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T ISMAEL NONATO JUNIOR PRODUÇÃO DE EMBRIÕES EM VACAS NELORE (Bos taurus indicus) COM A ASSOCIAÇÃO DOS MÉTODOS IN VIVO E IN VITRO Londrina - Paraná 2005

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T

ISMAEL NONATO JUNIOR

PRODUÇÃO DE EMBRIÕES EM VACAS NELORE (Bos

taurus indicus) COM A ASSOCIAÇÃO DOS MÉTODOS IN

VIVO E IN VITRO

Londrina - Paraná 2005

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ISMAEL NONATO JUNIOR

PRODUÇÃO DE EMBRIÕES EM VACAS NELORE (Bos

taurus indicus) COM A ASSOCIAÇÃO DOS MÉTODOS IN

VIVO E IN VITRO

Dissertação apresentada ao programa

de Pós-graduação em Ciência Animal, Área de concentração Sanidade Animal, da Universidade Estadual de Londrina como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Ciência Animal.

Orientador: Prof. Dr. Marcelo Marcondes Seneda

Londrina - Paraná 2005

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PRODUÇÃO DE EMBRIÕES EM VACAS NELORE (Bos

taurus indicus) COM A ASSOCIAÇÃO DOS MÉTODOS IN

VIVO E IN VITRO

Candidato: Ismael Nonato Junior

Comissão Examinadora:

Orientador: Prof. Dr. Marcelo Marcondes Seneda

Prof. Dr. Joaquim Mansano Garcia

Dr. José Lázaro da Rocha

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UEL Londrina – Paraná

2005

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho a meus pais Ismael Nonato e Maria de Lourdes Nonato, que são minha

luz, guiando-me em direção aos meus sonhos, e sempre estiveram presentes sem medir

esforços. Aos meus irmãos Juliana Nonato e Paulo André Nonato, que sempre me serviram

de exemplo de determinação. Sem vocês nada seria possível!

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AGRADECIMENTOS

A Deus em primeiro lugar, por me dar o privilégio da existência para poder caminhar em

busca dos meus sonhos.

A meus pais e irmãos, que nunca mediram esforços e sempre estiveram presentes na busca

de meus objetivos.

A minha amada Maria Cláudia, pelo otimismo e carinho em momentos que necessitei de

apoio.

A meus avós, tios, primos e amigos, que sempre compreenderam minha ausência em busca

de um sonho.

Ao meu dileto orientador Prof. Dr. Marcelo Marcondes Seneda, pelo apoio e amizade na

realização deste trabalho.

Ao médico veterinário José Henrique Fortes Pontes, que me orientou, apoiou e se revelou

um grande amigo.

Aos colegas Bruno Valente Sanches e Fabiana de Almeida Rufino, que foram leais

companheiros e não mediram esforços em me ajudar.

A todos os funcionários da Fazenda São Francisco e In Vitro Brasil, que me deram

condições para realização deste trabalho.

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A todos os alunos, funcionários e professores do Programa de Pós-graduação em Ciência

Animal.

Minha eterna gratidão a todos vocês!

NONATO JUNIOR, Ismael. Produção de embriões em vacas Nelore (Bos taurus indicus) com a associação dos métodos in vivo e in vitro. Londrina : UEL, 2005. (Dissertação de Mestrado em Ciência Animal).

Orientador: Prof. Dr. Marcelo Marcondes Seneda

RESUMO

Este trabalho comparou os métodos in vivo e in vitro associados para

obtenção de embriões na raça Nelore, por meio do número de embriões produzidos, taxas

de gestação, morte embrionária e avaliação da razão macho e fêmea dos fetos. Trinta

doadoras foram submetidas a 96 sessões de aspiração folicular e produção in vitro de

embriões (3,2/doadora) e 43 colheitas de embriões (1,43/doadora). Foram obtidos 910

embriões in vitro (9,48/aspiração) e 289 embriões in vivo (6,72/colheita - P<0,05). Obtêve-

se 341 gestações pelo método in vitro (3,55/aspiração) e 132 pelo método in vivo

(3,07/colheita - P<0,05). A mortalidade embrionária foi avaliada pela diferença das taxas de

gestação aos 30 e 60 dias, com percentuais de 10,56% para embriões produzidos in vitro e

9,09% para os obtidos in vivo (P=0,12). A relação macho:fêmea foi de 52,48% para machos

e 47,52% para fêmeas, pelo método in vitro (P=0,07), e 1:1 pelo método in vivo. A média

mensal de gestações obtidas por doadora foi de 2,7 para o método in vitro e 1,9 para o

método in vivo. Os resultados obtidos permitem concluir: 1) vacas Nelore produziram

maior número de embriões pelo método in vitro em comparação ao método in vivo 2) as

taxas de gestação aos 30 e 60 dias foram mais altas para os embriões obtidos in vivo

(132/289; 120/289) do que para os embriões produzidos in vitro (341/910; 305/341) 3) o

método de produção in vitro resultou em maior número de gestações por doadora em um

mesmo período de tempo 4) a relação macho-fêmea foi similar nos dois métodos estudados

5) a utilização intercalada das técnicas de produção de embriões in vitro e in vivo pode ser

vantajosa, pela possibilidade de agregação dos aspectos favoráveis de cada uma delas.

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Palavras-chave: produção in vitro de embriões; colheita de embriões; gestação

NONATO JUNIOR, Ismael. Embryo production in Nelore (Bos taurus indicus) cows

with the association of the methods in vivo and in vitro. Londrina : UEL, 2005. (Msc

Dissertation).

Adviser: Prof. Dr. Marcelo Marcondes Seneda

ABSTRACT

In the present work were compared the in vitro embryo production with

conventional approach method associated to obtain embryos in Nelore breed, evaluating

number of producted embryos, pregnancy rates, embryonic mortality and percentage male

vs female of fetus. The donor animals (30) were submitted to 96 ultrasound guided

transvaginal ovum pick-up sessions and in vitro production of embryos (3,2/donor) and 43

embryo collections (1,43/donor). Were obtained 910 in vitro embryos (9,48/session) and

289 in vivo embryos (6,72/collection – P<0,05).The in vitro method yielded 341

pregnancies (3,55/session) and 132 using the conventional method (3,07/collection –

P<0,05).The embryonic mortality was evaluated comparing the pregnancy rate at day 30

and day 60 after transfer, with percentage of 10,56% to in vitro embryos and 9,09% to in

vivo embryos (P=0,12). The IVF approach used in the present study produced 52,48%

males and 47,52% females (P=0,07) while were obtained 50% males : 50% females using

in vivo method. The monthly average of pregnancies obtained per donor was 2,7 to in vitro

method and 1,9 to in vivo technique. The results showed that: 1) Nelore cows produced

higher number of embryos using in vitro method compared with in vivo embryo production

2) pregnancy rates at day 30 and day 60 were higher in the case of in vivo produced

embryos (132/289; 120/289) that to in vitro produced embryos (341/910; 305/910) 3) the in

vitro embryo production method resulted in higher number of pregnancy per donor in the

same period 4) the percentege of males and females was similar in both methods 5) the

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alternate utilization of embryo production techniques in vitro and in vivo can be gainful, at

possibility of aggregation of the favourable aspects of them everyone.

