interação antigeno anticorpo

INTERAÇÕES ANTÍGENO-ANTICORPO

Antígeno

-Toda molécula reconhecida como estranha pelo organismo – interage com Ac e TCR

-Epitopo – menor fração de um antígeno capaz de ser reconhecida por anticorpos ou se ligar a TCRs.

-Antigenicidade: capacidade de um antígeno de ser reconhecido pelo sistema imunológico

-Imunogenicidade: capacidade do antígeno de ativar uma resposta imunológica

Determinantes Antigênicos

A estrutura íntegra do antígeno é primordial para seu reconhecimento ideal

Ligação do Antígeno ao Anticorpo

A ligação entre Ag e Ac é resultado da conformação do Ag e do Fab do Ac e das interações químicas entre eles

INTERAÇÃO AG-AC

Ag + Ac Ag-Ac

A interação Antígeno-Anticorpo segue a lei das massas

Complexo Ag-AC

A quantidade de um antígeno e de um anticorpo em umaSolução é fundamental para a formação de complexos Ag-Ac

INTERAÇÕES Reações reversíveisReações reversíveis.

Ligações não covalentes:Ligações não covalentes:-Pontes de hidrogênio-Interações hidrofóbicas-Interações de Van der Waals-Ligações iônicas

Detecção, quantificação e caracterização dos anticorpos e seu uso como ferramenta para

pesquisa e diagnóstico

MÉTODOS

• PRECIPITAÇÃOPRECIPITAÇÃO- Imunodifusão

• AGLUTINAÇÃOAGLUTINAÇÃO- Aglutinação direta e indireta- Inibição da aglutinação- Teste de Coombs

• IMUNOENSAIOSIMUNOENSAIOS- RIA- ELISA - Imunofluorescência e Citometria de Fluxo- Western Blotting

APLICAÇÕESAPLICAÇÕES

- - Pesquisa - Diagnóstico- Soroepidemiologia

MÉTODOS

1) Reagentes não marcados• Reação de precipitação• Reação de aglutinação

2) Reagentes marcados• Radioimunoensaios (RIA)• Ensaios imunoenzimáticos (ELISA)• Imunofluorescência• Western Blotting

PRECIPITAÇÃO X AGLUTINAÇÃO

• Precipitação:Precipitação:Formação de complexos Ag/Ac.

• Aglutinação:Aglutinação:É o agrupamento de partículas, usualmente por moléculas de Ac que se ligam a Ag na superfície de partículas adjacentes.

• As reações de precipitação e de aglutinação decorrem, respectivamente da ligação entre o Ac e Ag solúvel e particulado.

Classificação das reações de precipitação

1.Precipitação em meio líquido

2.Imunodifusão radial dupla

3.Imunodifusão radial simples

Precipitação em meio líquido

(Oudin, 1946)

• Zona de excesso de anticorpo = Formam-se imunocomplexos menores e solúveis e o sinal de leitura é baixo.

• Zona de equivalência = Formam-se grandes complexos gerando um sinal máximo.

• Zona de excesso de antígeno = Formam-se imunocomplexos menores e solúveis e o sinal de leitura decresce novamente.

O sistema para detecção dos precipitados:

• Fonte de energia radiante (halogênio, tungstênio e laser)

• Condensador (flash de luz paralelo e não divergente)

• Seletor de comprimentos de onda (filtro ou monocromadores)

• Cubeta

• Sistema de detecção (define a técnica empregada)

• 0º = Turbidimetria

• 90º = Nefelometria

Fontede luz

Cubeta

0º

• Turbidimetria:

17

Fontede luzTungstênioMercúrioXenônio

Cubeta

30º

0º

90º

• Nefelometria:

Imunodifusão radial dupla

(Ouchterlony, 1947)

Antígeno e anticorpo colocados em posição horizontal, em pontos diferentes, difundem-se um contra o outro formando um precipitado.

