ISOLAMENTO E APLICAÇÕES DE MICROSSATÉLITES … · Primeiramente gostaria de agradecer a Deus, por estar presente em todos os momentos da minha vida. Por me dar força e sabedoria

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL-REI – UFSJ

CAMPUS CENTRO-OESTE DONA LINDU – CCO

PROGRAMA MULTICÊNTRICO DE PÓS-GRADUAÇÃO

EM BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR

ROBERTA ARIANE DE ANDRADE RAMOS

ISOLAMENTO E APLICAÇÕES DE MICROSSATÉLITES

POLIMÓRFICOS LOCALIZADOS EM DIFERENTES CROMOSSOMOS

DO GENOMA DO Trypanosoma cruzi

DIVINÓPOLIS-MG

AGOSTO/ 2017

ROBERTA ARIANE DE ANDRADE RAMOS

ISOLAMENTO E APLICAÇÕES DE MICROSSATÉLITES

POLIMÓRFICOS LOCALIZADOS EM DIFERENTES CROMOSSOMOS

DO GENOMA DO Trypanosoma cruzi

Dissertação apresentada ao Programa

Multicêntrico de Pós-Graduação em Bioquímica e

Biologia Molecular da Universidade Federal de São

João Del Rei, como requisito parcial para a

obtenção do grau de Mestre.

Orientador: Prof. Dr. Helder Magno Silva

Valadares

Co-orientadora: Profª. Drª. Aparecida Sadae

Tanaka

DIVINÓPOLIS-MG

AGOSTO/2017

Ramos, Roberta Ariane de Andrade.

R165i ISOLAMENTO E APLICAÇÕES DE MICROSSATÉLITES

POLIMÓRFICOS LOCALIZADOS EM DIFERENTES CROMOSSOMOS DO

GENOMA DO Trypanosoma cruzi / Roberta Ariane de

Andrade Ramos ; orientador Helder Magno Silva

Valadares; coorientadora Aparecida Sadae Tanaka. --

Divinópolis, 2017.

134 p.

Dissertação (Mestrado - Programa Multicêntrico

de Pós-Graduação em Bioquímica e Biologia

Molecular) -- Universidade Federal de São João del-

Rei, 2017.

1. Trypanosoma cruzi. 2. Doença de Chagas. 3.

Variabilidade Genética. 4. Microssatélites

polimórficos. 5. Diagnóstico da doença de Chagas. I.

Valadares, Helder Magno Silva, orient. II. Tanaka,

Aparecida Sadae, co-orient. III. Título.

Ficha catalográfica elaborada pela Divisão de Biblioteca (DIBIB) e Núcleo de Tecnologia da Informação (NTINF) da UFSJ,

com os dados fornecidos pelo(a) autor(a)

iii

iv

AGRADECIMENTOS

Primeiramente gostaria de agradecer a Deus, por estar presente em todos os

momentos da minha vida. Por me dar força e sabedoria para alcançar essa vitória.

À alma Santa de Padre Libério e Nossa Senhora Aparecida por me darem forças e

proteção durante essa caminhada.

À minha mãe Ivani, que fez tudo para que eu pudesse chegar até aqui. Por todo

amor, apoio, carinho, força e compreensão. Por ser meu maior exemplo e por

acreditar em mim!

À minha tia Nina, minha segunda mãe, por todo apoio, amor, carinho, incentivo. Por

não me deixar desistir! Sem você nada disso seria possível!

À minha avó Laurinda pelas orações, incentivo e carinho.

À minha prima Silmara, que me incentivou e me guiou para que eu pudesse realizar

esse sonho. Pela amizade e companheirismo, obrigada por tudo!

Aos meus familiares pela força, incentivo e por sempre acreditarem em mim!

Aos meus amigos pelo companheirismo, apoio e compreensão!

Ao Professor Dr. Helder Magno Silva Valadares pela oportunidade, paciência,

dedicação, orientação e por todos os ensinamentos. Meus sinceros agradecimentos!

À Professora Drª. Aparecida Sadae Tanaka pela atenção e preciosa colaboração na

execução deste trabalho.

À Professora Drª. Andréa Mara Macedo por nos auxiliar disponibilizando reagentes e

amostras biológicas, os quais foram essenciais para a realização deste trabalho.

v

Às alunas do Laboratório de Genética Molecular: Heloísa, Thalissa, Kênia, Letícia,

Jéssica e Natália por me receberem tão bem no laboratório, pela amizade, pela

disposição em ajudar e pelo companheirismo.

À Heloísa por todos os ensinamentos, por todas as conversas, palavras de incentivo

e pela amizade! Obrigada pela companhia e por todo o apoio!

Ao laboratório de Biotecnologia de Microorganismos pelo apoio nos experimentos.

