1Departamento de Bioquímica da Faculdade de Medicina do Porto

ruifonte@med.up.pt

Introdução às reações enzímicas.Equilíbrio químico,

catálise e classificação funcional.

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As vias metabólicas existem porque existem enzimas que têm especificidade para substratos que são simultaneamente produtos de outras reações enzímicas.

membrana do hepatócito…

GLUT2

CO2 + H2O

ADP + Pi

ATP

Fosforílase do glicogénio

fosfoglicomútase

Glicose-6-fosfátase

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As enzimas catalisam reações mas não têm qualquer papel no sentido em que estas ocorrem.A razão entre a constante de equilíbrio (Keq) e o quociente de reação (QR) permite prever o sentido global em que uma reação tende a evoluir.

aA + bB ↔ pP + qQ

2- A reação evolui em sentido direto ... A + B → P + Qse Keq > QR ⇔ Keq/QR >1

3- e evolui em sentido inverso... P + Q → A + Bse Keq < QR ⇔ Keq/QR <1

1- Uma reação está em equilíbrio...Keq = QR ⇔ Keq/QR =1(= mesmo, in vitro, as concentrações de reagentes e produtos não se modificam ao longo do tempo)

Ao contrário do que acontece no tubo de ensaio, nas células as reações podem evoluir sem que as concentrações dos reagentes e produtos se modifiquem: o QR de uma determinada reação celular pode manter-se “estacionário”.

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Numa via metabólica existem enzimas com baixa atividade catalítica e que,consequentemente, catalisam reações em que Keq»QR.

Outras enzimas têm uma atividade catalítica elevada e, nestes casos, Keq≈QR.

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Na reação catalisada pela fosforílase do glicogénio estima-se que a Keq ≈0,3.

Glicogénio (n) + Pi Glicogénio (n-1) + Glicose-1-P

Keq = ≈ 0,3[Glicogénio]equi × [Glicose-1-P]equi

[Glicogénio]equi × [Pi]equi

QR = ≈ 0,0001[Glicose-1-P]real

[Pi]real

≈0,00004 mM

0,4 mM

As concentrações estacionárias da glicose-1-P ( 0,00004 mM) e do fosfato inorgânico (Pi ≈ 0,4 mM) nas células permitem estimar o QR ≈ 0,0001

Keq»QR (qualquer QR fisiológico) e a reação é fisiologicamente irreversível.

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Noutras condições metabólicas Keq < QR(17< [G6P](real)/[G1P] (real))

....e a reação evolui no sentido Glicose-6-P → Glicose-1-P

Na reação catalisada pela fosfoglicomútase estima-se que a Keq ≈17; as concentrações estacionárias da glicose-1-P (≈ 20-40 nM) e da glicose-6-P (≈ 400-800 nM) permitem estimar o QR ≈ 10 a 40

Em determinadas condições metabólicas Keq > QR(17 > [G6P](real)/[G1P] (real)) ....e a reação evolui no sentido Glicose-1-P → Glicose-6-P

Keq = ≈ 17[Glicose-6-P]equi

[Glicose-1-P]equi

Keq ≈ QR e a reação é fisiologicamente reversível.

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Numa via metabólica na ausência de “ramificações e entroncamentos” a velocidade efetiva de conversão (velocidade macroscópica = vel_direta-vel_inversa), ou seja, a velocidade de fluxo da via metabólica (J) é igual quer nas reações de “equilíbrio” quer nas de “desequilíbrio”.

vel. efetiva = vel_direta – vel_inversa= 1010 - 1000 = 10

Glicose-1-P

1000

1010

Glicose-6-P

Pi Glicose-1-P

0,01

10,01

vel. efetiva = vel_direta – vel_inversa= 10,01 – 0,01 = 10

J=10

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A equação de Gibbs relaciona a “energia de Gibbs” (ΔG) com a razão Keq/QR

Keq/QR

ΔGkJ/mol≈

Se a razão Keq/QR

...então a energia

de Gibbs

e a reação

A→P

106 -36 >1 Negat. tende a prosse-guir no sentido

direto103 -18

1 0 = 1 Nula Aparen-temente

parada

10-3 18 <1 Posit. tende a prosse-guir no sentidoinverso10-6 36

ΔG (kJ/mol) ≈ - log decimal (Keq/QR) × 6

O valor da razão Keq/QR é uma medida do “grau de desequilíbrio” da reação;

que pode exprimir-se de outra maneira; quanto maior é o valor da razão Keq/QRmais negativo é o valor da “energia de Gibbs”.

A energia de Gibbs = 0 se Keq = QR; ln 1 = 0. A energia de Gibbs é positiva se QR > Keq; ln número < 1 é um número negativo mas na equação de Gibbs

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Outra forma de exprimir Keq de uma reação é referir o ΔGº.

ΔGº = - RT ln Keq = energia de Gibbs padrão ( ΔG quando QR =1)

A reação de fosforólise do glicogénio diz-seexergónica porque o ΔG é negativo

ΔGº = -RT ln 0,3 = + 3 kJ mol-1

ΔG = -RT ln (0,3/0,0001) = - 20 kJ mol-1

O valor de ΔGº é apenas um equivalente da Keq e, em geral, não nos diz nada acerca do sentido em que a reação tende a evoluir nem da reversibilidade ou irreversibilidade do processo.

