UNIVERSIDADE FEDERAL DO ABC

Centro de Engenharia, Modelagem e Ciências Sociais Aplicadas

EN2105 - ­Microbiologia Ambiental

ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS DO SOLO E OBTENÇÃO DE

CULTURA PURA

David Ávila Almeida RA 11011711

Gabriela Pena Massari RA 11031407

Natalia Alves Cordeiro RA 11045212

Noele de Araujo Falcão RA 11080913

Tárcila Oliveira de Miranda RA11032510

Victor A. S. Almeida RA 11009610

Prof. Dra. Luísa Helena dos S. Oliveira

Santo André

2015

Sumário

1.Introdução

2.Objetivo

3.Materiais

4.Procedimentos

5.Resultados e Discussões

6.Conclusão

7.Bibliografia

1. INTRODUÇÃO

Os microrganismos apresentam uma imensa diversidade genética e

desempenham funções únicas e cruciais na manutenção de ecossistemas, como

componentes fundamentais de cadeias alimentares e ciclos biogeoquímicos [4], são

seres vivos muito pequenos que não podem ser vistos individualmente sem auxílio de

microscópio. Estes organismos são classificados como bactérias, archaeas, fungos,

protozoários, algas e parasitas [1]. Para este experimento, os microrganismos de

interesse são bactérias e fungos.

As bactérias são seres unicelulares e seu material genético não está envolto por

uma membrana, ou seja, são procariotos. O material orgânico proveniente de

organismos vivos ou mortos são fonte de alimento para muitas bactérias. Há ainda

bactérias que são capazes de sintetizar o próprio alimento através da fotossíntese ou

ainda outras que podem obter alimento de matéria inorgânica [1]. As bactérias

constituem o grupo mais numeroso, talvez o mais importante dentre os componentes

microbianos do solo. Num solo normal, obtido por métodos comuns de análise, podem

ser avaliados ao redor de vinte milhões de talos bacterianos por grama de solo. Essa

quantidade corresponde a aproximadamente 0,01% do volume do solo na sua camada

superior, ou, ainda, a cerca de trezentos quilogramas de talos bacterianos por hectare.

[5]

Os fungos podem ser unicelulares ou multicelulares e são seres eucariotos, ou

seja, possuem núcleo celular. O alimento é obtido através de material orgânico em um

ambiente ou em um hospedeiro [1]. A quantidade de fungos, dentro da população

microbiana do solo, é acentuadamente inferior a das bactérias; seu número, num solo

nas condições do caso anterior, poderia variar entre quinhentos mil e dois milhões de

indivíduos. [5]

O sucesso de um microrganismo em um determinado ambiente se dá em função

da extensão e rapidez de suas respostas fisiológicas às condições ambientais, sendo,

portanto, encontrados em diversos ecossistemas terrestres, especialmente nos solos

[8]. A biodiversidade de solos tem um papel fundamental na regulação dos processos

biogeoquímicos formadores e mantenedores dos ecossistemas. Dentre estes, incluem-

se: a formação e estruturação de solos; a decomposição da matéria orgânica; a

ciclagem de nutrientes; e a formação dos gases componentes da atmosfera terrestre.

[4]

A presença de um microrganismo em determinado solo é função das condições

ambientais dominantes e dos limites da sua bagagem genética. Dessa forma, existem

fatores ambientais que limitam a sobrevivência e a atividade dos microrganismos do

solo. Os principais fatores abióticos do solo são a temperatura, o pH, a salinidade, as

fontes de energia e substratos orgânicos, os nutrientes e os elementos tóxicos. [2]

Entre os principais componentes do meio, as fontes de nitrogênio, fósforo e sais

minerais juntamente com os açúcares formam os nutrientes necessários para o

desenvolvimento desses seres. A aplicação de estercos e compostos orgânicos ao solo

favorece a atividade e o desenvolvimento da microbiota. De outro lado, a aplicação de

compostos orgânicos como pesticidas e poluentes pode ocasionar prejuízos aos

microrganismos e ao processo bioquímico. [2]

Os microrganismos na natureza existem em culturas mistas, ou seja, várias

espécies diferentes ocupam um mesmo ambiente. No entanto, para determinar as

características de um certo microrganismos é necessário que ele esteja em uma cultura

pura, o que significa que todas as células da população tem as mesmas características

genéticas. Para que esse estudo possa ser realizados existem procedimentos para a

obtenção dessas culturas, chamados de isolamentos, e são essenciais para se ter o

microrganismo disponível para estudos de morfologia, taxonomia, reprodução e

fisiologia.

