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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA FABRÍCIO SOUZA SILVA INVESTIGAÇÃO DA ATIVIDADE ANTINEOPLÁSICA DE SUBSTÂNCIAS PURAS ISOLADAS DE PLANTAS DO SEMI- ÁRIDO BRASILEIRO E DERIVADOS SINTÉTICOS Feira de Santana, BA 2007

Investigação da atividade antineoplásica de substâncias puras

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA

FABRÍCIO SOUZA SILVA

INVESTIGAÇÃO DA ATIVIDADE ANTINEOPLÁSICA DE SUBSTÂNCIAS PURAS ISOLADAS DE PLANTAS DO SEMI-

ÁRIDO BRASILEIRO E DERIVADOS SINTÉTICOS

Feira de Santana, BA 2007

FABRÍCIO SOUZA SILVA

INVESTIGAÇÃO DA ATIVIDADE ANTINEOPLÁSICA DE SUBSTÂNCIAS PURAS ISOLADAS DE PLANTAS DO SEMI-

ÁRIDO BRASILEIRO E DERIVADOS SINTÉTICOS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Biotecnologia, da Universidade Estadual de Feira de Santana como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Biotecnologia. Orientadora: Prof. Dra. Milena Botelho Pereira Soares Co-orientador: Prof. Dr. Ricardo Ribeiro dos Santos

Feira de Santana, BA 2007

Aos meus pais, Francisco e Elenice, e meus

irmãos, Cézar, Sérgio, Flávio e Soráya, minha

maior riqueza.

À Maria Gorete, pela força, determinação, fé em

Deus, por não desistir dos obstáculos impostos e

ter conseguido vencer a maior batalha de sua

vida. Parabéns pela vitória!!!

AGRADECIMENTOS

Por mais uma etapa da minha formação cumprida, tenho o dever de agradecer a todos que

participaram em algum momento dessa conquista.

Inicialmente a Deus, por ter me concedido o dom da vida, por ter me dado força para

ultrapassar os obstáculos apresentados e me presenteado com uma família maravilhosa.

À minha família, Francisco, Elenice (meus pais), exemplos a serem seguidos, e Cézar,

Sérgio, Flávio e Soráya (meus irmãos), pessoas singulares que sempre estão ao meu lado,

apoiando cada decisão tomada, vibrando com cada conquista e, acima de tudo, estendendo a

mão em cada momento difícil.

À Profa. Dra. Angélica Maria Lucchese, minha mãe científica, por ter apostado em mim a

todo o momento e pelo incentivo no desenvolvimento desse trabalho.

Aos meus orientadores, Dra. Milena Botelho Pereira Soares e Dr. Ricardo Ribeiro dos

Santos, por acreditarem no meu potencial e estarem dispostos em melhorar a formação dos

seus orientandos.

Ao Prof. Dr. Aristóteles Góes Neto, pela dedicação, empolgação e busca pela excelência no

desenvolvimento de todas as atividades do PPGBiotec.

Ao grande Helton, pela disponibilidade em sempre conter os nossos êxitos e inquietações.

Aos colegas do mestrado Manoelito, Wagner, Catiane, Gisele, Marcelo, Ana Paula,

Anderson, Edna e Rodrigo, companheiros de inquietações e ansiedade.

A todos os meus colegas do LETI, em especial algumas pessoas em que os laços de amizade

foram mais fortes: Matheus, Fernando e Ricardo, por estarem sempre à disposição para

ajudar em todos os momentos, principalmente nos experimentos; Daniele e Juliana, pelas

conversas e discussões que nortearam nossos objetivos no PPGBiotec; Sheilla e Cláudio,

quase família, pelos momentos de conversas nada científicas; Flávia, pela dedicação

apresentada no desenvolvimento de suas atividades, administradora nata; Siane, pelo carinho

5

demonstrado em pouco tempo de convivência; e Carla, pela disposição em sempre realizar as

análises no citômetro de fluxo.

Aos estudantes de IC do LETI, pessoas diferenciadas pelo grande potencial demonstrado

ainda em fase de formação, pelas discussões e ajuda nos experimentos.

Às técnicas Edlúcia e Jaqueline, pelo incansável apoio demonstrado no desenvolvimento de

suas atividades indispensáveis.

À Kilma, pelo apoio e compreensão, pelas conversas sinceras e verdadeiras, pelos vários

momentos inesquecíveis e por demonstrar que a vida profissional deve ser baseada em ética,

dedicação e amor ao trabalho. Sou seu eterno aprendiz.

A todos os meus amigos, pessoas que escolhi para compartilhar momentos de felicidade e

angústia, pelo eterno apoio e disposição em sempre ajudar.

À Universidade Estadual de Feira de Santana, por proporcionar mais uma etapa de minha

formação, com ensino público e de qualidade.

Ao Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz, pela estrutura, que proporcionou o

desenvolvimento deste trabalho.

À FAPESB pela bolsa concedida.

O que há de pesquisador no professor não é uma qualidade ou uma forma de ser ou de atuar que se acrescente à de ensinar. Faz parte da natureza da prática docente a indagação, a busca, a pesquisa. O de que se precisa é que, em sua formação permanente, o professor se perceba e se assuma, porque professor, como pesquisador.

Paulo Freire

RESUMO

O câncer é uma patologia de origem genética caracterizada por aberrações no controle normal do ciclo celular, levando as células transformadas a um processo de multiplicação descontrolado. Dentre os fármacos disponíveis na quimioterapia antineoplásica atual, 60% foram desenvolvidos a partir de fontes naturais. Neste trabalho foi investigada a atividade antineoplásica de seis substâncias purificadas de plantas do semi-árido brasileiro e derivados sintéticos. No modelo de incorporação de [3H]-timidina, o acetato do ácido betulínico, a 568 e a -iodo-lapachona apresentaram valores de IC50 menores que 13 g/mL nas linhagens B16-F10, Daudi e K562. Todas as substâncias avaliadas inibiram a formação de colônias em meio semi-sólido na concentração de 15 g/mL, com perfil semelhante ao da doxorrubicina. No modelo de cicatrização de ferida estas substâncias inibiram a migração celular na menor concentração utilizada (5 g/mL). A -iodo-lapachona induziu a apoptose nas três linhagens celulares utilizadas. Dentre as substâncias avaliadas, a -iodo-lapachona e a 568 foram as mais potentes, enquanto que o nor-lapachol foi a substância que apresentou menor citotoxicidade para células normais. Os resultados encontrados demonstram o potencial antineoplásico de produtos naturais e derivados sintéticos obtidos do semi-árido brasileiro. Palavras-chave: Câncer. Produtos naturais. Semi-árido brasileiro. Migração celular. Apoptose.

ABSTRACT

Cancer is a pathology of genetic origin characterized for aberrations in the normal control of the cell cycle, leading to transformed cells to a descontroled multiplication. Amongst the available drugs of antineoplasic chemotherapy, about 60% were designed from natural sources. In this work we investigated the antineoplasic activity of six substances purified from Brazilian Semi-arid plant species and synthetic derivates. In the incorporation [3H]-thymidine model, acetate of betulinic acid, 568, and -iodo-lapachone showed values of IC50 lower than 13 g/mL in B16-F10, Daudi and K562 cell lines. All the substances tested inhibited the formation of colonies in semi-solid medium in the concentration of 15 g/mL, similar to doxorubicin. In the healing wound model, these substances inhibited the cellular migration in the lowest concentration tested (5 g/mL). -iodo-lapachone induced apoptosis in the three cell lines utilized. Amongst the evaluated substances, -iodo-lapachone and 568 were the more potent, while nor-lapachol was the substance less toxic to normal cells. The results demonstrate the antineoplasic potential of natural products obtained from Brazilian Semi-arid and synthetic derivates. Keywords: Cancer. Natural products. Brazilian Semi-arid. Cellular migration. Apoptosis.

LISTA DE FIGURAS Figura 1: Esquema ilustrando algumas etapas do ciclo celular e sua regulação. 17 Figura 2: Etapas do processo de desenvolvimento de metástase. 22 Figura 3: Estruturas das substâncias avaliadas. 35 Figura 4: Citotoxicidade das substâncias naturais e derivados sintéticos para células normais. 41 Figura 5: Inibição da proliferação das células neoplásicas pelas substâncias puras testadas. 44 Figura 6: Influência das substâncias puras testadas no metabolismo mitocondrial das células B16-F10. 45 Figura 7: Influência das substâncias puras testadas no metabolismo mitocondrial das células K562. 46 Figura 8: Influência das substâncias puras testadas no metabolismo mitocondrial das células Daudi. 47 Figura 9: Inibição da formação de colônias em meio semi-sólido. 48 Figura 10: Inibição da migração celular das células B16-F10 pelas substâncias puras testadas. 51 Figura 11: Inibição da apoptose em células Daudi após tratamento com as substâncias puras testadas. 52 Figura 12: Inibição da apoptose em células K562 após tratamento com as substâncias puras testadas. 53 Figura 13: Inibição da apoptose em células B16-F10 após tratamento com as substâncias puras testadas. 54 Figura 14: Estruturas das substâncias avaliadas em comparação com substâncias descritas na literatura 61

LISTA DE SIGLAS ABC ATP-binding cassete AIF Apoptosis-inducing factor APC Anaphase-promoting complex ATM Ataxia telangiectasia mutated ATR AMT- and Rad3-related CDK Cyclin-dependent kinases CKI Proteínas inibidoras de CDK CML Chronic myeloid leukemia CPM Contagem por minuto DMSO Dimetilsulfóxido DNA Ácido desoxirribonucléico ECM Extracellular matrix EDTANa2 Etilenodiaminotetracetato bissódico EGF Epidermal growth factor ER Receptor de estrogênio ERK Extracellular-regulated signal kinase HER Receptor do fator de crescimento epidérmico HGF Hepatocyte growth factor HIF-1 Hypoxia-inducible factor-1 alpha IAP Inhibitor protein apoptosis IC50 Concentração que causa 50% de inibição IGF-l Insulin-like growth factor JNK c-jun N-terminal kinase MAPK Mitogen actived protein kinases MMP Metaloproteinase da matriz MTT Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium NCI National Cancer Institute OD Optical density PI3K Phosphatidyl-inositol 3 kinase RNA Ácido ribonucléico RPM Rotações por minuto SBF Soro bovino fetal SEM Standard error of the median STAT Signal transducer and activator of transcription VEGF Vascular endothelial cell growth factor

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 10

2 REVISÃO DA LITERATURA 13 2.1 CÂNCER 13 2.1.1 Ciclo celular 15 2.1.2 Angiogênese 19 2.1.3 Metástase 21 2.2 FÁRMACOS ANTINEOPLÁSICOS 24 2.2.1 Novos alvos moleculares para o tratamento do câncer 26 2.3 PRODUTOS NATURAIS CONTRA O CÂNCER 28 2.3.1 Biodiversidade, biotecnologia e o desenvolvimento de novos fármacos 29 2.3.2 Lapachol e derivados 30 2.3.3 Ácido betulínico e derivados 32 2.3.4 Solidagenona 33

3 MATERIAIS E MÉTODOS 34 3.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS 34 3.2 OBTENÇÃO DAS SUBSTÂNCIAS NATURAIS E DERIVADOS

SINTÉTICOS 34

3.3 CULTURA DE CÉLULAS 35 3.4 ANIMAIS 36 3.5 ENSAIO DE CITOTOXICIDADE EM CÉLULAS NORMAIS 37 3.6 AVALIAÇÃO DA PROLIFERAÇÃO DAS CÉLULAS NEOPLÁSICAS 37 3.7 AVALIAÇÃO DO METABOLISMO MITOCONDRIAL DE CÉLULAS

NEOPLÁSICAS 38

3.8 ENSAIO DE FORMAÇÃO DE COLÔNIA EM MEIO SEMI-SÓLIDO 38 3.9 ENSAIO DE CICATRIZAÇÃO DE FERIDA EM CULTURA CELULAR 39 3.10 AVALIAÇÃO DA APOPTOSE EM CÉLULAS NEOPLÁSICAS 39 3.11 ANÁLISE DOS DADOS 40

4 RESULTADOS 41 4.1 CITOTOXICIDADE DAS SUBSTÂNCIAS PURAS TESTADAS EM

ESPLENÓCITOS DE CAMUNDONGOS 41

4.2 INIBIÇÃO DA INCORPORAÇÃO DE [3H]-TIMIDINA PELAS SUBSTÂNCIAS PURAS TESTADAS

42

4.3 INFLUÊNCIA DAS SUBSTÂNCIAS PURAS TESTADAS SOBRE O METABOLISMO MITOCONDRIAL

42

4.4 POTENCIAL ANTIMETASTÁTICO IN VITRO DAS SUBSTÂNCIAS PURAS TESTADAS

48

4.5 INIBIÇÃO DA MIGRAÇÃO CELULAR PELAS SUBSTÂNCIAS PURAS TESTADAS

49

4.5 INDUÇÃO DA APOPTOSE EM CÉLULAS NEOPLÁSICAS TRATADAS

COM AS SUBSTÂNCIAS PURAS

49

5 DISCUSSÃO 55

6 CONCLUSÃO 63

REFERÊNCIAS 64

1 INTRODUÇÃO

O Brasil possui a maior biodiversidade do mundo, estimada em cerca de 20% do

número total de espécies do planeta. Esse imenso patrimônio genético tem, na atualidade,

valor econômico-estratégico inestimável em várias atividades, mas é no campo do

desenvolvimento de novos medicamentos onde reside sua maior potencialidade. Estima-se

que 40% dos medicamentos disponíveis na terapêutica atual foram desenvolvidos de fontes

naturais, sendo 25% a partir de plantas, 13% de microorganismos e 3% de animais

(CALIXTO, 2003).

Cinco tipos de vegetações brasileiras apresentam uma abundância de plantas nativas

com carência de estudos químicos e farmacológicos completos: floresta amazônica, mata

atlântica, cerrado, pantanal e caatinga (BRITO; BRITO, 1993). Esta última estende-se pelo

domínio de clima semi-árido e é a vegetação predominante da Região Nordeste, ocupando

6,83% do território nacional (IBAMA).

Apesar desse enorme potencial, existe um grande desconhecimento sobre a

biodiversidade brasileira, tornando o uso dos produtos naturais e plantas medicinais

fragmentário e escasso. Menos de 1% da flora brasileira teve seus usos potenciais

corretamente investigados e sua imensidade é praticamente desconhecida em termos químicos

(GARCIA, 1995).

Por outro lado, o interesse por substâncias de origem natural como fonte de fármacos

é explicado por diversas vantagens frente às substâncias sintéticas, destacando-se: (1) grande

diversidade química com complexidade estrutural e potência biológica; (2) são a principal

fonte de farmacóforos; e (3) podem guiar o planejamento de compostos sintéticos (KNIGHT

et al, 2003). Com isso, percebe-se que o isolamento, a identificação e a avaliação biológica de

produtos naturais constituem os melhores caminhos para a descoberta de um novo fármaco

(MONTANARI; BOLZANI, 2001).

O câncer é uma doença em que ocorre uma desorganização no processo normal de

divisão celular, levando as células neoplásicas a um processo de multiplicação descontrolado.

Pode ser causado por vírus, agentes químicos carcinógenos, rearranjo cromossomal,

11

desregulação em genes supressores de tumor, protooncogenes ou transformação espontânea

(REDDY; ODHAV; BHOOLA, 2003). Os tratamentos disponíveis atualmente para o câncer

são a cirurgia, a radioterapia, a quimioterapia e a imunoterapia. Dentre os principais

medicamentos disponíveis para a quimioterapia destacam-se os agentes alquilantes e

intercalantes, os antimetabólicos e os antimitóticos (CORRÊA, 1995).

