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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ SETOR DE TECNOLOGIA DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS Trabalho acadêmico apresentado à disciplina Processos Fermentativos Industriais da Universidade Federal do Paraná. CURITIBA 2008

Isolamento de Microrganismos

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  • UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARAN

    SETOR DE TECNOLOGIA

    DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUMICA

    ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS

    Trabalho acadmico apresentado

    disciplina Processos Fermentativos

    Industriais da Universidade Federal

    do Paran.

    CURITIBA

    2008

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    SUMRIO

    1- INTRODUO................................................................................................ 2

    1.1- MEIOS DE CULTURA.............................................................................. 5

    2- DIVERSIDADE MICROBIANA........................................................................ 7

    3- ISOLAMENTO EM CULTIVO SLIDO........................................................... 13

    3.1- TCNICA DE SEMEADURA POR ESTRIAS........................................... 13

    3.2- TCNICA DE SEMEADURA POR ESPALHAMENTO............................. 14

    3.3- TCNICA DE SEMEADURA POR DERRAMAMENTO........................... 16

    3.4- TCNICA DE SEMEADURA EM PROFUNDIDADE................................ 17

    4- ISOLAMENTO EM CULTIVO LQUIDO......................................................... 17

    5- ISOLAMENTO EM CULTIVO CONTNUO..................................................... 18

    6- CULTURAS PURAS DE BACTRIAS........................................................... 21

    7- CULTURAS PURAS DE ACTINOMICETOS.................................................. 21

    8- CULTURAS PURAS DE FUNGOS................................................................. 23

    9- CULTURAS PURAS DE ALGAS.................................................................... 23

    10- OUTRAS TCNICAS.................................................................................... 23

    11- REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS............................................................. 25

    12- ANEXOS....................................................................................................... 27

  • 2

    1- INTRODUO

    Isolamento consiste na obteno de culturas puras que envolvem somente o

    organismo de interesse. Na fase do isolamento, ocorre a seleo de uma colnia

    atravs da observao da produo de determinado produto ou da morfologia da

    colnia (STANBURY, WHITAKER E HALL, 1995).

    Apesar de existir a possibilidade de utilizar microrganismos geneticamente

    modificados, ainda possvel encontrar uma grande variedade de novos

    microrganismos no meio ambiente, sendo que muitos podem ser at comercialmente

    interessantes. A primeira etapa para a utilizao de um microrganismo de interesse

    industrial muitas vezes a etapa de isolamento de uma colnia.

    Normalmente, as colnias de microrganismos se originam somente de uma

    clula ou esporo de microrganismo. Essas colnias apresentam caractersticas

    morfolgicas diferentes, as quais permitem a distino entre os microrganismos,

    como mostra a Figura 1. No entanto, para conseguir uma visualizao das colnias

    independentes no meio slido, necessrio a distribuio uniforme das bactrias

    sobre a placa de Petri. (TORTORA et al., 2006)

    Figura 1- Morfologia de colnias bacterianas

    Fonte: PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002.

    Uma cultura livre de outros microrganismos contaminantes onde o

    microrganismo de interesse est presente de forma homognea denominada

    cultura axnica. Um cultivo desse tipo d oportunidade de investigao de

  • 3

    caractersticas fisiolgicas e genticas sem a interferncia de outros microrganismos

    e em uma densidade populacional muito maior do que a encontrada em amostras de

    meio ambiente. No entanto alguns fatores podem ser alterados justamente por esse

    motivo, pois no meio ambiente ocorre uma interao entre diversas espcies e

    nutrientes, podendo, por exemplo, modificar o formato, a textura e a colorao de

    colnias (OGUNSEITAN, 2005).

    O isolamento, assim como todo o processo que ir se desenvolver

    futuramente, deve ser o mais econmico possvel, levando-se em considerao a

    produtividade que ser obtida pelo microrganismo e os gastos necessrios para

    isolamento de tal microrganismo. Fatores importantes na escolha de um

    microrganismo so as suas caractersticas nutricionais, pois se almeja obter

    microrganismos que utilizem substratos baratos, que podem ser obtidos atravs da

    formulao adequada do meio de isolamento; a temperatura tima, pois organismos

    com temperatura tima de 40C para cima facilitam o isolamento e reduz os custos

    de resfriamento do fermentador; ser compatvel com o fermentador utilizado e com o

    processo de cultivo desejado; e deve ser geneticamente estvel, ou quando se

    deseja a manipulao gentica devem ser conhecidos os melhores mecanismos

    (STANBURY, WHITAKER E HALL, 1995).

    Os microrganismos isolados podem ser obtidos a partir de ambientes naturais

    ou a partir de bancos de cepas. Esses centros de cepas, como os mostrados na

    Tabela 1, podem fornecer microrganismos de caractersticas j conhecidas, mas

    nem sempre esto presentes os melhores caracteres desejados, enquanto o

    ambiente possui uma infinidade de variaes. Os bancos de culturas tm como

    funo o armazenamento, a preveno de eventuais mudanas nas suas

    caractersticas, o ensino e a pesquisa sobre manuteno e caracterizao de cepas

    (ROITMAM, TRAVASSOS e AZEVEDO, 1988).

