QFL1201

Química Analítica Instrumental – Diurno

1º Semestre 2019

24 de maio

Luís Moreira GonçalvesBSc, MD, PhD

Introdução às Técnicas de Separação

0.5

1.0

1.5

Espectros de absorção de diferentes substâncias

460 nm

Detetor

Coluna

Sin

al

tempo

Михаил Семенович ЦветMikhail Semenovich Tswett

LS Ettre, M.S. Tswett and the Invention of Chromatography, LC-GC Eur Set (2003) 1-7

Asti, 1872

Geneve/Lausanne, 1872-1896

São Petersburgo/Kazan/Varsóvia/Tartu/Voronezh, 1896-1917

Tswett - significa cor

58 artigos, sem co-autores

MS Tswett, Trudy Varshavskogo Obshchestva Estestvoispytatelei Otdelenie Biologii, 14 (1905) 20–39

kroma [cor]

+

graphein [escrever]

1903

http://www.cromatografialiquida.com.br/claetswett.htm

Termos usados em cromatografiaFase estacionária – imobilizada em coluna ou superfície plana

Fase móvel – movimenta-se através da fase estacionária levando os analitos (gás, líquido ou fluído supercrítico)

Eluição – processo no qual os solutos são transportados através da fase estacionária pela fase móvel

Eluato – o que sai da coluna

Eluente – é o solvente empregado para transportar os componentes de uma mistura através da fase estacionária

Cromatograma – é o registro gráfico da função da concentração (sinal) pelo tempo ou volume de eluição

https://www.khanacademy.org/test-prep/mcat/chemical-processes/separations-purifications/a/principles-of-chromatography

Mecanismos de Separação

fase fasemóvel (líq./gas.) estacionária

Adsorção

Mecanismos de separação(físicos)

Cromatografia de adsorção

FE(sólida)

Analito(soluto)

fase fasemóvel estacionária

Partição (absorção)

Cromatografia de partição

Coluna capilar

Solutona fase líquida

ligada

Mecanismos de separação(físicos)

Absorção vs. Adsorção

+

+

fase fasemóvel estacionária

Troca iônica

+

+

-SO3- -N(CH3)3+

Cromatografia de troca iônica

-COO- -NH3+

Mecanismos de separação(químicos)

fase fasemóvel estacionária

Bioafinidade

Cromatografia de afinidade

Mecanismos de separação(químicos)

fase fasemóvel estacionária

Exclusão

Cromatografia de exclusão

Mecanismos de separação(mecânicos)

‘Ler’ um Cromatograma

Quais informações podemos tirar do cromatograma?

(tR)B

tempo

(tR)A

Sina

l

A B Cinjeção

(tR’)A

tM = tempo morto ou tempo de retenção da fase móveltR = tempo de retençãotR’ = tempo de retenção do analito na fase estacionária

tR

tM

Tempo/Volume

Sina

lTempo ou volume de retenção

VR’ = VR - VM

VR = x tR

tR’ = tR - tMtR’

VM = volume mortoVR = volume de retenção

= vazão da fase móvel (ml/min)VR’ = volume de retenção do analito na fase estacionária

tR

tM

Tempo

Sina

lFator de capacidade (k)

(Fator de Retenção)

k' = =tR-tM

tM

tR’tM

Usado para comparar as velocidades de migração dos solutos na coluna

k ideais de ~1 a 5 (k > 20 tempo de eluição é considerado longo)

(tR)B

tempo

(tR)A

Sina

l

A B Cinjeção

(tR’)B(tR’)A

=

Fator de separação ()(Fator de seletividade ou Retenção relativa)

Quanto maior maior a separação entre dois componentes.

γ(tR)B(tR)A

=

(tR)B

tempo

(tR)A

Sina

l

A B Cinjeção

KB

KA

kB

kA

(tR’)B(tR’)A

= ==

Usado para calcular o poder de resolução de uma coluna ( > 1)

Relação entre () (k) (K)

Rs = 0,50 Rs = 0,75

Rs = 1,00 Rs = 1,50

Resolução (Rs)

1,26%

1,00%

8,9%

Não é

normal!

Normal! > 20% Normal!