Key-words: in vitro embryo production; embryo collection; pregnancy

SUMÁRIO

1- REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................ 11

1.1 Aspectos importantes das biotecnologias da reprodução ........................ 12

1.2 Referências .............................................................................................. 20

2- OBJETIVOS .......................................................................................................... 29

2.1 Objetivo geral ........................................................................................... 30

2.2 Objetivos específicos .............................................................................. 30

3- ARTIGO PARA PUBLICAÇÃO ........................................................................ 31

3.1 Resumo .................................................................................................... 32

3.2 Abstract ................................................................................................... 33

3.3 Introdução ............................................................................................... 34

3.4 Material e Métodos .................................................................................. 36

3.4.1 Animais .................................................................................................... 36

3.4.1.1 Preparo dos animais ................................................................................. 37

3.4.2 Produção in vitro dos embriões ............................................................... 37

3.4.2.1 Aspiração Folicular ................................................................................. 37

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3.4.2.2 Seleção dos oócitos ................................................................................. 38

3.4.2.3 Maturação dos oócitos ............................................................................ 38

3.4.2.4 Fecundação dos oócitos .......................................................................... 39

3.4.2.5 Desenvolvimento ..................................................................................... 39

3.4.3 Produção in vivo dos embriões ................................................................ 40

3.4.3.1 Superovulação das doadoras .................................................................... 40

3.4.3.2 Colheita dos embriões ............................................................................. 40

3.4.4 Transferência dos embriões .................................................................... 41

3.4.5 Diagnóstico de gestação, avaliação da morte embrionária e sexagem fetal...

................................................................................................................. 41

3.4.6 Análise Estatística ................................................................................... 42

3.5 Resultados ............................................................................................... 42

3.6 Discussão ................................................................................................ 45

3.7 Referências ............................................................................................. 47

4- CONCLUSÕES .................................................................................................. 49

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LISTA DE TABELAS

TABELA 1- Produção média de embriões para os métodos in vitro e in vivo ............ Pg. 43

TABELA 2- Taxas de gestação aos 30 e 60 dias para os embriões produzidos in vitro e in

vivo ................................................................................................................................ Pg. 43

TABELA 3- Morte embrionária entre 30 e 60 dias de gestação .................................. Pg. 44

TABELA 4- Relação macho-fêmea para os embriões produzidos in vitro e in vivo ... Pg. 44

TABELA 5- Produção média mensal de gestações por doadora para os métodos in vitro e

in vivo ............................................................................................................................ Pg. 45

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LISTA DE ABREVIATURAS

IA – Inseminação artificial

TE – Transferência de embriões

PIV – Produção in vitro

FIV – Fecundação in vitro

MIV – Maturação in vitro

BSA – Albumina sérica bovina

FSH – Hormônio folículo estimulante

BE – Benzoato de estradiol

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1. REVISÃO DE LITERATURA

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1.1 Aspectos importantes das biotecnologias da reprodução

As modificações na reprodução dos animais possivelmente

ocorrem desde sua domesticação, uma vez que o cativeiro por si

próprio já seria capaz de alterar o comportamento reprodutivo.

Atualmente o homem tem realizado esforços para incrementar a

produtividade na exploração das espécies domésticas, e isto tem

sido verificado de diversas formas: modificações na nutrição,

instalações, manejo sanitário e reprodutivo (BOLS, 1997).

Em relação aos machos da espécie bovina, um grande avanço quali e quantitativo no aspecto reprodutivo ocorreu em 1939, quando Phillips tornou viável a inseminação artificial (IA) em larga escala, com o uso de diluidores adequados para o

sêmen e evoluindo com sua congelação em 1949 por Polge et al. (PÉREZ, 1985). As fêmeas bovinas também têm sido alvo de várias pesquisas, para que o

aproveitamento de um número maior de gametas seja possível. Segundo Gordon (2003), as

fêmeas bovinas nascem com mais de 100.000 oócitos em seus ovários, que pelas vias

naturais, podem gerar perto de 0,01% de produtos viáveis, ou seja, um número próximo a

dez descendentes em toda sua vida reprodutiva (BOLS, 1997).

Dentre as alternativas propostas para um maior

aproveitamento dos gametas de vacas e novilhas, destaca-se a

transferência de embriões (TE), que vem sendo usada com

sucesso desde 1958, quando Averill & Rowson fizeram o primeiro

relato de um produto nascido por esta técnica (PÉREZ, 1985).

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Sendo inicialmente um procedimento cirúrgico, a TE

posteriormente foi adaptada para uma técnica não invasiva

(GREVE, 1977), e desta forma é utilizada até os dias atuais. Em

um programa de TE, cada doadora pode multiplicar em mais de

três vezes o número de descendentes de sua vida reprodutiva

(BOLS, 1997).

No entanto, a TE apresenta algumas restrições. Relatos de cistos ovarianos,

endometrites e lesões iatrogênicas foram situações observadas em doadoras submetidas

consecutivamente à técnica (BAK et al., 1989). Kruip et al. (1991) observaram uma grande

variação no número de estruturas recuperadas. Tal aspecto parece estar relacionado com os

achados de Meintjes et al. (1995). Estes autores relataram como problemas maiores a

contínua interrupção do ciclo estral e as terapias gonadotróficas, capazes de comprometer a

fertilidade da doadora. Outro aspecto crítico é reportado por Bols et al. (1997), quanto à

variabilidade de respostas ao estímulo gonadotrófico, além da frequente colheita de

estruturas não fecundadas.

A ausência de resposta ao tratamento superovulatório ocorre em aproximadamente

20 a 30% dos animais, enquanto que outros 20 a 30% respondem apenas modestamente e

com baixas taxas de fertilização (< 6 embriões viáveis por colheita). Uma resposta de no

mínimo seis embriões viáveis por colheita tem sido obtida em apenas um terço das

doadoras (REICHENBACH, 2003). Torna-se válido considerar que a colheita de embriões

mostra-se inviável em algumas situações de infertilidade extra-ovariana, como

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hidrosalpinge bilateral (BOLS et al., 1996) e nas obstruções uterinas (SENEDA et al.,

2000).