ΔG = -RT ln (Keq/QR)10

As reações tendem a evoluir no sentido em que o valor do QR se aproxima do valor de Keq.

As reações evoluem sempre no sentido em que são exergónicas(podendo ser exotérmicas ou endotérmicas); as reações endergónicas são uma abstração e não existem.

Se QR=1… … ΔG=0 ⇔ reação em equilíbrio AB A ABB

Se pensar na reação inversa (B → A), QR=5…

Na reação B → A (não pode ocorrer)porque QR>Keq ⇔ ΔG é positivo: a reação B → A seria chamada de endergónica (ou não espontânea).

Se QR=1/5…Na reação A → B (que pode ocorrer)Keq>QR ⇔ ΔG é negativo: a reação A → B é exergónica (ou espontânea).

AA AB AA

AA A

AA AB AA

AA A

Pensando na reação A→B com Keq = 1

Keq > QR ⇔ reação exergónica = reação que pode ceder energia para que um processo endergónico (reativo ou de transporte) possa ocorrer.

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ATP

H2O

ADP + Pi ΔG = -50 kJNH4

+

H2O

ΔG = + 35 kJ

glutamato glutamina

ΔG soma =-15 kJ

As reações nunca evoluem no sentido em que são endergónicas mas os processos anabólicos são endergónicos...

As enzimas são as máquinas que acoplando processos endergónicos com exergónicospossibilitam a ocorrência dos processos endergónicos. A sintétase da glutamina é um exemplo.

exergónico(ΔG=-50kJ)

endergónico(ΔG= +35 kJ)

ATP

ADP + PiNH4

+

sintétase da glutamina

glutamato

glutamina

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As reações endergónicas não existem mas podem ocorrer se acopladas a reações exergónicas.Muitas reações podem ser entendidas como o somatório de duas reações em que uma semirreação é endergónica e a outra semirreação é exergónica; se o somatório dos ΔG das duas semirreações for negativo a reação soma é exergónica e tem tendência termodinâmica para ocorrer.

ATP + H2O ADP + Pi ΔG=-50 kJ; Keq/QR= 0,7x 109

ΔG = + 18 kJ; Keq/QR= 7x10-4

glicose + ATP ΔG = -32 kJ; Keq/QR= 4x105

exergónico(ΔG=-50kJ)

endergónico(ΔG= +18 kJ)

ATP

ADP

cínase da glicose

glicose

glicose-6-P

glicose-6-P + ADP

glicose + Pi glicose-6-P + H2O

A cínase da glicose é uma “máquina química” que acopla um processo endergónico (a formação de glicose-6-P) com outro exergónico (a hidrólise do ATP).

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Quando a reação ocorre em meio aquoso e um dos reagentes (ou produtos) é a água, a sua concentração não entra no cálculo da Keq (nem do QR).

AB + H2O → A + B

Keq* = [A]equil × [B] equil

[AB]equil × [H2O]Keq* × [H2O]= Keq =

[A]equil × [B] equil

[AB]equil

AH → A- + H+

Ka = [A-]equil × [H+] equil

[AH]equilKa’ =

[A-]equil

[AH]equil

Ka

[H+]fixo

=

Quando o pH do meio é fixo (meio tamponado) as constantes de acidez (Ka) podem ser transformadas de modo a refletirem a razão entre a forma básica (dissociada) e a forma ácida (não dissociada) da mesma substância. Para uma concentração determinada de protões= [H+]; Ka’ = Ka / [H+] = [A-] / [AH].

H2O → H+ + OH- Kw= [H+] × [OH-]= 10-14 M2

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Em bioquímica, porque as reações ocorrem sempre em meios tamponados, é frequente ignorarem-se as reações ácido-base: os valores das Keq (e QR) usados são transformados e podem designar-se de Keq’ (e QR’).

A + B → CH → C- + H+Keq Ka

[C-][CH]

[CH][A]×[B]Keq × Ka’=

[C-][A]×[B]

× =

Ka’ = [C-][CH]

Keq + Keq × Ka’ = [CH] + [C-][A] × [B]

Keq’ =

A ideia das Keq’ (como a soma de duas Keq) reflete-se na forma como se escrevem as equações das reações em bioquímica:Pode escrever-se a equação da glicólise anaeróbia: glicose → 2 lactato- + 2 H+; glicose → 2 lactato-

Mas muito mais frequentemente: glicose → 2 lactato sendo o lactato (sem especificar a carga)

a mistura de ácido láctico e lactato-

Keq = [CH]

[A] × [B]

Keq’ é a constante de equilíbrio aparente para a formação da mistura (CH + C-) a partir dos reagentes A e B.

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À Keq corresponde ΔGº e à razão Keq/QR corresponde ΔG.À Keq’ corresponde ΔG’º e à razão Keq’/QR’ corresponde ΔG’ e são estes últimos valores que são, habitualmente, apresentados nos livros de Bioquímica.Quando, em Bioquímica, se diz que na reação de hidrólise do ATP em ADP + Pi o ΔG’º é -30 kJ/mol quer-se dizer que a reação está em equilíbrio (ΔG’º = -30 kJ/mol ⇔ Keq’ = 1,8 x 105 M) quando

= 1,8 x 105 M[ADP] × [Pi]

[ATP]

…em que as concentrações de ADP, Pi e ATP são somatórios das concentrações das formas ionizadas e não ionizadas e ligadas ou desligadas do Mg2+.

