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FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal
Investigação de compostos isolados da peçonha da aranha
caranguejeira Acanthoscurria natalensis Chamberlin, 1917 e sua
caracterização química e biológica
Tania Barth
Orientador: Dr. Osmindo Rodrigues Pires Júnior
Brasília
2018
Tese de doutorado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em
Biologia Animal da Universidade de
Brasília como parte dos requisitos para
a obtenção do título de Doutor em
Biologia Animal.
ii
Dedico este trabalho,
Aos meus amados pais, Adalberto e Edith, que com todo amor e sabedoria
cultivaram o meu jardim e me ensinaram que para ele florir, é preciso amor,
respeito, dedicação, honestidade, simplicidade... Assim, cada flor que se abre
colorida e perfumada, posso colher graças a vocês.
Ao meu filho Hiroshi, a maior e mais bela flor do meu jardim, que me faz sorrir
todos os dias e que desperta em mim as mais incríveis emoções e o amor mais
profundo.
iii
Agradecimentos
Agradeço especialmente aos meus pais Adalberto e Edith e, meus irmãos
Eneide e Jayson, pelo amor pleno e verdadeiro, pelo apoio e incentivo e por
compreenderem minha ausência neste período.
Ao meu filho Hiroshi, que em tantos momentos difíceis, senti sua mãozinha
macia e cheia de ternura deslizando nos meus cabelos e me confortando
profundamente dizendo: mamãe, eu te amo muiiiiiiito!!!
Ao meu esposo Renato, pelos gestos de amor, de compreensão e pelas longas
conversas que me ajudaram a seguir em frente.
Agradeço aos professores da Morfologia/UESC, Aparecida, Cristina O.,
Cristina C., Marco, Andréia, Lígia, Lise, Bau, Fábio, Guisla e a professora Jane Lima,
amigos queridos, que mesmo sabendo que passariam por um período difícil, me
apoiaram e me ajudaram na realização deste trabalho.
Agradeço às instituições, Universidade Estadual de Santa Cruz – UESC e
Universidade de Brasília - UnB, que apoiaram a realização do curso de doutoramento.
À Andréia Pinheiro, pela sua amizade e por sua contagiante alegria, que
transformaram nossos dias em causos incríveis, que valerão sempre a pena
relembrar.
Agradeço ao professor Osmindo R. P. Júnior, pela oportunidade, orientação e
ensinamentos e, por compreender todas as situações que envolveram meu papel
como mãe.
Aos colegas do laboratório de Toxinologia/UnB, Carlos Santana, Ana Carolina
e Lucas Ferreira, por compartilharem conhecimentos, pelo socorro prestado nas horas
mais críticas (rsrsrs) e por todos os momentos carinhosos e divertidos que passamos.
Agradeço a Dhara, Elisama, Nayara e Tsai, pela imprescindível ajuda com a
coleta das amostras e principalmente pelo carinho!
A todos os professores e alunos do laboratório de Toxinologia/UnB, pela
convivência harmoniosa e gentil e, por todas as vezes em que de alguma forma me
ajudaram, em especial, Kamillinha e Andréia pelo auxílio com os ensaios hemolíticos.
Agradeço ao Washington, Adolfo, Patrícia, Elias e Danilo, do laboratório de
Toxinologia/UnB, pela atenção com que sempre me ajudaram e por tudo o que me
ensinaram.
iv
Agradeço aos professores Mariana Castro e Wagner Fontes, pela importante
contribuição com este trabalho, especialmente a espectrometria de massa e por todas
as conversas sempre produtivas, em que aprendi muita coisa e que sempre levavam
a mais um passo adiante.
Ao Nuno, um parceiro especial com quem sempre, sempre pude contar e muito
aprendi. Seu jeito simples e bem-humorado, transformou momentos difíceis em
diversão e tudo isso, vou guardar no lado esquerdo do peito!
Agradeço aos professores, Carlos André, Peter Roepstorff, Eliane Noronha e
Sônia Freitas e aos colegas Amanda e Alonso, pois a participação de vocês neste
trabalho foi de extrema importância. Agradeço também por compartilharem seu
conhecimento de forma tão atenciosa e incentivadora.
Agradeço a Dra. Jaqueline do laboratório de Nanobiotecnologia/UnB, uma
grande companheira e incentivadora. Jaque, te agradeço muito pela amizade, pela
força e por todos os ensinamentos que você generosamente fez questão de
compartilhar comigo.
Agradeço a todos os colegas do laboratório de Nanoboptecnologia/UnB, pelo
carinho e por toda ajuda que recebi.
A todos os professores, especialmente as professoras Consuelo Medeiros e
Aline Martins e aos alunos e servidores do LBQP/UnB, que carinhosamente me
receberem, me ajudaram e torceram por mim.
Agradeço aos professores da UnB, Diego Madureira, Ricardo Bentes, Eloísa
Dutra e, a Patrícia Diniz por terem viabilizado a realização de experimentos em seus
laboratórios e a professora Marta R. Magalhães (PUC/GO) que me esclareceu as
primeiras dúvidas nos experimentos enzimáticos.
Enfim, tenho certeza que estas palavras não são suficientes para expressar a
gratidão que sinto por todos aqueles que verdadeiramente me ajudaram, inclusive
aquela ajuda que vem de um simples sorriso.
E, “de acordo com a literatura, a hialuronidase é uma enzima que cliva
preferencialmente o ácido hialurônico e ...,” e eu diria ainda, que ela é uma criatura
danada, com vida própria e que gosta de causar fortes emoções. Digo isso, porque
tudo começou com ela e nossa “relação” foi muito além do que está escrito aqui, pois
além do grande aprendizado, conheci várias pessoas que comigo vibraram a cada
conquista. Por isso, a ela também agradeço.
v
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS ............................................................................................ viii
LISTA DE TABELAS ............................................................................................... x
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS.................................................................. xi
RESUMO .............................................................................................................. xii
ABSTRACT .......................................................................................................... xiii
I. INTRODUÇÃO .................................................................................................. 16
1. Aranhas ..................................................................................................... 17
2. Composição da peçonha e atividades biológicas ....................................... 18
2.1. Ação antimicrobiana..............................................................................19
2.2. Ação citotóxica......................................................................................21
2.3. Ação imunomoduladora............................. ...........................................22
2.4. Acilpoliaminas ..................................................................................... 24
2.5. Enzimas .............................................................................................. 27
2.6. Proteínas CRISP ................................................................................ 30
3. Acanthoscurria natalensis .......................................................................... 31
II. JUSTIFICATIVA ............................................................................................... 35
III. OBJETIVOS .................................................................................................... 36
IV. ESTRUTURA DA TESE .................................................................................. 37
PARTE I ............................................................................................................ 38
Fracionamento da peçonha de A. natalensis e screening de atividades
biológicas .......................................................................................................... 38
1. Material e métodos .................................................................................... 38
1.1. Material biológico e obtenção da peçonha .......................................... 38
1.2. SDS-PAGE ......................................................................................... 39
1.3. Fracionamento por cromatografia líquida de alta eficiência de fase
reversa (RP-HPLC) ................................................................................... 39
1.4. Screening de atividades biológicas da peçonha ................................. 40
2. Resultados ................................................................................................ 47
2.1. Perfil eletroforético da peçonha .......................................................... 47
2.2. Fracionamento da peçonha por cromatografia de fase reversa .......... 48
vi
2.3. Screening de atividades biológicas da peçonha ................................. 50
3. Discussão .................................................................................................. 57
PARTE II ........................................................................................................... 66
Acilpoliaminas: purificação, atividades biológicas e caracterização parcial da
estrutura química .............................................................................................. 66
1. Material e métodos .................................................................................... 66
1.1. Recromatografia por RP-HPLC e atividade antimicrobiana ................ 66
1.2. Determinação de CIM e atividade hemolítica ...................................... 67
1.3. Espectroscopia Ultravioleta (UV) ........................................................ 69
1.4. MALDI-TOF/TOF ................................................................................ 69
1.5. ESI-MS ............................................................................................... 70
2. Resultados ................................................................................................ 70
2.1. Recromatografia por RP-HPLC e atividade antimicrobiana ................ 70
2.2. CIM e atividade hemolítica ................................................................. 76
2.3. Caracterização parcial da estrutura química ....................................... 79
3. Discussão .................................................................................................. 90
PARTE III .......................................................................................................... 97
Caracterização bioquímica e estrutural de um complexo proteico contendo as
proteínas Hialuronidase e CRISP isoladas da peçonha da aranha
Acanthoscurria natalensis ................................................................................. 97
1. Material e métodos .................................................................................... 97
1.1. SDS-PAGE e zimograma ................................................................... 97
1.2. 1D Blue native (BN)-PAGE, 2D BN/SDS-PAGE e zimograma ............ 98
1.3. Digestão in gel .................................................................................... 99
1.4. Espectrometria de massa ................................................................... 99
1.5. Sequenciamento N-terminal por degradação de Edman................... 101
1.6. Processamento dos dados e análise da sequencia .......................... 101
1.7. Dicroismo circular (DC) ..................................................................... 103
1.8. Caracterização enzimática ............................................................... 105
2. Resultados .............................................................................................. 106
vii
2.1. MALDI-TOF e perfil eletroforético da AnHyal .................................... 106
2.2. Caracterização estrutural da AnHyal ................................................ 107
2.3. Análises 1D e 2D BN-PAGE ............................................................. 116
2.4. Análise de dicroísmo circular e estabilidade térmica ......................... 119
2.5. Caracteriazação enzimática da AnHyal ............................................ 121
3. Discussão ................................................................................................ 122
V. CONCLUSÕES.............................................................................................. 129
VI. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................. 132
Anexo I. Licença SISBIO .................................................................................... 147
Anexo II. Autorização CEUA .............................................................................. 148
Anexo III. Artigo científico publicado durante o período do doutorado ................ 149
viii
LISTA DE FIGURAS
I. INTRODUÇÃO
Figura 1. Representação da estrutura química geral das acilpoliaminas .......... 26
Figura 2. Exemplar de Acanthoscurria natalensis.. .......................................... 34
Figura 3. Distribuição da espécie A. natalensis no território brasileiro .............. 34
IV. ESTRUTURA DA TESE
PARTE I. Fracionamento da peçonha de A. natalensis e screening de atividades
biológicas
Figura 1. Perfil eletroforético da peçonha de A. natalensis............................... 49
Figura 2. Perfil cromatográfico de A. natalensis por RP-HPLC ........................ 48
Figura 3. Efeito da peçonha e FR5 sobre a viabilidade celular de células
tumorais (Hela e MCF7) e não tumorais (NIH3T3) ........................................... 51
Figura 4. Efeito da peçonha e FR5 sobre macrófagos J774............................. 53
Figura 5. Efeito da peçonha e FR5 sobre macrófagos J774 estimulados (LPS) 54
Figura 6. Atividade proteolítica da peçonha de A. natalensis ........................... 55
Figura 7. Atividade fosfolipásica da peçonha de A. natalensis ......................... 56
Figura 8. Atividade hialuronidásica da peçonha e frações cromatográficas de A.
