da taxa de consangüinidade entre populações.

O diagnóstico clínico da AME I foi mais simples devido ao início precoce e à

gravidade do quadro clínico. Nas formas intermediárias e tardias, houve dúvidas quanto à

classificação. Em alguns casos, o início dos sintomas foi precoce, compatível com AME II,

mas a habilidade motora estava mais preservada, portanto mais compatível com AME III. Por

outro lado, alguns pacientes tiveram o início da sintomatologia mais tardio, compatível com

AME III, porém, com habilidade motora muito comprometida.

Em 1995, Zerres & Rudnik-Schöneborn analisaram retrospectivamente 445

pacientes com AME. Encontraram 106 pacientes (24%) não classificáveis pelos critérios de

Munsat & Davies (1992). A idade de início das manifestações, a sobrevida e a função motora

nem sempre coincidiam com as utilizadas na classificação de Munsat & Davies. Nesse

sentido, Zerres & Rudnik-Schöneborn (1995) sugeriram uma mudança na classificação, para

quatro tipos de AMEs, com subdivisão em dois grupos da AME III. Acredita-se que pesquisas

de correlações genótipo-fenótipo através de estudos moleculares possam ser decisivas para

DISCUSSÃO

99

uma futura classificação mais abrangente das AMEs. A utilização do fluxograma pode ajudar

também na classificação das diferentes formas de AME, e sua associação com o diagnóstico

molecular pode reforçar qual o tipo da doença.

Depois da formulação do fluxograma, todos os pacientes foram testados para verificar

sua aplicação e foi observado que ele funciona com boa segurança para discriminar as atrofias

das distrofias, se faz necessário uma ampliação dessa ferramenta para diferenciar doenças de

um mesmo grupo. Todos esses resultados demonstram a complexidade das doenças e a

importância desse estudo ser continuado. Estabelecer um padrão de comparação das

diferenças observadas pode ser um bom começo para o incremento de terapias ou tratamentos

complementares mais eficientes, em um menor tempo possível, visando sempre um progresso

mais lento de cada enfermidade e consequentemente o bem estar dos pacientes.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

100

66.. CCOONNCCLLUUSSÕÕEESS

1. Não foi possível afastar a hipótese diagnóstica de AME nos casos em que não se

encontrou deleção em homozigose nos éxons 7 ou 8 do gene SMN e deleção dos éxons

5 e 6 do gene NAIP.

2. O estudo do éxon 7 e do éxon 8 do gene SMN foi extremamente importante para

confirmação diagnóstica.

3. Não foi possível afastar a hipótese do diagnóstico de DMD/B nos casos em que não se

encontrou deleção nos 18 éxons analisados, tendo em vista que estas correspondem a

70% das mutações.

4. O diagnóstico molecular é extremamente importante, para caracterização da patologia,

além de não ser invasivo como alguns exames complementares.

5. Os pacientes devem ser periodicamente revisados para aumentar a expectativa e

melhorar a qualidade de vida. É útil para os médicos como uma abordagem

estruturada e monitorar todos os sistemas e órgãos afetados.

6. Parte dos casos com suspeita clínica de DMD/B e AME não foi confirmado pelo

diagnóstico molecular, isso pode caracterizar uma mutação que não foi analisada ou

até mesmo outra doença neuromuscular, já que estas cursam um quadro clínico

semelhante.

7. Pacientes que não tinham suspeita clínica para essas doenças tiveram seu diagnóstico

confirmado. Isso reforça a importância do diagnóstico molecular para essas doenças,

mostrando que elas apresentam grande variabilidade nas manifestações clínicas.

8. O fluxograma ajudou a discriminar com razoável segurança as atrofias das distrofias.

9. A aplicação do fluxograma foi realizada com os nossos pacientes e pudemos observar

que funciona.


101

77.. RREEFFEERRÊÊNNCCIIAASS BBIIBBLLIIOOGGRRÁÁFFIICCAASS

ABERFELD DC, NAMBA T. Progressive ophthalmoplegia in Kugelberg-Welander disease.

Arch Neurol 1969. 20: 253.

ALBERTS MC & SAMAHA FJ. Serum pyruvate kinase in muscle disease and carrier states.

Neurology. 1974. 4: 462-464.

ALLEN JE & RODGIN DW. Mental retardation in association with progressive muscular

dystrophy. Am J of Diseases in Childhood. 1960. 100: 208-211.

AMEISEN JC. On the origin, evolution, and nature of programmed cell death: a timeline of

four billion years. Cell Death Differ. 2002. 9(4): 367-93.

ANDREASSI C, JARECKI J, ZHOU J, COOVERT DD, MONANI UR, CHEN X,

WHITNEY M, POLLOK B, ZHANG M, ANDROPHY E, BURGHES AH. Aclarubicin

treatment restores SMN levels to cells derived from type I spinal muscular atrophy

patients. Hum Mol Genet. 2001. 10(24): 2841-2849.

ANDREASSI C, ANGELOZZI C, TIZIANO FD, VITALI T, DE VINCENZI E,

BONINSEGNA A, VILLANOVA M, BERTINI E, PINI A, NERI G, BRAHE C.

Phenylbutyrate increases SMN expression in vitro: relevance for treatment of spinal

muscular atrophy. Eur J Hum Genet. 2004. 12(1): 59-65.

ARAÚJO AP & FONTENELLE LM. A Criança Hipotônica. Doenças Genéticas em

Pediatria. Editora Guanabara Koogan 2001. p. 442-446.

ARAÚJO APQC, DECO MC, KLÔH BS, COSTA MR, GÓIS FV, GUIMARÃES AFCM.

Diagnosis delay of Duchenne muscular dystrophy. Rev Bras Saúde Matern Infant. 2004.

4(2):179-183.

ARMAND S, MERCIER M, WATELAIN E, PATTE K, PELISSIER J, RIVIER F. A

comparison of gait in spinal muscular atrophy, type II and Duchenne muscular

dystrophy. Gait Posture. 2005 Jun;21(4):369-78.

AUBRY HL, McKENZIE AE, SURTH LC. Delineating the mutations in spinal muscular

atrophy: improved molecular detection and genotype-phenotype correlations. Am J Hum

Genet. 1995. 57: 234.

BAROIS A, ESTOURNET B, DUVAL-BEAUPÈRE G, BATAILLE J, LECLAIR-

RICHARD D. Amyotrophie spinale infantile. Rev Neurol. 1989. 145: 299-304.

BATTAGLIA G, PRINCIVALLE A, FORTI F, LIZIER C, ZEVIANI M. Expression of the

SMN gene the spinal muscular atrophy determining gene in the mammalian central

nervous system. Hum Mol Genet. 1997. 11: 1961-1971.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11734549?ordinalpos=6&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DefaultReportPanel.Pubmed_RVDocSum








102

BEGGS AH & KUNKEL LM. Improved diagnosis of Duchenne/Becker muscular dystrophy.

Journal of Clinical Investigation. 1990. 85: 613-619.

BEGGS AH, HOFFMANN EP, SNYDER JR, ARAHAT K, SPECHT L, SCHAPIRO F,

ANGELIN C, SUGITA H, KUNKEL LM. Exploring the molecular basis for variability

among patients with Becker muscular dystrophyn gene and protein studies. Am J Hum

Genet. 1991. 49: 54-67.

BECKER PE and KIENER F. Eine neue X-chromosomale muskeldystrophie. Archiv fuer

Psychiatrie und Nervenkrankheiten. 1955. 193: 427-428.

BECKER PE. Atrophia musculorum spinalis pseudomyopathica. Hereditaere neurogene

proximale Amyotrophie von Kugelberg und Welander. Z Menschl Vererb Konstitutions

1964. 37:193-220.

BEEVOR CE. A case of congenital spinal muscular atrophy (family type) and a case of

halmorrhage into the spinal cord at birth giving similar symptoms. Brain. 1902. 25: 85-

102.

BELL C. The nervous system of the human body: as explained in a series of papers read

before the Royal Society of London. Adam and Charles Black, Edinburgh. 1830.

BENNET AH. On chronic atrophy spinal paralysis in children. Brain. 1883. 6: 289-301.

BERTINI E, BURGHES A, BUSHBY K, ESTOURNET-MATHIAUD B, FINKEL RS,

HUGHES RA, IANNACCONE ST, MELKI J, MERCURI E, MUNTONI F, VOIT T,

REITTER B, SWOBODA KJ, TIZIANO D, TIZZANO E, TOPALOGLU H, WIRTH

B, ZERRES K. 134th ENMC International Workshop: Outcome Measures and

Treatment of Spinal Muscular Atrophy, 11-13 February 2005, Naarden, The

Netherlands. Neuromuscul Disord. 2005. 11: 802-816.

BIES RD, FRIEDMAN D, ROBERTS R, PERRYMAN MB, CASKEY CT. Expression and

localization of dystrophin in human cardiac Purkinje fibers. Circulation. 1992.86(1):

147-153.

BOLAND BJ, SILBERT PL, GROOVER RV, WOLLAN PC, SILVERSTEIN MD. Skeletal,

cardiac, and smooth muscle failure in Duchenne muscular dystrophy. Pediatr Neurol.

1996. 14(1): 7-12.

BORTOLINI ER. Pesquisa sobre uma possível heterogeneidade genética na distrofia de

Duchenne. Tese de Mestrado. Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo.

São Paulo. 1983.

BORTOLINI ER & ZATZ M. Investigation on genetic heterogeneity in Duchenne muscular

dystrophy. Am J of Medical Genetics. 1986. 24: 111-117.





103

BOTSTEIN D, WHITE RL, SKOLNICK M, DAVIS RW. Construction of a genetic linkage

map using restriction fragment length polymorphisms. Am J Hum Genet. 1980. 32: 314-

331.

BOUWSMA G, LESCHOT NJ. Unusual pedigree patterns in seven families with spinal

muscular atrophy; further evidence for the alelic model hypothesis. Clin Genet. 1986. 30:

145-149.

BRANDT S. Hereditary factors in infantile progressive muscular atrophy. Am J Dis Child.

1949. 28: 226

BRANDT S. Werdnig-Hoffmann’s infantile progressive muscular atrophy: clinical aspects,

pathology, heredity and relation to Oppenheim’s amyotonia congenita and other morbid

conditions with laxity of joints of muscles in infants. Copenhagen, Munksgaard. 1950.

BROOKE MH. A clinician’s view of neuromuscular diseases. Williams; Wilkins. Eds.

Baltimore. 1986.

BRZUSTOWICZ LM, LESHNER T, CASTILLA LH, PENCHASZADEH GK,

WILHELMSEN KC, DANIELS R, DAVIES KE, LEPPERT M, ZITER F, WOOD D,

DUBOWITZ V, ZERRES K, HAUSMANOWA-PETRUSEWICZ I, OTT J, MUNSAT

TL, GILLIAM TC. Gene mapping of chronic childhood-onset spinal muscular atrophy to

chromosome 5q11.2-13.3. Nature. 1990. 344: 540-541.

BRZUSTOWICZ LM, KLEYN PW, BOYCE FM, LIEN LL, MONACO AP,

PENCHASZADEH GK, DAS K, WANG CH, MUNSAT TL, OTT J, KUNKEL LM,

GILLIAM TC. Fine-mapping of the spinal muscular atrophy locus to the region flanked

by MAP1B and D5S6. Genomics 1992. 13:991-998.

BUCHTAL F, CLEMMENSEN. On the differentiation of muscle atrophy by

electromyography. Acta Psychiatr. 1941. 16: 143-181.

BUCHTAL F, OLSEN PZ. Electromyography and muscle biopsy in infantile spinal muscular

atrophy. Brain. 1970. 93: 15-30.

BUNDEY S & LOVELACE RE. A clinical and genetic study of chronic proximal spinal

muscular atrophy. Brain. 1975. 98: 455-472.