Embora a TE continue sendo amplamente utilizada, o

número de embriões obtidos por colheita tem se mantido estável

desde o início da década de oitenta, de 4,5 a 5, verificando-se

pouca eficiência nas tentativas de se obter mais embriões por

procedimento (HASLER et al., 1995). Desta forma, a produção de

embriões pela técnica de superovulação produz um número

médio inferior a 100 embriões durante toda a vida de uma

doadora (KRUIP et al., 1994).

As limitações da TE impulsionaram a busca por um melhor aproveitamento dos

oócitos bovinos. Um evento importante ocorreu em 1982, quando Brackett et al. relataram

o nascimento do primeiro bezerro obtido pela produção in vitro (PIV) de embriões. A PIV

de embriões, a partir de oócitos de matadouro, tem sido utilizada desde então com

perspectivas promissoras, tendo viabilizado o nascimento de expressivo número de

produtos (GALLI & LAZZARI, 1996).

Apesar da possibilidade de se obter mais descendentes de doadoras que vieram ao

óbito, a PIV de embriões a partir de oócitos de matadouro possui limitações, como o tempo

de transporte do matadouro ao laboratório, o desconhecimento acerca do estado sanitário,

do padrão hormonal dos animais e, principalmente, a impossibilidade de repetição da

técnica para um mesmo animal, já que os ovários são obtidos com o óbito do mesmo.

Segundo Pieterse et al. (1988), a recuperação de oócitos é a base do programa de

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fecundação in vitro (FIV) e com as limitações dos oócitos obtidos de matadouro,

alternativas foram propostas para o aproveitamento de oócitos de animais vivos (BOLS et

al. 1995; BROGLIATTI & ADAMS, 1996).

Valendo-se das possibilidades da ultra-sonografia, Callesen et al. (1987) relataram

pela primeira vez o uso desta técnica para a obtenção de oócitos bovinos. Pela manipulação

transretal, os ovários foram posicionados dorso-lateralmente na cavidade abdominal,

viabilizando sua visualização com um transdutor de 3.5 MHz posicionado sobre a pele, na

região da fossa paralombar, local de introdução da agulha capaz de puncionar os folículos.

Apesar do êxito deste procedimento, a recuperação de oócitos bovinos com uso da ultra-

sonografia só ganhou grande impulso um ano mais tarde, com nova modificação que tornou

o procedimento de mais fácil e rápida aplicação. Pieterse et al. (1988) alteraram a técnica

descrita para humanos (FEICHTINGER & KEMETER, 1986) e descreveram a aspiração

folicular via transvaginal através da ultra-sonografia, que tornou viável o aproveitamento de

oócitos bovinos, sem as limitações dos procedimentos existentes até então.

Após as primeiras avaliações, a técnica mostrou-se simples e segura, viabilizando a

recuperação, maturação e fecundação de oócitos imaturos, podendo ser repetida várias

vezes em um mesmo animal (KRUIP et al., 1991; PIETERSE et al., 1991). Contudo,

avaliações posteriores em animais submetidos consecutivas vezes à técnica mostraram um

aumento de tecido conjuntivo no parênquima ovariano (RODRIGUES & GARCIA, 2000).

A possibilidade de obtenção de embriões em situações de infertilidade extra-

ovariana motivou vários grupos à realização do procedimento, tendo-se verificado o

nascimento de diversos produtos (LOONEY et al., 1994; HASLER et al. , 1995; BOLS et

al., 1996; SENEDA et al., 2000), confirmando as observações de Dawson (1977), a respeito

de que a maioria das fêmeas bovinas classificadas como inférteis mostrava-se capaz de

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produzir gametas viáveis. A aspiração folicular apresentou-se viável para fêmeas com

limitações reprodutivas, e a sua aplicação mostrou-se mais ampla quando utilizada em

fêmeas saudáveis, produzindo quatro vezes mais embriões em relação à TE (KRUIP et al.,

1994), embora com maior custo por embrião (RODRIGUES & GARCIA, 2000).

O ganho genético acumulado obtido em programas de melhoramento animal

através do emprego de tecnologias de embriões foi estimado em 18 a 22% (LOHUIS,

1995). Em torno de 80 a 90% dos embriões bovinos transferidos mundialmente nos últimos

anos foram obtidos através da TE. O restante, 10 a 20% dos embriões transferidos

comercialmente, têm sido produzidos in vitro (THIBIER, 2001; THIBIER, 2002).

Na tentativa de maior exploração do potencial genético das doadoras, vários

grupos vêm associando as técnicas de produção de embriões. Bousquet et al. (1999)

obtiveram resultados semelhantes de produção embrionária com a PIV e a TE, 4,7 e 4,3

embriões viáveis por sessão, respectivamente. A associação entre as técnicas PIV e TE em

vacas da raça Gir, produziu uma média de 3,91 embriões viáveis na TE, e 7,83 embriões

viáveis na PIV (VIANA et al., 2004).

A produção in vitro de embriões é possível em animais jovens, em vacas em início

de gestação, em período pós-parto inicial e em doadoras que não respondem a

superovulação (PEREZ et al., 2000). Katsa & Smorag (1984), trabalharam com ovários de

matadouro e não encontraram diferenças na qualidade dos oócitos entre animais jovens (a

partir de 18 meses) e senis (até 17 anos), embora tenham notado redução na produção de

gametas nos animais mais velhos. Looney et al. (1994) relataram a possibilidade de

aspiração folicular nos animais bastante jovens, e Brogliatti & Adams (1996) obtiveram

oócitos de bezerras com apenas seis semanas de idade com a utilização de um transdutor

adequado. No entanto, os animais bem jovens têm mostrado reduzida competência de seus

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oócitos para chegar até blastocisto (REVEL et al., 1995), embora Armstrong et al. (1994)

tenham conseguido resultados animadores com bezerras de apenas três semanas de idade

através do estímulo gonadotrófico. Meintjes et al. (1995) constataram que vacas gestantes

podiam ser submetidas à técnica durante o primeiro trimestre de gestação e, Sauvé (1998)

até o sexto mês de prenhez, sem que fosse notado qualquer prejuízo à gestação ou às vacas.