[H2PO4-] + [HPO4

2-] + [MgHPO4][MgADP-] + [ADP3-] + [HADP2-]

[MgATP2-] + [ATP4-] + [HATP3-]

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Nos sistemas biológicos existem membranas que separam compartimentos, mas muitas substâncias podem atravessar essas membranas.

Existe transporte passivo ( = difusão) de uma determinada substância quando ela se move a favor do seu gradiente químico (ou electroquímico): o processo é estritamente exergónico.

Existe transporte ativo de uma determinada substância quando ela se move contra o seu gradiente químico (ou electroquímico): o processo contém um componente endergónico.

Algumas moléculas pequenas e sem carga (como o O2 e o CO2) podem atravessar membranas por processos em que não intervêm proteínas da membrana; o processo de transporte diz-se não mediado.Mas no transporte transmembranar da maioria das substâncias intervêm proteínas da membrana: o processo de transporte diz-se mediado.

O transporte não mediado é sempre estritamente exergónico (= passivo); o transporte mediado pode ser passivoou ativo.

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Na maioria das células a glicose (e outras substâncias não iónicas) atravessa as membranas a favor do seu gradiente de concentrações (difusão ou transporte passivo).No plasma sanguíneo e no líquido extracelular a [glicose] ≈ 5 mM mas no citosol da maioria das células, em resultado da ação da hexocínase, é cerca de 0,1 mM. Em equilíbrio haveria igual concentração nos 2 lados da membrana e a glicose tende a mover-se de fora para dentro.

Na membrana da maioria das células aglicose move-se a favor de gradiente

⇔ processo estritamente exergónico

Se a [glicose]fora = 5 mMe a [glicose]dentro= 0,1 mM

ΔG (para o processo detransporte fora → dentro) ≈- 10 kJ / (mole de glicosetransportada)

[glicose]fora ≈ 5 mM

[glicose]dentro ≈ 0,1 mM

ΔG = - RT lnKeq

QR= -RT ln 1

[glicose]dentro

[glicose]fora

= -RT ln [glicose]fora

[glicose]dentro

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O gradiente elétrico é uma consequência do facto de as membranas terem cargas diferentes entre as duas faces exterior e interior; o gradiente químico deve-se à diferença de concentrações.

Quando o transporte é passivo ⇔ a favor do gradiente electroquímico ⇔ ΔG<0o processo de transporte da substância em análise é exergónico.

O transporte transmembranar de substâncias iónicas é passivo (difusão) quando ocorre a favor do gradiente eletroquímico (gradiente elétrico e de concentrações) e ocorre através de canais iónicos ou de transportadores.

No caso do transporte desubstâncias com carga elétrica(iões) para além do gradientequímico temos de ter em conta aeventual existência de umadiferença de potencial entre osdois lados da membrana.

O lado interno da membranacitoplasmática tem carganegativa relativamente ao ladoexterno que tem carga positiva.

A energia envolvida no transporte de iões Na+ de fora para dentro da célula é o somatório:

energia correspondente ao gradiente químico (ΔG negativo)+

energia correspondente à diferença de potencial (ΔG negativo)

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O valor do ΔG correspondente ao gradiente elétrico de um ião com carga Z que é transportado do lado da exterior da membrana para o interior é dado pela expressão:

Carga do ião

Faraday= 96500 Coulomb mol-1

Diferença de potencial (Volt); por convenção o sinal é o do interior da membrana; Ψ = psi

Ψ = - 0,086 V

[Na+]fora

[Na+]fora= 10 mM

ΔG(gradiente elétrico) = 1 × 96500 × (- 0,086)= - 8,3 kJ mol-1

ΔG(gradiente químico) = - RT ln (145/10) = - 6,6 kJ mol-1

Quais os valores de ΔG (elétrico e químico e o ΔG soma) correspondentes ao transporte de 1 mol de ião Na+ de fora para dentro?

ΔG(soma) = (- 8,3 - 6,6) = - 14,9 kJ mol-1

ΔG = Z F Ψ

ΔG(gradiente electroquímico) = - 14,9 kJ mol-1

= 145 mM

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Transporte de 3 Na+ contra gradiente electroquímico (ΔG ≈ + 44,7 kJ/mol de ATP)Transporte de 2 K+ (admitindo equilíbrio eletroquímico) (ΔG ≈ 0 kJ/mol de ATP)Hidrólise de 1 ATP (ΔG ≈ - 50 kJ/mol de ATP)⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯Processo global catalisado pela bomba de Na+/K+ (ΔG ≈ - 5,3 kJ/mol de ATP)

...é exergónico.

É o caso 1- da ATPase do sódio/potássio (bomba de sódio/potássio) e dos…

Quando o transporte de uma substância ocorre contra o seu gradiente electroquímico e o processo exergónico acoplado é uma reação química falamos em transporte ativo primário.

2- dos complexos I, III e IV da cadeia respiratória. Aqui a componente exergónica é uma reação redox...e o endergónico o bombeamento de protões contra gradiente electroquímico.

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Quando o transporte de uma substância ocorre contra o seu gradiente electroquímico e o processo exergónico é o transporte de um ião a favor do seu gradiente electroquímico (por sua vez criado por um transporte ativo primário) falamos em transporte ativo secundário.