    Pode ser mais barato comprar uma cultura do que isol-la da natureza, mas

    tambm pode ser que se encontre um organismo muito melhor depois de uma

    procura extensa no meio ambiente. Mas geralmente necessrio utilizar uma cepa

    dos bancos como uma referncia para comparao com novos microrganismos

    descobertos atravs do isolamento da natureza (STANBURY, WHITAKER E HALL,

    1995).

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    Tabela 1 Principais centros de coleo de culturas

    Fonte: ROITMAM, TRAVASSOS e AZEVEDO, 1988.

    O isolamento inicia com a escolha da fonte mais provvel de conter o

    microrganismo desejado, podendo variar desde solo at guas, ar, lodo, alimentos

    ou rgos. Caractersticas que um determinado organismo possui para se

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    desenvolver em certo ambiente so usadas como fatores seletivos no processo de

    isolamento.

    Presso seletiva muitas vezes utilizada no isolamento de microrganismos

    que se desenvolvem preferencialmente em determinado substrato, na presena de

    certos compostos ou no cultivo sob condies que so adversas a outros

    microrganismos que no so de interesse.

    Quando no possvel fazer uso da presso seletiva, utilizam-se

    caractersticas detectveis como morfologia (tipo e forma da colnia) ou produo de

    compostos caractersticos de determinada espcie (como, por exemplo, a produo

    de antibiticos por estreptomicetos) (STANBURY, WHITAKER E HALL, 1995).

    1.1- MEIOS DE CULTURA

    Para fazer o isolamento de um microrganismo, deve-se empregar o meio de

    cultivo mais adequado para o seu desenvolvimento. O meio de cultura um material

    nutriente preparado em laboratrio cuja utilizao importante para o crescimento,

    transporte e estocagem de microrganismos. No preparo do meio muitas vezes

    emprega-se o ambiente natural como modelo de composio, pois os requerimentos

    nutricionais dos microrganismos refletem o tipo de ambiente onde ele encontrado

    (PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002).

    Os meios de cultivo podem ser classificados em: meios sintticos

    (quimicamente definidos) e meios complexos. Os meios sintticos so aqueles em

    que a composio qumica exata conhecida. Alguns microrganismos necessitam

    de um meio definido com muitos fatores necessrio para o crescimento e so

    denominados fastidiosos ou muito exigentes em termos nutricionais. Meios

    quimicamente definidos so utilizados normalmente em trabalhos experimentais em

    laboratrios ou para o crescimento de seres autotrficos (TORTORA et al., 2006).

    J os meios complexos so aqueles que apresentam algum componente que

    tem uma composio varivel. Nesse caso esto includos extratos de leveduras, de

    carne, de plantas ou produtos da digesto protica como peptonas. Quando o meio

    complexo est na forma lquida chamado de caldo nutriente e quando est na

    forma solidificada chamado de gar nutriente. Esses meios so utilizados

    normalmente para bactrias heterotrficas e fungos (TORTORA et al., 2006). Meios

    complexos tambm so usados quando no as necessidades nutricionais de um

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    microrganismo em particular no so conhecidas e, portanto, um meio definido no

    pode ser construdo (PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002).

    No caso de microrganismos anaerbios deve-se utilizar um meio especial

    denominado meio redutor. Eles contm reagentes como o tioglicolato de sdio que

    capaz de se combinar com o oxignio dissolvido, eliminando-o da cultura

    (TORTORA et al., 2006).

    Meios de cultivo que propiciam o desenvolvimento de vrios tipos de

    microrganismos so chamados de meios de uso geral, como o tryptic soy broth.

    Quando esses meios so complementados com algumas substncias de forma a

    fortific-lo, temos ento um meio enriquecido.

    Quando h substncias que favorecem o crescimento de determinado

    organismo e/ou inibem o de outros no meio, eles passam a serem chamados de

    meios seletivos. Nesses meios h componentes como sais de bile e cristal violeta

    (inibem o desenvolvimento de bactrias gram-positivas), substratos degradados

    somente por alguns tipos de microrganismos, ou antibiticos (PRESCOTT, HARLEY

    e KLEIN, 2002).

    Os meios de cultivo tambm podem ser diferenciais quando possvel

    distinguir de alguma forma os diferentes tipos de microrganismos. Por exemplo, no

    gar sangue possvel separar bactrias hemolticas (que formam um halo ao seu

    redor) de no-hemolticas (que no formam halo), ou no gar MRS com corante azul

    de anilina, onde as bactrias lcteas iro ficar azuladas e outros microrganismos

    no.

    Tambm existem os meios de enriquecimento, que so utilizados no

    isolamento de bactrias presentes em pequeno nmero junto com outras que esto

    em grande quantidade. Ele semelhante ao meio seletivo, sendo que a diferena

    que o microrganismo a ser cultivado est em pequena quantidade e seu crescimento

    deve ser estimulado (TORTORA et al., 2006). A tabela 2 resume todos esses meio e

    em que ocasies eles devem ser utilizados.

