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Isolamento de ácidos nucléicos de células e tecidos Extração de ácidos nucléicos Obtenção do material: • Vírus • Bactérias; fungos • Célula vegetal / célula animal

Isolamento de ácidos nucléicos de células e tecidos Extração de ácidos nucléicos

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Isolamento de ácidos nucléicos de células e tecidos Extração de ácidos nucléicos. Obtenção do material: Vírus Bactérias; fungos Célula vegetal / célula animal. Extração de ácidos nucléicos. Requerimento essencial: quantidade (rendimento) pureza integridade - PowerPoint PPT Presentation

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Page 1: Isolamento de ácidos nucléicos de células e tecidos Extração de ácidos nucléicos

Isolamento de ácidos nucléicos

de células e tecidos

Extração de ácidos nucléicos

Obtenção do material:

• Vírus

• Bactérias; fungos

• Célula vegetal / célula animal

Page 2: Isolamento de ácidos nucléicos de células e tecidos Extração de ácidos nucléicos

Extração de ácidos nucléicos

Requerimento essencial: • quantidade (rendimento)• pureza• integridade

Etapas na obtenção de ácidos nucléicos:• Lise física ou bioquímica das paredes celulares

e membranas• Purificação dos ácidos nucléicos: desnaturação /

inativação de proteínas celulares• Precipitação

Page 3: Isolamento de ácidos nucléicos de células e tecidos Extração de ácidos nucléicos

Extração de ácidos nucléicos

1. Rompendo membranas celulares

Lise das células liberação dos componentes

citoplasmáticos e/ou nucleares

Estratégia: de acordo com o tipo de célula

envolvida: (deve ser o mais “gentil” possível)

- bactérias (parede glicoproteica) tratamento

inicial com lisozimas (orifícios na parede enfraquecimento rompimento em solução

hipotônica); outras soluções alternativas:

temperatura elevada; sonificação

Page 4: Isolamento de ácidos nucléicos de células e tecidos Extração de ácidos nucléicos

Extração de ácidos nucléicos

Células de plantas ou animais presentes em tecidos:

• Pré tratamentos adicionais para romper a matriz tecidual célula individual lise: digestão enzimática / homogeneização

• Célula vegetal – parede celular: tratamento mecânico para promover lise.

Page 5: Isolamento de ácidos nucléicos de células e tecidos Extração de ácidos nucléicos

Extração de ácidos nucléicos

Células sem cobertura externa ou em solução:

Sem tratamentos agressivos – tratamento com detergente – SDS (SODIUM DODECYL SULFATE) – dodecil sulfato de sódio substâncias tensoativas que agem dissociando as proteínas dos ácidos nucleicos e dissolvendo proteínas de membranas

solução de lise: NH4Cl / NH4HCO3

Page 6: Isolamento de ácidos nucléicos de células e tecidos Extração de ácidos nucléicos

2. Desnaturando proteínas celulares:

Lisados celulares contêm mistura complexa de macromoléculas:

- DNA / RNA; proteínas, lipídeos, carboidratos.- Fragmentos de membrana lipídica- Proteínas intracelulares: enzimas nucleases

degradativas – DNAses / RNAses interferem no rendimento dos ácidos nucléicos

Melhora na recuperação dos ácidos nucléicos: - Extração em baixas temperaturas- Incubação dos lisados com reagentes desnaturan- tes

de proteínas- Agentes que retardam atividade das nucleases:

Page 7: Isolamento de ácidos nucléicos de células e tecidos Extração de ácidos nucléicos

Extração de ácidos nucléicos

Agentes que retardam atividade das nucleases: - tampões de extração com agentes quelantes

(EDTA – ácido etileno diaminotetracético)- Solução de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico

desnaturam nucleases e coagulam proteínas durante a extração

- RNA- inibir Rnases (proteinase K; DEPC – dietil pirocarbonato )

Page 8: Isolamento de ácidos nucléicos de células e tecidos Extração de ácidos nucléicos

Extração de ácidos nucléicos 3. Separando DNA / RNA / Proteínas

Extração por solventes - precipitação e/ou centrifugação

Extração com fenol – solvente orgânico; desnatura proteínas; permite isolamento de DNA e proteínas

(emprega solubilidade diferencial de proteínas, lipídios e ácidos nucleicos no fenol)