BURD L, SHORT SK, MARTSOLF JT, NELSON RA. Prevalence of type I spinal muscular

atrophy in North Dakota. Am J Med Genet. 1991. 41: 212-225.

BURGHES AHM, INGHAHAM SE, MCLEAN M, THOMPSON TG, MCPHERSON JD,

KOTE-JARAI Z, CARPTEN JD, DIDONATO CJ, IKEDA JE, SURCH L, WIRTH B,

SARGENT CA, FERGUSON-SMITH MA, FUERST P, MOYSIS RK, GRASDY DL,

ZERRES KI, KORNELUX R, MACKENZIE A, WASMITH JJ. A multicopy


104

dinucleotide marker that maps close to the spinal muscular atrophy gene. Genomics.

1994a. 21: 394-402.

BURGHES AHM, INGHAHAM SE, KOTE-JARAI Z, ROSENFELD S, HERTA N,

NACLKARNI N, DIDONATO CJ, CARPTEN J, HURKO O, FLORENCE J. Linkage

mapping of the spinal muscular atrophy gene. Hum Genet. 1994b. 93: 305-312.

BURLET P, BÜRGLEN L, CLERMONT O, LEFEBVRE S, VIOLLET L, MUNNICH A

AND MELKI J. Large scale deletions of the 5q13 region are specific to Werdnig-

Hoffmann disease. J Med Genet 1996. 33:281-283.

BUSHBY KM, HILL A, STEELE JG. Failure of early diagnosis in symptomatic Duchenne

muscular dystrophy. Lancet 1999. 353 (9152) 557-558.

CANADO AASC, CARVALHO MS, BROTO M, SALUM PM, LEVY J. Amiotrofia

espinhal crônica juvenil simulando distrofia muscular / the chronic spinal muscular

atrophy juvenile simulating muscular dystrophy. Rev Bras Neurol. 1990. 26: 154-156.

CARMO EH, BARRETO MI, BARBOSA SJ. Mudanças nos padrões de morbimortalidade da

população brasileira: os desafios para um novo século. Epidemiologia e Serviços de

Saúde. 2003. 12 (2): 61-73.

CASKEY CT, PIZZUTI A, YING-HUI FU, RAYMOND G, FENWICK JR., DAVID L,

NELSON. Triplet repeat mutations in human disease. Science. 1992; 256:784-787.

CHAMBERLAIN JS, GIBSS RA, RANIER JE, BGUYEN PN, THOMAS C. Deletion

screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification.

Nucleic Acids Res. 1988. 16: 11141-11156.

CHONG AE KIM. Estudo genético e clínico das Amiotrofias Espinhais Progressivas. 1996.

Dissertação (Doutorado em Medicina) – Universidade de Medicina.

CHONG AE KIM. As Amitrofias Espinhais Progressivas. Doenças Genéticas em Pediatria.

Editora Guanabara Koogan 2001. 296-299.

CLERMONT O, BURLET P, BÜRGLEN L, LEFEBVRE S, PASCAL F, MCPHERSON J,

WASMUTH J, COHEN D, LE PASLIER D, WEISSENBACH J, LATHROP M,

MUNNICH A, MELKI J. Use of genetic and physical mapping to locate the spinal

muscular atrophy locus between two new highly polymorphic DNA markers. Am J Hum

Genet. 1994. 54: 687-694.

COHEN HJ, MOLNAR GE, TAFT LT. The genetic relationship of progressive muscular

dystrophy (Duchenne type) and mental retardation. Developmental Medicine and Child

Neurology. 1968. 10: 754-765.


105

COLLEBAUT I & MORNON JP. The human EBNA-2 coactivator p100: multidomain

organization and relationship to the staphylococcal nuclease fold and to the tudor protein

involved in Drosophila melanogaster development. Biochem J. 1997. 1:125-132.

COLLIER & WILSON, 1908 apud PEARN J. 1990.

CONTE G & GIOJA L. Scrofola del sistema musculare. Annali Clinici dell’ospedale degli

incurabili da Napoli. 1836. 2: 66-79.

CZEIZEL A. High incidence of acute infantile spinal atrophy in Hungrya. Hum Genet. 1991.

86: 539.

CZEIZEL A & HAMULA J. A hungarian study on Werdnig-Hofmann disease. J Med

Genet.1989. 26: 761-763.

DAMIANI D. Mecanismos da Apoptose. Manual de Patologia e Citopatologia Oncológica

2004. http://www.sistemanervoso.com/

DANIELS RJ, SUTHERS GK, MORRISON KE, THOMAS NH, FRANCIS MJ, MATHEW

CG, LOUGHLIN S, HEIBERG A, WOOD D, DUBOWITZ V, DAVIES KE. Prenatal

prediction of spinal muscular atrophy. J Med Genet 1992a. 29:165-170.

DANIELS RJ, THOMAS NH, MACKINNON RN, LEHNER T, OTT J, FLINT TJ,

DUBOWITZ V, IGNATIUS J, DONNER M, ZERRES K, RIETSCHEL M, COOKSON

WOC, BRZUTOWICZ LM, GILLIAM TC, DAVIES KE. Linkage analysis of spinal

muscular atrophy. Genomics 1992b. 12:335-339.

DAVIES KE, PEARSON PL, HARPER PS. Linkage analysis of two cloned DNA sequences

flanking the Duchenne muscular dystrophy locus on the short arm of the human X

chromosome. Nucleic Acids Research. 1983. 11: 2303-2312.

DEN DUNNEN JT, GROOTSCHOLTEN PM, BAKKER E, BLONDEN LAJ, GINJAAR

HB, WAPENAAR MC, VAN PAASSEN HMB. Topography of the Duchenne muscular

dystrophy (DMD) gene: FIGE and cDNA analysis of 194 cases reveals 115 deletions and

13 duplications. Am Journ of Hum Genet. 1989. 45: 835-847.

DESAI AD, JAYAM AV, BANERJI AP, KHIYAR FN E ARDHAPURKAR I. Study of the

central nervous system in Duchenne type of muscular dystrophy. Neurology. 1969. 184-

190.

DEYMEER F, SERDAROĞLU P, PODA M, GÜLŞEN-PARMAN Y, OZÇELIK T,

OZDEMIR C. Segmental distribution of muscle weakness in SMA III: implications for

deterioration in muscle strength with time. Neuromuscul Disorder. 1997. 7 (8): 521-528.

DICKSON G, LOVE DR, DAVIES KE, WELLS KE, PEPER TA, WALSH FS. Human

dystrophin gene transfer: production and expression of a functional recombinant DNA-

based gene. Human Genetics. 1991. 88: 53-58.

http://www.sistemanervoso.com/


106

DIDONATO CJ, MORGAN K, CARPTEN JD, FUERST P, INGRAHAN SE, PRESCOTT

G, McPHERSON JD, WIRTH B, ZERRES K, HURKO O, WASMUTH JJ, MENDELL

JR, BURGHES AHM, SIMARD LR. Association between AgI-CA alleles and severity

of autosomal recessive proximal spinal muscular atrophy. Am J Hum Genet. 1994. 55:

1218-1229.

DREYFUS JC, SCHAPIRA G, DEMOS J. Étude de la créatine-kinase sérique chez lês

myopathies et leurs familles. Revue Française Étude Clinique et Biologie. 1960. 5: 384-

386.

DUBOWITZ V. Infantile muscular atrophy. A prospective study with particular reference to

slowly progressive variety. Brain. 1964. 87: 707-718.

DUBOWITZ V. Intellectual impairment in muscular dystrophy. Arch of Diseases in

Childhood. 1965. 40: 296-301.

DUBOWITZ V. Muscle Disorders in Childhood. Philadelphia. WB Saunders. 1978.

DUBOWITZ V. Diseases of the lower motor neurone. In: Dubowitz V. Muscle biopsy a

pratical approach. Baillière Tindall. 1985. 254-257.

DUBOWITZ V, DANIELS RJ, DAVIES KE. Olivopontocerebellar hypoplasia with anterior

horn cell involvement (SMA) does not localize to chromosome 5q. Neuromuscul Disord.

1995 5(1):25-9.

DUCHENNE BGBA (1861) apud MOSER H. Duchenne muscular dystrophy: patogenetic

aspects and genetic prevention. Human Genetics. 1984. 66: 17-40.

DUCHENNE BGBA (1868) apud MOSER H. Duchenne muscular dystrophy: patogenetic

aspects and genetic prevention. Human Genetics. 1984. 66: 17-40.

EBASHI S, TOYOKURA Y, MOMOI H and SUGITA H. High creatine phosphokinase

activity of sera of progressive muscular dystrophy. Journal of Biochemistry (Tokio).

1959. 46: 103-104.

EMERY AEH &SKINNER R. Clinical studies in begin (Becker type) X-linked muscular

dystrophy. Cardiomiology. 1976. 2: 13-23.

EMERY AEH. The muscular dystrophies. In Principles and practice of medical genetics.

Emery AEH and Rimoin D. 1983. Chuchill Livingstone, Edinburg, London, New york.

392-413.

EMERY AE. Duchenne muscular dystrophy. 2 ed. Oxford Uniersity Press. 1993.

EMERY AE. Muscular dystrophy into the new millennium. Neuromuscul Disord. 2002

12(4):343-9. Review.





107

ENGLAND SB, NICHOLSON LVB, JOHNSON MA, FORREST SM, LOVE DR,

ZUBRZYCKA-GAARN EE, BULMAN DE, HARRIS JB, DAVIES KE. Very mild

muscular dystrophy associated with the deletion of 46% of dystrophyn. Nature. 1990.

343: 180-182.

ERB WH. Über die “juvenile form” der progressiven muskelatrophie und ihre Beziehungen

zur sogenannten pseudohypertrophie der muskeln. Deutsches Archiv für Klinische

Medizin. 1884. 34: 467-519.

ERB W (1891) apud Gardner Medwin D. Clinical features and classification of the muscular

dystrophies. British Medical Bulletin. 1980. 36 (2): 109-115.

ERVAST JM, KAHL SD, CAMPBELL KP. Purification of dystrophin from skeletal muscle.

Journal of Biological Chemistry. 1991. 226: 9191-9165.

ESPERON LC, ESPERON PSM, ESPERON CTM, KLUJSZO MCC. Atrofia muscular

espinhal progressiva infantil (Doença de Werdnig-hoffmann). Pediatr Mod. 1988. 23:

267-276.

FALLON L, HARTON GL, SISSON ME, RODRIGUEZ E, FIELD LK, FUGGER, EF,

GELTINGER M, SUN Y, DOFFMANN A, SCHOENER C, BICK D, SCHULMAN J,

LEVINSON G AND BLACK SH. Peimplantation genetic diagnosis for spinal muscular

atrophy type I. Neurology 1999. 53:1087-1090.

FELDKOTTER M, SCHWARZER V, WIRTH R, WIENKER TF, WIRTH B. Quantitative

analyses of SMN1 and SMN2 based on real-time light cycler PCR: fast and highly

reliable carrier testing and prediction of severity of spinal muscular atrophy. Am J Hum

Genet. 2002. 2: 358-368.

FENG W, GUBITZ AK, WAN L, BATTLE DJ, DOSTIE J, GOLEMBE TJ, DREYFUSS G.

Gemins modulate the expression and activity of the SMN complex. Hum Mol Genet. 2005

(12): 1605-1611.

FEENER CA, KOENIG M, KUNKEL LM. Alternative splicing of human dystrophin mRNA

generates isoforms at the carboxy terminus. Nature. 1989. 338: 509-511.

FERRAZ EM. Estudo multicêntrico para construção de curvas de dilatação cervical, em

função do tempo em gestantes brasileiras. Conferência proferida durante o III Congresso

Latino Americano de Perinatologia, SP. 1993.

