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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PSICOBIOLOGIA
Irish Coffee: Efeitos de álcool e cafeína no comportamento
e aprendizagem do peixe paulistinha
LUANA CARLA DOS SANTOS
Orientadora: Ana Carolina Luchiari
Natal/2016
LUANA CARLA DOS SANTOS
Irish Coffee: Efeitos de álcool e cafeína no comportamento
e aprendizagem do peixe paulistinha
Dissertação apresentada ao programa de
pós-graduação em psicobiologia como
requisito para obtenção de título de
Mestre em Psicobiologia
Área de concentração: Comportamento
Animal
Orientadora: Ana Carolina Luchiari
NATAL, 2016
Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial do Centro de
Biociências
Santos, Luana Carla dos.
Irish Coffee: efeitos de álcool e cafeína no comportamento e
aprendizagem do peixe paulistinha / Luana Carla dos Santos. – Natal,
RN, 2016.
77 f.: il.
Orientadora: Profa. Dra. Ana Carolina Luchiari.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do
Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em
Psicobiologia.
1. Atividade locomotora e memória. – Dissertação. 2. Substâncias
psicoativas – Dissertação. 3. Peixe paulistinha. – Dissertação. I. Luchiari,
Ana Carolina. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III.
Título.
RN/UF/BSE-CB CDU 159.953
TITULO: Irish Coffee: Efeitos de álcool e cafeína no comportamento e aprendizagem do
peixe paulistinha
AUTOR: Luana Carla dos Santos
DATA DA DEFESA: 04 de março de 2016
BANCA EXAMINADORA:
__________________________________________
Dr. Rodrigo Egydio Barreto
UNESP – Botucatu, SP
__________________________________________
Dr. Rámon Hipolyto Lima
UFRN - Natal, RN
__________________________________________
Dra. Ana Carolina Luchiari (orientadora)
UFRN - Natal, RN
AGRADECIMENTOS
Após mais uma jornada acadêmica chega o momento de olharmos para trás e
analisarmos todos os caminhos que percorremos até a conclusão desse ciclo. Dedicarmos-nos
a pesquisar o que apreciamos, achamos pertinente e gratificante, mas como em toda
caminhada há inúmeros desafios, frustrações e êxitos.
Como em todos os momentos da minha vida, compartilho todas essas fases com
pessoas fundamentais nesse processo, que estão ou estiveram comigo no dia a dia, que
“abraçaram a causa”, que me fizeram refletir e amadurecer pessoalmente e profissionalmente,
enfim, que através de incentivos e críticas construtivas influenciaram no resultado final desse
trabalho no qual me dediquei integralmente durante esses dois anos.
Assim, inicio meus agradecimentos referenciando as pessoas mais importantes na
minha vida, a minha família, que sempre me apoiam, dão incentivo e amor incondicional.
Pessoas que compreendem minhas mudanças de humor (não é fácil!), respeitaram meus
momentos de isolamento quando precisava ficar um final de semana inteiro diante do
computador, em silêncio, escrevendo sobre ela, elaborando apresentações. Pessoas prontas
para acolher minha angustias e vibrar a cada vitória, não importando a hora do dia.
À minha orientadora Ana Carolina Luchiari, pela orientação, pelos conselhos que só
me ajudaram nesses nossos quase seis anos de convivência, essa jornada que teve início no
comecinho da graduação. Agradeço a paciência, a compreensão, ao tempo dedicado mesmo
quando estava tão longe do Brasil.
Agradeço as colegas de laboratório: Jéssica Polyana e Júlia Ruiz que foram meus
braços direito, esquerdo, pernas e corpo todo. Por toda dedicação e empenho, pelas horas
gasta analisando vídeos, trocando água dos peixes, limpando vazamento, pesando cafeína,
fazendo mil planilhas, escrevendo resumo para congressos, enfim, sem vocês este trabalho
não seria possível.
Continuando aos agradecimentos as colegas do laboratório: Adrielly Marcela, Diana
Chacon, Jaquelinne Pinheiro, Jéssica Janine e Priscila Fernandes, pelo auxílio na realização
dos experimentos, pela colaboração na revisão da dissertação, pelas ideias, conselhos e
discussões sobre o trabalho que ajudaram e muito no andamento dele. Agradeço pelo
empenho, apoio e amizade. Sem dúvidas, essa pesquisa carrega um pouco de cada uma.
Enfim, expresso aqui meus agradecimentos e desejo de encontros profissionais futuros
com essas figuras que tiveram importância direta na realização deste mestrado, sem esquecer
os funcionários da UFRN, em especial, aos que viabilizaram meu trabalho nos finais de
semana e feriados.
RESUMO
Substâncias psicoestimulantes vêm sendo utilizadas de forma indiscriminada há
muitos anos, e pouco se sabe os efeitos que elas causam a curto e longo prazo no
comportamento geral, na aprendizagem e na memória. Essas substâncias são bastante usadas
por jovens e adultos e elas possuem efeitos diferentes. Essas substâncias são dose dependente,
caso consumidas em baixa quantidade agem como estimulante, aumentando a atividade
locomotora, caso consumidas em alta quantidade, causam efeito depressor, diminuindo a
atividade locomotora e/ou causando ansiedade. Poucos estudos vêm investigando os efeitos
dessas substâncias na atividade locomotora, aprendizagem e memória e grande parte desses
estudos são realizados em roedores. Peixe paulistinha é um modelo animal promissor para
estudos comportamentais, cognitivos, ontogenéticos, dentre outros. Nossos objetivos foram
determinar os efeitos do álcool, cafeína e de seu uso combinado com álcool, na atividade
locomotora desses animais, usando para isso doses crônicas durante 27 dias e doses agudas
durante um dia. Visto que pouco se sabe sobre os efeitos dessa exposição prolongada.
Também investigamos os efeitos das substâncias em teste de reconhecimento de objetos, que
se baseia na memória de único evento. Essas memórias são mais vulneráveis que memórias
baseadas em várias repetições de eventos. Sendo assim, um teste adequado para utilizar com
uso de substâncias psicoativas. Observamos que o uso crônico de cafeína provoca alteração na
atividade locomotora dos animais, do mesmo modo, abstinência de álcool combinada com
cafeína em dose aguda (dose média) provoca aumento de atividade locomotora. Quando
submetidos a testes de memória, os animais exposto a doses altas agudas de álcool e em
abstinência dessa droga têm prejuízo na formação e/ou resgate da memória. No entanto,
tratamento com cafeína não prejudica a formação de memória. Animais expostos a tratamento
com dose crônica moderada de álcool e dose aguda moderada de cafeína tem melhor
desempenho na tarefa, indicando que dose aguda moderada de cafeína pode evitar os efeitos
deletérios ocasionados pela abstinência do álcool. Em termos do comportamento geral, doses
agudas de cafeína aumentam a locomoção, enquanto doses elevadas e a abstinência de cafeína
induzem a comportamentos tipo-ansioso. A combinação álcool crônico e cafeína aguda
induzem a alto comportamento tipo-ansiedade, enquanto a combinação cafeína crônica e
álcool agudo diminuem tanto a locomoção quanto a ansiedade.
Palavras-chaves: Substâncias psicoativas, peixe paulistinha, atividade locomotora, memória
ABSTRACT
Psychostimulant substances are being used in an indiscriminate way for many
years and little is known about the effects they cause in short and long term in learning and
memory. These substances are highly used by young people and adults and they present
different effects. The substances are dose dependent, if consumed in lower quantity they act
as a stimulant, increasing locomotor activity, if consumed on higher doses, they cause a
depressor effect, lowering the locomotor activity. Few studies investigate the effects of these
substances on the locomotor activity, learning and memory and most of these studies are on
rodents. The zebrafish is a good animal model for behavioral, cognitive, ontogenetic and other
studies. Our objectives were to determine the effects of alcohol, caffeine and its combined use
with alcohol on the locomotor activity of the animals, using chronic doses during 27 days and
acute doses during one day, since little is known about the effects of the prolonged exposition.
As also, investigate the effects of the substances on a one trial learning test of objects
discrimination, which is based on a memory of one single event. This type of memory is more
vulnerable than the memories based on many repetitions. Therefore, an adequate test to use
with the psychoactive substances. We found that the chronic use of caffeine provokes an
alteration on the locomotors activity of the animals. In the same way, alcohol withdrawal
combined with acute caffeine (moderate dose) provokes an increase on locomotors activity.
When submitted to the discrimination tests the animals exposed to higher acute doses of
alcohol and withdrawal of this drug have impairment on memory. However, the caffeine
treatment does not harm memory. Animals exposed to a treatment with moderate chronic
alcohol dose and moderate acute caffeine dose learned the task, indicating that moderate acute
caffeine doses may prevent deleterious effects caused by alcohol withdrawal. In terms of the
general behavior, acute doses of caffeine increase the mobility, while high doses of caffeine
and its abstinence induce anxiety-like behavior. The combination of chronic alcohol and acute
caffeine induces high anxiety-like behavior, while chronic caffeine combined with acute
alcohol decrease both locomotion as anxiety.
Key-words: Psychoative substance, zebrafish, locomotor activity, memory.
SUMÁRIO
Introdução geral................................................................................................................... 7
Breve histórico do uso de substâncias psicoativas.................................................................... 7
O álcool................................................................................................................................. 8
Metabolismo.................................................................................................................... 8
Ação do álcool no sistema nervoso central....................................................................... 9
Efeitos do álcool no comportamento – estudos com peixe paulistinha............................... 11
Cafeína................................................................................................................................. 12
Metabolismo.................................................................................................................... 12
Ação da cafeína no sistema nervoso central........................................................................ 13
Efeitos da cafeína no comportamento – estudos com peixe paulistinha............................... 14
O uso combinado de álcool e cafeína.................................................................................... 15
Peixe paulistinha como modelo animal.................................................................................. 17
Objetivos................................................................................................................................. 18 -19
Capítulo 1
Irish coffee: Behavioral changes induced by alcohol and caffeine in zebrafish
Resumo...................................................................................................................................... 20
1. Introdução............................................................................................................................. 21
2. Materiais e métodos.......................................................................................................... 23
3. Resultados............................................................................................................................ 27
4. Discussão.............................................................................................................................. 41
Agradecimentos......................................................................................................................... 40
5. Referências............................................................................................................................ 47
Figura 1..................................................................................................................................... 29
Figura 2...................................................................................................................................... 31
Figura 3...................................................................................................................................... 32
Figura 4...................................................................................................................................... 33
Figura 5...................................................................................................................................... 35
Figura 6...................................................................................................................................... 37
Figura 7...................................................................................................................................... 38
Figura 8...................................................................................................................................... 39
Figura 9...................................................................................................................................... 40
Capitulo 2
Irish coffee: Effects of alcohol and caffeine on object discrimination in zebrafish
Resumo...................................................................................................................................... 56
1. Introdução............................................................................................................................. 56
2. Materiais e métodos.......................................................................................................... 57
3. Resultados............................................................................................................................ 58
4. Discussão.............................................................................................................................. 60
Agradecimentos......................................................................................................................... 64
5. Referências............................................................................................................................ 64
Tabela 1..................................................................................................................................... 57
Figura 1..................................................................................................................................... 59
Figura 2...................................................................................................................................... 60
Figura 3...................................................................................................................................... 61
Figura 4...................................................................................................................................... 62
Figura 5...................................................................................................................................... 63
Figura 6...................................................................................................................................... 64
Conclusões gerais..................................................................................................................... 66
Referências............................................................................................................................... 67
Anexos....................................................................................................................................... 76-77
7
Introdução geral
Breve histórico do uso de substâncias psicoativas
O uso de substâncias psicoativas é um hábito humano milenar (Seidl, Costa &
Sudbrack, 1999) e pode ser correlacionado com diferentes contextos sociais, como lazer,
rituais religiosos e fins terapêuticos (Merlin, 2003). Na América, Europa e Ásia antiga, o
homem já utilizava plantas como a papoula do ópio, também chamada planta da felicidade,
pelo seu efeito alucinógeno (MacRae, 2001; Seibel & Toscano, 2001) e ansiolítico (Seibel &
Toscano, 2001). Ao longo do tempo, diferentes substâncias psicoativas passaram a ser
consumidas pelo homem, como álcool, maconha, cocaína, cafeína, nicotina, dentre outras
(Seidl et al., 1999) na busca pela atenuação de sensações desprazerosas e promoção de bem-
estar.
O álcool foi bastante consumido na forma de vinho por egípcios, gregos e hebreus,
sendo considerado uma “dádiva dos deuses” (Amouretti et al., 1999; Carneiro, 2005; Purcell,
2003; Rosenzweig, 1998). A maconha foi comumente utilizada pela medicina chinesa como
anestésico em cirurgias e ainda como hipnótico, analgésico e espasmolítico (Murad, 1996). Os
nativos da América do Sul, ainda hoje possuem o hábito de mascar folhas de coca para tolerar
o trabalho em altitudes, somado à pobre dieta alimentar (Bahls & Bahls, 2002; Gold, 1993).
Esse hábito de mascar folha da coca garante efeito estimulatório, semelhante ao efeito da
ingestão de cafeína, proporcionando maior rendimento aos trabalhadores (Bucher &
Olievenstein, 1992), sendo utilizada também como anestésico local (Seidl et al., 1999). Os
chineses utilizavam plantas com cafeína para preparação de chás, hábito esse difundido
mundialmente (Trevisanato & Kim, 2000). Com o passar dos séculos, os efeitos prejudiciais
destas substâncias tornaram-se conhecidos e atualmente a maconha, a heroína e a cocaína são
consideradas ilícitas na maioria dos países; embora o álcool, a nicotina e a cafeína sejam
8
drogas lícitas que estão incorporadas aos hábitos sociais de homens e mulheres (Pratta &
Santos, 2009).
Dentre as substâncias mencionadas, destacamos o álcool e a cafeína que são
largamente consumidas pela sociedade atual (Fredholm, Bättig, Holmén, Nehlig, & Zvartau,
1999; WHO, 2014). Apesar de ser uma droga lícita, o álcool pode causar dependência e é
considerado o segundo maior causador de complicações neuropsiquiátricas, perdendo apenas
para depressão (Brundtland, 2000). No ano de 2012, 3,3 milhões de pessoas chegaram a óbito
em decorrência do uso de álcool, devido à síndrome alcoólica fetal, cirrose hepática, câncer de
boca, câncer da faringe, câncer do esôfago, câncer da laringe, pancreatite, violência
interpessoal, acidentes de trânsito, dentre outros (WHO, 2014). Já a cafeína age de maneira
menos evidente, podendo levar também à dependência física de forma mais branda que o
álcool (Griffiths & Woodson, 1988), e, se consumida de forma desregulada, pode ocasionar
quadros de dor de cabeça, enjoo, letargia, dentre outros.
O álcool
Metabolismo
Após a ingestão, o álcool é rapidamente absorvido no estômago e intestino delgado,
sendo levado até a corrente sanguínea, e distribuído nos líquidos corporais totais (Cuppari,
2002; Dutra de Oliveira & Marchini, 2003). A concentração de álcool no sangue é máxima
em aproximadamente 30 min após o consumo, se o indivíduo estiver com o estômago cheio
esse processo tende a ser mais longo (Norberg, Jones, Hahn, & Gabrielsson, 2003). O
metabolismo gástrico do álcool é menor nas mulheres do que nos homens, o que contribui
para maior sensibilidade das mulheres a essa substância (Lieber, 2000; Schuckit, 2006a,
2006b).
9
O álcool é principalmente metabolizado no fígado, pela oxidação hepática.
Inicialmente, o álcool é transformado em acetaldeído pela ação da enzima ADH (álcool
desidrogenase), depois a enzima ALDH (aldeído desidrogenase) age e transforma o
acetaldeído em ácido acético e na coenzima NADH (nicotinamida adenina dinucleotídeo). Por
fim, o ácido acético é oxidado em dióxido de carbono. O ADH também é encontrado no
estômago, intestino, musculatura esquelética e tecido cerebral (Baraona, 2000; Duester et al.,
1999; Lim et al., 1993; Zakhari, 2006).
O álcool também pode ser metabolizado por vias extra-hepáticas, quando mantido
em grandes concentrações no organismo. Esse processo ocorre em grande parte no cérebro,
local com baixa atividade de ADH, por ação da enzima citocromo P450 (Zakhari, 2006).
Outra enzima que também realiza metabolismo extra-hepático é a catalase, encontrada nos
peroxissomos, e é utilizada em menor escala (Zimatkin & Deitrich, 1997). Independente da
enzima, o metabolismo do álcool tem como principal subproduto o acetaldeído, uma
substância tóxica, cujo acúmulo leva a reações adversas como tontura, náusea, vômito,
taquicardia e taquipnéia (Edenberg, 2007; Tuma, 2002).
Pequenas quantidades de álcool são excretadas na urina, no suor e no ar expirado,
enquanto o metabolismo do álcool é responsável pela excreção de 90-98% do álcool ingerido
principalmente devido à função hepática do ADH e ADLH (Brunton, Chabner, & Knollman,
2012). É necessário certo cuidado com o consumo, visto que o álcool atravessa a barreira
hematoencefálica e placentária facilmente (Gilman et al., 1996).