Apesar de já terem sido estabelecidos alguns alvos moleculares importantes para o

tratamento de diversas neoplasias, novos mecanismos têm sido propostos para a quimioterapia

do câncer ou para serem utilizados como adjuvantes na terapêutica. Pesquisas nesse sentido

identificaram substâncias que induzem a apoptose de células cancerosas (GUPTA et al, 2002;

DUVOIX et al, 2003), reduzem a transcrição de metaloproteinases (HUANG et al, 2005),

possuem atividade antiangiogênica (MEADE-TOLLIN et al, 2004; MICHAELIS et al, 2004)

e inibem a invasão e migração de células tumorais (OGASAWARA; SUZUKI, 2004;

VELASCO-VELÁZQUEZ et al, 2003).

Nesse contexto, o papel dos produtos naturais obtidos de plantas ou outros

organismos é extremamente relevante. Um dos principais compostos já isolados de vegetal é o

taxol, obtido inicialmente de Taxus brevifolia, sendo introduzido na terapêutica em 1992, com

aprovação em tempo recorde pelo Food and Drug Administration dos Estados Unidos

(CORRÊA, 1995; HAMBURGER; HOSTETTMANN, 1991). O taxol se liga à subunidade -

tubulina, suprimindo a dinâmica dos microtúbulos, promovendo, assim, a estabilização dessas

microestruturas celulares. Desse modo, há uma inibição da mitose, evitando a multiplicação

das células tumorais (JORDAN; WILSON, 2004).

Outras substâncias também de grande importância já foram isoladas e seus

mecanismos elucidados, incluindo os alcalóides da vinca vincristina e vimblastina, obtidos a

partir de Catharantus roseus, bloqueiam a polimerização dos microtúbulos (MAHIDOL et al,

1998); o alcalóide natural camptotecina, isolado de Camptotheca acuminata, é um potente

inibidor da DNA topoisomerase I (LEE, 1999); e os antibióticos doxorubicina e

daunorubicina, isolados de Streptomyces peucetius, provocam danos no DNA por intercalação

da porção antraciclina e formação de radicais livres (REDDY; ODHAV; BHOOLA, 2003).

Analisando todos esses aspectos em relação à descoberta de novas substâncias ativas

a partir de produtos naturais e considerando que o potencial farmacológico desses compostos

são pobremente explorados (RATES, 2001), destaca-se a relevância deste trabalho na busca

de novos agentes antitumorais. Outro aspecto relevante é que a maioria dos quimioterápicos

12

disponíveis na terapêutica atual apresentam fortes reações adversas e não são totalmente

eficazes. Portanto, esse trabalho visou à avaliação da atividade antineoplásica de substâncias

puras isoladas de plantas da região do semi-árido brasileiro e derivados sintéticos, com o

objetivo de identificar moléculas mais seletivas e potentes, as quais poderão constituir

candidatos a fármacos no tratamento de neoplasias ou ser utilizadas como protótipos para o

desenvolvimento de novas moléculas mais eficazes.

Com isso, o objetivo desse trabalho foi investigar a atividade antineoplásica de

substâncias puras obtidas a partir de plantas do semi-árido brasileiro e derivados sintéticos.

Para alcançar este objetivo, foi necessária a determinação dos seguintes objetivos específicos

para guiar o desenvolvimento do trabalho:

1. Avaliar a atividade antiproliferativa in vitro de substâncias puras obtidas de plantas do

semi-árido brasileiro e derivados sintéticos sobre as linhagens de células tumorais K562,

Daudi e B16-F10;

2. Determinar o potencial antimetastático in vitro de substâncias puras obtidas de plantas do

semi-árido brasileiro e derivados sintéticos sobre a linhagem celular B16-F10;

3. Estabelecer o padrão de morte celular in vitro de substâncias puras obtidas de plantas do

semi-árido brasileiro e derivados sintéticos sobre as linhagens de células tumorais K562,

Daudi e B16-F10.

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 CÂNCER

O câncer é uma palavra singular que se refere a uma grande diversidade de doenças

que podem afetar qualquer órgão de um sistema vivo. A principal característica do câncer é a

proliferação rápida ou lenta de células transformadas, evolutivamente distintas dos tipos

celulares em que foram originadas. Diferencia-se de outros tipos de crescimentos celulares

anormais, como tumores benignos, já que não respeitam os limites teciduais, promovendo

invasão aos tecidos adjacentes (HOLLAND, 2003).

Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), o câncer é uma das principais

causas de morte em todo o mundo, acometendo todas as pessoas e não distinguindo idade,

sexo, raça ou condição econômica. Em 2005, das 58 milhões de mortes ocorridas, 7,6 milhões

(ou 13%) foram causadas por câncer, sendo que mais de 70% dessas ocorreram em países de

baixa e média renda. Estima-se que em 2015 ocorram 9 milhões de mortes por câncer e 11,4

milhões em 2030 (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2006).

Em um estudo desenvolvido pelas instituições American Cancer Society (ACS),

Centers for Disease Control and Prevetion (CDC), National Cancer Institute (NCI) e North

American Association of Central Ccncer Registries (NSSCCR) foi avaliado a ocorrência do

câncer nos Estados Unidos no período de 1975 a 2003 e observou-se um aumento na

incidência de casos entre 1975 e 1992, e, a partir deste ano até 2003, houve uma estabilização.

Um dado importante que foi relatado é a diminuição geral da taxa de mortalidade desde a

década de 1990, sendo atribuído este fato, em parte, aos esforços obtidos na prevenção do

câncer por diminuição dos fatores de risco, diagnóstico nas fases iniciais dos casos, melhores

prognósticos devido a tratamentos mais efetivos e melhor acesso da população aos exames

preventivos e tratamentos disponíveis (HOWE et al, 2006).

Por outro lado, o Ministério da Saúde do Brasil vem registrando um aumento da

incidência de câncer em um ritmo que acompanha o envelhecimento populacional, estando

ligado às alterações globais que modificaram a situação de saúde dos povos pela urbanização

14

acelerada e mudança nos hábitos de vida, bem como nos padrões de consumo. Foram

registrados, em 2004, 141 mil óbitos, sendo a segunda principal causa de morte entre os

brasileiros, e estima-se para 2006 mais de 470 mil novos casos de câncer. Com isso, o Sistema

Único de Saúde gasta mais de R$ 1,1 bilhão em assistência oncológica, sendo tratados

mensalmente 128 mil pacientes em quimioterapia e 98 mil em radioterapia ambulatorial

(BRASIL, 2005; INSTITUTO NACIONAL DO CÂNCER, 2006).

Pode-se considerar o câncer como uma doença de origem genética no sentido em

que o fenótipo maligno resulta de uma ou mais alterações genéticas que são transmitidas da

célula alterada para suas células filhas (WARD, 2002), permitindo uma proliferação excessiva

e não regulada, mesmo os tumores sendo dependentes do hospedeiro para sobreviver

(KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005).

Várias formas de alterações genéticas podem dar origem às células neoplásicas,

sendo classificadas em anormalidades cromossômicas ou alterações nas seqüências normais

dos nucleotídeos, gerando mutações que vão garantir a expansão clonal das células tumorais.

Assim, o câncer é caracterizado como uma doença em que há expressão gênica anormal, onde

há uma inativação de mediadores negativos (genes supressores tumorais) ou ativação de

mediadores positivos da proliferação celular (proto-oncogenes) (COLEMAN; TSONGALIS,

2006).

A ativação dos proto-oncongenes ocorre através de uma amplificação gênica, em

que uma quantidade adicional de proteína é traduzida, ocasionando uma acentuação na

atividade por elas mediadas. A amplificação pode envolver regiões curtas dos cromossomos,

braços cromossomais, até cromossomos inteiros, envolvendo centenas a milhares de genes.

Os genes supressores tumorais geralmente são reguladores negativos da proliferação celular e

outras funções que podem afetar o potencial invasivo e metastático das células neoplásicas. A

inativação desses genes pode envolver mutações ou outro mecanismo que interfira em sua

expressão e função, como metilação do gene supressor tumoral ou aumento da degradação do

produto gênico pelo proteasoma (OSBORNE; WILSON; TRIPATHY, 2004). Essas alterações

na expressão gênica influenciam diretamente o controle do ciclo celular, conferindo à célula

neoplásica a capacidade de escapar dos processos de controles normais (WARD, 2002).

15

2.1.1 Ciclo celular

O ciclo celular é um evento universal pelo qual as células duplicam-se e está

presente durante o crescimento e desenvolvimento de todos os organismos vivos, constituindo

um processo altamente conservado desde seres unicelulares eucarióticos até organismos

multicelulares complexos (NURSE, 2000).

Para que as células entrem no ciclo celular é necessária a presença de fatores críticos

no ambiente em que estão contidas, como fatores de crescimento. Essas moléculas vão atuar

em receptores celulares específicos e induzir cascatas de sinalização intracelular, promovendo

a proliferação celular. Uma das vias mais importantes envolve as proteínas-cinases ativadas

por mitógeno (MAPK, mitogen actived protrein kinases), que pode ser ativada por vários

fatores de crescimento, levando o sinal da superfície da célula para o núcleo através da

ativação de fatores de transcrição que vão regular a transcrição gênica e estimular a síntese de

proteínas necessárias para o crescimento e proliferação celulares (FANG; RICHARDSON,

2005).

Dois eventos de maior importância do ciclo celular sâo a duplicação de ácido

desoxirribonucléico (DNA), que ocorre durante a fase S em um período de cerca de 10-12

horas nas células de mamíferos, e a segregação das cópias precisamente para cada célula filha,

evento que acontece na fase M ou mitose e que dura menos de uma hora nas células de

mamíferos. Porém, entre esses processos é necessário que as células dupliquem sua massa de

proteínas e as organelas, constituindo as fases gap ou de intervalos do ciclo celular: G1 situa-

se entre as fases mitose e S e G2 inicia-se após a fase S durando até o início da mitose. Ainda,

quando as células se encontram em um ambiente desfavorável, ocorre uma parada no ciclo

celular em G1, sendo também chamada de G0, onde podem permanecer quiescentes por toda a

vida ou até o ambiente tornar-se favorável (ALBERTS et al., 2002).

A transição de uma fase do ciclo celular para a outra ocorre de maneira altamente

ordenada e regulada por diferentes proteínas celulares . Proteínas-chave nesse processo são as

cinases dependentes de ciclina (CDK, cyclin-dependent kinases), uma família de proteínas

heterodiméricas com atividade serina/treonina cinase, compostas de uma subunidade catalítica

(CDK) e uma regulatória chamada ciclina. Nos mamíferos foram identificados 20 genes que

codificam CDKs, porém apenas cinco deles (Cdk1, Cdk2, Cdk3, Cdk4 e Cdk6) estão

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envolvidos diretamente no controle do ciclo celular (MALUMBRES; BARBACID, 2007;

VERMEULEN; VAN BOCKSTAELE; BERNEMAN, 2003).

A progressão da fase G1 é regulada por um complexo mecanismo que envolve pelo

menos três CDKs – CDK4, CDK6 e CDK2 – e seus reguladores (Figura 1). Inicialmente, a

sinalização mitogênica proveniente da via RAS/RAF/MAPK induz a síntese da ciclina D e o

transporte de CDK4 e CDK6 para o núcleo. O complexo ativo de CDK4 ou CDK6 e ciclina D

fosforila proteínas da família do retinoblastoma (Rb), que forma um complexo inibitório com

um grupo de fatores de transcrição da família E2F. Com essa fosforilação ocorre uma

inativação inicial, porém ainda permitindo a transcrição de genes como a ciclina E, que ativa a

CDK2, e o complexo CDK2-ciclina E fosforila e inativa irreversivelmente a Rb, liberando o

fator de transcrição E2F, que ativa a transcrição de genes de proteínas necessárias para a fase

S, como a timidilato sintase e a dihidrofolato redutase. No início da fase S, há a degradação

das ciclinas D e E, e produção da ciclina A, que complexa com CDK2 e estimula a progressão

da fase S. O complexo CDK2-ciclina A inativa E2F por fosforilação, impedindo, assim, que

este fator de transcrição interaja com o DNA. No fim da fase S e início da fase G2, há um

aumento nos níveis das ciclinas A e B, e os complexos CDK2-ciclina A e CDK1-ciclina B

compartilham vários substratos, como proteínas envolvidas na replicação do DNA e que

participam no controle da progressão do ciclo celular. Durante a fase G2 a ciclina A é

degradada, enquanto que a ciclina B tem sua síntese estimulada; esta se associa à CDK1 e

regula vários eventos relacionados à progressão para a mitose, como condensação dos

cromossomos, fragmentação do complexo de Golgi e degradação da lâmina nuclear. Por fim,

a ciclina B é degradada pelo complexo promotor da anáfase (APC, anaphase-promoting

complex) (MALUMBRES; BARBACID, 2005; SHWARTZ; SHAH, 2005).

Durante as fases G1 e G2 existem controles do ciclo celular chamados pontos de

restrição, em que são necessários estímulos para que o ciclo celular seja continuado. Na fase

G1, a necessidade de fatores de crescimento se dá até 2-3 horas antes do início da fase S, a

partir do qual a célula pode progredir no ciclo celular e passar por mitose independente de

mitógenos. Supõe-se que seja necessário um acúmulo de uma proteína para que a célula passe

do ponto de restrição, podendo envolver a atuação da Rb, cuja função está na inativação de

fatores de transcrição necessários para a expressão de genes importantes no desenvolvimento

do ciclo celular. Um segundo ponto de restrição na fase G2 tem sido proposto, em que é

necessária a presença de mitógeno até aproximadamente 10 horas antes da célula entrar em

atividade mitótica, a partir do qual o ciclo celular pode progredir independentemente de

17

mitógeno. Em ambos os pontos de restrição há o envolvimento de proteínas inibidoras de

CDK (CKI) (FOIJER; RIELE, 2006).

As CKIs são divididas em duas famílias de proteínas, de acordo com a estrutura

protéica e especificidade de inibição de CDKs: (a) proteínas inibidoras de CDK4 (INK4), que

atuam inibindo a subunidade catalítica de CDK4 e CDK6, sendo incluídas nesta classe

p16INK4a, p15INK4b, p18INK4c e p19INK4d, e (b) proteínas da família Cip/Kip, que afetam a

atividade de cinases dependentes das ciclinas D, E e A, incluindo nesta família p21Cip1,

p27Kip1 e p57Kip2. Essas proteínas atuam nos pontos de restrição do ciclo celular, influenciando

diretamente na atividade das CDKs, sendo a Rb uma das proteínas que podem ter a atividade

controlada (ROBERTS; SHERR, 1999).

Figura 1

Figura 1: Esquema ilustrando algumas etapas do ciclo celular e sua regulação. Ver texto para a identificação das siglas. , indica local fosforilado; , ativação; e ⊢, inibição. Fonte: VERMEULEN; VAN BOCKSTAELE; BERNEMAN, 2003.

18

Além das ciclinas, CDKs e CKIs, existem outros mecanismos de controle, referidos

como checkpoints, pelos quais as células promovem uma parada do ciclo celular até garantir

que os processos ativados anteriomente, como replicação do DNA ou mitose, estejam

completados, fazendo com que a informação genética seja transmitida com integralidade para

as células-filhas. Nesses processos estão envolvidas proteínas cinases que interrompem o

ciclo celular, como a ATM (ataxia telangiectasia mutated), que é ativada quando o DNA é

lesado, e a ATR (AMT- and Rad3-related), que pára a replicação do DNA (KASTAN;

BARTEK, 2004).