Diz-se que os transportadores de Na+ e glicose existentes no polo apicaldos enterócitos (SGLT1; sodium dependent glucose transporter 1)é um “simporte” porque só pode funcionartransportando 2 iões Na+ e 1 molécula de glicoseno mesmo sentido.

O transporte de glicose no polo apicaldos enterócitosé um transporte ativo secundárioem que o processo exergónicoé a passagem de iões sódio para dentro das células a favor do gradiente electroquímicoe o endergónico o transporte de glicose contra gradiente.

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Aquando da síntese de ATP pela síntase de ATP mitocondrial (complexo V) ocorre um processo que é o inverso do que corresponde aos processos de transporte ativo primário: uma reação enzímica endergónica (ΔG >0) está acoplada com um transporte exergónico (ΔG <0)

+++

++

++

+

++

+

- - - - - - -

----

++++++

--

[H+]=10-7 M

[H+] = 10-7,6 MADP + Pi

ATP + H2O3 H+3 H+

Ψ = - 0,15 V

ΔG(gradiente elétrico) = 1× 96500 C mol-1 × (- 0,15 V)= - 14,5 kJ mol-1

ΔG(gradiente químico) = - RT ln (10-7,0/10-7,6)= - 3,6 kJ mol-1

ΔG(gradiente eletroquímico) relativo ao transporte de 3 moles protões =3 (-14,5 kJ - 3,6 kJ) = - 54,1 kJ

ΔG relativo à síntese de 1 mol de ATP = 50 kJ

ΔG relativo ao processo global = - 54,1 kJ + 50 kJ = -4,1 kJ

V

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As palavras “difusão”, “transporte passivo” e “transporte ativo” referem-se à termodinâmica do processo de transporte.As palavras “simples”, “facilitado/a”, “mediado”, “transportador”, “cotransporte” “uniporte”, “antiporte” e “simporte” referem-se ao catalisador (ou à sua ausência).1- Palavras que descrevem a energia envolvida no processo de transporte e estão, portanto, relacionadas com aspetos relacionadas com termodinâmica do processo:a) transporte passivo = difusão = transporte a ”favor do gradiente electroquímico” b) transporte ativo = transporte “contra o gradiente químico ou electroquímico”.

2- Palavras relacionadas com o tipo de catalisador envolvido no processo de transporte:

a) simples = não mediado (sem catalisador).b) facilitado = mediado por transportador. b1) uniporte, simporte e antiporte.b2) quando há cotransporte está envolvido um simporte ou um antiporte.

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A linha de separação entre transportadores e enzimas é tão ténue que, em muitos casos, éimpossível dizer se estamos a falar de uma enzima ou de um transportador.1- Nos complexos da cadeia respiratória da mitocôndria as reações de oxi-redução são exergónicas e o componente endergónico é o transporte de protões contra gradiente electroquímico.

1’- Um caso semelhante ocorre no caso da bomba de sódio e potássio. (hidrólise de ATP exergónica; movimento de iões endergónico)

2- No caso da síntase do ATP na mitocôndria nas condições in vivo o componente exergónico é o movimento de protões a favor do gradiente electroquímicoe o endergónico é a reação de síntese do ATP(ADP+Pi → ATP + H2O ).

Nota: os transportadores/enzimas são apenas catalisadores...

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Conhecer o ΔG (⇔ razão Keq/QR) de um sistema reativo indica-nos o sentido em que a reação pode evoluir ... mas não nos diz nadaacerca da velocidade em que ela ocorre.

1- Algumas reações são muito lentas:

A Keq da reação de oxidação da glicose (glicose + 6 O2 → 6 CO2 + 6 H2O)

é cerca de 10500 M-1 ΔG’º = - 2840 kJ/mol

a reação tem tendência a evoluir até ao consumo total do reagente limitante (em geral a glicose)

...mas, à temperatura ambiente e na ausência de enzimas, posso ter

glicose em contacto com O2 durante milhares de anos que não acontece nada.

2- Outras reações são muito rápidas

As reações de dissociação de protões ou ligação de protões (ácido-base)aproximam-se rapidamente do equilíbrio e não necessitam de catalisadores.

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A maioria das reações que ocorrem nos seres vivos só existem porque existem enzimas que as catalisam. A maioria das enzimas são de natureza proteica e, relativamente aos outros catalisadores, têm uma grande especificidade em relação aos substratos e produtos da reação.

1- A palavra “enzima” (do Grego: en, na + zima, levedura) foi inventada em 1878 por FredrichKühne.

2- A sua natureza proteica só foi definitivamente aceite na década de 1930.

3- Relativamente aos catalisadores não enzímicos as enzimas são, em geral:

a) mais potentes,

b) atuam em condições “ pouco agressivas “ (pH ≈ 7, temp. < 100°C, etc.),

c) têm uma enorme especificidade relativamente aos substratos e produtos, e

d) a sua atividade pode ser, frequentemente, regulada por substâncias diferentes dos substratos e dos produtos (as enzimas podem ser sensores do meio ambiente em que estão inseridas...).