FONTANA MH, PÖRTNER MR, SALIM PAK, BOBEK PR, ROZA PR. Atrofia muscular

espinhal infantil progressiva. Arq Neuropsiquiatr. 1990. 48: 26-31.

FRANCIS MJ, MORRISON KE, CAMPBELL L, GREWAL PK, CHRISTODOULO Z,

DANIELS RJ, MONACO AP, FRICHAUF AM, MCPHERSON J, WASMUTH J,

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=11791208&dopt=Abstract



108

DAVIES KE. A contig of non-chimeric YACs containing the spinal muscular atrophy

gene in 5q13. Hum Mol Genet. 1993. 2: 1161-1167.

FRANCO CR. Caracterização do diagnóstico clínico e detecção de portadoras de deleções no

gene na Distrofia Muscular de Duchenne/Becker no Rio Grande do Sul por PCR

quantitativo em tempo real. Dissertação apresentada a Universidade Federal do Rio

Grande do Sul. 2007.

FRIED K, EMERY AEH. Spinal muscular atrophy type II. A separate genetic and clinical

entity from type I (Werdnig-Hoffmann disease) type III Kugelberg Welander disease.

Clin Genet. 1971. 2: 203-209.

FRIED K, MUNDEL G. High incidence of spinal muscular atrophy type I (werdnig-

Hoffmann disease) in the Kararite comunity in Israel. Clin Genet. 1977. 12: 250-251.

GAMSTORP I. Progressive spinal muscular atrophy with onset in infancy or early childhood.

Acta Paediatr Scand. 1967. 56: 408-423.

GARDNER-MEDWIN D, HUDGSON P, WALTON JN. Benign spinal muscular atrophy

arising in childhood and adolescence. J Neurol Sci. 1967. 5: 121-158.

GILLIAM TC, BRZUSTOWICZ LM, CASTILLA LH, LESHNER T, PENCHASZADEH

GK, DANIELS RJ, BYTH BC, KNOW LES J, HISIOP JE, SHAPIRA Y, DUBOWITZ

V, MUNSAT TL, OTT J, DAVIES KE. Genetic homogeneity between acute and chronic

forms of spinal muscular atrophy. Nature. 1990. 345: 823-825.

GOWERS WR. Clinical lecture on pseudo-hypertrophic muscular paralysis. Lancet. 1879. 2:

1-2, 37-39, 73-75, 113-116.

GRUBER H, ZEITLHOFER J, PRAGER J, PILS P. Complex oculomotor dysfunctions in

Kugelberg-Welander disease. Neuroophthalmology. 1983. 3: 125-128.

GUBITZ AK, FENG W, DREYFUSS G. The SMN complex. Exp Cell Res. 2004. 296(1):51-

56. Review.

GUYER MS, COLLINS FS. The human genome project and the future of medicine. Am J Dis

Child. 1993. 147: 1145-1152.

HAHNEN ET, WIRTH B. Frequent DNA variant in exon 2a of the survival motor neuron

gene (SMN): a further possibility for distinguishing the two copies of the gene. Hum

Genet. 1996.1: 122-123.

HAMMONDS RG. Protein sequence of DMD gene is related to actin-binding domain of α-

actin. Cell. 1987. 51:1.

HAUSHALTER P. 1898 apud PEARN J. 1990.



109

HAUSMANOWA-PETRUZEWICZ I. Infantile and juvenile spinal muscular atrophy. In:

WALTON JN; CONAL N; SCARLATO G. Eds. Muscle Diseases. Amsterdam. Excepta

medica ics. 1970. 558-567.

HITOMI Y, KIZAKI T, WATANABE S, MATSUMURA G, FUJIOKA Y, HAGA S. Seven

skeletal muscles rich in slow muscle fibers may function to sustain neutral position in the

rodent hindlimb. Comparative Biochemistry and Physiology. 2005. 140(1): 45-50.

HOFFMANN J. 1883 apud PEARN J. 1990.

HOFFMANN EP, BROWN JR, KUNKEL LM. Dystrophin: The protein product of the

Duchenne muscular dystrophy locus. Cell. 1987. 51: 919-928.

HUTTENHOWER C, HALEY EM, HIBBS MA, DUMEAUX V, BARRETT DR, COLLER

HA, TROYANSKAYA OG. Exploring the human genome with functional maps.

Genome Res. 2009. 19(6):1093-106..

IANNACCONE ST, BURGHES A. Spinal muscular atrophies. Adv Neurol. 2002. 88:83-98.

Review.

IBRAGHIMOV-BESKROVNAYA O, ERVASTI JM, LEVEILLE CJ, SLAUGHTER CA,

SERNETT SW, CAMPBELL KP. Primary structure of dystrophin-associated

glycoproteins linking dystrophin to the extracellular matrix. Nature. 1992. 6362:696-702.

IMAI T, MINAMI R, NAGAOKA M, ISHIKAWA Y, KAMEDA K, OKABE M,

MATSUMOTO H. Proximal and distal nerve conduction velocities in Werdnig-

Hoffmann disease. Pediatr Neurol. 1980. 6: 82-86.

JUNQUEIRA LC, CARNEIRO J. Basic Histology 1980. 3a edição, Editora Lange, Los

Altos- CA.

KARAGAN NJ & SORENSEN JP. Intellectual functioning in non-Duchenne muscular

dystrophy. Neurology. 31: 448-452.

KARLSTRÖM F, WOHLFART G. Klinische und histopathologische studien über infantile

spinale muskelatrophie (Oppenheimsche und Werdnig-Hoffmannsche Krankheit). Acta.

Psychiatr. 1939. 14: 453-488.

KARPATI G. Possible treatment of Duchenne muscular dystrophy by non-dystrophic

myoblast implantation into dystrophic muscles. Pathogenesis and therapy of Duchenne

and Becker muscular dystrophy. 1990. 59-63.

KASPAR RW, ALLEN HD, MONTANARO F. Current understanding and management of

dilated cardiomyopathy in Duchenne and Becker muscular dystrophy. J Am Acad Nurse

Pract. 2009. 21(5): 241-9. Review.








110

KINGSTON HM, THOMAS NST, PEARSON PL, SARFARAZI M, HARPER PS. Genetic

linkage between Becker muscular dystrophy and a polymorphic DNA sequence on the

short arm of the X chromosome. Journal of Medical Genetics. 1983. 20: 255-258.

KINGSTON HM, SARFARAZI M, THOMAS NST, HARPER PS. Localization of the

Becker muscular dystrophy gene on the short arm of the X chromosome by linkage to

cloned DNA sequences. Human Genetics. 1984. 67: 6-17.

KLEYN PW, WANG CH, LIEN LL, VITALE E, PAN J, ROSS BM, GRUNM A, PALMER

DA, WARBURTON D, BRZUSTOWICZ LM, KUNKEL LM, GILLIAM TC.

Construction of a yeast artificial chromosome contig spanning the spinal muscular

atrophy disease gene region. Proc. Natl Acad Sci. 1993. 90: 6801-6805.

KOENIG M, HOFFMAN EP, BERTELSON CJ, MONACO AP, FEENER C, KUNKEL LM.

Complete cloning of the Duchenne muscular dystrophy (DMD) cDNA and preliminary

genomical organization of the DMD gene in normal and affected individuals. Cell. 1987.

50: 509-517.

KOENIG M, MONACO AP, KUNKEL LM. The complete sequence of dystrophin predicts a

rod shaped cytoskeletal protein. Cell. 1988. 53: 219-228.

KOENIG M & KUNKEL LM. Detailed analysis of the repeat domain of dystrophin reveals

four potential hinge segments that may confer flexibility. Journ of Biological Chemistry.

1990. 265: 4560-4566.

KOSTOVA FV, WILLIAMS VC, HEEMSKERK J, IANNACCONE S, DIDONATO C,

SWOBODA K, MARIA BL. Spinal muscular atrophy: classification, diagnosis,

management, pathogenesis, and future research directions. J Child Neurol. 2007. 22(8):

926-945.

KUNKEL LM, MONACO AP, MIDDLESWORTH W, OCHS HD, LATT SA. Specific

cloning of DNA fragments from the DNA from a patient with an X chromosome

deletion. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 1985. 82: 4778-4782.

LAW PK, BERTORINI TE, GOODWIN TG. Dystrophin production induced by myoblast

transfer therapy in Duchenne muscular dystrophy. Lancet. 1990. 336: 114-115.

LEFEBRVE S, BÜRGLEN L, REBOULLET S, CLERMON O, BURLET S, VIOLLET L,

BEENICHOU B, CRUAUD C, MILLASSEAU P, ZEVIANI M, LE PASLIER D,

FRÉZAL J, COHEN D, WELSSEN BACH J, MUNNICH A, MELKI J. Identification

and characterization of a spinal muscular atrophy-determining gene. Cell 1995; 80:155-

165.

LEHRMAN EJ. Birth in the left lateral position--an alternative to the traditional delivery

position. J Nurse Midwifery. 1985. 30(4): 193-197.




111

LEIBOWITZ D, DUBOWITZ V. Intellect and behaviour in Duchenne muscular dystrophy.

Developmental Medicine and Child Neurology. 1981. 23: 577-590.

LEYRER RH. Case reports of progressive infantile muscular atrophy (Werdnig-Hoffmann) in

fraternal twins. Am J Dis Child. 1954. 88: 604.

LIEN LL, BOYCE FM, KEIN P, BRZUSTOWICZ LM, MENNINGER J, WARD DC,

GILLIAM TC, KUNKEL LM. Mapping of a gene encoding a dystrophin cross-reactive

protein in close proximity to the spinal muscular atrophy locus. Am J Hum Genet. 1991.

49: 412.

LIN JJ, HWANG MS, HSIA SH, CHUNG HT, CHANG YS, LIN KL. Pericardial effusion

with cardiac tamponade as a cardiac manifestation of Duchenne muscular dystrophy.

Muscle Nerve. 2009. 40(3): 476-80.

LINDENBAUM RH, CLARKE G, PATEL C, MONCRIEFF M, HUGHES JT. Muscular

dystrophy in an X, 1 translocation female suggests that Duchenne locus is on X

chromosome short arm. Journal of medical genetics. 1979. 16: 389-392.

LO CS, CAPON F, MELCHIONDA S, GANNARELLI M, NOVELLI G, DALLAPICCOLA

B. First trimester prenatal of spinal muscular atrophy using microsatellite markers. Prenat

Dian. 1994. 14: 459-462.

LUGARESI E, GAMBETTI P, ROSSI PG. Chronic neurogenic muscle atrophies of infancy.

Their nosological relationship with Werdnig-Hoffman’s disease. J Neurol Sci. 1966. 3:

399-409.

LUYS, 1860 apud PEARN J. 1990.

MAILMAN MD, HEINZ JW, PAPP AC, SNYDER PJ, SEDRA MS, WIRTH B, BURGHES

AH, PRIOR TW. Molecular analysis of spinal muscular atrophy and modification of the

phenotype by SMN2. Genet Med. 2002. 1: 20-26.

MARQUARDT JE. MAC LOWRY J, PERRY RE. Infantile progressive spinal muscular

atrophy in identical negro twins. N Engl J Med. 1962. 23: 386-388.

McKUSICK VA. Genética Humana. Editora da Universidade de São Paulo.1971.

McLEAN MD, ROY N, MACKENZIE AE, SALIH M, BURGHES AHM, SIMARD L,

KORNELUK RG, IKEDA JE, SURCH L. Two 5q13 simple tandem repeat loci are in

linkage disequilibrium with type I spinal muscular atrophy. Hum Mol Genet. 1994. 3:

1951-1956.

MEHLER MF. Brain dystrophin, neurogenetics and mental retardation. Brain Research. 2000.