Após centrifugação do lisado / mistura com fenol: 3 fases: aquosa (ácidos nucleicos)

interface: proteínas

camada do fenol

Page 9: Isolamento de ácidos nucléicos de células e tecidos Extração de ácidos nucléicos

Após centrifugação do lisado / mistura com fenol:

Extração de DNA (fenol com pH neutro ou básico)

3 fases: aquosa (ácidos nucléicos: DNA e RNA)

interface: proteínas

camada do fenol

Camada aquosa

Camada de proteínas

Camada do fenol

pH

pH neutro

ou básico

Page 10: Isolamento de ácidos nucléicos de células e tecidos Extração de ácidos nucléicos

Após centrifugação do lisado / mistura com fenol:

Extração de RNA (fenol com pH ácido)

3 fases: aquosa (RNA)

interface: proteínas

camada do fenol (DNA)

Camada aquosa

Camada de proteínas

Camada do fenol

pH

pH ácido

Page 11: Isolamento de ácidos nucléicos de células e tecidos Extração de ácidos nucléicos

Extração de ácidos nucléicos 4. Precipitação e lavagem com álcool

DNA: Ressuspender DNA em TE pH 8,0 – (Tris-HCl / EDTA), até completa dissolução – Armazenar a 4ºC -20º C

DNA precipitado

Page 12: Isolamento de ácidos nucléicos de células e tecidos Extração de ácidos nucléicos

Extração de ácidos nucléicos 4. Precipitação e lavagem com álcool

RNA: Ressuspender RNA em água estéril (DEPC) –

incubar à 55 – 65ºC por 10 minutos (inativar RNAse) – armazenar `a -80ºC

RNA precipitado

Page 13: Isolamento de ácidos nucléicos de células e tecidos Extração de ácidos nucléicos

Extração de ácidos nucléicos com fenol DNA RNA

Camada aquosa (RNA)Interface (proteínas)Camada de fenol (DNA)

Fenol pH neutro/alc. Fenol pH ácido

DNA pptado RNA pptado

Page 14: Isolamento de ácidos nucléicos de células e tecidos Extração de ácidos nucléicos

Extração de ácidos nucléicos a partir de sangue total

Page 15: Isolamento de ácidos nucléicos de células e tecidos Extração de ácidos nucléicos

Extração de ácidos nucléicos

Page 16: Isolamento de ácidos nucléicos de células e tecidos Extração de ácidos nucléicos

Extração de ácidos nucléicos

Page 17: Isolamento de ácidos nucléicos de células e tecidos Extração de ácidos nucléicos

Gel de agarose 1% com 3 l de DNA genômico

M 1 2 3

M - Marcador

1, 2 e 3 - amostras de DNA genômico

Page 18: Isolamento de ácidos nucléicos de células e tecidos Extração de ácidos nucléicos

Extração de ácidos nucléicos

• Soluções utilizadas• tampão de extração• solução de lise• solução desnaturante de proteínas• fenol• clorofórmio• Etanol• Proteinase K

Page 19: Isolamento de ácidos nucléicos de células e tecidos Extração de ácidos nucléicos

Extração de ácidos nucleicos

Função dos reagentes • Tampão: proporciona um pH ideal para

manutenção da integridade das moléculas de ácidos nucléicos; inibem atividade de desoxirribonuclease; ex.: TE - pH 8,0 (Tris-HCl / EDTA – ácido etilenodiamino tetracético).

• Detergentes: substâncias tensoativas que agem dissociando as proteínas dos ácidos nucléicos e dissolvendo os lipídios de membrana; SDS = sodium dodecyl sulfate.

• Fenol: desnatura proteínas, permitindo o isolamento de DNA/RNA de amostras biológicas.

Page 20: Isolamento de ácidos nucléicos de células e tecidos Extração de ácidos nucléicos

Extração de ácidos nucléicos

Função dos reagentes • Clorofórmio: desnatura proteínas aumentando a

eficiência da extração de ácidos nucléicos.

• Inibidores de nucleases: quelante de Mg++(EDTA)

DEPC – dietil pirocarbonato).

• Etanol: induz alterações estruturais nas moléculas de ácidos nucléicos provocando a agregação das moléculas, seguida de precipitação (remove resíduos de fenol e clorofórmio).

• Proteinase K – a contaminação com proteínas pode ser removida pela digestão com proteinase K