  • 7

    Tabela 2- Meios de Cultura

    Tipo Finalidade

    Quimicamente

    definido

    Crescimento de quimioautotrficos e autotrficos e anlises

    microbiolgicas.

    Complexo Crescimento da maioria dos organismos quimio-heterotrficos.

    Redutor Crescimento de anaerbios obrigatrios.

    Seletivo Impedir o crescimento de microrganismos no desejados;

    favorecer o crescimento do organismo de interesse.

    Diferencial Diferenciar colnias do organismo de interesse dos outros

    microrganismos.

    Enriquecimento Semelhante ao seletivo, mas com a caracterstica importante de

    aumentar o nmero de bactrias de interesse tornando-a

    detectvel.

    Fonte: TORTORA et al., 2006.

    2- DIVERSIDADE MICROBIANA

    O termo diversidade, no contexto biolgico, define a multiplicidade de formas

    presente em um sistema, sendo que muitas vezes essas diferentes formas s ficam

    aparentes atravs da utilizao de ferramentas especializadas de observao.

    Essas ferramentas podem ir desde a visualizao atravs de microscpio ou at

    uma anlise em nvel molecular.

    No entanto, mesmo com toda a tecnologia disponvel, no possvel obter

    uma informao completa sobre todos os microrganismos presentes em uma

    amostra de ambiente, devido inadequao de certos microrganismos s tcnicas

    de recuperao, isolamento e cultivo utilizadas atualmente. Esses microrganismos

    no cultivveis ainda so metabolicamente ativos e so chamados de viveis, mas

    no cultivveis (VBNC viable but non-culturable) ou de somniclulas ou

    dormentes no-esporuladas. Portanto, muitos microrganismos presentes na

    natureza ainda no formaram colnias viveis sob condies laboratoriais e somente

    10% (ou menos) passvel de ser cultivado em laboratrio. A figura 2 esquematiza

    os microrganismos possveis de serem cultivados (ativos, danificados e dormentes)

    e aqueles no-cultivveis (VBNC, inativas, e mortas) (OGUNSEITAN, 2005).

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    Figura 2- Estados fisiolgicos dos microrganismos e possibilidade de cultivo

    Fonte: OGUNSEITAN, 2005.

    Para os organismos cultivveis, ainda pode haver uma diferena na sua

    atividade na natureza e sob condies laboratoriais. Por exemplo, as cianobactrias

    Trichodesminium so capazes de formar colnias em laboratrio, mas na natureza

    so encontradas somente na forma individualizada.

    A maioria das tentativas de isolamento tenta proporcionar uma condio

    balanceada de nutrientes como fonte de carbono, condies timas de temperatura,

    pH, presso de oxignio e umidade. Algumas espcies requerem tambm fatores de

    crescimento, sendo que alguns deles podem estar sendo produzidos por outras

    espcies que convivem junto no meio ambiente. A simulao de um ambiente

    natural um bom comeo para o isolamento e cultivo desses microrganismos.

    (OGUNSEITAN, 2005)

    Devido grande diversidade de microrganismos presentes no meio ambiente,

    possvel encontrar numa amostra ambiental caractersticas nutricionais variadas,

    as quais definem o tipo de meio de isolamento a ser utilizado. Pode-se fazer uma

    distino com relao s fontes de energia, fontes de carbono e os oligoelementos.

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    A figura 3 mostra as diferentes combinaes dessas caractersticas e a classificao

    dos microrganismos com relao a elas.

    Figura 3- Classificao de microrganismos de acordo com as fontes utilizadas

    Fonte: OGUNSEITAN, 2005.

    Meios de cultivo seletivo ou condies seletivas de incubao podem ser

    usados para estreitar a variedade de espcies em uma comunidade microbiana. O

    uso de meios enriquecidos com determinado substrato limitante possibilita um maior

    crescimento de determinadas espcies em detrimento de outras. Por exemplo,

    Beijerinck isolou espcies de Rhizobium de ndulos de razes atravs do

    enriquecimento por substratos nitrogenados limitantes; estudos recentes usando

    enriquecimento tambm conseguiram descobrir espcies capazes de metabolizar

    molculas xenobiticas e antropognicas de poluentes. A tcnica de enriquecimento

    tambm pode ser chamada na literatura de bioaugmentation ou molecular breeding

    (OGUNSEITAN, 2005).

    As interaes entre microrganismos no ambiente podem ser muito

    importantes, e, quando no se deseja utilizar somente um microrganismo isolado,

    pode-se fazer uso de dois tipos de culturas: culturas de populaes mistas ou

    culturas de comunidades microbianas. A primeira consiste na combinao de duas

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    ou mais culturas puras enquanto exclui outros microrganismos, pois feito em

    condies asspticas. Culturas de comunidades microbianas j incluem interaes

    entre fatores biticos e abiticos, podem ocorrer variaes da composio das

    espcies microbianas devido a essas condies. Elas so mantidas em

    microcosmos que so estruturados para incubar amostras naturais em laboratrio,

    sendo importantes na investigao de como mudanas ambientais tem reflexo na

    diversidade microbiana. (OGUNSEITAN, 2005)

    H uma grande diversidade de populaes microbianas, sendo que em cada

    ambiente ser encontrado um nicho diferente. Pequenas distncias como milmetros

    no solo podem ter uma condio de oxignio, luz e nutrientes diferente que propicia

    o desenvolvimento de variados microrganismos. A tabela 3 mostra a quantidade de

    microrganismos estimada no solo dependendo da profundidade estudada. Esse

    nmero no certo, pois no possvel isolar em uma placa para contagem todos

    os tipos de microrganismos presentes na natureza (TORTORA et al., 2006).