Na fase do isolamento, ocorre a seleção de uma colônia através da observação

da produção de determinado produto ou da morfologia da colônia. Para fazer o

isolamento de um microrganismo, deve-se empregar o meio de cultivo mais adequado

para o seu desenvolvimento. O meio de cultura é um material nutriente preparado em

laboratório cuja utilização é importante para o crescimento, transporte e estocagem de

microrganismos [3]. As técnicas de isolamento podem ser classificadas de acordo com

a consistência do material e as operações são executadas sob rigorosa assepsia, em

ambiente próprio, usando-se ferramentas e material desinfestados ou esterilizados

1.1 Isolamento em Cultivo Sólido

1.1.1 Técnica de Semeadura por Estrias

Esse método também é chamado de esgotamento de alça. Através de uma alça

de platina, de um fio de platina ou até mesmo um swab, coleta-se uma pequena

parcela do meio de inóculo e o espalha sobre uma placa de Petri com ágar fazendo

movimentos em zigue-zague, formando um caminho na forma de estrias. Existem

várias possibilidades de fazer essas estrias, sendo ela descontínua ou contínua [6]. A

forma descontínua é mostrada na figura abaixo, onde são feitas estrias na porção 1 da

placa e em seguida flamba-se a alça; após, faz-se uma retirada de bactérias da região

1 e espalha-se sobre a região 2; flamba-se mais uma vez e espalha-se bactérias da

região 2 na 3. As colônias presentes na região 3 estarão mais isoladas [3].

Figura 1: Técnica de Semeadura por Estriar

Fonte: PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002; TORTORA et al., 2006.

1.1.2 Técnica de Semeadura por Espalhamento

Nessa técnica um pequeno volume da solução de microrganismos contendo de

30-300 células é transferido para o cento de uma placa de ágar já solidificado com o

auxílio de uma pipeta estéril. Em seguida, mergulha-se uma alça de Drigalski em álcool

e a flamba de modo a manter todo o material estéril. Com o auxílio dessa alça,

espalha-se aquele volume depositado por toda a superfície do ágar. As colônias

cresceram espalhadas por toda a superfície do ágar [3].

1.1.3 Técnica de Semeadura por Derramamento

O método de semeadura por derramamento, ou também denominado de pour

plate é muito utilizado para bactérias e fungos. A amostra original é diluída de forma

que quando é feita a placa consegue-se colônias bem separadas. Um pequeno volume

da melhor diluição é então derramado em uma placa de Petri sem ágar. Em seguida,

derrama-se ágar fundido na temperatura de 45ºC e mistura-se os dois com uma

agitação leve da placa e deixa-se o meio solidificar.

Esse método permite o crescimento de colônias na superfície e dentro do ágar,

pois algumas células foram misturadas no ágar durante a sua solidificação, onde há a

comparação do crescimento após a semeadura por pour plate e por espalhamento [3].

1.1.4 Técnica de Semeadura em Profundidade

Faz-se a utilização da agulha de platina e semea-se o material contido nela

picando um ágar sólido contido num tubo. Com isso haverá o crescimento de

microrganismos em anaeróbio se no fundo e aerobiose perto da superfície do ágar [6].

Figura 2: Semeadura em Profundidade

Fonte: DROVAL, LIMA e HABU, 2001.

1.2. Isolamento em Cultivo Líquido

Os meios de enriquecimento que propiciam um grande aumento de determinada

população microbiana são geralmente líquidos. Após o crescimento avantajado então

ocorre o isolamento de determinadas células. Isso pode ser feito como mostrado nas

técnicas em estado sólido ou através de uma série de diluições em meio líquido.

Fazendo uma diluição em novo meio estéril, espera-se que em certo momento

se obterá culturas provenientes de somente uma única célula. Série de diluição para

isolamento de um microrganismo é apresentado na figura abaixo.

