Introdução à Biologia Celular, Histologia e … · 1 Docentes Prof. Dr. Cesar Martins: [email protected] Prof. Dr. Cláudio Oliveira Prof. Dr. Rafael H Nóbrega Morfologia

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Docentes Prof. Dr. Cesar Martins: [email protected] Prof. Dr. Cláudio Oliveira Prof. Dr. Rafael H Nóbrega

Morfologia Biologia Celular, Histologia e Embriologia

Introdução à Biologia Celular, Histologia e Embriologia e seus métodos de estudo

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A invenção do microscópio Microscópio óptico Microscópio eletrônico Avanços em Biologia Molecular

Invenção de lentes de aumento: levou ao descobrimento do mundo microscópico.

Desenvolvimento da Microscopia

Algumas grandezas... 1km ! 1.000m 1m ! 100 cm 1cm ! 10 mm 1mm ! 1000 µm 1 µm ! 1000 nm 1Å (Angstron) ! 10-10m

Visão panorâmica da célula

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Visão panorâmica da célula Aumento e Poder de Resolução

Resolução: menor distância para que duas partículas apareçam como objetos separados. O limite de resolução da Microscopia Óptica é de 0,2 µm

Visão panorâmica da célula

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-Microscópio Óptico (luz) -Microscópio Eletrônico (elétrons)

Microscópio óptico – utiliza feixes de luz


Sistemas de lentes (condensador, objetiva e ocular) O limite de resolução do MO é de 0,2 µm e depende essencialmente da objetiva.

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Microscópio óptico


Microscópio óptico de campo claro


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Microscópio óptico de fluorescência


Microscópio óptico de fluorescência


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Microscópio óptico confocal


Outros tipos de microscópios ópticos


Iluminação direta (sem coloração)

Contraste de fase (refração da luz)

Contraste diferencial de interferência (refração da luz)

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Microscópio eletrônico -utiliza feixes de elétrons -lentes eletromagnéticas


! Alta resolução, abaixo de 0,3nm. ! Necessita de cortes muito finos (0,02 a 0,1 µm) ! Material biológico é impregnado com metais pesados como ósmio, chumbo e urânio !  Imagem elétron-densa (escura) e elétron-lúcida (clara)

Estrutura e funcionamento

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Microscópio eletrônico de transmissão


Microscópio eletrônico de varredura

! Alta resolução ! Fragmentos maiores ou tecidos inteiros ! Material biológico é recoberto com metais como ouro ou platina !  Estrutura tridimensional (3D)

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MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA


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Centro de Microscopia Eletrônica

UNESP - Botucatu

MEV MET

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Preparação de material para análise ao microscópio

As células e tecidos precisam estar perfeitamente preservados, apresentando a mesma estrutura e composição química que possuíam quando vivas.


Fixação – Preserva a morfologia e composição do tecido. Fixador mais utilizado ! Formaldeído. Para microscopia eletrônica (ME) os tecidos necessitam de tratamentos especiais em soluções de aldeído glutárico e tetróxido de ósmio.

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Lavagem


Desidratação – Retirada da água presente nos tecidos através de sucessivos banhos em uma série de etanol (70%!80%!90%!100%).

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Diafanização ou clareamento – Substituição do etanol por líquido miscível (geralmente xilol) com o meio de impregnação e retirada de lipídios.


Meio de impregnação – Substituição do líquido (xilol) por parafina ou resina sintética. A resina sintética possibilita cortes mais finos (1 a 2 µm). O ME necessita de cortes muito finos (0,02 a 0,1 µm) e por isso utiliza se resinas mais duras. Neste caso os cortes são feitos com navalhas de vidro ou diamante.

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Meio de inclusão – Suporte para o tecido impregnado.


Tecido preparado para análise ao Microscópio Eletrônico

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Micrótomo Instrumento para cortar finas fatias do tecido (menores que 1µm de espessura).


Micrótomo automatizado – Permite a obtenção rápida de cortes sem passar pelas etapas descritas antes.

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Micrótomo Realizando cortes do material


Micrótomo Instrumento para cortar finas fatias do tecido (menores que 1µm de espessura).

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Estufa 60 oC Derreter e eliminar a parafina


Xilol Retirada da parafina

Série alcoólica - Rehidratação.

Hidratação completa

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Coloração


Hematoxilina/Eosina (HE) Coloração freqüentemente utilizada

Coloração – A maioria dos corantes utilizados se comportam como ácido ou base. !Estrutura celular basófila, liga-se a corantes básicos. !Estrutura celular acidófila, liga-se a corantes ácidos.

Além destes corantes freqüentemente utilizados, utiliza se também outros tipos de coloração, como a impregnação com sais de prata e ouro.

Corantes básicos: azul-de-tuluidina, azul-de-metileno, hematoxilina... Corantes ácidos: eosina, orange G, fucsina ácida...

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Além destas colorações frequentemente utilizadas, outros métodos baseados em reações químicas (citoquímica), imunológicas (imunocitoquímica), entre outras, também podem ser empregados.


Montagem das lâminas

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Análise do Material


Resultados

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Plano de corte

Desenvolvimento do Microscópio Óptico - 1700 Desenvolvimento Microscópio Eletrônico - 1930 Desenvolvimento da Biologia Molecular - 1970

Avanços em Biologia Celular

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...outras técnicas que podem ser empregadas na Biologia Celular e Molecular

: Radioautografia : Imunocitoquímica : Cromatografia : Eletroforese : Cristalografia e difração de raio-X : Hibridação de ácidos nucléicos

Avanços em Biologia Celular e Molecular

Cultura de Células e Manipulação de Moléculas

George Gey, 1951: primeira cultura de células

Células HeLa (Henrietta Lacks)

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Conhecimento da diversidade estrutural celular

Organização geral das células

Organismos da natureza (visão clássica) Eucariontes: Protozoários, fungos, plantas e animais Procariontes: Bactérias

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Organização geral das células

Organismos da natureza (visão moderna) Bactérias Arqueobactérias Eucariontes

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