    Tabela 3- Microrganismos por grama de um solo tpico de jardim em vrias

    profundidades.

    Profundidade (cm) Bactrias Actinomicetos* Fungos Algas**

    3-8 9.750.000 2.080.000 119.000 25.000

    20-25 2.179.000 245.000 50.000 5.000

    35-40 570.000 49.000 14.000 500

    65-75 11.000 5.000 6.000 100

    135-145 1.400 - 3.000 -

    * Bactrias filamentosas

    ** Algas encontradas em grandes profundidades no so ativas metabolicamente, mas foram

    introduzidas por drenagem ou movimentos mecnicos.

    Fonte: TORTORA et al., 2006.

    Alm dos solos, tambm podem ser isolados microrganismos do ambiente

    areo, aqutico. No ambiente aqutico, as populaes microbianas so afetadas

    principalmente pela disponibilidade de oxignio, nutrientes e luminosidade. Para

    algas fotossintticas a luz a fonte de energia principal e, portanto, elas se

    localizam prximas superfcie. Esses organismos so importantes para o ambiente

    porque tambm so fontes de alimento para bactrias, protozorios, peixes e outras

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    formas de vida aqutica. Como o oxignio no se difunde bem na gua, perto do

    fundo de um lago estaro microrganismos anaerbicos. A Figura 4 mostra um lago

    em trs zonas de caractersticas diferentes e os microrganismos mais provveis de

    serem encontrados em cada uma (TORTORA et al., 2006).

    Figura 4- As zonas de um lago e os microrganismos tpicos de cada zona

    Fonte: TORTORA et al., 2006.

    Podemos ver tambm a variao dos tipos de microrganismos encontrados

    de acordo com cada poro de um ambiente atravs da coluna de Winogradsky

    (Figura 5). Ela consiste de uma coluna de 30 cm de altura por 5 cm de dimetro

    onde h a deposio de um tero do volume com sedimento de rio ou lago e a

    complementao com gua do mesmo ambiente. ento feito o cultivo por dois a

    trs meses e, aps esse perodo possvel isolar microrganismos devido ao

    gradiente qumico. Ser possvel encontrar microrganismos representantes de cada

    uma das categorias apresentadas anteriormente na Figura 3. (OGUNSEITAN, 2005)

  • 12

    Figura 5- Separao de microrganismo de acordo com o gradiente qumico

    Fonte: OGUNSEITAN, 2005.

    Devido grande quantidade de microrganismos presentes em um meio

    natural altamente competitivo, eles tentam explorar todas as vantagens fisiolgicas e

    metablicas possveis para ter um desenvolvimento melhor em relao aos outros

    microrganismos competidores. Eles devem utilizar os nutrientes comuns mais

    rapidamente, utilizar nutrientes que outros no consigam metabolizar e ainda se

    possvel produzir metablitos que inibem o crescimento de concorrentes. Por

    exemplo, bactrias lcticas so capazes de tornar um nicho inspito para

    organismos competidores atravs da produo de cido ltico que ir acidificar o

    meio e inibir alguns outros organismos (TORTORA et al., 2006).

    Microrganismos que se desenvolvem em ambientes que apresentam

    condies extremas de temperatura, salinidade, acidez ou alcalinidade so

    chamados de extremfilos. Seu isolamento tem sido muito importante atualmente

    devido possibilidade de cultiv-los sem que haja contaminaes ou o uso de suas

  • 13

    enzimas em condies que desativam outras que no so de interesse, como no

    caso da Taq polimerase utilizada no processo de PCR. (OGUNSEITAN, 2005)

    3- ISOLAMENTO EM CULTIVO SLIDO

    Esse mtodo usado para o isolamento de certos produtores de enzimas,

    usando meios seletivos contendo o substrato que podem ser degradados pelas

    enzimas produzidas pelos microrganismos desejados.

    Os estudos iniciais feitos pelo bacteriologista alemo Robert Koch foram

    muito importantes para a obteno de culturas puras. Antigamente, as tentativas de

    isolamento eram feitas somente atravs de meios lquidos, sendo assim muito difcil

    isolar microrganismos como bactrias. Em 1881, Koch fez uma tentativa de cultivo

    slido em superfcie de batata. Por volta do mesmo tempo, um associado de Koch,

    Frederick Loeffler, desenvolveu o extrato de carne peptonado para o cultivo de

    bactrias patognicas, e Koch tentou solidificar esse meio (PRESCOTT, HARLEY e

    KLEIN, 2002). Ele conseguiu atravs da mistura do meio com gelatina em um

    suporte slido que permitia a sua solidificao, mas tinha a desvantagem de se

    liquefazer temperatura superiores a 28C e ser degradada por vrias espcies

    microbianas que possuem gelatinase (LECLERC et al., 1983).