Ao CNPq, FAPEMIG e UFSJ, pelo financiamento deste projeto.

vi

“Noventa por cento do sucesso se baseia simplesmente em insistir. ”

(Woody Allen)

vii

RESUMO

Desde a sua descoberta no genoma do T. cruzi, os microssatélites revelaram-se

marcadores moleculares extremamente úteis em análises de variabilidade genética,

estrutura populacional e filogenia deste parasito. Trabalhos anteriores permitiram o

isolamento de locos de microssatélites do genoma do T. cruzi, porém, estes locos

apresentam algumas limitações, tais como, regiões flanqueadoras curtas às

repetições ou locos restritos ao cromossomo 3. Além disso, existem poucos locos

que apresentam um alto nível de polimorfismo e alta sensibilidade nos ensaios de

PCR. Assim, baseado nesses fatos, o objetivo deste trabalho foi isolar novos locos

de microssatélites polimórficos localizados em diferentes cromossomos do genoma

do T. cruzi e aplicá-los em estudos de variabilidade genética do parasito e no

diagnóstico molecular da doença de Chagas. Inicialmente, utilizando o programa

Tandem Repeats Finder foram identificados 10 locos de microssatélites localizados

nos cromossomos 1 a 11, exceto o cromossomo 3. Os iniciadores específicos para

cada loco foram desenhados e os ensaios de PCR foram padronizados. Para avaliar

o polimorfismo foram empregadas 27 cepas ou clones do T. cruzi pertencentes às

diferentes linhagens filogenéticas e estes locos mostraram ser polimórficos entre as

diferentes cepas. O tamanho dos alelos foi determinado através do sequenciador

automático de DNA e foram observados perfis característicos de cepas monoclonais

homozigotas ou heterozigotas, assim como, de cepas multiclonais. Posteriormente,

foram realizadas as análises de parâmetros de genética de populações, as quais

mostraram que o loco mais polimórfico foi o TcTTA15, e que, a maioria dos locos

apresentaram um drástico desvio do equilíbrio de Hardy-Weinberg e um forte

desequilíbrio de ligação. Com as abordagens filogenéticas foi possível agrupar as

cepas do T. cruzi em suas linhagens características demonstrando que os novos

locos de microssatélites podem ser utilizados como ferramentas em estudos de

filogenia deste parasito. Posteriormente, foi avaliada a sensibilidade dos ensaios de

PCR utilizando a técnica de Full Nested PCR, a qual permitiu detectar o DNA do T.

cruzi até no nível de 200 fg/µL. Finalmente, através de ensaios de Full Nested PCR

foi possível detectar o DNA do parasito em tecido cardíaco de pacientes chagásicos

crônicos, demonstrando a aplicabilidade destes microssatélites no diagnóstico

molecular da doença de Chagas.

Palavras-chave: Trypanosoma cruzi, doença de Chagas, variabilidade genética,

microssatélites polimórficos, Full Nested PCR, diagnóstico da doença de Chagas.

viii

ABSTRACT

Since its discovery in the Trypanosoma cruzi genome, the microsatellite markers

proved to be extremely useful in analyzes of genetic variability, population structure

and phylogeny for this parasite. Previous studies allowed the isolation of

microsatellite loci composed by di, tri and tetranucleotide motifs in the T. cruzi

genome. However, these loci present some limitations, such as, short flanking

regions to the repeats and microsatellite loci restricted to chromosome 3.

Additionally, there are few loci that present high level of polymorphism and high

sensitivity in PCR assays. Thus, based on these facts, the aim of this work was to

isolate new microsatellite loci in different chromosomes from T. cruzi genome and to

apply them in genetic variability studies of this parasite and in molecular diagnosis of

Chagas disease. Initially, using the Tandem Repeats Finder software were identified

10 new microsatellite loci located on chromosomes from 1 to 11, except chromosome

3. The specific primers for each microsatellite loci were designed and PCR assays

were standardized. To evaluate the polymorphism of these microsatellite loci 27 T.

cruzi strains or clones belonging to different phylogenetic lineages were employed,

and these loci showed to be polymorphic among the different strains.The allele size

determination was performed using the automatic DNA sequencer and were obtained

typical profiles of homozygous and heterozygous monoclonal strains, as well as of

multiclonal strains. Subsequently, population genetic analyzes showed that the most

polymorphic locus was TcTTA15 and that most of the loci presented drastic

deviations of the Hardy-Weinberg equilibrium and a strong linkage disequilibrium

between the loci. With the phylogenetic approaches it was possible to group the

strains of T. cruzi in their characteristic lineages demonstrating that the new

microsatellite loci can be used as tools in phylogenetic studies for this parasite.

Posteriorly, the sensitivity of the PCR assays for the new loci was evaluated using

the Full Nested PCR strategy that allowed the detection of T. cruzi DNA up to the

level of 200 fg/μL. Finally, using Full Nested PCR assays it was possible to detect the

parasite DNA in cardiac tissues of chronic chagasic patients demonstrating the

applicability of these microsatellites in the molecular diagnosis of Chagas disease.