4- Sendo as enzimas moléculas proteicas o seu tamanho é, frequentemente, muito granderelativamente ao tamanho das moléculas dos substratos.O “sítio ativo” (ou “sítio catalítico”) é um local específico modelado de tal forma que permite a interação específica com o substrato (ou substratos) e é onde ocorre a reação química.

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A Comissão de Enzimas da União Internacional de Bioquímica definiu critérios para a classificação e denominação das enzimas; os critérios são de tipo funcional: duas enzimas com estruturas diferentes que catalisam a mesma reação (isozimas ou isoenzimas) têm o mesmo nome.

1- A cada enzima foi atribuído um “número EC” (de Enzyme Commission) que contém 4 números separados por pontos (EC W.X.Y.Z).

Os números W, X e Y referem-se, respetivamente, à classe, subclasse e sub-sub-classe e o númeroZ é específico de cada enzima.

2- No dia 19-10-2011 estavam classificadas 4652 enzimas que podem ser consultadas em http://www.expasy.ch/enzyme/

3- Em geral uma mesma enzima tem vários nomes e a nomenclatura não é isenta de ambiguidade; a atribuição de um número E às enzimas é uma tentativa de resolver essa ambiguidade.

Foram definidas 6 classes: Classe 1: oxi-redútases Classe 2: transférases Classe 3: hidrólasesClasse 4: líases Classe 5: isomérases Classe 6: lígases ou sintétases

4- A classificação é de tipo funcional: diferentes proteínas com a mesma atividade catalítica(como as isoenzimas) têm o mesmo nome e número E. 28

Exemplos: fosfoglicomútase (Glicose-1-P ↔ Glicose-6-P)mútase do fosfoglicerato (3-fosfoglicerato ↔ 2-fosfoglicerato)isomérase das hexoses-fosfato (Glicose-6-P ↔ Frutose-6-P)epimérase das pentoses-fosfato (Ribulose-5-P ↔ Xilulose-5-P)epimérase da UDP-galactose (UDP-Galactose ↔ UDP-Glicose)

Em geral, nas reações catalisadas pelas isomérases as Keq têm valores não muito diferentes de 1 ( ΔGº não muito diferente de 0) e são fisiologicamente reversíveis.

As isomérases (EC 5.x.y.z) catalisam a interconversão de dois isómeros: A↔B

Em rigor, as isomérases são as únicas enzimas em que se pode falar do substrato daenzima no singular.

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Nas reações catalisadas pelas hidrólases (EC 3.x.y.z) um dos reagentes é a água e o substrato rompe-se nas suas partes constituintes: AB + H2O → A + B

Em geral, quando à frente do nome de um composto se coloca o sufixo “ase” a enzima é uma hidrólase (maltase, amílase, fosfolípase, lípase, ATPase, glutamínase ...). Quase sempre catalisam reações fisiologicamente irreversíveis.

As hidrólases catalisam a rotura de ligações sendo a água um dos substratos.Exemplos de ligações que podem sofrer rotura hidrolítica:

1- éster (produtos = álcool + ácido) ou tioéster (produtos = tiol + ácido)

2- lactona (produtos = álcool + ácido; notar que neste caso, porque a lactona é “um éster interno”: A + H2O → B)

3- anidrido (produtos = ácido + ácido)

4- amida (produtos = ácido + amina ou amónio)

5- osídicas (produtos = semi-acetal + álcool ou semi-acetal + semi-acetal ou semi-acetal + ácido ou o semi-acetal + amina)

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As fosfátases são hidrólases em que um dos produtos é o fosfato inorgânico (Pi). As reações catalisadas pelas fosfátases chamam-se desfosforilações.

Alguns exemplos de fosfátases:

pirofosfátase inorgânica(PPi + H2O → 2 Pi)

ATPase (ATP + H2O → ADP + Pi)

H2O

H2O

2

Glicose-6-fosfátase

(glicose-6-P + H2O → glicose + Pi)

31

Nas reações catalisadas pelas transférases (EC 2.x.y.z)um substrato dador cede um grupo químico ou um resíduo a um outro substrato (o substrato aceitador) que o aceita: XT + Y → X + YT

Uma transférase catalisa uma reação em que um resíduo T é transferido de XT para Y(ou, tendo em conta a reação inversa, de YT para X).

São exemplos de transférases:1- cínases (ATP + Aceitador → ADP + Aceitador-P)2- fosforílases (Dador-T + Pi → Dador + T-P)3- pirofosforílases (Aceitador-T + PPi ← Aceitador + T-PP)4- transférases de uridilato

(dador-UMP + aceitador → dador + aceitador-UMP)32

As cínases são fosfotransférases que catalisam reações do tipo: ATP + Y → ADP + Y-P. As reações catalisadas pelas cínases chamam-se fosforilações.Nas reações catalisadas por cínases o resíduo transferido é um fosfato e, em geral, o dador de fosfato é o ATP (ou o GTP) que cede o fosfato γ (o terceiro) a um aceitador.Numa reação enzímica do tipo: ATP + Y ↔ ADP + Y-Pa enzima denominar-se-ia cínase do Y sendo Y o substrato que aceita o fosfato γ do ATP.Exemplos de cínases:

cínase da glicose cínase da frutose-6-P

A denominação das cínasesnão tem em linha de conta o sentido em que a reação ocorre nos seres vivos: (1) a cínase do piruvato catalisa in vivo a fosforilação do ADP pelo fosfoenolpiruvato.