natalensis ........................................................................................................ 57
PARTE II. Acilpoliaminas: purificação, atividades biológicas e caracterização
parcial da estrutura química
Figura 1. Recromatografia (1ª. RC) da fração 5 (FR5) ..................................... 71
Figura 2. Recromatografia (2ª. RC) das frações 5.13 a 5.18 ............................ 74
Figura 3. Espectros MALDI TOF/TOF das frações 5.13 a 5.18 ........................ 75
Figura 4. Atividade antimicrobiana das frações 5.13 a 5.18 ............................. 77
Figura 5. Atividade hemolítica da peçonha, FR 5 e frações 5.13 a 5.18 ........... 78
ix
Figura 6. Espectro de absorção UV das frações 5.13 a 5.16 e 5.18................. 80
Figura 7. Análise ESI-MS/MS da ApAn728.. .................................................... 83
Figura 8. Análise ESI-MS/MS da ApAn614a .................................................... 84
Figura 9. Análise ESI-MS/MS da ApAn614b .................................................... 86
Figura 10. Análise ESI-MS/MS da ApAn742 .................................................... 87
Figura 11. Análise ESI-MS/MS da ApAn756. ................................................... 89
PARTE III. Caracterização bioquímica e estrutural de um complexo proteico
contendo as proteínas Hialuronidase e CRISP isoladas da peçonha da aranha
Acanthoscurria natalensis
Figura 1. Análise da AnHyal por SDS-PAGE e zimograma ............................ 106
Figura 2. Peptídeos da AnHyal sequenciados de novo com similaridade para a
hialuronidase de Brachypelma vagans........................................................... 108
Figura 3. Peptídeos da AnHyal por degradação de Edman e sequenciados de
novo com similaridade para GTx-VA1 de Grammostola rosea. ...................... 108
Figura 4. Alinhamento múltiplo da AnHyalH com a hialuronidase de outros
artrópodes. .................................................................................................... 114
Figura 5. Alinhamento múltiplo da AnHyalC com CRISPs de aranhas ........... 115
Figura 6. BN-PAGE, 2D BN/SDS-PAGE e/ou zimograma da AnHyal ............ 117
Figura 7. Espectro de Dicroísmo Circular (DC) da AnHyal em função da
temperatura ................................................................................................... 120
Figura 8. Caracterização enzimática da AnHyal ............................................. 121
x
LISTA DE TABELAS
IV. ESTRUTURA DA TESE
PARTE I. PARTE I
Fracionamento da peçonha de A. natalensis e screening de atividades biológicas
Tabela 1. Atividade antimicrobiana da peçonha de A. natalensis e frações
cromatográficas. .............................................................................................. 50
PARTE II. Acilpoliaminas: purificação, atividades biológicas e caracterização
parcial da estrutura química
Tabela 1. Atividade antimicrobiana das frações 5.1 a 5.19 .............................. 73
PARTE III. Caracterização bioquímica e estrutural de um complexo proteico
contendo as proteínas Hialuronidase e CRISP isoladas da peçonha da aranha
Acanthoscurria natalensis
Tabela 1. Sequenciamento de novo da AnHyal com similaridade para a
hialuronidase de Brachypelma vagans........................................................... 109
Tabela 2. Sequencia N-terminal e sequenciamento de novo da AnHyal com
similaridade para GTx-VA1 de Grammostola rósea. ...................................... 110
Tabela 3. Sequenciamento de novo dos peptídios da AnHyalH e AnHyalC
obtidos pela digestão in gel ............................................................................ 118
xi
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Abs Absorbância ACN Acetonitrila ANOVA Análise de Variância ATCC American Type Culture Colection BSA Albumina sérica bovina, do inglês “bovine serum albumin” CEUA Comissão de Ética no Uso Animal CIM Concentração inibitória mínima Da Dalton DMSO Dimetilsulfóxido DTT Ditiotreitol ESI Ionização por eletrospray HCCA Ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico IL Interleucina LC-MS/MS Cromatografia líquida acoplada a espectrômetro de massas
sequencial LPS Lipopolissacarídeo purificado de Escherichia coli 0127 MALDI-TOF Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Fligth MeOH Metanol [M+H]+ Massa molecular monoisotópica MRM Multiple reaction monitoring MS Espectrometria de massa, do inglês “mass spectrometry” MTT 3-(4,5)-dimetilalzolil-2,5-difeniltetrazólio m/z Massa/carga NaNO2 Nitrito de Sódio NEED diamina-di-hidroclorido naftaleno NF-kB Fator nuclear kappa B NO Óxido Nítrico PBS Tampão fosfato de sódio, do inglês “Phosphate-buffered saline” RPMI Meio de cultura celular, do inglês “Roswell Park Memorial Institute” RMN Ressonância magnética nuclear RP-HPLC Cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa, do inglês
“Reversed-Phase High Performance Liquid Chroatography” SA Ácido sinapínico, do inglês “Sinapinic acid” SDS-PAGE Dodecil Sulfato de Sódio - Gel de Poliacrilamida SFB Soro fetal bovino TFA Ácido trifluoroacético TNF-α Fator de necrose tumoral alfa UV Ultravioleta
xii
INVESTIGAÇÃO DE COMPOSTOS ISOLADOS DA PEÇONHA DA ARANHA
CARANGUEJEIRA ACANTHOSCURRIA NATALENSIS CHAMBERLIN, 1917 E
SUA CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA E BIOLÓGICA
RESUMO
A peçonha de aranhas é composta por uma mistura complexa de moléculas, como
acilpoliaminas, peptídios e proteínas neurotóxicas e, enzimas, como hialuronidases. A
caracterização destas moléculas tem possibilitado o desenvolvimento de diversas
aplicações farmacológicas e biotecnológicas. Contudo, poucas moléculas foram
estudadas em aranhas do gênero Acanthoscurria, inclusive em Acanthoscurria natalensis.
Assim, o objetivo deste estudo foi a investigação de compostos presentes na peçonha de
A. natalensis e sua caracterização química e biológica. A peçonha foi fracionada por
cromatografia líquida (RP-HPLC) obtendo-se 18 frações principais. O screening de
atividades biológicas da peçonha e/ou frações, identificou ação antimicrobiana
pronunciada, manutenção da viabilidade celular e redução da produção de óxido nítrico,
na fração composta por acilpoliaminas. A peçonha apresentou atividade hialuronidásica
correspondente a fração 18 (AnHyal) e nenhuma atividade proteásica e fosfolipásica. A
concentração inibitória mínima (CIM) das acilpoliaminas contra Staphylococcus aureus e
Escherichia coli variou entre 128 e 256 µM, sem causar hemólise nestas mesmas
concentrações. A estrutura química parcial das acilpoliaminas (614―756 Da) sugerida
pelo espectro UV e padrão de fragmentação (ESI-MS/MS), compreende uma unidade
tirosil ligada a uma cadeia poliamina, contendo ao menos uma espermidina. A
caracterização da AnHyal indicou atividade máxima entre pH 4,0 e 6,0 e temperatura
entre 30 e 60oC, degradando preferencialmente o ácido hialurônico. O sequenciamento
parcial (LC-MS/MS e degradação de Edman) da AnHyal mostrou similaridades para a
hialuronidase da aranha Brachipelma vagans e proteína CRISP de Grammostola rosea,
com 64% e 79% de cobertura proteica, respectivamente. Análises por 1D e 2D BN-
PAGE/SDS-PAGE/zimograma, mostraram que a AnHyal é composta pelas proteínas
hialuronidade e CRISP, formando um complexo enzimaticamente ativo. Sua estrutura
secundária contém 36,15% de α-hélice e a temperatura de desnaturação (Tm) foi de 46,37
°C, sendo esta irreversível. Em conclusão, este estudo possibilitou a identificação e
caracterização parcial de acilpoliaminas com propriedades biológicas que podem
contribuir para sua qualificação como possível agente terapêutico. Ainda, a AnHyal
mostrou a presença de um complexo proteico enzimaticamente ativo entre as proteínas
hialuronidase e CRISP, sendo este descrito pela primeira vez. Estudos adicionais poderão
elucidar outras propriedades deste complexo, ampliando as possibilidades de aplicações
biotecnológicas.
Palavras-chave: aranha, Acanthoscurria natalensis, peçonha, acilpoliaminas,
antimicrobiano, óxido nítrico, hialuronidase, CRISP, complexo proteico, sequenciamento
de novo.
xiii
INVESTIGATION OF ISOLATED COMPOUNDS FROM SPIDER
CARANGUEJEIRA ACANTHOSCURRIA NATALENSIS CHAMBERLIN, 1917
AND ITS CHEMICAL AND BIOLOGICAL CHARACTERIZATION
ABSTRACT
Spider venom is composed of a complex mixture of molecules, such as acylpolyamines,
peptides and neurotoxic proteins, and enzymes such as hyaluronidases. The
characterization of these molecules has enabled the development of several
pharmacological and biotechnological applications. However, few molecules have been
studied in spiders of the genus Acanthoscurria, including Acanthoscurria natalensis. Thus,
the objective of this study was the investigation of the compounds present in A. natalensis
venom and its chemical and biological characterization. The venom was fractionated by
liquid chromatography (RP-HPLC) obtaining 18 main fractions. The screening of biological
activities of venom and/or fractions, identified pronounced antimicrobial action,
maintenance of cellular viability and reduction of nitric oxide production, in the fraction
composed of acylpolyamines. The venom presented hyaluronidase activity corresponding
to fraction 18 (AnHyal) and no protease and phospholipase activity. The minimum
inhibitory concentration (MIC) of the acylpolyamines against Staphylococcus aureus and
Escherichia coli varied between 128 and 256 μM, without causing hemolysis at these
same concentrations. The partial chemical structure of the acylpolyamine (614-756 Da)
suggested by the UV spectrum and fragmentation standard (ESI-MS / MS) comprises a
tyrosyl moiety attached to a polyamine chain containing at least one spermidine. The
characterization of AnHyal indicated maximum activity between pH 4.0 and 6.0 and
temperature between 30 and 60oC, preferentially degrading hyaluronic acid. AnHyal's
partial sequencing (LC-MS / MS and degradation of Edman) showed similarities to the
Brachipelma vagans spider hyaluronidase and Grammostola rosea CRISP protein, with
64% and 79% protein coverage, respectively. Analyzes by 1D and 2D BN-PAGE/SDS-
PAGE/zymogram, showed that AnHyal is composed of hyaluron and CRISP proteins,
forming an enzymatically active complex. Its secondary structure contains 36.15% α-helix
and the denaturation temperature (Tm) was 46.37 ° C, which is irreversible. In conclusion,
this study allowed the identification and partial characterization of acylpolyamines with
biological properties that may contribute to its qualification as a possible therapeutic agent.
Furthermore, AnHyal showed the presence of an enzymatically active protein complex
between the hyaluronidase and CRISP proteins, which is described for the first time.
Further studies may elucidate other properties of this complex, expanding the possibilities
of biotechnological applications.
Keywords: spider, Acanthoscurria natalensis, venom, acylpolyamines, antimicrobial, nitric
oxide, hyaluronidase, CRISP, protein complex, de novo sequencing.
.
16
I. INTRODUÇÃO
As aranhas representam um grupo de organismos terrestres com
extraordinário sucesso evolutivo, com registros fósseis que datam de 380 milhões
de anos, abrangendo o período Devoniano. Este sucesso é sustentado por
diversos fatores, como a presença de estruturas especializadas para a
transferência segura de sêmen para a fêmea e a presença de um par de glândulas
de peçonha na base das quelíceras (Mygalomorpha) ou em seu prossoma
(Araneomorpha) (Coddington e Levi, 1991). A peçonha é um importante recurso
para estes animais, com o propósito de promover sua alimentação e defesa contra
predadores naturais. Assim, dispor de uma peçonha contendo componentes com
ação mais inespecífica, possibilita maior eficiência frente a um amplo espectro de
presas e predadores (Kuhn-Nentwig, Stöcklin e Nentwig, 2011). Estas ações
incluem neurotoxicidade, citotoxicidade e outras associadas a degradação da
matriz extracelular (Sannaningaiah, Subbaiah e Kempaiah, 2014). Por outro lado,
permanentes modificações ocorridas ao longo da sua evolução, promoveram o
desenvolvimento de uma complexa mistura de compostos na peçonha de aranhas,
resultando na ampliação dos seus efeitos biológicos (Kuhn-Nentwig, Stöcklin e
Nentwig, 2011). Estes foram continuamente sendo investigados e a descoberta de
várias outras atividades biológicas relacionadas a peçonha foram aproveitadas
para o desenvolvimento de produtos com interesse farmacológico e biotecnológico
(Harvey, 2014). Nas últimas décadas, este potencial tem sido demonstrado por
diversas pesquisas, que tem possibilitado o isolamento, purificação e
caracterização de moléculas da peçonha de várias espécies de aranhas por meio
de diferentes metodologias, como a espectrometria de massa, que tem sido uma
17
importante aliada para novas descobertas (Baldwin, 2004). Mas, apesar deste
potencial e da grande diversidade de espécies de aranhas, apenas uma pequena
parte deste grupo de animais foi estudado quanto a composição de sua peçonha,
correspondendo a aproximadamente 0,4 % das espécies e, menos que um terço
das famílias conhecidas (Nentwig, 2013).
1. Aranhas
As aranhas (classe Araneae) compõem um grupo muito diversificado de
organismos terrestres, compreendendo aproximadamente 46.986 espécies
amplamente distribuídas em diversos continentes (Platnick, 2017). A classe
Araneae é dividida em dois grupos: o Mesothelae e o Opisthothelae. O primeiro
mantém características plesiomórficas, como a glândula de peçonha pouco
desenvolvida. Já o grupo Opisthothelae, apresenta esta glândula bem
desenvolvida, o que os torna interessantes do ponto de vista toxinológico. Este
grupo é representado pelas subordens Migalomorfas e Araneomorfas (Coddington
e Levi, 1991). A glândula de peçonha está localizada dentro das quelíceras
(migalomorfas) ou ocupa a porção anterior do cefalotórax (araneomorfas) e suas
presas movem-se dorsoventralmente (migalomorfas) ou mediolateralmente
(araneomorfas) em direção ao seu alvo, atuando como pinças (Kuhn-Nentwig,
Stöcklin e Nentwig, 2011).