Ação do álcool no sistema nervoso central
Segundo a WHO (2014), drogas são substâncias capazes de alterar a função dos
organismos vivos. Aquelas com ação sobre o sistema nervoso central (SNC) podem aumentar
10
(estimulantes) ou diminuir (depressoras) sua atividade, ou ainda alterar a capacidade
perceptiva (perturbadoras); e dessa forma geram mudanças fisiológicas e comportamentais.
Apesar de ser considerado uma droga de forma geral depressora, o efeito inicial do álcool é
excitatório. Assim que entra no sistema nervoso central, o álcool causa o aumento dos níveis
de serotonina (Forman, Chou, & Strichartz, 2009) e ativação da via de recompensa, mediando
pelo sistema dopaminérgico mesocórticolímbico a sensação de prazer que é gerada durante
esta fase do consumo. É devido à excitação desta via que o álcool pode causar o
comportamento de busca pela substância (Moreau, 1996; Samson & Harris, 1992). Após o
quadro inicial de euforia, surge o efeito depressor do álcool (Rang, Dale, Ritter, & Flower,
2007), que se dá pela ação sobre a neurotransmissão GABAérgica, que é inibitória (SMITH;
OLSEN, 1995). Esse neurotransmissor (GABA) possui dois tipos de receptores, GABAA e
GABAB, apenas GABAA é estimulado pelo álcool e nesse momento, ocorre aumento no
tempo de abertura do canal e maior influxo de Cl- (Forman et al., 2009).
O consumo de álcool de forma crônica reduz o número de receptores GABAA, sendo
esse um dos efeitos que promove a tolerância à droga (Sanna et al., 1993). A decorrente busca
pela dose que continue causando os mesmos efeitos anteriores pode levar o indivíduo à
dependência. Caso o indivíduo interrompa o consumo de álcool no estágio da dependência,
ele pode apresentar sintomas da crise de abstinência, derivados da perda dos efeitos inibitórios
da droga e deficiência de receptores GABAA (Devaud, Fritschy, Sieghart, & Morrow, 1997).
Além de estimular a atividade dos receptores GABAA, o etanol também atua sobre o
receptor do glutamato, funcionando como um antagonista. O glutamato possui três receptores:
NMDA, cainato e AMPA, e embora todos sejam inibidos na presença do álcool, os receptores
NMDA são mais afetados (DeLucia, Cruz, Marin, & Planeta, 2006). O consumo crônico de
álcool acaba por promover o aumento do número de receptores glutamatérgicos (Freund &
11
Anderson, 1996; Hoffman, Lorio, Snell, & Tabakoff, 1995), o que está relacionado com a
hiperestimulação deste sistema durante a abstinência do álcool, podendo ocasionar crises
convulsivas e acidentes vasculares cerebrais (Lovinger, 1993).
Efeitos do álcool no comportamento – estudos com peixe paulistinha
O álcool afeta vários aspectos funcionais do organismo, como memória (Luchiari,
Chacon, & Oliveira, 2015), aprendizagem (Santos, Oliveira, Oliveira, Silva, & Luchiari,
2016), ansiedade (Maximino, da Silva, Gouveia, & Herculano, 2011) e locomoção (Tran &
Gerlai, 2013). Daremos ênfase ao seu efeito na função cognitiva e locomotora.
A aprendizagem é um processo contínuo, que ocorre por meio de interações com
outros sujeitos ou objetos ao longo do tempo de vida do indivíduo (Kandel & Schwartz,
2001). Aprender e lembrar o que foi aprendido é essencial para a sobrevivência em muitas
espécies. Uma vez que o animal vive uma dada experiência, o indivíduo pode alterar seu
comportamento e responder de forma mais eficiente quando enfrentar aquela mesma situação
novamente.
Roedores expostos a etanol na fase pré-natal submetidos a tarefas cognitivas de medo
condicionado demonstram atraso na resposta quando expostos ao risco (Brady, Allan, &
Caldwell, 2013). Peixes pauslistinhas expostos a altas doses de álcool apresentam prejuízo na
realização de tarefas cognitivas como tarefas de aprendizagem associativa, enquanto que
peixes sob efeito de baixas doses apresentam melhora na realização dessa mesma tarefa
(Chacon & Luchiari, 2014). Nessa mesma linha, já foi visto que doses baixas e moderada de
álcool administradas de forma aguda alteram a preferência de local de peixe paulistinha,
passando a preferir o local onde o animal foi inicialmente submetido ao álcool, mostrando o
quão recompensador é essa substância (Collier, Khan, Caramillo, Mohn, & Echevarria, 2014).
12
É sabido que o álcool tem efeito dose-dependente, doses intermediárias de álcool
(0,25% e 0,50%) aumentam a atividade locomotora de peixe paulistinha, enquanto que doses
elevadas diminuem a atividade locomotora desses animais (Gerlai, Lahav, Guo, & Rosenthal,
2000). No entanto, durante a abstinência de álcool, esses mesmos animais apresentam altos
índices de freezing, passam mais tempo no fundo do aquário e sua latência para chegar à
superfície do aquário é maior, o que caracteriza um comportamento tipo-ansioso (Egan et al.,
2009). De forma similar, roedores expostos a doses médias (1.g/Kg, 10% e 35%) de álcool,
aumentam a atividade locomotora (Brys, Pupe, & Bizarro, 2014; Jerlhag, Landgren,
Egecioglu & Dickson, 2011).
Cafeína
Metabolismo
Após o consumo, a metabolização da cafeína se inicia no trato gastrointestinal, e
após 20-30 min do seu consumo, a substância atinge níveis máximos no organismo e pode
levar de 2,5 à 10 h para total eliminação. No entanto, sua total eliminação pode variar de
acordo com diversos fatores como idade, peso corporal, ingestão de medicamentos, dentre
outros (Magkos & Kavouras, 2005).
Aproximadamente 5% da quantidade ingerida é eliminada através da urina (Kumar,
2013). Assim como no álcool, a enzima citocromo P450 atua metabolizando a cafeína, mas
nesse caso, essa ação ocorre em sua maior parte no fígado, e não no cérebro. A enzima
citocromo P450 metaboliza a cafeína em três dimetilxantinas: paraxantina, que pode aumentar
as taxas sanguíneas de glicerol e gorduras; teobromina, que provoca dilatação dos vasos
sanguíneos causando efeito diurético; e teofilina, responsável pela dilatação das vias aéreas
(também utilizada no tratamento de asma).
13
Ação da cafeína no sistema nervoso central
No cérebro, a cafeína interfere na atividade da adesonina, neurotransmissor com
efeitos inibitórios e de normalização da homeostase de diversas células (Longhi, Robson,
Bernstein, Serra, & Deaglio, 2013; Purves et al., 2010). A cafeína possui conformação
estrutural semelhante à adenosina, e uma vez que ocorre a ligação entre a cafeína e o receptor
adenosinérgico, ela inibe o receptor e bloqueia a ação inibitória da adenosina, fazendo
prevalecer os efeitos estimulantes da cafeína, como aumento da disposição, alerta e
concentração (Griffiths & Woodson, 1988; Griffiths et al., 1986).
A cafeína liga-se apenas a dois receptores de adenosina, receptor A1 e receptor A2A
(Fredholm, Ijzerman, Jacobson, Klotz, & Linden, 2001). O receptor A1 está presente em
diversas regiões do cérebro como hipocampo, córtex cerebral, cerebelo e núcleos
hipotalâmicos; e estimula a liberação de neurotransmissores como o glutamato, dopamina,
acetilcolina e serotonina, que são excitatórios e aumentam o estado de vigília e atenção
(Sheth, Brito, Mukherjea, Rybak, & Ramkumar, 2014). O receptor A2A está distribuído pelos
oligodendrócitos, microglia, bulbo olfatório, gânglios basais e regiões pré-sinápticas no
hipocampo, região onde também ocorre liberação de glutamato, noradrenalina e acetilcolina
(Sheth et al., 2014). Somada à ação nos receptores de adenosina, outras vias de atuação da
cafeína também são responsáveis por seu efeito estimulante como o bloqueio dos receptores
GABAA (receptores de ação inibitória) e mobilização do cálcio intracelular (responsável pelo
aumento de atividade locomotora).
O consumo da cafeína ativa áreas relativas ao prazer, busca pela substância, alerta,
concentração, dentre outros, mediados pelos neurônios dopaminérgicos, adrenérgicos,
glutamatérgicos, serotoninérgicos e adrenérgicos (Fredholm et al., 1999; Longhi et al., 2013).
14
Recentemente tem se noticiado uma possível ação neuroprotetora do consumo do café
orgânico, o que pode estar relacionado a menores taxas de mal de Alzheimer e Parkinson nas
sociedades da América do Sul, nas quais se consomem esse tipo de café.
Semelhante ao consumo de álcool, a cafeína também pode levar ao desenvolvimento
de dependência decorrente de seu consumo crônico (Heishman & Henningfield, 1992), no
entanto, a abstinência da cafeína é bem mais branda que a do álcool, sendo associada a dores
de cabeça, fadiga, irritação e sonolência (Kenneth Silverman, Suzette M. Evans, Eric C.
Strain, 1994; Richardson, Rogers, Elliman, & O’Dell, 1995). O consumo crônico e agudo
parece não ocasionar prejuízos à saúde (Abreu, Silva-Oliveira, Moraes, Pereira, & Moraes-
Santos, 2011), sendo este o provável motivo de não existirem restrições quanto a seu consumo
(Aguiar, Turnes, Cardoso, Vasconcelos, & Caputo, 2011; Killer, Blannin, & Jeukendrup,
2014).
Efeitos da cafeína no comportamento – estudos com peixe paulistinha
Quando comparadas as informações sobre o efeito do álcool no comportamento do
peixe paulistinha com os dados até então existentes sobre a cafeína, podemos afirmar que
pouco se sabe sobre o efeito da cafeína nesta espécie. Entretanto, os estudos realizados têm
mostrado que a cafeína pode alterar o comportamento dos animais, embora de forma mais
branda que o álcool.
A cafeína é dita uma substância benéfica para a memória. De acordo com Cunha e
Agostinho (2010), essa característica benéfica se deve não a uma melhora direta da memória,
mas à habilidade normalizadora da cafeína, ou seja, de prevenir prejuízos a memória. Animais
submetidos à exposição crônica de cafeína, ao receber uma dose aguda de canabidiol,
15
substância que prejudica a formação de memória, não apresentaram alteração nesta função
(Nazario et al., 2015), confirmando o papel normalizador da cafeína.
A cafeína também apresenta efeito dependente da dose consumida. A exposição à
dose aguda média (50mg/L) ocasiona alteração na atividade locomotora do peixe paulistinha,
diminuindo a velocidade média, indicando certo grau de ansiedade conferido pela
administração da substância (Ladu, Mwaffo, Li, Macrì, & Porfiri, 2015). De modo
semelhante, animais expostos à dose alta (85mg/L) de cafeína passam mais tempo no lado
escuro do aquário que os indivíduos controle, indicando grau de ansiedade devido à
administração da substância (Steenbergen, Richardson, & Champagne, 2011). De acordo com
Egan et al. (2009), peixes paulistinha expostos a dose aguda alta de cafeína (100 mg/L)
tiveram o desenvolvimento de comportamento tipo-ansioso, caracterizado pelo aumento na
latência para explorar o topo da coluna d’água, somada a diminuição do tempo nessa área.
Quando peixes paulistinha receberam doses de 1μM de cafeína demonstraram
aumento da atividade locomotora (velocidade e distância percorrida), já animais expostos a
dose alta de 100μM diminuíram a atividade locomotora (Gupta, Khobragade, Shingatgeri, &
Rajaram, 2014). A abstinência da cafeína é mais branda do que a do álcool, muitas vezes não
indicando fatores relacionados à sua administração. Cachat et al. (2010) demonstraram que
peixe paulistinha em abstinência de cafeína (50 mg/L), não apresenta alteração na sua
atividade locomotora e nem em seus níveis de cortisol. Diferente do álcool que é considerado
uma forte recompensa, Collier et al. (2014) testaram o paradigma de preferência por local
com diferentes doses de cafeína, e observaram que o paulistinha não apresenta
comportamento de busca pela substância, indicando a ausência de um efeito de recompensa
da cafeína no paulistinha.
16
O uso combinado de álcool e cafeína
A combinação do consumo de álcool e cafeína tem se tornado cada vez mais popular,
principalmente entre os jovens (Sionaldo E. Ferreira et al., 2004; Marczinski, 2011; O’Brien,
McCoy, Rhodes, Wagoner, & Wolfson, 2008). Esse consumo tem sido feito muitas vezes de
forma desenfreada, podendo acarretar prejuízos para o indivíduo, como diminuição no
julgamento em tomada de decisões, comportamento de risco (violência, comportamento
sexual arriscado), e maior propensão a acidentes (Marczinski, 2011; Oteri, Salvo, Caputi, &
Calapai, 2007; Thombs et al., 2010). Pouco se sabe da ação combinada dessas duas
substâncias no metabolismo, no entanto, cafeína não exerce nenhum efeito sobre o
metabolismo hepático do álcool, consequentemente, não reduz a concentração de álcool no
sangue (Sionaldo Eduardo Ferreira, de Mello, Pompeia, & Souza-Formigoni, 2006). Não
existem estudos que investiguem a ação combinada dessas substâncias no sistema nervoso
central.
Poucos estudos investigam o comportamento sob efeito dessas substâncias e a
maioria desses estudos é desenvolvido em roedores. Com relação ao afeito da combinação na
atividade locomotora, estudos indicam que esse uso pode aumentar os efeitos estimulatórios
iniciais do álcool ou reduzir efeitos depressores posteriores (Heinz, de Wit, Lilje, & Kassel,
2013; Spinetta et al., 2008), podendo levar o indivíduo a consumir mais álcool (Sionaldo
Eduardo Ferreira et al., 2006; Spinetta et al., 2008). Spinetta et al. (2008) observaram que
roedores conseguem reconhecer o odor de outros indivíduos mesmo sob efeito combinado
dessas substâncias, indicando efeito positivo dessa combinação, sugerindo que a cafeína
consegue reverter os efeitos prejudiciais ocasionados pelo álcool. Outro estudo aponta que
roedores machos submetidos à combinação dessas substâncias tiveram aumento do número de
entradas em compartimento escuro, indicando diminuição da ansiedade (Hughes, 2011).
17
Não existem investigações acerca da mistura dessas substâncias no comportamento
do peixe paulistinha, importante modelo em neuroetologia.
Peixe paulistinha como modelo animal
O peixe paulistinha (Danio rerio) é um vertebrado pertencente à classe dos
teleósteos, que surgiu a aproximadamente 350 milhões de anos (Metscher & Ahlberg, 1999).
Esses indivíduos são encontrados em riachos de águas doces e lentas no sul e leste da Ásia,
habitando águas rasas, com temperaturas que variam entre 24ºC a 38ºC (Engeszer, Patterson,
Rao, & Parichy, 2007). Os indivíduos possuem organização do sistema nervoso central
semelhante aos outros vertebrados, tendo o sistema nervoso divido em quatro partes: a medula
espinhal, que está protegida pela coluna vertebral e está localizada na parte mais caudal do
sistema nervoso central, o rombencéfalo, correspondente à parte mais caudal do encéfalo
dentro do crânio, o prosencéfalo, mais rostral e ocupando a maior área no cérebro, e o
mesencéfalo.
Diversos estudos evidenciam o peixe paulistinha como excelente modelo em estudos
translacionais de diversas áreas, por possuírem similaridade significativa com humanos, em
torno de 60-80% (Reimers, Hahn, & Tanguay, 2004; Renier et al., 2007), fazendo dele muitas
vezes um modelo alternativo ao uso de roedores. Esses indivíduos possuem o genoma
totalmente sequenciado (Howe et al., 2013; Silveira et al., 2002; Woods et al., 2000) e
compartilham diversos sistemas de neurotransmissores com mamíferos, como exemplo o
serotonérgico (Rink & Guo, 2004), dopaminérgico (Ma, 2003), glutamatérgico (Edwards &
Michel, 2002), GABAérgico (Nam, Kim, & Lee, 2004), dentre outros. Esses indivíduos
possuem rápido desenvolvimento, chegando à fase adulta três meses após fertilização
18
(Kimmel, Ballard, Kimmel, Ullmann, & Schilling, 1995). São também considerados modelo
importantes para estudos com drogas, por apresentarem rápida absorção das drogas pelo
sistema nervoso central (Goldsmith, 2004), sem a necessidade de metodologias invasivas e
altamente manipulativas.