(2) a cínase do adenilato (=AMP) catalisa a fosforilação do AMP pelo ATP (mas também a reação inversa; é fisiologicamente reversível): ATP + AMP ↔ 2 ADP

cínase do piruvato

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Numa reação enzímica do tipo: ATP + Y ↔ ADP + Y-Pa enzima denominar-se-ia cínase do Ye a regra mantém-se mesmo quando o aceitador é outra enzima.

Exemplo: a cínase da desidrogénase do piruvato catalisa a fosforilação da desidrogénase do piruvato pelo ATP

Em geral, quando existe uma cínaseque catalisa a fosforilação de um substrato A

existe também uma fosfátase (hidrólase) que catalisa a desfosforilação do substrato A fosforilado

… e ambas as reações são (quase sempre) fisiologicamente irreversíveis 34

Glicose

Pi

ATP ADP

v = 10

J= 90

v = 100

A cínase da glicose e a fosfátase da glicose-6-fosfato têm papeis metabólicos opostos, mas as

Quando uma cínase e a fosfátase que se lhe opõe estão simultaneamente ativas a reação soma é a hidrólise de ATP

A reação inversa da fosforilação da glicose por ação da cínase da glicose seria a fosforilação do ADP (a ATP) pela glicose-6-P…

A + ATP → ADP + A-PA-P + H2O → A + Pi

H2O

Glicose-6-P

As ações das cínases e das fosfátases não são reações inversas.

Quando isto acontece falamos em “ciclos de substrato”.

reações que catalisam não são a inversa uma da outra.

Cínase da glicose

Fosfátase da glicose-6-P = Glicose-6-Pase

35PKA (ligada ao AMPc)

Alguns fármacos e hormonas exercem os seus efeitos ligando-se a recetores celularesque têm atividade catalítica intrínseca e que são, portanto, enzimas.Alguns recetores celulares são enzimas.

O recetor da insulina é uma cínase que, quando a insulina está ligada, catalisa a fosforilação de proteínas citoplasmáticas chamadas “substratos do recetor da insulina”.

Algumas cínases (com a PKA; cínase de proteínas dependente do AMP cíclico) são relativamente inespecíficas catalisando a fosforilação de muitas enzimas e essa fosforilação pode ativar ou inibir essas enzimas.

ATP + síntase do glicogénio (ativa)

ADP + síntase do glicogénio fosforilada (inativa)

36

As fosforílases são transférases em que o substrato aceitadoré o fosfato inorgânico (Pi): XT + Pi ↔ X + T-P.As reações catalisadas pelas fosforílases denominam-se fosforólises.

Numa reação do tipo XT + Pi ↔ X + T-P

a enzima denominar-se-ia fosforílase do XT (T é o resíduo transferido)...e XT sofre uma fosforólise: XT rompe-se (lise) por ação do fosfato inorgânico (Pi).

Exemplo de fosforílase:

A fosforílase do glicogéniocatalisa a fosforólise do glicogénio

Glicose-glicose-glicose...+ Pi →glicose-glicose...+ Glicose-1-P

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As pirofosforílases são transférases em que o substrato aceitador do resíduo transferido é o pirofosfato inorgânico (PPi): XT + PPi ↔ X + T-P-P.As reações catalisadas pelas pirofosforílases denominam-se pirofosforólises.Numa reação do tipo XT + PPi ↔ X + T-P-P

a enzima denominar-se-ia pirofosforílase do XT...e XT sofre pirofosforólise: rompe-se (lise) por ação do pirofosfato inorgânico (PPi).

Exemplo de pirofosforílase:

Pirofosforílase do UDP-Glicose

Para compreender porque se denomina pirofosforílase do uridina-difosfato de glicose (UDP-glicose) à enzima que catalisa a reação Glicose-1-P + UTP → UDP-glicose + PPi, temos de pensar na reação inversa àquela que, de facto, ocorre nas células dos seres vivos. A reação inversa é a pirofosforólise do UDP-glicose.

38

As transférases de uridilato (uridil-transférases) são enzimas em que o resíduo transferido é o UMP (e não se forma nem se consome PPi inorgânico): X-UMP + Y ↔ X + Y-UMP.

Galactose-1-P UDP-Glicose

UDP-GalactoseGlicose-1-P

Galactose-P

Glicose-P-P-uridina

Galactose-P-P-uridina

Glicose-P

O UMP (uridina-monofosfosto) também se designa de uridilato.

Uridiltransférase da galactose-1-P

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Quando a rotura do ATP ocorre entre os resíduos fosfato β e γ forma-se ADP e Pi

…mas quando ocorre entre os resíduos fosfato α e βforma-se AMP e PPi.

Nas reações catalisadas pelas lígases aenergia libertada no processo dehidrólise do ATP permite acombinação de dois reagentes A e B.

Ou, considerando o sentido inverso,que a energia libertada na cisão de ABpermite a síntese de ATP.

ATP + A + B ↔ ADP + Pi + AB ouATP + A + B ↔ AMP + PPi + AB

As lígases (ou sintétases) (EC 6.x.y.z) catalisam reações que podem ser lidas como sendo o somatório de duas reações: uma de hidrólise do ATP e outra de combinação de duas substâncias.

Sintétase do AB

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Nalgumas lígases o nucleosídeo trifosfato envolvido na reação não é ATP mas o GTP.