32 (1): 277-307.






112

MELKI J, SHETH P, ABDELHAK S, BURLET P, BACHELOT MF, LATHROP MG,

FREZAL J, MUNNICH A. Mapping of acute (type I) spinal muscular atrophy to

chromosome 5q12-q14. Lancet 336, 1990. 271-273.

MELKI J, ABDELHAK S, BURLET P, RACLIN V, KAPLAN J, SPIEGEL R,

GILGENKRANTZ S, PHILIP N, CHAUVET ML, DUMEZ Y, BRIARD ML, FREZAL

J, MINNICH A. Prenatal prediction of Werdnig-Hoffmann disease using linked

polymorphic DNA probes. J Med Genet 1992. 29:171-174.

MELKI J, LEFEBVRE S, BURGLEN L, BURLET P, CLERMONT O, MILLASSEAU P,

REBOULLET S, BÉNICHOU B, ZEVIANI M, LE PASLIER D, ET AL. De novo and

inherited deletions of the 5q13 region in spinal muscular atrophies. Science. 1994.

264(5164):1474-7.

MERYON E. On granular and fatty degeneration of the voluntary muscles. Medico-

chirurgica, Transactions (London). 1852. 35: 73-84.

MILLER RG, MOORE DH, DRONSKY V, BRADLEY W, BAROHN R, BRYAN W,

PRIOR TW, GELINAS DF, IANNACCONE S, KISSEL J, LESHNER R, MENDELL J,

MENDOZA M, RUSSMAN B, SAMAHA F, SMITH S. SMA Study Group. A placebo-

controlled trial of gabapentin in spinal muscular atrophy. J Neurol Sci. 2001. 191(1-2):

127-131.

MILLER SA, DYKES DD, POLESKY HFA. A simple salting out procedure for extracting

DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res. 1998. 16(3): 1215.

MOKRI B, ENGEL AG. Duchenne dystrophy: electron microscopic findings pointing to a

basic or early abnormality in the plasma membrane of the muscle fiber. Neurology. 1998.

51(1): 1-10.

MONACO AP, BERTELSON CJ, MIDDLESWORTH W, COLLETTIFRUNER C,

ALDRIDGE J, FISCHBECK KH, BARTLETT R, PERICAK-VANCELL MA, ROSES

AD, KUNKEL LM. Detection of deletions spanning the Duchenne muscular locus using

a tightly linked DNA segment. Nature. 1985.316: 842-845.

MOOSA A, DUBOWITZ V. A motor nerve conduction velocity in spinal muscular atrophy

of childhood. Arch Dis Child. 1976. 51: 974-977.

MORRISSON KE, DANIELS RJ, SUTHERS GK, FLYN GA, FRANCIS MJ, BUCKLE VJ,

DAVIES KE. High resolution genetic map around the spinal muscular atrophy (SMA)

locus on chromosome 5. Am J Hum Genet. 1992. 50: 520-527.

MOSER H. Duchenne muscular dystrophy: pathogenetic aspects and genetic prevention.

Human Genetics. 1984. 66(1): 17-40.






113

MOSTACCINOLO ML, DANIELI GA, TREERSAN C, MULLER E, ANGELINI C.

Epidemiology of spinal muscular atrophies in a sample of the Italian population.

Neuroepidemiology. 1992. 11: 34-38.

MULLER B, MELKI J, BURLET P, CLERGET-DARPOUX F. Proximal spinal muscular

atrophy (AME) types II e III in the same sibship are not cauded by different alleles at the

AME locus on 5q. Am J Hum Genet 1992. 50:892-895.

MULLER J, VAYSSIERE N, ROYUELA M, LEGER ME, MULLER A, BACOU F.

Comparative evolution of muscular dystrophy in diaphragm, gastrocnemius and masseter

muscles from old male mdx mice. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 2001.

22(2): 133-139.

MUNSAT TL, WOODS R, FOWLER W, PEARSON CM. Neurogenic muscular atrophy of

infancy with prolonged survival. Brain. 1969. 92: 9-24.

MUNSAT TL, DAVIES KE. Spinal muscular atrophy. Neuromuscular Disorders. 1992. 2:

423-428.

MUNSAT TL, DAVIES KE. Spinal muscular atrophy. In: Emeru AEHE. Diagnostic criteria

for neuromuscular disorders. Bear Netherlands. European neuromuscular Centre. 1994.

48-54.

MUNTONI F, TORELLI S, FERLINI A. Dystrophin and mutations: one gene, several

proteins, multiple phenotypes. Lancet Neurol. 2003. 2(12): 731-740.

MURPHY EG, COREY PNJ, CONEN PE. Varying manifestations of Duchenne muscular

dystrophy in a family with affected female. In Muscle. 1965. 529-545.

MURRAY JM, DAVIES KE, HARPER PS, MEREDITH L, MUELLER CR, WILLIANSON

R. Linkage relationship of a cloned DNA sequence on the short arm of the X

chromosome to Duchenne muscular dystrophy. Nature. 1982. 300: 69-71.

NAMBA L, ABERFELD DC, GROB D. Chronic proximal spinal muscular atrophy. J Neurol

Sci. 1970. 11: 401.

NISHIO H, TAKESHIMA Y, NARITA N, YANAGAWA H, SUZUKI Y, ISHIKAWA Y.

Identification of a novel fisrt exon in the human dystrophin gene and of a new promoter

located more than 500kb upstream of the nearest known promoter. The Journal of

Clinical Investigation. 1994. 94(3): 1037-1042.

NUDEL U, ZUK D, EINAT P, ZEELON E, LEVY Z, NEUMAN S, YAFFE D. Duchenne

muscular dystrophy gene product is not identical in muscle and brain. Nature. 1989. 337:

76-78.

OGINO S, WILSON RB. Genetic testing and risk assessment for spinal muscular atrophy

(SMA). Hum Genet. 2002. 6: 477-500.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Muntoni%20F%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Torelli%20S%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Ferlini%20A%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Ogino%20S%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Wilson%20RB%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus


114

OZAWA E. Dystrophin, dystrophin-associated protein and dystrophinopathy. Nihon Shinkei

Seishin Yakurigaku Zasshi. 1995. (3):289-293. Review.

OPPENHEIM, 1900 apud PEARN J. 1990.

PARREIRA SLS. Quantificação da força e habilidades motoras de pacientes com Distrofia

Muscular de Duchenne, em tratamento com corticoterpia. Dissertação apresentada à

faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. 2005.

PARSONS DW, McANDREW PE, IANNACCONE ST, MENDELL JR, BURGHES AH,

PRIOR TH. Intragenic telSMN mutations: frequency, distribution, evidence of a founder

effect, and modification of the spinal muscular atrophy phenotype by cenSMN copy

number. Am J Hum Genet. 1998. 6: 1712-1723.

PASCALET-GUIDON MJ, BOIS E, FEINGOLD J, MATTEI JF, COMBES JA, HAMON C.

Cluster of acute infantile spinal muscular atrophy (Werdnig-Hoffmann disease) in a

limited area of Reunion Island. Clin Genet. 1984. 26: 39-42.

PASCUAL-CASTROVIEJO I. Ctary: clinical aspects of spinal muscular atrophy. In:

Gamstorp I, sarnat HB. Eds progressive spinal muscular atrophies. New York. Raven

Press. 1984. 43-54.

PARTRIDGE TA, MORGAN JE, COULTON GR, HOFFMANN EP, KUNKEL LM.

Conversion of mdx myofibres from dystrophin-negative to positive by injection of

normal myoblast. Nature. 1989. 337: 176-179.

PEARN JH, WILSON J. Chronic generalised spinal muscular atrophy of infancy and

childhood: arrested Werdnig-Hoffmann disease. Arch Dis Child. 1973. 48: 768.

PEARN JH. The gene frequency of acute Werdnig-Hoffmann disease (SMA type I). A total

population survey in North-Eart England. J Med Genet. 1973b. 10: 260-265.

PEARN JH. Fetal moviments and Werdnig-Hoffmann disease. J Neurol Sci. 1973a. 18: 373-

379.

PEARN J. Autossomal dominant spinal muscular atrophy. A clinical and genetic study. J

Neurol Sci. 1978b. 38: 263-275.

PEARN J. Genetic studies of acute infantile spinal muscular atrophy (SMA type I). An

analysis of sex ratios, segregation ratios and sex influence. J med Genet. 1978c. 15: 414-

417.

PEARN J. Incidence, prevalence and gene frequency studies of chronic childhood spinal

muscular atrophy. J Med Genet. 1978d. 15: 409-413.

PEARN J. Spinal muscular atrophies. In: Emery AEH, Rimoin DL. Eds. Principles and

Practice of medical genetics. New York. Churchill Livingstone. 1990. 565-578.


115

PENNINGTON RJT. Clinical biochemistry of muscular dystrophy. British Medical Bulletin.

1980. 36: 123-126.

PIERI PDE C, NOGUEIRA JDE A, MARQUES-DIAS MJ, RESENDE B, KIM CA, REED

UC, OKAY TS. A duplex allele-specific amplification PCR to detect SMN1 deletion.

Genet Test Mol Biomarkers. 2009. 13(2):205-208.

PÖCH H & BECKER PE. Eine muskeldystrophie auf einem altagyptishen Relief. Nervenarzt.

1955. 26: 528-530.

PRIOR TW, BIASCO PA, DOVE JL, LESHNER RT AND GRUEMER HD. Use of DNA

probes in detecting carriers of Duchenne Muscular Dystrophy: Selected case studies.

Clinical Chemistry 1989; 35(4):679-683.

PROSSER EJ, MURPHY EG, THOMPSON MW. Intelligence and the gene for Duchenne

muscular dystrophy. Archives of Disease in childhood. 1969. 44: 221-230.

RAGOT T, VINCENT N, CHAFEY F, VIGNE E, GILGENKRANTZ H, COUTON D,

CARTAUD J, BRIAND P, KAPLAN JC, PERRICAUDET M, KAHAN A. Efficient

adenovirus-mediated transfer of a human minidystrophin gene to skeletal muscle of mdx

mice. Nature. 1993. 361: 647-650.

RAY PN, BELFALL B, DUFF C, LOGAN C, KEAN V, THOMPSON MW, SYLVESTER

JE, GORSKY JL, SCHMICKEL RD, WORTON RG. Cloning of the breakpoint of an X,

21 translocation associated with Duchenne muscular dystrophy. Nature. 1985. 318:672-

675.

REED UC. Neuromuscular disorders. J Pediatr. 2002. 78 Suppl 1: 89-103.

REED UC. Síndrome da criança hipotônica. In Diament A.; Cypel S. 4º Edição. São Paulo.

Editora Atheneu. 2005. 1431-1462.

ROCHETTE CF, GILBERT N, SIMARD LR. SMN gene duplication and the emergence of

the SMN2 gene occurred in distinct hominids: SMN2 is unique to Homo sapiens. Hum

Genet. 2001. 3: 255-266.

RODRIGUES NR, OWEN N, TALBOT K, PATEL S, MUNTONI F, IGNATIUS J,

DUBOWITZ V, DAVIES KE. Gene deletions in spinal muscular atrophy. J Med Genet.

1996. 33: 93-96.

ROMANISH MT, NAKAMURA H, LAI CB, WANG Y, MAGER DL. A novel protein

isoform of the multicopy human NAIP gene derives from intragenic Alu SINE

promoters. PLoS One. 2009. 4(6): e5761.

ROSS MH, ROMRELL LJ. Histology: A text and Atlas 1993. Editora Panamericana, SP.