    Por volta do ano de 1882, passou-se a se utilizar gar como agente

    solidificante, que foi descoberto por Minora Tarazaemon, um japons dono de uma

    hospedaria, ao perceber que uma sopa de algas tinha gelificado aps uma noite fria

    (PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002). Outro agente solidificante o cido silcico,

    o qual quimicamente definido. Ele importante na preparao de meios que

    devem ser rigorosamente definidos (LECLERC et al., 1983).

    3.1- TCNICA DE SEMEADURA POR ESTRIAS

    Esse mtodo tambm chamado de esgotamento de ala. Atravs de uma

    ala de platina, de um fio de platina ou at mesmo um swab, coleta-se uma pequena

    parcela do meio de inculo e o espalha sobre uma placa de Petri com gar fazendo

    movimentos em zigue-zague, formando um caminho na forma de estrias. Existem

    vrias possibilidades de fazer essas estrias, sendo ela descontnua ou contnua

    (DROVAL, LIMA e HABU, 2001). A forma descontnua seria feita como mostrado na

  • 14

    figura 6, onde so feitas estrias na poro 1 da placa e em seguida flamba-se a ala;

    aps, faz-se uma retirada de bactrias da regio 1 e espalha-se sobre a regio 2;

    flamba-se mais uma vez e espalha-se bactrias da regio 2 na 3. As colnias

    presentes na regio 3 estaro mais isoladas (TORTORA et al., 2006).

    Fazendo de forma contnua, haveria primeiramente a coleta de uma pequena

    quantidade do meio de semeadura e iniciar-se-ia as estrias em uma das bordas da

    placa e percorreria o fio de platina continuamente na forma de estrias at a outra

    borda da placa (DROVAL, LIMA, HABU, 2001). LECLERC e colaboradores (1983)

    descrevem a semeadura por estrias feita em duplicata em uma mesma placa,

    percorrendo a ala ou fio de platina somente at o centro da placa, e do lado oposto

    fazendo o mesmo procedimento. As colnias isoladas estaro mais ao centro e,

    atravs da repetio, poder-se-ia obter microrganismos que estavam presentes na

    segunda amostra do inculo, porm no presente na primeira.

    Figura 6- Semeadura por estrias com ala de platina

    Fonte: PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002; TORTORA et al., 2006.

    3.2- TCNICA DE SEMEADURA POR ESPALHAMENTO

    Nessa tcnica, que mostrada na figura 7, um pequeno volume da soluo

    de microrganismos contendo de 30-300 clulas transferido para o cento de uma

  • 15

    placa de gar j solidificado com o auxlio de uma pipeta estril. Em seguida,

    mergulha-se uma ala de Drigalski em lcool e a flamba de modo a manter todo o

    material estril. Com o auxlio dessa ala, espalha-se aquele volume depositado por

    toda a superfcie do gar. As colnias cresceram espalhadas por toda a superfcie

    do gar. (PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002)

    Figura 7- Semeadura por espalhamento

    Fonte: PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002.

    O espalhamento pode ser feito tambm empregando outros materiais.

    GREENE e colaboradores testaram a utilizao do aparato mostrado na figura 8,

    que consiste de um anel cilndrico metlico com uma tira de material fibroso. Ao

    botar em contato o material fibroso e a amostra de inculo lquida, por exemplo, os

    microrganismos iro se fixar na fibra e esto carimba-se meios de cultivo estreis

    sucessivamente, de modo a obter colnias cada vez mais isoladas e definidas.

    Figura 8- Aparato para semeadura do meio

    Fonte: GREENE, VERSLEY e KEENAN, 1962.

  • 16

    3.3- TCNICA DE SEMEADURA POR DERRAMAMENTO

    O mtodo de semeadura por derramamento, ou tambm denominado de pour

    plate muito utilizado para bactrias e fungos. A amostra original diluda de forma

    que quando feita a placa consegue-se colnias bem separadas. Um pequeno

    volume da melhor diluio ento derramado em uma placa de Petri sem gar. Em

    seguida, derrama-se gar fundido na temperatura de 45C e mistura-se os dois com

    uma agitao leve da placa e deixa-se o meio solidificar.

    Figura 9- Comparao entre o mtodo de pour plate e de espalhamento

    Fonte: TORTORA et al., 2006.

  • 17

    Esse mtodo permite o crescimento de colnias na superfcie e dentro do

    gar, pois algumas clulas foram misturadas no gar durante a sua solidificao,

    como pode ser verificado na Figura 9, onde h a comparao do crescimento aps a

    semeadura por pour plate e por espalhamento (PRESCOTT, HARLEY e KLEIN,

    2002).