Parece haver um consenso quanto a condição corporal, em que animais

subnutridos seriam doadores de oócitos com menor capacidade para desenvolverem - se até

blastocisto (LOPES RUIZ et al., 1996) e há indícios de que animais submetidos à situações

de estresse também seriam doadores de oócitos menos competentes (SENEDA et al., 2000).

Dominguez (1995) mostrou melhor recuperação de oócitos em fêmeas da raça Holandesa,

quando comparado com fêmeas zebuínas, enquanto Dayan et al. (1999) relataram altas

taxas de recuperação de oócitos viáveis em fêmeas da raça Nelore.

Tamassia et al. (2003) relataram que a doadora influencia a produção de

blastocistos, confirmando os achados de Bousquet et al. (1999), e também demonstraram

que a doação de oócitos e a produção de embriões são fatores independentes. Watanabe et

al. (1998) demonstraram variação entre touros utilizados na PIV de embriões bovinos, de

acordo com a taxa de clivagem e desenvolvimento até blastocisto, porém, não observaram

diferenças nas taxas de eclosão.

O intervalo entre as sessões de aspiração folicular influencia a quantidade e a

qualidade de oócitos colhidos (MERTON et al., 2003). Hasler et al. (1995) observaram uma

tendência para a diminuição do número de oócitos após muitas sessões de aspiração em

uma mesma doadora. Looney et al. (1994) relataram aumento nos números de folículos

aspirados (12,3 contra 8,9) e oócitos recuperados (8,6 contra 6,2), em doadoras com

problemas específicos, tratadas com FSH. Também houve maior produção de embriões

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viáveis por aspiração, comparando-se com a média de doadoras não tratadas com FSH

(1,38 contra 0,96).

A fase reprodutiva, incluindo o período gestacional, tem sido alvo de diversos

estudos propostos para apontar um momento mais favorável à realização da aspiração

folicular. Pelo fato do ciclo estral do bovino apresentar geralmente duas a três ondas de

crescimento folicular (BUNGARTZ & NIEMAN, 1994; GINTHER, 2000), podendo

chegar até quatro a cinco ondas sob tratamento com progestágenos (BOLS, 1997), a

dinâmica folicular tem sido analisada na tentativa de se estabelecer relações que permitam

melhor aproveitamento dos oócitos. Bols (1997) observou que os oócitos apresentavam

diferentes capacidades de desenvolvimento, conforme a fase do ciclo estral em que eram

colhidos. Um número maior de embriões foi obtido após cultivo de oócitos recuperados

entre os dias 14 e 16 do ciclo estral, segundo Machatkova et al. (1995). No entanto,

trabalhando com ovários de abatedouro, Smith et al. (1996) analisaram a dominância

folicular, relatando que a produção in vitro de embriões não era afetada pela presença ou

ausência do folículo dominante. Assey et al. (1994) analisaram a ultra-estrutura de oócitos

de folículos dominantes e subordinados, e relataram degenerações prematuras no oócito

dominante, embora Rhodes et al. (1997) não tenham constatado diferenças na competência

para o desenvolvimento entre oócitos obtidos de folículos dominantes ou folículos

subordinados. Boediono et al. (1995) relataram maior competência dos oócitos quando a

punção era realizada em fase luteínica. Resultados semelhantes foram obtidos por Moreno

et al. (1993), descrevendo as doadoras gestantes com maior número de oócitos de boa

qualidade, embora Thonon et al. (1993) e Dayan et al. (1999) tenham mostrado resultados

opostos.

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A qualidade dos oócitos, taxa de clivagem e desenvolvimento até blastocisto não

difere entre folículos de diferentes tamanhos, possibilitando aspiração de folículos de

menor diâmetro (SENEDA et al., 2001). As relações entre dinâmica e atresia foliculares

também têm sido estudadas, com relatos de presença de oócitos saudáveis em folículos

claramente atrésicos (KRUIP & DILEMAN, 1982; BLONDIN & SIRARD, 1995;

MERTON et al., 2003). Na TE, a remoção do folículo dominante antes do tratamento de

superovulação melhora o número de embriões viáveis por sessão de 3,9 para 5,4 em vacas

mas não em novilhas (MERTON et al., 2003).

Posteriores à fase laboratorial, problemas nas demais etapas têm sido atribuídos

aos embriões produzidos artificialmente. As taxas de gestação após a transferência de

embriões PIV têm sido geralmente mais baixas em comparação às obtidas com embriões

produzidos pela TE (KRUIP & DEN DASS, 1997; MERTON et al., 2003). Na PIV de

embriões bovinos, obtem-se um maior número de machos em relação a fêmeas, já na TE, os

números são mais próximos. Isto foi confirmado nos achados de Bousquet et al. (1999) que,

para PIV, obtiveram 56,8% de embriões machos, sexados por PCR, 37,5% de embriões

fêmeas e 5,7% de embriões sem sexo conhecido. Com relação aos embriões produzidos in

vivo, 47,3% eram machos, 47,4% fêmeas e 5,0% dos embriões não tiveram seu sexo

conhecido. O aumento na incidência de abortos, prolongamento da gestação, anormalidades

congênitas e uma maior mortalidade perinatal representam as anomalias mais citadas

(WAGTENDONK-DELEEUW et al., 2000).

Combinar PIV e TE representa uma boa opção para se obter um maior número de

embriões viáveis (REICHENBACH, 2003). A utilização de tecnologias de produção de

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embriões bovinos maximiza a exploração do potencial das doadoras, buscando um maior

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2. OBJETIVOS

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2.1 Objetivo geral

• Avaliar a associação dos métodos in vivo e in vitro para a produção de embriões em

vacas da raça Nelore.

2.2 Objetivos específicos

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• Avaliar o número de embriões produzidos através de cada método

• Avaliar as taxas de gestação e de morte embrionária entre 30 e 60 dias de gestação,

para os embriões obtidos in vivo e in vitro

• Considerar as gestações obtidas por cada método em relação ao intervalo de tempo

• Avaliar a razão macho/fêmea nas gestações produzidas.

3. ARTIGO PARA PUBLICAÇÃO

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NONATO JUNIOR, Ismael. Produção de embriões em vacas Nelore (Bos taurus indicus) com a associação dos métodos in vivo e in vitro. Londrina : UEL, 2005. (Dissertação de Mestrado em Ciência Animal).