A subordem Migalomorfa é um grupo bastante diverso, representado por 16
famílias. Entre estas, destaca-se a família Theraphosidae, que reúne aranhas de
grande porte (com até 10 cm de comprimento do corpo) denominadas
18
caranguejeiras ou tarântulas e contém quase três vezes mais espécies que as
demais famílias (Coddington e Levi, 1991).
As aranhas são animais predadores generalistas ecologicamente
importantes, alimentando-se predominantemente de insetos e outros pequenos
invertebrados. O principal mecanismo para a obtenção de suas presas, bem como
sua defesa, se dá pelo uso de sua peçonha (Kuhn-Nentwig, Stöcklin e Nentwig,
2011). Contudo, devido à complexidade de sua composição, o custo energético de
produção e a quantidade limitada, as aranhas utilizam este recurso de forma
estratégica, visando sua economia e otimização (Cooper, Nelsen e Hayes, 2015).
2. Composição da peçonha e atividades biológicas
A peçonha das aranhas é composta por uma mistura complexa de moléculas
biologicamente ativas. Quanto à natureza de sua ação, podem ser divididas em
moléculas neurotóxicas e necróticas (citolíticas). Em termos de estrutura química,
podem ser agrupadas em: i) compostos de baixa massa molecular (<1 kDa), como
sais, carboidratos, aminoácidos, aminas biogênicas e acilpoliaminas; ii) peptídeos
(1-10 kDa), como neurotoxinas contendo pontes dissulfeto e peptídeos citolíticos
lineares e; iii) compostos de alta massa molecular (>10 kDa) representados por
diferentes proteínas, incluindo enzimas e outras neurotoxinas (Vassilevski, Kozlov
e Grishin, 2009) e, proteínas secretoras ricas em cisteína (CRISP) (Sanggaard et
al., 2014). As acilpoliaminas e peptídeos lineares representam as principais
categorias de moléculas produzidas continuamente e que possuem alta potência e
seletividade para múltiplos alvos celulares (Kuhn-Nentwig, Stöcklin e Nentwig,
2011). Dentre os compostos enzimáticos, as hialuronidases, proteases,
19
fosfolipases e esfingomielinases foram extensivamente identificadas e
caracterizadas na peçonha de aranhas (Sannaningaiah, Subbaiah e Kempaiah,
2014).
Em humanos, estes compostos podem produzir uma série de eventos
adversos, incluindo toxicidade local (edema, hemorragia, dermo e mionecrose) e
sistêmica (neurotoxicidade, miotoxicidade, citotoxicidade, alterações hemostáticas
e inflamação), os quais podem ser atribuídos ao efeito sinérgico de toxinas
enzimáticas e não enzimáticas (Sannaningaiah, Subbaiah e Kempaiah, 2014).
A permanente investigação da diversidade molecular presente na peçonha,
das propriedades bioquímicas, estruturais e os mecanismos de ação de seus
compostos, revelaram um leque ainda maior de atividades biológicas, ampliando
as possibilidades de aplicações farmacológicas e biotecnológicas (Matavel,
Estrada e Marco Almeida, 2016; Vassilevski e Grishin, 2011). Assim, os
compostos presentes na peçonha podem ser empregados como agentes
antimicrobianos, citotóxicos contra células tumorais, imunomoduladores, entre
outros (Saez et al., 2010; Utkin, 2015).
2.1. Ação antimicrobiana
A ação antimicrobiana da peçonha de aranhas, assim como em outros
organismos, tem sido relacionada a compostos de natureza peptídica,
denominados peptídios antimicrobianos (PAMs) (Kuhn-Nentwig, 2003). Os PAMs
presentes na peçonha são utilizados especialmente para a obtenção de suas
presas e defesa contra predadores, atuando isolada ou sinergicamente com outros
compostos (Kuhn-Nentwig, 2003). Os PAMs da peçonha são de natureza
20
catiônica, anfipática, com estrutura em -hélice linear e sem resíduos de cisteína
(Kuhn-Nentwig, 2003). O caráter anfipático comum a muitos PAMs, confere
grande habilidade em provocar distúrbios na membrana plasmática (Giangaspero,
Sandri e Tossi, 2001).
A atividade antimicrobiana dos PAMs da peçonha de aranhas é bastante
ampla, incluindo peptídios com ação contra bactérias Gram-positivas e Gram-
negativas, vírus, fungos e parasitas (Wang e Wang, 2016).
Na peçonha de aranhas, os principais PAMs foram identificados em Lycosa
carolinensis (licotoxinas I e II) (Yan e Adams, 1998), Oxyopes takobius
(oxiopininas) (Corzo et al., 2002) e Cupiennius salei (cupieninas) (Kuhn-Nentwig et
al., 2002). A atividade antimicrobiana dos peptídios licotoxina I e II (ambos em
concentração de 10 a 20 µM) foi similar contra a bactéria Gram-negativa E. coli,
mas contra a bactéria Gram-positiva Bacillus thuringensis israelenses, a licotoxina
I (5 µM) foi mais efetiva (Yan e Adams, 1998). Os peptídios oxiopininas mostraram
alta atividade contra as bactérias Bacillus subtilis, E. coli, Pseudomonas
fluorescens (MIC 0,5–1 µM) e S. aureus (MIC 10 µM) (Corzo et al., 2002),
enquanto os peptídios isolados de C. salei foram ativos contra as bactérias E. coli,
Pseudomonas aeruginosa, S. aureus e Enterococcus faecalis (0,31–5 µM) (Kuhn-
Nentwig et al., 2002).
A análise da estrutura secundária destes peptídios mostrou uma
conformação em α-hélice catiônica amfipática, sendo esta característica estrutural
relacionada a muitos PAMs capazes de romper membranas biológicas por meio
da formação de poros (Estrada, Villegas e Corzo, 2007; Giangaspero, Sandri e
21
Tossi, 2001). Desta forma, este mesmo mecanismo foi sugerido para os PAMs da
peçonha de aranhas citados acima.
Por outro lado, em estudos posteriores, a atividade antimicrobiana foi
identificada também em um grupo de moléculas não peptídicas presentes na
peçonha de aranhas, denominadas acilpoliaminas (Ferreira e Silva Junior, 2012;
Sutti et al., 2015). Assim, este tema será abordado adiante, no item 2.4 da
introdução.
2.2. Ação citotóxica
Compostos isolados da peçonha animais como escorpiões, abelhas, vespas,
aranhas, formigas e lagartas, possuem propriedades citotóxicas sobre células
tumorais, que são capazes de afetar diferentes funções celulares, como
viabilidade celular, apoptose, migração e proliferação celular (Heinen e Veiga,
2011). Estes compostos são representados principalmente por peptídeos e
proteínas e têm sido empregados como agentes antitumorais. Algumas relações
entre tais propriedades e seus efeitos sobre células tumorais podem ser
exemplificadas, como: i) compostos que atuam sobre canais iônicos, podem afetar
a fisiologia da célula tumoral bloqueando canais iônicos específicos; ii) compostos
que se ligam a alvos específicos na membrana celular, podem causar a morte de
células tumorais; iii) compostos que inibem a angiogênese, podem afetar o
desenvolvimento do tumor; iv) compostos que são formadores de poros, podem
causar permeabilização da membrana e levar a morte celular, entre outros
(Heinen e Veiga, 2011).
22
Em relação a peçonha de aranhas, o seu efeito citotóxico foi avaliado sobre
diferentes linhagens tumorais, sendo demonstrado que a peçonha das espécies
da família Salticidae provocou o rompimento instantâneo da membrana celular de
células N1E-115 (neuroblastoma murino). Contudo, considerou-se que este efeito
foi provavelmente devido às enzimas contidas na peçonha e não aos peptídeos ou
acilpoliaminas presentes (Cohen e Quistad, 1998). Neste mesmo estudo, uma
ação citotóxica mais moderada foi identificada para as espécies das famílias
Lycosidae e Oxyopidae, enquanto que as espécies da família Theraphosidae e
Arenidae, apresentaram baixa citotoxicidade.
Outros estudos investigaram o efeito da peçonha da aranha Macrothele
raven (Hexatelidae), sendo demonstrado que in vitro, a peçonha diminuiu a
proliferação de células HeLa (carcinoma cervical humano) e MCF-7 (câncer de
mama humano) de maneira dose dependente e in vivo, o tamanho do tumor foi
significativamente reduzido (Gao et al., 2005) (Gao et al., 2007).
2.3. Ação imunomoduladora
A imunomodulação está relacionada a ações que modificam a resposta
imune de uma maneira positiva ou negativa (Saroj et al., 2012). A estimulação ou
supressão da resposta imune pode ser necessária frente a diferentes condições
de saúde, como em infecções ou imunodeficiência (Saroj et al., 2012). Algumas
moléculas de natureza peptídica foram identificadas como reguladoras do sistema
imune, atuando como estimuladores ou supressores da produção de citocinas e
mediadores inflamatórios e prevenindo a ativação de macrófagos, por exemplo
(Haney e Hancock, 2014). Apesar da complexidade deste processo, algumas
23
moléculas estão classicamente envolvidas na resposta imune inata, como o óxido
nítrico (NO). Este é um importante sinalizador biológico, que apresenta rápida
difusão e habilidade para permear membranas celulares, atuando em diversos
processos fisiológicos, como regulação da pressão sanguínea, resposta imune e
comunicação neural e, patológicos como câncer (Choudhari et al., 2013).
A ação imunomoduladora de compostos da peçonha, representados
principalmente por peptídeos, tem sido identificada em alguns animais, como
formigas, escorpiões, anêmonas, serpentes, abelhas e anfíbios (Kastin, 2013),
porém em aranhas esta propriedade tem sido pouco explorada.
Um estudo relacionado a aranhas, porém não com moléculas da peçonha,
avaliou o efeito imunomodulador da Migalina. Esta molécula isolada da hemolinfa
de Acanthoscurria gomesiana, foi capaz de induzir a produção de interferon gama
(IFN- e NO por esplenócitos e macrófagos murinho (Mafra et al., 2012).
O primeiro relato a respeito de ação imunomoduladora na peçonha de
aranhas, refere-se ao peptídeo Cupienina 1a, isolado de Cupiennius salei. Esta é
uma molécula com importante atividade citolítica, mas também capaz de inibir a
formação de óxido nítrico pela enzima óxido nítrico sintetase neuronal (nNOS),
cujo mecanismo envolve a formação de um complexo entre a Cupienina 1a e a
calmodulina, uma proteína reguladora de cálcio (Pukala et al., 2007).
O peptídeo Tx2-6 purificado da peçonha de Phoneutria nigriventer,
apresentou um significativo aumento da produção de óxido nítrico no tecido
cavernoso de ratos após injeção subcutânea, promovendo a ereção. Este estudo
24
demonstrou que o peptídeo Tx2-6 é uma molécula promissora para o tratamento
da disfunção erétil (Nunes et al., 2008).
Ainda relacionado a peçonha, mas dentro de outro contexto, alguns estudos
avaliaram o envolvimento de diversas moléculas nos processos de
envenenamento, onde compostos presentes na peçonha podem interagir com
proteínas e receptores celulares de células T e macrófagos, por exemplo,
resultando em eventuais respostas inflamatórias. Estas envolvem a ativação de
células e liberação de citocinas pró-inflamatórias e outros mediadores, como o
óxido nítrico. Estes são importantes para a interação entre células do sistema
imune e respostas inflamatórias, que tem o propósito de reparar danos teciduais
gerados pelo envenenamento (Petricevich, 2004). Por exemplo, a injeção de
diferentes doses da proteína F35 isolada da peçonha de Loxosceles intermedia e
da peçonha total em camundongos, induziu a produção de fator de necrose
tumoral (TNF), interleucina (IL)-6, IL-10 e NO no soro, além de diversos sintomas
clínicos e alterações histopatológicas (Tambourgi et al., 1998).
2.4. Acilpoliaminas
As acilpoliaminas são um grupo de moléculas presentes em diversos
organismos, sendo os mais abundantemente representados na peçonha de
aranhas (Estrada, Villegas e Corzo, 2007). Entre as aranhas, as acilpoliaminas
foram primeiramente identificadas em Nephila clavata e Argiope lobata e
posteriormente, muitas outras espécies também foram investigadas e um número
significativo de acilpoliaminas foi caracterizado (Nentwig, 2013). Mais de cem
estruturas químicas já foram elucidadas, sendo as acilpoliaminas presentes em
25
aranhas da subfamília Nephilinae e do gênero Argiope, as que foram amplamente
caracterizadas (Palma, 2012).