O câncer pode ser iniciado quando qualquer um ou mais desses sistemas de controle

sofrem algum tipo de alteração e as células não mais controlam com eficácia o ciclo celular,

fazendo com que ocorra uma proliferação anormal. Foi demonstrada a importância do fator de

crescimento semelhante à insulina (IGF-I, insulin-like growth factor) na progressão do câncer

de mama, por uma integração de sinais envolvendo o receptor tirosina-cinase do mesmo com

o receptor de estrogênio- (ER-), proporcionando uma ativação do último de maneira

independente de ligante (BARON et al., 2007). Em outro estudo, Dhar et al. (2007)

demonstraram o efeito mitogênico do IGF-I em células neoplásicas de mama positivas para

ER. A expressão do receptor do fator de crescimento epidérmico (HER1-4) está associado a

um mal prognóstico em indivíduos com câncer de mama (WITTON et al., 2003). Assim, o

aparecimento de mutações em genes que codificam receptores de fatores de crescimento tem

sido estudado para a devida correlação com a tumorigênese e com o desenvolvimento de

metástase (FRANCO-HERNANDEZ et al., 2007).

Corsino et al. (2007) demonstraram que o complexo CDK2-cliclina D1 influencia

alguns efeitos transformadores que resultam na superexpressão da cliclina D1 em câncer de

mama humano. O gene da ciclina D1 tem sido apontado como alvo da leptina em células de

câncer de mama, estimulando o crescimento celular anormal mediado por complexos

coativadores distintos que são estimulados pelo fator de transcrição STAT3 (signal transducer

and activator of transcription) (SAXENA et al., 2007). Outra relação importante do ciclo

celular com o câncer foi observada em indivíduos chineses portadores de leucemia linfocítica

crônica, em que a hipermetilação do DNA induz uma diminuição na expressão de genes que

codificam CKI, sendo o mais afetado o p16INK4a (CHIM et al., 2006). Analogamente, Chien et

al. (2007) demonstraram que camundongos com ausência de expressão dos genes p27Kip1 e Rb

desenvolveram tumores na hipófise, com perfis de expressão gênica diferenciados, destacando

a importância do íntimo controle do ciclo celular para a manutenção da homeostase celular.

19

Com essas considerações, assume-se que as células neoplásicas transformadas

passarão a se mutiplicar sem controle, formando uma massa tecidual que, à medida que

aumenta em diâmetro, dificulta a chegada de nutrientes para as células que estão no centro do

tumor. Nesse momento, é importante uma melhor irrigação sanguínea para que ocorra um

suprimento adequado dos nutrientes e oxigênio e garanta a sobrevivência das células. Com

isso, evidências mostram que o crescimento tumoral é dependente da angiogênese, processo

de formação de novos vasos sanguíneos a partir de capilares pré-existentes (FOLKMAN,

1990).

2.1.2 Angiogênese

Os capilares sanguíneos são formados por células endoteliais e pericitos, que

constituem os tubos, as ramificações e a completa rede capilar. Para que ocorra a angiogênese

e novos vasos sejam formados, é necessária uma mudança morfológica nessas células que, por

sua vez, podem ser estimuladas ou inibidas por diversos fatores (FOLKMAN; SHING, 1992).

Quando as células neoplásicas assumem o fenótipo pró-angiogênico, ocorre a

liberação de moléculas angiogênicas pelas mesmas ou por células inflamatórias, como os

macrófagos associados ao tumor, que são atraídas para a região do tumor, proporcionando

uma série de eventos moleculares que ativam a transcrição de genes responsáveis pela

proliferação das células endoteliais (DIRKX et al., 2006).

Dentre alguns fatores angiogênicos pode-se destacar: (a) o fator de crescimento da

célula endotelial vascular (VEGF, vascular endothelial cell growth factor), que é o mais

abundante e potente mitógeno, podendo ativar dois receptores, VEGFR1 e VEGFR2 e

ativando proteínas da família Rho, induzindo proliferação da célula endotelial por várias vias,

incluindo a ativação de fosfatidil-inositol 3 cinase (PI3K, phosphatidyl-inositol 3 kinase),

MAPK, cinase regulada por sinal extracular (ERK, extracellular-regulated signal), cinase c-

jun N-terminal (JNK, c-jun N-terminal kinase), o fator de transcrição NF-B e membros da

família RhoGTPase (GINGRAS; LAMY; BÉLIVEAU, 2000; GROSJEAN et al., 2006;

ROUSSEAU et al., 1997; ZACHARY, 2003); (b) o fator de crescimento epidérmico (EGF,

epidermal growth factor), que se liga ao EGFR, também conhecido como receptor do fator de

crescimento epidérmico humano (HER), que é um receptor tirosina-cinase que ativa a via

20

Ras/MAPK/PI3K (FITSIALOS et al., 2007, HORNBERG; TIJSSEN; LANKELMA, 2004;

WENNSTRÖM; DOWNWARD, 1999); (c) o fator de crescimento do hepatócito (HGF,

hepatocyte growth factor), que se liga ao receptor tirosina-cinase c-met, podendo induzir a

produção de VEGF no endotélio (REISINGER; KAUFMANN; GILLE, 2003; ZHANG et al.,

2003); e (d) o fator induzido por hipóxia-1(HIF-1, hypoxia-inducible factor-1 alpha), que

regula a transcrição de mais de 60 genes, pela ligação em regiões do DNA nomeadas

elementos de resposta à hipóxia (BRUICK, 2003; PAUL; SIMONS; MABJEESH, 2004).

A atuação desses fatores de crescimento está diretamente associada às fases do

processo de angiogênese, que envolve a ativação de sinais intracelulares de proliferação e

diferenciação celular, permitindo o desenvolvimento de novos vasos sanguíneos.

Inicialmente, ocorre um aumento na permeabilidade endotelial pela dissociação dos

componentes que formam a aderência célula-célula, como as caderinas, diminuindo a adesão

e estimulando a migração celular. A proliferação das células endoteliais, que até então

estavam quiescentes pela atuação dos pericitos, é ativada por fatores de crescimento através

da modulação de reguladores do ciclo celular. Outro evento crítico é a degradação da

membrana basal pelas metaloproteinases da matriz (MMP) extracelular, principalmente a

MMP-2, MMP-9 e MMP-associada à membrana 1 (MT1, membrane type 1). Nesse momento,

há uma reorganização do citoesqueleto das células endoteliais, com o aumento da expressão

de moléculas de adesão, como as integrinas, e as células assumem um fenótipo migratório.

Por fim, a estabilização dos capilares nascentes constitui a etapa final do processo

angiogênico, mediado por fatores como a angiopoietina, que promove a quiescência das

células endoteliais (BERGERS et al., 2000; MILKIEWICZ et al., 2006; SUAREZ;

BALLMER-HOFER, 2001).

O crescimento de novos vasos sanguíneos no tumor, que na maior parte dos cânceres

é estimulado pelo VEGF e pelo aumento da expressão de MMPs, facilita o aumento do

número de células neoplásicas aí instaladas. Com isso, indivíduos que apresentam alto

desenvolvimento de angiogênese são considerados como de mau prognóstico clínico, não só

pela possibilidade de expansão do tumor, mas devido à probabilidade das células neoplásicas

destacarem-se do tumor primário, alcançarem a corrente sanguínea e se alojarem em outras

partes do corpo, formando um tumor secundário ou metástase. Portanto, considera-se que a

angiogênese está diretamente relacionada ao aparecimento de metástase (GONZALEZ et al.,

2007; LYONS et al., 2007; MOON et al., 2006; SUN et al., 2006 ZHEN;G et al., 2006).

21

2.1.3 Metástase

A metástase envolve o espalhamento de células de um tumor primário para outros

órgãos ou tecidos, sendo referido como o aspecto mais devastador e a principal causa de falha

no tratamento do câncer. Excetuado a prevenção do câncer, o objetivo mais urgente do

oncologista é evitar ao máximo o aparecimento de metástases, com o auxílio das diversas

técnicas terapêuticas disponíveis (FIDLER, 1978).

O processo de metástase é altamente seletivo e envolve uma série de etapas

seqüenciais e inter-relacionadas (Figura 2). Quando a massa tumoral excede 1 mm de

diâmetro, é necessário que o tumor estimule a angiogênese, seguido de uma invasão tecidual

do estroma do hospedeiro. Uma vez que as células neoplásicas penetrem nos canais linfáticos

ou nos vasos sanguíneos, pode ocorrer aí o crescimento tumoral ou uma única célula ou um

grupo de células pode destacar-se e ser transportado pelo sistema circulatório. O êmbolo do

tumor pode sobreviver às defesas imunológicas do hospedeiro e à turbulência da circulação,

parar então no leito capilar do órgão receptor, extravasar para o seu parênquima, proliferar e

estabelecer uma micrometástase (FIDLER, 2002).

Para cada etapa do processo metastático, as células neoplásicas devem alterar a

expressão de diversas proteínas para facilitar a invasão e a migração. As MMPs estão

implicadas diretamente na degradação da matriz extracelular (ECM, extracellular matrix),

facilitando a invasão tecidual do tumor, e da membrana basal que forma os capilares

sanguíneos e promovendo a entrada das células tumorais na circulação (FOLGUERAS et al.,

2004). Porém, a degradação da ECM deve ser sutilmente controlada, devendo ocorrer uma

atividade proteolítica suficiente para permitir a movimentação das células, mas não tão

intensa que resulte na perda da tração celular (HOOD; CHERESH, 2002). Hao et al. (2007)

estudaram a relação da MMP-9 com o desenvolvimento de metástase de câncer de mama,

sugerindo que a expressão dessa proteína está intimamente relacionada à promoção de

angiogênese no tumor e ao potencial metastático das células neoplásicas. Petrella e

Brinckerhoff (2006) demonstraram que linhagens de carcinoma celular renal aumentam o

potencial invasivo com a expressão de MMP-MT1. Outros estudos têm relatado a importância

de diversas MMPs na invasão e metástase de vários tipos de tumores (GORDEN et al., 2007;

LEE et al., 2007; MIYATA et al., 2006; VIZOSO et al., 2007; ZHENG et al., 2006).

22

Outros fatores de importância para a invasão e migração das células neoplásicas são

a afinidade e a avidez na interação entre essas e a ECM no qual estão contidas. As mudanças

fenotípicas para a capacidade migratória são mediadas por alterações na expressão de

moléculas de adesão presentes na superfície celular e pelo remodelamento da ECM. A

interação das proteínas de adesão com seus ligantes específicos induz uma sinalização

intracelular que resulta em alteração da expressão gênica, reorganização do citoesqueleto,

manutenção da subrevivência, resultando em células neoplásicas mais invasivas, migratórias e

com melhor capacidade de sobreviver em diferentes ambientes (HOOD; CHERESH, 2002).

Figura 2

A maior família de moléculas de adesão celular é a das integrinas, que são

receptores heterodiméricos transmembranares e possuem os domínios extracelular grande e

intracelular curto. São compostas por subunidades e associadas não-covalentemente,

Figura 2: Etapas do processo de desenvolvimento de metástase. Fonte: FIDLER, 2003.

23

combinando-se para formar 24 proteínas diferentes, cada uma reconhecendo um ligante

específico na ECM. A ativação desse receptor inicia uma sinalização que inclui a ativação de

forças mecânicas do citoesqueleto, interagindo com a talina, a -actinina e a filaminina, além

de proteínas adaptadoras, favorecendo a motilidade celular em seu microambiente

(HUMPHRIES, 2000; HUMPHRIES et al., 2003; HUMPHRIES et al., 2004;

LAMBRECHTS; TROYS; AMPE, 2004;). Mostafavi-Pour et al. (2003) demonstraram que as

integrinas influenciam a formação de adesão focal por meio de ativação ou não de isoformas

de proteína cinase A e proteínas GTPase da família Rho, mediando a migração celular. A

importância das integrinas na proliferação, na invasão, na migração celular e no

desenvolvimento de metástases tem sido demonstrada por vários estudos (CHEREPANOVA

et al., 2006; REDONDO-MUÑOZ et al., 2006; TSUJI et al., 2002; WANG et al., 2006;

WATSON-HURST; BECKER, 2006).

Quando as células neoplásicas chegam à circulação podem continuar nos vasos

sanguíneos até estabelecer uma micrometástase. Para que ocorra o alojamento dessas células

em um novo tecido, é preciso que haja uma compatibilidade entre estas e o tecido no qual

deverá ocorrer o desenvolvimento do tumor primário. A primeira observação desse fato foi

realizada pelo cirurgião inglês Stephen Paget, em 1889, que demonstrou, após examinar cerca

de 900 relatos de autópsia de pacientes com diferentes tipos de tumor primário, que a

ocorrência de metástase não se deve ao acaso, mas pelo fato de que certas células neoplásicas

têm afinidade específica a certos órgãos. Essa hipótese ficou conhecida como a “semente”

(célula neoplásica metastática) e o “solo” (órgão no qual ocorreu o desenvolvimento da

metástase) (FIDLER, 2003; PAGET, 1889).

Um exemplo que apóia a hipótese de Paget é a migração preferencial das células de

melanoma murino B16F10 para o pulmão, quando injetadas por via endovenosa. Foi

demonstrado que o alojamento dessas células no pulmão é dependente da interação entre a

molécula de adesão CD44, expressa pelas células B16F10, e o ácido hialurônico. O

tratamento de camundongos com um inibidor do receptor CD44 inibiu o desenvolvimento de

metástase pulmonar quando as células de melanoma foram injetadas por via endovenosa, mas

não o crescimento o local após injeção subcutânea (MUMMERT et al., 2003). Acredita-se

que isso se deva ao fato dos vasos sanguíneos pulmonares, dos brônquios e dos bronquíolos

expressarem em sua superfície uma grande quantidade de ácido hialurônico

(MOHAMADZADEH et al., 1998), podendo a expressão dessa molécula na superfície das

células endoteliais ser estimulada em algumas condições (UNDERHILL et al., 1993).

24

Outro exemplo de metástase direcionada a um órgão específico foi demonstrado por

Engbring et al. (2002). Quando células B16F10 são expostas a um peptídeo sintético que

contém a região carboxi-terminal da cadeia 1 da laminina ocorre uma indução do fenótipo

maligno dessas células, favorecendo o desenvolvimento de metástase hepática em

camundongos quando esse peptídeo é co-injetado com as células. Porém, as células B16F10

que são tratadas com uma combinação de heparitinase e condrointinase ABC têm uma menor

capacidade de desenvolver metástase hepática, evidenciando a importância dos proteoglicanos

heparan sulfato e condroitina sulfato para o alojamento das células no fígado.

2.2 FÁRMACOS ANTINEOPLÁSICOS

Embora o desenvolvimento do câncer tenha sido reconhecido há séculos, pouco se

sabia sobre os mecanismos biológicos de transformação e progressão tumoral até o advento da

biologia molecular na última metade do século 20. Antes de 1950, a terapia antineoplásica

baseava-se em procedimentos cirúrgicos e a radioterapia teve sua importância terapêutica

depois de 1960, porém essas terapias não atingiam tumores metastáticos. O início da era

moderna da quimioterapia antineoplásica foi em 1942, com a introdução da mostarda

nitrogenada, por Louis Goodman e Alfred Gilman e colaboradores, no tratamento do linfoma

não-Hodgkin (CHABNER; ROBERTS, 2005).