ROY N, MAHADEVAN MS, MCLEAN M, SHUTLER G, YARAGHI Z, FARAHANI R,

BAIRD S, BESNER-JOHNSTON A, LEFEBVRE C, KANG X, SALIH M, AUBRY H,

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Pieri%20Pde%20C%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Nogueira%20Jde%20A%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Marques-Dias%20MJ%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Resende%20B%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Kim%20CA%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Reed%20UC%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Reed%20UC%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Okay%20TS%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus





116

TAMAI K, GUAN X, IOANNOU P, CRAWFORD TO, DE JONG PJ, SURCH L,

IKEDA JE, KORNELUX RG, MACKENZIE A. The gene for neuronal apoptosis

inhibitory protein is partially deleted in individuals with spinal muscular atrophy. Cell

1995. 80:167-178.

RUSSMAN BS, BUNCHER CR, WHITE M, SAMAHA FJ, IANNACCONE ST. Function

changes in spinal muscular atrophy II and III. The DCN/SMA group. Neurology. 1996.

47: 973-976.

SCHORER CE. Muscular dystrophy and the mind. Psychosomatic Medicine. 1964. 26: 5-13.

SELIG S, BRUNO S, SCHARF JM, WANG CH, VITALE E, GILLIAM TC, KUNKEL LM.

Expressed cadherin pseudogenes are localized to the critical region of the spinal

muscular atrophy gene. Proc Natl Acad Sci USA. 1995. 92: 3702-3706.

SHAPIRA F, DREYFUSS JC, SHAPIRA G, DEMOS J. Étude de l’aldolase et de la créatine

kinase du sérum chez les mères de myopathes. Revue Française Étude Cliniques et

Biologiques. 1960. 5: 990-994.

SHAPIRA F & DREYFUSS JC. Biochemistry of progressive muscular dystrophy. In

Muscular dystrophy in man and animal. 1963. 47-48.

SHETH P, ABDELHAK S, BACHELOT MF, BURLET P, MASSET M, HILLAIRE H,

CLERGET-DARPOUX F, FREZAL J, LATHROP GM, MUNNICH A, MELKI J.

Linkage analysis in spinal muscular atrophy, by six closely flanking markers on

chromosome 5. Am J Hum Genet. 1991. 48: 764-768.

SILVESTRE M. 1899 apud PEARN J. 1990.

SMITH JB, PATEL A. The Wohlfart-Kugelberg-Welander disease. Neurology. 1965. 15:

469.

SOARES VM, BRZUSTOWICZ LM, KLEYN PW, KNOWLES JA, PALMER DA,

ASOKAN S, PENCHASZEDEH GK, MUNSAT TL, GILLIAM TC. Refinement of the

spinal muscular atrophy locus to the interval between D5S435 and MAP-1B. Genomics.

1993. 15: 365-371.

SOSSI V, GIULI A, VITALI T, TIZIANO F, MIRABELLA M, ANTONELLI A, NERI G,

BRAHE C. Premature termination mutations in exon 3 of the SMN1 gene are associated

with exon skipping and a relatively mild SMA phenotype.

Eur J Hum Genet. 2001. 2: 113-120.

SPIEGLER AWJ, HAUSMANOWA-PETRUSEWICZ I, BORKOWSKA J, KLOPOCKA A.

Population data on acute infantile and chronic childhood spinal muscular atrophy in

Warson. Hum Genet. 1990. 85: 211-214.




117

STEWART H, WALLACE A, MCGAUGHRAN J, MOUNTFORD R, KINGSTON H.

Molecular diagnosis of spinal muscular atrophy. Arch Dis Child. 1998. 6: 531-535.

SUGITA H, ARAHATA K, ISHIGURO T, SUHARA Y, TSUKAHARA T, ISHIURA S,

EGUCHI C, NONAKA I, IZAWA E. Negative immunostaining of Duchenne muscular

dystrophy (DMD) and mdx muscular surface membrane with antibody against synthetic

peptide fragment predicted from DMD cDNA. Proceedings of the Japan Academy. 1988.

64: 37-39.

SUMNER CJ, HUYNH TN, MARKOWITZ JA, PERHAC JS, HILL B, COOVERT DD,

SCHUSSLER K, CHEN X, JARECKI J, BURGHES AH, TAYLOR JP, FISCHBECK

KH. Valproic acid increases SMN levels in spinal muscular atrophy patient cells. Ann

Neurol. 2003. 54(5):647-654.

SURA T, EU-AHSUNTHORNWATTANA J, PINGSUTHIWONG S, BUSABARATANA

M. Sensitivity and frequencies of dystrophin gene mutations in Thai DMD/BMD patients

as detected by multiplex PCR. Dis Markers. 2008. 25(2):115-121.

SURONO A, TAKESHIMA Y, WIBAWA T, IKEZAWA M, NONAKA I, MATSUO M.

Circular dystrophin RNAs consisting of éxons that were skipped by alternative splicing.

Human molecular Genetics. 1999. 8(3): 493-500.

TALBOT K, DAVIES KE. Spinal muscular atrophy. Semin Neurol. 2001. 21(2): 189-197.

Review.

TAKEMASA T, SUGIMOTO K, MIYAZAKI M, MACHIDA M, IKEDA S, HITOMI Y.

Simple method for the identification of oxidative fibers in skeletal muscle. European

Journal of Applied Physiology. 2004. 91: 357-359.

THEODOSIOU AM, MORRISON KE, NESBIT AM, DANIELS RJ, CAMPBELL L,

FRANCIS MJ, CHRISTODOULOU Z, DAVIES KE. Complex repetitive arrangements

of gene sequence in the refined candidate region of the spinal muscular atrophy gene in

5q13. Am J Hum Genet. 1994. 55: 1209-1217.

THOMPSON MW. The genetic transmission of muscle disease. In mycology (eds AG Engel

& BQ Banker). McGraw-Hill Book Co, New York. 1986. (1): 1151-1184.

THOMPSON MW, MC INNES RR, WILLARD HF. Genética Médica. Rio de Janeiro,

Guanabara. 1993.

THOMPSON WHS. Serum enzyme studies in acquired disease of skeletal muscle. Clinica

Chimica Acta. 1971. 35: 193-199.

TIZIANO FD, PINTO AM, FIORI S, LOMASTRO R, MESSINA S, BRUNO C, PINI A,

PANE M, D'AMICO A, GHEZZO A, BERTINI E, MERCURI E, NERI G, BRAHE C.



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Tiziano%20FD%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Pinto%20AM%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Fiori%20S%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Lomastro%20R%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Messina%20S%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Bruno%20C%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Pini%20A%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Pane%20M%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22D'Amico%20A%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Ghezzo%20A%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Bertini%20E%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Mercuri%20E%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Neri%20G%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Brahe%20C%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus


118

SMN transcript levels in leukocytes of SMA patients determined by absolut real-time

PCR. Eur J Human Genet. 2009.

TSUKAGOSHI H, SUGITA H, FURUKAWA T, TSUBAKI T, ONO E. Kugelberg-

Welander syndrome with dominant inheritance. Arch Neurol. 1966. 14: 378-381.

VELASCO E, VALERO C, VALERO A, MORENO F, HERNÁNDEZ-CHICO C. Molecular

analysis of the SMN and NAIP genes in spanish spinal muscular atrophy (SMA) families

and correlation between number of copies BCD541 and SMA phenotype. Hum Mol

Genet. 1996. 5: 257-263.

VERELLEN C, MARKOVIC V, DE MEYER R, FREUND M, LATERRE C, WORTON R.

Expression of an X-linked recessive disease in a female due to non-random inactivation

of the X chromosome. American Journal of Human. 1978. 30: 97 A (Abstract).

WALLAR PH, REECE JM. Ocular findings in a patient with Kugelberg-Welander syndrome:

a case report. J Pediatr Ophthalmol Strabismus. 1978. 15: 15-18.

WANG CH, XU J, CARTER TA, ROSS BM, SUGARMAN EA, ALITTO BA,

PENCHASZADEH GK, MUNSAT TL, GILLIAM TC. Analysis of the survival motor

neuron (SMN) gene in spinal muscular atrophy families. Am J Hum Genet. 1995. 57:

253.

WANG H, YANG I, JONG Y. Evaluation of muscle strength in pacients with spinal muscular

atrophy. Kaohsiung J Med. 2002. 18: 241-247.

WEISS A, LEINWAND LA. The mammalian myosin heavy chain gene family. Annual

Review of Cell and Developmental Biology. 1996. 12: 417-439.

WELLS DJ, WELLS KE, WALSH FS. Human dystrophin expression corrects the myopathic

phenotype in transgenic mdx mice. Human Molecular Genetics. 1992. 1: 35-40.

WERDNIG G, 1891 apud PEARN J. 1990.

WHEWAY JM, ROBERTS RG. The dystrophin lymphocyte promoter revisited: 4.5-

megabase intron, or artifact? Neuromuscul Disord. 2003. 13(1): 17-20.

WHITTLE MR. Famílias brasileiras diagnosticadas com atrofia muscular espinhal proximal

crônica (tipo Kugelberg-Welander). Estudo de ligação genética com marcadores do

cromossomo 5. São Paulo. 1991. Tese de Mestrado – Instituto de Química da

Universidade de São Paulo.

WILCOX DE, COOKE A, COLGAN J, BOYD E, AITKEN DA, SINCLAIR L, GLASGOW

L, STEPHENSON JBP, FERGUSON-SMITH MA. Duchenne muscular dystrophy due to

familial Xp21 deletion detectable by DNA analysis and flow cytometry. Human

Genetics. 1986. 73: 175-180.


119

WINDSOR EJ, MURPHY EG, THOMPSON MW, REED TE. Genetics of childhood spinal

muscular atrophy. J Med Genet. 1971. 8: 143-148.

WINTER RM, PEMBREY ME. Does unequal crossing over contribute to the mutation rate in

Duchenne muscular dystrophy? Am J Med Genet. 1982.12(4): 437-41.

WIRTH B, VOOSEN B, ROHRIG D, KNAPP M, PIECHACZEK B, RUDNIK-

SHONEBORN S, ZERRES K. Fine mapping and narrowing of the genetic interval of the

spinal muscular atrophy region by linkage studies. Genomics 1993. 15:113-118.

WIRTH B, RUDNIK-SHONEBORN S, HAHNEN E, ROHRIG D, ZERRES K. Prenatal

prediction in families with autossomal recessive proximal spinal muscular atrophy

(5q11.2-q13.3): molecular genetics and clinical experience in 109 cases. Prenatal Diag

1995. 15:407-417.

WIRTH B. An update of the mutation spectrum of the survival motor neuron gene (SMN1) in

autosomal recessive spinal muscular atrophy (SMA). Hum Mutat. 2000. 3: 228-237.

WOLFF JÁ, MALONE RW, WILLIAMS P. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo.

Science. 1990. 247: 1465-1468.

WORDEN DK & VIGNOS PJ. Intellectual function in childhood progressive muscular

dystrophy. Pediatrics. 1962. 29: 968-977.

YASUDA N, KONDO K. The effect of parental age on rate of mutation for Duchenne

Muscular dystrophy. Am J Med Genet. 1982. 13(1): 91-99.

YOSHIDA M, MIZUNO Y, NONAKA I, OZAWA E. A dystrophin-associated glycoprotein,

A3a (one of 43DAG doublets), is retained in Duchenne muscular dystrophy muscle. J

Biochem. 1993. 114(5):634-639.

ZATZ M. Atividade de creation-fosfoquinase (CPK) e estudos de ligação em distrofias

musculares progressivas de herança ligada ao X. Tese de Doutorado, Instituto de

Biociências, USP. 1973. São Paulo, Brasil.

ZATZ M, FROTA-PESSOA O, LEVY JÁ, PERES CA. Creatine-phosphokinase (CPK)

activity in relatives of patients with X-linked muscular dystrophies: a Brazilian study.

Journal de Genetique Humain. 1976. 24(2): 153-168.