Orientador: Prof. Dr. Marcelo Marcondes Seneda

RESUMO

Este trabalho comparou os métodos in vivo e in vitro associados para obtenção de

embriões na raça Nelore, por meio do número de embriões produzidos, taxas de gestação,

morte embrionária e avaliação da razão macho e fêmea dos fetos. Trinta doadoras foram

submetidas a 96 sessões de aspiração folicular e produção in vitro de embriões

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(3,2/doadora) e 43 colheitas de embriões (1,43/doadora). Foram obtidos 910 embriões in

vitro (9,48/aspiração) e 289 embriões in vivo (6,72/colheita - P<0,05). Obtêve-se 341

gestações pelo método in vitro (3,55/aspiração) e 132 pelo método in vivo (3,07/colheita -

P<0,05). A mortalidade embrionária foi avaliada pela diferença das taxas de gestação aos

30 e 60 dias, com percentuais de 10,56% para embriões produzidos in vitro e 9,09% para os

obtidos in vivo (P=0,12). A relação macho:fêmea foi de 52,48% para machos e 47,52%

para fêmeas, pelo método in vitro (P=0,07), e 1:1 pelo método in vivo. A média mensal de

gestações obtidas por doadora foi de 2,7 para o método in vitro e 1,9 para o método in vivo.

Os resultados obtidos permitem concluir: 1) vacas Nelore produziram maior número de

embriões pelo método in vitro em comparação ao método in vivo 2) as taxas de gestação

aos 30 e 60 dias foram mais altas para os embriões obtidos in vivo (132/289; 120/289) do

que para os embriões produzidos in vitro (341/910; 305/341) 3) o método de produção in

vitro resultou em maior número de gestações por doadora em um mesmo período de tempo

4) a relação macho-fêmea foi similar nos dois métodos estudados 5) a utilização intercalada

das técnicas de produção de embriões in vitro e in vivo pode ser vantajosa, pela

possibilidade de agregação dos aspectos favoráveis de cada uma delas.

Palavras-chave: produção in vitro de embriões; colheita de embriões; gestação

NONATO JUNIOR, Ismael. Embryo production in Nelore (Bos taurus indicus) cows

with the association of the methods in vivo and in vitro. Londrina : UEL, 2005. (Msc

Dissertation).

Adviser: Prof. Dr. Marcelo Marcondes Seneda

ABSTRACT

In the present work were compared the in vitro embryo production with conventional approach method associated to

obtain embryos in Nelore breed, evaluating number of producted embryos, pregnancy rates, embryonic mortality and percentage

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male vs female of fetus. The donor animals (30) were submitted to 96 ultrasound guided transvaginal ovum pick-up sessions and in

vitro production of embryos (3,2/donor) and 43 embryo collections (1,43/donor). Were obtained 910 in vitro embryos

(9,48/session) and 289 in vivo embryos (6,72/collection – P<0,05).The in vitro method yielded 341 pregnancies

(3,55/session) and 132 using the conventional method (3,07/collection – P<0,05).The embryonic mortality was evaluated comparing the pregnancy rate at day 30 and day 60 after transfer,

with percentage of 10,56% to in vitro embryos and 9,09% to in

vivo embryos (P=0,12). The IVF approach used in the present study produced 52,48% males and 47,52% females (P=0,07) while

were obtained 50% males : 50% females using in vivo method. The monthly average of pregnancies obtained per donor was 2,7

to in vitro method and 1,9 to in vivo technique. The results showed that: 1) Nelore cows produced higher number of embryos using in vitro method compared with in vivo embryo production 2) pregnancy rates at day 30 and day 60 were higher in the case of in

vivo produced embryos (132/289; 120/289) that to in vitro produced embryos (341/910; 305/910) 3) the in vitro embryo

production method resulted in higher number of pregnancy per donor in the same period 4) the percentege of males and females was similar in both methods 5) the alternate utilization of embryo

production techniques in vitro and in vivo can be gainful, at possibility of aggregation of the favourable aspects of them

everyone.

Key-words: in vitro embryo production; embryo collection; pregnancy 3.3 Introdução

Com os avanços das biotécnicas reprodutivas, a produção de embriões apresenta-se

em contínua expansão, verificando-se expressivo crescimento na América Latina,

particularmente no Brasil (REINCHENBACH, 2003). Desde o primeiro relato de colheita

de embriões pelo método transcervical (GREVE, 1977) até a descrição da aspiração

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folicular transvaginal pela ultra-sonografia (PIETERSE et al., 1988), diversos grupos de

trabalho dedicam-se à busca pela maior eficiência em cada uma dessas técnicas.

Apesar dos embriões produzidos in vivo propiciarem taxas de gestação superiores

às obtidas com os embriões produzidos in vitro, o número de embriões obtidos por colheita

tem se mantido estável desde o início da década de oitenta (4,5 a 5,0) verificando-se pouca

eficiência nas tentativas de se obter mais embriões por procedimento (HASLER et al.,

1995). Além disso, 40-60% das doadoras não respondem ao tratamento superovulatório ou

respondem com números insatisfatórios (REICHENBACH, 2003).

Em decorrência desta limitação, a produção in vitro (PIV) de embriões expandiu-se

nos últimos anos, como método alternativo para aumentar o número de embriões obtidos,

pela possibilidade de se repetir a técnica em um menor período de tempo, além de ser

viável em doadoras com problemas de infertilidade extra-ovariana (BOLS et al., 1996).

Uma maneira para se obter um maior número de embriões em um menor período

de tempo é a associação dos métodos de produção de embriões in vivo e in vitro,

maximizando a exploração do potencial das doadoras, acelerando a seleção e o

melhoramento genético (BOUSQUET et al., 1999).

Visando este objetivo, analisamos a associação dos métodos in vitro e in vivo para a

produção de embriões em vacas da raça Nelore, bem como as taxas de gestação e a morte

embrionária entre 30 e 60 dias de gestação, e a razão macho/fêmea nas gestações

produzidas.

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3.4 Material e Métodos

3.4.1 Animais

O experimento foi realizado nas Fazendas São Francisco e Império, nos municípios

de Mogi Mirim/SP e Vargem Grande do Sul/SP, respectivamente, durante o período de

abril de 2003 a abril de 2004.

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Vacas da raça Nelore (n=30) de alto valor genético, livres de doenças infecciosas e

reprodutivas, doadoras, não gestantes, com idades variando de 2 a 8 anos (média de 5 anos)

e novilhas cruzadas, livres de doenças infecciosas e reprodutivas, receptoras, foram

utilizadas neste experimento.