A importância clínica dos agentes antineoplásicos induz a necessidade de estudo

sistemático, o que primeiramente deveria ser feito com o uso de classificações químicas,

levando-se em conta os diferentes grupos funcionais presentes na estrutura das moléculas dos

agentes antitumorais. Contudo, a variedade de tipos de compostos utilizados em quimioterapia

oncológica é tão grande que tal classificação só pode ser feita indiretamente (ALMEIDA et

al., 2005).

Poucas categorias de fármacos apresentam um índice terapêutico mais estreito e um

maior potencial em causar efeitos adversos do que os agentes antineoplásicos. É essencial

adquirir uma compreensão completa de sua farmacologia, das interações medicamentosas e da

farmacocinética clínica para o seu uso seguro e efetivo nos seres humanos. Os agentes úteis

no tratamento das doenças neoplásicas podem ser classificados como: (1) agentes alquilantes,

onde se encontram as mostardas nitrogenadas, etilieneiminas, derivados da metilidrazina,

alquil sulfonato, nitrosuréias, triazenos e compostos de coordenação de platina; (2)

25

antimetabólitos, compreendendo os análogos do ácido fólico, da pirimidina e da purina; (3)

produtos naturais, como os alcalóides da vinca, taxanos, epipodofilotoxinas, camptotecinas,

antibióticos e enzimas; (4) hormônios e seus análogos; e (5) outros agentes, como os

anticorpos, inibidores da proteína tirosina cinase e modificadores da resposta biológica

(CHABNER et al., 2006).

A ação dos atuais fármacos antineoplásicos está direcionada, em sua totalidade, em

bloquear a proliferação e/ou o crescimento celular. Para isso, atuam diretamente nos

processos ou moléculas fundamentais a replicação das células, como o DNA, o RNA e na

divisão mitótica. Nem sempre, contudo, a ação é única ou por apenas um mecanismo de ação,

podendo ser expressa em vários níveis, dependendo da concentração em que o fármaco se

encontra no ambiente tumoral. Em qualquer situação, a especificidade pelas células tumorais

é pequena, afetando outros órgãos e tecidos e dando origem a uma toxicidade que quase

sempre limita as possibilidades de se administrar a dose total que teoricamente seria

conveniente. Com isso, as células mais afetadas são as que apresentam maior velocidade de

divisão e crescimento: as células da medula óssea, dos órgãos reprodutivos, do epitélio

intestinal e dos folículos pilosos. Alguns órgãos são afetados com maior freqüência, tais como

o pulmão, fígado, rim e estruturas nervosas (FLOREZ, 1997; PAGE et al., 2006).

Um dos maiores problemas relacionados à quimioterapia antineoplásica diz respeito

ao aparecimento de células resistentes ao tratamento. Para tentar ultrapassar essa barreira,

introduziu-se na terapêutica a utilização de combinações de fármacos com mecanismos de

ação distintos, visando melhorar a eficácia através da atuação sinérgica nas células

neoplásicas, levando à obtenção de resultados clínicos melhores do que quando é utilizado um

único agente, mesmo sendo este o mais eficaz para um dado tipo de tumor. Como ferramenta

para a observação da combinação ideal, têm-se avaliações in vitro de linhagens de células

neoplásicas estabelecidas ou, mais raramente, de cultura primária de células tumorais, com o

intuito de explorar ao máximo a interação sinérgica entre os fármacos combinados a nível

bioquímico e molecular (ZOLI et al., 2000).

Aliado a esse artifício terapêutico, pode ser utilizado o estudo das variações

genéticas da resposta farmacológica de indivíduos à quimioterapia. O entendimento desses

fatores possibilitará a identificação de indivíduos propensos ao desenvolvimento de reações

adversas tóxicas, ou daqueles que responderão melhor a um dado regime de tratamento. Tais

estudos podem ser aplicados na clínica através de diagnóstico molecular ou genotipagem,

26

facilitando a seleção ideal da combinação de fármacos e a dose para um paciente individual

(LEE et al., 2005).

O objetivo primordial da terapia do câncer, que é prolongar a sobrevivência ou

alcançar a cura do indivíduo, não sofrerá mudanças, mesmo com várias possibilidades

terapêuticas entre os fármacos disponíveis atualmente ou a introdução de novas moléluculas.

Porém, a identificação de alvos moleculares mais seletivos para cada tipo de tumor,

especialmente para o bloqueio de vias de sinalização aberrantes envolvendo o crescimento das

células neoplásicas, dos processos de angiogênese e metástase e da regulação do ciclo celular,

possibilitam o desenvolvimento de novos tratamentos para o câncer (ROWINSKY, 2000).

2.2.1 Novos alvos moleculares para o tratamento do câncer

Garrett e Workman (1999) consideram que o câncer é uma doença “inteligente”,

sendo necessária uma terapia mais inteligente ainda para derrotá-la. Essa consideração é

baseada no pressuposto de que pacientes em tratamento para diferentes tipos de neoplasias

podem responder pouco ou até mesmo não responder à melhor combinação de terapia

disponível. Com isso, a identificação de um novo alvo e sua validação, influenciando

qualquer uma das etapas da oncogênese, tem sido utilizada como ferramenta para o

desenvolvimento de novas moléculas para o tratamento do câncer.

A introdução do taxol na clínica em 1992 foi o marco da atuação específica de

moléculas contra o câncer. Esse fármaco foi originalmente isolado da casca da Taxus

brevifolia e atua interagindo de maneira específica e reversível com a subunidade -tubulina

dos microtúbulos, impedindo a despolimerização dos mesmos de modo independente de GTP.

Esses componentes do citoesqueleto são extremamente importantes para o processo de

mitose, podendo ser destacados como alvo para o tratamento do câncer. Com mecanismo de

ação análogo ao taxol, outros produtos naturais, tais como as epotilona A e B, a

discodermolida e a eleuterobina, estão sendo estudados como prováveis fármacos para a

quimioterapia antineoplásica (CORRÊA, 1995; HE; ORR; HORWITZ, 2001; JORDAN;

WILSON, 2004).

27

O desenvolvimento racional e a busca por moléculas que atuam em alvos específicos

pode originar agentes com baixa toxicidade, alta eficácia clínica e amplo índice terapêutico.

Isso é devido à habilidade em induzir seletivamente citotoxicidade nas células neoplásicas,

pela atuação em aberrações que contribuem para a proliferação do tumor e não atingindo

tecidos normais. Vários ensaios clínicos estão avaliando substâncias que atuam

especificamente na inibição do receptor do fator de crescimento erbB ou em proteínas cinases

que atuam na sinalização desse receptor, como Ras, Raf, MAPK/ERK cinase (MEK), PI3-

cinase e Akt. Porém, para a ótima eficácia de cada tratamento específico, é requerida uma

combinação de agentes e a seleção de pacientes que têm tumores que utilizam o alvo

selecionado para a indução da proliferação celular (BONO; TOLCHER; ROWINSKY, 2003).

O processo de morte celular programada ou apoptose é um mecanismo

evolutivamente conservado, empregando uma complexa sinalização para a remoção de células

em um tecido. É um processo importante durante o desenvolvimento, na homeostasia dos

órgãos e na eliminação de células comprometidas em suas funções normais, como células

danificadas, infectadas, neoplásicas e linfócitos auto-reativos (GULBINS; DRESCHERS;

BOCK, 2006). A apoptose pode ser iniciada pela ativação do “receptor da morte”, que age

sobre a caspase 8, ou pela via mitocondrial, que atua na caspase 9, mas ambas as vias

convergem para a ativação da caspase efetora (caspase 3), que age sobre os “substratos da

morte”. Esse processo é regulado pelas proteínas do linfoma de célula B-2 (Bcl-2, B-cell

lymphoma protein 2) e pelas proteínas inibidoras de apoptose (IAP, inhibitor protein

apoptosis). Em neoplasias em que o processo de apoptose está desregulado, ocorre uma

superexpressão de proteínas membros dessas famílias, e, portanto, a apoptose é considerada

como um alvo para fármacos antineoplásicos (ANDERSEN; BECKER; STRATEN, 2005;

DON; HOGG, 2004; MAKIN; DIVE, 2001).

O melhor entendimento do ciclo celular e a observação de que muitos tipos de

cânceres são iniciados por alterações na expressão de reguladores do processo normal, com a

perda da integridade dos checkpoints, levou ao desenvolvimento de uma nova classe de

agentes quimioterápicos que atuam nas proteínas CDKs. A inibição dessas cinases pode

ocasionar a limitação da célula tumoral em não ser influenciada pelos checkpoints do ciclo

celular, facilitando a indução da apoptose (SCHWARTZ; SHAH, 2005).

Desde que Judah Folkman iniciou uma nova era na terapia do câncer com a hipótese

de que a modulação da angiogênese deve ser usada para controlar o crescimento tumoral,

baseado na observação de que tumores requerem uma neovascularização para continuar seu

28

crescimento, esforços têm sido realizados para o desenvolvimento de moduladores desse

processo (FOLKMAN, 1971; MILKIEWICZ et al., 2006). A vantagem da exploração da

angiogênese destaca-se pelo fato de a inibição da motilidade, da migração e da formação do

tubo das células endoteliais por agentes quimioterápicos ocorrer em doses mais baixas do que

a necessária para influenciar a proliferação das células neoplásicas. Outro motivo é que as

células endoteliais são geneticamente estáveis e não adquirem mecanismos de resistência a

drogas. Esses fatores podem proporcionar aos agentes antiangiogênicos uma janela

terapêutica mais larga quando comparados aos quimioterápicos que influenciam no

crescimento das células neoplásicas (SCHIRNER, 2000). Várias moléculas que têm sido

aprovadas e estão em fase clínica de estudo atuam no processo da angiogênese, como

bortezomib, bevacizumab, sorafenib, sunitinib entre outras (FOLKMAN, 2007).

Um sério problema que está envolvido na ineficácia do tratamento quimioterápico

do câncer é a resistência múltipla a drogas, cuja incidência pode variar entre os tipos de

tumores e o esquema terapêutico em utilização. Diferentes mecanismos celulares de

resistência a drogas têm sido descritos, tais como a redução da acumulação intracelular do

fármaco, a alteração no alvo celular, a ativação de sistemas de detoxificação, o aumento do

reparo a danos provocados ao DNA induzidos por fármacos, o bloqueio da apoptose e

alterações nos fatores envolvidos no controle do ciclo celular. Dentre esses mecanismos, um

dos principais que pode ser observado clinicamente é a atuação de proteínas transportadoras

pertencentes à classe de transportadores com cassete de ligação ao ATP (ABC, ATP-binding

cassete), que utilizam a energia da hidrólise do ATP para translocar seus substratos através da

membrana celular (FILIPITS, 2004; TSURUO et al., 2003)

2.3 PRODUTOS NATURAIS CONTRA O CÂNCER

Os produtos naturais têm exercido um papel importante como fonte de efetivos

agentes no combate ao câncer, já que cerca de 60% dos fármacos antineoplásicos disponíveis

atualmente na terapêutica foram desenvolvidos a partir de fontes naturais, incluindo plantas,

organismos marinhos e microrganismos. A procura por agentes antitumorais iniciou-se na

década de 1950 com a descoberta de substâncias que se tornaram fármacos, como os

alcalóides vincristina e vimblastina e as podofilotoxinas (CRAGG; NEWMAN, 2005).

29

Observando o potencial dos produtos naturais como fonte de moléculas

antitumorais, o NCI iniciou em 1955 seu programa sistemático de triagem de drogas,

estabelecendo o Cancer Chemotherapy National Service Center (NSC). Inicialmente, a

triagem era realizada in vivo com uma das linhagens hematológicas tumorais murinas P388 ou

L1210, porém essa triagem teve pouco sucesso devido a limitações do modelo utilizado. Isso

levou o NCI a repensar o programa de triagem de novas moléculas, passando a utilizar, a

partir de 1989, um sistema in vitro com um painel com 60 linhagens de diferentes tumores

humanos, sendo um componente chave do Devolopmental Therapeutics Program (DPT) na

Division of Cancer Treatment and Diagnosis (TAKIMOTO, 2003).

Com esse programa de triagem, o NCI já testou mais de 90.000 extratos obtidos de

fontes naturais contra linhagens celulares de diferentes leucemias humanas, permitindo a

identificação de espécies com uma alta probabilidade de se encontrar moléculas de interesse

farmacológico. Cragg, Newman e Yang (2006) destacaram famílias com um alto número de

espécie ativas, como a Fabaceae, Myrsinaceae, Lecythidaceae, Apocynaceae e Solanaceae.

Observa-se, então, que os produtos naturais, com destaque para as plantas,

constituem em componentes essenciais na procura por novas possibilidades terapêuticas para

o tratamento do câncer, por já terem proporcionado um alto número de fármacos utilizados

clinicamente (BALUNAS; KINGHORN, 2005).

2.3.1 Biodiversidade, biotecnologia e o desenvolvimento de novos fármacos

A biodiversidade refere-se a todos os produtos da evolução orgânica, em seus

diferentes níveis – de genes a espécies e ecossistemas completos – bem como à sua

capacidade de reprodução. Corresponde à variabilidade viva, ao próprio grau de

complexidade da vida, abrangendo a diversidade entre as espécies e seus hábitats (ALBAGLI,

1998).

A biotecnologia, compreendida em toda sua abrangência, está relacionada com

qualquer exploração tecnológica da biodiversidade, utilizando a informação e uso crescente

da ciência e tecnologia no processo produtivo. A partir desse aspecto, há uma potencialização

dos usos e aplicações da biotecnologia na ampliação do interesse de importantes segmentos

30

econômicos e industriais na biodiversidade como capital natural de realização futura

(ALBAGLI, 1998; GARCIA, 1995).

Nesse contexto, destaca-se o valor do Brasil por possui a maior biodiversidade do

mundo, estimada em cerca de 20% do número total de espécies do planeta. Considerando que

esse patrimônio genético é escasso nos países desenvolvidos, tem na atualidade um valor

econômico-estratégico inestimável, principalmente para o desenvolvimento de novos

medicamentos, já que 40% dos fármacos disponíveis na terapêutica atual foram desenvolvidos

a partir de produtos naturais (CALIXTO, 2003).

Os produtos naturais são tipicamente metabólitos secundários produzidos por

organismos em resposta a estímulos externos como alterações nutricionais, infecção e

competição. São bem reconhecidos pela indústria farmacêutica por possuir grande

variabilidade química e largo espectro de atividade farmacológica, conferindo, assim,

vantagens em relação às substâncias químicas sintéticas (STROHL, 2000).

Na busca por moléculas naturais de interesse farmacológico, podem ser utilizadas

várias técnicas, incluindo triagem randômica, etnofarmacologia, quimiossitemática e

influência no metabolismo do organismo produtor utilizando a biotecnologia. Essas

ferramentas, aliadas a estudos farmacológicos e otimização molecular do composto ativo,

permitem uma grande probabilidade de se encontrar uma molécula que poderá vir a ser um

fármaco ou ser utilizado como protótipo para o desenvolvimento de novas drogas (BASSO et

al., 2005; HAMBURGER; HOSTETTMANN, 1991; VERPOORTE, 1998).

2.3.2 Lapachol e derivados

O lapachol é uma hidroxi-naftoquinona substituída, 2-hidróxi-3(3-metil-2-butenil)-

1,4-naftalenodiona, e foi descoberto e estudado desde o século passado. Foi obtido

originalmente da espécie Tabebuia avellanedae Lor. (Bignoniaceae), mas pode ocorrer em

espécies das famílias Verbenaceae, Proteaceae, Leguminosae, Sapotaceae, dentre outras. Tem

a forma de cristais prismáticos ou folhas amareladas, bastante solúvel em diferentes solventes

orgânicos, com a solubilidade em água influenciada pelo pH, apresentando comportamento de

uma substância ionizável fracamente ácida. Alguns derivados éter metílico do lapachol

31

também já foram isolados, como a -lapachona, a -lapachona, o desoxilapachol e a desidro-

-lapachona (xiloidona) (FONSECA; BRAGA; SANTANA, 2003).