Key-words: Trypanosoma cruzi, Chagas disease, genetic variability, polymorphic

microsatellites, Full Nested PCR, diagnosis of Chagas disease.

ix

SUMÁRIO

I) INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 1

I.1) Trypanosoma cruzi............................................................................................. 2

I.2) Ciclo biológico do T. cruzi .................................................................................. 2

I.3) Vias de transmissão do T. cruzi ......................................................................... 5

I.4) Doença de Chagas ............................................................................................ 6

I.5) Epidemiologia da Doença de Chagas .............................................................. 10

I.6) Organização genômica do T. cruzi................................................................... 14

I.7) Variabilidade intraespecífica do T. cruzi........................................................... 18

I.8) Marcadores moleculares em T. cruzi ............................................................... 20

I.8.1) Microssatélites ....................................................................................... 20

II) JUSTIFICATIVA.................................................................................................... 25

III) OBJETIVOS ......................................................................................................... 28

III.1) Objetivo Geral ................................................................................................ 29

III.2) Objetivos Específicos ..................................................................................... 29

IV) MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................... 30

IV.1) Identificação dos novos locos de microssatélites no genoma do T. cruzi. ..... 31

IV.2) Desenho dos iniciadores correspondentes às regiões flanqueadoras dos

locos de microssatélites ......................................................................................... 31

IV.3) Padronização dos ensaios de PCR .............................................................. 32

IV.4) Avaliação do polimorfismo dos novos locos de microssatélites .................... 35

IV.5) Eletroforese em gel de poliacrilamida ........................................................... 37

IV.6) Determinação do tamanho dos alelos dos microssatélites ........................... 37

IV.7) Avaliação dos parâmetros de genética de populações ................................. 38

IV.8) Avaliação dos parâmetros de filogenia ......................................................... 39

IV.9) Aplicação dos novos locos de microssatélites em ensaios de Full Nested

PCR em amostras de tecido cardíaco de pacientes chagásicos crônicos ............. 40

IV.9.1) Desenho dos iniciadores externos ...................................................... 40

IV.9.2) Padronização dos ensaios de PCR para os iniciadores internos e

externos .......................................................................................................... 40

IV.9.3) Avaliação da sensibilidade dos ensaios de Full Nested PCR.............. 42

IV.9.4) Ensaios de Full Nested PCR em amostras de tecido cardíaco de

pacientes chagásicos crônicos ....................................................................... 46

x

V) RESULTADOS ..................................................................................................... 49

V.1) Identificação dos novos locos de microssatélites no genoma do T. cruzi ....... 50

V.2) Desenho dos iniciadores correspondentes às regiões flanqueadoras dos locos

de microssatélites .................................................................................................. 53

V.3) Padronização dos ensaios de PCR ................................................................ 55

V.4) Avaliação do polimorfismo dos locos de microssatélites ................................ 62

V.5) Determinação do tamanho dos alelos dos microssatélites ............................. 68

V.6) Avaliação dos parâmetros de genética de populações................................... 71

V.7) Avaliação dos parâmetros de filogenia ........................................................... 75

V.8) Aplicação dos novos locos de microssatélites em ensaios de Full Nested PCR

em amostras de tecido cardíaco de pacientes chagásicos crônicos ...................... 78

V.8.1) Desenho dos iniciadores externos ....................................................... 78

V.8.2) Padronização dos ensaios de PCR para os iniciadores internos e

externos .......................................................................................................... 78

V.8.3) Avaliação da sensibilidade dos ensaios de PCR .................................. 83

V.8.4) Ensaios de Full Nested PCR em amostras de tecido cardíaco de

pacientes chagásicos crônicos ....................................................................... 90

VI) DISCUSSÃO ....................................................................................................... 95

VII) CONCLUSÕES..................................................................................................114

VIII) REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................... 116

xi

LISTA DE FIGURAS

Figura 1

Ciclo biológico do Trypanosoma cruzi. 4

Figura 2

Modelo para a organização estrutural dos 41 cromossomos

presentes no genoma do T. cruzi.

17

Figura 3 Esquema representativo das diluições seriadas do DNA da cepa

JG do T. cruzi de 1ng/µL até o nível de 10 fg/µL.

43

Figura 4 Desenho esquemático para a estratégia de Full Nested PCR.

44

Figura 5 Locos de microssatélites TcAT13, TcAC13, TcTG14, TcCAA9,

TcTTA15 identificados no genoma do T. cruzi pelo programa

Tandem Repeats Finder.

51

Figura 6 Locos de microssatélites TcCAG8, TcGCT11, TcAAC8,

TcAAAT9, TcCTTT7 identificados no genoma do T. cruzi pelo

programa Tandem Repeats Finder.

52

Figura 7 Géis de poliacrilamida 6% corados com nitrato de prata

mostrando os produtos amplificados para os locos de

microssatélites TcAC13 e TcTG14 por meio da estratégia de

PCR com temperaturas de anelamento em gradiente.