As acilpoliaminas apresentam massas moleculares entre 350 e 1000 Da e
podem ser organizadas em dois grupos, aquelas contendo aminoácidos,
presentes em aranhas das famílias Araneidae e Nephilidae e, aquelas sem
aminoácidos em sua composição, presentes em algumas famílias como
Ctenizidae, Hexathelidae e Theraphosidae (Nentwig, 2013).
A estrutura química geral destas moléculas pode ser dividida em quatro
segmentos: i) um grupo acil aromático lipofílico, ii) uma ligação amina, iii) uma
cadeia poliamina estrutural e iv) uma cadeia poliamina terminal (Fig. 1). O grupo
acil aromático e a estrutura poliamina, compõem a parte principal comum a todas
as moléculas conhecidas desta classe, enquanto a ligação amina e a cauda são
opcionais, presentes em certas acilpoliaminas (Palma e Nakajima, 2005).
Devido a combinação destes diferentes componentes, as acilpoliaminas
podem ser estruturalmente muito diversas, variando em extensão, número de
ligações amida e grupos funcionais (Nentwig, 2013; Palma, 2012), de modo que
um número ainda maior destas moléculas pode existir.
26
Inicialmente, a resolução da estrutura química das acilpoliaminas era obtida
por meio de extensiva purificação da peçonha, seguida por técnicas de hidrólise e
derivatização, análise de aminoácidos por degradação de Edman e ressonância
magnética nuclear (NMR). Mais recentemente, outras estratégias têm sido
empregadas envolvendo métodos cromatográficos associados à NMR
bidimensional, HRMS e MS/MS, entre outras (Palma, 2012).
As acilpoliaminas são reconhecidas por sua atividade neuromoduladora
sobre o sistema nervoso de vertebrados e invertebrados. A presença de cargas
positivas nas aminas livres e secundárias de sua cadeia poliamina, confere
importante ação neuroativa, antagonizando receptores de glutamato e bloqueando
seletivamente canais catiônicos (Estrada, Villegas e Corzo, 2007). Contudo,
atualmente as acilpoliaminas têm sido investigadas também acerca do seu
potencial antimicrobiano.
Figura 1. Representação dos blocos estruturais que podem ser encontradas em acilpoliaminas da peçonha de aranhas. Adaptado de Palma, 2012.
27
Em 2007, o estudo realizado por Pereira e colaboradores, identificou uma
molécula produzida por hemócitos da aranha caranguejeira A. gomesiana, sendo
denominada Migalina. A análise estrutural revelou que se tratava de uma
acilpoliamina. Esta molécula mostrou uma importante atividade antimicrobiana
contra bactérias Gram-negativas em concentrações micromolares (Pereira et al.,
2007).
O primeiro relato sobre a ação antimicrobiana de acilpoliaminas isoladas da
peçonha de aranha foi publicado apenas recentemente, sendo esta, uma função
biológica anteriormente desconhecida para tais moléculas. A análise da peçonha
de Nephilengys cruentata, uma espécie de aranha brasileira, revelou a presença
de vários peptídeos antimicrobianos e acilpoliaminas, com atividade
antimicrobiana contra bactérias Gram-positivas e fungos (Ferreira e Silva Junior,
2012).
A acilpoliamina VdTX-I isolada da peçonha da aranha caranguejeira Vitalius
dubius foi primeiramente identificada como uma molécula antagonista de
receptores nicotínicos colinérgicos (Rocha-e-Silva, Sutti e Hyslop, 2009).
Posteriormente, a VdTX-I foi avaliada quanto a sua atividade antimicrobiana e
mostrou um amplo espectro de atividade contra diferentes linhagens de bactérias
e fungos, em concentrações micromolares (Sutti et al., 2015).
2.5. Enzimas
Por algum tempo, pouca atenção foi dada às enzimas presentes na
peçonha de aranhas. Atualmente, as enzimas identificadas na peçonha de
aranhas podem ser separadas em dois grupos: aquelas que atuam sobre
28
polímeros da matriz extracelular e as que atuam sobre fosfolipídios de membrana
e compostos relacionados. A ação conjunta das enzimas com as demais toxinas
da peçonha tem o propósito de transpor as barreiras representadas pela matriz
extracelular e assim facilitar o acesso dos demais compostos (Kuhn-Nentwig,
Stöcklin e Nentwig, 2011).
A presença de enzimas na peçonha de aranhas, especialmente proteases,
foi alvo de questionamento, devido à possibilidade de contaminação por proteases
tissulares ou fluido digestivo durante o processo de extração por dissecação ou
eletroestimulação, respectivamente (Rash e Hodgson, 2002). Contudo, foi
demonstrado que a adoção de cuidados apropriados no processo de
eletroestimulação evita a contaminação da peçonha (Kuhn-Nentwig, Schaller e
Nentwig, 1994).
As proteases (E.C. 3.4) são enzimas que catalisam a hidrólise
especificamente de ligações peptídicas de proteínas e podem ser classificadas de
acordo com o local de clivagem em exopeptidases e endopeptidases (López-Otín
e Bond, 2008). Proteases presentes na peçonha podem causar a destruição
tecidual facilitando a difusão de outras toxinas (Sannaningaiah, Subbaiah e
Kempaiah, 2014). Proteases, especialmente metalo e serino proteases, estão
presentes na peçonha de aranhas de espécies como, Lycosa raptoria, Phoneutria
nigriventer e do gênero Loxosceles, sendo neste último, componentes bastantes
expressivos da peçonha (Sannaningaiah, Subbaiah e Kempaiah, 2014). Contudo,
em geral as espécies da família Theraphosidae, não apresentam relevante
atividade proteolítica (García-Arredondo et al., 2015). Com base na homologia
destas enzimas com outras proteases envolvidas na ativação de proteínas
29
precursoras, foi sugerido que as proteases da peçonha atuem também no
processamento e ativação de pró-toxinas (Sanggaard et al., 2014).
As fosfolipases (E.C. 3.1.1) compreendem uma classe diversa de enzimas
representadas por quatro principais grupos: A, B, C ou D, dependendo do sítio de
clivagem dentro do fosfolipídio. Estas enzimas atuam sobre fosfolipídios e
compostos relacionados, que são os componentes fundamentais das membranas
celulares, mas também atuam na regulação da sinalização de diversos eventos
celulares (Vines e Bill, 2015) e processos patofisiológicos (Shridas e Webb, 2014).
Na peçonha de aranhas, diferentes fosfolipases foram descritas, tais como:
fosfodiesterase (cliva ligações fosfodiéster), esfingomielinase D (degrada a
esfingomielina) e fosfolipases (hidrolisam fosfolipídeos) (Nentwig, 2013). Contudo,
estas enzimas foram identificadas principalmente em aranhas do gênero
Loxosceles e da família Hexathelidae. Já em aranhas da família Theraphosidae,
as fosfolipases são raramente encontradas (Vassilevski, Kozlov e Grishin, 2009).
A hialuronidase (HA) (E.C. 3.2.1.35) é uma enzima bem conservada,
produzida por diversos organismos, desde unicelulares até vertebrados (Kuhn-
Nentwig, Stöcklin e Nentwig, 2011). A HA de aranhas apresenta massa molecular
variando entre 33 and 47 kDa em sua forma monomérica (Bordon et al., 2015).
Esta enzima preferencialmente catalisa a hidrólise do ácido hialurônico, um
polissacarídeo linear formado por unidades dissacarídicas repetidas de N acetil-β-
D-glucosamina (GlcNAc) e β-D-ácido glucurônico (GlcUA), sendo o principal
constituinte da matriz extracelular presente em tecidos conjuntivos (Bordon et al.,
2015). Sua ação facilita a difusão de outras toxinas presentes na peçonha, sendo
por isso denominada como “fator de espalhamento” (Sannaningaiah, Subbaiah e
30
Kempaiah, 2014). Esta propriedade tem sido empregada para facilitar a absorção
e disperção de drogas injetáveis, mas seu potencial nas áreas médica e
biotecnológica é ainda mais amplo, sendo a hialuronidase utilizada em terapias
anticancer e imunoterapia (Heinen e Veiga, 2011; Senff-Ribeiro et al., 2008).
A presença da HA na peçonha de diversos animais tem sido relatada (Frost,
Csóka e Stern, 1996). Entre as aranhas, a HA foi identificada primeiramente na
peçonha da aranha caranguejeira Dugesiella hentzi, sendo considerada como o
principal constituinte da peçonha (Schanbacher et al., 1973). Adicionalmente, a HA
foi também identificada em outras espécies, entre elas, Hippasa partita (Nagaraju,
Devaraja e Kemparaju, 2007), Vitaluis dubius (Rocha-e-Silva, Sutti e Hyslop,
2009), Brachypelma vagans (Clement et al., 2012), Loxosceles intermedia (Ferrer
et al., 2013), Cupiennius salei (Biner et al., 2015) e diversas outra espécies de
Theraphosidaes (Rodríguez-Rios et al., 2017).
2.6. Proteínas CRISP
Proteínas CRISP representam uma extensa família de proteínas secretoras
ricas em cisteína altamente conservadas e amplamente distribuídas entre
mamíferos, representada por três grupos principais, denominados CRISP-1,
CRISP-2 e CRISP-3 (Krätzschmar et al., 1996). As principais funções biológicas
relacionadas a CRISP-1 e CRISP-2 incluem ação bloqueadora de canais iônicos e
envolvimento nos processos de maturação e fusão de gametas, sendo neste caso,
mediado pela sequencia de aminoácidos chamada assinatura 2 (Cohen et al.,
2011). CRISP-3 é encontrada no plasma sanguíneo e nas secreções exócrinas,
sendo sua atividade biológica relacionada a imunidade inata (Udby et al., 2002).
31
Estas proteínas também foram encontradas na forma de complexos com as
proteínas α1B-glicoproteína no plasma sanguíneo (Udby et al., 2004) e PSP94 no
plasma seminal (Anklesaria et al., 2016; Udby et al., 2005), sendo proposto que
este complexo contribui para a neutralização de efeitos possivelmente danosos da
CRISP-3 em sua forma livre.
Apenas recentemente, CRISPs foram identificadas também na peçonha,
apresentando diferentes funções. Em serpentes, CRISPs foram descritas para
várias espécies, atuando principalmente como bloqueadores de canais iônicos
(Yamazaki e Morita, 2004). Em Bothrops jararaca, a primeira CRISP isolada desta
espécie, denominada Bj-CRP, apresentou atividade sobre sistema complemento e
induziu respostas inflamatórias (Lodovicho et al., 2017). Por outro lado, a presença
de CRISPs na peçonha de invertebrados tem sido pouco relatada. No gastrópode
Conus textile (Milne et al., 2003) e na aranha Grammostola iheringi (Borges et al.,
2016), as CRISPs identificadas mostraram atividade proteolítica, mas nas aranhas
Grammostola rosea (M5AWW7, UniProtKB) e Trittame loki (Undheim et al., 2013),
nenhuma atividade biológica foi relatada. Estas evidências mostram que as
funções biológicas relacionadas as CRISPs podem ser bastante diversas.
3. Acanthoscurria natalensis
O gênero Acanthoscurria contém aproximadamente 39 espécies descritas,
amplamente distribuídas em regiões Neotropicais, principalmente na América do
Sul. O gênero é caracterizado pela presença de cerdas estridulantes na face
retrolateral do trocanter palpal, apenas uma apófise tibial na pata I e um nódulo
32
retrolateral na tíbia palpal. As fêmeas podem ser reconhecidas pelo receptáculo
seminal com uma base comum e dois lobos mais ou menos evidentes (Pérez-
Miles et al., 1996).
A espécie A. natalensis (Fig. 2) tem ampla distribuição em biomas de
Caatinga e Cerrado, abrangendo os estados do Pará, Maranhão, Piauí, Ceará, Rio
Grande do Norte, Tocantins, Pernambuco, Paraíba, Mato Grosso, Bahia, Alagoas,
Sergipe, Goiás, e Minas Gerais (Fig. 3). Os machos de A. natalensis lembram
Acanthoscurria paulensis e Acanthoscurria chacoana em alguns aspectos, mas
podem ser distinguidos pela quilha menos desenvolvida e uma projeção anterior
do embolo bem marcada. As fêmeas podem ser diferenciadas de outras espécies
do gênero pelo lobo do receptáculo seminal com uma base estreita e mais
projetado (Lucas et al., 2011). A. natalensis é uma espécie não agressiva e se
alimenta de diversos invertebrados e pequenos vertebrados (Ferreira et al., 2014).
Poucas espécies deste gênero foram estudadas quanto a presença de
moléculas bioativas, sendo que na peçonha, estas estão restritas a apenas dois
relatos (Mourão et al., 2013; Rates et al., 2013).