    A maioria dos fungos e bactrias no morta pela breve exposio ao gar

    quente, mas microrganismos sensveis ao calor certamente podem ser danificados

    pelo gar fundido e ficarem impossibilitados de formarem colnias. Alm disso,

    quando se deseja identificar microrganismos atravs da morfologia da colnia, esse

    mtodo no muito indicado, pois as colnias presentes dentro do gar no

    fornecero dados corretos. (TORTORA et al., 2006)

    3.4- TCNICA DE SEMEADURA EM PROFUNDIDADE

    Faz-se a utilizao da agulha de platina e semea-se o material contido nela

    picando um gar slido contido num tubo (Figura 10). Com isso haver o

    crescimento de microrganismos em anaerbio-se no fundo e aerobiose perto da

    superfcie do gar.

    Figura 10- Semeadura em profundidade

    Fonte: Adaptado de DROVAL, LIMA e HABU, 2001.

    4- ISOLAMENTO EM CULTIVO LQUIDO

    Os meios de enriquecimento que propiciam um grande aumento de

    determinada populao microbiana so geralmente lquidos. Aps o crescimento

    avantajado ento ocorre o isolamento de determinadas clulas. Isso pode ser feito

  • 18

    como mostrado nas tcnicas em estado slido ou atravs de uma srie de diluies

    em meio lquido.

    Fazendo uma diluio em novo meio estril, como na figura 11, espera-se que

    em certo momento se obter culturas provenientes de somente uma nica clula.

    dessa forma que feita o isolamento e a contagem de clulas de Escherichia coli

    em guas ou alimentos, por exemplo (LECLERC et al., 1983).

    Figura 11- Srie de diluio para isolamento de um microrganismo

    Fonte: Adaptado de PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002.

    5- ISOLAMENTO EM CULTIVO CONTNUO

    Mtodos de isolamento dependendo da capacidade de desenvolvimento de

    um microrganismo em determinado meio, sendo que para isso ele dever produzir

    um nmero muito maior de clulas do que em relao aos outros.

    Cultivo em meio de enriquecimento geralmente feito em Erlenmeyers. No

    entanto, o crescimento de um determinado organismos oriundo de uma amostra

    variada na forma de batelada pode resultar numa mudana das condies do meio,

    e, portanto, ocorre uma variao nas presses seletivas. Isso pode ser reajustado

    inoculando uma parcela desse meio de enriquecimento em um novo meio idntico

    ao inicial. Aps um bom desenvolvimento do microrganismo desejado, semea -se

    uma alquota em meio slido (STANBURY, WHITAKER E HALL, 1995).

    A prevalncia do microrganismo desejado com relao aos outros depender

    da taxa mxima de crescimento dele com relao aos outros organismos capazes

    de tambm crescer no meio. Portanto, aquele capaz de crescer mais rapidamente

    com os substratos disponveis poder ter um nmero maior de clulas.

  • 19

    No entanto, nem sempre o organismo com maior taxa de crescimento o

    desejvel, mas sim aquele que apresenta uma maior afinidade pelo substrato

    limitante. Para isso, faz-se uso de um cultivo contnuo, onde novo meio de cultivo

    adicionado de tempos em tempos e as presses seletivas so restauradas

    (STANBURY, WHITAKER E HALL, 1995).

    Em um cultivo contnuo, a taxa de crescimento depende da taxa de diluio e

    da concentrao do substrato limitante. Para definir isso, deve-se partir da equao

    de Monod, mostrada na frmula 1:

    (1)

    onde a taxa de crescimento , s a concentrao do substrato residual, Ks a

    constante de utilizao do substrato (que expressa a afinidade do microrganismo

    para o consumo do substrato).

    No estado estacionrio, temos que igual a taxa de diluio (D),

    transformando a frmula em:

    (2)

    onde a concentrao do substrato no reator, que ser constante no estado

    estacionrio.

    Como mostrado pela frmula 2, se o substrato estiver abaixo do nvel da taxa

    de crescimento predita pela taxa de diluio, pode ocorrer que a taxa de crescimento

    ser menor que a taxa de diluio e as clulas sero eludas do reator (wash out)

    numa taxa maior do que a taxa de sua produo, resultando na diminuio na

    concentrao de biomassa desse microrganismo (STANBURY, WHITAKER E HALL,

    1995).

    Como exemplo genrico de um processo de isolamento usando cultivo

    contnuo temos a Figura 12, em que temos dois microrganismos em cultivo contnuo,

    onde, se a taxa de diluio for menor do que a do ponto Y, o organismo B se

    desenvolver mais, mas quando a taxa de diluio maior, temos o organismo A se

    desenvolvendo preferencialmente. Portanto, o cultivo ser limitado pelo substrato,

    podendo ser obtidos microrganismos que no seriam detectados durante o cultivo

    em batelada.

    Os organismos obtidos atravs do cultivo em batelada ou em placas de Petri

    podem muitas vezes no se adaptar ao cultivo contnuo, sendo mais vantajoso fazer

  • 20

    o isolamento diretamente atravs do cultivo contnuo para selecionar aqueles j

    adaptados para essa condio quando deseja-se desenvolver um processo em

    sistema contnuo.

    Figura 1- Efeito da concentrao do substrato na taxa de crescimento de dois

    microrganismos.

    Fonte: STANBURY, WHITAKER E HALL, 1995.

    Essa tcnica bastante utilizada na seleo de microrganismos para a

    produo de biomassa, mas tambm j foi usada para o isolamento de bactrias

    produtoras de enzimas (STANBURY, WHITAKER E HALL, 1995).