Existem hoje cerca de 46.000 estudos realizados com o peixe paulistinha como
modelo, de acordo com a plataforma de pesquisa “web of knowledge”
(https://apps.webofknowledge.com/UA_GeneralSearch_input.do?product=UA&SID=4BSQA
XhN9rynOCvHn7b&search_mode=GeneralSearch). Dentre as diversas publicações voltadas
para esse modelo, encontramos abordagem em diversas áreas como biologia do
desenvolvimento (Kimmel et al., 1995; Kishi, 2011; Peng, Zhang, & Meng, 2012), genética
(Hu et al., 2015; Nishimura et al., 2015; Shah, Davey, Whitebirch, Miller, & Moens, 2015),
comportamento (Hu et al., 2015; Niihori et al., 2015; Santos et al., 2016), toxicologia
(Gebauer et al., 2011; Santos et al., 2016; Wu et al., 2009), doenças degenerativas (De Groef,
Dekeyster, & Moons, 2015; Lu et al., 2015; Seto et al., 2015), e desenvolvimento de drogas
terapêuticas (Rubinstein, 2003, 2006)
Objetivo Geral
O objetivo geral desse estudo foi verificar a ação do álcool, cafeína e da combinação
dessas substâncias no comportamento locomotor e no desempenho em tarefa discriminativa
envolvendo a memória no peixe paulistinha.
19
Objetivos específicos
Caracterizar o comportamento locomotor ao longo do tempo de exposição do peixe
paulistinha às doses crônicas e agudas de álcool, cafeína e da combinação dessas
substâncias (capítulo 1).
Avaliar os efeitos ansiolíticos e ansiogênicos de doses crônicas e agudas de álcool,
cafeína e da combinação dessas substâncias (capítulo 1).
Averiguar o desempenho do peixe paulistinha em tarefa de reconhecimento de objetos
quando sob efeito crônico e agudo de álcool, cafeína e da combinação dessas
substâncias (capítulo 2).
20
(Artigo a ser submetido para a revista Pharmacology, Biochemistry and Behavior) 1
2
Irish Coffee: Behavioral changes induced by alcohol and caffeine in zebrafish 3
Santos, L.C., Oliveira J.R., Oliveira, J.J., Silva, P.F., Luchiari A.C. 4
Departamento de Fisiologia, Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio 5
Grande do Norte, PO BOX 1510, 59078-970 Natal, Rio Grande do Norte, Brazil. 6
Phone: +55 84 32153409, Fax: +55 84 32119206, E-mail: [email protected] 7
8
Resumo 9
Enquanto a cafeína é conhecida por estimular o estado de alerta e diminuir a fadiga e 10
a sonolência, o álcool é um grande inibidor do sistema nervosa central. O uso combinado 11
dessas duas substâncias vem crescendo nas últimas décadas, mas pouco se sabe sobre os 12
efeitos desta combinação. Neste sentido, este estudo objetivou caracterizar o efeito de 13
diferentes doses de cafeína e do uso combinado dessas substâncias sobre o comportamento 14
do peixe paulistinha, um modelo animal estabelecido para investigações 15
neurocomportamentais por apresentar respostas comportamentais sólidas e semelhança 16
neuroquímica e fisiológica com mamíferos. Avaliamos a atividade locomotora em termos de 17
velocidade média, distância total percorrida, tempo de freezing e tempo no fundo do tanque 18
durante o período de 60 min do peixe paulistinha sob tratamento agudo, crônico e 19
abstinência de álcool e cafeína. Observamos que a dose média aguda de cafeína e seu uso 20
crônico aumentam a atividade locomotora e diminuem o comportamento tipo-ansioso, 21
enquanto a dose aguda elevada e a cessação do uso continuado provocam elevado 22
comportamento tipo-ansioso. Por outro lado, o uso de dose média de cafeína durante a 23
abstinência de álcool aumenta a atividade locomotora, enquanto a dose elevada de cafeína 24
21
provoca aumento acentuado da ansiedade. O uso de dose aguda de álcool durante a 25
abstinência de cafeína tem papel inverso, aumentando a atividade locomotora conforme a 26
dose, embora o comportamento tipo-ansioso seja ausente. Concluímos que a análise 27
temporal do comportamento é bastante sensível em permitir o estudo de alterações 28
comportamentais decorrentes da exposição ao álcool e à cafeína, e que o peixe paulistinha 29
oferece a oportunidade de estudos comportamentais e neurofisiológicos mais aprofundados 30
para o entendimento dos mecanismos de ação de drogas de uso indiscriminado pela 31
sociedade. 32
33
Palavras-chave: Atividade locomotora, álcool, cafeína, peixe paulistinha. 34
35
22
1. Introdução 36
Álcool e cafeína são substâncias psicoativas largamente consumidas pela população 37
(Fredholm et al., 1999; Goetzel et al., 2003; Gerlai, 2010). Ambas as drogas têm efeitos 38
sobre o sistema nervoso central pela interferência em uma gama de vias moleculares (Nehlig 39
et al., 1992; Hyman e Malenka, 2001; Vengeliene et al., 2008); o consumo excessivo de 40
qualquer destas substâncias pode levar ao desenvolvimento de tolerância, que pode ser 41
observada comportamentalmente (Ocakçioglu et al., 1998; Arias et al., 2012; Tran e Gerlai, 42
2013). Atualmente, estas drogas vêm sendo usadas em associação, e mais comumente o 43
consumo de cafeína é feito em busca de suas ações estimulantes para minimizar os efeitos 44
depressores do álcool após consumo excessivo. 45
O álcool é a droga de abuso legalmente comercializada mais difundidas em nossa 46
sociedade (Ferreira e Willoughby, 2008; National Institute on Alcohol Abuse and 47
Alcoholism, 2008), com alto potencial aditivo. Sabe-se que sua ingestão em doses baixas 48
está associada com a boa saúde física e mental (Weyerer et al., 2011; Chacon e Luchiari, 49
2014), ao contrário, o uso agudo ou crônico de altas doses pode provocar grandes prejuízos 50
às funções fisiológicas e cognitivas (Obernier et al., 2002; Rosenbloom e Pfefferbaum, 51
2004; Crews e Nixon, 2009; Beveridge et al., 2013; Spinello et al., 2013; Luchiari et al., 52
2015). Já a cafeína, muito menos associada a danos sistêmicos, quando usada em baixas 53
doses aumenta a frequência cardiorespiratória, acelera o metabolismo e o estado de alerta, e 54
diminui o cansaço e a fadiga (Braga e Alves, 2000; De Luca et al., 2007). No entanto, seu 55
uso indiscriminado pode causar problemas cardiovasculares, insônia e transtornos de 56
ansiedade (Striley et al., 2011). 57
As duas drogas apresentam efeito bifásico: por exemplo, doses baixas de álcool e 58
cafeína aumentam a atividade locomotora (Gerlai et al., 2000; Halldner et al., 2004), 59
23
aumentam a agressividade (Wilson et al., 2000; Gerlai et al., 2000), aceleram a tomada de 60
decisão (Killgore et al., 2007; Anderson et al., 2011) e melhoram o desempenho em tarefas 61
cognitivas (Angelucci et al., 2002; Chacon e Luchiari, 2014; Luchiari et al., 2015), enquanto 62
doses altas diminuem a locomoção (Tran e Gerlai, 2013; Halldner et al., 2004), causam 63
efeitos gerais depressores (Marin et al., 2011; Rosemberg et al., 2012), prejudicam a 64
formação de memoria (Santos et al., 2016) e o desenvolvimento normal do animal 65
(Rodriguez et al., 2014). Entretanto, esses efeitos dependem do tempo de exposição à droga: 66
o consumo diário e por longos períodos ocasiona o desenvolvimento de tolerância (Tran e 67
Gerlai, 2013; Tran et al., 2015; Luchiari et al., 2015), e a exposição aguda provoca 68
sensibilização, ou seja, doses menores passam a provocar efeitos similares àqueles de doses 69
elevadas nos próximos contatos com a droga (Blaser et al., 2010). Neste sentido, o estudo 70
dos efeitos do álcool e da cafeína no comportamento, tanto em separado quanto em 71
associação, permitirá a investigação dos mecanismos que embasam a ação destas drogas. 72
O peixe paulistinha é considerado modelo para estudos com drogas pela facilidade de 73
administração (Gerlai et al., 2000), alta homologia genética com seres humanos (Crollius e 74
Weissenbach, 2005) e similaridade do sistema nervoso central com mamíferos (Barbazuk et 75
al., 2000; Collier e Echevarria, 2013), o que permite que os resultados de pesquisas sejam 76
translacionais para doenças humanas (Kolb e Whishaw, 1998; Klee et al., 2012). O estudo 77
de Tran e Gerlai (2013) utilizou o paulistinha para caracterizar os efeitos do álcool em 78
diversas doses e tempos de exposição, mostrando mudanças temporais nos padrões de 79
natação avaliados. Embora diversos estudos sobre os efeitos do álcool no comportamento 80
tenham sido conduzidos, não há relatos sobre a caracterização comportamental dos efeito de 81
cafeína ou da combinação álcool-cafeína. Além disso, não se sabe o quanto doses elevadas 82
das substâncias combinadas podem afetar os comportamentos normais, causando reversão 83
24
da tolerância ou sensibilização. A combinação dessas duas drogas é amplamente utilizada 84
pela sociedade, e o presente estudo avalia esta questão. Apresentamos a caracterização 85
temporal detalhada das alterações comportamentais durante a fase aguda de contato com as 86
drogas, concomitante ou não com o uso crônico prévio tanto de álcool quanto de cafeína. 87
Abordamos também a cessação do uso das drogas, visando observar as principais alterações 88
da primeira fase da abstinência. 89
90
2. Materiais e métodos 91
2.1. Procedimentos gerais 92
Peixes paulistinha (Danio rerio) adultos (4 a 5 meses) adquiridos em fazenda de 93
criação local (Natal-RN) foram transferidos para o biotério do Laboratório de Peixes 94
Ornamentais (Departamento de Fisiologia da UFRN) e estocados em tanques (80x25x40cm, 95
50 L) dispostos em sistema de recirculação de água com filtragem mecânica, biológica e 96
química e desinfecção através de luz UV. A temperatura da água permaneceu em 28ºC, o pH 97
em 7,1 e o fotoperíodo adotado foi 12C:12E (claro: escuro). A alimentação ocorreu duas 98
vezes ao dia com Artêmia salina e ração comercial peletizada (38% proteína e 4% lipídeo, 99
Nutricom Pet). 100
Para o tratamento com as drogas, os animais foram transferidos para aquários 101
(50x30x30cm; 30L) sem filtração e recirculação, e a água foi trocada diariamente para 102
assegurar sua qualidade e manter as concentrações desejadas das drogas. A aeração de cada 103
aquário foi mantida com pedras porosas. A qualidade da água, composição química e 104
temperatura foram mantidas as mesmas das condições de estoque, tanto na fase de exposição 105
às drogas quanto na fase de avaliação comportamental. 106
Os testes experimentais conduzidos com os animais seguiram as normas éticas 107
25
aprovadas pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA n° 045/2015) da UFRN. 108
2.2. Administração de drogas 109
Após a transferência para aquários de 30L, dos animais foram mantidos sem drogas 110
por 5 dias para aclimatação as condições dos aquários. Nesse período, apenas 50% da água 111
foi trocada diariamente. Em seguida, a submissão às drogas teve inicio e foi feita de forma 112
contínua (24h/dia). Empregamos o protocolo 2x3 baseado em Tran e Gerlai (2013), com 113
duas doses crônicas (0mg/L e 50mg/L) e três doses agudas (0mg/L, 50mg/L e 100mg/L) 114
para os tratamentos exclusivos com cafeína. Para os grupos que receberam a combinação de 115
álcool e cafeína, modificamos o protocolo para 2X2, duas doses crônicas e duas agudas, nas 116
quais dois grupos receberam cafeína crônica e álcool agudo e outros dois grupos receberam 117
álcool crônico e cafeína aguda. As doses de cafeína e de álcool foram ministradas de forma 118
gradual para evitar mortalidade dos animais e lentamente tornar o peixe aclimatado às 119
concentrações finais das drogas (Tran e Gerlai, 2013). 120
A administração crônica durou 27 dias e a concentração final foi mantida em 50mg/L 121
de cafeína e 0,50% de álcool. Assim, inicialmente os peixes foram alojados em 12mg/L de 122
cafeína ou 0,125% de álcool durante os dias 1-4, em seguida a dose foi aumentada para 123
25mg/L de cafeína ou 0,250% de álcool para os dias 5-8, foi novamente aumentada para 124
35mg/L de cafeína ou 0,375% de álcool nos dias 9-12, e subsequentemente foi aumentada 125
para 50mg/L de cafeína ou 0,50% de álcool e mantida pelo restante do período de exposição 126
crônica (dias 13-27). 127
No 28º dia, os peixes foram individualmente expostos a uma das doses de cafeína 128
aguda (00, 50 ou 100 mg/L) ou álcool agudo (0.00, 0.50 ou 1.00%) em um tanque de 30L, 129
durante 60 min. Nesse período, o comportamento dos peixes foi registrado individualmente. 130
O delineamento 2×3 com cafeína permitiu a formação de 6 grupos experimentais, aos 131
26
quais nos referimos considerando C para a concentração crônica e A para a concentração 132
aguda, como se segue: C00A00 (n=10), C00A50 (n=11), C00A100 (n=11), C50A00 (n=12), 133
C50A50 (n=10), C50A100 (n=7). 134
O delineamento 2×2 com álcool e cafeína permitiu a formação de 4 grupos 135
experimentais, aos quais nos referimos considerando C para a concentração crônica (Cc 136
concentração crônica de cafeína e Ca concentração crônica de álcool) e A para a 137
concentração aguda (Ac concentração aguda de cafeína e Aa concentração aguda de álcool), 138
como se segue: Cc50Aa0.50 (n=10), Cc50Aa1.00 (n=13), Ca0.5Ac50 (n=10), Ca0.5Ac100 139
(n=10). 140
2.3. Registro do comportamento 141
No 28º dia de submissão às drogas, os peixes foram individualmente expostos à dose 142
aguda de cafeína ou álcool (acima descrito) durante 1 hora e o comportamento dos animais 143
foi registrado em vídeo (Sony Digital Vídeo Câmera Recorder; DCR-SX45). Os arquivos de 144
vídeo foram transferidos e analisados utilizando o software ZebTrack desenvolvido em 145
MatLab (Pinheiro-da-Silva et al., unpublished results). Para caracterização dos efeitos das 146
drogas nos indivíduos, foram considerados os seguintes parâmetros: velocidade média de 147
natação, distância total percorrida, tempo em freezing. ocupação da região do fundo do 148
aquário (entre 0 e 6 cm da base do tanque). 149
2.4. Análises estatísticas 150
Foram realizadas análises iniciais de normalidade e homoscedasticidade dos dados. A 151
análise temporal, ao longo dos 60 min, foi realizada utilizando Anova para medidas 152
repetidas (RM Anova) para cada grupo experimental. Todos os parâmetros locomotores 153
(velocidade média, distância total percorrida, freezing e tempo de permanência no fundo do 154
aquário) foram analisados quanto a media geral dos 60 min através de Anova One Way 155
27
seguida de Teste post hoc Tukey HSD para identificar diferenças entre os grupos. RM 156
Anova foi utilizada para comparar os três blocos de tempo (0-20, 21-40, 41-60 min) dentro 157
de cada grupo. Realizamos Anova Two Way para comparar o efeito das substâncias ao 158
longo dos três blocos de tempos. Para todos os testes, adotamos o nível de significância de 159
5%. 160
161
3. Resultados 162
3.1. Tratamento com cafeína 163
A análise da velocidade média sugere que a cafeína tem efeito temporal neste 164
comportamento (Fig. 1). Houve efeito dos grupos (Anova Two Way, F=31,54; p<0,001) sob 165
os comportamentos. Não houve efeito do tempo (Anova Two Way, F=0,62; p=0,54), nem do 166
tempo sob os grupos (Anova Two Way, F=0,47; p=0,87). A análise por RM Anova 167
confirmou estas observações e mostrou efeito significativo do tratamento com dose média 168
aguda de cafeína - C00A50 (F=2.66, p<0.001) e do tratamento crônico com cafeína - 169
C50A50 (F=1.83, p<0.001). O grupo controle teve resultado inverso àquele do grupo sob 170
tratamento crônico (RM Anova, F=3.54, p<0.001). A trajetória temporal dos grupos sob 171
tratamento agudo alto de cafeína (C00A100), abstinência (C50A00) e aumento agudo da 172