Na hemolinfa de A. gomesiana foram identificadas três importantes
moléculas, denominadas Migalina, Gomesina e Acanthoscurrina. Estas moléculas
apresentaram atividades biológicas relacionadas principalmente a ação
antimicrobiana e antiparasitária (Lorenzini et al., 2003; Pereira et al., 2007; Silva,
Daffre e Bulet, 2000).
Na peçonha de Acanthoscurria paulensis foi encontrada a Ap1a, o primeiro
peptídeo descrito para esta espécie. Ele contém 48 resíduos de aminoácidos e
possui massa molecular de 5.457 Da. Este peptídio mostrou ação sobre a junção
33
neuromuscular de insetos e mamíferos, sendo esta, mediada por receptores de
glutamato (Mourão et al., 2013).
Em uma publicação mais recente, a análise da peçonha de A. natalensis
revelou a presença de um peptídeo, denominado µ-Theraphotoxin-An1a (µ-TRTX-
An1a). Este peptídeo mostrou atividade sobre canais de sódio dependentes de
voltagem de neurônios de insetos (Rates et al., 2013).
34
Figura 2. Exemplar de Acanthoscurria natalensis. Imagem: arquivo pessoal.
Figura 3. Distribuição da espécie A. natalensis no território brasileiro. (A): território brasileiro representado pela área destacada em cinza claro e escuro (em detalhate na figura B). (B): pontos representam a distribuição de A. natalensis nos estados da região nordeste e centro-oeste. Adaptado de Lucas et al., 2011.
35
II. JUSTIFICATIVA
As aranhas são um grupo zoológico de ampla diversidade e representam
uma importante fonte para a obtenção de compostos bioativos. Contudo,
relativamente poucos compostos foram identificados e caracterizados a partir da
peçonha de aranhas. Estes compostos bioativos apresentam diferentes ações
biológicas, como: antimicrobiana, antitumoral e imunomodulatória e, com
atividades enzimáticas, como a hialuronidase, conferindo assim um grande
potencial para novas descobertas. Diversos destes compostos possuem aplicação
na área médica e nas indústrias farmacêutica, alimentícia, biotecnológica, entre
outras (Matavel, Estrada e Marco Almeida, 2016). Por exemplo, as espécies de
aranhas Phoneutria nigriventer e Lycosa erythrognatha possuem compostos com
potencial aplicação na modulação da função erétil e com ação antimicrobiana,
respectivamente (Marco Almeida et al., 2015). A propriedade da enzima
hialuronidase, conhecida como “fator de espalhamento”, pode ser utilizada no
aumento da permeabilidade tecidual para facilitar a dispersão e absorção de
drogas injetáveis, na redução de edemas (Bordon et al., 2015) e ainda, pode ser
empregada diretamente como agente antitumoral (Heinen e Veiga, 2011).
Estudos dedicados a caracterização de compostos bioativos em
Acanthoscurria spp. tem se restringido a investigação de peptídeos
antimicrobianos e poliaminas presentes na hemolinfa de A. gomesiana e
neurotóxicos na peçonha de A. paulensis e A. natalensis. O pouco conhecimento
disponível sobre os componentes da peçonha da aranha A. natalensis e as
evidências de seu potencial científico, torna esta espécie importante alvo de
investigação, que poderá contribuir de forma relevante para descrição da
36
diversidade molecular e a caracterização estrutural e funcional de compostos
presentes na sua peçonha, bem como, para o conhecimento científico da
biodiversidade brasileira.
III. OBJETIVOS
Geral
Investigar e caracterizar química e biologicamente, compostos isolados da
peçonha da aranha caranguejeira Acanthoscurria natalensis.
Objetivos específicos
1. Fracionar os compostos presentes na peçonha bruta por cromatografia
líquida de alta performance de fase reversa (RP-HPLC).
2. Identificar as frações de interesse por meio de screening das
atividades:antimicrobiana, efeitos sobre a viabilidade celular e modulação da
produção de óxido nítrico.
3. Identificar as frações de interesse por meio de screening das atividades
enzimáticas: proteásica, fosfolipásica e hialuronidásica.
4. Caracterizar a estrutura química dos compostos de interesse por
espectrometria de massa.
37
IV. ESTRUTURA DA TESE
A tese foi organizada em três partes, nas quais são apresentados os
métodos utilizados e os resultados obtidos, bem como a respectiva discussão.
Parte I: Aborda os aspectos relacionados ao fracionamento da peçonha de
A natalensis e identificação de frações de interesse por meio de screenings de
atividades biológicas.
Parte II: Contempla o tema “Acilpoliaminas: purificação, atividade
antimicrobiana e hemolítica e, caracterização parcial da estrutura química”.
Parte III: Contempla o tema “Caracterização estrutural e bioquímica de uma
nova Hialuronidase isolada da peçonha de Acanthoscurria natalensis”.
38
PARTE I
Fracionamento da peçonha de A. natalensis e screening de atividades
biológicas
1. Material e métodos
1.1. Material biológico e obtenção da peçonha
Exemplares de A. natalensis (n~30) foram coletadas (no. de licença SISBIO:
51803-1, Anexo I) na Fazenda Nossa Senhora Aparecida-GO e transportadas até
o biotério do Instituto de Biologia-UnB, onde foram mantidas individualmente em
caixas contendo areia e água, em uma sala reservada e sob condições naturais de
foto período e ventilação. As aranhas foram alimentadas mensalmente com
camundongos neonatos provenientes do biotério. Os exemplares foram
identificados (Lucas et al., 2011) e a espécie confirmada pelo professor Dr. Paulo
César Motta, curador da Coleção de Aracnídeos da UnB. Um indivíduo de A.
natalensis foi depositado como testemunho na referida coleção.
A extração da peçonha foi realizada apenas em fêmeas em estágio
intermuda nos dias que precedem a alimentação. Cerca de 30 µL de peçonha por
animal foram coletados em microtubos por meio de eletroestimulação,
posicionando-se os eletrodos lateralmente na base das quelíceras e aplicando-se
um estímulo de 75 V por 3 s, sob baixa corrente e pulsado, de 1 a 2 vezes por
animal (Rocha-e-Silva, Sutti e Hyslop, 2009). As amostras foram levadas ao
Laboratório de Toxinologia-UnB e congeladas individualmente para liofilização
(Speed-Vac, Thermo Scientific) e conservação a -20oC até o uso. A quantidade
39
total de peçonha foi obtida pela pesagem de microtubos, antes e após sua
utilização para a coleta e liofilização das amostras (peso seco).
1.2. SDS-PAGE
A separação dos componentes proteicos presentes na peçonha foi
realizada por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil
sulfato de sódio (SDS-PAGE), sob condições redutoras (Laemmli, 1970). A
amostra de peçonha (8 µg) foi preparada em tampão de amostra (Tris-HCl 0,5M,
pH 6,8, glicerol, SDS 10% e azul de bromofenol 0,5%) e aplicada no gel de
poliacrilamida 12% separador, preparado em tampão Tris pH 8,8 na presença de
SDS. Após a eletroforese em sistema mini-gel a 40C, sob voltagem de 180 V e
corrente de 40 mA, o gel foi colorado com nitrato de prata (Nesterenko, Tilley e
Upton, 1994). Proteínas com massa molecular entre 97 e 14.4 kDa foram
utilizadas como marcador molecular (fosforilase b: 97 kDa, albumina: 66 kDa,
ovoalbumina: 45 kDa, anidrase carbônica: 30 kDa, inibidor de tripsina: 20 kDa e α-
lactalbumina: 14,4 kDa) (Low Molecular Weight Calibration Kit for Electrophoresis,
GE Healthcare, U.K.).
1.3. Fracionamento da peçonha por cromatografia líquida de alta eficiência
de fase reversa (RP-HPLC)
O fracionamento da peçonha foi obtido por RP-HPLC, sob sistema de
gradiente de solventes. As amostras liofilizadas (20 mg/mL) foram solubilizadas no
solvente A (0,12% ácido trifluoracético (TFA) (v/v) em água Milli-Q) e centrifugadas
por 10 minutos a 10.000 rpm. Alíquotas de 200 µL do sobrenadante foram
40
aplicadas em coluna de fase reversa C18 (Vydac 218TP54, 250 mm x 4,5 mm, 5
µm), previamente equilibrada com o mesmo solvente, sob fluxo de 1 mL/min. As
frações cromatográficas foram eluídas sob gradiente linear de 0 a 60% do solvente
B (0,12% de TFA v/v em acetonitrila (ACN)) em 60 min. e detectadas
simultaneamente em 216 e 280 nm. As frações coletadas manualmente em
microtubos foram liofilizadas em Speed-Vac (Thermo Scientific) e mantidas a -
200C até o uso. A quantificação das frações cromatográficas foi obtida como
descrito acima, no item 1.1.
1.4. Screening de atividades biológicas da peçonha
1.4.1. Ensaio antimicrobiano
A avaliação da atividade antibacteriana e antifúngica de amostras da
peçonha total e frações cromatográficas foi realizada pelo método de microdiluição
em caldo, utilizando-se as bactérias Gram-negativas Escherichia coli ATCC 25922
e Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 e, Gram-positivas Staphylococcus aureus
ATCC 25923 e Enterococcus faecalis ATCC 29212 e o fungo Candida albicans
ATCC 10231, cultivadas em meio Mueller-Hinton (MH) (bactérias) ou Brain Heart
Infusion (BHI) (fungo), sob leve agitação a 37°C. Após 24 h e a densidade óptica
atingir o valor de 1 a 595 nm, alíquotas de 50 μL de cada cultura, diluídas na
proporção de 1:100 (bactérias Gram-positivas e fungo) e 1:50 (bactérias Gram-
negativas) foram incubadas por 24 h a 37°C com 50 μL da amostra de peçonha
(10 mg/mL) ou fração cromatográfica (equivalente a uma corrida), diluídas em
água Milli-Q estéril. Para o controle positivo (crescimento pleno) e negativo
(ausência de crescimento), os microorganismos foram incubados com meio de
41
cultura e água Milli-Q e, formaldeído 0,4% (v/v), respectivamente. A leitura da
densidade óptica a 595 nm foi realizada em leitora de placas Multiskan FC
(Thermo Scientific) e o valor do branco (meio de cultura e Milli-Q), subtraído de
todas as amostras. O crescimento do microorganismo foi determinado como um
percentual do controle positivo, definido como 100%, obtido em dois ensaios
independentes em duplicata.
1.4.2. Ensaio de viabilidade celular de células tumorais e não tumorais
A influência da peçonha total e da fração cromatográfica FR5 na viabilidade
celular de células tumorais e não tumorais foi avaliada pelo ensaio colorimétrico do
MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-45 diphenyltetrazolium bromide), que é
baseado na capacidade das células viáveis reduzirem o substrato MTT em um
produto de coloração azulada, o formazan (Mosmann, 1983).
As linhagens celulares tumorais Hela (colo de útero humano), MCF-7
(mama humano) e não tumoral NIH/3T3 (fibroblasto de camundongo) foram
cedidas pelo Prof. Ricardo Bentes do Laboratório de Nanobiotecnologia-UnB, no
qual os experimentos foram realizados. As células provenientes do estoque em
nitrogênio líquido foram semeadas em garrafas de poliestireno (25 cm2) contendo
meio de cultura DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de
estreptomicina e penicilina e incubadas por 24h, a 370C e 5% de CO2. O meio de
cultura foi trocado após as 24h e posteriormente a cada 48h. Ao atingirem
confluência de aproximadamente 80%, as células foram removidas pela adição de
2 mL de tripsina por 2 min, sendo após inativada pela adição de igual volume de
meio suplementado. As células foram centrifugadas (5 min., 2000 rpm),
42
ressuspensas em 1 mL de meio e recultivadas para expansão das células. Ao
atingirem confluência de aproximadamente 80%, as células foram removidas com
tripsina, centrifugadas e ressuspensas em 1 mL de meio.
As células foram contadas em câmara de Neubauer (utilizando-se 10 µL da
diluição obtida pela mistura de 10 µL da suspensão celular com 40 µL de azul
tripan) e a concentração celular foi ajustada para 5 x 103 células por poço. As
células foram adicionadas em placas de 96 poços e incubadas por 24 h, nas
condições já citadas. Após a remoção do meio de cultura, as células foram
tratadas com 200 µL da amostra de peçonha (10 mg/mL) ou fração cromatográfica
(equivalente a uma corrida) diluídas em meio suplementado e incubadas por 24h.
Células incubadas apenas com meio de cultura suplementado foram utilizadas
como controle positivo. Após a incubação e remoção do meio de cultura, 150 µL
de uma solução de MTT (15 µL de MTT 5mg/mL diluídos em 135 µL de meio
suplementado) foram adicionados a cada poço. Após 4 horas de incubação, o
MTT foi removido e os cristais de formazam solubilizados com 100 µL de DMSO
10%. Um branco foi estabelecido somente com DMSO. A absorvância foi lida a
595 nm e a viabilidade celular foi expressa como um percentual do controle
positivo, definido como 100% de viabilidade celular, obtida em dois ensaios
independentes em duplicata.