  • 21

    6- CULTURAS PURAS DE BACTRIAS

    Ao fazer o isolamento das culturas, no s de bactrias, mas tambm de

    outros microrganismos, deve-se fazer uma coleta de material ambiental com

    instrumentos estreis.

    Bactrias existem em grande variedade na natureza, e cada tipo necessita de

    um meio de isolamento diferente. Algumas necessitam gar suplementado com

    extratos na concentrao de 10 a 50% do volume total, outras necessitam de

    infuses feitas do material da onde foram coletadas (solo, lama, folhas, pedras,

    troncos, detritos). Podem ser usados tambm alguns meios seletivos como gar

    sangue, verde bile brilhante, MRS, ou McConkey (DEMAIN and DAVIES, 1999).

    7- CULTURAS PURAS DE ACTINOMICETOS

    Actinomicetos so bactrias filamentosas que fazem parte da maioria dos

    substratos naturais. No difcil isolar actinomicetos de amostras que tambm

    contm fungos devido s suas propriedades fisiolgicas distintas. O uso de

    antibiticos e antifngicos tambm auxilia no isolamento, como mostra a tabela 4.

    Tabela 4- Antibiticos usados e microrganismos alvo que so inibidos

    Fonte: STANBURY, WHITAKER and HALL, 1995.

    Os actinomicetos geralmente crescem lentamente, e demoram de 4 a 20 dias

    para formarem colnias definidas quando incubadas temperatura de 65-80C

    (DEMAIN and DAVIES, 1999). O crescimento desses microrganismos tambm

    favorecido quando h no meio de cultivo algum dos componentes listados na tabela 5:

  • 22

    Tabela 5- Substncias que estimulam o desenvolvimento de actinomicetos em geral

    e actinomicetos produtores de antibiticos

    Fonte: STANBURY, WHITAKER and HALL, 1995.

    El-Nakeeb e Lechevalier compararam meios de cultivo no isolamento de

    actinomicentos. Pela tabela 6 percebe-se que a quantidade de actinomicetos obtidos

    variando a fonte de carbono e nitrognio e o tipo de meio utilizado.

    Tabela 6- Comparao de meio AGS com meio de chitin e efeito das fontes de

    carbono e nitrognio no meio*

    Fonte: EL-NAKEEB and LECHEVALIER, 1963.

  • 23

    8- CULTURAS PURAS DE FUNGOS

    Fungos podem ser isolados de diversos materiais. Devido sua preferncia

    por substratos que tambm forneam suporte para o seu crescimento, eles so

    freqentemente encontrados em matria em decomposio, plantas, rochas e solo.

    Em uma planta, por exemplo, dependendo do tecido que for coletado, pode-se

    encontrar diferentes tipos de fungos.

    Esses microrganismos tambm so bastante variados, e a mudana de

    somente um dos constituintes de um meio de cultivo pode resultar no isolamento de

    um fungo diferente. Para a seleo de um meio, deve-se considerar as condies

    fsicas do meio de origem e o tipo de fungo que se deseja. A luminosidade tambm

    um fator importante s vezes, pois alguns fungos necessitam de luz para frutificarem

    (DEMAIN and DAVIES, 1999).

    Macrofungos tem o isolamento facilitado, pois possvel isol-los do ambiente

    atravs da coleta de tecidos, esporos ou estruturas vegetativas.

    9- CULTURAS PURAS DE ALGAS

    Para isolar eficientemente algas, necessrio simular em parte o ambiente

    onde a amostra foi coletada, como pH, temperatura, salinidade, luminosidade.

    Mtodos de diluio so bastante indicados nesse caso, uma vez que algas e

    microalgas so normalmente encontradas em meio lquido. A filtragem de amostras

    e posterior inoculao do filtro em novo meio estril tambm um mtodo utilizado.

    10- OUTRAS TCNICAS

    O avano da biologia molecular, da gentica e da imunologia permitiu o

    desenvolvimento de novos mtodos de isolamento com o uso de detectores,

    enzimas e receptores de determinados microrganismos. Abaixo esto listados

    alguns exemplos:

    A utilizao de organismos testes com sensitividade elevada para

    determinado antibitico podem indicar onde esto os microrganismos

    produtores.

  • 24

    A clonagem de genes codificantes para enzimas ou receptores usados na

    deteco de microrganismos pode fazer com que eles estejam mais

    acessveis em grande escala para a realizao dos testes.

    O uso de genes reprteres, que codificam substncias facilmente detectveis

    e que so fusionados com uma seqncia que produz a substncia de

    interesse.

    Sondas moleculares para seqncias de genes particulares podem detectar

    microrganismos capazes de produzir certos produtos.

    O desenvolvimento de testes imunolgicos como a captura por ELISA.