O potencial do lapachol como agente antitumoral foi descrito pela primeira vez em

1968 por Rao et al., atuando sobre o carcinossarcoma de Walker 256. Apesar de o mecanismo

de ação ainda não estar estabelecido, foi demonstrado que o lapachol inibe a vitamina K

epóxido redutase, por assumir uma forma tautomérica análoga ao intermediário hidroxi-

vitamina K enolato que se encontra ligado à enzima oxidada (PREUSCH; SUTTIE, 1984).

Correlacionando essa atividade com o potencial antineoplásico, Dinnen e Ebisuzaki (1997),

utilizando a linhagem celular de eritroleucemia murina clone 3-1, observaram que a ação do

lapachol era inibida pela adição de vitamina K1, indicando que o potencial antitumoral está

relacionado com reações dependentes de vitamina K.

Ainda, Balassiano et al. (2005) demonstraram que o lapachol alterou o perfil da

expressão de proteínas de células HeLa em concentrações não-tóxicas, além de inibir a

migração celular no modelo experimental da membrana corioalantóica, sugerindo um

potencial antimetastático.

Demonstrou-se que um dos derivados naturais do lapachol, a -lapachona, possui

atividade antitumoral através da inibição do reparo do DNA induzido por radiação ionizante,

possivelmente devido à ativação da topoisomerase I (BOOTHMAN; TRASK; PARDEE,

1989; PARK et al., 2005; SUN et al., 2006). Outros estudos evidenciaram o potencial da -

lapachona na indução da apoptose (PLANCHON et al., 1995; WOO et al., 2006) e de

inibidores de CDK (CHOI; KANG, YOO, 2003; DON et al., 2001) e inibição da angiogênese

(KUNG et al., 2006).

Já foram realizados estudos clínicos com o lapachol, indicando a ausência de

atividade antitumoral, e acredita-se que isto se deve ao fato de a droga não alcançar a

concentração plasmática efetiva sem o desenvolvimento de efeitos tóxicos (BLOCK et al.,

1974; RAO; MCBRIDE; OLESON, 1968; SANTANA; SILVA, 1981).

Com essas observações, vários estudos têm sido realizados visando à otimização

molecular e à identificação de derivados do lapachol com atividade superior à molécula

protótipo sobre a leucemia linfocítica P-388 in vitro e in vivo (CONSOLACAO et al., 1975),

o carcinossarcoma de Walker 256 (SUBRAMANIAN; FERREIRA; TRSIC, 1998), a

linhagem celular de câncer de mama MCF-7 (SILVA et al., 2002) e inibição da ativação do

vírus Epstein-Barr induzido por éster de forbol (SACAU et al., 2003).

32

2.3.3 Ácido betulínico e derivados

O ácido betulínico é um triterpeno pentacíclico de origem natural presente em várias

espécies distribuídas pelos trópicos, como a Tryphyllum peltatum, a Ancistrocladus heyneaus,

a Diospyros leucomelas, a Tetracera boliviana, a Zizyphus joazeiro, a Syzygium formosanum,

dentre outras. Foi isolado a partir de fracionamento biomonitorado, sendo identificado como

um agente com citotoxicidade seletiva para uma grande variedade de linhagens celulares

tumorias e sugerido como um forte candidato para estudos pré-clínicos e clínicos (PISHA et

al., 1995; ZUCO et al., 2002).

Estudos tentando elucidar o mecanismo de ação da citotoxicidade seletiva do ácido

betulínico têm sido realizados, indicando que essa substância natural ativa a apoptose por

diferentes vias. Fulda et al. (1998) demonstraram que o ácido betulínico induz apoptose, de

modo independente de CD95, por ativação das capases-8 e -3 e liberação do fator indutor de

apoptose (AIF, apoptosis-inducing factor) após transição de permeabilidade das mitocôndrias

das células da linhagem de neuroblastoma humano SHEP. Tan, Yu e Pezzuto (2003)

demonstraram que a apoptose induzida por ácido betulínico nas células UISO-Mel-1, obtidas

do linfonodo de um paciente com melanoma metastático, é desencadeada pela ativação de

MAPKs. Golpal et al. (2005) evidenciaram que a linhagem celular K562, referente à leucemia

mielóide crônica, é sensível à apoptose induzida por ácido betulínico, provavelmente por

alteração na permeabilidade mitocondrial e sem alterar os níveis da proteína Bcr-Abl.

O potencial do ácido betulínico não tem sido restrito à monoterapia, já que há a

sugestão da associação desse composto natural com outros fármacos antineoplásicos, como

doxorrubicina e cisplatina, na sensibilização à apoptose. O objetivo é aumentar a eficácia de

outros agentes antitumorais, visando à utilização de regimes de dose menores para minimizar

os efeitos adversos e tóxicos provenientes da quimioterapia (FULDA; DEBATIN, 2005).

Desde a identificação do ácido betulínico como um provável agente antineoplásico,

várias modificações moleculares têm sido propostas para aumentar a potência do composto

original, por meio de simples substituições (KIM; KOO; KIM, 2001; KIM; PEZZUTO;

PISHA, 1998; YOU et al., 2003), adição de grupamentos ftalatos (KVASNCA et al., 2005) ou

conjugação com aminoácidos (JEONG et al., 1999).

33

2.3.4 Solidagenona

A solidagenona é um triterpeno do tipo labdano, encontrado em espécies do gênero

Solidago. Estudos demonstram que essa substância apresenta efeito gastroprotetor em

modelos animais (RODRIGUES et al., 2002; SCHMEDA-HIRSCHMANN; RODRIGUEZ;

ASTUDILLO, 2002). Até o momento não há relatos de atividade antineoplásica para a

solidagenona.

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS

Este trabalho foi desenvolvido com base no projeto 025, “Avaliação da atividade

farmacológica de substâncias químicas naturais”, aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa

Animal do Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz da Fundação Oswaldo Cruz

(CEUA/CPqGM/FIOCRUZ). Os vegetais utilizados para a obtenção das substâncias puras

foram coletados em Áreas de Proteção Ambiental (APAs) do Estado da Bahia, com

autorização do Centro de Recursos Ambientais do Estado da Bahia (CRA/BA).

3.2 SUBSTÂNCIAS NATURAIS E DERIVADOS SINTÉTICOS

Todas as substâncias naturais e derivados sintéticos utilizados foram dissolvidos em

dimetilsulfóxido (DMSO, Sigma, St. Louis, MO, EUA), na concentração de 10 mg/mL, e

armazenadas em tubos de microcentrífuga à -20º C. No momento da utilização, as substâncias

foram descogenladas à temperatura ambiente e diluídas em meio RPMI 1640 (Life

Technologies, GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD, EUA).

As substâncias puras acetato do ácido betulínico, lapachol, nor-lapachol, -iodo-

lapachona e 568 foram cedidas pelo Prof. Dr. José Maria Barbosa Filho (Laboratório de

Tecnologia Farmacêutica, Universidade Federal da Paraíba, LTF/UFPB). A solidagenona foi

cedida pela Dra. Therezinha Tomassini (FarManguinhos/FIOCRUZ).

O lapachol (345) foi isolado a partir da espécie Tabebuia aurea. A partir deste,

modificações químicas foram realizadas, dando origem ao nor-lapachol (342), através da

contração de cadeia pela reação de Hooker; e à -iodo-lapachona (344), através de iodo-

ciclização (Figura 3).

35

O acetato do ácido betulínico (453) foi obtido através da acetilação do ácido

betulínico isolado de Zizyphus joazeiro Mart. (Rhamnaceae), utilizando anidrido acético e

piridina (Figura 3).

A solidagenona (273) foi isolada a partir da espécie Solidago chilensis (Figura 3).

O nome e a estrutura da substância 568 não foram apresentados por motivo de sigilo,

já que se trata de uma substância inédita.

Figura 3

3.3 CULTURA DE CÉLULAS

Células das linhagens B16-F10, K562 e Daudi foram mantidas em meio RPMI 1640,

suplementado com 10% de soro bovino fetal (SBF, Cultilab, Campinas, SP, Brasil) e 50

OH

O

O

nor-lapachol (342)

OH

O

O

lapachol (345)

O

O

O

I

-iodo-lapachona (344)

COOH

CH3COO

acetato do ácido betulínico (453)

O

OH

HO

solidagenona (273)

Figura 3: Estruturas das substâncias avaliadas.

36

g/mL de gentamicina (Novafarma, Anápolis, GO, Brasil), em estufa umidificada a 37ºC e

5% de CO2. Sendo as células B16-F10 caracteristicamente aderentes, para todos os

experimentos em que estas foram utilizadas, procedeu-se o destacamento das mesmas das

garrafas de cultura por método não-enzimático, utilizando o agente quelante

etilenodiaminotetracetato bissódico (EDTANa2, Dinâmica, Diadema, SP, Brasil) a 1% em

PBS (phosphate buffer saline, Sigma)

A linhagem de células B16-F10 são um subclone da linhagem B16 de melanoma de

camundongo, obtida inicialmente por Fidler (1973), e é caracterizada por possuir um alto

potencial metastático e instabilidade genética, o que lhe a confere capacidade de dar origem a

variantes resistentes a drogas (CILLO et al., 1987).

K562 e Daudi são linhagens celulares de câncer humano com origens genéticas

distintas. A primeira refere-se à leucemia mielóide crônica (CML, chronic myeloid leukemia),

procedente da translocação do gene da tirosina cinase abl, situado no braço longo do

cromossomo 9, para o cromossomo 22, resultando no cromossomo Filadélfia (Ph1). A

expressão do gene fusionado bcr-abl vai produzir uma proteína tirosina cinase (Bcr-Abl)

constitutivamente ativa (LUGO et al., 1990; ROWLEY, 1973). A linhagem Daudi

corresponde ao linfoma de Burkitt, que é um linfoma de célula B com alta taxa de replicação,

originado, em 80% dos casos, da translocação entre os cromossomos 8 e 14, resultando na

justaposição do gene c-myc (cromossomo 8) com o enhancer da cadeia pesada de

imunoglobulina do gene IgH (cromossomo 14), causando a superexpressão da proteína c-Myc

(BLUM; LOZANSLKI; BYRD, 2004).

3.4 ANIMAIS

Camundongos machos e fêmeas, com idade entre quatro e oito semanas, da

linhagem BALB/c, provenientes do Biotério do Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz, foram

utilizados para a obtenção dos esplenócitos para o ensaio de citotoxicidade. Os animais foram

mantidos no biotério com água e alimentos ad libitum e, no momento do experimento, foram

sacrificados em câmeras de CO2 para a retirada do baço.

37

3.5 ENSAIO DE CITOTOXICIDADE EM CÉLULAS NORMAIS

A avaliação da citotoxicidade em células normais foi realizada pelo método de

incorporação de [3H]-timidina, com cinco diluições seriadas na proporção 1:3, a partir da

concentração 500 g/mL. Assim, esplenócitos de camundongos sadios foram adicionados, em

triplicata, às placas de 96 poços (6 x 105 células/poço), e incubados por 24 horas, em estufa

umidificada à 37ºC e 5% de CO2, na presença das substâncias e de 25 L de [3H]-timidina (1

Ci/poço; Amersham, Little Chalfont, England). Após este período, as células foram

coletadas em um filtro de fibra de vidro com o auxílio de um coletor de células (Filtermate

196, Packard, Meriden, CT, EUA). Os filtros, após secagem à temperatura ambiente por 24

horas, foram lidos em contador de radiação (Beta Counter, Packard, Meriden, CT, EUA).

Foram realizados três experimentos independentes. O percentual de citotoxicidade foi

determinado comparando-se os valores da radioatividade incorporada pelas células incubadas

na presença das substâncias avaliadas com os das células não-tratadas.

3.6 AVALIAÇÃO DA PROLIFERAÇÃO DAS CÉLULAS NEOPLÁSICAS

Células das linhagens B16-F10, K562 e Daudi foram adicionadas na densidade 5 x

104, 1 x 105 e 5 x 104, respectivamente, em placas de 96 poços, na presença ou ausência das

substâncias testadas. Para este ensaio, as substâncias foram adicionadas na concentração de

100 g/mL, a partir da qual foram realizadas cinco diluições seriadas na proporção de 1:3, em

triplicata, e em três experimentos independentes. As células foram mantidas em estufa

umidificada à 37ºC e 5% de CO2 por 24 horas, e após este período, foram adicionados 25 L

de [3H]-timidina (1 Ci/poço), sendo as culturas incubadas por um período adicional de 12-18

horas. Após este período, as células foram coletadas em um filtro de fibra de vidro com o

auxílio de um coletor de células. Os filtros, após secagem à temperatura ambiente por 24

horas, foram lidos em contador de radiação . O percentual antineoplásico foi determinado

comparando-se os valores da radioatividade incorporada pelas células incubadas na presença

das substâncias avaliadas com os das células não-tratadas.

38

3.7 AVALIAÇÃO DO METABOLISMO MITOCONDRIAL DAS CÉLULAS

NEOPLÁSICAS

Células das linhagens B16-F10, K562 e Daudi foram adicionadas na densidade 5 x

104, 1 x 105 e 5 x 104, respectivamente, em placas de 96 poços, na presença ou na ausência

das substâncias testadas. Para este ensaio, as substâncias foram adicionadas na concentração

de 100 g/mL, a partir da qual foram realizadas cinco diluições seriadas na proporção de 1:3,

em triplicata, e em três experimentos independentes. As células foram mantidas em estufa

umidificada à 37ºC e 5% de CO2 por 4, 12 e 24 horas, sendo que 4 horas antes do término da

incubação foi adicionado MTT [brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium;

Sigma]. Após este período, as placas foram centrifugadas a 2.000 RPM por três minutos, o

sobrenadante foi descartado com o auxílio de micropipeta multicanal, e o precipitado de

formazan gerado, dissolvido em 200 L de DMSO. Utilizando um leitor de microplacas

Spectramax 190 (Molecular Devices Co., Sunnyvale, CA, EUA), foi realizada a leitura da

absorção a 490 nm nas placas. O percentual de inibição do metabolismo mitocondrial foi

determinado comparando-se os valores de absorção no comprimento de onda indicado pelas

células incubadas na presença das substâncias avaliadas com os das células não-tratadas.

3.8 ENSAIO DE FORMAÇÃO DE COLÔNIA EM MEIO SEMI-SÓLIDO

Neste ensaio, células B16-F10 foram adicionadas a placas de 6 poços para a

avaliação do potencial antimetastático inicial das substâncias. Uma solução de agar a 1% foi

autoclavada e misturada ao RPMI 1640 e SBF a 20% e pré-aquecido à 40ºC em banho-maria,

na proporção 1:1, obtendo-se uma solução de agar 0,5%. Foi adicionado 1,5 mL desta solução

a cada poço para a formação do agar base. Uma solução de agarose 0,7% também foi

autoclavada e misturada ao RPMI 1640 e SBF a 20% e pré-aquecido à 40ºC em banho-maria,

na proporção de 1:1, sendo adicionado a esta solução células de B16-F10 e as substâncias

testadas em três concentrações diferentes e em triplicata. Foi adicionado 1,5 mL desta solução

final de agarose 0,35% a cada poço, sendo a densidade final das células 5 x 104 por poço e a

39

concentração final das substâncias 5, 15 e 50 g/mL. A doxorrubicina, nas concentrações 5,

10 e 20 g/mL, foi utilizada como controle positivo. As placas foram incubadas por 14 dias a

37ºC e 5% de CO2 em estufa umidificada e, após este período, fotografadas com a câmera

Photometrics CoolSNAP cf (Roper Scientific, Inc.) acoplada ao microscópio invertido

Olympus IX71 (Tóquio, Japão), sendo observadas as colônias formadas. A inibição da

formação de colônias em meio semi-sólido foi determinada comparando-se as colônias dos

poços que continham células na presença das substâncias avaliadas com os que continham

células não-tratadas.