Todos os animais foram submetidos intercaladamente às técnicas de colheita de

embriões e aspiração folicular, com intervalo médio de 45 dias. As aspirações foram

realizadas em média 3,2 procedimentos/animal, sendo o mínimo de uma e o máximo de

cinco vezes em cada animal, em um período médio de 4,2 meses / doadora. Em relação à

colheita de embriões, o mínimo foi de uma e o máximo de três, sendo a média 1,4

procedimentos/animal, em um período médio de 2,3 meses / doadora. Cada doadora, nos

procedimentos in vivo e in vitro, foi submetida ao mesmo touro, através de sêmen

congelado de fertilidade comprovada, proveniente de centrais de colheita de sêmen.

3.4.1.1 Preparo dos animais

Antes de cada procedimento, esvaziava-se o reto dos animais e a higienização da

região perineal era feita com água corrente e álcool etílico 70º GL. Para redução dos

movimentos peristálticos e o menor desconforto do animal, eram injetados 5 ml de

lidocaína 2 % no espaço epidural.

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3.4.2 Produção in vitro dos embriões

3.4.2.1 Aspiração folicular

Os procedimentos de aspiração folicular transvaginal (PIETERSE et al., 1988)

foram realizados com o auxílio de ultra-som 485 Anser (Pie Medical, Holanda) com

transdutor setorial (convexo) de 7,5 MHz. O transdutor era acoplado em dispositivo próprio

para utilização transvaginal (Ceafepe Tecnologia Veterinária Ltda., Brasil). Para aspiração

dos folículos eram utilizadas agulhas hipodérmicas descartáveis 40 mm x 20 G (Becton

Dickinson Ltda., Brasil) e mangueira de silicone com 2 mm de diâmetro interno e 80 cm de

comprimento. A pressão de vácuo era de 65 a 75 mm de Hg, mantida com uma bomba de

aspiração (Cook, Nova Zelândia). O meio de aspiração era constituído por DPBS

(Nutricell, Brasil) acrescido de 20.000 UI/L de heparina sódica (Liquemine, Roche, Brasil),

mantido à 30 ºC durante a aspiração. Este meio era utilizado para lavagem prévia do

sistema para prevenir a coagulação de sangue. Após a visualização e avaliação numérica, os

folículos eram aspirados em ambos ovários.

3.4.2.2 Seleção dos oócitos

Imediatamente após a aspiração folicular, o material recuperado era lavado em

filtros para colheita de embriões (Em Com) com DPBS (Nutricell, Brasil), e depositado em

placas de petri 90mm x 15 mm (Inlab, Brasil). Os oócitos recuperados eram classificados,

lavados em meio TCM 199 Hepes (Gibco, EUA ) suplementado com 10 % de Soro Fetal

Bovino (Gibco, EUA), 22 µg/mL de piruvato, 0,5 µg/mL de hormônio folículo estimulante

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(FSH - Folltropin-V, Vetrepharm, Canadá), e 50 µg/mL de hormônio luteinizante (LH –

APL, Bélgica), e transferidos para criotubos de 2 mL (Corning/Coastar, EUA) onde

permaneciam, durante o transporte até o laboratório, em incubadoras de transporte

(Minitub, Alemanha) à 38 ºC.

3.4.2.3 Maturação dos oócitos

Os oócitos eram colocados em placas de petri 60 mm x 15 mm (Corning, EUA), em

gotas de 100 µL de meio TCM 199 Bicarbonato (Gibco, EUA) suplementado com 10 % de

Soro Fetal Bovino (Gibco, EUA), 22 µg/mL de piruvato, 0,5 µg/mL de hormônio folículo

estimulante (FSH - Folltropin-V, Vetrepharm, Canadá), e 50 µg/mL de hormônio

luteinizante (LH - APL, Bélgica), recobertas com óleo mineral e mantidas à 38,8 ºC em

incubadoras (Thermo Forma, EUA) com atmosfera de 5% de CO2 em ar, durante 24 horas.

3.4.2.4 Fecundação dos oócitos

Após a maturação in vitro (MIV), os oócitos eram colocados em gotas de 100 µL de

meio Tyrodes, suplementado com 0,6 % de albumina sérica bovina (BSA - Fraction V,

Sigma, EUA), gentamicina, 22 µg/mL de piruvato, e 10 µg/mL de heparina (PARRISH et

al., 1986). A heparina é utilizada para capacitar os espermatozóides bovinos, através de

mudanças bioquímicas na membrana plasmática do espermatozóide. Palhetas contendo

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sêmen eram descongeladas por 20 segundos em água aquecida à 35 ºC, depositadas em

tubo cônico de 15 ml e centrifugadas a 900g por 30 minutos através de um gradiente de

Percoll 45-90% (Sigma, EUA). Após a centrifugação o sêmen era diluído para 106

espermatozóides vivos/mL e adicionado às gotas de fecundação, a 38,8 ºC e atmosfera de

5% de CO2 em ar. Os touros utilizados eram de fertilidade comprovada tanto para o método

in vitro como para o método in vivo.

3.4.2.5 Desenvolvimento

Após a fecundação in vitro (FIV), os oócitos e as células do cumulus eram

transferidos para gotas de 100 µL de meio de cultura de embriões, um fluido de oviduto

sintético modificado SOFaa BSA (TERVIT et al., 1972), contendo 8 mg/mL de BSA

(Sigma, EUA) livre de ácido graxo e 1 mM de glutamina, nas mesmas condições da FIV. A

osmolaridade foi mantida em 270 – 280 mOsmol e o pH em 7,4. A taxa de

desenvolvimento foi considerada pelo número de embriões obtidos a partir do total de

oócitos maturados.

3.4.3 Produção in vivo dos embriões

3.4.3.1 Superovulação das doadoras

Considerando como dia zero (D0) o dia para colocação do implante intravaginal de

1,9 g de progesterona (CIDR, Pfizer, Nova Zelândia) além da aplicação de 2 mg de

benzoato de estradiol (BE - Estrogin, Farmavet, Brasil). Entre o dia quatro (D4) e o dia sete

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(D7), as doadoras receberam 333 UI de FSH (Pluset, Serono, Itália), em doses decrescentes.

No dia 6 (D6), receberam duas doses de 250 mg de cloprostenol sódico (Ciosin, Coopers,

Brasil) com intervalo de 12 horas entre as aplicações. Na manhã do dia 8 (D8), foram

administrados 25 µg de lecirelina (Gestran Plus, Tecnopec, Brasil), e as doadoras foram

inseminadas 36 e 48 horas após a retirada do implante intravaginal no D7. No dia quinze

(D15), foram realizadas a colheita e a transferência dos embriões.