    (STANBURY, WHITAKER e HALL, 1995)

    Com relao a esse ltimo, a tcnica de imunocaptura pode ser utilizada no

    isolamento de bactrias. SANTOS e REIS (artigo em anexo 1) utilizaram essa

    metodologia para isolar Gluconacetobacter diazotropicus e de bactrias fixadoras de

    nitrognio proveniente do solo. Para o isolamento de G. diazotropicus fez-se uso de

    anticorpos anti-Gluconacetobacter diazotropicus fixados em uma microplaca de

    poliestireno de 96 poos, onde colocada a amostra de solo. Aps as etapas de

    incubao e lavagem, a ligao da bactria com o anticorpo foi quebrada com a

    adio de KCl 0,1M. A desvantagem dessa tcnica que necessrio o

    conhecimento prvio do microrganismo que se deseja isolar e deve-se fazer o

    inculo de suas clulas mortas em cobaias como coelhos para a produo de

    anticorpos.

    As tcnicas de micromanipulao tambm podem ser utilizadas para o

    isolamento, apesar de serem mais caras devido aos equipamentos. Com o uso de

    objetivas de longa distncia com uma grande magnificao, possvel coletar uma

    nica clula microbiana atravs de tubos microcapilares, que iro aspirar a bactria

    e depois deposit-la em uma outra superfcie de gar ou em um meio lquido (para

    mais, ver artigo em anexo 2).

    Existe tambm a possibilidade de utilizar a citometria de fluxo para separar

    clulas de microrganismos. Essa tcnica utiliza anticorpos marcados, sondas de

    nucleotdeos marcadas fluorescentemente ou constituentes celulares que

    naturalmente refratam a luz ou emitem fluorescncia. A Tabela 1 presente no anexo

    3, mostra propriedades de certos microrganismos que podem ser diferenciadas

    atravs da citometria de fluxo, podendo-se ento isolar essas clulas.

  • 25

    11- REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

    DEMAIN, A.L.; DAVIES, J. E. Manual of Industrial Microbiology and

    Biotechnology. Second Edition, ASM Press, Washington, D.C.,1999, 830p.

    DROVAL, A. A.; LIMA, D. P.; HABU, S. Manual Prtico de Microbiologia de

    Alimentos. Curso de Microbiologia de Alimentos, Manual do Participante.

    CEFET/PR Unidade de Medianeira, 2001.

    EL-NAKEEB, M. A.; LECHEVALIER, H. A. Selective isolation of aerobic

    actinomycetes. Appl. Microbiol., Vol. 11, p. 75-77, 1963.

    FRHLICH, J.; KNIG, H. New techniques for isolation of single prokaryotic

    cells. FEMS Microbiology Reviews, 24, p. 567-572, 2000.

    GREENE, V. W.; VERSLEY, D.; KEENAN, K. M. New Method for Microbiological

    Sampling of Surfaces. J. Bacteriol., Vol. 84, p.188-189, 1962.

    KATSURAGI, T.; TANI, Y. Screening for Microorganisms with Specific

    Characteristics by Flow Cytometry and single-Cell Sorting. Journal of bioscience

    and Bioengineering, Vol. 89, No. 3, p. 217-222, 2000.

    LECLERC, H.; IZARD, D.; HUSSON, M.-O.; WATTRE, P.; JAKUBCZAK, E.

    Microbiologie Gnrale. Doin diteurs, Paris, 1983. 369 p.

    OGUNSEITAN, O. Microbial Diversity Form and Function in Prokaryotes.

    Blackwell Publishing, Oxford, 2005, 292 p.

    PRESCOTT, L. M.; HARLEY, J. P.; KLEIN, D. A. Microbiology. 5th edition. The

    McGraw-Hill Companies, 2002, 1139 p.

    ROITMAM, I.; TRAVASSOS, L. R.; AZEVEDO, J. L. Tratado de Microbiologia

    Volume 1. Editora Manole Ltda., So Paulo, 1988, 186p.

  • 26

    SANTOS, C. C. R.; REIS, V. M. Desenvolvimento do Mtodo de Imunocaptura de

    Bactrias para Aplicao em Solo Argiloso. EMBRAPA, Comunicado Tcnico 64,

    ISSN 1517-8862, Maro 2004, Seropdica, RJ.

    STANBURY, P. F.; WHITAKER, A.; HALL, S. J. Principles of Fermentation

    Technology. Second Edition. Butterworth Heinemann, Elsevier Science, 1995, 357

    p.

    TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, A. L. Microbiologia. 8 edio, 1

    reimpresso, Artmed, Porto Alegre, 2006, 894 p.

  • 27

    12- ANEXOS

    ANEXO 1

    DESENVOLVIMENTO DO MTODO DE IMUNOCAPTURA DE BACTRIAS PARA

    APLICAO EM SOLO ARGILOSO

    CARLA CRISTIANE ROCHA DOS SANTOS e VERNICA MASSENA REIS

  • 28

    ANEXO 2

    NEW TECHNIQUES FOR ISOLATION OF SINGLE PROKARYOTIC CELLS

    JRGEN FRHLICH and HELMUT KNIG

  • 29

    ANEXO 3

    SCREENING FOR MICRORGANISMS WITH SPECIFIC CHARACTERISTICS BY

    FLOW CYTOMETRY AND SINGLE-CELL SORTING

    TOHORU KATSURAGI and YOSHIKI TANI