dose (C50A100) não foi significativo (RM Anova, C00A100: F=0.90, p=0.62; C50A00: 173
F=0.94 p=0.60; C50A100: F=1.09, p=0.31). A análise das médias dos intervalos de 20 min 174
mostrou que o tratamento agudo de 50mg/l (C00A50) tem efeito significativo no aumento da 175
velocidade média entre 20 e 40 min da exposição (RM Anova, F=4.17, p=0.03) e o efeito do 176
uso continuado de cafeína foi inverso ao grupo controle, com menor velocidade nos 20 min 177
iniciais da observação (RM Anova, C00A00: F=9.55, p=0.002; C50A50: F= 7.27, p=0.006). 178
Os outros grupos não mostraram diferença entre intervalos de tempo (RM Anova, C00A100: 179
28
F=0.06, p=0.94; C50A00: F=1.88, p=0.18; C50A100: F=0.46, p=0.64). O teste post hoc de 180
Tukey HSD feito em busca de diferenças entre os grupos indicou que houve diferença 181
significativa (p<0.05) entre C50A100 em relação a C00A50, C00A100 e C50A00, e o grupo 182
C50A50 diferiu significativamente dos grupos C00A50 e C00A100. 183
Nós também avaliamos a distância total percorrida nos 60 min de análise (Fig. 2). 184
Este parâmetro é calculado a partir da localização central do animal em relação à amostra 185
imediatamente anterior, e indica a quantidade de deslocamento do indivíduo. O padrão geral 186
de variação de deslocamento parece similar aos resultados encontrados para velocidade 187
média. Houve efeito dos grupos (Anova Two Way, F=22,69; p<0,001) sob os 188
comportamentos. Não houve efeito do tempo (Anova Two Way, F=0,49; p=0,62), nem do 189
tempo sob os grupos (Anova Two Way, F=0,30; p=0,96). A RM Anova detectou efeito 190
temporal significativo nos grupos tratados com cafeína aguda 50mg/L (F=2.46, p<0.001) e 191
cafeína crônica (F=1.84, p<0.001). O grupo controle apresentou maior distância percorrida 192
nos 20 min iniciais e diminuição deste comportamento no restante do tempo (RM Anova, 193
F=3.40, p<0.001). A mesma análise não indicou diferença temporal para os outros grupos 194
(C00A100: F= 0.91, p=0.67; C50A00: F=1.16, p=0.20; C50A100: F=0.96, p=0.56). 195
A comparação entre os blocos de 20 min indicou haver diferença significativa no 196
grupo controle (RM Anova, F=10.02, p=0.002) e no tratamento crônico com cafeína (RM 197
Anova, F=7.27, p=0.006), o controle com maior distancia percorrida nos 20 min iniciais e o 198
grupo crônico com decréscimo do deslocamento no tempo. Os outros grupos não mostraram 199
diferença entre intervalos de tempo (RM Anova, C00A50: F=3.39, p=0.056; C0A100: 200
F=0.08, p=0.92; C50A00: F=1.43, p=0.26; C50A100: F=0.46, p=0.64). O teste post hoc de 201
Tukey HSD entre os grupos mostrou que apenas o grupo C50A100 diferiu do grupo controle 202
(p=0.04), do grupo C00A50 (p<0.001), do grupo C00A100 (p<0.001) e do grupo C50A00 203
29
Fig. 1. Velocidade média dos grupos expostos a tratamento com cafeína ao longo de intervalo de 60 204 min. A letra C representa exposição crônica e os valores que seguem são as concentrações da cafeína utilizadas 205 (00 e 50mg/L). A letra A representa exposição aguda de cafeína e os valores que seguem são as concentrações 206 de cafeína usadas (00, 50 e 100mg/L). Os gráficos (a) C00A00 (n=9), (c) C00A50 (n=10), (e) C00A100 207 (n=10), (g) C50A00 (n=11), (i) C50A50 (n=9) e (k) C50A100 (n=9) apresentam velocidade média minuto a 208 minuto ± SEM (RM Anova, resultados estatísticos vide texto). Os gráficos (b), (d), (f), (h), (j) e (l) 209 representam a comparação entre os três blocos de tempo de velocidade média ± SEM (0-20, 21-40, 41-60min). 210 Letras minúsculas indicam diferença estatística entre os blocos de tempo (Rm Anova, p<0.05). 211
212
0
10
20
30 (a) C00A00 (b) C00A00
b a a
0
10
20
30 (c) C00A50 (d) C00A50
b a a
0
10
20
30 (e) C00A100 (f) C00A100
0
10
20
30 (g) C50A00 (h) C50A00
(i)C50A50 (j) C50A50
a b b
0
10
20
30
1 min - time intervals
(k)C50A100
0 10 20 30 40 50 60
0-20min 21-40min 41-60min
20 min - time intervals
(l) C50A100
Aver
age
spee
d (
cm/s
)
30
(p<0.001). Já o grupo C50A50 diferiu dos grupos C00A50 (p<0.001) e do grupo 213
C00A100 (p=0.01). 214
O comportamento de freezing foi avaliado como indicador de estresse/ansiedade. 215
Este parâmetro parece ser afetado pelo tratamento com cafeína (Fig. 3). Houve efeito dos 216
grupos (Anova Two Way, F=22,04; p<0,001) sob os comportamentos. Não houve efeito do 217
tempo (Anova Two Way, F=0,41; p=0,66), nem do tempo sob os grupos (Anova Two Way, 218
F=0,47; p=0,87). A RM Anova da trajetória temporal minuto a minuto demonstrou efeito 219
significativo da dose aguda média (50mg/L) e alta (100mg/L) de cafeína (C00A50: F=1.80, 220
p<0.001; C00A100: F=2.67, p<0.001), do pré-tratamento com cafeína e retirada da droga 221
(F=1.65, p<0.002) e do pré-tratamento com aumento da dose de forma aguda (F=2.32, 222
p<0.001). A análise dos outros grupos não indicou diferença significativa na trajetória 223
temporal (C00A00: F=0.63, p=0.99; C50A50: F=0.98, p=0.51). Quando analisamos as 224
médias de blocos de 20 min para o comportamento de freezing, a RM Anova mostrou haver 225
diferença significativa com alto freezing nos 20 min iniciais do grupo que recebeu dose 226
crônica de cafeína (F=6.14, p=0.01) e aumento progressivo do freezing nos 3 blocos de 227
tempo para o grupo em abstinência de cafeína (F=4.28, p=0.02). Os outros grupos não 228
apresentaram diferença entre os blocos de 20 min (RM Anova, C00A00: F=0.21, p=0.81; 229
C00A50: F=2.75, p=0.09; C00A100: F=0.19, p=0.83; C50A100: F=0.11, p=0.89). O teste 230
post hoc de Tukey HSD em busca de diferenças entre os grupos para cada intervalo de 20 231
min demonstrou que o grupo em abstinência de cafeína difere dos grupos controle e 232
tratamento crônico com cafeína nos intervalos de 20 a 40 min (p<0.05) e 40 a 60 min 233
(p<0.05), mas não ha diferença entre os grupos nos 20 min inicias da observação (p>0.05). 234
235
236
31
Fig. 2. Distância total percorrida dos grupos expostos à cafeína ao longo de intervalo de 60 min. A 237 letra C representa exposição crônica a cafeína e os valores que segue são as concentrações utilizadas (00 e 238 50mg/L). A letra A representa exposição aguda de cafeína e os valores que seguem são as concentrações 239 utilizadas (00, 50 e 100mg/L). Os gráficos (a) C00A00 (n=9), (c) C00A50 (n=10), (e) C00A100 (n=10), (g) 240 C50A00 (n=11), (i) C50A50 (n=9) e (k) C50A100 (n=9) apresentam distância total percorrida minuto a minuto 241 ± SEM (RM Anova, Resultados estatísticos vide texto). Os gráficos (b) C00A00 (n=9), (d) C00A50 (n=10), (f) 242 C00A100 (n=10), (h) C50A00 (n=11), (j) C50A50 (n=9) e (l) C50A100 (n=9) representam comparação entre 243 os três blocos de tempo de distância total percorrida ± SEM (0-20, 21-40, 41-60min). Letras minúsculas 244 indicam diferença estatística entre os blocos de tempo RM Anova, p<0.05). 245
0
500
1000
1500 (a) C00A00 (b) C00A00
b a a
0
500
1000
1500 (c) C00A50 (d) C00A50
0
500
1000
1500 (e) C00A100 (f) C00A100
0
500
1000
1500 (g) C50A00 (h) C50A00
0
500
1000
1500 (i) C50A50 (j) C50A50
a b
b
0
500
1000
1500
1min - time intervals
(k) C50A100
0 10 20 30 40 50 60
0-20min 21-40min 41-60min
20 min- time intervals
(l) C50A100
Tota
l dis
tance
tra
vel
ed (
cm)
32
246
Fig. 3. Tempo de freezing dos grupos expostos à cafeína ao longo de intervalo de 60 min. A letra C 247 representa exposição crônica e os valores que seguem são as concentrações da cafeína utilizadas (00 e 248 50mg/L). A letra A representa exposição aguda de cafeína e os valores que seguem são as concentrações da 249 cafeína utilizadas (00, 50 e 100mg/L). Os gráficos (a) C00A00 (n=9), (c) C00A50 (n=10), (e) C00A100 250 (n=10), (g) C50A00 (n=11), (i) C50A50 (n=9) e (k) C50A100 (n=9) apresentam freezing minuto a minuto ± 251 SEM (RM Anova, Resultados estatísticos vide texto). Os gráficos (b), (d), (f), (h), (j) e (l) representam 252 comparação entre os três blocos de tempo de freezing ± SEM (0-20, 21-40, 41-60 min). Letras minúsculas 253 indicam diferença estatística entre os blocos de tempo (RM Anova, p<0.05). 254
255
0
20
40 (a) C00A00 (b) C00A00
0
20
40 (c) C00A50 (d)C00A50
0
20
40 (e) C00A100 (f)C00A100
0
20
40 (g) C50A00 (h)C50A00
b
a
c
0
20
40 (i) C50A50 (j)C50A50
a a b
0
20
40
1 min - time intervals
(k) C50A100
0 10 20 30 40 50 60
0-20min 21-40min 41-60min 20 min - time intervals
(l)C50A100
Fre
ezin
g (
s)
33
Adicionalmente, medimos também o tempo que os animais de cada grupo 256
experimental permaneceram próximos ao fundo do tanque. Este tempo pode também ser um 257
parâmetro comportamental sensível aos efeitos da cafeína, pois depende do nível de medo e 258
da função motora dos animais (Rosemberg et al. 2012). A RM Anova demonstrou que 259
apenas os grupos C00A50 e C50A50 apresentaram diferença ao longo dos 60 minutos de 260
observação (C00A00: F=1.33, p=0.06; C00A50: F=3.24, p<0.001; C00A100: F=1.28, 261
p=0.09; C50A00: F=0.76, p=0.91; C50A50: F=2.95, p<0.001; C50A100: F=1.06, p=0.38). 262
A comparação do tempo médio total de permanência na parte inferior do tanque através de 263
Anova identificou diferença entre os grupos (F=11.44, p<0.001), sendo os grupos de 264
tratamento agudo alto (100mg/l) e pré-tratamento com aumento da dose (C50A100) que 265
tiveram os maiores tempos na área do fundo, e o grupo controle o menor tempo (Fig. 4). 266
267
268
Fig 4. Tempo médio ±SEM de permanência no fundo do tanque pelos grupos expostos à cafeína. A 269 letra C representa exposição crônica e os valores que seguem são as concentrações da cafeína utilizadas (00 e 270 50mg/L). A letra A representa exposição aguda de cafeína e os valores que seguem são as concentrações da 271 cafeína usadas (00, 50 e 100mg/L). Letras minúsculas indicam diferença estatística entre os grupos (One Way 272 Anova, p<0.05). 273
274 275 276
0
10
20
30
40
50
C00A00 C00A50 C00A100 C50A00 C50A50 C50A100
Tim
e sp
ent
in b
ott
om
are
a o
f th
e ta
nk
(s)
a
ab
c
ab ab
bc
34
3.2. Tratamento com álcool e cafeína 277
A análise de velocidade média indicou que o tratamento com combinação das 278
substâncias (álcool e cafeína) exerce efeito temporal neste comportamento (Fig. 5). Houve 279
efeito dos grupos (F=9,74; p<0,001) e dos grupos sob o tempo (F=4,20; p<0,001) nos 280
comportamentos. Não houve efeito do tempo (F=0,08; p=0,92). A análise por RM Anova 281
mostrou que o grupo Ca0.50Ac50 (F=2.66, p<0.001) apresentou variação significativa da 282
velocidade média ao longo dos 60min de análise. Os grupos Ca0.50Ac100, Cc50Aa0.50 e 283
Cc50Aa1.00 não apresentaram diferença de velocidade média na trajetória temporal (RM 284
Anova, Ca0.50Ac100: F=1.13, p=0.26; Cc50Aa0.50: F=0.90, p=0.68; Cc50Aa1.00: F=0.94, 285
p=0.60). Houve diferença significativa entre as médias de blocos de 20 min para a 286
velocidade média apenas no grupo Ca0.50Ac50 (RM Anova, F=3.58, p=0.04; Fig. 5b), 287
enquanto os outros grupos não tiveram diferenças significativas (RM Anova, Ca0.50Ac100: 288
F=0.36, p=0.70; Cc50Aa0.50: F=0.82, p=0.45; Cc50Aa1.00: F=0.34, p=0.72). O teste post 289
hoc de Tukey HSD entre os grupos mostrou que apenas o grupo Ca0.50Ac50 diferiu 290
significantemente (p<0.05) de todos os outros grupos. 291
Para a distância total percorrida, houve efeito dos grupos (Anova Two Way, F=9,67; 292
p<0,001) e dos grupos sob o tempo (Anova Two Way, F=3,98; p<0,001) nos 293
comportamentos. Não houve efeito do tempo (Anova Two Way, F=0,18; p=0,84). 294
Novamente apenas o grupo Ca0.50Ac50 apresentou diferença ao longo dos 60 minutos (RM 295
Anova, Ca0.50Ac50 F=1.44, p=0.002, Fig.6a). Os grupos Ca0.50Ac100, Cc50Aa0.50 e 296
Cc50Aa1.00 não apresentaram diferença significativa na trajetória temporal (RM Anova, 297
Ca0.50Ac100: F=1.12, p=0.28; Cc50Aa0.50: F=0.94, p=0.6; Cc50Aa1.00: F=0.99, p=0.51). 298
Apenas o grupo Ca0.50Ac50: mostrou diminuição da distância percorrida nos 20 min 299
finais de observação (RM Anova, F=4.18, p=0.04; Fig. 6b). 300
35
Fig. 5. Velocidade média dos grupos expostos a tratamento com álcool e cafeína ao longo de intervalo 301 de 60 min. A letra C representa exposição crônica ao álcool (Ca) ou cafeína (Cc) e os valores que seguem são as 302 concentrações de álcool (0.50%) ou cafeína (50mg/L) utilizadas. A letra A representa exposição aguda ao 303 álcool (Aa) ou cafeína (Ac) e os valores que seguem correspondem as concentrações de álcool (0.50% e 1.00%) 304 ou cafeína (50 mg/L e 100 mg/L) usadas. Os gráficos (a) Ca0.50Ac50 (n=9), (c) Ca0.50Ac100 (n=7), (e) 305 Cc50Aa0.50 (n=10), e (g) Cc50Aa1.00 (n=10) apresentam a velocidade média minuto a minuto ± SEM (RM 306 Anova, Resultados estatísticos vide texto). Os gráficos (b) Ca0.50Ac50, (d) Ca0.50Ac100, (f) Cc50Aa0.50, (h) 307 Cc50Aa1.00 representam comparação entre os três blocos de tempo de velocidade média ± SEM (0-20, 21-40, 308 41-60 min). Letras minúsculas indicam diferença estatística entre os blocos de tempo (RM Anova, p<0.05). 309
310 Não houve diferença significativa entre os grupos Ca0.50Ac100, Cc50Aa0.50 e 311
Cc50Aa1.00 na comparação entre os intervalos de 20min de observação (RM Anova, 312
Ca0.50Ac100: F=0.16, p=0.84; Cc50Aa0.50: F=1.10, p=0.35; Cc50Aa1.00: F=0.46, p=0.64). 313
O teste post hoc de Tukey HSD entre os grupos mostrou que o grupo Ca0.50Ac50 diferiu 314
0
30
60 (a) Ca0.5Ac50 (b) Ca0.5Ac50
b b
a
0
30
60 (c) Ca0.5Ac100 (d) Ca0.5Ac100
0
30
60 (e) Cc50Aa0.50 (f) Cc50Aa0.50
0
30
60
1min - time intervals
(g) Cc50Aa1.00
0 10 20 30 40 50 60
0-20min 21-40min 41-60min
20 min - time intervals
(h) Cc50Aa1.00
Aver
age
spee
d (
cm/s
)
36
significantemente (p<0.05) de todos os outros grupos, sendo os outros grupos (Ca0.50Ac100, 315
Cc50Aa0.50 e Cc50Aa1.00) semelhantes entre si (p<0.05). 316
Nos resultados de freezing, houve efeito dos grupos (Anova Two Way, F=2,55; 317
p=0,04) e dos grupos sob o tempo (Anova Two Way, F=4,18; p<0,001) nos 318
comportamentos. Não houve efeito do tempo (Anova Two Way, F=0,33; p=0,72). Os grupos 319
Ca0.50Ac50, Ca0.50Ac100 e Cc50Aa1.00 apresentaram diferença significativa ao longo dos 320
60min de observação (RM Anova, Ca0.50Ac50: F=1.44, p=0.02; Ca0.50Ac100: F=1.77, 321
p<0.001; Cc50Aa1.00 F=1.55, p=0.007, Fig. 7). O grupo Cc50Aa0.50 não apresentou 322
diferença significativa na trajetória temporal (RM Anova, F=1.01, p=0.46). Não houve 323
diferença significativa entre os grupos nos intervalos de 20min de observação (RM Anova, 324
Ca0.50Ac50: F=13.41, p=0.29; Ca0.50Ac100: F=0.62, p=0.56; Cc50Aa0.50: F=4.20, p=0.12; 325
Cc50Aa1.00: F=0.09, p=0.91). O teste post hoc de Tukey HSD entre os grupos mostrou que 326
o grupo Ca0.50Ac100 diferiu significantemente (p<0.05) dos outros grupos. 327
Quanto ao tempo de permanência no fundo do tanque, a RM Anova indicou que o 328
grupo Ca0.50Ac50 diferiu significativamente durante a trajetória temporal, enquanto os 329
outros grupos não diferiram (Ca0.50Ac50: F=1.95, p<0.001; Ca0.50Ac100: F=1.28, p=0.95; 330
Cc50Aa0.50: F=0.74, p=0.93; Cc50Aa1.00: F=0.73, p=0.93). O tempo médio total de 331
permanência na parte inferior do tanque não diferiu entre os grupos (Anova, F=0.57, 332
p=0.69). 333
334
335
37