↓CIDR + BE Cloprostenol↓↓ ↑CIDR ↓Lecirelina Colheita e transferência ↓

�___________________�____�____�____�____�_____IA 36 e 48 hs__________________�

D0 D4 D5 D6 D7 D8 D15

�_____FSH____�

3.4.3.2 Colheita dos embriões

A colheita dos embriões foi realizada pelo método transcervical (GREVE, 1977),

utilizando-se DPBS (Nutricell, Brasil) para a lavagem uterina. O material drenado era

filtrado e depositado em placas de petri 90 mm x 15 mm (Inlab, Brasil). Posteriormente,

com o auxílio de uma lupa esteroscópica, selecionou-se os embriões, e então, somente os

embriões viáveis (segundo padrões da INTERNATIONAL EMBRYO TRANSFER

SOCIETY – 1998) foram envasados e transferidos.

3.4.4 Transferência dos embriões

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Os embriões obtidos pelos dois métodos foram transferidos a receptoras cruzadas,

livres de doenças infecciosas e reprodutivas, previamente sincronizadas e preparadas como

no item 3.4.1.1. As receptoras foram sincronizadas através da aplicação de 500 mg de

cloprostenol sódico (Ciosin, Coopers, Brasil), em dose única, administradas dois antes da

aspiração folicular, no caso dos embriões produzidos in vitro, e dois dias antes da IA, no

caso dos embriões produzidos in vivo. Os embriões foram transferidos através de

inovulação transcervical no corno uterino ipsilateral ao ovário com corpo lúteo.

3.4.5 Diagnóstico de gestação, avaliação da morte embrionária e sexagem fetal

Tanto no método in vitro como in vivo, o diagnóstico precoce de gestação e a

sexagem fetal foram realizados com o auxílio de ultra-som 485 Anser (Pie Medical,

Holanda), utilizando-se transdutor linear de 5,0 MHz. A sexagem fetal foi realizada através

da identificação da localização do tubérculo genital. O feto era avaliado ventralmente e, o

tubérculo genital localizado próximo ao umbigo, conferia o sexo masculino ao feto, e

feminino, se próximo a cauda. O diagnóstico precoce era realizado aos trinta dias de

gestação e o sexo dos fetos era conhecido nas gestações confirmadas aos sessenta dias. A

morte embrionária foi calculada pela diferença de percentual entre as taxas de gestação com

30 e 60 dias.

3.4.6 Análise estatística

A comparação entre os métodos in vitro e in vivo de produção de embriões

quanto às proporções de gestação, morte embrionária e sexo fetal foi realizada pelo método

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do qui-quadrado. A variável número de embriões foi analisada utilizando-se um modelo

linear geral, que incluiu os efeitos de tratamento (in vitro e in vivo), de animal e a interação

entre ambos, sendo que a comparação foi realizada pelo teste de Tukey.

3.5 Resultados

Foram obtidos 2.463 oócitos em 96 sessões de aspiração folicular, com média de

25,66 oócitos / aspiração. As médias de oócitos viáveis e inviáveis foram 22,92 e 2,74

respectivamente. Um total de 36,95 % dos oócitos atingiram estágio embrionário,

completando um total de 910 (9,48 / aspiração) embriões viáveis.

Das 43 colheitas de embriões, obtêve-se 376 estruturas totais (8,74 / colheita) e

289 (6,72 / colheita) embriões viáveis. O número médio de embriões viáveis por

procedimento variou de 0 a 24 para o método in vitro e de 2 a 19 para o método in vivo.

O número médio de embriões viáveis produzidos foi de 9,48 para o método in

vitro e 6,72 para o método in vivo (P<0,05) (Tabela 1). As taxas de gestação aos 30 dias

foram de 37,47% (341/910) para os embriões oriundos do método in vitro, e 45,67%

(132/289) para os embriões obtidos pelo método in vivo. Aos 60 dias, as taxas de gestação

foram de 33,52% (305/910) para os embriões produzidos pelo método in vitro, e 41,52%

(120/289) para os embriões produzidos pelo método in vivo. Houve diferença significativa

nas taxas de gestação aos 30 dias entre os métodos analisados e também nas taxas de

gestação aos 60 dias (P<0,05), conforme ilustrado na Tabela 2.

Tabela 1. Produção média de embriões para os métodos in vitro e in vivo.

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Método Produção média de embriões In Vitro 9,48a In Vivo 6,72b

P < 0,05

Tabela 2. Taxas de gestação aos 30 e 60 dias para os embriões produzidos in vitro e in

vivo.

Origem dos embriões

In Vitro In Vivo

Nº de embriões transferidos 910 289

Gestações aos 30 dias (%) 341 (37,47)a 132 (45,67)b

Gestações aos 60 dias (%) 305 (33,52)a

120 (41,52)b

Valores com sobescritos diferentes na mesma linha diferem entre si P < 0,05

A diferença entre as taxas de gestação aos 30 e 60 dias retrata a morte

embrionária. Embora esta taxa tenha sido numericamente maior para os embriões

produzidos in vitro, do que para os embriões produzidos in vivo, sendo, respectivamente,

10,56% (36/341) e 9,09% (12/132), não houve diferença significativa (P=0,12) (Tabela 3).

Tabela 3. Morte embrionária entre 30 e 60 dias de gestação.

Método Morte embrionária (%)

In Vitro 10,56

In Vivo 9,09

P = 0,12

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Para o método in vitro, a percentagem de machos e fêmeas foi, respectivamente,

52,48% (159/303) e 47,52% (144/303) (P=0,07). Para o procedimento in vivo, a relação

macho:fêmea foi exatamente 1:1 (60/120) (Tabela 4).

Tabela 4. Relação macho – fêmea para os embriões produzidos in vitro e in vivo.

Método Machos (%) Fêmeas (%)

In Vitro 52,48 47,52

In Vivo 50,0 50,0

P = 0,07

O número médio de gestações obtidas por doadora por mês foi de 2,7 para o

método in vitro e 1,9 para o método in vivo (Tabela 5).

Tabela 5. Produção média mensal de gestações por doadora para os métodos in vitro e

in vivo.

Método Produção mensal de gestações (gestações/doadoras/meses) média

In Vitro (341/30/4,2) 2,7

In Vivo (132/30/2,3) 1,9

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3.6 Discussão

A aspiração folicular guiada por ultra-sonografia para produção in vitro de

embriões bovinos mostrou-se eficaz com média de 25,66 oócitos recuperados por sessão de

aspiração. Na produção in vivo de embriões obteve-se média de 8,74 estruturas totais por

sessão de colheita de embriões. Hasler et al. (1995) obtiveram média de 5,03 oócitos por

sessão de aspiração, sendo que 17,83% dos oócitos atingiram estágio embrionário. No

presente trabalho, 36,95% dos oócitos Bos indicus tornaram-se embriões, mostrando

diferença de aproximadamente 20% em relação aos números para Bos taurus obtidos por

Hasler et al. (1995).