3.9 ENSAIO DE CICATRIZAÇÃO DE FERIDA EM CULTURA CELULAR

Para este experimento, células da linhagem B16-F10 foram utilizadas para avaliar o

potencial das substâncias em inibir a migração celular. As células (8 x 105/garrafa) foram

adicionadas a garrafas de cultura celular com superfície de crescimento de 25 cm2 e, após

aderência por 24 horas à 37ºC e 5% de CO2 em estufa umidificada, realizou-se duas feridas na

monocamada celular, em locais distintos, com o auxílio da ponta de uma pipeta estéril de

plástico de 5 mL. Lavou-se as células duas vezes com solução salina (NaCl 0,9%) e

adicionou-se novo meio de cultura contendo ou não as substâncias em solução nas

concentrações 10, 25 e 50 g/mL. Foi utilizada a colchicina como controle positivo nas

concentrações 0,2, 0,6 e 1,0 g/mL. Neste momento, fotografou-se a ferida formada com a

câmera acoplada ao microscópio invertido, e após 24 horas adicionais de incubação.

Observações foram feitas acerca da migração celular, em comparação com a garrafa controle

(sem as substâncias avaliadas).

3.10 AVALIAÇÃO DA APOPTOSE EM CÉLULAS NEOPLÁSICAS

Tentando estabelecer uma correlação entre a atividade antineoplásica com o padrão

de morte celular, o potencial das substâncias em induzir apoptose foi avaliado por citometria

de fluxo. Células das linhagens Daudi e B16-F10 (5 x 104/poço) e células da linhagem K562

40

(1 x 105/poço) foram adicionadas, em triplicata, a placas de 96 poços, na presença ou na

ausência das substâncias avaliadas e incubadas por 4 horas em estufa umidificada à 37ºC e

5% de CO2. A concentração das substâncias para todas as linhagens celulares foi de 100

g/mL Após este período, as células foram transferidas para tubos de citometria, lavadas duas

vezes com 1 mL de PBS gelado a 2000 RPM por 3 minutos, resuspensas em 100 L do

tampão de ligação da anexina-V (contendo HEPES/NaOH a 10mM, pH 7,4; NaCl a 140 mM;

e CaCl2 a 2,5 mM) e marcadas com 5 L de anexina-V (BioSource, Camarillo, CA, EUA) por

15 minutos, na ausência de luz. Após este período, adicionou-se 400 L do tampão de ligação

da anexina-V e 10 L de iodeto de propídio (BioSource). Os dados foram adquiridos em

seguida no citômetro de fluxo FACSCalibur (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EUA) e

analisados no programa CellQuest FACS (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA).

3.11 ANÁLISE DOS DADOS

Todos os ensaios, com exceção da cicatrização de ferida em cultura celular, foram

realizados em triplicatas. Os ensaios de citotoxicidade, da avaliação da proliferação e do

metabolismo mitocondrial de células neoplásicas foram realizados em três experimentos

independentes.

O percentual de inibição foi calculado de acordo com a fórmula abaixo:

% inibição = 100 – (valor da substância x 100)/valor do controle

Onde valor da substância corresponde a contagem por minuto (CPM) ou densidade óptica

(OD, optical density) na presença das substâncias e o valor controle corresponde a contagem

por minuto (CPM) ou densidade óptica (OD, optical density) na ausência das substâncias.

O IC50 dos experimentos foi calculado utilizando Prism 4 for Windows (Graphpad

Software, Inc., San Diego, CA, USA). Os percentuais de inibição estão apresentados como

média ± erro padrão (SEM, standard error of the median).

4 RESULTADOS

4.1 CITOTOXICIDADE DAS SUBSTÂNCIAS PURAS TESTADAS EM ESPLENÓCITOS

DE CAMUNDONGOS

A avaliação da citotoxicidade em células normais foi realizada para determinar se

ocorre toxicidade seletiva das substâncias em relação às células neoplásicas. Assim,

esplenócitos de camundongos normais foram utilizados para a determinação da concentração

que causa 50% de inibição (IC50) da proliferação dessas células, obtida a partir dos

percentuais de inibição de cinco concentrações seriadas de três experimentos independentes.

O nor-lapachol foi a substância pura que apresentou a menor toxicidade para células

normais, com IC50 de 282 g/mL, enquanto que a -iodo-lapachona e a 568 foram as

substâncias com maior toxicidade, apresentando IC50 de 17 g/mL e 16 g/mL,

respectivamente. A IC50 de cada substância está ilustrada na Figura 4.

Figura 4

Figura 4: Citotoxicidade das substâncias naturais e derivados sintéticos para células normais. Esplenócitos de camundongos foram incubados na presença ou ausência das substâncias e [3H]-timidina por 24 horas. O percentual de citotoxicidade foi determinado de acordo com a incorporação de timidina, sendo apresentado como média ± SEM, e a IC50 de cada substância foi calculada utilizando Prism 4 for Windows. 273, solidagenona; 342, nor-lapachol; 344, -iodo-lapachona; 345, lapachol; e 453, acetato do ácido betulínico.

IC50

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.00

25

50

75

100

125273

342

344

345

453568

Droga IC50 (g/mL)

22,38

282,2016,99

127,50

40,8515,71

log[droga]

% d

e in

ibiç

ão

42

4.2 INIBIÇÃO DA INCORPORAÇÃO DE [3H]-TIMIDINA PELAS SUBSTÂNCIAS

PURAS TESTADAS

A influência das substâncias sobre a proliferação das células neoplásicas B16-F10,

K562 e Daudi foi avaliada pela incorporação de [3H]-timidina, sendo determinada a IC50 para

cada linhagem celular.

Para as células B16-F10, o acetato do ácido betulínico e a 568 mostraram-se as mais

potentes, com IC50 de 7 g/mL e 2,5 g/mL, respectivamente. Para as demais substâncias

foram obtidos valores de IC50 maiores que 19 g/mL (Figura 5A).

Para as células K562, a -iodo-lapachona e a 568 mostraram-se as mais potentes,

ambas apresentando IC50 em torno de 3 g/mL. O lapachol apresentou IC50 de 8 g/mL, e as

demais substâncias apresentaram valores de IC50 maiores que 11 g/mL (Figura 5B). A -

iodo-lapachona, o lapachol, o acetato do ácido betulínico e a 568 apresentaram valores de IC50

que não tiveram diferença estatística (p > 0,05) quando comparado à IC50 da doxorrubicina

(2,75 g/mL), que foi o controle positivo utilizado.

Mantendo o padrão de inibição frente às células neoplásicas Daudi, as substâncias -

iodo-lapachona e 568 apresentaram IC50 de 3 g/mL e 2,5 g/mL, respectivamente, com as

demais substâncias apresentando IC50 com valores maiores que 12 g/mL (Figura 5C). A -

iodo-lapachona, o acetato do ácido betulínico e a 568 apresentaram valores de IC50 que não

tiveram diferença estatística (p > 0,05) quando comparado à IC50 da doxorrubicina (2,74

g/mL), que foi o controle positivo utilizado.

4.3 INFLUÊNCIA AS SUBSTÂNCIAS PURAS TESTADAS SOBRE O METABOLISMO

MITOCONDRIAL

Utilizou-se o método do MTT para a observação da influência das substâncias sobre

o metabolismo mitocondrial das células neoplásicas, sendo cada linhagem incubada na

presença ou na ausência das substâncias durante 4, 12 e 24 horas.

43

De acordo com o resultado dos experimentos, as substâncias testadas não

influenciaram o metabolismo mitocondrial das células B16-F10 de forma acentuada, de

maneira que as substâncias solidagenona, nor-lapachol, -iodo-lapachona e 568 apresentaram

percentual de inibição menor que 50% na concentração de 100 g/mL. O lapachol e o acetato

do ácido betulínico apresentaram percentual de inibição abaixo 75% na concentração de 100

g/mL. A substância 568 foi testada apenas no tempo 24 horas, devido à quantidade

insuficiente de droga para a avaliação nos demais tempos de incubação (Figura 6).

Em cultura de células K562, as substâncias -iodo-lapachona, acetato do ácido

betulínico e 568 influenciaram entre 70 a 80% no metabolismo das mitocôndrias apenas no

período de 24 horas de incubação (Figura 7). Já com as células da linhagem Daudi, as

substâncias -iodo-lapachona e 568 comprometeram cerca de 70% o metabolismo

mitocondrial, apenas no período de incubação de 12 horas (Figura 8).

44

Figura 5

B16-F10

0.0 0.5 1.0 1.5 2.00

25

50

75

100

125273

342344

345

453568

Droga IC50 (g/mL)

37,74

42,27

31,54

7,032,53

19,30

log[droga]

% d

e in

ibiç

ão

K562

0.0 0.5 1.0 1.5 2.00

25

50

75

100

125 273

342

344

345

453568

Droga IC50 (g/mL)

42,34

2,99

2,79

57,63

8,18

10,99

log[droga]

% d

e in

ibiç

ão

Daudi

0.0 0.5 1.0 1.5 2.00

25

50

75

100

125 273

342344345

453

568

Droga IC50 (g/mL)

44,29

56,35

3,12

12,40

2,51

NC

log[droga]

% d

e in

ibiç

ãoA

B

C

Figura 5: Inibição da proliferação das células neoplásicas pelas substâncias puras testadas. Células das linhagens B16-F10 (A), K562 (B) e Daudi (C) foram incubadas na presença ou ausência das substâncias por 24 horas. O percentual de inibição da proliferação foi determinado de acordo com a incorporação de timidina, sendo apresentado como média ± SEM, e o IC50 de cada substância foi calculado utilizando Prism 4 for Windows. Os ensaios foram realizados em triplicatas e em três experimentos independentes. 273, solidagenona; 342, nor-lapachol; 344, -iodo-lapachona; 345, lapachol; 453, acetato do ácido betulínico; e NC, não calculado.

45

Figura 6

273

0 1,2 3,7 11 33 1000

25

50

75

1004 horas12 horas24 horas

Concentração (em g/mL)

% d

e in

ibiç

ão

342

0 1,2 3,7 11 33 1000

25

50

75

1004 horas

24 horas12 horas

Concentração (em g/mL)

% d

e in

ibiç

ão

344

0 1,2 3,7 11 33 1000

25

50

75

100

24 horas12 horas4 horas

Concentração (em g/mL)

% d

e in

ibiç

ão

345

0 1,2 3,7 11 33 1000

25

50

75

1004 horas12 horas24 horas

Concentração (em g/mL)

% d

e in

ibiç

ão

453

0 1,2 3,7 11 33 1000

25

50

75

1004 horas12 horas24 horas

Concentração (em g/mL)

% d

e in

ibiç

ão

568

0 1,2 3,7 11 33 1000

25

50

75

1004 horas12 horas24 horas

Concentração (em g/mL)

% d

e in

ibiç

ão

Figura 6: Influência das substâncias puras testadas no metabolismo mitocondrial das células B16-F10. Células da linhagem B16-F10 foram incubadas na presença ou na ausência das substâncias por 4, 12 e 24 horas. O percentual de inibição mitocôndrial foi calculado de acordo com os valores de absorbância do precipitado de formazan formado, sendo apresentado como média ± SEM de três experimentos independentes. 273, solidagenona; 342, nor-lapachol; 344, -iodo-lapachona; 345, lapachol; e 453, acetato do ácido betulínico.

46

Figura 7

Figura 7: Influência das substâncias puras testadas no metabolismo mitocondrial das células K562. Células da linhagem K562 foram incubadas na presença ou na ausência das substâncias por 4, 12 e 24 horas. O percentual de inibição mitocôndrial foi calculado de acordo com os valores de absorbância do precipitado de formazan formado, sendo apresentado como média ± SEM de três experimentos independentes. 273, solidagenona; 342, nor-lapachol; 344, -iodo-lapachona; 345, lapachol; e 453, acetato do ácido betulínico.

273

0 1,2 3,7 11 33 1000

25

50

75

1004 horas12 horas24 horas

Concentração (em g/mL)

% d

e in

ibiç

ão

342

0 1,2 3,7 11 33 1000

25

50

75

1004 horas

24 horas12 horas

Concentração (em g/mL)

% d

e in

ibiç

ão

344

0 1,2 3,7 11 33 1000

25

50

75

100

24 horas12 horas4 horas

Concentração (em g/mL)

% d

e in

ibiç

ão

453

0 1,2 3,7 11 33 1000

25

50

75

1004 horas12 horas24 horas

Concentração (em g/mL)

% d

e in

ibiç

ão

345

0 1,2 3,7 11 33 1000

25

50

75

1004 horas12 horas24 horas

Concentração (em g/mL)

% d

e in

ibiç

ão

568

0 1,2 3,7 11 33 1000

25

50

75

1004 horas12 horas24 horas

Concentração (em g/mL)

% d

e in

ibiç

ão

47

Figura 8

Figura 8: Influência das substâncias puras testadas no metabolismo mitocondrial sobre as células Daudi. Células da linhagem Daudi foram incubadas na presença ou ausência das substâncias por 4, 12 e 24 horas. O percentual de inibição mitocôndrial foi calculado de acordo com os valores de absorbância do precipitado de formazan formado, sendo apresentado como média ± SEM de três experimentos independentes.. A substância 568 foi avaliada apenas no tempo 24 horas. 273, solidagenona; 342, nor-lapachol; 344, -iodo-lapachona; 345, lapachol; e 453, acetato do ácido betulínico.

273

0 1,2 3,7 11 33 1000

25

50

75

1004 horas12 horas24 horas

Concentração (em g/mL)

% d

e in

ibiç

ão

342

0 1,2 3,7 11 33 1000

25

50

75

1004 horas

24 horas12 horas

Concentração (em g/mL)

% d

e in

ibiç

ão

344

0 1,2 3,7 11 33 1000

25

50

75

100

24 horas12 horas4 horas

Concentração (em g/mL)

% d

e in

ibiç

ão

345

0 1,2 3,7 11 33 1000

25

50

75

1004 horas12 horas24 horas

Concentração (em g/mL)

% d

e in

ibiç

ão

453

0 1,2 3,7 11 33 1000

25

50

75

1004 horas12 horas24 horas

Concentração (em g/mL)

% d

e in

ibiç

ão

568

0 1,2 3,7 11 33 1000

25

50

75

1004 horas12 horas24 horas

Concentração (em g/mL)

% d

e in

ibiç

ão

48

4.4 POTENCIAL ANTIMETASTÁTICO IN VITRO DAS SUBSTÂNCIAS PURAS

TESTADAS

O potencial antimetastático in vitro foi avaliado pelo ensaio de formação de

colônias. As células B16-F10 foram incubadas em meio de cultura semi-sólido na presença ou

na ausência das substâncias por 14 dias. Após este período as placas foram fotografadas para

a observação das colônias formadas. Todas as substâncias avaliadas inibiram a formação de

colônias na concentração de 15 g/mL, com perfil de atividade semelhante à doxorrubicina,

sendo que a -iodo-lapachona foi a mais potente por inibir completamente a formação de

colônias na concentração 5 g/mL (Figura 9).