No ciclo de Krebs a reação catalisada pela sintétase de succinil-CoA (uma das isoenzimas) evolui no sentido da rotura do succinil-CoA e síntese de GTP: GDP + Pi + succinil-CoA → succinato + CoA + GTP

Podemos considerar, conceptualmente,que a sintétase de succinil-CoA faz a acoplagem de duas reações:

Succinil-CoA + H2O → Succinato + CoA (reação exergónica) ΔG1<0GDP + Pi → GTP + H2O (reação endergónica) ΔG2>0⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯GDP + Pi + Succinil-CoA ↔ GTP + Succinato + CoA ΔG(1,2)=ΔG1+ΔG2

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Nas reações catalisadas pelas líases (EC 4.x.y.z) um dos reagentes que contém uma dupla ligação combina-se com um segundo reagente de tal maneira que o produto já não contém a dupla ligação: A=B + C ↔ ABC

Ou, pensando na reação inversa: são líases as enzimas que catalisam reações em que um composto se rompe dando origem a dois produtos sendo que um destes produtos contém uma dupla ligação que não existia no composto que lhe deu origem: ABC ↔A=B + C

Frequentemente o composto C é a água mas aqui, ao contrário do caso das hidrólases, a reação de C com A=B não resulta na lise de A=B.

42

As oxi-redútases (EC1.x.y.z) catalisam reações de oxi-redução

Exemplos de nomes associados a oxi-redútases:

Desidrogénases

Redútases

Oxídases

Oxigénases

Peroxídases

Catálase

Dismútases

dinucleotídeos são substratos

catalisam reações de dismutação

O2 é o oxidante direto

o H2O2 é reduzido a água...

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1) As desidrogénases são oxi-redútases que catalisam reações do tipo:

AH2 +

NAD+

NADP+

FADFMN

A +

NADHNADPHFADH2FMNH2desidrogénase de AH2

lactato NAD+ NADH

Piruvato Acetil-CoANAD+ NADH

Coenzima A CO2

NAD+NADH Desidrogénase do NADH

(não se chama desidrogénase do ubiquinol)Ubiquinona Ubiquinol

Desidrogénase do lactato

Desidrogénase do piruvato

Piruvato

44

2) As redútases também são oxi-redútases. A maioria das redútasescatalisa reações do mesmo tipo das desidrogénases mas o redutor é o NADPH...

AH2 +

NAD+

NADP+FADFMN

A +

NADH

NADPHFADH2FMNH2

redútase do A

NADPH NADP+

2 e- H+

H+

Exemplo: redútase do glutatião; NADPH + dissulfureto de glutatião (GSSG) → NADP+ + 2 glutatião (2GSH)

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3) As oxídases também são oxi-redútases. Catalisam reações em que o O2 é um dos reagentes que se reduz a H2O, a peróxido de hidrogénio (H2O2) ou a superóxido (O2

• -).

2 cyt. c (Fe2+) + ½ O2 2 cyt. c (Fe3+) + H2Ooxídase do citocromo cNADPH + 2 O2 NADP+ + 2 O2

• -oxídase da NADPH

4) As mono-oxigénases (também chamadas oxigénases de função mista) também são oxi-redútases. Catalisam reações em que o O2 é o oxidante direto, sendo que um dos átomos de oxigénio se vai incorporar num composto orgânico que é oxidado e o outro vai formar água.

São frequentemente chamadas hidroxílases; neste caso seria hidroxílase do VH (no exemplo está a reação catalisada pela hidroxílase da fenilalanina)

WH2

VOH

O2

VH

W

H2O

tetrahidrobiopterina

tirosina

O2

fenilalanina

H2O

dihidrobiopterina 46

5) As peroxídases também são oxi-redútases. Catalisam reações em que o H2O2 é o agente oxidante direto de um composto orgânico.

2 e- 2H+

H2O2 2 H2O

Exemplo: a peroxídase do glutatião é a mais conhecida

2 Glutatião (2 GSH) + H2O2 → dissulfureto de glutatião (GSSG) + 2 H2O

47

A palavra síntase (não confundir com sintétase) está popularmente associado a algumas enzimas e as síntases podem pertencer a diferentes classes.

1- A síntase do glicogénioé de facto uma transférase.

Algumas vezes o nome que foi originalmente atribuído a uma enzima (síntase do composto X), embora fora da nomenclatura sistemática, manteve-se o mais popular ao longo dos anos.

2 - A síntase do ATPé de facto uma hidrólase (e, simultaneamente um transportador de protões).

ADP + Pi → ATP + H2O

A componente exergónica do processo é o transporte de protões através de um componente da enzima que está mergulhado na membrana interna da mitocôndria. Os protões deslocam-se a favor do seu gradiente electroquímico.

48

À rotura hidrolítica das ligações fosfoanidrido do ATP (entre os fosfatos α-β e β-γ) estão associados valores de ΔGº “muito” negativos; por isso se diz na gíria dos bioquímicos que estas ligações são “ricas em energia”.1- Dizemos que a glicose e o etanol

“são substâncias energéticas” porque no seu processo de oxidação libertam enormes quantidades de energia:

Glicose + 6 O2 → 6 CO2 + 6 H2O ΔGº = - 2840 kJ/mol

Etanol + 2 O2 → 2 CO2 + 2 H2O ΔGº = - 168 kJ/mol

(nota: estes ΔGº não se referem aos seres vivos; ΔGº refere-se sempre a condições padrão)

2- Quando dizemos que o ATP é “uma substância energética” não estamos a falar da reação de oxidação do ATP mas da sua fosfohidrólise.