1.4.3. Avaliação da produção de óxido nítrico (NO)
O efeito da peçonha total e da fração cromatográfica FR5 sobre a produção
de óxido nítrico de macrófagos J744, foi avaliada pela reação colorimétrica de
Griess (Hibbs et al., 1988). O NO gerado em diferentes processos fisiológicos,
43
como nas respostas inflamatórias, é rapidamente oxidado a nitrito e nitrato. Assim,
sob condições in vitro, o NO presente no sobrenadante celular pode ser
determinado indiretamente pela quantificação do nitrito (NO2-) pela reação de
Griess. O reagente de Griess converte o nitrito a um produto azo de coloração
violeta, que pode ser detectado espectrofotometricamente e que reflete a
quantidade de óxido nítrico produzido.
Cultura celular de macrófagos
A cultura de macrófagos da linhagem J774 ATCC-CCL TIB-67TM ocorreu de
modo semelhante ao descrito no item 1.4.2., em relação a manutenção, expansão
e contagem celular. Porém, o meio de cultura utilizado para os macrófagos foi o
RPMI-1640, suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina e
estreptomicina e a concentração de macrófagos por poço (placas de 96 poços) foi
de 1x105 células. Após a adição das células aos poços, as placas foram mantidas
em estufa a 370C e 5% de CO2 por 2h para a aderência celular. Após este
período, o meio de cultura foi removido e as células foram incubadas a 370C e 5%
de CO2 por 24h com lipopolissacarídeo-LPS (utilizado como ativador de produção
de NO) a 50 ng/mL em meio suplementado, na presença ou ausência da peçonha
total e FR5 nas concentrações de 50, 125 e/ou 250 µg/mL em meio suplementado.
O controle de produção de NO foi obtido pela incubação das células somente com
LPS. Células cultivadas apenas com meio RPMI representaram o controle de
viabilidade celular e ausência de produção de NO.
44
Teste de viabilidade celular de macrófagos
A viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio colorimétrico do MTT, como
descrito no item 1.4.2. Após a incubação dos macrófagos com LPS e/ou as
amostras por 24 h, o sobrenadante celular de cada poço foi transferido para outra
placa (para a quantificação de nitrito, descrito a seguir) e as células aderidas
foram submetidas ao ensaio do MTT. Os resultados de viabilidade celular obtidos
em dois experimentos em triplicata foram expressos como um percentual do
controle positivo (células em meio RPMI) definido como 100% de viabilidade
celular.
Produção de óxido nítrico (NO) por macrófagos
A produção de NO pelas células expostas ou não ao ativador (LPS) e a
peçonha total e FR5 foi detectada pela adição de 100 µL do reagente de Griess
(solução de sulfanilamida 1% e hidrocloreto naftiletileno diamina-NEED 0,1%,
ambos em 2,5% de H3PO4) preparado no momento do uso, aos poços contendo
100 µL dos sobrenadantes celulares. Após 10 min., a absorvância foi lida em
espectrofotômetro a 540 nm. A concentração de nitrito foi calculada a partir de
uma curva padrão preparada com concentrações conhecidas de nitrito de sódio (0
a 200 µM). Os resultados apresentados foram obtidos em um experimento
realizado em triplicata.
45
1.4.4. Atividade proteolítica
A presença de atividade proteolítica na peçonha total foi avaliada
espectrofotometricamente (Christen e Marshall, 1984), pela detecção do
grupamento azo liberado pela hidrólise do substrato cromogênico azocaseína. O
ensaio foi realizado pela adição de 300 µL da solução de azocaseína (1 mg/mL em
tampão Tris-HCl 0,1 M pH 6,0 ou pH 8,0) em microtubos e em seguida, 20 µL das
amostras e controles. As amostras da peçonha de A. natalensis foram testadas
nas concentrações de 2 e 4 mg/mL. Para o controle positivo, o substrato foi
incubado com 20 µL da peçonha da serpente Bothrops moojeni (5 mg/mL). Poços
contendo apenas tampão ou azocaseína, foram utilizados como controles de 0% e
100% de substrato, respectivamente. A mistura foi incubada por 1,5 h a 370C e a
reação foi interrompida pela adição de 100 µL de TCA (ácido tricloroacético) 0,5M.
Os tubos foram então centrifugados a 10.000 rpm por 5 min. e 200 µL do
sobrenadante, transferidos para uma placa de 96 poços para leitura da
absorvância a 342 nm em espectrofotômetro. A atividade proteolítica foi expressa
como a porcentagem de substrato hidrolisado em relação ao controle de 100%,
em dois ensaios em triplicata.
1.4.5. Atividade de fosfolipase
A presença de atividade fosfolipásica na peçonha total foi avaliada
espectrofotometricamente pela diminuição da turbidez provocada pela ação da
enzima sobre uma suspensão de gema de ovo utilizada como substrato (Marinetti,
1965). O ensaio foi realizado em placa de 96 poços, pela adição de 180 µL da
suspensão de gema de ovo a 2% (m/v) em tampão Tris-HCl 0,1 M pH 8,0 a cada
46
poço para a primeira leitura (tempo 0) da absorvância a 405 nm. Em seguida,
alíquotas de 20 µL das amostras e controles foram adicionadas aos poços. Após 5
min., uma nova leitura de absorvância foi realizada. As amostras da peçonha de A.
natalensis foram testadas nas concentrações de 2 e 4 mg/mL. Para o controle
positivo, o substrato foi incubado com 20 µL da peçonha da serpente Bothrops
moojeni (5 mg/mL). Poços contendo apenas tampão ou emulsão de gema de ovo,
foram utilizados como controles de 0% e 100% de substrato, respectivamente.
Para verificar o efeito do cálcio na atividade fosfolipásica, as amostras foram
incubadas com 10 µL de CaCl 10mM. A atividade fosfolipásica foi expressa como
porcentagem de substrato hidrolisado em relação ao controle de 100%, em dois
ensaios em triplicata.
1.4.6. Atividade hialuronidásica
A presença de atividade hialuronidásica na peçonha total e frações
cromatográficas agrupadas como: fração 1-3, 4, 5, 6-7, 8-12, 13-17 e 18, foi
avaliada por turbidimetria de acordo com (Di-Ferrante, 1956), com algumas
modificações. A mistura de reação foi preparada em placa de 96 poços utilizando
57 μL de tampão de acetato de sódio 200 mM, pH 5,8 contendo 150 mM de NaCl,
12 μL de ácido hialurónico (0,5 mg/mL) e 5 μL de amostra (contendo 50 μg de
peçonha ou 5 μg das frações cromatográficas). Como controle positivo, 5 µg de
hialuronidase testicular bovina (400-1000 U/mg, Sigma Aldrich) foi utilizada. Poços
contendo apenas tampão ou ácido hialurônico, foram utilizados como controles de
0% e 100% de substrato, respectivamente. A placa foi incubada durante 15 min a
37 °C e a reação enzimática interrompida pela adição de 125 μL de brometo de
47
cetiltrimetilamónio (CTAB) 2,5% (m/v) em NaOH 2% (m/v). Após 10 min, a
absorvância foi medida a 405 nm contra um branco contendo tampão e CTAB. A
quantidade de ácido hialurônico hidrolisado foi obtida pela diferença nas
absorvâncias entre o controle de 100% e a amostra. A atividade enzimática foi
expressa como porcentagem de substrato hidrolisado em relação ao controle de
100%, em dois ensaios em triplicata.
1.5. Análise estatística
Os dados foram expressos como média ± desvio padrão. ANOVA bi-fatorial
foi utilizada para as análises estatísticas (dados dos ensaios de MTT e NO), e a
diferença estatística foi identificada pelo teste de Bonferroni, utilizando o programa
estatístico GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc, EUA). O nível de
significância foi estabelecido como P<0,05.
2. Resultados
2.1. Perfil eletroforético da peçonha
O perfil eletroforético da peçonha obtido por SDS-PAGE e coloração por
nitrato de prata, revelou a presença de um pequeno número de componentes de
natureza proteica (Fig. 2). O principal componente foi identificado na faixa de 45
kDa, sugerindo corresponder a enzima hialuronidase, de modo semelhante ao
descrito na literatura para outras hialuronidases (Bordon, et al., 2015).
48
2.2. Fracionamento da peçonha por cromatografia de fase reversa
A peçonha total foi fracionada por RP-HPLC em coluna C18 e com sistema
de gradiente de solventes (Fig.1), permitindo a identificação de 18 frações
principais, eluídas predominantemente com até aproximadamente 30% de ACN,
indicando o caráter mais hidrofílico dos seus componentes. Nesta região, a fração
5 (FR5) foi a mais abundante, eluindo entre 15 e 25% de ACN. A baixa resolução
deste pico indicou a presença de uma grande quantidade de componentes
coeluídos e de natureza química bastante semelhantes, sugerindo corresponder
às acilpoliaminas. Já na região mais hidrofóbica (em torno de 50% de acetonitrila),
o principal componente eluído foi a fração 18 (FR18).
Figura 1. Perfil eletroforético da peçonha (8 µg) de A. natalensis (An) em SDS-PAGE 12% corado com nitrato de prata. M: marcador molecular (kDa), fosforilase b (97), albumina (66), ovoalbumina (45), anidrase carbônica (30), inibidor de tripsina (20) e α-lactalbumina (14,4).
49
Figura 2. Perfil cromatográfico representativo da peçonha total (4mg) de A. natalensis fracionada por RP-HPLC em coluna C18, sob gradiente linear de 0 a 60% do solvente B em 60 min, sob fluxo de 1,0 mL/min. Solvente A: 0,12% de TFA em água Milli-Q. Solvente B: 0,12% de TFA em ACN.
50
2.3. Screening de atividades biológicas da peçonha
2.3.1. Atividade antimicrobiana
A atividade antimicrobiana da peçonha total e das 18 frações
cromatográficas foi avaliada contra bactérias Gram-positivas, Gram-negativas e
uma linhagem de fungo, pelo método de diluição em meio líquido. As amostras
que apresentaram atividade antimicrobiana são apresentadas na tabela 1. A
peçonha total não se mostrou muito efetiva, com porcentagens de inibição de
crescimento inferiores a 50% contra todos os microorganismos. A fração FR5
apresentou expressiva atividade, com inibição acima de 80% contra 4 dos 5
microorganismos testados. A atividade antimicrobiana das demais frações foi mais
moderada, inibindo o crescimento microbiano predominantemente entre 50 e 80%.
Tabela 1. Atividade antimicrobiana da peçonha total (PT) de A. natalensis e
frações cromatográficas (FR).
Amostra Microorganismos
Fungo Gram-positivo Gram-negativo
CA SA KP EC EF
PT + + + + +
FR2 ++ ++ + ++ ++
FR5 +++ +++ ++ +++ +++
FR6 ++ ++ ++ ++ ++
FR7 + ++ +++ +++ +++
CA: Candida albicans, SA: Staphylococcus aureus, KP: Klebsiella pneumoniae, EC: Escherichia
coli e EF: Enterococcus faecalis
(+++) inibição de crescimento bacteriano ≥ que 80%
(++) inibição de crescimento bacteriano entre 50 e 80%
(+) inibição de crescimento bacteriano < que 50%.
Negrito: fração que apresentou atividade antimicrobiana mais expressiva
51
2.3.2. Efeito sobre a viabilidade celular de células tumorais e não tumorais
Os resultados obtidos pelo ensaio do MTT, mostraram que a peçonha total
e FR5 não reduziram significativamente a viabilidade celular das linhagens
celulares testadas, quando comparado com o controle de viabilidade celular (CT).
A FR5 mostrou ainda, um possível aumento da viabilidade celular das células
MCF7 e NIH3T3, embora não estatisticamente significativo devido ao elevado
desvio padrão (Fig. 3).
Figura 3. Efeito da peçonha total (PT) e fração cromatográfica FR5 sobre a viabilidade celular de células tumorais (Hela e MCF7) e não tumorais (NIH3T3) após 24 h de incubação, avaliado pelo ensaio do MTT. Hela: colo uterino humano. MCF7: mama humano. NIH3T3: fibroblasto de camundongo. CT: controle (100% de viabilidade celular). Dados foram expressos como média ± DP.