56



microssatélites TcAT13 e TcCAG8 por meio da estratégia de


57



microssatélites TcCAA9 e TcGCT11 por meio da estratégia de

58

xii




microssatélites TcAAC8 e TcCTTT7 por meio da estratégia de


59


mostrando os produtos amplificados para os novos locos de

microssatélites TcTTA15 e TcAAAT9 empregando o Kit Opti-

Prime (Stratagene).

60



microssatélites TcTTA15 e TcAAAT9 por meio da estratégia de


61



microssatélites TcAT13 e TcTG14 entre as diferentes cepas do

T. cruzi.

63



microssatélites TcAC13 e TcCAA9 entre as diferentes cepas do

T. cruzi.

64



microssatélites TcTTA15 e TcCAG8 entre as diferentes cepas do

T. cruzi.

65

Figura 16 Géis de poliacrilamida 6% corados com nitrato de prata 66

xiii


microssatélites TcGCT11 e TcAAC8 entre as diferentes cepas do

T. cruzi.



microssatélites TcAAAT9 e TcCTTT7 entre as diferentes cepas

do T. cruzi.

67

Figura 18 Cromatogramas obtidos a partir do sequenciador automático de

DNA Genetic Analyser 3130xl mostrando o tamanho dos

produtos amplificados para três locos de microssatélites.

70

Figura 19 Rede de Wagner sem raiz proposta para as 24 cepas

monoclonais do T. cruzi baseada nos perfis de nove locos de

microssatélites.

77


mostrando os produtos amplificados para os iniciadores internos

dos locos de microssatélites TcAC13 e TcTG14 empregando o

Kit Opti-Prime (Stratagene).

80



dos locos de microssatélites TcGCT11 e TcTTA15 empregando

o Kit Opti-Prime (Stratagene).

81



dos locos de microssatélites TcAAAT9 e TcCTTT7 empregando

o Kit Opti-Prime (Stratagene).

82

Figura 23 Gel de poliacrilamida 6% corado com nitrato de prata mostrando 84

xiv

a sensibilidade do loco de microssatélite TcAC13, através do

protocolo de Full Nested PCR, empregando diluições seriadas

de DNA da cepa JG do T. cruzi.

Figura 24 Gel de poliacrilamida 6% corado com nitrato de prata mostrando

a sensibilidade do loco de microssatélite TcTG14, através do



85


a sensibilidade do loco de microssatélite TcGCT11, através do



86


a sensibilidade do loco de microssatélite TcTTA15, através do



87


a sensibilidade do loco de microssatélite TcAAAT9, através do



88


a sensibilidade do loco de microssatélite TcCTTT7, através do



89


mostrando a utilização dos locos de microssatélites TcAC13 e

TcTG14, através do protocolo de Full Nested PCR, empregando

como molde o DNA extraído de tecido cardíaco de pacientes

91

xv

chagásicos crônicos.


mostrando a utilização dos locos de microssatélites TcGCT11 e

TcTTA15, através do protocolo de Full Nested PCR,

empregando como molde o DNA extraído de tecido cardíaco de

pacientes chagásicos crônicos.

92


mostrando a utilização dos locos de microssatélites TcAAAT9 e

TcCTTT7, através do protocolo de Full Nested PCR,

empregando como molde o DNA extraído de tecido cardíaco de


93

xvi

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Composição dos tampões 10x do Kit Opti-Prime utilizados na

padronização dos ensaios de PCR para os locos TcAAAT9 e

TcTTA15.

33

Tabela 2 Lista das cepas e clones do T. cruzi empregadas neste

trabalho.

36

Tabela 3 Tampões e programas no termociclador utilizados para cada

loco de microssatélite empregando a estratégia de Full Nested

PCR.

45

Tabela 4 Descrição das amostras isoladas de tecido cardíaco de


48

Tabela 5 Localização cromossomal para os dez novos locos de

microssatélites selecionados neste trabalho.

50

Tabela 6 Sequências e características dos iniciadores internos utilizados

neste trabalho.

54

Tabela 7 Tamanho dos alelos em pares de bases obtidos para os locos

de microssatélites entre diferentes cepas de T. cruzi.

69

Tabela 8 Frequência alélica em porcentagem para os novos locos de

microssatélites.

72

Tabela 9 Frequência genotípica em porcentagem para os novos locos de

microssatélites.

73

Tabela 10 Teste de desequilíbrio de ligação para os novos locos de

microssatélites (valores de P).

74

xvii

Tabela 11 Valores de heterozigosidade esperda (Hesp) e observada (Hobs)

obtidos para os novos locos de microssatélites.

76

Tabela 12 Frequência de homozigose e heterozigose em porcentagem

para os novos locos de microssatélites.

76

Tabela 13 Sequências dos iniciadores externos utilizados neste trabalho.