Ac

Ag Ag

1. Os reagentes são colocados em

concentrações molares idênticas

a velocidade de difusão vai

depender do PM.

2. A curvatura estará dirigida

sempre para o orifício em que se

encontra a substância de maior

PM, nas condições ideais para a

reação.

Imunodifusão radial simples

(Mancini e Fahey, 1965)

• Ac + Ag multivalente particulado • Título: maior diluição que ainda causa aglutinação (semi-

quantitativo)• Agregação visível de partículas = Eritrócitos, bactérias, fungos e látex

REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO

ANTÍGENOS PARTICULADOS

Exemplos: Aglutinação Ativa: Bactérias (Brucelose) Hemácias (Sistema ABO)

Aglutinação Passiva: Hemácias tratadas antígenos Partículas tratadas antígenos anticorpos

Partículas Naturais PartículasSintéticas

PassivaConjugaçãoPrévia Ag

HEMAGLUTINAÇÃO BACTÉRIAS LÁTEX, ETC

PassivaConjugação

Prévia Ag ou Ac

Antígenossuperfície

membrana

Antígenos ouReceptoressuperfície

membrana

2) Reagente (anticorpo anti A, B):

AGLUTINAÇÃO DIRETA

1) Amostra de sangue na placa teste:

Exemplo: tipagem sanguínea em lâminas (sistema ABO)

Células ou partículas insolúveis + Ac = Aglutinação

Leitura do resultado:

Um resultado positivo é indicado por uma aglutinação visível (aglomeração dos eritrócitos na placa teste), como ilustrado acima.

negativo positivo

AGLUTINAÇÃO DIRETA

N acetil glicosamina

Exemplo: presença de hCG na urina (gravidez)

INIBIÇÃO DA AGLUTINAÇÃO

+Soro anti - hCGUrina

São incubados e colocados numa placa

Adicionam-se Partículas revestidas com hCG

Resultado positivo: (presença de hCG na urina): não ocorre aglutinação.

Ac se ligaram no hCG da urina, (ficando bloqueados), na incubação inicial

Resultado negativo:(ausência de hCG na urina). Ocorre aglutinação, pois os anticorpos anti-hCG não são bloqueados na incubação inicial, porque não havia o hormônio na urina. Livres, podem aglutinar as partículas revestidas de hCG.

TESTE DE COOMBS

• Ac antiimunoglobulinas (Robert Coombs);

• DHRN – mãe produz IgG anti-Rh;

• Não aglutinam os eritrócitos;• Direto: Ac ligados aos

eritrócitos fetais;• Indireto: Ac anti-Rh não

aglutinantes no soro materno. • Permite detectar

incompatibilidades Rh, prevenindo contra DHRN.

• Reagentes marcados (enzimas, fluorocromos, isótopos)

• Tipos:- Radioimunoensaios

- Ensaios imunoenzimáticos (ELISA)

- Imunofluorecência / Citometria de Fluxo

- Western blotting

IMUNOENSAIOS

Ensaios Imunoenzimáticos (EIE)

Marcação de Anticorpos

1966 Nakane Avrameas

Conjugação de anticorpos com a

Peroxidase

Inicialmente aplicada a antígenos particulados


EIE

Todo em fase líquidaHOMOGÊNEOS

HETEROGÊNEOSSeparação em

fase sólida

(ELISA)

CROMÓGENOS SOLÚVEIS CROMÓGENOS INSOLÚVEIS

( W. BLOTTING)


1971 Engval & Perlmann

IMOBILIZAÇÃO DE ANTÍGENOS SOLÚVEISEM FASES SÓLIDAS (PLÁSTICOS)

ELISA


ELISAFASE SÓLIDA POLIESTIRENO

POLIVINILCLORETO

NYLON

IMUNOPEROXIDASE

SOBRE TECIDOS OU CULTURAS CELULARES

WESTERN BLOTTING

SOBRE PAPEL DE NITROCELULOSE OU NYLON APÓS TRANSFERÊNCIA DO GEL DE ELETROFORESE

UTILIZAM UMA ENZIMA PARA GERAR O SINAL DA REAÇÃO ANTÍGENO-ANTICORPO


O QUE LEVAR EM CONSIDERAÇÃO ???