Figura 3: Isolamento pela técnica de diluição

Fonte: PRESCOTT, HARLEY e KLEIN.

2. OBJETIVOS

O experimento foi dividido em duas etapas, onde cada uma possui objetivos

específicos. A primeira parte do experimento teve com objetivos isolar os

microrganismos no solo, quantificar a densidade de bactérias e fungos por Unidades

Formadoras de Colônias (UFC) e praticar a técnica de diluição e semeadura. Já na

segunda parte do experimento, de obtenção de cultura pura, os objetivos foram

demonstrar práticas de assepsia e outros procedimentos necessários para isolamento

de culturas e demonstrar os principais métodos de obtenção de culturas axênicas.

3. METODOLOGIA

3.1. Materiais

As duas partes do experimento utilizaram diferentes materiais. Na parte de

isolamento de microrganismos do solo foram utilizadas amostras de solo (areia da praia

e agapanto), 4 placas de petri, uma pipeta automática de 1 mL, Luria Bertani Agar

(LBA), Meio Martin (previamente fundido e mantido a temperatura de 45ºC), 200 mL de

solução salina 0,7% NaCl esterilizado, um frasco esterilizado com capacidade para 90

mL de solução salina, Bico de Bunsen, estufa de incubação, caneta azul para

retroprojetor e 4 frascos para diluição contendo 9 mL de solução salina 0,7% NaCl.

Na parte de obtenção de culturas puras foram utilizados os seguintes materiais:

duas placas de Petri pequenas contendo o meio Ágar nutriente (já vertido e solidificado

nas placas), duas placas de Petri pequenas contendo o Meio Martin (já vertido e

solidificado nas placas), palito de dente, alça de platina e estufa de incubação.

3.2. Procedimentos

3.2.1. Isolamento de Microrganismos do Solo

Primeiramente, foram coletadas 50g de amostra de solo (areia da praia e

agapanto) em frasco estéril. Utilizando a caneta para retroprojetor, foram marcados os

frascos para diluição com: 10-1, 10-2, 10-3 e 10-4 . A seguir, as 50g de amostra de solo

foram diluídas no frasco com 90 mL de água de diluição.

Com o auxílio de pipeta, 1 mL de líquido foi retirado do frasco com amostra

diluída e, próximo ao bico de Bunsen foi transferido para o frasco marcado como 10-2 e

então o tubo foi agitado. O procedimento foi repetido transferindo 1 mL do frasco

marcado como 10-2 para o frasco marcado como 10-3 e depois transferindo 1 mL do

frasco 10-3 para o frasco 10-4.

Figura 4: Diluição em tubos de ensaio.

Uma placa de Petri foi marcada como 10-2 MM (Meio Martin), uma como 10-3 MM

(Meio Martin), outra como 10-3 LBA (Luria Bertani Agar) e a última como 10-4 LBA (Luria

Bertani Agar). Novamente com a pipeta e próximo ao bico de Bunsen, 1 mL do frasco

10-2 foi transferido para a placa de Petri 10-2 MM. Depois, 1 mL do frasco 10-3 foi

transferido para a placa 10-3 MM e 1 mL para a placa 10-3 LBA. Finalmente, 1 mL do

frasco 10-4 foi transferido para a placa de Petri marcada como 10-4 LBA.

Próximo ao bico de Bunsen, aproximandamente 10 mL de Meio Martin foram

vertidos nas placas de Petri marcadas como 10-2 MM e 10-3 MM. Nas placas de Petri

marcadas como 10-3 LBA e 10-4 LBA foram vertidos aproximadamente 10 mL de meio

Luria Berani Agar em cada.

Esperou-se a solidificação dos meios nas placas e então estas foram invertidas

para evitar a formação de água na superfície do agar. Por fim, as placas foram

colocadas na estufa de incubação a 35º C. A contagem de colônias formadas nas

placas foi realizada um dia após o preparo das placas, 4, 5, 6 e 7 dias após o preparo

das culturas.

3.2.1. Isolamento e Obtenção de Cultura Pura

Antes de cada etapa do experimento, a alça de platina foi esterilizada na chama

do bico de Bunsen e resfriada através da imersão em tubo contendo água destilada e

as placas de Petri foram marcadas como 10-2 MM, 10-3 MM, 10-3 LBA e 10-4 LBA.