52
2.3.3. Produção de óxido nítrico (NO)
Efeito da peçonha total e fração 5 sobre a viabilidade celular e
produção de NO de macrófagos
Considerando que a peçonha de aranhas e moléculas como poliaminas,
podem interferir na viabilidade celular ou modular respostas imunológicas ou
inflamatórias, o efeito da peçonha total e fração 5 de A. natalensis sobre a
viabilidade celular e produção de NO de macrófagos foi avaliado pelo método do
MTT e de Griess, respectivamente.
Como resultado, os macrófagos expostos a diferentes concentrações da
peçonha total e fração 5 (50, 125 e/ou 250 µg/mL) não promoveram alterações na
viabilidade celular quando comparadas ao controle (células em RPMI) (Fig. 4A). A
produção de NO de macrófagos incubados por 24 h com as amostras testes não
foi alterada quando comparado as células não estimuladas (células em RPMI)
(Fig. 4B), diferentemente do que foi observado nas células incubadas com LPS.
Estes resultados demonstram que as amostras não interferem na viabilidade
celular e não estimulam a produção de NO de macrófagos nas condições
testadas.
53
Efeito da peçonha total e fração 5 sobre a viabilidade celular e
produção de NO de macrófagos estimulados com LPS
Como observado na figura 4B, a peçonha total e fração 5 não induziram a
produção de NO. Assim, para investigar o possível efeito supressor da produção
de NO, macrófagos estimulados com LPS foram expostos a diferentes
concentrações das amostras (50, 125 e/ou 250 µg/mL). Os resultados mostraram
que a presença de 50 e 125 µg/mL da peçonha total e fração 5 significativamente
reduziu a produção de NO das células estimuladas com LPS (Fig. 5A). O maior
efeito foi obtido com 125 µg/mL, que representa uma redução na produção de NO
em aproximadamente 64% quando comparado com o respectivo controle (células
estimuladas com LPS). A redução na produção de NO observada não foi
considerada uma consequência de alterações na viabilidade celular das células
estimuladas com LPS, uma vez que esta não diferiu estatisticamente do controle
NO
- 2(
M/1
05 c
élu
las)
0
10
20
30
40
50 125
B
RPMI
LPS
PT
FR 5
(g/mL)
Via
bili
dad
e c
elu
lar
(%)
0
50
100
150RPMI
PT
FR 5
50 125 250 (g/mL)
A
Figura 4. Efeito da peçonha total (PT) e fração cromatográfica FR5 sobre macrófagos J774, em diferentes concentrações (µg/mL). (A): Viabilidade celular (ensaio do MTT). RPMI: controle de 100% de viabilidade celular. (B): Produção de NO (método de Griess). RPMI: controle de ausência de produção de NO. LPS: controle de produção de NO. Dados foram expressos como média ± DP.
54
de viabilidade celular (células em RPMI) em nenhuma das concentrações testadas
(Fig. 5B).
Via
bilid
ad
e c
elu
lar
(%)
0
50
100
150
50 125 250
B
RPMI
LPS
PT
FR 5
(g/mL)
NO
- 2(
M/1
05 c
élu
las)
0
5
10
15
****** ***
***
50 125
A
RPMI
LPS
PT
FR 5
(g/mL)
Figura 5. Efeito da peçonha total (PT) e fração cromatográfica FR5 sobre macrófagos J774 estimulados com LPS (50 ng/mL), em diferentes concentrações (µg/mL). (A): Produção de NO (método de Griess). RPMI: controle de ausência de produção de NO. LPS: controle de produção de NO (B): Viabilidade celular (ensaio do MTT). RPMI: controle de 100% de viabilidade celular. Dados foram expressos como média ± DP.
55
2.3.4. Atividade proteolítica
A presença de atividade proteolítica na peçonha foi avaliada sobre o
substrato azocaseína. Nenhuma atividade proteolítica foi identificada nas
diferentes concentrações (2 e 4 mg/mL) e pH testados, diferentemente do controle
positivo representado pela peçonha de B. moojeni (Fig. 6).
2.3.5. Atividade fosfolipásica
A presença de atividade fosfolipásica na peçonha foi avaliada sobre uma
emulsão de gema de ovo como substrato. Nenhuma atividade fosfolipásica foi
identificada nas diferentes concentrações (2 e 4 mg/mL) testadas, mesmo na
presença de cálcio, diferentemente do controle positivo representado pela
peçonha de B. moojeni (Fig. 7).
Substr
ato
hid
rolis
ado (
%)
CT 2 4 50
50
100
150pH 6,0
pH 8,0
A. natalensis B. moojeni
(mg/mL)
Figura 6. Atividade proteolítica da peçonha de A. natalensis usando o substrato azocaseína, sob diferentes concentrações e pH. CT: controle sem adição de enzima (100% de substrato). B. moojeni: controle positivo. Dados foram expressos como média ± DP.
56
2.3.6. Atividade hialuronidásica
A atividade hialuronidásica da peçonha e frações cromatográficas foi
avaliada turbidimétricamente (Fig. 8). Apenas a peçonha total e fração 18
mostraram atividade hialuronidásica, hidrolisando aproximadamente 100% do
substrato, de modo semelhante ao controle positivo, representado pela
hialuronidase testicular bovina (Bv).
Substr
ato
hid
rolis
ado (
%)
CT 2 4 50
20
40
60
80
(mg/mL)
A. natalensis B. moojeni
Figura 7. Atividade fosfolipásica da peçonha de A. natalensis usando emulsão de gema de ovo como substrato, sob diferentes concentrações. CT: controle sem adição de enzima. B. moojeni: controle positivo. Dados foram expressos como média ± DP.
57
3. Discussão
Fracionamento da peçonha e perfil eletroforético
A separação de moléculas por cromatografia líquida de fase reversa (RP-
HPLC) se baseia na relação de hidrofobicidade entre as moléculas a serem
purificadas e a matriz cromatográfica. O fracionamento da peçonha de A.
natalensis foi realizado por RP-HPLC em coluna C18, sob gradiente linear de
acetonitrila, obtendo-se 18 frações principais eluídas predominantemente na
região mais hidrofílica do cromatograma. Nesta região, o principal componente
encontrado foi a fração 5 (FR5).
Conhecidamente, em RP-HPLC, a região mais hidrofílica do cromatograma
caracteriza-se pela eluição preferencial de compostos de baixa massa molecular,
tais como, aminas biogênicas e acilpoliaminas (Skinner et al., 1989). Estas últimas
constituem uma família de moléculas estruturalmente muito semelhantes e de
Amostra
Substr
ato
hid
rolis
ado (
%)
CT PT 1-3 4 5 6-78-12
13-17 18 Bv
0
20
40
60
80
100
Figura 8. Atividade hialuronidásica da peçonha total (PT) e frações cromatográficas (1-3, 4, 5, 6-7, 8-12, 13-17 e 18) de A. natalensis sobre o substrato ácido hialurônico. CT: controle sem adição de enzima. Bv: hialuronidade testicular bovina, usada como controle positivo. Dados foram expressos como média ± DP.
58
difícil separação (Estrada, Villegas e Corzo, 2007). A análise conjunta destes
aspectos indicou que a FR5 corresponde ao grupo de acilpoliaminas. Além disto, a
eluição desta fração por aproximadamente 4 minutos, mostra que há uma
quantidade ainda maior de compostos presentes na peçonha. Entre as aranhas,
esta é uma característica que tem sido frequentemente relatada (Palma, 2012).
Já na região mais hidrofóbica do cromatograma, foi observada a eluição de
um componente principal, a fração 18 (FR18). Nesta região hidrofóbica, também é
conhecido que compostos com massa molecular mais elevada são
caracteristicamente eluídos (Skinner et al., 1989), sendo estes em geral, de
natureza peptídica. O perfil eletroforético da peçonha mostrou a presença de
poucos componentes proteicos na peçonha, sendo a banda na faixa de 45 kDa, a
mais expressiva. A presença de componentes proteicos com massa molecular
entre 5 e 15 kDa (Estrada-Gomez, Muñoz e Quintana, 2013) e em torno de 40 kDa
(Rocha-e-Silva, Sutti e Hyslop, 2009), foi demonstrada na peçonha de aranhas
Theraphosidaes. Os componentes com massas moleculares mais elevadas (~40
kDa), podem corresponder a enzimas (Gentz et al., 2009) e dentre estas, a
hialuronidase tem sido descrita para diversas espécies de aranhas (Rash e
Hodgson, 2002) (Vassilevski, Kozlov e Grishin, 2009). Assim, a análise conjunta
do perfil cromatográfico e eletroforético e, do ensaio de atividade enzimática de A.
natalensis, confirmaram que a FR18 contém a enzima hialuronidase (HA).
59
Screening de atividades biológicas
As atividades biológicas da peçonha de A. natalensis avaliadas incluíram:
ação antimicrobiana, efeito sobre a viabilidade celular e produção do óxido nítrico
(NO).
A atividade antimicrobiana de compostos da peçonha de diversos animais,
comumente é atribuída a moléculas de natureza peptídica (Saez et al., 2010).
Contudo, na peçonha de A. natalensis a atividade antimicrobiana mais
pronunciada foi identificada na fração 5 (FR5), constituída por acilpoliaminas.
Desta forma, a FR5 foi selecionada para a continuidade do estudo, visando
caracterizar suas atividades biológicas e estrutura química (apresentados na Parte
II, sobre acilpoliaminas).
Embora a peçonha de diversos animais, como serpentes, abelhas e
escorpiões, tem demonstrado efeitos citotóxicos contra células tumorais, entre as
aranhas (Heinen e Veiga, 2011), estes efeitos têm sido pouco relatados para
membros da família Theraphosidae. Contudo, recentemente a atividade citotóxica
de moléculas da peçonha de 24 espécies desta família foi avaliada. Destas, 11
espécies (incluindo uma espécie do gênero Acanthoscurria, Acanthoscurria
geniculata) demonstraram atividade citotóxica contra células MCF7. Esta atividade
foi relacionada a duas acilpoliaminas identificadas na peçonha, denominadas
PA389 e PA366. A análise da estrutura química destas moléculas mostrou a
presença de um grupo aromático indole na PA389, enquanto na PA366, a presença
de um grupo hidroxifenil, confere a esta uma atividade mais acentuada (Wilson et
al., 2017).
60
A peçonha e a fração acilpoliamina de A. natalensis não reduziram a
viabilidade celular das células tumorais e não tumoral testadas, mas um possível
aumento da viabilidade celular das células MCF7 e NIH3T3 foi observado na
fração FR5. Certamente estudo adicionais são necessários para verificar esta
possibilidade, sobretudo em relação ao fibroblasto de camundongo (NIH3T3), pois
poderia abrir uma linha interessante de investigação, voltada para os processos de
cicatrização de feridas, já que estes envolvem diferentes eventos fisiológicos,
como a proliferação celular. Neste contexto, alguns animais têm sido explorados
para identificar compostos com propriedades cicatrizantes. Em Lonomia obliqua, a
proteína Losac e rLosac (recombinante) mostrou diversas atividades, como
citoproteção, proliferação celular e estimulação da produção de proteínas da
matriz extracelular e, in vivo, rLosac promoveu aumentou a proliferação epidermal
e induziu a contração da ferida (Sato et al., 2016). O peptídio antimicrobiano
Pardaxin (GE33), isolado do peixe Pardachirus marmoratus, em adição a sua
atividade antimicrobiana, promoveu rápida reepitelização de feridas infectadas
com Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) e não apresentou
efeitos imunotóxicos (Huang et al., 2014). Compostos com propriedades
cicatrizantes, também foram identificados na peçonha de alguns animais, como
em abelhas e serpentes. A Melitina isolada de Apis mellifera, mostrou atividade
antimicrobiana contra Listeria monocytogenes em concentração micromolar (CIM:
12.5 µg/mL) e acelerou a contração da ferida e reepitelização decorrente da
proliferação celular (Alia, Laila e Al-DaoudeAntonious, 2013). Isolado da peçonha
de Crotalus adamanteus, o composto CaTx-II (7.8 mg/mL) mostrou expressiva
ação antimicrobiana contra Staphylococcus aureus. CaTx-II não foi citotóxico
61
contra células de pulmão (MRC-5) e fibroblastos (HEPK), aumentou a produção de
citocinas envolvidas na cicatrização e migração celular em camundongos,
resultando cicatrização completa da ferida (Samy et al., 2014).
A peçonha de aranhas contém diversas moléculas bioativas, com
propriedades já bastante conhecidas, como neurotoxicidade, ação antimicrobiana
e enzimática (Kuhn-Nentwig, Stöcklin e Nentwig, 2011). Contudo, o efeito dos
componentes da peçonha de aranhas sobre respostas imunológicas tem sido
pouco explorado. Embora extremamente complexas, as respostas imunológicas
são primariamente mediadas por macrófagos, que rapidamente produzem
mediadores inflamatórios, como o óxido nítrico, em resposta a diferentes
antígenos, sejam eles de natureza química ou biológica (Fujiwara e Kobayashi,
2005).