ZATZ M, SCHAPIRO LJ, CAMPION DS, ODA E, KABACK MM. Serum pyruvate-kinase

(PK) and creatine-phosphokinase (CPK) in progressive muscular dystrophies. J of Neurol

Sciences. 1978. 36: 349-362.

ZATZ M, VIANNA-MORGANTE AM, CAMPOS P, DIAMENT AJ. Translocation (X;6) in

a female with Duchenne muscular dystrophy: implications for the localization of DMD

locus. Journal of Medical Genetics. 1981. 18: 442-447.




http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Yasuda%20N%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kondo%20K%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract




120

ZATZ M, RAPAPORT D, PASSOS MR, LEVY JA. Becker-type muscular dystrophy in a

mother of three boys affected by Duchenne muscular dystrophy: a follow-up study.

Revista Brasileira de Genética. 1987. 2: 375-384.

ZATZ M, RAPAPORT D, VAINZOF M, PASSOS-BUENO MR, BORTOLINI ER,

PAVANELLO RCM, PEPES CA. Serum creatine-kinase (CK) and pyruvate-kinase (PK)

activities in Duchenne (DMD) as compared with Becker (BMD) muscular dystrophy. J

Neurol Sci. 1991. 102: 190-196.

ZELLWEGER H & NIEDERMEYER E. Central nervous system manifestations in childhood

muscular dystrophy I. Annales of Paediatrics. 1965. 205: 25-42.

ZELLWEGER H, SCHNEIDER DR, SCHULDT DR, MERGNER W. Heritable spinal

muscular atrophies. Helv Pediatr Acta. 1969. 24: 92-105.

ZELLWEGER H. The genetic heterogeneity of spinal muscular atrophy (SMA). In: Bergsma

D. Ed. The 2nd conf clin delineation of birth defects, original article series. New York.

The National Foundation. 1971. 82-89.

ZERRES K, GRIMM T. Genetic counseling in families with spinal muscular atrophy type

Kugelberg-Welander. Hum Genet. 1983. 65: 74-75.

ZERRES K, RUDNIK-SHÖNEBORN S. Natural history in proximal spinal analysis of 445

patients and suggestions for a modification of existing classifications. Arch Neurol. 1995.

52: 518-523.

ZERRES K, WIRTH B, RUDNIK-SHÖNEBORN S. Spinal muscular atrophy-clinical and

genetic correlations. Neuromuscul Disord. 1997. 7(3): 202-207.

ZUBRZYCKA-GAARN EE, BULMAN DE, KARPATI G, BURGHES AHM, BELFALL B,

KLAMUT HJ, TALBOT J, HODGES RS, RAY PN, WORTON RG. The Duchenne

muscular dystrophy gene product is localized in sarcolemma of human skeletal muscle.

Nature. 1988. 333: 466-469.

ANEXOS

121

88.. AANNEEXXOOSS

8.1. ANEXO 1: APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA (CEP).

ANEXOS

122

8.2. ANEXO 2: AVALIAÇÃO DA COMISSÃO NACIONAL DE ÉTICA EM PESQUISA.

ANEXOS

123

8.3. ANEXO 3: TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE). Investigador principal no IPPMG: Dra. Alexandra Prufer de Queiroz Campos Araújo Serviço de Neuropediatria. Demais Investigadores: Vivianne Galante Ramos e Dr. Pedro Hernán Cabello Laboratório de Genética Humana DGEN-IOC.

CARTA DE CONSENTIMENTO Eu _______________________________________ permito que meu (minha) filho (a) _______________________________ faça parte deste grupo de estudo. Discuti com o médico responsável pelo acompanhamento do (a) meu (minha) filho (a) sobre o estudo, recebendo todas as orientações. Entendi o propósito do estudo, sabendo tratar-se de pesquisa que visa estudar a caracterização genética e molecular da Atrofia Muscular Espinhal (AME), nas crianças e seus familiares diretos (mãe e pai). Sei que meu (minha) filho (a) irá à sua próxima coleta de sangue de rotina, ter parte deste sangue (um total de 5 ml) reservado para um exame especial, que será realizado no Laboratório de Genética Humana DGEN-IOC. O mesmo acontecerá com os demais membros da família. Informações do prontuário serão resumidas em uma ficha. A assistência médica não será modificada em função da aceitação ou não em participar desta pesquisa. A participação de meu (minha) filho (a) nesta pesquisa não envolverá custo adicional. As informações obtidas através dessa pesquisa manterão o seu anonimato, serão confidenciais, serão divulgadas apenas sob forma de publicação científica. O sangue do (a) meu (minha) filho (a) colhido e enviado para este exame de análise genética molecular para os genes envolvidos na AME não será usado de outra maneira. Caso haja resto desse sangue, o mesmo será jogado fora. Caso venha ser necessário, em função do resultado deste exame qualquer modificação nos cuidados recebidos, isto será feito. O desenvolvimento de técnicas e métodos de diagnóstico molecular específico ajuda em um melhor aconselhamento genético e a aplicação do tratamento adequado das doenças. É possível que este tipo de exame no futuro venha evitar que outras crianças com problemas semelhantes sejam submetidas a exames que causam desconforto, como a eletroneuromiografia e a biópsia muscular. Posso desistir de sua participação a qualquer momento sem que isto interfira no tratamento futuro do (a) meu (minha) filho (a) neste hospital (Instituto de Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira - IPPMG). Estou ciente de poder fazer quaisquer perguntas a qualquer momento. Compreendo que no caso de dano físico que resulte diretamente dos procedimentos da pesquisa, o pesquisador principal bem como o IPPMG assumirão a responsabilidade de fornecer a assistência integral às complicações e danos decorrentes dos riscos previstos neste estudo. Sei que esta pesquisa foi submetida ao Comitê de Ética em Pesquisa Humana do Instituto de Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira. Assinatura do Paciente: __________________________________________ Assinatura do Responsável: __________________________________________ Assinatura da Testemunha: __________________________________________

ANEXOS

124

8.4. ANEXO 4: FICHA DE ANAMNESE.

PRONTUÁRIO: ___________ NÚMERO NA PESQUISA DATA DE NASCIMENTO: DATA DA PRIMEIRA CONSULTA NA NEURO/IPPMG: BIÓPSIA MUSCULAR

sim não Data: Local: Resultado: ELETRONEUROMIOGRAFIA

sim não Data: Local: Resultado: HISTÓRIA FAMILIAR

sim não CONSANGÜINIDADE

sim não HEREDOGRAMA Data e Idade da Percepção dos 1os Sintomas: (Idade ______ ) Data e Idade do Diagnóstico Definitivo: (Idade ______ ) MARCOS DO DESENVOLVIMENTO:

Movimentos intra-uterinos presentes sim não Sustentar à cabeça sim não (idade em meses ___) Sentar sim não (idade em meses ___) Ficar de pé sim não (idade em meses ___) Andar sim não (idade em meses ___)

COMPLICAÇÕES CLÍNICAS

sim não Pneumonia sim não (quantas?____) Internação sim não (quantas?____) Gastrostomia sim não (data ) Traqueostomia sim não (data ) Outras complicações sim não (quais?)

EXAME FÍSICO Cor da pele/etnia Branco Negro Mulato Indígena Oriental

Atrofia sim não (localização _______) Paresia sim não (localização _______) Hipo/arreflexia sim não (localização _______) Fasciculações sim não (localização _______)

ANEXOS

125

Alterações de Nervos Cranianos sim não (quais? ___________) Alterações de Sensibilidade sim não (quais/localização___)

OUTROS EXAMES COMPLEMENTARES

DATA EXAME (RESULTADO)

FORMA DE ATROFIA MUSCULAR ESPINHAL

(caso a suspeita seja Atrofia Muscular Espinhal)

Tipo I

Tipo II

Tipo III

Outro (qual _________________________________________________)

ANEXOS

126

8.5. ANEXO 5: IDENTIFICAÇÃO DE FAMILIARES CUJO SANGUE FOI COLHIDO IDENTIFICAÇÃO

Nome: ________________________________________________________

Parentesco: ____________________ Número: F

Nome: ________________________________________________________


Nome: ________________________________________________________


Nome: ________________________________________________________


ANEXOS

127

8.6. ANEXO 6: ESCALA DOS MARCOS MOTORES DENVER II

ANEXOS

128

8.7. ANEXO 7: PROGRAMA DISAME (EM LINGUAGEM PERL) #!/usr/bin/perl use strict; ########################################################################### # Vivianne Galante Ramos - Pedro H. Cabello # # # (21/10/09) # # # Script para executar o algoritmo “DisAme” # # # # # ########################################################################### # Declarando variaveis my $SA = ""; my $SD = ""; # $SA = 0; #1.- Faça SA = 0 #$ SD = 0; #2.- Faça SD = 0 print $SD; print $SA; print "Digite o sexo: F ou M (femenino/masculino):\n"; my $sexo = <STDIN>; print "Apresenta Pseudo-Hipertrofia: S ou N (sim/nao)\n"; my $pse_hiper = <STDIN>; print "Digite o valor de CK: (en XXX unidades):\n"; my $CK = <STDIN>; print "Apresenta Hipotonia: S ou N (sim/nao)\n"; my $hipot = <STDIN>; print "Digite a idade dos primeiros sintomas: (en meses):\n"; my $idade = <STDIN>; print "Sustenta a cabeça: S ou N (sim/nao)\n"; my $sust_cab = <STDIN>; print "Tem atrofia: S ou N (sim/nao)\n"; my $atrof = <STDIN>; print "Apresenta fasciculações: S ou N (sim/nao)\n"; my $fasci = <STDIN>; print "Apresenta ENMG: L ou G (normal ou nao_tiver_informacao/neurogênico)\n"; my $enmg = <STDIN>;

ANEXOS

129

print "Apresenta reflexos: L ou H (normal ou nao_tiver_informacao/hiporeflexia)\n"; my $reflexo = <STDIN>; print "Apresenta problemas relacionados a nervos craniais: S ou N (sim/nao)\n"; my $nervo_cranial = <STDIN>; print "Apresenta movimentos Intra-Uterinos durante a gravidez: S ou N (sim/nao)\n"; my $movim_intraut = <STDIN>; print "Sentou a tempo: S ou N (sim/nao)\n"; my $sentar = <STDIN>; print "Ficou em pé: S ou N (sim/nao)\n"; my $ficou_pe = <STDIN>; print "Andou: S ou N (sim/nao)\n"; my $andou = <STDIN>; if ($sexo =~ /F/i) { #3.- Sexo: Se feminino, faça SA = SA + 1 e continue $SA = $SA + 1} #else { # print "sexo M, que faco... ou paro(exit)"} print $SA."aaaa\n"; if ($pse_hiper =~ /S/i) { #4.- Se apresenta Pseudo-Hipertrofia, faça SD = SD + 1 $SD = $SD + 1} if ($CK =~ /\d/) { if ($CK > 10) { #5.- Se CK > 10xNormal, faça SD = SD + 1 e continue $SD = $SD + 1 } #}else { # print "Error, deve ingresar um numero para CK, deve exit\n" #} if ($hipot =~ /S/i) { #6.- Se apresenta Hipotonia, faça SA = SA + 1 e continue $SA = $SA + 1} if ($idade =~ /\d/) { #7.- Se a idade dos Primeiros sintomas é < 6 meses, faça SA = SA + 1 e 1 continue if ($idade < 6){ $SA = $SA + 1 } } else { print "Error, deve ingresar um numero para idade, deve exit\n" } if ($sust_cab =~ /S/i) { #8.- Se sustenta a cabeça, faça SD = SD + 1 e continue $SD = $SD + 1} if ($atrof =~ /S/i) { #9.- Se tiver atrofia, faça SA = SA + 1 e continue $SA = $SA + 1}