Fig. 6. Distância total percorrida dos grupos expostos a tratamento com álcool e cafeína ao longo de 336 intervalo de 60 min. A letra C representa exposição crônica ao álcool (Ca) ou cafeína (Cc) e os valores que 337 seguem são as concentrações de álcool (0.50%) ou cafeína (50mg/L) utilizadas. A letra A representa exposição 338 aguda ao álcool (Aa) ou cafeína (Ac) e os valores que seguem correspondem as concentrações de álcool (0.50% 339 e 1.00%) ou cafeína (50 mg/L e 100 mg/L) usadas. Os gráficos (a) Ca0.50Ac50 (n=9), (c) Ca0.50Ac100 (n=7), 340 (e) Cc50Aa0.50 (n=10), e (g) Cc50Aa1.00 (n=10) apresentam a distância total percorrida minuto a minuto ± 341 SEM (RM Anova, Resultados estatísticos vide texto). Os gráficos (b) Ca0.50Ac50, (d) Ca0.50Ac100, (f) 342
Cc50Aa0.50, (h) Cc50Aa1.00 representam comparação entre os três blocos de tempo da distância total 343 percorrida ± SEM (0-20, 21-40, 41-60min). Letras minúsculas indicam diferença estatística (p<0.05) entre os 344 blocos de tempo (RM Anova, p<0.05). 345
346
0
1000
2000
3000 (a) Ca0.5Ac50 (b) Ca0.5Ac50
b b a
0
1000
2000
3000 (c) Ca0.5Ac100 (d) Ca0.5Ac100
0
1000
2000
3000 (e) Cc50Aa0.5 (f) Cc50Aa0.50
0
1000
2000
3000
1min - time intervals
(g) Cc50Aa1.0
0 10 20 30 40 50 60 0-20min 21-40min 41-60min
20 min - time intervals
(h) Cc50Aa1.00
Tota
l dis
tance
tra
vel
ed (
cm)
38
Fig 7. Tempo de freezing dos grupos expostos a tratamento com álcool e cafeína ao longo de intervalo 347 de 60 min. A letra C representa exposição crônica ao álcool (Ca) ou cafeína (Cc) e os valores que seguem são as 348 concentrações de álcool (0.50%) ou cafeína (50mg/L) utilizada. A letra A representa exposição aguda ao álcool 349 (Aa) ou cafeína (Ac) e os valores que seguem correspondem as concentrações de álcool (0.50% and 1.00%) ou 350 cafeína (50 mg/L e 100 mg/L) usada. Os gráficos (a) Ca0.50Ac50 (n=9), (c) Ca0.50Ac100 (n=7), (e) Cc50Aa0.50 351 (n=10), e (g) Cc50Aa1.00 (n=10) apresentam freezing minuto a minuto ± SEM (RM Anova, resultados 352 estatísticos vide texto). Os gráficos (b) Ca0.50Ac50, (d) Ca0.50Ac100, (f) Cc50Aa0.50, (h) Cc50Aa1.00 353 representam comparação entre os três blocos de tempo do freezing ± SEM (0-20, 21-40, 41-60min). Letras 354 minúsculas indicam diferença estatística entre os blocos de tempo (RM Anova, p<0.05). 355
356 357 Por fim, comparamos os comportamentos dos grupos de tratamento cruzados de 358
álcool crônico (álcool crônico + cafeína 50mg/L e álcool crônico + cafeína 100mg/L) com 359
os animais em abstinência de álcool (Ca0.50Ac00). Tanto a velocidade média quanto a 360
0
30
60 (a) Ca0.50Ac50 (b) Ca0.5Ac50
0
30
60 (c) Ca0.50Ac100 (d) Ca0.50Ac100
0
30
60 (e) Cc50Ac0.50 (f) Cc50Ac0.50
0
30
60
1 min - time intervals
(g ) Cc50Aa1.00
0 1 0 20 30 40 50 60 0-20min 21-40min 41-60min 20 min - time intervals
(h) Cc50Aa1.00
Fre
ezin
g (
s)
39
distância total percorrida foram menores para os grupos Ca0.50Ac00 e Ca0.50Ac100 do que 361
para Ca0.50Ac50 (Anova, velocidade média: F=11.33, p=0.001; Fig. 8a, distância percorrida: 362
F=8.31, p=0.002; Fig. 8b). Os tempos de freezing e no fundo do tanque foram maiores para 363
o grupo Ca0.50Ac100 do que para os outros grupos (Anova, freezing: F=9.33, p=0.001; Fig. 364
8c, tempo no fundo: F=4.09, p=0.03; Fig. 8d). 365
Fig.8. Parâmetros locomotores dos grupos expostos cronicamente a álcool e agudamente a cafeína. (a) 366
velocidade média ± SEM, (b) distância total percorrida ± SEM, (c) freezing ± SEM e (d) tempo de 367
permanência no fundo ± SEM. A letra Ca representa exposição crônica ao álcool e o valor que segue é a 368
concentração de álcool utilizada (0.50%). A letra Ac representa exposição aguda à cafeína e os valores que 369
seguem correspondem âs concentrações (00 mg/L, 50 mg/L e 100 mg/L) usadas. Letras minúsculas indicam 370
diferença estatística entre os grupos (One Way Anova, p<0.05). 371
372
A comparação entre os grupos de tratamento cruzado com cafeína crônica (cafeína 373
crônica + álcool 0.50% e cafeína crônica + álcool 1.00%) com os animais em abstinência de 374
cafeína (Cc50Aa00) diferiram quanto à velocidade média navegada (Anova, F=3.48, p=0.04; 375
0
20
40
Ca0.50Ac0.00 Ca0.50Ac50 Ca0.50Ac100
Ave
rage
sp
eed
(cm
/s)
b b
a a)
0
1000
2000
Ca0.50Ac0.00 Ca0.50Ac50 Ca0.50Ac100
To
tal d
ista
nce
tra
vele
d (
cm)
b b
a b)
0
20
40
Ca0.50Ac0.00 Ca0.50Ac50 Ca0.50Ac100
Fre
ezin
g (s
)
b b
a c)
0
30
60
Ca0.50Ac0.00 Ca0.50Ac50 Ca0.50Ac100 Tim
e sp
ent
in t
he
bo
tto
m a
rea
of t
he
tan
k (
s)
a
b ab
d)
40
Fig. 9a) e quanto à distância total percorrida (Anova, F=3.65, p=0.04; Fig. 9b), sendo apenas 376
o grupo Cc50Aa00 diferente do grupo Cc50Aa1.00. Os comportamentos de freezing e tempo 377
no fundo do tanque não diferiram entre os grupos (Anova, freezing: F=0.99, p=0.38; Fig. 9c, 378
tempo no fundo: F=2.40, p=0.11; Fig. 9d). 379
380
Fig. 9. Parâmetros locomotores dos grupos expostos cronicamente a cafeína e agudamente a álcool. (a) 381
velocidade média ± SEM, (b) distância total percorrida ± SEM, (c) freezing ± SEM e (d) tempo de 382
permanência no fundo ± SEM. A letra Cc representa exposição crônica à cafeína e os valor que segue é a 383
concentração de cafeína (50mg/L) utilizada. A letra Aa representa exposição aguda ao álcool e os valores que 384
seguem correspondem às concentrações de álcool (0.00, 0.50% e 1.00%) usadas. Letras minúsculas indicam 385
diferença estatística entre os grupos (One Way Anova, p<0.05). 386
387
4. Discussão 388
Neste trabalho caracterizamos variações no padrão locomotor do peixe paulistinha 389
0
5
10
Cc50Aa0.00 Cc50Aa0.50 Cc50Aa1.00
Ave
rage
sp
edd
(cm
/s) ab
b
a a)
0
300
600
Cc50Aa0.00 Cc50Aa0.50 Cc50Aa1.00
To
tal d
ista
nce
tra
vele
d (
cm) a
b
ab
b)
0
15
30
Cc50Aa0.00 Cc50Aa0.50 Cc50Aa1.00
Fre
ezin
g (s
)
c)
0
20
40
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em resposta à cafeína e à combinação de cafeína e álcool, em diferentes doses e tratamentos 390
ao longo do tempo. Observamos que a cafeína tem efeito temporal dose-dependente na 391
atividade locomotora e em parâmetros indicadores de comportamento tipo-ansioso no 392
paulistinha, destacando-se o aumento de atividade locomotora e diminuição da ansiedade 393
decorrente das doses média aguda e do tratamento crônico com cafeína, bem como o 394
aumento do comportamento tipo-ansioso da dose alta aguda e da abstinência de cafeína. 395
Além disso, a exposição ao álcool durante a abstinência de cafeína promoveu diminuição 396
crescente (decorrente da dose) no padrão locomotor sem concomitante indução de 397
comportamento tipo-ansioso, enquanto a exposição à cafeína durante a abstinência de álcool 398
induziu aumento da atividade locomotora e decréscimo de ansiedade apenas na dose média 399
(50mg/L). Este é o primeiro estudo a apresentar a avaliação comportamental temporal dos 400
efeitos da exposição aguda e crônica da cafeína no peixe paulistinha. 401
A dose aguda média de cafeína altera o comportamento do peixe paulistinha. A 402
cafeína é conhecida por sua ação estimulante (De Luca et al., 2007), mas esse efeito varia de 403
acordo com a dose consumida. Roedores submetidos a dosagens agudas médias aumentam a 404
atividade locomotora, enquanto dosagens altas promovem sua diminuição, indicando efeito 405
dose dependente (Angelucci et al., 2002). Em peixes, estudos têm encontrado resultados 406
divergentes: Steenbergen et al. (2011) observaram que peixes paulistinha expostos a 85 407
mg/L de cafeína durante 5 min não apresentam modificação do padrão locomotor e passam 408
mais tempo no compartimento escuro do tanque (resposta relacionada à ansiedade), 409
enquanto Richendrfer et al. (2012) relatam diminuição da velocidade média em indivíduos 410
submetidos à dose de 100 mg/L ao longo de 1h de observação. Tais diferenças podem 411
decorrer de variações metodológicas aplicadas por cada estudo, incluindo diferentes doses e 412
tempo de exposição, o que pode ter contribuído para a diferença nos resultados. Semelhante 413
42
ao nosso estudo, Ladu et al. (2015) utilizaram dose aguda média de 50 mg/L durante 40min, 414
mas, contrário ao nosso resultado esta dose reduziu a locomoção. 415
Em nosso estudo, o tratamento crônico por 28 dias com cafeína (C50A50) induziu ao 416
aumento da atividade locomotora (Fig. 1i e j; Fig. 2i e j) ao longo do registro do 417
comportamento. Alguns outros estudos apresentam efeito resposta comportamental 418
semelhante ao grupo controle, sugerindo que o efeito estimulante da cafeína na atividade 419
locomotora desaparece quando seu consumo é contínuo, caracterizando o desenvolvimento 420
de tolerância a essa substância (Meliska et al., 1990; Abreu et al., 2011; Ruiz-Medina et al., 421
2013). Entretanto, a adaptação comportamental a uma droga pode ser afetada pelo contexto; 422
um fator não farmacológico, como o ambiente no qual o animal está inserido, pode alterar a 423
resposta à droga (Mattson et al., 2008; Siegel e MacRae, 1984). A tolerância a uma 424
substância pode ser maior quando ela é administrada repetidamente no mesmo ambiente 425
(Siegel e MacRae, 1984) enquanto é mais evidente a ocorrência de sensibilização quando o 426
contexto é novo (Badiani et al., 1995). Mattson et al. (2008) observaram que não só a 427
atividade locomotora em ratos submetidos a cocaína é modulada pela mudança do ambiente, 428
mas diferentes áreas cerebrais são ativadas quando o ambiente de submissão a droga é 429
modificado. Em nosso estudo, grupos de animais foram submetidos a 27 dias de tratamento 430
crônico com cafeína e, no 28o dia, os animais foram individualmente observados em 431
ambiente separado. Assim, acreditamos que a alteração ambiental pode ter sido responsável 432
pela resposta de sensibilização observada através do aumento da locomoção neses animais. 433
Esses resultados são corroborados pela resposta de freezing (Fig. 3i e j), na qual houve 434
maior incidência de freezing nos 20 min iniciais de observação, indicando sensibilização à 435
droga relacionada ao contexto. 436
O aumento de atividade locomotora após o consumo de cafeína se deve ao bloqueio 437
43
dos receptores de adenosina do tipo A2 (El Yacoubi et al., 2000), impedindo a ação inibitória 438
da adenosina no sistema nervoso (Dunwiddie e Masino, 2001). O papel antagonista da 439
cafeína produz efeitos que em geral são estimuladores do sistema nervoso central e 440
ativadores da transmissão dopaminérgica (Daly e Fredholm, 1998; Kirch et al., 1990; 441
Nehlig, 2010). Outro evento que ocorre no momento da ingestão da cafeína e que causa 442
aumento de atividade locomotora é a inibição da fosfodiesterase (enzima que hidroliza o 443
AMPc), que promovem liberação de cálcio das reservas intracelulares e interfere na 444
sensibilidade dos receptores GABA (Ribeiro e Sebastião, 2010). 445
Enquanto o comportamento locomotor (vel. média e distância percorrida) do grupo 446
em abstinência de cafeína foi semelhante ao grupo controle, a resposta de freezing se 447
mostrou crescente ao longo dos 60 min de observação. Em humanos, a abstinência de 448
cafeína tem sido associada a efeitos negativos como fadiga, dores de cabeça e ansiedade 449
(Hughes et al., 1991; Silverman et al., 1992; Khaliq et al., 2012; Rogers et al., 2013). A 450
interrupção do consumo de cafeína aumenta a sensibilidade à adenosina, o que causa 451
letargia, sonolência e altera a atividade cerebral (Jones et al., 2000; Rogers et al., 2013). 452
Roedores tratados com doses médias de cafeína durante 21 dias apresentam maiores níveis 453
de imobilidade e diminuição de níveis de serotonina e seus metabólitos quando em 454
abstinência da droga (Khaliq et al., 2012), o que pode indicar estado de ansiedade. Contrário 455
ao nosso resultado, Cachat et al. (2010) não encontraram nenhuma alteração no 456
comportamento de freezing e nos níveis de cortisol em paulistinha quando em 12 h de 457
abstinência do tratamento por 7 dias com cafeína. Deste modo, acreditamos que os efeitos da 458
cafeína sejam decorrentes do tempo de exposição à droga, que deve provocar inibição 459
adenosinérgica crescente e, no pico de abstinência observado em nosso estudo (60 min sem 460
a droga após 27 dias de uso continuado), o aumento da atividade da adenosina deve ter 461
44
provocado o incremento do comportamento tipo-ansioso. 462
O tempo que o animal permanece no fundo do aquário também é considerado um 463
comportamento indicador de ansiedade (Cachat et al., 2010). Apesar do aumento no 464
comportamento de freezing, o tempo que o grupo abstinência permaneceu no fundo do 465
tanque foi semelhante ao controle. Esse parâmetro foi mais sensível em demosntrar 466
comportamenti tipo-ansioso nos grupos que receberam a dose aguda alta de cafeína 467
(C00A100 e C50A100). Esses resultados corroboram estudos sobre o efeito ansiogênico da 468
cafeína (Egan et al., 2009; Steenbergen et al., 2011). 469
A cafeína é uma substância amplamente utilizada pela sociedade (Fredholm et al., 470
1999) e, se utilizada moderadamente (até 200 mg/dia em média) pode trazer diversos 471
benefícios, como melhora no desempenho de tarefas (Abreu et al., 2011; Aguiar et al., 472
2011), no entanto o uso elevado e abusivo pode inibir estes efeitos (Burgess, 1982). 473
Além da cafeína já encontrada em chás, refrigerantes, chocolates e no próprio café, o 474
uso dessa substância combinada ao álcool tem se mostrado cada vez mais comum entre 475
jovens (O’Brien et al., 2008; Oteri et al., 2007). A cafeína é tanto utilizada para reverter os 476
efeitos depressores de altas doses de álcool, como potencializar os efeitos excitatórios de 477
doses baixas do álcool, ou ainda o consumo do álcool e da cafeína é feito por indivíduos que 478
ingerem essas drogas em altas doses com regularidade (Ferreira et al., 2004). Esse consumo 479
combinado dessas drogas feito de forma indiscriminada pode provocar sintomas como 480
diarreia, náusea, vômito, fadiga, enxaqueca e aumento dos batimentos cardíacos (Ferreira et 481
al., 2006; Finnegan, 2003; O’Brien et al., 2008; Thombs et al., 2010). No entanto, alguns 482
estudos relatam efeitos cognitivos benéficos do uso combinado das substâncias: Gulick e 483
Gold (2009) sugerem que o álcool pode bloquear os efeitos ansiogênicos da cafeína, e Heinz 484
et al. (2013) propõem que o uso de cafeína recobra a reatividade perdida devido ao consumo 485
45
de álcool. 486
Em nosso estudo, o grupo tratado cronicamente com álcool e sujeito aos efeitos 487
agudos de dose média de cafeína (Ca0.5Ac50) apresentou aumento da atividade locomotora e 488
diminuição do comportamento tipo-ansioso (freezing) decorrente da abstinência do álcool 489
(Fig. 8). A retirada do álcool após o uso continuado leva ao desenvolvimento da síndrome de 490
abstinência, caracterizada pelo surgimento de comportamento tipo-ansioso no paulistinha 491
(Cachat et al., 2010; Tran et al., 2015). Nossos resultados mostram que dose moderada de 492
cafeína durante a abstinência do álcool decresce o quadro de ansiedade dos animais, e 493
aumenta a atividade locomotora, o que não pode ser observado para a dose alta de cafeína 494
(Figs. 5, 6 e 8). A dose aguda alta de cafeína induz ao comportamento tipo-ansioso, reduz a 495
locomoção e, em muitos casos provoca comportamento semelhante à convulsão e posterior 496
morte dos indivíduos. A mesma reatividade foi observada por Rodriguez et al. (2014) em 497
larvas de peixe paulistinha sob ação de altas doses de cafeína. É sabido que a adenosina 498