Figura 9

273 (5 g/mL)

273 (15 g/mL)

273 (50 g/mL)

342 (5 g/mL)

342 (15 g/mL)

342 (50 g/mL)

344 (5 g/mL)

344 (15 g/mL)

344 (50 g/mL) 453 (50 g/mL)

453 (15 g/mL)

453 (5 g/mL)

345 (50 g/mL)

345 (15 g/mL)

345 (5 g/mL)

controle DOX (5 g/mL) DOX (10 g/mL) DOX (20 g/mL)

Figura 9: Inibição da formação de colônias de B16-F10 em meio semi-sólido. Células da linhagem B16-F10 foram incubadas em meio de cultura semi-sólido na presença ou na ausência das substâncias testadas por 14 dias. O potencial antimetastático das substâncias foi avaliado por comparação com o controle não-tratado. 273, solidagenona; 342, nor-lapachol; 344, -iodo-lapachona; 345, lapachol; 453, acetato do ácido betulínico; e DOX, doxorrubicina.

49

4.5 INIBIÇÃO DA MIGRAÇÃO CELULAR PELAS SUBSTÂNCIAS PURAS TESTADAS

A capacidade das substâncias de influenciar a migração das células B16-F10 foi

avaliada pelo ensaio de cicatrização de ferida em cultura celular. Todas as substâncias

inibiram a migração das células para o local onde foi feita a ferida na monocamada celular na

menor concentração (5 g/mL). Além disso, todas as substâncias, na concentração de 25

g/mL, excetuando-se o nor-lapachol, modificaram a morfologia das células, que passaram de

um aspecto fusiforme para uma forma arredondada (Figura 10).

4.6 INDUÇÃO DE APOPTOSE EM CÉLULAS NEOPLÁSICAS TRATADAS COM AS

SUBTÂNCIAS PURAS

Como observado no ensaio anterior, houve uma mudança na morfologia das células

neoplásicas na presença das substâncias testadas, sugerindo que estas possam causar morte

celular. Além disso, o potencial das substâncias avaliadas em inibir a proliferação das

linhagens ensaiadas pode também estar relacionado à morte celular. Este processo pode ser

melhor avaliado por citometria de fluxo, com o intuito de determinar o padrão de morte

celular (apoptose ou necrose) envolvido. O padrão de morte celular foi avaliado por

citometria de fluxo; a marcação com anexina V indica apoptose, enquanto que as células em

processo de necrose ou fase final da apoptose apresentam marcação com iodeto de propídio.

Observou-se que todas as substâncias induziram apoptose nas células da linhagem

Daudi. As células tratadas com a -iodo-lapachona apresentaram 52% marcação positiva para

anexina e 8% apresentaram dupla marcação para iodeto de propídio e anexina V. Das células

tratadas com o lapachol, 13% apresentaram marcação para anexina V e 8% para iodeto de

propídio e anexina V. Após tratamento com o nor-lapachol, 19% das células marcaram

positivamente para anexina V e 7% para anexina V juntamente com iodeto de propídio, 10 %

das células tratadas com a solidagenona foram marcadas com anexina V e as células tratadas

com o acetato do ácido betulínico apresentaram 18% de marcação positiva para anexina V.

Contudo, apenas a -iodo-lapachona induziu a apoptose nas linhagens K562 (35% de

marcação positiva para anexina V e 10% para iodeto de propídio juntamente com anexina V)

50

e B16-F10 (16% de marcação positiva para anexina V e 76% para iodeto de propídio

juntamente com anexina V). Esses resultados evidenciam o comportamento diferenciado de

resposta de cada tipo celular ao tratamento antineoplásico (Figuras 11, 12 e 13).

Devido a problemas de caráter técnico as substâncias solidagenona, nor-lapachol e

568 não foram avaliadas no ensaio de indução de apoptose nas células neoplásicas da

linhagem K562. Do mesmo modo, apenas a substância -iodo-lapachona foi avaliada na

indução da apoptose das células B16-F10.

51

273 (10 g/mL) t = 24 h

273 (25 g/mL) t = 24 h

273 (50 g/mL) t = 24 h 342 (50 g/mL) t = 24 h

342 (25 g/mL) t = 24 h

342 (10 g/mL) t = 24 h 344 (10 g/mL) t = 24 h

344 (25 g/mL) t = 24 h

344 (50 g/mL) t = 24 h 568 (50 g/mL) t = 24 h

568 (25 g/mL) t = 24 h

568 (10 g/mL) t = 24 h

453 (50 g/mL) t = 24 h

453 (25 g/mL) t = 24 h

453 (10 g/mL) t = 24 h

345 (50 g/mL) t = 24 h

345 (25 g/mL) t = 24 h

345 (10 g/mL) t = 24 h

controle t = 0 h controle t = 24 h

colchicina (1 g/mL) t = 24 h

colchicina (0,6 g/mL) t = 24 h

colchicina (0,2 g/mL) t = 24 h

Figura 10

Figura 10: Inibição da migração celular das células B16-F10 pelas substâncias puras testadas. Células da linhagem B16-F10 foram adicionadas a garrafas de cultura com área de superfície de crescimento de 25 cm2 e deixadas aderir por 24 horas. Após este período, foram realizadas duas feridas na monocamada celular, sendo fotografadas no tempo 0 e 24 horas. A influência das substâncias sobre a migração celular foi avaliada por comparação com a ferida da garrafa controle (sem tratamento) no tempo 24 horas. 273, solidagenona; 342, nor-lapachol; 344, -iodo-lapachona; 345, lapachol; e 453, acetato do ácido betulínico.

52

Figura 11

File: Daudi 345.006Log Data Units: Linear ValuesAcquisition Date: 01-Feb-07Gated Events: 10000Total Events: 10000X Parameter: FL1-H Annexin (Log)Y Parameter: FL2-H PI (Log)

Quad Events % TotalUL 122 1.22UR 784 7.84LL 7742 77.42LR 1352 13.52

File: Daudi DOX 4h.016Log Data Units: Linear ValuesAcquisition Date: 30-Jan-07Gated Events: 10000Total Events: 10000X Parameter: FL1-H Annexin (Log)Y Parameter: FL2-H PI (Log)

Quad Events % TotalUL 1207 12.07UR 6908 69.08LL 1450 14.50LR 435 4.35

File: Daudi 342.007Log Data Units: Linear ValuesAcquisition Date: 01-Feb-07Gated Events: 10000Total Events: 10000X Parameter: FL1-H Annexin (Log)Y Parameter: FL2-H PI (Log)

Quad Events % TotalUL 50 0.50UR 719 7.19LL 7314 73.14LR 1917 19.17

File: Daudi Controle.012Log Data Units: Linear ValuesAcquisition Date: 30-Jan-07Gated Events: 10000Total Events: 10000X Parameter: FL1-H Annexin (Log)Y Parameter: FL2-H PI (Log)

Quad Events % TotalUL 20 0.20UR 41 0.41LL 9921 99.21LR 18 0.18

File: Daudi 344 4h.015Log Data Units: Linear ValuesAcquisition Date: 30-Jan-07Gated Events: 10000Total Events: 10000X Parameter: FL1-H Annexin (Log)Y Parameter: FL2-H PI (Log)

Quad Events % TotalUL 197 1.97UR 816 8.16LL 3742 37.42LR 5245 52.45

File: Daudi 273.004Log Data Units: Linear ValuesAcquisition Date: 01-Feb-07Gated Events: 10000Total Events: 10000X Parameter: FL1-H Annexin (Log)Y Parameter: FL2-H PI (Log)

Quad Events % TotalUL 139 1.39UR 360 3.60LL 8428 84.28LR 1073 10.73

File: Daudi 453.005Log Data Units: Linear ValuesAcquisition Date: 01-Feb-07Gated Events: 10000Total Events: 10000X Parameter: FL1-H Annexin (Log)Y Parameter: FL2-H PI (Log)

Quad Events % TotalUL 52 0.52UR 544 5.44LL 7588 75.88LR 1816 18.16

Figura 11: Indução da apoptose em células Daudi após tratamento com as subtâncias puras testadas. Células da linhagem Daudi foram incubadas por 4 horas na presença ou na ausência das substâncias avaliadas. Após este período, as células foram marcadas com anexina V por 15 minutos e com iodeto de propídio no momento da aquisição no citômetro de fluxo. 273, solidagenona; 342, nor-lapachol; 344, -iodo-lapachona; 345, lapachol; 453, acetato do ácido betulínico; e DOX, doxorrubicina.

53

Figura 12

Figura 12: Indução da apoptose em células K562 após tratamento com as substâncias puras testadas. Células da linhagem K562 foram incubadas por 4 horas na presença ou na ausência das substâncias avaliadas. Após este período, as células foram marcadas com anexina V por 15 minutos e com iodeto de propídio no momento da aquisição no citômetro de fluxo. 344, -iodo-lapachona; 345, lapachol; 453, acetato do ácido betulínico; e DOX, doxorrubicina.

File: K562 453.004Log Data Units: Linear ValuesAcquisition Date: 01-Feb-07Gated Events: 10000Total Events: 10000X Parameter: FL1-H Annexin (Log)Y Parameter: FL2-H PI (Log)

Quad Events % TotalUL 394 3.94UR 1618 16.18LL 7988 79.88LR 0 0.00

File: K562 344 4h.010Log Data Units: Linear ValuesAcquisition Date: 30-Jan-07Gated Events: 10000Total Events: 10000X Parameter: FL1-H Annexin (Log)Y Parameter: FL2-H PI (Log)

Quad Events % TotalUL 434 4.34UR 1032 10.32LL 5056 50.56LR 3478 34.78

File: K562 DOX 4h.011Log Data Units: Linear ValuesAcquisition Date: 30-Jan-07Gated Events: 10000Total Events: 10000X Parameter: FL1-H Annexin (Log)Y Parameter: FL2-H PI (Log)

Quad Events % TotalUL 3463 34.63UR 4071 40.71LL 2465 24.65LR 1 0.01

File: K562 Controle.006Log Data Units: Linear ValuesAcquisition Date: 30-Jan-07Gated Events: 10000Total Events: 10000X Parameter: FL1-H Annexin (Log)Y Parameter: FL2-H PI (Log)

Quad Events % TotalUL 12 0.12UR 2 0.02LL 9981 99.81LR 5 0.05

File: K562 345.005Log Data Units: Linear ValuesAcquisition Date: 01-Feb-07Gated Events: 10000Total Events: 10000X Parameter: FL1-H Annexin (Log)Y Parameter: FL2-H PI (Log)

Quad Events % TotalUL 800 8.00UR 1384 13.84LL 7816 78.16LR 0 0.00

54

Figura 13

File: B16 Controle.001Log Data Units: Linear ValuesAcquisition Date: 30-Jan-07Gated Events: 10000Total Events: 10000X Parameter: FL1-H Annexin (Log)Y Parameter: FL2-H PI (Log)

Quad Events % TotalUL 5 0.05UR 28 0.28LL 9966 99.66LR 1 0.01

File: B16 344 4h.004Log Data Units: Linear ValuesAcquisition Date: 30-Jan-07Gated Events: 10000Total Events: 10000X Parameter: FL1-H Annexin (Log)Y Parameter: FL2-H PI (Log)

Quad Events % TotalUL 141 1.41UR 7609 76.09LL 688 6.88LR 1562 15.62

File: B16 DOX 4h.005Log Data Units: Linear ValuesAcquisition Date: 30-Jan-07Gated Events: 10000Total Events: 10000X Parameter: FL1-H Annexin (Log)Y Parameter: FL2-H PI (Log)

Quad Events % TotalUL 1083 10.83UR 7777 77.77LL 977 9.77LR 163 1.63

Figura 13: Indução da apoptose em células B16-F10 após tratamento com as substâncias puras testadas. Células da linhagem B16-F10 foram incubadas por 4 horas na presença ou na ausência das substâncias avaliadas. Após este período, as células foram marcadas com anexina V por 15 minutos e com iodeto de propídio no momento da aquisição no citômetro de fluxo. 344, -iodo-lapachona; e DOX, doxorrubicina.

5 DISCUSSÃO

A partir da década de 1990 ocorreu uma intensificação na busca por substâncias

naturais de interesse farmacológico pelas indústrias farmacêuticas, principalmente

provenientes das florestas tropicais brasileiras, onde há uma carência em estudos químicos e

biológicos (PINTO et al., 2002). Esse fato se deve à grande diversidade química que pode ser

observada nas plantas, capaz de dar origem a substâncias de interesse farmacológico. Mesmo

que metabólitos especiais isolados não venham a se tornar fármacos, esses compostos podem

ser utilizados como protótipos e originar moléculas com utilidade clínica (MONTANARI;

BOLZANI, 2001).

Seguindo a linha de pesquisa do Laboratório de Engenharia Tecidual e

Imunofarmacologia que envolve a avaliação farmacológica de produtos naturais em vários

sistemas biológicos, este trabalho foi iniciado a partir de uma triagem preliminar in vitro de

88 substâncias purificadas em linhagens tumorais murinas. As 6 substâncias mais potentes

foram selecionadas para uma melhor avaliação em diferentes modelos experimentais,

conforme apresentado neste estudo.

Inicialmente, a avaliação da citotoxicidade destas 6 substâncias em esplenócitos

normais de camundongos foi realizada para a determinação da toxicidade seletiva dos

compostos contra as células neoplásicas estudadas. Levando-se em consideração as IC50 dos

ensaios de incorporação de [3H]-timidina, todas as substâncias testadas, com exceção da

solidagenona, mostraram-se menos tóxicas para as células normais do que para as linhagens

neoplásicas (Figuras 5 e 6). Substâncias com IC50 superior para células normais e valores

baixos de IC50 para células neoplásicas, como o nor-lapachol (IC50 de 282 g/mL para os

esplenócitos normais e 42-56 g/mL para as células neoplásicas) são de maior interesse, por

apresentarem toxicidade seletiva.

Vários trabalhos têm sido desenvolvidos com o intuito de identificar moléculas com

toxicidade seletiva em relação às células neoplásicas, capazes de agredir menos os tecidos

normais do que as células tumorais. Pendey et al. (2005) mostraram que a pancratistatina,

isolada a partir de Pancratium littorale, induziu apoptose especificamente em células

tumorais, mas não em fibroblastos e células endoteliais normais. Jasmonatos, que são

56

hormônios vegetais, podem induzir a despolarização da mitocôndria de forma específica em

células de leucemia linfocítica crônica, cujo mecanismo constitui alteração da permeabilidade

mitocondrial (ROTEM et al., 2005). Também de forma seletiva, a 4-hidroxicumarina causa a

desorganização dos filamentos de actina do citoesqueleto em células B16-F10, mas não em

fibroblastos normais B82 (VELASCO-VELÁZQUEZ et al., 2003). O desenvolvimento de

novos candidatos a fármacos que ajam de maneira seletiva pode dar origem a agentes com

baixa toxicidade, com melhor eficiência e amplo índice terapêutico, além de criar novas

possibilidades de combinações com medicamentos já utilizados. Clinicamente, isso

proporciona uma melhor tolerância e qualidade de vida dos pacientes que farão uso da nova

molécula (BONO; TOLCHER; ROWINSKY, 2003).