79

Tabela 14 Tamanho estimado dos produtos amplificados pela estratégia

Full Nested PCR em tecido cardíaco de pacientes chagásicos.

94

xviii

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

°C Graus Celsius

AgNO3 Nitrato de Prata

BAC Cromossomo Artificial de Bactéria, do inglês, Bacterial

Artificial Chromosome

BENEFIT Avaliação do Benzonidazol para Interrupção da

Tripanossomíase, do inglês, Benznidazole Evaluation for

Interrupting Trypanosomiasis

Ca²+ Cálcio

COII Citocromo Oxidase subunidade II

dNTP’s DesoxirribonucleotídeosTrifosfatados

DNA Ácido Desoxirribonucleico

DTUs Discretas Unidades Taxonômicas

EDTA

FACS

Ácido etilenodiamino tetra-acético

Separação de Células Ativadas por Fluorescência, do inglês,

Fluorescence Activated Cell Sorter

fg Fentograma

gRNA Ácido ribonucléico guia

HCl Ácido clorídrico

IDT Integrated DNA Technologies

Kb Quilobases

KCl Cloreto de potássio

kDNA DNA do cinetoplasto

Mb Megabases

MDS Escala Multidimensional, do inglês, Multidimensional scaling

mL Mililitros

μL Microlitros

MgCl2 Cloreto de magnésio

μM Micromolar

mM Milimolar

mRNA Ácido ribonucléico mensageiro

m/v Concentração massa por volume

NaCl Cloreto de sódio

xix

NADH Dinucleótideo de nicotinamida e adenina reduzido

NaOH Hidróxido de sódio

ng Nanograma

nm Nanômetros

OTU Unidade Taxonômica Operacional, do inglês, Operational

Taxonomic Units

pb Pares de bases

PCR Reação em Cadeia da Polimerase, do inglês, Polymerase

Chain Reaction

PFGE Eletroforese em Campo Pulsátil, do inglês, Pulsed Field Gel

Eletrophoresis

pg Picograma

PHYLIP Pacote de programas para inferência filogenética, do inglês,

Phylogeny Inference Package

pH Potencial de hidrogênio

RAPD DNA Polimórfico Amplificado Aleatoriamente, do inglês,

Randomly Amplified Polymorphic DNA

RFLP Polimorfismos de Tamanho de Fragmentos de Restrição, do

inglês, Restriction Fragment Length Polymorphisms

RNA Ácido ribonucleico

SL Sequência líder, do inglês, splice leader

SSR-PCR PCR ancorada em Sequências Simples Repetidas, do inglês,

Simple Sequence Repeat PCR

STR Sequências curtas repetidas em tandem, do inglês, Short

Tandem Repeats.

TBE Tampão Tris-Base- EDTA

TEMED Tetrametiletilenodiamino

Tm Temperatura de Melting, do inglês, Melting Temperature

TRF Programa Tandem Repeats Finder

Tris-HCl Hidroximetilaminometano−ácido clorídrico

U Unidades

V Volts

v/v Concentração volume por volume

xx

VNTRs Repetição em Tandem de Número Variável, do inglês,

Variable Number of Tandem Repeats

% Porcentagem

I) INTRODUÇÃO

2

I.1) O Trypanosoma cruzi

O Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas, foi descoberto

em 1909, pelo pesquisador brasileiro Carlos Justiniano Ribeiro Chagas, em

Lassance, MG (CHAGAS, 1909).

O T. cruzi é um protozoário flagelado, digenético, pertencente à ordem

Kinetoplastidae e à família Trypanosomatidae. Os membros da ordem

kinetoplastidae são caracterizados pela presença de uma mitocôndria única e

alongada, que abriga uma estrutura chamada de cinetoplasto, o qual contém uma

fonte de DNA extranuclear denominada de DNA do cinetoplasto ou kDNA (MYLER,

1993).

I.2) Ciclo biológico do T. cruzi

O ciclo biológico do T. cruzi é complexo e necessita de um hospedeiro

invertebrado (triatomíneos da família Reduviidae) e de um hospedeiro vertebrado

(mamíferos de diversas ordens). Aproximadamente, cerca de 180 espécies de

mamíferos foram constatadas como participantes do ciclo de vida do parasito

(CÂMARA, 2008; NOIREAU, 2009).

Durante o seu ciclo vital, o T. cruzi apresenta três estágios morfologicamente

distintos: tripomastigotas, epimastigotas e amastigotas (NOGUEIRA, COHN,1976).

O ciclo de vida do T. cruzi tem início no momento em que os triatomíneos se

alimentam do sangue de um hospedeiro que contém tripomastigotas sanguíneos

circulantes. Após a ingestão, esses tripomastigotas se diferenciam em formas

epimastigotas, no intestino do triatomíneo. Estas formas migram para o intestino

médio do vetor infectado, onde ocorre a multiplicação por divisão binária. As formas

epimastigotas deslocam-se para a porção final do intestino ou para o reto, onde se

transformam em tripomastigotas metacíclicas, as quais representam as formas

infectantes. Ao picar o hospedeiro durante o repasto sanguíneo, o triatomíneo libera

as fezes contaminadas com tripomastigotas metacíclicas próximo ao local da picada.