ANEXOS

130

if ($fasci =~ /S/i) { #10.- Se apresenta fasciculações, faça SD = SD + 1 e continue $SD = $SD + 1} if ($enmg =~ /L/i) { #11.- Se apresenta ENMG Normal ou não tiver informação, vá para 13 print "ENMG normal ou não tem informação\n"} if ($enmg =~ /G/i) { #12.- Se apresentar ENMG Neurogênico, faça SA = SA + 1 e continue $SA = $SA + 1} if ($reflexo =~ /L/i) { #13.- Se tiver reflexos normais ou não tiver informação vá para 15 print "Reflexo normal ou nao tem informacao\n"} if ($reflexo =~ /H/i) { #14.- Se apresenta Hiporeflexia, faça SD = SD + 1 e continue $SD = $SD + 1} if ($nervo_cranial =~ /S/i) { #15.- Se apresenta problemas relacionados a nervos craniais, faça SA = SA + 1 e continue $SA = $SA + 1} if ($movim_intraut =~ /N/i) { #16.- Se não apresentou Movimentos Intra-Uterinos durante a gravidez, faça SA = SA + 1 e continue $SA = $SA + 1} if ($sentar =~ /N/i) { #17.- Se não sentou a tempo, faça SA = SA + 1 e continue $SA = $SA + 1} if ($ficou_pe =~ /N/i) { #18.- Se não ficou em pé, faça SA = SA + 1 e continue $SA = $SA + 1} if ($andou =~ /S/i) { #19.- Se andou, faça SD =SD +1 e continue $SD = $SD + 1} if ($SD < $SA) { #20.- Se SD < SA, vá para 23 print "emitir laudo de atrofia\n".$SA;} if ($SD > $SA) { print "emitir laudo de distrofia\n".$SD;} if ($SD eq $SA) { print "fazer testes aternativos\n";} print "BYE"; ####21.- Testar para DMD/B #22.- Se DMD/B (+) vá para 26 ###if ($dmdb = "+") { ### print "emitir laudo"} ####23.- Testar para AME ####24.- Se AME (+) vá para laudo ###if($ARG_AME = "+") { ### print "emitir laudo"} ####25.- Testar outras doenças ####26.- Emitir Laudo #27.- Fim

APÊNDICE

131

9. APÊNDICE

Molecular Analysis of the SMN and NAIP genes in Brazilian Spinal Muscular Atrophy

Patients

Vivianne Galante Ramos1, Flávia Lima dos Santos1, Silvia Regina Sampaio Freitas1,2,

Alexandra Prufer Araújo3, Pedro Hernán Cabello1

Authors’s institutional affiliation:

1 Laboratory of Human Genetics, Oswaldo Cruz Institute, Oswaldo Cruz Foundation, Rio de

Janeiro, RJ, Brazil

2 Laboratory of Genetics and Molecular Cardiology, Heart Institute/InCor, University of São

Paulo Medical School, São Paulo, Brazil;

3 Martagão Gesteira Pediatrics Institute, Rio de Janeiro Federal University, Rio de Janeiro,

RJ, Brazil

Running Title: Molecular investigation of SMA

Key Words: Polymorphism, Genetics, Nested-PCR, Survival motor neuron, Neuronal

apoptosis inhibitory protein

Correspondence to:

Pedro Hernan Cabello, PhD.

Laboratório de Genética Humana, Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ

Pavilhão Leônidas Deanne, 6° andar, sala 615

Av. Brasil, 4365 – Manguinhos, Rio de Janeiro, RJ, Brazil, 21045-900

APÊNDICE

132

Telephone: (+55 21) 3865-8214, Fax number: (+55 21) 2260-4282

e-mail: [email protected]

Abstract:

Spinal muscular atrophy (SMA) is an autossomal recessive disorder which results in

progressive muscle weakness and atrophy due to the anterior horn cells of the spinal cord

degeneration. Three types of SMA are recognized depending on the age of onset and clinical

severity: SMA-I, SMA-II and SMA-III. Two candidate genes, the survival of motor neuron

(SMN) has been identified as a SMA determining gene, whereas the neuronal apoptosis

inhibitory protein (NAIP) is considered to be a modifying factor of the severity of SMA. The

main objective of this study was to analyse the deletion of SMN and NAIP genes in a sample

of Brazilian children with clinical symptoms of SMA. With this purpose, polymerase chain

reaction (PCR) combined with restriction fragment length polymorphism (RFLP) was

performed to detect the deletion of both genes in twenty-five patients (3 SMA-I, 9 SMA-II

and 13 SMA-III). Deletion of exons 7 and/or 8 of the SMN gene was found in 67% of patients

with SMA-II and in 62% of SMA-III. Homozygous deletion for both exons in SMN and NAIP

genes were detected in 100% of SMA-I patients, 33% SMA-II and 15% SMA-III. Moreover,

no deletion of SMN and NAIP genes was found in 11 parents, 2 unaffected sibs and 40 normal

controls evaluated. The findings of homozygous deletion of exons 7 and 8 of SMN gene

confirmed the diagnosis of SMA, and suggested that the deletion of SMN exon 7 is a major

cause of SMA in Brazilian patients, and NAIP gene may be a modifying factor for disease

severity. According with our results, we suggested that molecular diagnosis system based on

PCR-RFLP analysis could conveniently be applied in the clinical testing, genetic counseling,

prenatal diagnosis of SMA.

APÊNDICE

133

Spinal muscular atrophy (SMA) is a disorder characterized by degeneration of the anterior

horn cells of the spinal cord. The worldwide prevalence of SMA is one in 6000 newborns

(Darras and Kang 2007), making it the most common autossomal recessive disorder after

cystic fibrosis and the second most common neuromuscular disorder after Duchenne muscular

dystrophy. SMA has been traditionally classified into three clinical forms according to the age

of onset and clinical severity (Munsat and Davies 1992): a) SMA-I is the most severe form

with onset in utero or within the few months of life. Affected patients never achieve the

ability to sit unsupported and usually die from respiratory complications before two years of

age; b) SMA-II usually manifests within the first two years of life and although affected

children may sit unaided, they never achieve the ability to walk independently. The survival

of these patients depends on the degree of respiratory complications; and c) SMA-III or

Kugelberg-Welander disease is the mildest form of the disorder and is characterized by a later

age of onset (after 24 months) and variable clinical severity. Affected individuals may walk

independently and have a normal life expectancy.

Linkage analysis mapped all three SMA types to chromosome 5q11.2–13.3 (Brzustowicz et

al. 1990; Lefebvre et al. 1995; Melki et al. 1990; Roy et al. 1995), a complex and unstable

region harbouring a 500kb duplication which results in two copies (a telomeric and a

centromeric) of any gene found within the duplication. Telomeric copies of the survival motor

neuron (SMN1) gene (exon 7 and 8 in particular) have been shown to be deleted in

approximately 95% of SMA patients. Single base exchanges (840C<T) in exons 7 and 8 allow

one to distinguish centromeric (SMN2) from telomeric SMN copies through polymerase chain

reaction (PCR) followed by restriction enzyme analysis assay. Molecular studies have shown

that a vast majority of SMA patients have homozygous deletions of exons 7 and/or 8 on the

SMN1 telomeric copy independent of the severity of the disease (Lefebvre et al. 1995). On the

other hand, deletions events in neuronal apoptosis inhibitory protein gene (NAIP) are

APÊNDICE

134

apparently higher in SMA-I patients than SMA-II and SMA-III, and therefore seem to affect

the disease severity (Roy et al. 1995).

In this study, we aim to confirm clinical diagnosis of Brazilian SMA patients and to correlate

the frequency of genetic variants within SMN and NAIP genes with spinal muscular atrophy.

With this purpose, twenty-five patients (aged 3 months to 8 years) with a characteristic SMA

clinical picture were screened for deletions in SMN and NAIP genes. Affected patients were

classified into three subgroups according to the criteria of the International SMA Consortium

(Munsat and Davies 1992) as follows: 3 were grouped as SMA-I, 9 as SMA-II and 13 as

SMA-III. All patients were submitted to neurological and clinical examinations and detailed

information including age at onset, motor development as well as respiratory complications

were recorded. Complementary exams included serum creatine kinase analysis and

electromyography. Patients with an uncertain diagnosis were also submitted to muscle biopsy.

In addition to the 25 affected patients, 11 parents, 2 unaffected sibs and 40 control individuals

were tested for SMN and NAIP genes. Ethics Committee for Research on Human Subject of

Pediatrics Institute of Rio de Janeiro Federal University approved this study and all subjects

gave written informed consent to participate.

The presence of exons 7 and 8 for either SMN1 or SMN2 genes were determined using nested-

PCR followed by restriction enzyme analysis (Fallon et al. 1999). PCR products of exon 8

from SMN1 and SMN2 were readily distinguishable by the presence of the recognition site for

DdeI, which is absent in SMN1 but present in SMN2. For exon 7, a mismatched downstream

oligonucleotide primer, directly adjacent to the variant site that contains the restriction site to

create DraI site in the PCR product of SMN2 exon 7. Amplified products were

electrophoresed on 1% agarose gel for further analysis. PCR-digested products with DraI for

exon 7 and DdeI for exon 8 were electrophoresed on 3% agarose gel. NAIP gene analysis was

APÊNDICE

135

performed by PCR amplification of exons 5, 6 and 13 (which was used as a positive PCR

control) using specific oligonucleotide primers previously described (Roy et al. 1995). PCR

products were visualized by ethidium bromide stained on 2% agarose gels and scored for the

presence or absence of exon 5 and 6 using exon 13 as a positive control.

Genotype-phenotype correlations from SMA patients are summarized in Table 1. Deletions of

exon 7, exon 8 or both in the SMN gene were observed in 54% of the patients with the

following distribution: 3/3 of SMA-I, 6/9 of SMA-II and 8/13 of SMA-III. Among the 14

patients with deletion, 8 had both exons deleted while 4 had deletion only of exon 7: one

SMA-II and three SMA-III. We also found two patients, one SMA-II and one SMA-III, with

only exon 8 deleted. Deletion of both 5 and 6 exons from NAIP gene were found in 3/3 SMA-

I, 1/9 SMA-II and 2/13 SMA-III. No SNM or NAIP gene deletions were found in three SMA-

III patients, 13 parents and 40 controls individuals. By using the genotypes of SMN and NAIP,

three principal haplotypes were identified (Table 1). Haplotype A was seen in 100% of SMA-

I, 33% of SMA-II, and 15% of SMA-III patients. Haplotype B is the most common haplotype

that is observed in 67% of SMA-II patients and 62% of SMA-III. Finally, haplotype C

appears to be the least common among the 3 haplotypes. It is seen in 23% of SMA-III, but it

is not seen among SMA-I and II patients.

Although the role of SMN1and SMN2 genes in the pathogenesis of SMA is still uncertain, the

deletion of SMN1 is the most important clue for diagnosing SMA. Transcripts of the two 20-

kb genes differ only at 2 nucleotides in the terminal exons 7 and 8, but these differences do

not change the sequence of the coded protein. The majority of the SMA patients are

characterized by homozygous deletions of exons 7 and 8 for SMN1 (Kim AC 1999; Liang et

al. 2009; Swaminathan et al. 2008; Watihayati et al. 2007a; Watihayati et al. 2007b). Deletion

of the SMN in the absence of NAIP is sufficient to give the SMA phenotype. Patients with

APÊNDICE

136

additional deletions are more likely to belong to a more severe phenotype. In the present

study, Brazilian SMA patients were analyzed for alterations in the SMN and NAIP genes. Our

results show homozygous deletion of SMN gene exons 7 and 8 in 88% of SMA patients,

which is in agreement with the majority of previous studies (Kim AC 1999; Liang et al. 2009;

Swaminathan et al. 2008; Watihayati et al. 2007a; Watihayati et al. 2007b). The frequency of

homozygous SMN deletion was found in 100% of SMA-I patients, which is similar to some

reports on adult-onset SMA (Kim AC 1999; Liang et al. 2009; Swaminathan et al. 2008;

Watihayati et al. 2007a; Watihayati et al. 2007b). The frequency of homozygous SMN

deletion in SMA-II and SMA-III patients were 67% and 62% respectively. All NAIP-deleted

patients also lacked the SMN gene. We observed a strong correlation between NAIP deletion

and the severity of SMA. The overall frequency of NAIP exons 5 and 6 in our study was 32%.