Considerando que o câncer pode ser originado a partir de vias genéticas

diferenciadas e que as células neoplásicas são geneticamente instáveis, é importante a

avaliação antineoplásica de substâncias em neoplasias de diferentes origens genéticas,

podendo ser identificadas drogas que atuem com melhor eficácia em um tipo específico de

câncer. Neste trabalho isto foi evidenciado com o lapachol, que apresentou valores de IC50 de

19,3 g/mL para a linhagem B16-F10 e 8,2 g/mL para a K562, mas apresentou baixo

percentual de inibição para a linhagem Daudi, mesmo na concentração de 100 g/mL.

A avaliação da proliferação celular pelo método de incorporação de [3H]-timidina

tem sido muito utilizada para a observação do potencial antineoplásico de novas moléculas

(BRATHE et al., 2003; EL-METWALLY et al., 2005; POURPAK et al., 2007; THABREW

et al., 2005; YUSUP et al., 2005). Esse ensaio permite estimar a cinética da divisão celular

por detectar as células na fase S do ciclo celular, já que ocorre a captação da base pirimídica

marcada para uma nova síntese de DNA (COLOZZA et al., 2005).

Outro método bastante utilizado é a metabolização do MTT a cristais insolúveis de

formazan pelas células viáveis em cultura (BENASSI et al., 2006; CHOI; KIM; LEE, 2007;

CHRYSSANTHI et al., 2007; ROOMI et al., 2006). Após a transformação química pela

desidrogenase succínica mitocondrial das células viáveis, o sal amarelo de tetrazolium e

solúvel em água, é metabolizado e convertido à cristais de formazan de cor lilás

(GONZALEZ; TARLOFF, 2001; HAMID et al., 2004). Assim, a diminuição da formação de

precipitado pode inferir o dano mitocondrial nas células que estão em contato com o agente

antineoplásico, e, como ambos os padrões de morte celular (apoptose ou necrose) envolvem

alterações nas mitocôndrias, pode-se inferir que uma substância que interfira no metabolismo

do MTT esteja induzindo morte nas células.

57

Neste estudo foram identificadas moléculas com potente atividade inibitória (IC50

abaixo de 10 g/mL) sobre a proliferação das células neoplásicas, como o lapachol, a -iodo-

lapachona, a 568 e o acetato do ácido betulínico (Figura 5), mas houve pouca correlação com

os dados obtidos na metabolização do MTT (Figuras 6, 7 e 8). Com as células da linhagem

B16-F10, foi encontrada pouca relação concentração-resposta com as substâncias puras

avaliadas, apresentando variações no percentual de inibição que não condiz com o esperado,

como o que ocorreu com lapachol, nor-lapachol, solidagenona e -iodo-lapachona. Nas

células das linhagens K562 e Daudi, a relação concentração-resposta foi melhor observada,

mas ainda com grande variação do potencial de inibição, que não foi correlacionado com a

incorporação de [3H]-timidina. Esses dados refletem diferenças do metabolismo mitocondrial

entre as linhagens celulares estudadas.

A metodologia do MTT utilizada é usualmente descrita na literatura. Porém, Plumb,

Milroy e Kaye (1989) descreveram vários fatores que podem influenciar o metabolismo desse

sal pelas células, como a concentração do MTT no meio de cultura, o número e a linhagem de

células utilizadas e a variação do pH. Essas observações podem explicar a não-correlação da

atividade antineoplásica de algumas substâncias nesse ensaio e no da incorporação de [3H]-

timidina.

Em relação à variação do pH do meio com o tempo de cultura, observa-se que a

acidez aumenta de acordo com o tempo de incubação e número de células presentes. Plumb,

Milroy e Kaye (1989) demonstraram que, com a adição de um tampão juntamente com o

MTT, ocorreu uma diminuição da IC50 da doxorrubicina em várias linhagens celulares, sendo,

portanto um fator que influencia diretamente o resultado. Contudo, convém ressaltar que a

células neoplásicas in vivo estão sujeitas a um grau de hipóxia tecidual, cujo pH no local

geralmente torna-se ácido. A adição de tampão na cultura pode gerar resultados falso-

positivos.

Outro fator que influencia o método do MTT é a formação de cristais insolúveis, que

podem ser facilmente solubilizados com DMSO. Entretanto, quando são utilizadas células

não-aderentes, há a necessidade da centrifugação das placas, ocasionando mais uma variável

que pode constituir em erro de leitura.

De acordo com o que foi observado neste estudo, a incorporação de [3H]-timidinia é

um método mais eficaz do que o MTT para a avaliação antineoplásica de novas moléculas em

larga escala, conforme foi destacado também por Benassi et al. (2006). Da mesma forma,

58

Jeremias et al. (2004) consideraram o ensaio com MTT de pouca confiança devido às

variações apresentadas nos resultados. As variáveis metodológicas que interferem nos

resultados tornam esse método pouco útil para triagem em larga escala de novos agentes

antineoplásicos.

O ensaio de formação de colônias é uma ferramenta que já foi muito utilizada em

clínica para avaliar a sensibilidade ou resistência das células neoplásicas a agentes ou

combinação de agentes antineoplásicos (KIRKELS et al., 1983). Esta técnica representa uma

ferramenta útil, cuja observação macroscópica permite determinar a potência da substância

analisada e se a mesma afeta todas as células ou subconjuntos em uma população heterogênea

de células, além de proporcionar uma avaliação inicial da atividade antimetastática da

substância, já que as células crescem em um ambiente independente de adesão, similar à

corrente sanguínea (ALLEY et al., 1991). Vários trabalhos utilizaram este ensaio como

ferramenta para a avaliação antineoplásica de novas substâncias (DREES et al., 1997;

HUANG, S. C. et al, 2005; OBERSCHMIDT et al., 2007; RAFFAGHELLO et al., 2006;

ZIRVI; HILL; HILL, 1986).

Analisando os dados obtidos com o ensaio de formação de colônias, todas as

substâncias testadas têm uma potencial ação antimetastática, apresentando inibição da

formação de colônias na concentração de 15 g/mL, comparável à ação da doxorrubicina

(Figura 9). Para confirmar essa atividade, as substâncias testadas serão avaliadas em modelos

experimentais in vivo, por exemplo, o da injeção de células B16-F10 em camundongos

C57Bl/6 por via endovenosa, ou ensaios que determinem se essas substâncias interferem em

alguma etapa no processo de metástase (GAUTAM; DENSMORE;WALDREP, 2000; GUDE

et al, 1999; MUMMERT et al, 2003).

Sabe-se que a migração celular constitui um fator preponderante para que ocorra a

metástase, já que, para a célula tumoral alcançar a corrente sanguínea ou linfática, deve se

desprender do tumor primário e migrar até o local apropriado. Esse processo pode ser

correlacionado com o repovoamento da ferida realizada na monocamada celular da garrafa de

cultura, constituindo o ensaio de cicatrização de cultura celular um indicador de atividade

antimetastática de novas substâncias.

O processo de migração celular é dependente de vários fatores, como moléculas de

adesão, integridade do citoesqueleto e expressão de MMP. Assim, uma substância que

interfira em qualquer desses fatores pode comprometer a migração celular e,

59

consequentemente, o desenvolvimento de metástases, podendo ser utilizado como adjuvante

na quimioterapia antineoplásica.

Todas as substâncias avaliadas inibiram a migração celular no modelo de

cicatrização de ferida em cultura celular. Contudo, convém destacar o perfil do nor-lapachol,

que, na concentração de 10 g/mL, inibiu completamente a migração celular sem influenciar

de maneira expressiva a morfologia da células B16-F10 (Figura 10). Isso indica que essa

substância pode estar influenciando especificamente o processo de migração, em algum dos

fatores, como a dinâmica dos componentes do citoesqueleto. Esse fato já foi demonstrado por

Velasco-Velázquez et al. (2003), pela atuação da 4-hidroxicumarina sobre a linhagem B16-

F10, comprometendo a formação de fibras de stress e lamelipódios, mas não de filipódios.

Para comprovar a atuação do nor-lapachol sobre a migração celular são necessárias outras

avaliações que envolvam a expressão de moléculas envolvidas no processo, tais como MMP e

moléculas de adesão celular.

A importância da identificação de substâncias com potencial antimetastático é

grande por ser a metástase responsável pela alta morbidade e mortalidade em pacientes com

câncer. A introdução na terapêutica de fármacos que comprometam qualquer das etapas desse

processo poderá possibilitar uma melhora no prognóstico dos pacientes em uso da

quimioterapia antineoplásica, aumentando a expectativa de vida.

A determinação do padrão de morte celular constitui um importante fator na busca

por novos agente antineoplásicos. Um dos métodos mais utilizados para determinar se uma

substância induz necrose ou apoptose em uma célula neoplásica é a marcação dessas com

anexina V e iodeto de propídio, e análise por citometria de fluxo. Nos estágios iniciais da

apoptose ocorre a exposição da fosfatidilserina para a face da membrana plasmática voltada

para o superfície extracelular, o que acontece ainda quando membrana está intacta; a anexina

V se liga às moléculas de fosfatidilserina. O iodeto de propídio é um corante que se liga ao

DNA, porém, para que isso ocorra a membrana celular não deve estar mais íntegra (ALLEN;

HUNTER; AGRAWAL, 1997; VERMES et al., 1995). Por isso, as células que estão passando

por apoptose apresentam uma marcação positiva para anexina V e, nos estágios mais

avançados, apresentam marcação também para o iodeto de propídio.

Este trabalho descreve, pela primeira vez, a atividade antineoplásica da -iodo-

lapachona, que induziu a apoptose em todas as linhagens celulares avaliadas (Figuras 11, 12 e

13). A indução da apoptose pode ser deflagrada por vários fatores, desde o aumento da

60

expressão de genes pró-apoptóticos até à alteração na permeabilidade mitocondrial. Assim,

faz-se necessária a investigação do mecanismo pelo qual a -iodo-lapachona induz apoptose

nas células neoplásicas. A identificação deste mecanismo de ação poderá servir de base para

estudos de relação entre a estrutura e a atividade, possibilitando o planejamento de moléculas

mais eficazes e potentes.

A -lapachona (Figura 14), que possui uma estrutura química muito semelhante à -

iodo-lapachona, tem sido descrita em vários trabalhos como agente indutor de apoptose.

Planchon et al. (1995) demonstraram que a -lapachona inibe especificamente a enzima DNA

topoisomerase I de modo diferente da camptotecina, induzindo o bloqueio no ciclo celular na

progressão da fase G0 para G1 e apoptose. Li, Wang e Pardee (1995) apontaram que a indução

da apoptose por -lapachona em linhagens de câncer de próstata ocorre de maneira

independente de p53 e bcl-2. Don et al. (2001) indicaram que a indução da apoptose em

linhagens de cânceres de próstata humano ocorre devido a indução de CKI, aumento da

expressão de bak e estimulação da caspase-7. A indução de CKI pela -lapachona foi

confirmada posteriormente por Choi, Kang e Yoo (2003).

O lapachol apresentou atividade antineoplásica em todos os experimentos. Como

relatado anteriormente, é uma substância que há muito tem sido estudada como um provável

agente antineoplásico. Em um dos estudos mais recentes, Balassiano et al. (2005)

inivestigaram o potencial antimetastático do lapachol em vários modelos experimentais,

utilizando essa substância na concentração de 400 g/mL. É importante ressaltar que, no

presente trabalho, a maior concentração utilizada foi de 100 g/mL, sendo que nos ensaios de

formação de colônia e cicatrização de ferida, o lapachol manteve uma atividade expressiva em

concentrações abaixo de 50 g/mL.

A avaliação da atividade antineoplásica em modelos experimentais distintos permite

uma observação geral do perfil de atividade antineoplásica. Neste trabalho foram utilizados

modelos que refletem viabilidade e a proliferação celular, e dois modelos que presumem a

atividade antimetastática. Foi observado que o nor-lapachol não apresentou atividade

expressiva nos modelos de incorporação de [3H]-timidina e MTT, mas exibiu atividade

antimetastática nos modelos de cicatrização de ferida e formação de colônias. Por outro lado,

a -iodo-lapachona e o acetato do ácido betulínico apresentaram potente atividade em todos

os modelos experimentais avaliados. Este perfil diferenciado permite que um melhor

direcionamento seja dado na pesquisa do mecanismo de ação dessas substâncias.

61

O lapachol, o nor-lapachol e a -iodo-lapachona são naftoquinonas com similaridade

estrutural, mas com diferenças na atividade antineoplásica. Os dados apresentados neste

trabalho fornecem informações para uma avaliação quantitativa entre estrutura e atividade

dessas moléculas, sendo de utilidade no desenvolvimento de novos agentes com mecanismo

de ação semelhante.

Neste trabalho foi demonstrado que o acetato do ácido betulínico induz a apoptose

nas células Daudi, mas não na linhagem K562 (Figuras 8 e 9). Na literatura não há relatos da

atividade antineoplásica dessa substância, porém existem vários relatos da indução de

apoptose em células neoplásicas pelo ácido betulínico, que é o precursor do acetato do ácido

betulínico (Figura 14). Gopal et al. (2005) demonstraram que o ácido betulínico induz a

apoptose de células K562 na concentração de 12,5 g/mL, porém os autores incubaram as

células por 24 horas, um tempo muito maior que o utilizado neste trabalho. O ácido betulínico

induziu a apoptose nas linhagens celulares A549 e HT-29, através do aumento da expressão

dos genes bax e diminuição de bcl-2 e ciclina D1 (RZESKI et al., 2006). Liu et al. (2004)

demonstraram que o ácido betulínico e alguns derivados induziram a apoptose em células da

linhagem B16 interferindo no potencial de membrana mitocondrial.

Figura 14

Figura 14:Estruturas das substâncias avaliadas em comparação com substâncias descritas na literatura. As diferenças estruturais estão circuladas.

COOH

CH3COO

acetato do ácido betulínico (453)

COOH

OH

ácido betulínico

O

O

O

I

-iodo-lapachona (344)

O

O

O

-lapachona

62

A solidagenona inibiu a migração celular das células B16-F10 (Figura 10) e induziu

a apoptose nas células Daudi (Figura 11), mas nos demais experimentos, a atividade

antitumoral desta substância não foi expressiva. Além disso, esta substância apresentou uma

alta citotoxicidade em esplenócitos murinos normais. Não há relatos na literatura de atividade

antineoplásica dessa substância.

A substância 568 demonstrou uma potente atividade em todos os experimentos,

destacando-se como uma molécula promissora no tratamento do câncer. Avaliações em

ensaios mais específicos devem ser realizados para determinação do seu mecanismo de ação,

visando identificar o seu alvo e possibilitar estudos de relação estrutura-atividade.

6 CONCLUSÃO

Os resultados apresentados demonstram o potencial antineoplásico de substâncias de

origem natural do semi-árido brasileiro e derivados sintéticos em vários modelos

experimentais, incluindo moléculas que ainda não tiveram sua atividade descrita.

A -iodo-lapachona e a 568 foram as substâncias mais potentes dentre as avaliadas

em todos os ensaios, sendo que a primeira induz apoptose nas linhagens celulares B16-F10,

K562 e Daudi.

O nor-lapachol foi a substância que apresentou menor toxicidade para as células

normais e inibiu a migração celular, no modelo de cicatrização de ferida, sem influenciar de

maneira marcante a morfologia celular.

O método de incorporação de [3H]-timidina é mais eficaz para a triagem de

substâncias antineoplásicas, quando comparado com o MTT.

Modelos experimentais in vitro mais sensíveis e modelos animais devem ser

utilizados para comprovar a atividade antineoplásica das substâncias avaliadas, visando

identificar o mecanismo de ação para uma melhor abordagem no desenvolvimento de

moléculas candidatas a fármacos.

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