A avaliação do efeito da peçonha total e fração 5 de A. natalensis sobre
macrófagos não estimulados, mostrou que as amostras em concentrações de até
250 µg/mL não reduziram a viabilidade celular e não induziram a produção de NO.
De modo semelhante, a peçonha do escorpião Tityus serrulatus não afetou a
viabilidade celular de células mononucleares de sangue periférico nas mesmas
concentrações (Casella-Martins et al., 2015). Por outro lado, a peçonha da
serpente Crotalus durissus terrificus causou a lise de macrófagos em baixas
concentrações (25 µg/mL) e induziu a produção de NO (Cruz, Mendonça e
Petricevich, 2005). Já a Migalina, uma acilpoliamina isolada da peçonha de
Acanthoscurria gomesiana, também não afetou a viabilidade celular de
esplenócitos e macrófagos sob concentrações entre 5 e 40 µg/mL, mas induziu a
produção de NO (Mafra et al., 2012).
62
O óxido nítrico é uma molécula produzida endogenamente, atuando como
importante sinalizador em diversos processos fisiológicos, como vasodilatação,
neurotransmissão e respostas imunológicas (Moncada e Higgs, 1991). No caso de
respostas inflamatórias, o NO é um dos mais importantes mediadores e o seu
efeito pró ou anti-inflamatório parece depender das concentrações em que é
produzido. O NO produzido em baixas quantidades atua como anti-inflamatório,
enquanto altas concentrações, como aquelas produzidas em resposta a bactérias,
são pró-inflamatórias (Grisham, Jourd’Heuil e Wink, 1999). A produção de NO
excessiva ou desregulada pode contribuir para o estabelecimento de condições
patofisiológicas, como respostas inflamatórias severas, sepse e câncer (Choudhari
et al., 2013). Assim, a busca por novos compostos com habilidade de modular a
produção de NO podem representar alternativas terapêuticas para o controle de
doenças inflamatórias, autoimunes, entre outras (Barreto, Correia e Muscará,
2005; Saez et al., 2010).
Efeitos imunomoduladores da peçonha de aranhas, tem sido pouco relatado
na literatura e a maior parte destes, abordam as respostas pró-inflamatórias
causadas pela injeção da peçonha de espécies dos gêneros Loxosceles e
Phoneutria em animais experimentais (Farsky, Antunes e Mello, 2005; Nunes et
al., 2008). Alguns estudos in vitro, foram realizados com a peçonha de Loxosceles
gaúcho e Loxosceles deserta sobre queratinócitos, sendo demonstrada a indução
de TNF-α (Malaque et al., 1999) e fator de crescimento endotelial vascular (VEGF)
(Desai, Lankford e Warren, 2000), respectivamente. Em relação ao efeito
imunomodulador de moléculas isoladas da peçonha, a Migalina, acima
mencionada, promoveu a modulação positiva de macrófagos e esplenócitos,
63
aumentando a produção de algumas citocinas e de NO (Mafra et al., 2012). A
peçonha de outros animais como escorpiões e serpentes, também possuem
propriedades imunomoduladoras, representadas principalmente por efeitos
imunoestimulantes e pró-inflamatórios (Farsky, Antunes e Mello, 2005; Petricevich,
2010).
No presente estudo, a peçonha total e fração 5 foram também avaliadas
quanto a capacidade em modular negativamente a produção de NO de
macrófagos estimulados com LPS. Os resultados mostraram que ambas as
amostras reduziram significativamente a produção de NO induzida por LPS, em
concentrações de 50 e 125 µg/mL.
O estudo realizado com peptídio Cupienina 1a, isolado da peçonha da
aranha Cupiennius salei, inibiu a óxido nítrico sintase neuroral (nNOS) e assim, a
produção de NO, em concentrações de IC50 de 1.3 µM (5.1 µg/mL). Neste estudo,
a inibição de nNOS foi medida pela conversão da [3H] arginine em [3H] citrulline
(Pukala et al., 2007).
Outros estudos relacionados a efeitos imunossupressores em peçonha de
aranhas não foram encontrados na literatura. Contudo, estes efeitos têm sido
identificados na peçonha de animais, como abelhas, vespas, formigas e serpentes
(Rajendra, Armugam e Jeyaseelan, 2004). O efeito imunomodulador da peçonha
de abelha e seu principal componente, a Melitina (ambos em concentrações de 1
e 2 µg/mL), foi avaliado sobre células microgliais, resultando na inibição da
produção citocinas e de NO induzido por LPS (Moon et al., 2007). A peçonha da
vespa Nasonia vitripennis, modulou a atividade de macrófagos estimulados com
LPS, inibindo a produção da citocina pró-inflamatória IL-6 e do fator de transcrição
64
NF-κB, que regula genes relacionados a reações inflamatórias (Danneels et al.,
2014). Atividades anti-inflamatórias também foram identificadas em compostos
isolados de organismos marinhos (Abad, Bedoya e Bermejo, 2008; Malve, 2016),
a exemplo do coral Sinularia spp., que inibiu a produção de TNF-α e NO por
macrófagos estimulados com LPS (Takaki et al., 2003). A astaxantina, um
carotenoide isolado do camarão marinho Litopenaeus vannamei, também reduziu
a produção de NO em macrófagos estimulados com LPS. A concentração que
apresentou este resultado foi de 43,5 µg/mL (Santos et al., 2012), estando próxima
a menor concentração (50 µg/mL) de peçonha total e fração 5 utilizadas no
presente trabalho.
A caracterização enzimática da peçonha de A. natalensis, envolveu três
grupos de enzimas conhecidos em aranhas: proteases, fosfolipases e
hialuronidases.
Com relação à presença de enzimas de natureza proteolítica e
fosfolipásica, nenhuma atividade foi detectada na peçonha de A. natalensis, de
modo semelhante a outros Theraphosidaes (Kuhn-Nentwig, Stöcklin e Nentwig,
2011) como, Poecilotheria regalis, Ceratogyrus darlingi, Brachypelma epicureanum
(García-Arredondo et al., 2015) e Vitalius dubius (Rocha-e-Silva, Sutti e Hyslop,
2009). Por outro lado, algumas aranhas do gênero Loxoceles (Sannaningaiah,
Subbaiah e Kempaiah, 2014) e Hippasa (Nagaraju et al., 2006) contém ambas as
enzimas em sua peçonha, enquanto outras apresentam apenas atividade
fosfolipásica ou proteásica, como em Pamphobeteus aff. nigricolor (Estrada-
Gomez, Muñoz e Quintana, 2013) e algumas espécies de Phoneutria (Richardson
et al., 2006), respectivamente.
65
A hialuronidase é uma enzima comumente presente na peçonha de
diversos animais, incluindo as aranhas. Em A. natalensis, a atividade
hialuronidásica foi identificada por turbidimetria na fração 18 (FR18), sendo esta
bastante expressiva. Desta forma, a FR18 foi selecionada para a continuidade do
estudo, visando a caracterização bioquímica e estrutural da enzima hialuronidase.
(apresentados na Parte III, sobre hialuronidase).
129
V. CONCLUSÕES
A peçonha de A. natalensis possui predominantemente compostos de baixa
massa molecular e com caráter hidrofílico, eluídos na porção inicial do
cromatograma e, uma pequena quantidade de compostos proteicos, sendo o
principal encontrado na faixa de 45 kDa (SDS-PAGE).
Os compostos de baixo peso molecular presentes na FR5, representados
pelas acilpoliaminas, apresentaram relevante atividade antimicrobiana com até
90% de inibição do crescimento bacteriano.
A FR5 não reduziu a viabilidade celular (VC) de células tumorais e não-
tumoral e por outro lado, um possível aumento da VC de fibroblastos de
camundongo (NIH3T3) foi observado. Contudo, estudos adicionais são
necessários para confirmar este possível efeito, que pode representar uma
interessante linha de investigação.
Ainda, a FR5 mostrou um possível efeito modulador da produção de NO de
macrófagos J774 induzida por LPS, reduzindo esta produção em
aproximadamente 64%, sem afetar a VC. Sem dúvida, futuras investigações são
necessárias a fim de identificar e isolar o (os) componente (s) que detêm esta
capacidade, bem como avaliar seu efeito sobre a produção de citocinas e as vias
de ativação dos macrófagos. A ampla caracterização destas propriedades
contribuirá para a qualificação dos seus componentes como possíveis agentes
terapêuticos no tratamento de doenças relacionadas a infecção e inflamação.
A caracterização das acilpoliaminas da FR5, denominadas ApAn728,
ApAn614a, ApAn614b, ApAn742 e ApAn756, mostrou atividade antibacteriana
130
contra E. coli e S. aureus com CIM variando entre 128 e 256 µM e ausência de
atividade hemolítica contra eritrócitos de camundongos.
As ApAn apresentaram massas moleculares entre 614 e 756 Da e a análise
da estrutura química mostrou a presença de uma unidade tirosil como cromóforo,
ligada a uma cadeia poliamina contendo ao menos uma unidade similar a
espermidina. Análises por ressonância magnética nuclear (RMN) poderão
contribuir para a elucidação completa da estrutura química destas acilpoliaminas.
A peçonha não apresentou atividade proteolítica e fosfolipásica, porém uma
expressiva atividade hialuronidásica foi identificada na FR18, sendo esta
denominada AnHyal.
A AnHyal apresentou um íon monocarregado em 42,55 kDa (MALDI-TOF),
sugerindo a homogeneidade da amostra e íons multi-carregados sugerindo a
presença de formas oligoméricas. Uma banda principal em 45 kDa e outras
bandas menores (acima de 45 kDa) enzimaticamente ativas, além de uma banda
não ativa em 42 kDa, foram identificadas na AnHyal (SDS-PAGE e zimograma).
O sequenciamento de novo e degradação de Edman da AnHyal resultou na
identificação de similaridades para as proteínas hialuronidase de B. vagans, com
cobertura proteica de 64% e CRISP de G. rosea, com cobertura proteica de 79%.
A identificação de domínios conservados (característicos das roteínas
hialuronidase ou CRISP) nos peptídios da AnHyal e o alinhamento destes com
outras hialuronidases e CRISP, indicaram a presença destas duas proteínas na
AnHyal, sendo denominados AnHyalH (hialuronidase) e AnHyalC (CRISP).
As análises por BN-PAGE mostraram que a AnHyal pode ser encontrada
como formas oligoméricas enzimaticamente ativas. Uma destas formas foi
131
decomposta em duas subunidades, uma ativa em 53 kDa e outra não ativa em 44
kDa. O sequenciamento de novo destas subunidades mostrou que a banda ativa
corresponde a hialuronidase, enquanto a banda não ativa corresponde a CRISP.
A AnHyalC encontra-se em proporção maior que a AnHyalH e desta forma,
é possível que o sinal da AnHyalH tenha sido suprimido, de modo que esta não foi
visualizada na análise por MALDI-TOF.
A estrutura secundária da AnHyal foi compatível com aquela apresentada
para outras proteínas CRISP, contendo 36,15% de α-hélice e 15,5% de folha β. A
AnHyal sobre um processo gradadivo de desnaturação, sendo que a temperatura
de transição (Tmelting) ocorre em 46,4 oC e a desnaturação total em 65 oC.
A AnHyal apresentou atividade máxima em uma ampla faixa de pH (4,0-6,0)
e temperatura (30-60 oC), com uma atividade residual de 85% a 60 oC, sendo que
esta pode ter sido favorecida pela associação entre a hialuronidase e CRISP.
A AnHyal apresentou especificidade pelo substrato ácido hialurônico e um
valor de KM de 617,9 µg/mL, sugerindo uma baixa afinidade por seu substrato.
Este trabalho permitiu pela primeira vez, a identificação de um complexo
enzimaticamente ativo entre as proteínas hialuronidase e CRISP. Estudos
adicionais devem ser realizados para identificar a função da proteína CRISP na
peçonha de A. natalensis, que poderá ajudar a elucidar a possível relação entre as
duas proteínas. A descoberta e caracterização de novos tipos de hialuronidases
pode expandir ainda mais as possibilidades de aplicações biotecnológicas dessas
enzimas.
132
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Anexo I. Licença SISBIO
148
Anexo II. Autorização CEUA
149
Anexo III. Artigo científico publicado durante o período do doutorado
Marine Depsipeptides as Promising Pharmacotherapeutic Agents
Marisa Rangel, Carlos José Correia de Santana, Andréia Pinheiro, Lilian dos
Anjos, Tania Barth, Osmindo Rodrigues Pires Júnior, Wagner Fontes e Mariana S.
Castro
Current Protein and Peptide Science, 2017, 18, 72-91