A saliva do vetor possui substâncias capazes de causar um pequeno processo

alérgico no local e, deste modo, no instante em que o hospedeiro coçar a ferida, a

forma infectante pode penetrar em seu organismo. Além disso, os tripomastigotas

podem penetrar no hospedeiro através das mucosas e feridas pré-existentes. Assim,

3

os parasitos adentram à circulação sanguínea e são fagocitados por várias células

do hospedeiro. Após a invasão, os tripomastigotas se diferenciam em amastigotas

intracelulares e se reproduzem após um período de 4 a 5 dias por aproximadamente

12 horas e, então, são transformados para a forma tripomastigota novamente. A

membrana plasmática da célula hospedeira é rompida, liberando os parasitos na

corrente sanguínea. Os tripomastigotas podem infectar novas células ou

espalharem-se pelo organismo por via hematogênica, podendo ser ingeridos pelo

vetor em um novo repasto, reiniciando o ciclo (NOGUEIRA, COHN,1976; BERN,

2015) (Figura 1).

O estabelecimento da infecção por T. cruzi depende de uma série de eventos

que iniciam com a invasão das células do hospedeiro. Diversas células podem ser

alvos de invasão, dentre elas macrófagos, células epiteliais, neuronais e musculares

(ANDREWS, 1995). Moléculas de superfície do parasito, localizadas nas células do

hospedeiro, são responsáveis pelos processos de interação e invasão como

mucinas, transialidades, polissacarídeos, glicoproteínas e lipídios ancorados ao

fosfatidilinositol na membrana, além de outras proteínas integrais da membrana do

parasito (VILLALTA et al., 2009).

As mucinas são as principais proteínas responsáveis pela invasão da célula

hospedeira, proteção do parasito e estabelecimento da infecção. Estas proteínas

estão ancoradas na superfície celular do T. cruzi (VILLALTA et al., 2009).

A invasão do T. cruzi nas células ocorre com a formação do vacúolo

parasitóforo (na célula hospedeira) e um aumento de Ca2+, tanto no parasito, quanto

na célula hospedeira, provocada por moléculas de superfície do parasito

(ANDREWS, 1995). A membrana do vacúolo é derivada de lisossomos e contém no

seu interior, componentes ácidos líticos potencialmente destrutivos para o parasito.

Dessa maneira, a evasão desse compartimento para o meio intracelular torna-se

essencial para o crescimento do parasito. A saída desse vacúolo é mediada por uma

proteína secretada pelo parasito, a TC-tox, a qual possui uma atividade lítica e

formadora de poros da membrana deste vacúolo em pH ácido, facilitada pela

presença de transialidases, localizadas na superfície da membrana das formas

tripomastigotas (ANDREWS, 1995; SACKS, SHER, 2002).

4

Figura 1 - Ciclo biológico do Trypanosoma cruzi. Os números de 1 a 8 representam

a sequência em que normalmente procede a infecção pelo T. cruzi. (1) O triatomíneo

infectado libera sobre a pele do hospedeiro fezes e urina contaminadas com

tripomastigotas metacíclicos após o repasto sanguíneo. (2) As formas

tripomastigotas atingem a corrente sanguínea. (3) Os tripomastigotas invadem

células onde se diferenciam em amastigotas. (4) Os amastigotas se multiplicam

dentro da célula e se diferenciam em tripomastigotas. As células se rompem e

liberam na corrente sanguínea os parasitos que invadem outras células. (5) Os

tripomastigotas circulantes são ingeridos por outro triatomíneo no momento da

hematofagia. (6) No intestino do triatomíneo, os tripomastigotas se diferenciam em

epimastigotas (7) e se multiplicam por divisão binária. (8) Os epimastigotas se

deslocam para o intestino posterior e se diferenciam em tripomastigotas

metacíclicos, reiniciando o ciclo (Adaptado de CDC, 2016;

http://www.cdc.gov/parasites/chagas/biology.html).

5

1.3) Vias de transmissão do T. cruzi

O T. cruzi apresenta mecanismos de transmissão que podem ser

classificados em primários ou principais e em secundários (COURA, 2015).

Entre os mecanismos primários estão a transmissão vetorial, transfusão

sanguínea, transmissão congênita, transmissão oral e através do canal do parto

durante o nascimento. A via vetorial é considerada uma das principais vias de

transmissão que consiste na inoculação do T. cruzi nos humanos e demais

hospedeiros através do contato com fezes de triatomíneos (conhecidos

popularmente como “barbeiros”) infectados com o parasito. Esses insetos vivem nas

frestas e nos telhados de casas em pobres condições, tornando as pessoas que

moram em áreas rurais e suburbanas mais susceptíveis à infecção. Além disso, os

triatomíneos escondem-se durante o dia, e durante à noite saem em busca de

alimento, sendo atraídos pela luz das casas (COURA, 2015; WHO, 2015).