A média de embriões produzidos in vitro foi de 9,48 por sessão de aspiração

folicular, porém, foi obtida média de 6,72 embriões viáveis produzidos in vivo por colheita

de embrião. Hasler et al. (1995) obtiveram média bem mais baixa de embriões produzidos

in vitro (0,72 / aspiração folicular). Bousquet et al. (1999) obtiveram resultados

semelhantes de produção embrionária in vitro (4,7) e in vivo (4,3). VIANA et al. (2004)

utilizaram vacas da raça Gir e conseguiram média de 3,91 embriões viáveis produzidos in

vivo, e 7,83 embriões viáveis produzidos in vitro. Neste trabalho, o maior número de

embriões produzidos in vitro, possivelmente ocorre pelo fato dos animais Bos indicus

apresentarem maior quantidade de folículos em seus ovários, permitindo maior recuperação

de oócitos e maior produção embrionária.

Aos 30 dias de gestação, 341 dos 910 embriões produzidos in vitro foram

confirmados gestantes, representando uma taxa de gestação de 37,47%. No entanto,

embriões Bos taurus biopsiados produzidos in vitro, mesmo considerando-se a injúria

causada pela biópsia, apresentaram taxa de gestação de 53,4% (BOUSQUET et al., 1999).

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A taxa de gestação aos trinta dias, para embriões produzidos in vivo, foi de 45,67%, um

pouco inferior aos 53% reportado por Bousquet et al. (1999).

O presente estudo apresentou taxa de gestação aos 60 dias de 33,52% para

embriões produzidos in vitro, e de 41,52% para embriões produzidos in vivo. Hasler (1994)

obteve taxa de gestação similar aos sessenta dias (54%), para embriões produzidos in vitro

tanto biopsiados quanto intactos, levando-se em consideração a injúria causada pela

biópsia. Em outro estudo, embriões produzidos in vitro tiveram taxa de gestação aos 60 dias

notavelmente inferior ao mesmo número de embriões produzidos in vivo, respectivamente,

37% e 79% (FARIN, 1995).

A morte embrionária que ocorre entre 30 e 60 dias de gestação foi considerada

normal para os embriões produzidos in vitro (10,56%) e para os embriões produzidos in

vivo (9,09%). Bousquet et al. (1999) relataram morte embrionária superior para embriões

produzidos in vitro (9,6%) do que para embriões produzidos in vivo (2,9%), porém, todos

esses embriões foram injuriados por biópsia.

Nas gestações confirmadas aos 60 dias, o sexo dos fetos era conhecido obtendo-

se satisfatória relação macho-fêmea, com 52,48% de machos e 47,52% de fêmeas, para

embriões produzidos in vitro. Na produção in vivo de embriões, a relação macho:fêmea foi

de 1:1. Bousquet et al. (1999) obtiveram 60,2% de embriões machos produzidos in vitro e,

para os embriões produzidos in vivo, 49,8% eram machos. Uma vez que a demanda é maior

por fêmeas na raça em questão, estes resultados nos mostram uma quantidade de fêmeas

próxima a de machos, o que também é favorável para a produção in vitro de embriões, já

que é uma técnica que rotineiramente produz mais machos.

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3.7 Referências

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techniek: geboorte van de eerste OPU kalveren in België. Vlaams Diergeneeskunding

Tijdschrift, v.65, p. 86-91, 1996.

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G.; DUROCHER, J. In vitro embryo production in the cow: an effective alternative to the

conventional embryo production approach. Theriogenology, v. 51, p. 59-70, 1999.

FARIN, P.W.; FARIN, C.E. Transfer of bovine embryos produced in vivo or in vitro:

survival and foetal development. Biology Reproduction, v. 52, p. 676-682, 1995.

GREVE, T.; LEHN-JENSEN, H.; RASBECH, N.O. Non-surgical recovery of bovine

embryos. Theriogenology, v. 07, n. 04, p. 239-250, 1977.

HASLER, J.F. Commercial applications of in vitro fertilization in cattle. The

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HASLER, J.F.; HENDERSON, W.B.; HURTGEN, P.J.; JIN, Z.Q.; McCAULEY, A.D.;

MOWER, S.A.; NEELY, B.; SHUEY, L.S.; STOKES, J.E.; TRIMMER, S.A. Production,

freezing and transfer of bovine IVF embryos and subsequent calving results.

Theriogenology, v. 43, p. 141-152, 1995.

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PARRISH, J.J.; SUSKO-PARRISH, J.L.; LEIBFRIEDGE-RUTHEDGE,

M.L., CRITSER E.S., EYESTONE, W.H.; FIRST, N.L.Bovine in vitro

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600,1986.

PIETERSE, M.C.; KAPPEN K.A.; KRUIP, T.A.M.; TAVERNE, M.A.M.

Aspiration of bovine oocytes during transvaginal ultrasound scanning of the

ovaries. Theriogenology, v. 30, n. 04, p. 751-762, 1988.

REICHENBACH, H. D. Transferência e congelamento de embriões bovinos: considerações

práticas. Arquivos da Faculdade de Veterinária UFRGS, v.31, n.1, p.15, 2003.

STRINGFELLOW, D. A.; SEIDEL, S. M. Manual da Sociedade

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TERVIT, H.R.; WHITTINGHAM, D.G.; ROWSON, L.E.A. Successful culture in vitro of

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VIANA, J.H.M.; ARASHIRO, E.K.N.; FREITAS, C.; PALHÃO, M.P.; FONSECA, J.F.

Associação entre as técnicas de punção folicular e colheita de embriões em vacas gir.

Arquivos da Faculdade de Veterinária UFRGS, v. 32, n.1, p. 193, 2004. (Resumo).

4. Conclusões

Os resultados obtidos nos permitem concluir que:

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1) Vacas Nelore produziram maior número de embriões pelo método in vitro em

comparação ao método in vivo

2) As taxas de gestação aos 30 e 60 dias foram mais altas para os embriões obtidos in

vivo

3) O método de produção in vitro resultou em maior número de gestações por doadora

em um mesmo período de tempo

4) A relação macho-fêmea foi similar nos dois métodos estudados

5) A utilização intercalada das técnicas de produção de embriões in vitro e in vivo pode

ser vantajosa, pela possibilidade de agregação dos aspectos favoráveis de cada uma

delas.

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