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INTERAÇÃO ANTÍGENO-ANTICORPO Dayse Locateli 2005

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INTERAÇÃO

ANTÍGENO-ANTICORPO

Dayse Locateli2005

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Ligações não covalentes:

•Pontes de Hidrogênio

• Ligações iônicas

• Interações hidrofóbicas

• Interações de Van der Waals

Interação reversível

Complementariedade

Especificidade

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AfinidadeForça de interação entre um único sítio de ligação Ag-Ac (em um único epítopo).

AvidezForça de interações total entre Ac e Ag.

Soma das afinidades de todos epítopos envolvidos

Reação cruzadaDois Ag diferentes apresentam um epítopo idêntico

Ac específicos para um epítopo se ligam a um epítopo não relacionado, mas com propriedades químicas similares.

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Pesquisa

Diagnóstico

Soroepidemiológia

Métodos:

Precipitação

Aglutinação

Imunoensaios

Aplicações

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Metodologias que utilizam:

1) Reagentes não marcados• Reação de precipitação• Reação de aglutinação

2) Reagentes marcados• RIA• ELISA • Imunofluorescência• Western Blot

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Reagentes não marcados

Detectam / quantificam as conseqüências da ligação Ag – Ac

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Interação: ac - ag solúvel forma uma rede que pode desenvolver um precipitado visível.

Anticorpos bivalentes

+

Antígenos multivalentes

Reação de Precipitação

PRECIPITADO

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1- Reação de precipitação em soluções

Reação quantitativa:•Qtidade cte Ac•Qtidade cresc. Ag

Qtidade precipitina

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2 - Reação de Precipitação em gel

Utiliza uma matriz de ágar

Ag + Ac = linha de precipitação visível

a) Imunodifusão radial

(Método de Mancini)

• Ag ou Ac fixos

• Dosagem de proteínas séricas

b) Imunodifusão dupla

• Identidade de Ags = Ac de reatividade conhecida

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Reações de Aglutinação

Ac + Ag particulado aglutininas

Agregação visível de partículas

• Efeito pró-zona

EritrócitosBactériasFungoslátex

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Aglutinação Direta

Tipagem ABO

Testes confirmatórios para sífilis

Células ou partículas insolúveis + Ac = Aglutinação

• Detecção Acs específicos• Quantificação

Aglutinação bacterianaPresença de infecçãoDiferenciação de espécies

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Aglutinação passiva

Ag solúveis associados a outras superfícies(Partículas de látex ou superfície de hemácias)

+

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Inibição da Aglutinação

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Reagentes Marcados

Detectam / quantificam diretamente a ligação Ag - Ac

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Ensaio Imunoadsorvente Ligado à Enzima - ELISA

substrato (incolor)

Qualitativos Quantitativos

Direto = Ag Indireto = Ac

Ac marcados com Enzimas + + = CORAg

Fosfatase alcalinaPeroxidaseB-galactosidase

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ELISA Indireto

ELISA Direto ou Sanduíche

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ELISA Competitivo

Aplicações do ELISA: Testes de rotina em Laboratórios Clínicos e de Pesquisa

Vantagens: Teste de alta sensibilidade Permite quantificar Ag ou Ac das amostras Seguros e de baixo custo

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Imunofluorescência

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luz

Ac + fluorocromo Ac + Fluorocromo

rght

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IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA

IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA

Reagentes secundários:

Anticorpo secundário marcado com fluorocromoproteína A marcada com fluorocromo = porção Fc das IgGs

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Isotiocianato de fluoresceína (FITC) VERDE Ficoeritrina (FE) VERMELHA

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Aplicações:

• Identificar subpopulações de linfócitos• Identificar espécies bacterianas• localização de hormônios• Detecção complexos ag-ac em doenças auto-imunes

•Detecção anticorpos anti-DNA• Teste qualitativo

Fc

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Citometria de Fluxo

Separação de células ativadas por fluorescência Anticorpos contra moléculas de membrana ou Antígenos do Conjunto de Diferenciação (CD) Cada Ac é marcado com um fluorocromo diferente Teste qualitativo e quantitativo

CD 4

CD 18

CD 125

CD 147

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Tamanho Granulosidade Fluorescência

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CD4

CD8

CD20

Aplicações:

Determinar o tipo e no de céls. sanguíneas brancas

isolar populações celulares

distribuição de céls de acordo com a densidade dos Ag

o tamanho celular.

Uso de múltiplos anticorpos fluorescentes

HIV , Leucemias

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Western Blotting

• Eletroforese de proteínas• Diferença de tamanho (PM)• Mobilidade da proteína• Detecção Ag ou Ac

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Western Blotting

Gelmembrana de transferênciapapel filtropreenchimentotela de suportetela de suporte

Gel/ membrana/ filtro

Tampão

( +)( - )

Separação e detecção de proteínas

• Identificação de Ac específico

Ac radiomarcado ou Ac sec. ligado a enzima

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Radioimunoensaio RIA

• Hormônio• proteínas séricas• drogas• vitaminas• Ac

0,0001 microgramas/ mL

Moléculas marcadas com ISÓTOPO

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Marcações:

– I125: emite raios gama

– H3: raios beta

Aplicações:

Testes que necessitem de alta sensibilidade

Triagem vírus da hepatite B em doadores de sangue

Pesquisa

Desvantagem: Não é um teste seguro!

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