Deletions of the NAIP gene were seen more frequently in SMA-I patients (100%) compared

with SMA-II (33%) and SMA-III (15%), which is in accordance with previously reported

observations (Kim AC 1999; Liang et al. 2009; Swaminathan et al. 2008; Watihayati et al.

2007a; Watihayati et al. 2007b). Haplotype A that could be formed with SMN and NAIP

deletions was seen in 100% of the SMA-I patients. Interestingly, all SMA-I patients with this

haplotype had a very early onset of symptoms (i.e., at less than 1 month of age). Our results

provide an additional dimension for the phenotype-haplotype correlation in SMA-I.

The PCR-RFLP test used in this study is fast, sensitive, and inexpensive, and forgoes the need

for invasive diagnostic procedure like a muscle biopsy from the patients (mostly children).

Also, it is particularly applicable for prenatal diagnosis and pre-implantation genetic

diagnosis. The limitation of this method is that smaller rearrangements or point mutations of

SMN gene can also result in a large series of SMA patients (Su et al. 2005). Further analyses

revealed that SMN2 copy number has been well established as a modifying factor of clinical

severity. The absence of SMN gene in SMA-I is associated with gene dosage effect, whereas

APÊNDICE

137

no gene dosage effect was detected in SMA-II or SMA-III (Yamashita et al. 2004). These

observations raised the hypothesis of a gene deletion event in SMA-I and a gene conversion

event in SMA-II or SMA-III, which would result in an increased number of SMN2 copies

(Yamashita et al. 2004). Therefore, the copy numbers of SMN1 and SMN2 genes should be

determined by the point mutation and gene dosage analysis. In addition, PCR-based assay for

determining the presence or absence of SMN1 is not quantitative, and therefore, cannot

identify SMA carriers. The genomic complexity of the SMN region and its high degree of

variability hamper the ability to directly screen the SMA carriers. Thus the comprehensive

SMA tests including SMA deletion analysis, linkage analysis, and SMA heterozygosity

detection should be the most complete evaluation of the clinical diagnosis of SMA (Chen et

al. 1999).

APÊNDICE

138

REFERENCES

Brzustowicz LM, Lehner T, Castilla LH, Penchaszadeh GK, Wilhelmsen KC, Daniels R,

Davies KE, Leppert M, Ziter F, Wood D, et al. (1990) Genetic mapping of chronic childhood-

onset spinal muscular atrophy to chromosome 5q11.2-13.3. Nature 344:540-541

Chen KL, Wang YL, Rennert H, Joshi I, Mills JK, Leonard DG, Wilson RB (1999)

Duplications and de novo deletions of the SMNt gene demonstrated by fluorescence-based

carrier testing for spinal muscular atrophy. Am J Med Genet 85:463-469

Darras BT, Kang PB (2007) Clinical trials in spinal muscular atrophy. Curr Opin Pediatr

19:675-679

Fallon L, Harton GL, Sisson ME, Rodriguez E, Field LK, Fugger EF, Geltinger M, Sun Y,

Dorfmann A, Schoener C, Bick D, Schulman J, Levinson G, Black SH (1999)

Preimplantation genetic diagnosis for spinal muscular atrophy type I. Neurology 53:1087-

1090

Kim AC P-BM, Marie SK, Cerqueira A, Contil U, Marques-Dias MJ, Gonzalez CH, Zatz M

(1999) Clinical and molecular analysis of spinal muscular atrophy in brazilian patients.

Genetics and Molecular Biology, pp 487-492

Lefebvre S, Burglen L, Reboullet S, Clermont O, Burlet P, Viollet L, Benichou B, Cruaud C,

Millasseau P, Zeviani M, et al. (1995) Identification and characterization of a spinal muscular

atrophy-determining gene. Cell 80:155-165

Liang YH, Chen XL, Yu ZS, Chen CY, Bi S, Mao LG, Zhou BL, Zhang XN (2009) Deletion

analysis of SMN1 and NAIP genes in Southern Chinese children with spinal muscular

atrophy. J Zhejiang Univ Sci B 10:29-34

Melki J, Abdelhak S, Sheth P, Bachelot MF, Burlet P, Marcadet A, Aicardi J, Barois A,

Carriere JP, Fardeau M, et al. (1990) Gene for chronic proximal spinal muscular atrophies

maps to chromosome 5q. Nature 344:767-768

APÊNDICE

139

Munsat TL, Davies KE (1992) International SMA consortium meeting. (26-28 June 1992,

Bonn, Germany). Neuromuscul Disord 2:423-428

Roy N, Mahadevan MS, McLean M, Shutler G, Yaraghi Z, Farahani R, Baird S, Besner-

Johnston A, Lefebvre C, Kang X, et al. (1995) The gene for neuronal apoptosis inhibitory

protein is partially deleted in individuals with spinal muscular atrophy. Cell 80:167-178

Su YN, Hung CC, Li H, Lee CN, Cheng WF, Tsao PN, Chang MC, Yu CL, Hsieh WS, Lin

WL, Hsu SM (2005) Quantitative analysis of SMN1 and SMN2 genes based on DHPLC: a

highly efficient and reliable carrier-screening test. Hum Mutat 25:460-467

Swaminathan B, Shylashree S, Purushottam M, Taly AB, Nalini A (2008) Deletion analysis

of spinal muscular atrophy in southern Indian population. Neurol India 56:348-351

Watihayati MS, Zabidi-Hussin AM, Tang TH, Matsuo M, Nishio H, Zilfalil BA (2007a)

Deletion analyses of SMN1 and NAIP genes in Malaysian spinal muscular atrophy patients.

Pediatr Int 49:11-14

Watihayati MS, Zabidi AM, Tang TH, Nishio H, Zilfalil BA (2007b) NAIP-deletion analysis

in Malaysian patients with spinal muscular atrophy. Kobe J Med Sci 53:171-175

Yamashita M, Nishio H, Harada Y, Matsuo M, Yamamoto T (2004) Significant increase in

the number of the SMN2 gene copies in an adult-onset Type III spinal muscular atrophy

patient with homozygous deletion of the NAIP gene. Eur Neurol 52:101-106

APÊNDICE

140

Table 1: Genotype-phenotype correlation of 25 Brazilian SMA patients.

Anthropological characteristics SMN and NAIP Haplotypes

Gender Family History EMG* Muscle

biopsy

Haplotype

A

Haplotype

B

Haplotype

C SMA types (n) Age

Male Female Positive Negative Positive

SMA1 (3) 0 – 3 months 2 1 1 2 1 1 3/3 (100%) - -

SMA2 (9) 0 - 18 months 4 5 6 3 3 1 3/9 (33%) 6/9 (67%) -

SMA3 (13) 6 – 84 months 6 8 5 8 3 5 2/13 (15%) 8/13 (62%) 3/13 (23%)

*EMG - electromiography

Haplotype A - deletion in SMN exons 7 and 8, as well as NAIP exons 5 and 6.

Haplotype B - deletion in SMN exons 7 and 8.

Haplotype C - none abnormalities in the examined regions.

APÊNDICE

141

Forwarded message ---------- From: Editor/GMB <[email protected]> Date: 2009/11/13 Subject: RE: submissão de manuscrito To: Pedro Hernan Cabello Acero <[email protected]>

Dear Author,

Within few days we will send you another correspondence to inform the manuscript submission number.

We thank you for submitting to Genetics and Molecular Biology

Cristina de Morais

Assistant

Genetics and Molecular Biology

http://scielo.br/gmb

http://www.gmb.org.br

http://correio.ioc.fiocruz.br/images/blank.png

http://correio.ioc.fiocruz.br/images/blank.png

http://scielo.br/gmb

http://www.gmb.org.br/

Livros Grátis( http://www.livrosgratis.com.br )

Milhares de Livros para Download: Baixar livros de AdministraçãoBaixar livros de AgronomiaBaixar livros de ArquiteturaBaixar livros de ArtesBaixar livros de AstronomiaBaixar livros de Biologia GeralBaixar livros de Ciência da ComputaçãoBaixar livros de Ciência da InformaçãoBaixar livros de Ciência PolíticaBaixar livros de Ciências da SaúdeBaixar livros de ComunicaçãoBaixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNEBaixar livros de Defesa civilBaixar livros de DireitoBaixar livros de Direitos humanosBaixar livros de EconomiaBaixar livros de Economia DomésticaBaixar livros de EducaçãoBaixar livros de Educação - TrânsitoBaixar livros de Educação FísicaBaixar livros de Engenharia AeroespacialBaixar livros de FarmáciaBaixar livros de FilosofiaBaixar livros de FísicaBaixar livros de GeociênciasBaixar livros de GeografiaBaixar livros de HistóriaBaixar livros de Línguas










http://www.livrosgratis.com.br/cat_1/administracao/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_2/agronomia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_3/arquitetura/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_4/artes/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_5/astronomia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_6/biologia_geral/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_8/ciencia_da_computacao/1











http://www.livrosgratis.com.br/cat_9/ciencia_da_informacao/1











http://www.livrosgratis.com.br/cat_7/ciencia_politica/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_10/ciencias_da_saude/1











http://www.livrosgratis.com.br/cat_11/comunicacao/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_12/conselho_nacional_de_educacao_-_cne/1















http://www.livrosgratis.com.br/cat_13/defesa_civil/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_14/direito/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_15/direitos_humanos/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_16/economia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_17/economia_domestica/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_18/educacao/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_19/educacao_-_transito/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_20/educacao_fisica/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_21/engenharia_aeroespacial/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_22/farmacia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_23/filosofia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_24/fisica/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_25/geociencias/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_26/geografia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_27/historia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_31/linguas/1







Baixar livros de LiteraturaBaixar livros de Literatura de CordelBaixar livros de Literatura InfantilBaixar livros de MatemáticaBaixar livros de MedicinaBaixar livros de Medicina VeterináriaBaixar livros de Meio AmbienteBaixar livros de MeteorologiaBaixar Monografias e TCCBaixar livros MultidisciplinarBaixar livros de MúsicaBaixar livros de PsicologiaBaixar livros de QuímicaBaixar livros de Saúde ColetivaBaixar livros de Serviço SocialBaixar livros de SociologiaBaixar livros de TeologiaBaixar livros de TrabalhoBaixar livros de Turismo

http://www.livrosgratis.com.br/cat_28/literatura/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_30/literatura_de_cordel/1











http://www.livrosgratis.com.br/cat_29/literatura_infantil/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_32/matematica/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_33/medicina/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_34/medicina_veterinaria/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_35/meio_ambiente/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_36/meteorologia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_45/monografias_e_tcc/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_37/multidisciplinar/1





http://www.livrosgratis.com.br/cat_38/musica/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_39/psicologia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_40/quimica/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_41/saude_coletiva/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_42/servico_social/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_43/sociologia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_44/teologia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_46/trabalho/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_47/turismo/1







Documents

INSTITUTO OSWALDO CRUZ - Livros Grátislivros01.livrosgratis.com.br/cp127314.pdf · INSTITUTO OSWALDO CRUZ Doutorado em Biologia Celular e Molecular DIAGNÓSTICO MOLECULAR DIFERENCIAL