Próximo ao Bico de Bunsen, a placa de Petri 10-3 LBA contendo os

microoganismos isolados na parte 1 foi aberta e a alça de platina foi inserida nesta

cultura. Fechou-se a placa e então, na nova placa de Petri também marcada como 10-3

LBA foram desenhadas três estrias com a alça contendo microganismos retirados da

outra placa. Após esterilização da alça de platina, o mesmo procedimento foi realizado

retirando microrganismos da placa 10-4 LBA da parte 1 e transferindo-os para a nova

placa de Petri com a mesma marcação, 10-4 LBA.

Ainda próximo ao bico de Bunsen, a placa contendo microrganismos marcada

como 10-2 MM da parte 1 foi aberta e o palito de dente foi inserido em uma colônia. A

placa foi fechada e o palito de dente contendo microrganismos foi inserido no centro da

nova placa de Petri marcada como 10-2 MM. A placa de Petri marcada como 10-3 MM

da parte 1 não apresentou crescimento de colônias, portanto uma segunda colônia da

placa 10-2 MM foi utilizada na segunda nova placa de Petri contendo Meio Martin.

4. RESULTADOS E DISCUSSÕES

“O solo é um recurso natural vital para o funcionamento do ecossistema terrestre

e representa um balanço entre os fatores físicos, químicos e biológicos.”(ARAÚJO;

LEITE, 2007) Bactérias e fungos compõe a fração biológica de microrganismos no solo,

realizando diversas funções importantes para a manutenção do solo, tais como

degradando substâncias tóxicas, fornecendo nutrientes responsáveis pelo crescimento

da flora e decompondo a matéria orgânica. Esses microrganismos podem viver tanto

em simbiose quanto isolados. A distribuição dos mesmos no solo depende de muitas

variáveis, dentre elas a temperatura, pH, umidade e disponibilidade de oxigênio.

A temperatura afeta diretamente a fisiologia dos microrganismos e altera

também o ciclo de nutrientes e a atividade da água. Observa-se uma taxa mais alta de

crescimento tanto bacteriano quanto de fungos ao passo que estes chegam à sua

temperatura ótima, que varia de espécie para espécie. Diferentes grupos de bactérias

possuem diferentes temperaturas ótimas, as bactérias Psicrófilas possuem uma

temperatura ótima de aproximadamente 15 °C, já as Mesófilas possuem uma

temperatura ótima de 37°C, as Termófilas são bactérias que aguentam temperaturas

extremas e possuem uma temperatura ótima na faixa de 85°C.

As bactérias podem crescer em meios cujo o pH esteja entre 6,5 a 9, faixa

normalmente observada na natureza. Elas podem ser classificadas em Neutrófilas,

Acidófilas e Alcalinófilas, com a faixa de pH respectivamente entre 5,4 a 8,5; 0,1 a 5,4 e

8,5 a 11,5. Como toda célula metabolicamente ativa necessita de água, a umidade é

essencial para o crescimento bacteriano, sendo apenas possível para o endósporo da

bactéria viver na sua ausência.

Para os fungos, a temperatura ótima de proliferação ocorre por volta dos 25 °C,

porém existem espécies que se adaptam a temperaturas mais baixas. Eles são

essencialmente aeróbicos, ou seja, dependem do oxigênio para sobreviverem. Fungos

crescem em meio ao pH que pode variar de muito ácido (pH 2) até levemente ácido,

próximo a 6.

Os solos arenosos são caracterizados por possuirem grãos largos e numerosos

poros, o que facilita a rápida penetração da água em camadas profundas do solo,

levando com ela, todos os nutrientes e sais necessários para o desenvolvimento da

vida vegetal, resultando em um solo pobre em matéria orgânica. Por outro lado, nos

solos de Agapanto, utilizam-se fertilizantes e adubos orgânicos para o crescimento da

flor, que deve ser cultivada e regada em abundância na primavera e verão, o que indica

um alto teor de umidade deste tipo de solo.

Figura 5: Microrganismos e processos biológicos afetados pelo pH do solo.