regula a atividade de vários neurônios, como os glutamatérgicos; se o efeito da adenosina é 499
bloqueado, a transmissão glutamatérgica aumenta e consequentemente a resposta excitatória 500
(Fisone et al., 2004; Nehlig et al., 1992). 501
Durante a abstinência do álcool, a atividade glutamatérgica também é alta. A soma 502
desses efeitos pode gerar o resultado observado no comportamento dos animais, embora na 503
dose moderada isto tenha ocorrido de forma mais branda e não prejudicial aos indivíduos. 504
Santos et al. (2016) verificaram que dose alta de cafeína durante a abstinência do álcool 505
prejudica a aprendizagem de animais, além de causar morte, mas mostraram que a dose 506
moderada de cafeína permite desempenho cognitivo comparável ao grupo controle. 507
A abstinência da cafeína também tem elevado efeito ansiogênico, com principal 508
efeito sobre o aumento do freezing (Fig. 3). A exposição ao álcool (dose moderada ou alta) 509
46
não alterou esse parâmetro ou o tempo de permanência do animal na área basal do tanque, 510
mas induziram a decréscimo progressivo da velocidade média e da distância total percorrida 511
(Fig. 9). Esse resultado provavelmente se deve ao efeito depressor do álcool. O álcool possui 512
efeito dose-dependente na atividade locomotora do paulistinha, doses intermediárias (0,25 a 513
0,50%) aumentam a atividade, enquanto dose alta de 1,00% diminui a atividade devido aos 514
efeitos sedativos da droga (Gerlai et al., 2000; Chacon e Luchiari, 2014; Luchiari et al., 515
2015). Desta forma, o uso de doses agudas de álcool não são eficientes em reduzir os efeitos 516
da abstinência de cafeína (Fig. 9), como também não promovem qualquer beneficio em 517
tarefa cognitiva (Santos et al., 2016). 518
Este trabalho é o primeiro a avaliar temporalmente a ação da cafeína em peixe 519
paulistinha e apresentar os efeitos do uso combinado de cafeína e álcool, combinação esta 520
bastante usual na sociedade atual. Como demonstrado para outras substâncias psicoativas, o 521
efeito da cafeína depende da dose e do tempo de exposição, embora não tenhamos registrado 522
algum prejuízo grave da sua administração. Já a combinação comum entre álcool e cafeína 523
pode ser altamente deletéria, como observado no uso continuado de álcool e posterior 524
exposição à cafeína em dosagem elevada. Os dados existentes sobre os efeitos da cafeína em 525
paulistinha ainda são escassos, principalmente quando comparamos com o que se sabe sobre 526
o álcool. Dentre a literatura disponível, os dados são divergentes e inconclusivos, sendo 527
necessários maiores investimentos em estudos nesta temática, incluindo mais doses e 528
combinações que viabilizem o estudo dos efeitos de ambas as drogas agindo ao mesmo no 529
organismo. Ainda assim, destacamos o paulistinha como modelo translacional e eficiente 530
para esse tipo de estudo e reiteramos efeitos potenciais de doses moderadas das substancias 531
aqui estudadas. Como já dito pelo médico e alquimista Paracelso (1493-1541), “somente a 532
dose correta diferencia o veneno do remédio”. 533
47
534
Agradecimentos 535
Agradecemos a J.P.S Lima pelo suporte técnico com os dados coletados. Esse estudo 536
foi financiado pelo Cnpq (Universal 481396/2012-8). 537
538
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Pharmacology, Biochemistry and Behavior 143 (2016) 34–43
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Irish coffee: Effects of alcohol and caffeine on object discriminationin zebrafish
Luana C. Santos, Julia Ruiz-Oliveira, Jéssica J. Oliveira, Priscila F. Silva, Ana C. LuchiariDepartamento de Fisiologia, Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, PO BOX 1510, 59078-970 Natal, Rio Grande do Norte, Brazil
E-mail address: [email protected] (A.C. Luchi
http://dx.doi.org/10.1016/j.pbb.2016.01.0130091-3057/© 2016 Elsevier Inc. All rights reserved.
a b s t r a c t
a r t i c l e i n f oArticle history:Received 17 December 2015Received in revised form 27 January 2016Accepted 31 January 2016Available online 2 February 2016
Many studies regarding the effects of drugs investigate the acute and chronic use of alcohol, but only a fewaddress the effects of caffeine and alcohol combined to the performance of the zebrafish in cognitive tasks. Thezebrafish is an important model for studying the effects of drugs on learning, because it has large genetic similar-ities to humans and the non-invasive administration of the substances favors translational bias of research. In thisstudy, we observed the effects of alcohol and caffeine on zebrafish cognition through an object discriminationtest. We noticed that animals subjected to acute alcohol dose and those under alcohol or caffeine withdrawaldid not show discrimination. When fish were treated with associated alcohol and caffeine, those chronicallytreated with alcohol and subjected to moderate acute dose of caffeine showed learning of the task. Our resultsreinforce the harmful effects of the alcohol use on cognitive tasks, and suggest that continued use of highdoses of caffeine cause cognitive impairment during withdrawal of the substance. However, the acute use ofcaffeine appears to reverse the harmful effects of alcohol withdrawal, allowing discriminative performanceequivalent to control fish. Finally, we reiterate the use of zebrafish as a model for drug effects screening andsearch for active compounds that modulate the alcohol and caffeine effects.
© 2016 Elsevier Inc. All rights reserved.
Keywords:Psychoactive drugsAlcoholCaffeineDiscriminationDanio rerioMemory
1. Introduction
The zebrafish has gained increasing popularity in behavioral brainresearch due to its practical simplicity, elaborated brain structure(Klee et al., 2012; Kolb and Whishaw, 1998) and neurochemistry(Gerlai et al., 2009) that offers translational relevance to humans(Crollius and Weissenbach, 2005). This species is a very prolific smallvertebrate that, due to its size and the social nature, can be held inlarge numbers in small rack systems (up to 4000 fish in 250 Lwater vol-ume), demanding little cost and technical maintenance. In addition, thezebrafish shares manymolecular pathways, genes and protein productswithmammals (Faraco et al., 2006; Holzschuh et al., 2001; Kaslin, 2004;Kaslin and Panula, 2001; McLean and Fetcho, 2004; Mueller et al., 2004;Prober et al., 2006). Moreover, the majority of the genes already identi-fied in this species is conserved and have homologs in mammals (Cerdàet al., 1998; Crollius and Weissenbach, 2005), which makes it an idealmodel organism for embryology, development and disease studies(Sison andGerlai, 2010). A large number of genetic tools have been pro-duced for the zebrafish and genetic knowledge has been accumulated(Ackerman et al., 2009; Welsh et al., 2009). These materials have beensuccessfully used for the examination of brain function and the develop-ment of brain diseases (Kalueff et al., 2014), and the zebrafish has beenaccepted as one of the best research animals for high throughput
ari).
screening in many areas of study (Gebauer et al., 2011; Gerlai, 2011;Holzschuh et al., 2001). In the past decade, many studies approachedthe genetics of behavior and brain function of the zebrafish, but only afew attempted to study learning processes (Fernandes et al., 2014;Sison and Gerlai, 2010).
Learning is an important feature that allows the acquisition of newskills or concepts from experience, possibly due to neuronal plasticity(Gould, 2010; Kolb and Whishaw, 1998). Learning capacity is mainlyaffected by physiological and neural changes due to psychoactive druguse (Gould, 2010). Amongst licit drugs, alcohol and caffeine are the psy-choactive substances most widely used by the society (Fredholm et al.,1999; Frances and Garfild, 2006). The alcohol develops a biphasic re-sponse, excitatory in the beginning and then depressive; the alcohol ef-fects depend on the dose and exposure regime (Tran and Gerlai, 2013).For instance, low doses of alcohol cause increase on locomotor activ-ity in zebrafish while higher doses lead to the opposite response(Gerlai et al., 2000). Also the effects of alcohol on the cognitive pro-cesses seem to be benefic in low doses and harmful in higher doses(Chacon and Luchiari, 2014). Moreover, while acute doses maycause sensitivity (Blaser et al., 2010), chronic exposure to alcoholmay develop tolerance to the substance (Luchiari et al., 2015a, b;Tran and Gerlai, 2013; Tran et al., 2015) and throughout long timecan cause irreversible dementia known as Wernicke–Korsakoff syn-drome (Savage et al., 2000).
Caffeine, as alcohol, shows a biphasic effect depending on thedosage. Low and medium doses increase locomotor activity while high
35L.C. Santos et al. / Pharmacology, Biochemistry and Behavior 143 (2016) 34–43
doses result in robust anxiogenic effects that includes decreasedlocomotion and increased freezing and erratic movements (Eganet al., 2009; Marin et al., 2011). Although many studies regard thebehavioral effects of caffeine (Cachat et al., 2010; Marin et al.,2011; Steenbergen et al., 2011), there are a lack in the literatureconcerning the chronic and acute consumption effects on memoryacquisition and consolidation. Amongst them, some suggests thatacute low doses of caffeine might improve memory retention inrodents (Angelucci et al., 2002), however the results are still incon-clusive and deserve more studies.
Therefore, while few studies have investigated learning andmemoryunder the effects of alcohol (Chacon and Luchiari, 2014; Fernandes et al.,2014; Luchiari et al., 2015a, b) and caffeine (Collier et al., 2014;Steenbergen et al., 2011), there are no reports of works that addressthe effects of both drugs combined on the cognitive responses. Knowingthat these drugs are indiscriminately used and, many times, used inassociation for the pursuit of potentializing the excitatory effects of alco-hol or lessening its later depressive effects (Heinz et al., 2013; Spinettaet al., 2008), this study proposes to test the influence of the acute andchronic alcohol and caffeine exposure in the performance of zebrafishon a cognitive task. For this aim, we used a one-trial-learning protocol,because the memory formed after a single exposure to an event ismore sensible and easily disrupted by the use of psychostimulantsubstances than memories formed by sequential exposure to stimuli(conditioning) (Oliveira et al., 2015).
2. Materials and methods
2.1. General procedures
For the study, 182 adult zebrafish Danio rerio (4 to 5 months; wild-type) were acquired from a local breeding farm (Natal-RN) and keptin high-density system tanks in the vivarium of the Ornamental FishLaboratory (Physiology Department — UFRN).
Each four 50 L-tanks formed a recirculating systemwithmulti-stagefiltration including a mechanical filter, a biological filter, activatedcarbon filter, and a UV light sterilizing unit. The animals were kept inthe tanks (onefish/L),with aerated and filteredwater, and temperature,pH and oxygen measured regularly. Photoperiod was set on 12 L:12D(Light:Dark) cycle and light intensity was around 250–30 lx. Feedingfrequency was twice a day ad libitum with brine shrimp and commer-cial flake diet. The Ethical Committee for Animal Use of Federal Univer-sity of Rio Grande do Norte gave permission for all animal procedures(CEUA 046/2015).
Table 1Summary of the alcohol and caffeine exposure treatments used for zebrafish.
Alcohol exposure Acute doses (
0.00%
Chronic doses(1st to 27th days)
0.00% C0.00A0.00 (n0.50% C0.50 A0.00 (
Caffeine exposure Acute doses (
00 mg/L
Chronic doses(1st to 27th days)
00 mg/L C00A00 (n =50 mg/L C50A00 (n =
Alcohol and caffeine exposure Acute doses (
Alcohol 1.00%
Chronic doses(1st to 27th days)
Alcohol 0.50% (Ca) –
Caffeine 50 mg/L (Cc)Cc50Aa0.50 (nCc50Aa1.00 (n
2.2. Alcohol and caffeine exposure
Seven days before the beginning of the drugs exposure, animalswere transferred from the stock tanks to 30 L tanks (50 × 30 × 30 cm,width × height × length) composing the groups for drugs treatments.The tanks were kept with constant aeration given by air stones andthe entire volume was exchanged in 30% every day to assure qualityconditions.
The drugs exposure followed the 2 × 3 experimental design pro-posed by Tran and Gerlai (2013) with two chronic and three acutedoses. For the alcohol treatments, we used 0.00% and 0.50% for thechronic doses and 0.00%, 0.50% and 1.00% for the acute doses(Table 1). For the caffeine treatments, we used 00 mg/L and 50 mg/Lfor the chronic doses and 00 mg/L, 50 mg/L and 100 mg/L for theacute doses (Table 1). For the groups exposed to alcohol and caffeinecombined, we used a 2 × 4 protocol, two chronic doses (0.50% alcoholor 50 mg/L caffeine) and four acute doses (0.50 and 1.00% alcohol or50 and 100 mg/L caffeine), in which two groups received chronic caf-feine and acute alcohol doses and two other groups received chronic al-cohol and acute caffeine doses (Table 1).
To achieve the final concentration of 0.50% alcohol and 50 mg/Lcaffeine, we applied a drug escalation procedure that minimizes themortality and allows the fish to acclimatize to the drug condition(Tran and Gerlai, 2013). The dosage was progressively increased alongthe days: 1/4 of the dose for the first four days, after which the dosewas increased to 1/2 for days 5–8, reached 3/4 for days 9–12 and thenwas increased to the final concentration of 0.50% alcohol or 50 mg/Lcaffeine for the remaining 15 days. The chronic exposure lasted27 days, 24 h per day. On the last 5 days (23rd to 27th day) fish weretransferred to a smaller tank for thehabituation phase of thediscrimina-tion task. During these days, the drug concentration in the habituationtank corresponded to the chronic dose for each particular group.
On the 28th and 29th days, fish were individually exposed to one ofthe acute doses for 1 h in a 2 L tank. After the acute exposure on the 28thday, fish returned to the previous chronic dosewhere it was held beforeuntil the 29th day. On these two days, zebrafishwere individually testedfor the objects discrimination (28th day: memorization phase and 29thday: discrimination phase). During the cognitive tests, drugs concentra-tion in the tank corresponded to the acute dose for each particular fish.
To name each experimental group from 2 × 3 alcohol treatment,2 × 3 caffeine treatment and 2 × 4 alcohol + caffeine treatment, weused C to refer to the chronic concentration and A to refer to the acuteconcentration. For the alcohol treatment, animals were divided intothe following groups: C0.00A0.00 (control group, n = 17), C0.00A0.50(acute 0.5% group, n = 18), C0.00A1.00 (acute 1.0% group, n = 12),
28th and 29th days)
0.50% 1.00%
= 17) C0.00A0.50 (n = 17) C0.00A1.00 (n = 9)n = 9) C0.50A0.50 (n = 13) C0.50 A1.00 (n = 13)
28th and 29th days)
50 mg/L 100 mg/L
17) C00A50 (n = 11) C00A100 (n = 11)12) C50A50 (n = 10) C50A100 (n = 7)
28th and 29th days)
(Aa) Caffeine 100 mg/L (Ac)
Ca0.50Ac50 (n = 9)Ca0.50Ac100 (n = 11)
= 13)= 13)
–
36 L.C. Santos et al. / Pharmacology, Biochemistry and Behavior 143 (2016) 34–43
C0.50 A0.00 (withdrawal group, n = 9), C0.50A0.50 (chronic group,n = 13), C0.50 A1.00 (increased dose group, n = 13).