•Pureza•Atividade específica•Limiar de detecção•Facilidade de conjugação•Eficácia após conjugação•Estabilidade do conjugado

ENZIMAS

PEROXIDASE

FÁCIL OBTENÇÃO E BAIXO CUSTO

FÁCIL CONJUGAÇÃO A PROTEÍNAS

ESTÁVEL APÓS CONJUGAÇÃO

VÁRIOS CROMÓGENOS DISPONÍVEIS

PEROXIDASE

Como se processa a reação ????

H2O2

H2O

½ O2

PEROXIDASE

Cromógeno

COR

CROMÓGENOS PARA PEROXIDASE

Orthophenylene diamine (OPD)

5-aminosalicylic acid (5AS)

Tetramethylbenzidine (TMB)

2,2 azino-di(3- ethylbenzothiazoline) (ABTS)

4-Cloronaphthol

Diaminobenzidine (DAB)

ELISA INDIRETO

ELISA / CAPTURA

TMB

OPD

APLICAÇÕES DOS ENSAIOS IMUNO-ENZIMÁTICOSAPLICAÇÕES DOS ENSAIOS IMUNO-ENZIMÁTICOS

- - Borrelia burgdorferiBorrelia burgdorferi (IgG e IgM) (IgG e IgM)

- Citomegalovírus (IgG e IgM)- Citomegalovírus (IgG e IgM)

- Citomegalovírus (Ag)- Citomegalovírus (Ag)

- Hepatite A (Ac totais)- Hepatite A (Ac totais)

- Hepatite B:- Hepatite B:anti-HBsanti-HBsanti-HBc (IgG e IgM)anti-HBc (IgG e IgM)anti-HBeanti-HBeHBsAgHBsAgHBeAgHBeAg

- Hepatite D (Ac totais)- Hepatite D (Ac totais)

- Hepatite C- Hepatite C

- HIV - Ac- HIV - Ac

- HIV - Ag- HIV - Ag

- HTLV-1 e HTLV-2 - Ac- HTLV-1 e HTLV-2 - Ac

- Rubéola (IgG e IgM)- Rubéola (IgG e IgM) Curso CBAB/CNPq/MCT - 2006Curso CBAB/CNPq/MCT - 2006

ELISPOTELISPOT

Imuno-histoquímicaImuno-histoquímica

Western-blotWestern-blot

Negative Negative -No bands presentNo bands present

PositivePositive-Bands at either p31 OR p24 Bands at either p31 OR p24 AND bands present at either AND bands present at either

gp160 OR gp120 gp160 OR gp120

IndeterminateIndeterminate

- Bands present, but pattern - Bands present, but pattern does not meet criteria for does not meet criteria for

positivity positivity

gp160

gp120

gp55

gp41

gp31

gp24

RadioimunoensaiosRadioimunoensaios

lucigeninalucigenina

luminolluminol luciferinaluciferina

QuimioluminescênciaQuimioluminescência

Reações de ImunofluorescênciaReações de Imunofluorescência

Luz ultra-Luz ultra-violeta violeta

(145-290 nm)(145-290 nm) Luz visível Luz visível (>450nm)(>450nm)

(Coons (Coons et al.,et al., 1941,1942) 1941,1942)

Isotiocianato de Isotiocianato de Fluoresceína Fluoresceína

(ITCF)(ITCF)

Isotiocianato de Isotiocianato de Rodamina BRodamina B

Treponema pallidumTreponema pallidum

Pneumocystis cariniiPneumocystis carinii

Tripanosoma cruziTripanosoma cruzi

Giardia lambliaGiardia lamblia

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interação antigeno anticorpo