Outro mecanismo de grande importância epidemiológica é a transfusão

sanguínea, pois em algumas regiões endêmicas ainda não há um controle efetivo

dos bancos de sangue (COURA, 2015). Já a transmissão congênita ocorre em

aproximadamente 5% dos recém-nascidos de mães infectadas, sendo que o risco de

transmissão pode ser influenciado por vários fatores como níveis de parasitemia

materna, idade, fatores imunológicos e características genéticas do parasito

(CARLIER et al., 2015).

E por fim, tem-se a transmissão por via oral através do consumo de alimentos

contaminados com o T. cruzi como, por exemplo, o açaí e o caldo de cana.

Atualmente, a infecção por via oral é considerada um modo de transmissão

significante em diversas regiões do Brasil, com relatos de surtos de doença aguda

severa pela ingestão de alimentos contaminados com as fezes de triatomíneos

infectados (RIBEIRO et al., 2016). Nessas situações, acredita-se que fezes de

triatomíneos contaminados ou insetos infectados com o T. cruzi sejam triturados

juntamente com os alimentos (YOSHIDA, 2008). No Brasil, entre os anos de 2000 e

2011, foram revelados 1.252 casos agudos de infecções pelo T. cruzi e desses, 70%

foram conferidos à transmissão oral (DOMINGUES et al., 2015).

Os mecanismos secundários são considerados menos frequentes e

consistem em transplantes de órgãos de doadores infectados com o parasito,

acidentes de laboratório, manipulação de animais contaminados, ingestão de carne

6

mal cozida de animais infectados, transmissão sexual e, excepcionalmente, através

de infecção criminal induzida (COURA, 2015).

I.4) A doença de Chagas

A doença de Chagas também conhecida como tripanossomíase americana é

uma complexa doença parasitária, que foi descoberta pelo pesquisador brasileiro

Carlos Ribeiro Justiniano Chagas (1878-1934), em 1909, no município de Lassance,

no Estado de Minas Gerais (CHAGAS, 1909; WHO, 2015). O T. cruzi foi descoberto,

pela primeira vez, no sangue de uma menina de três anos, chamada Berenice, em

abril de 1909 (CHAGAS, 1909; FIOCRUZ, 2003). O jovem Carlos Chagas foi o único

e o primeiro pesquisador a descobrir o parasito e seus vetores, os aspectos clínicos

da doença e os possíveis reservatórios do parasito. Esse fato inédito na história da

medicina tornou Chagas conhecido mundialmente (MOLINA et al., 2015).

A doença de Chagas é caracterizada por duas fases distintas: a fase aguda e

a fase crônica, as quais apresentam manifestações clínicas variáveis, variando

desde casos assintomáticos na fase aguda até graves comprometimentos cardíacos,

gastrointestinais ou mistos na fase crônica (RASSI JR, RASSI, MARIN-NETO, 2010).

A fase aguda é caracterizada por um alto parasitismo sanguíneo e tecidual e,

na maioria dos indivíduos, é assintomática e inaparente (MESSENGER, MILES,

BERN, 2015). Essa fase tem duração de até 3 meses e apresenta sinais clínicos

como febre, reação inflamatória na pele (chagoma) ou na conjutiva (sinal de

Romaña, edema bipalpebral unilateral), linfonodomegalia, arritmia cardíaca e

esplenomegalia (AYO et al., 2013; MOLINA et al., 2015;). A doença aguda grave

ocorre em menos de 1% dos pacientes e a mortalidade nessa fase é rara, podendo

ocorrer manifestações clínicas como miocardite aguda, derrame pericárdico e

meningoencefalite. A mortalidade nessa fase ocorre principalmente em lactentes e

em pacientes imunocomprometidos. Geralmente a fase aguda é resolvida

espontaneamente em torno de 2 a 4 meses mesmo na ausência de tratamento

(RASSI JR, RASSI, REZENDE, 2012; MESSENGER, MILES, BERN, 2015; MOLINA

et al., 2015).

Atualmente, alguns casos de doença de Chagas aguda têm sido relacionados

com a transmissão oral do T. cruzi através da ingestão de alimentos contaminados

com formas tripomastigotas metacíclicos do parasito. Geralmente nesses casos, o

7

quadro agudo, na maioria das vezes, leva a morte dos pacientes. Índices de

mortalidade são maiores nos casos de infecção oral devido a complicações tais

como insuficiência cardíaca congestiva, miocardite e meningoencefalite (BASTOS et

al., 2010; BOONEY, ENGMAN, 2015).