For the caffeine treatment, fish were divided into the followinggroups: C00A00 (control group, n = 17), C00A50 (acute 50 mg/L,n = 12), C00A100 (acute 100 mg/L, n = 11), C50A00 (withdrawalgroup, n = 12), C50A50 (chronic group, n = 11), C50A100 (increaseddose group, n = 8).
The alcohol and caffeine combined design produced four treatmentgroups we refer to according to the chronic concentration of alcohol(Ca) and caffeine (Cc), and the acute concentration of alcohol (Aa)and caffeine (Ac) as follows: Ca0.50Ac50 (n = 9), Ca0.50Ac100 (n =11), Cc50Aa0.50 (n = 13), Cc50Ac1.00 (n = 13).
2.3. Object discrimination test
The object discrimination testwas based on the experimental designproposed by Oliveira et al. (2015) and consisted in three phases: habit-uation (23rd to 27th day of the drugs treatment), memorization (28thday) and discrimination (29th day).
The habituation phase lasted 5 days. The animalswere transferred tothe testing tank (40 × 20 × 25 cm) and were allowed to explore it for20 min (drugs doses were kept according to the chronic treatment).At first, fish were placed in the tank in groups of 6 to minimize isolationstress. On the following days, the number of fish allowed to explore thetank was progressively reduced to reach 1 fish/tank on the last day ofhabituation. After each habituation period fish were placed back ineach particular chronic treatment tank.
The drugs acute doseswere administrated on the 28th and 29th daysfor 40min before (in a 2 L tank) and 20 min during the test (in the test-ing tank), totalizing 1 h exposure. After the end of the memorizationphase the animals were transferred back to the chronic treatmenttank until the discrimination phase.
On thememorization phase (day 28) two 3D objects named A and Bwith same color, size and shape, were introduced in the tank, each onepositioned next to each smaller wall and around 30 cm away from eachother. Fish were individually allowed to explore the tank with the twoobjects for 20 min. Behavior was recorded from above using a handycam (Sony Digital Video Camera Recorder; DCR-SX45). After that, fishreturned to its chronic treatment tank.
On the discrimination phase (day 29), object B was replaced by anew one named object C. The new object showed the same size andshape but different color from the former. Fish were first exposed tothe acute dose for 40 min and then transferred to the tank to exploredthe objects for 20min. Behavior was registered in video. In both phases,we considered that animal's permanence in a 10 cm area around theobjects, characterizes exploration (Lucon-Xiccato and Dadda, 2014).
2.4. Data and statistical analysis
The behavioral data were analyzed using a tracking software devel-oped in MatLab. The following parameters were evaluated: time fishspent exploring each object, total distance traveled, freezing and aver-age swimming speed.
We compared the objects exploration time inmemorization and dis-crimination phases, and also between the two phases using Student ttest. All the locomotor parameters were statistically compared usingOne Way Anova. We considered the probability level of p b 0.05 forstatistical significance.
3. Results
3.1. Alcohol treatment
In the memorization phase, the control group (C0.00A0.00) did notshowany difference betweenobject A andB exploration time (Student'st test, t =−1.29, p= 0.22; Fig. 1a). In the discrimination phase, control
fish (C0.00A0.00) explore more the new object (object C) than theknown one (object A) (Student's t test, t = 2.78, p = 0.01). Fish ex-plored more object C in the discrimination phase than object B in thememorization phase (Student's t test, t = 1.94, p = 0.05).
The acute 0.50% alcohol group (C0.00A0.50) explored significantlymore object B than object A in the memorization phase (Student's ttest, t=−2.51, p= 0.02; Fig. 1b). In the discrimination phase, both ob-jects were explored equally (Student's t test, t =−2.00, p= 0.05). Fishexplored more object C in the discrimination phase than the object B inthememorization phase (Student's t test, t =−2.17; p = 0.04, Fig. 1b).
Both acute 1.00% alcohol group (C0.00A1.00; Fig. 1c) andwithdraw-al group (C0.50 A0.00; Fig. 1d) did not show differences in the explora-tion time in the memorization phase (Student's t test, acute 1.00%:t = −0.62, p = 0.67; withdrawal: t = −0.52, p = 0.62). When thenew object was displayed, the groups also did not differ in the explora-tion (Student's t test, acute: t= 1.40, p= 0.20; withdrawal: t=−0.62,p = 0.56).
The animals in the chronic group (C0.50A0.50) did not show differ-ence in the exploration of the objects in the memorization phase(Student's t test, t = −0.58, p = 0.58; Fig. 1e). In the discriminationphase, fish showed higher exploration of object C than object A(Student's t test, t =−6.60, p b 0.001). Object A explorationwas higherin the memorization than in the discrimination phase (Student's t test,t = 2.91, p = 0.01).
The increased dose group (C0.50 A1.00) did not show difference inexploration of objects A and B in the memorization phase (Student's ttest, t = 0.34, p = 0.71; Fig. 1f). There was higher exploration of objectC than object A in the discrimination phase (Student's t test, t = 2.24,p = 0.04). This group explored more object C in the discriminationphase than object B in the memorization phase (Student's t test,t = −2.10, p = 0.05).
The highest values of average swimming speed were observed forC0.50 A1.00 and C0.00A1.00 groups (One Way Anova, memorizationphase: F = 4.88, p b 0.001; discrimination phase: F = 3.41, p = 0.01;Fig. 2a). Both groups C0.00A1.00 and C0.50 A1.00 showed differencein average speed between thememorization and discrimination phases(Student's t test, C0.00A1.00: t = 2.65, p= 0.05; C0.50 A1.00: t = 3.0.5,p=0.01). Regarding the total distance traveled, groups C0.00A1.00 andC0.50 A00 showed the lowest values, while C0.5 A1.00 showed thehighest (One Way Anova, memorization phase: F = 15.73, p b 0.001;discrimination phase: F = 9.13, p b 0.001; Fig. 2b). The alcohol with-drawal and the chronic 0.50% alcohol treatment group differed in thetotal distance traveled between the memorization and discriminationphases (Student's t test, C0.5 A0.00: t = −2.34, p = 0.04; C0.50A0.50:t = 2.47, p = 0.03; C0.50 A1.00: t = 0.37, p = 0.71). The groups thatshowed the higher freezing values were C0.00A1.00 and C0.50 A0.00(One Way Anova, memorization phase: F = 14.56, p b 0.001; discrimi-nation phase: F=6.16, p b 0.001; Fig. 2c). Freezingdiffered between thememorization and discrimination phases only in C0.00A1.00 group(Student's t test, t = 2.70, p = 0.03).
3.2. Caffeine treatment
Fig. 3 shows objects exploration of animals exposed to chronic andacute caffeine treatment. A single control group (C00A00) was usedfor the caffeine and the alcohol treatments (results described above),and explored mainly the new object in the memorization phases.
The acute 50mg/L caffeine group (C00A50) did not show any differ-ence in exploration time of the objects in the memorization phase(Student's t test, t = 0.28, p = 0.78; Fig. 3b). Fish explored more objectC than A in the discrimination phase (Student's t test, t = 3.01, p =0.01). This group explored more object B in the memorization phasethan object C in the discrimination phase (Student t test, t = −3.07,p = 0.01).
The acute 100 mg/L caffeine group (C00A100) did not show differ-ences in exploration in the memorization phase (Student t test, t =
Fig. 1. Zebrafish exploration time for objects A vs. B (memorization phase), or A vs. C (discrimination phase) for the alcohol exposure regimes: (a) C0.00A0.00 —Control (n = 17),(b) C0.00A0.50 — acute 0.50% alcohol (n = 18), (c) C0.00A1.00 — acute 1.00% alcohol (n = 12), (d) C0.50 A0.00 — withdrawal (n = 9), (e) C0.50A0.50 – chronic (n = 13), and(e) C0.50 A1.00 — increased dose (n = 13). Bars mean exploration time + SEM in each object, in the memorization and discrimination phases. Fish were observed for 20 min andanalyzed using video-tracking software (ZebTrack). Asterisk indicates statistical difference between fish exploration in each pair of objects markedwith a bracket (Student t test, p b 0.05).
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0.28, p = 0.78; Fig. 3c). There was more exploration of object C than A inthe discrimination phase (Student t test, t=−3.04, p=0.01). This groupexplored more object A in the discrimination than the same object Ain the memorization phase (Student t test, t = −2.34, p = 0.04), andalso explore more object C in the discrimination phase than object Bin the memorization phase (Student t test, t =−6.96, p b 0.001).
The withdrawal group (C50A00) did not present exploration differ-ences either in the memorization phase (Student's t test, t = −1.04,p = 0.32; Fig. 3d) or in the discrimination phase (Student's t test, t =1.92, p = 0.08).
The chronic group (C50A50) did not show differences in explorationtime between objects in the memorization phase (Student's t test, t =0.27, p = 0.79; Fig. 3e). In the discrimination phase, this group showedincreased exploration of object C (Student's t test, t=−2.29, p=0.05).
There was also higher exploration of object C in the discriminationphase than object B in the memorization phase (Student's t test,t = −2.91, p = 0.04).
The increased dose group (C50A100) did not differ in explorationtime in the memorization phase (Student's t test, t = 0.80, p = 0.45;Fig. 3f), but explored more object C than the object A in the discrimina-tion phase (Student's t test, t = −4.36, p b 0.001). Fish also exploredmore object C in the discrimination phase than object B in the memori-zation phase (Student's t test, t = −5.01, p b 0.001).
The locomotion parameters differed between the caffeine treatedgroups. Average swimming speed was higher for C00A00 and C50A50groups, and lower for C00A50 group in the memorization phase (OneWay Anova, F = 3.50, p b 0.001; Fig. 4a). The caffeine groups did notdiffer in terms of average speed in the discrimination phase (One Way
Fig. 2. Locomotor parameters for the alcohol exposure groups. (a) average speed ± SEM,(b) total distance traveled ± SEM and (c) freezing ± SEM. The alcohol treatmentconditions are shown on the x-axis. The letter C represents chronic alcohol exposureand the values that follow are the concentrations of alcohol used (0.00% and 0.50%). Theletter A represents acute alcohol exposure and the values that follow are theconcentrations of alcohol used (0.00%, 0.50% and 1.00%). At least one different letterindicates statistical difference by One Way Anova (p b 0.05). Lower case letter signalizethe comparison between the groups in the memorization phase and capital letterssignalize the comparison between the groups in the discrimination phase. Asteriskindicates statistical differences between memorization and discrimination phases of thesame alcohol treatment group.
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Anova, F = 0.68, p = 0.64). Only C50A50 group showed differences inaverage speed between the memorization and discrimination phases(Student's t test, t = 3.72, p = 0.005).
For distance traveled, once more C00A50 group showed the lowervalue while C00A00 and C50A50 groups had the higher values (OneWay Anova, memorization phase: F = 3.32, p = 0.01; discriminationphase: F = 1.77, p = 0.13; Fig. 4b). There was no significant differencebetween the memorization and discrimination phases for any of thecaffeine groups (Student's t test, p N 0.05).
The freezing values were higher for C00A50 and C00A100 thanfor the other groups in both phases (One Way Anova, memoriza-tion phase: F = 5.51, p b 0.001; discrimination F = 3.44,p b 0.001; Fig. 4c). The groups did not differ in terms of freezingbetween the memorization and discrimination phases (Student'st test, p N 0.05).
3.3. Alcohol and caffeine treatment
The Fig. 5 shows time of objects exploration in the memorizationand discrimination phases for the groups treated with both alcoholand caffeine. The groups exposed to chronic caffeine and acute alcohol,Cc50Aa0.50 did not show exploration difference between objects in thememorization phase (Student's t test, t =−0.71, p= 0.49; Fig. 5a), butexplored more object A than C in the discrimination phase (Student's ttest, t = 2.21, p= 0.05). The group Cc50Aa1.00 did not show explorato-ry differences in the memorization phase (Student's t test, t = −0.71,p = 0.49; Fig. 5b), but explored more object A than object C in the dis-crimination phase (Student's t test, t = 2.45; p = 0.03). This last groupshowed higher exploration of object B in the memorization phase thanobject C in the discrimination phase (Student's t test, t = 2.51, p =0.03).
The groups treated with chronic alcohol and acute caffeine,Ca0.50Ac50 did not present exploration differences in thememorizationphase (Student's t test, t=−0.71, p=0.49; Fig. 5c), whilefish exploredmore object C than object A in the discrimination phase (Student's t test,t =−2.92, p= 0.02), and exploredmore object A in thememorizationthan in the discrimination phase (Student's t test, t = 5.21, p b 0.001).On the contrary, Ca0.50Ac100 did not show difference in objects explo-ration either in the memorization (Student's t test, t = 0.69, p = 0.51;Fig. 5d) or in the discrimination phase (Student's t test, t = 0.78, p =0.45).
In the memorization phase there were no differences in averagespeed between groups (Anova One Way, F = 2.54, p = 0.07; Fig. 6a).In the discrimination phase, average speed was higher for Cc50Aa1.00than for Ca0.50Ac50 and Ca0.50Ac100 groups (Anova One Way, F =7.00, p b 0.001; Fig. 6a). Only Ca0.50Ac50 group showed average speeddifference between the memorization and discrimination phases(Student's t test, t = −2.14, p = 0.05).
There were no differences in total distance traveled in the memori-zation phase (Anova OneWay, F = 2.47, p = 0.08; Fig. 6b) and the dis-crimination phase (Anova One Way, F = 1.51, p = 0.23). For totaldistance traveled, only Ca0.50Ac50 group showed difference betweenthe memorization and discrimination phases (Student's t test, t =2.06, p = 0.01).
Therewere nodifferences between the groups in terms of freezing inthe memorization phase (Anova One Way, F = 1.42, p = 0.25; Fig. 6c).The freezing value Ca0.50Ac50 group was the highest in the discrimina-tion phase (Anova One Way, F = 6.35, p = 0.001). Again, Ca0.50Ac50was the only group that showed difference in freezing between thememorization and discrimination phases (Student's t test, t = 2.60,p = 0.02).
4. Discussion
In this study we present a view of the effects of alcohol and caffeineon the learning andmemory performance of adult zebrafish. Our resultsprovide evidence that acute alcohol exposure as well as withdrawalfrom both chronic alcohol and caffeine impair discriminative learning.Rather, the natural tendency to explore novelty is expected to motivatethe zebrafish to learn about new items in the tank. Not only do ourresults confirm the ability of zebrafish to discriminate objects, asshown by Oliveira et al. (2015), but we also show that the discrimina-tive performance was dependent upon the alcohol and caffeine doseand exposure regimen.
According to the naturalistic and psychological viewpoints, learningis the ability to change behavior with experience, which providesvarious benefits to the animal's life. The cognitive ability of discrimina-tive learning involves many areas of the central nervous system (CNS),particularly the hippocampus (Barker andWarburton, 2011; Good et al.,2007;Mumby et al., 2002). This is an important zone also becausemanydrugs affect neurons in this region, for example, alcohol was shown toaffect the hippocampus (Norman et al., 2009; Willoughby et al., 2008)
Fig. 3. Zebrafish exploration time for objects A vs. B (memorization phase), or A vs. C (discrimination phase) for the caffeine exposure regimes: (a) C00A00—Control (n= 17), (b) C00A50—acute 50mg/L caffeine (n=12), (c) C00A100— acute 100mg/L caffeine (n=11), (d) C50A00—withdrawal (n=12), (e) C50A50— chronic (n=11), and (e) C50A100— increased dose (n=8). Bars mean exploration time+ SEM in each object, in the memorization and discrimination phases. Fish were observed for 20 min and analyzed using video-tracking software (ZebTrack).Asterisk indicates statistical difference between fish exploration in each pair of objects marked with a bracket (Student t test, p b 0.05).
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and impair memory (Hamilton et al., 2003; Uecker and Nadel, 1996). Infact, our data corroborates these findings since the use of high dose ofalcohol affected fish performance in objects discrimination. However,the exact effects of alcohol in the fish lateral pallium, area that corre-sponds to the mammalian hippocampus, are still to be confirmed infuture studies.
High doses of alcohol have been suggested to promote depressionto the CNS (Gerlai, 2013; Quoilin et al., 2013; Roseribloom et al.,2004). In zebrafish, it has been shown that high concentrations of al-cohol cause a decrease in activity (Gerlai et al., 2000; Gerlai et al.,2006; Tran and Gerlai, 2013). In this study, we observed this patternfor acute doses of 1.00% alcohol in terms of the objects exploration,total distance traveled and freezing. Although it is not clear if theseeffects were derived from increased anxiety or sedation, high acute
alcohol exposure significantly affected behavior. At first glance, theresult of the group under high acute dose of alcohol action seemsto indicate their inability to discriminate objects. However, it is pos-sible that the fish did learn but the acute alcohol exposure interferedwith their ability to recall memory and/or simply swim properly inthe tank. Other studies have also noticed the harmful effects ofacute alcohol doses on motion (Gerlai et al., 2000; Tran and Gerlai,2013), perception, and memory recall (Bartholow et al., 2003;Chacon and Luchiari, 2014). On the other hand, we observed thatthe moderate acute dose of alcohol (C0.00A0.50) did not alter loco-motion patterns but affect objects discrimination, possibly interfer-ing with sustained attention and environmental details perception(Parker et al., 2014; Baiamonte et al., 2015), result that was notobserved for fish chronically exposed to alcohol.