Fonte: ARAÚJO; LEITE, 2007

Na primeira etapa, observamos as culturas depois de 1, 4, 5, 6 e 7 dias, fizemos as

contagens de UFCs e tiramos fotos. Como a turma foi dividida, temos apenas as fotos das

culturas de Agapantos. São elas:

Imagem 1: após 1 dia de cultura. Imagem 2: após 4 dias de cultura.

Imagem 3: após 5 dias de cultura. Imagem 4: após 6 dias de cultura.

Imagem 4: após 7 dias.

Foram observados os seguintes resultados:

Solo Bactéria

10-3 Bactéria

10-4 Fungo 10-

2 Fungo 10-

3

Massa do Solo

Úmido

pH

Agapantos 86 48 82 69 11,52% 6,0

Areia da Praia

70 42 1 0 10,45% 7,0

Tabela 1: Quantidade de Unidades Formadoras de Colônia (UFC) por microrganismo, nos dois tipos de

solo.

Observando-se a tabela 1, nota-se que a melhor diluição para ambos

microrganismos foram as de 10-3 LBA para bactérias e 10-2 MM para fungos, onde se

obteve uma homogeneidade maior entre o número de microorganismos contados, ou

seja, nessas concentrações as condições para o desenvolvimento dos mesmos foram

otimizadas em comparação com as outras diluições propostas. O solo de Agapantos foi

o que se mostrou mais favorável aos dois microrganismos.

5. CONCLUSÃO

Nesse trabalho utilizamos a técnica de semeadura e diluição a fim de isolarmos

microrganismos, como bactérias e fungos os quais foram quantificados por Unidades

Formadoras de Colônias (UFC), como apresentadas nos resultados. A contagem de

fungos na areia da praia não apresentou uma quantidade de colônias esperada,

justificada pelo valor do pH. Observou-se que houve um crescimento muito mais

acentuado de microrganismos nos solos de agapanto, uma vez que estes são ricos em

matéria orgânica e possuem melhores condições físicas para o desenvolvimento dos

mesmo.Cada grupo em seu respectivo meio de crescimento, meios LBA e Meio Martin,

respectivamente para bactérias e fungos.

Já sobre a assepsia, aplicamos a flambagem ou esterilização por calor seco sob bico

de bunsen da alça de platina utilizada no experimento, para obtenção da cultura pura

aplicado de maneira satisfatória.

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1 TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, A. L. Microbiologia. 8ª edição, 1ª

reimpressão, Artmed, Porto Alegre, 2006, 894 p.

2 ARAÚJO, A. S. F.; LEITE, L. F. C. Ecologia Microbiana do Solo. Sapiência, Teresina,

v. 4, n. 12, p 3. jul. 2007.

3 PRESCOTT, L. M.; HARLEY, J. P.; KLEIN, D. A. Microbiology. 5 th edition. The

McGraw-Hill Companies, 2002, 1139 p.

4 MINISTÉRIO DO MEIO AMBIENTE. Microorganismos e biodiversidade dos

solos.Versão de 28/10/98. Disponível em :

<http://www.mma.gov.br/estruturas/sbf_chm_rbbio/_arquivos/Microrganismos%20e%20

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5 UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO. Microrganismos do solo. Disponível em :

<http://www.revistas.usp.br/aesalq/article/viewFile/38761/41645>.

6 DROVAL, A. A.; LIMA, D. P.; HABU, S. Manual Prático de Microbiologia de

Alimentos. Curso de Microbiologia de Alimentos, Manual do Participante. CEFET/PR –

Unidade de Medianeira, 2001.

7 MENDES, I. de C.; REIS JUNIOR, F. B. d. Microrganismos do solo e a

sustentabilidade dos agroecossistemas. Planaltina, DF: Embrapa Cerrados, 2010.

Disponível em: <http://www.cpac.embrapa.br/noticias/artigosmidia/publicados/188/>.

8 SIQUEIRA, J. O.; MOREIRA, F. M. S. Biologia e Bioquímica do Solo. Universidade

Federal de Lavras.

9 GALLI, Fernando. Microrganismos do Solo. Escola Superior de Agricultura “Luiz de

Queiroz”. Vol XXI, 1964.