ATP + H2O → ADP + Pi ΔGº = - 31 kJ/mol

ATP + H2O → AMP + PPi ΔGº = - 46 kJ/mol ΔGº= -31 kJ

ΔGº= -46 kJ

49

As ligações em que o ΔGº que corresponde à sua rotura hidrolítica (em condições padrão) tem um valor semelhante ou é ainda mais negativo que o que corresponde à rotura das ligações fosfoanidrido do ATP (- 31 kJ mol-1 ou -46 kJ mol-1) dizem-se “ricas em energia” e costumam representar-se por

As ligações “ricas em energia” podem ser de tipo: a) fosfoanidrido como no ATP

c) enolfosfato como no fosfoenolpiruvato.

b) fosfamida como na fosfocreatina

ΔGº= - 43 kJ

ΔGº= -62 kJ

d) tioéster como no succinil-CoA.

Quando dizemos que o ATP, a fosfocreatina, o fosfoenolpiruvato ou o succinil-CoA“são substâncias energéticas” estamos simplesmente a dizer que a sua fosfohidrólisetem um valor de ΔGº muito negativo.

ΔGº= -36 kJ

50

Embora o ΔGº seja apenas uma medida da Keq (e não determine por si só o sentido em que a reação vai evoluir) o conceito de “ligação rica em energia” revelou-se útil…(1) porque, normalmente, quando uma enzima catalisa o acoplamento de duas semirreações em que uma é a rotura de uma “ligação rica em energia” e a outra a formação de uma ligação que “não é rica em energia” (como as fosfoéster) a reação é fisiologicamente irreversível…

Exemplos:

+ glicose → ADP + glicose-6-P (cínase da glicose)

+ frutose-6-P → ADP + frutose-1,6-bisfosfato (cínase da frutose-6-P)

(2) e porque, normalmente, quando nas duas semirreações acopladas, numa se rompe e na outra se forma uma “ligação rica em energia” a reação é fisiologicamente reversível

Exemplos:

+ ADP + Pi ↔ succinato + CoA +

+ ADP ↔ creatina +

+ ADP ↔ 3-fosfoglicerato +

Sintétase de succinil-CoA

Cínase da creatina

Cínase do 3-fosfoglicerato

51

No 1,3-bisfosfoglicerato há uma ligação fosfoanidrido (“rica em energia”) que não existe no 3-fosfoglicerato...

A cínase do 3-fosfoglicerato catalisa uma reação de fosfotransferência que é fisiologicamente reversível (no sentido da síntese de ATP na glicólise e de consumo de ATP na gliconeogénese)...

…mas nem sempre o acoplamento de semirreações em que há síntese e rotura de “ligações ricas em energia” corresponde a reações fisiologicamente reversíveis: por exemplo, a reação catalisada pela cínase do piruvato é fisiologicamente irreversível.

+ ADP → piruvato + 52

As reações enzímicas que in vivo geram PPi têm um ΔG (real) muito negativo porque o produto PPi é rapidamente hidrolisado pela ação catalítica de pirofosfátases que mantém a sua concentração muito baixa.

Como resultado da ação catalítica das pirofosfátases celulares a concentração de PPi na célula é muito baixa;não existe um dos substratos para que a reação inversa possa ocorrer

As reações em que um dos produtos é o PPi são reações exergónicas em todas as condições metabólicas reações fisiologicamente irreversíveis.

53nutrientes

NAD+

NADH

O2

I love electrons

We hate electrons

nutrientes

O2

H2O

CO2

ADP

Pi

H2O

enzimas e enzimas/trans-portadores envolvidas no catabolismo

ΔG < 0ΔG > 0

ATP54

Glicose

2 acetil-CoA

2 Piruvato

NAD+

NAD+

NADH

NAD+

NADH

NADH

2 ADP

2 ADP

2

2

2 CO2

2 CO2

2 CO2

I III IVQ cyt c

1 NADH NAD+

4 H+

O H2O

V Simp. Pi

10 H+

2,5 ADP + 2,5 Pi

(2 H+ + 4 H+)

2,5

A oxidação completa de 1 mole de glicose é a componente exergónica num processo global em que a componente endergónica é a síntese de 30 (envolvimento da lançadeira do glicerol-3-P) a 32 moles (envolvimento do malato) de ATP.

NADH

55

Nutrientes ou intermediários do metabolismo

H2O

ADP

Pi

enzimas e enzimas/trans-portadores

ΔG < 0

ΔG > 0

ATP

proteínas, glicoproteínas,lipídeos e glicídeos complexos, ácidos nucleicos...

56

Bibliografia consultada:Newsholme, E. A. & Leech, T. (2009) Functional Biochemistry in Health and disease,

Wiley-Blackwell, Oxford.

Nelson DL & Cox MM. (2005) Lehninger Principles of Biochemistry. 4th ed. Worth Publishers. New York.

Chang R. (1994) Química 5ª ed. McGrow-Hill de Portugal, Lda