< 0,01%Não é

normal!

Resolução (Rs)

wb1 wb2

tR1

tR2

Rs =tR

Wb

Wb1 + Wb2

2=Wb

Medida da largura da banda

ponto deinflexão

Sina

l

Tempo ou volumeinjeçãot=0

Rs 0,59 tR

W1/2

=Rs tR

Wb

=

Mais teoria...

Teoria dos pratos

prato teórico

“estágio” de equilíbrio

A

A

K = [A]E/[A]M

[A]E

K =[A]M

[A]E

[A]M

isoterma de distribuição

cromatografia linear

Coeficiente de partição (K)(Constante de Distribuição)

Amóvel Aestacionária

K permanece invariável por um amplo intervalo de concentração, portanto [A]E é proporcional a [A]M

Número de pratos (teóricos), N

Coluna mais eficiente

tR

wb

N

H = NL

Maior tR implica maior tempo de análise

N = número de pratos teóricosL = comprimento da colunaH = altura de prato

Eficiência da Coluna Cromatográfica

σ2

LH = Pode ser expresso pela variância (σ2) da largura do sinal de pico

(geralmente uma gaussiana) por unidade de comprimento da coluna.

Pode ser expresso pelo tempo de retenção de uma dada substância ao passar pela coluna e a largura da base do pico. Relação entre H e N

LH

N = LL

= σ2

L2

= (W/4)2

CG H ~ 0,1-1 mmHPLC H ~ 10 m

Eletroforese CapilarEC H < 1 m

Ainda mais teoria...

Alargamento de bandacoluna

Causas do alargamento

⚫problemas na injeção⚫ coluna/fase móvel⚫detector

Alargamento de banda reflete a perda de eficiência da coluna.

Variáveis que afetam a eficiência da coluna

Velocidade linear da fase móvel: u = L(cm)/tM(s)

Coeficiente de difusão do soluto na fase móvel: DM (cm2/s)

Coeficiente de difusão do soluto na fase estacionária: DE (cm2/s)

Fator de retenção: k’ = tR’/tM

Diâmetro das partículas (colunas recheadas): dp (cm)

Espessura da camada de líquido da fase estacionária (coluna capilar): df (cm)

H = A + B/u + Cu

caminhosmúltiplos difusão

longitudinaltempo deequilíbrio

Teoria do alargamento de bandaEquação de van Deemter

A = 2 l dPl = constante que depende do tipo de empacotamentodp = diâmetro da partícula

u = velocidade linear

H = A + B/u + Cu

caminhosmúltiplos difusão

longitudinal

tempo deequilíbrio

Equação de van Deemter

B = 2 g DM

g = constante T viscosidade e u B/u

B = é o coeficiente de difusão do soluto na fase móvel u = velocidade linear do eluente

Na difusão as espécies migram de uma região mais concentradapara mais diluída.

Velocidade de migração é proporcional a diferença de conc.entre as regiões e ao coeficiente de difusão das espécies.

Efeito significativo na CG e de menor importância na CL

Equação de van DeemterB/u = termo de difusão longitudinal

to

t1

Efeito da difusão longitudinal

H = A + B/u + Cu

caminhosmúltiplos difusão

longitudinaltempo deequilíbrio

Equação de van Deemtertermo de

transferênciade massa

fase móvel

faseestacionária

eluição

H = A + B/u + Cu

caminhosmúltiplos difusão

longitudinaltempo deequilíbrio

Equação de van Deemtertermo de

transferênciade massa

Fase estacionária

interface

Fase móvel

Perfil de concentraçãono equilíbrio

Perfil de concentraçãoreal

H

u (ml/min)

Equação de van DeemterH = A + B/u + Cu

A + B/u + Cu

cromatografiagasosa

cromatografialíquida

Equação de van Deemter

Bandas assimétricas

sobrecarga

formaçãode cauda

Resolução em função das condições(equação de Purnell)

N ( α – 1 ) k’BRs =

4 α 1 + k’B

eficiência separação retenção

aumenta α

aumenta N

t0

inicialA B

Resumo dos parâmetros cromatográficos

Relação entreResolução, N, k’ e

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