Fig. 4. Locomotor parameters for the caffeine exposure groups. (a) average speed± SEM,(b) total distance traveled ± SEM and (c) freezing ± SEM. The caffeine treatmentconditions are shown on the x-axis. The letter C represents chronic caffeine exposureand the values that follow are the concentrations of caffeine used (00 and 50 mg/L).The letter A represents acute caffeine exposure and the values that follow are theconcentrations of caffeine used (00, 50 and 100 mg/L). At least one different letterindicates statistical difference by One Way Anova (p b 0.05). Lower case letter signalizethe comparison between the groups in the memorization phase and capital letterssignalize the comparison between the groups in the discrimination phase. Asteriskindicates statistical differences between memorization and discrimination phases of thesame caffeine treatment group.
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The main differences on the performance of fish chronicallyexposed to alcohol appear when we compare withdrawal(C0.50A0.00) against the other groups (C0.50A0.50 andC0.50A1.00). It seems that chronic alcohol exposure promoted toler-ance to the drug and decreased the effects of higher acute exposureafterward (acute 1.00%), once these groups have shown perfor-mance comparable to the control group in many aspects. This resultis in agreement with the study of Boulouard et al. (2002), showingthat chronic administration produces tolerance to the adverse ef-fects of acute alcohol exposure in rats, and also in accordance tothe observed behavior of zebrafish (Gerlai et al., 2006; Gerlai et al.,2009; Tran and Gerlai, 2013). According to these studies, the toler-ance could be partly attributed to altered metabolism of ethanoland to cellular and molecular adaptations of the glutamate andGABA neurotransmissions. In fish, the same glutamatergic andGABAergic systems are present in the telencephalon, and participatein memory formation (Blank et al., 2009; Nam et al., 2004; Xu et al.,2003).
Contrary to the tolerance effect described above, we showed thatcessation of alcohol exposure (i.e. withdrawal) leads to a significant de-crease in exploration, suggesting higher levels of stress and anxiety inthe withdrawal fish. For example, Gerlai et al. (2009) showed that dis-continuous alcohol exposure disrupts zebrafish shoaling behavior,Cachat et al. (2010) observed that withdrawal from alcohol causesstress response in terms of increased cortisol release, and Mathur et al.(2011) related the alcohol withdrawal to anxiety-like behavior. Inmammals, the clinical symptoms of withdrawal are high anxiety, in-creased heart rate and perspiration, nausea and headache, increasedtremors, and hallucinations (Martinotti et al., 2008; Prat et al., 2009;Wills et al., 2009;Wu et al., 2009). In fish, our results suggest that with-drawal from alcohol can induce inability to properly explore the ambi-ent and difficulty to learn and form memory, behavioral responsesassociated with the peak of the withdrawal syndrome (Bayard et al.,2004).
On the opposite of the alcohol actions that are considered harmful,caffeine is considered a stimulant psychotropic. Caffeine acts on theCNS through several mechanisms, such as intracellular calcium mobili-zation, phosphodiesterase inhibition and sodium-potassium pumpstimulation (Braga and Alves, 2000), however the most striking effectis the reversible antagonism on adenosine receptors (El Yacoubi et al.,2000; Solinas et al., 2002). Considering that adenosine receptors arefound in dopaminergic, glutamatergic and GABAergic neurons (Dalyand Fredholm, 1998), by blocking adenosine receptors, caffeine alsoaffects these neurons sensibility.
In our study, withdrawal from caffeine (C50A00) affected discrimi-native learning. This cognitive impairment was not associated to anylocomotor compromising (average speed, total distance traveled andfreezing). Comparative studieswith rodents during caffeinewithdrawalshowedpoor performance in the aquaticmaze task (Bruce, 1989; Khaliqet al., 2012). Cessation of caffeine intakewas shown to increase sensitiv-ity to adenosine, and thus provoke decreased alertness, lethargy anddrowsiness, altered cerebral blood flow velocity and quantitative EEG(Jones et al., 2000; Rogers et al., 2013).
Animals exposed to acute caffeine (C00A50 and C00A100) showed aslightly decrease in average speed and total distance traveled during thefirst exposure to the drug, and increased freezing behavior. Similar loco-motor effects were reported in rodents and zebrafish (Chen et al., 2008;Marin et al., 2011). These effects may occur due to the caffeine's antag-onism on A1 and A2 adenosine receptors that affect locomotor activity(Gupta et al., 2014). On the other hand, the acute caffeine exposuredid not affect the fish's ability to discriminate the new object from theformer ones.
Acute and chronic caffeine exposure allow for cognitive performancein discrimination task comparable to untreated fish (control). Althoughit was already shown that chronic doses of caffeine leads to toleranceoutcome (Satel, 2006), the main effects of prolonged use are related todecrease in fatigue contender and alertness promotion (Striley et al.,2011). The long-term usage of caffeine causes no cognitive impairment(Angelucci et al., 2002; Borota et al., 2014), which is in accordance withour results. Many studies using caffeine support its role as a memoryimprover (Cunha and Agostinho, 2010). The drug mnemonic effectsseems to be related to the non-specific antagonism of adenosine recep-tors (Cunha and Agostinho, 2010; Fredholm et al., 1999). However, inzebrafish discrimination task, caffeine seems to prevent memory im-pairment, acting much more as a cognitive normalizer than enhancer.
The consumption of alcohol in combination with drinks containingcaffeine has been suggested as responsible for binge drinking anddependence development (Marczinski, 2011). The combination isworldwide reported and its consumption can often cause social prob-lems, interpersonal violence, risky sexual activity and severe intoxica-tion, mainly when indiscriminately used (Naimi et al., 2003). Severalbeverages such as teas, energetic drinks, soft drinks and others presentcaffeine as an ingredient (Lozano et al., 2007; Nehlig and Boyet, 2000),and lately alcohol has been added to it. Caffeine does not exert any effect
Fig. 5. Zebrafish exploration time for objects A vs. B (memorization phase), or A vs. C (discrimination phase) for the alcohol and caffeine combined treatments. The letter C representschronic exposure and the letter A represents acute exposure. The letter that follows C represents the alcohol (Ca) or caffeine (Cc) chronic treatment and the values that follow are theconcentrations of alcohol (0.50%) or caffeine (50 mg/L) used. The letter that follows A represents the alcohol (Aa) or caffeine (Ac) acute exposure and the values that follow are theconcentrations of alcohol (0.50% and 1.00%) or caffeine (50 mg/L and 100 mg/L) used. (a) Cc50Aa0.50 (n = 13), (b) Cc50Aa1.00 (n = 13), (c) Ca0.50Ac50 (n = 9), and (d) Ca0.50Ac100(n = 11). Bars mean exploration time + SEM in each object, in the memorization and discrimination phases. Fish were observed for 20 min and analyzed using video-trackingsoftware (ZebTrack). Asterisk indicates statistical difference between fish exploration in each pair of objects marked with a bracket (Student t Test, p b 0.05).
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on the alcoholmetabolism by the liver and thus, it does not reduce alco-hol blood concentrations (Ferreira et al., 2006). Still, when these sub-stances are combined, the caffeine may mask the depressive effects ofalcohol (Ferreira et al., 2006), leading to increased and prolongedintake.
In our study, fish chronically exposed to caffeine and acutelyexposed to alcohol (Cc50Aa0.50 and Cc50Aa1.00) did not discriminatea new object. This result seems to be derived from two effects: first,the withdrawal from caffeine that promotes decreased alertness, andthen, the acute alcohol effects that is detrimental for learning, resultsthat are also observed in separate. However, the locomotor responseobserved for these groups seems to reveal the stronger effects ofacute alcohol dose for these fish, as average speed, distance traveledand freezing are more related to the alcohol effects than to caffeinewithdrawal.
The group exposed to chronic alcohol dose and high acute caffeinedose (Ca0.50Ac100) also did not discriminate the objects. For thisgroup, we observed increased mortality during the caffeine exposure,which seems to be related to the high dose of caffeine in combinationto alcohol withdrawal. During chronic alcohol exposure, there areboth down regulation of GABA receptors and up regulation of glutamatereceptors (tolerance related response) (Kang et al., 1998; Piepponenet al., 2002; Tsai et al., 1995). The cessation of the drug intake provokeincrease in glutamatergic transmission and, due to the increasednumber of receptors, the excitatory response is highly increased.When we exposed fish to alcohol withdrawal and high dose of caffeine,the blockage of adenosine receptor may have intensified evenmore theglutamatergic response, leading to death. Similar response was also
observed by Rodriguez et al. (Rodriguez et al., 2014) after high dose ofcaffeine used for zebrafish. These authors describe curvature body as-pect before fish is considered dead.
On the other hand, chronic alcohol exposure followed by moderateacute caffeine dose (Ca0.50Ac50) brought about a complete differentpicture: fish showed objects discrimination and locomotor patternscomparable to the control group, indicating an attenuating effect ofthe caffeine on the withdrawal from alcohol. Taking into account thesame effects of withdrawal described above, the moderate dose of caf-feine used afterwards may have slightly blocked adenosine receptorsand thus, intensified the sensibility of the glutamatergic and GABAergicneurons in a moderate extent. Therefore, these combined effects seemto have promoted cognitive stimulation, allowing fish to perceive anddiscriminate objects. There are few studies regarding the effects of thiscombination, in rodents the adenosine reduces the number of seizurescaused by alcohol withdrawal (Malec et al., 1995) and caffeine preventsretrograde amnesia induced by alcohol (Spinetta et al., 2008), andhumans report higher tolerance to alcohol when the drug is combinedwith caffeine (Fillmore, 2003). However, studies approaching signalingpathways and brain areas related to the effects of both alcohol and caf-feine are still needed and future studies may contribute to increase theknowledge in this issue.
Although our study is the first to investigate alcohol and caffeine ef-fects on the cognitive performance in zebrafish,many gaps are still openand deserve attention, for instance, the substances effects on long-termmemory formation, development of the nervous system andmore com-plex cognitive functions. Also, alcohol and caffeine have dose dependenteffect, and other dosages may generate different consequences for the
Fig. 6. Locomotor parameters for the alcohol and caffeine combined exposure groups.(a) average speed ± SEM, (b) total distance traveled ± SEM and (c) freezing ± SEM.The letter C represents chronic exposure and the letter A represents acute exposure. Theletter that follows C represents the alcohol (Ca) or caffeine (Cc) chronic treatment andthe values that follow are the concentrations of alcohol (0.50%) or caffeine (50 mg/L)used. The letter that follows A represents the alcohol (Aa) or caffeine (Ac) acuteexposure and the values that follow are the concentrations of alcohol (0.50% and 1.00%)or caffeine (50 mg/L and 100 mg/L) used. (a) Cc50Aa0.50 (n = 13), (b) Cc50Aa1.00(n = 13), (c) Ca0.50Ac50 (n = 9), and (d) Ca0.50Ac100 (n = 11). At least one differentletter indicates statistical difference between the groups in the discrimination phase byOne Way Anova (p b 0.05). Asterisk indicates statistical differences betweenmemorization and discrimination phases of the same alcohol treatment group.
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learning process. In conclusion, our study confirms that increasedconsumption of alcohol is harmful for learning, but caffeine alonedoes not influence discrimination either in chronic or acute use.However, moderate caffeine exposure after cessation of prolongedalcohol intake seems to reduce the deleterious effects of withdrawal,indicating the caffeine potential as drug that may help to reverse thefirst effects of alcohol withdrawal. It would be important at this pointto invest in techniques that show the effects of alcohol and caffeinein the brain, mainly focusing on areas, neurotransmitters and pro-teins related to learning.
Acknowledgements
The authors are thankful to Miss J.P.S Lima for data collection sup-port. This study was supported by CNPq (Universal 481396/2012-8),grants to A.C. Luchiari, and by CAPES, master scholarship to L.C. Santos.
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66
Conclusões gerais
O tipo de consumo de álcool e cafeína, se agudo ou crônico, e a dose consumida afetam a
atividade locomotora e desempenho cognitivo do peixe paulistinha.
A exposição aguda a dose média de álcool não provoca alterações na atividade locomotora,
mas causa prejuízos cognitivos, enquanto a exposição aguda a dose alta e abstinência de
álcool diminuem padrões locomotores e aumentam o comportamento tipo-ansioso, além de
promoverem prejuízos cognitivos.
A exposição crônica à dose média e exposição aguda à mesma dose de cafeína aumentam
os padrões locomotores, mas diminuem o comportamento tipo-ansioso, enquanto o uso agudo
de dose elevada de cafeína causa resposta ansiogênica.
A abstinência da cafeína é prejudicial ao peixe paulistinha, promove resposta de ansiedade
e interfere na capacidade de discriminação em teste cognitivo.
A dose média de cafeína consumida após a cessação do uso continuado de álcool estimula
a resposta locomotora, o que não acontece com a dose elevada de cafeína. Ademais, a dose
moderada de cafeína permite desempenho cognitivo em tarefa de discriminação de objetos,
enquanto a dose elevada não auxilia na cognição e provoca mortalidade aumentada. Assim,
apenas a dose média de cafeína parece reverter os efeitos deletérios da síndrome de
abstinência alcoólica.
Doses elevadas de álcool usadas na abstinência de cafeína não afetam o comportamento
tipo-ansioso, mas diminuem padrões locomotores (resposta menos acentuada para a dose
média de álcool). Quanto à resposta cognitiva, tanto a dose média quanto a dose alta de álcool
impedem o reconhecimento de objetos.
67
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UFRN – Campus Universitário – Centro de Biociências Celular Institucional (Claro): 9229-6491 Av. Salgado Filho, S/N – CEP: 59072-970 – Natal/RN e-mail: [email protected]
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS - CEUA
PROTOCOLO N.º 045/2015
Professor/Pesquisador: ANA CAROLINA LUCHIARI
Natal (RN), 02 de setembro 2015.
Certificamos que o projeto intitulado “Mudanças comportamentais causadas pela
administração de álcool e cafeína em peixe paulistinha (Danio rerio)”, protocolo 045/2015,
sob a responsabilidade de ANA CAROLINA LUCHIARI, que envolve a produção, manutenção
e/ou utilização de animais pertencentes ao filo Chordata, subfilo Vertebrata (exceto o homem),
para fins de pesquisa científica encontra-se de acordo com os preceitos da Lei n.º 11.794, de 8
de outubro de 2008, do Decreto n.º 6.899, de 15 de julho de 2009, e com as normas editadas
pelo Conselho Nacional de Controle da Experimentação Animal (CONCEA), e foi aprovado
pela COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS da Universidade Federal do Rio Grande do
Norte – CEUA/UFRN, em reunião de 02 de setembro de 2015.
Vigência do Projeto FEVEREIRO 2016
Número de Animais 100
Espécie/Linhagem Peixes (Danio rerio)
Peso/Idade 0,5g / 5 meses
Sexo Machos e Fêmeas
Origem Adquiridos em comércio local
Informamos ainda que, segundo o Cap. 2, Art. 13 do Regimento, é função do
professor/pesquisador responsável pelo projeto a elaboração de relatório de
acompanhamento que deverá ser entregue tão logo a pesquisa for concluída.
Josy Carolina Covan Pontes Coordenadora da CEUA
UFRN – Campus Universitário – Centro de Biociências Celular Institucional (Claro): 9229-6491 Av. Salgado Filho, S/N – CEP: 59072-970 – Natal/RN e-mail: [email protected]
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS - CEUA
PROTOCOLO N.º 046/2015
Professor/Pesquisador: ANA CAROLINA LUCHIARI
Natal (RN), 02 de setembro 2015.
Certificamos que o projeto intitulado “Efeitos do álcool e cafeína na tarefa de
discriminação de objetos em peixe paulistinha”, protocolo 046/2015, sob a responsabilidade de
ANA CAROLINA LUCHIARI, que envolve a produção, manutenção e/ou utilização de animais
pertencentes ao filo Chordata, subfilo Vertebrata (exceto o homem), para fins de pesquisa
científica encontra-se de acordo com os preceitos da Lei n.º 11.794, de 8 de outubro de 2008,
do Decreto n.º 6.899, de 15 de julho de 2009, e com as normas editadas pelo Conselho
Nacional de Controle da Experimentação Animal (CONCEA), e foi aprovado pela COMISSÃO
DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS da Universidade Federal do Rio Grande do Norte –
CEUA/UFRN, em reunião de 02 de setembro de 2015.
Vigência do Projeto FEVEREIRO 2016
Número de Animais 100
Espécie/Linhagem Peixes (Danio rerio)
Peso/Idade 0,5g / 5 meses
Sexo Machos e Fêmeas
Origem Adquiridos em comércio local
Informamos ainda que, segundo o Cap. 2, Art. 13 do Regimento, é função do
professor/pesquisador responsável pelo projeto a elaboração de relatório de
acompanhamento que deverá ser entregue tão logo a pesquisa for concluída.
Josy Carolina Covan Pontes Coordenadora da CEUA