A fase crônica, por sua vez, é inicialmente assintomática e afeta cerca de 50 a

60% dos indivíduos, os quais permanecem infectados por toda a vida. Essa

condição é uma das características da forma indeterminada da doença

(MESSENGER, MILES, BERN, 2015). Tal forma também pode ser caracterizada

pela positividade sorológica e/ou parasitológica, além de ausência de manifestações

clínicas, eletrocardiográficas ou radiológicas significativas. Nesse estágio da doença,

o paciente apresenta uma resposta imune específica, que pode controlar a

multiplicação do parasito, reduzindo a parasitemia e, consequentemente,

controlando a infecção (RASSI JR, RASSI, MARIN-NETO, 2010; CHATELAIN,

2017;). Pelo menos 50% dos pacientes permanecem na forma indeterminada pela

vida inteira e não apresentam sequelas a longo prazo. Porém, após um período de

10 a 30 anos, aproximadamente 10 a 40% dos indivíduos infectados na fase crônica

assintomática desenvolvem patologias cardíacas e/ou digestivas (AYO et al., 2013;

CHATELEIN, 2017).

Aproximadamente 20 a 30% dos pacientes infectados na fase crônica

sintomática apresentam comprometimentos cardíacos irreversíveis como destruição

de fibras miocárdicas pelo processo inflamatório e substituição das mesmas por

tecido fibroso, além de insuficiência cardíaca, arritmias, tromboembolismo e, em

fases terminais, podem desenvolver cardiomiopatia chagásica crônica (AYO et al.,

2013; MESSENGER, MILES, BERN, 2015; STANAWAY, ROTH, 2015). A

cardiomiopatia chagásica crônica é o sinal clínico mais relevante levando até a

morte súbita. Essa manifestação é caracterizada por anomalias do sistema de

condução, em particular no bloqueio atrioventricular direito e/ou bloqueio fascicular

anterior esquerdo e contrações ventriculares antecipadas (AYO, et al., 2013;

MESSENGER, MILES, BERN, 2015).

As manifestações clínicas digestivas são mais raras do que as cardíacas e

representam cerca de 15 a 20% dos casos. A forma digestiva é mais comum no sul

do rio Amazonas e muito rara nos países do norte da América Latina. Tal forma tem

como característica a dilatação do esôfago e do cólon formando o megaesôfago e

megacólon, respectivamente, além de lesão no sistema nervoso autônomo em todo

8

o trato gastrointestinal, diminuição da motilidade intestinal e disfunção dos

esfíncteres (MESSENGER, MILES, BERN, 2015; STANAWAY, ROTH, 2015; DIAS

et al., 2016).

Ainda dentro das manifestações clínicas da doença de Chagas, pode existir

também a forma mista ou cardiodigestiva onde se observa nos pacientes sinais

clínicos cardíacos e digestivos simultaneamente (AYO et al., 2013).

Carlos Chagas, em seu estudo publicado em 1913, descreve a forma neural

crônica da doença de Chagas, após a observação de alterações no sistema nervoso

depois do fim da fase aguda (CHAGAS, 1913). Tais alterações poderiam ser

sequelas do acometimento nervoso da fase aguda. Porém, não existem estudos

anatomopatológicos que comprovem a existência dessa forma neural crônica.

Alterações e acomentimentos do sistema nervoso, como meningoencefalite,

distúrbios no sistema nervoso autônomo, central e periférico, estão presentes tanto

na fase aguda quanto na crônica. Além disso, no caso de pacientes

imunodeprimidos, o acometimento do sistema nervoso central apresenta grande

importância e gravidade (SIQUEIRA-BATISTA et al., 2008).

Mesmo após mais de 100 anos da descoberta da doença de Chagas, os

fatores determinantes das diferentes manifestações clínicas dessa doença ainda não

se encontram totalmente esclarecidos. Acredita-se que os fatores associados aos

pacientes estão envolvidos, mas está cada vez mais evidente que os aspectos

genéticos do parasito desempenham um papel fundamental nas características

clínicas da doença. No entanto, a aparente ausência de correlação entre diversidade

genética do parasito com as formas clínicas da doença pode ser explicada pelo fato

de que várias cepas do T. cruzi são constituídas por diferentes subpopulações ou

clones que podem apresentar tropismo para diferentes tecidos (MACEDO, et al.,

2004).

Além disso, muitas questões sobre a doença de Chagas ainda não foram

respondidas, como a progressão da doença, interações entre hospedeiro e parasito,

variabilidade genética com diferentes cepas de T. cruzi, o que representa uma

limitação para o desenvolvimento de pesquisas e descoberta de novos fármacos

para o tratamento da doença (CHATELAIN, 2015).

Segundo dados da Organização Mundial de Saúde, a doença de Chagas

apresenta um tratamento limitado a apenas dois medicamentos antiparasitários, o

Benzonidazol e o Nifurtimox. Esses medicamentos são quase totalmente eficazes

9

quando administrados logo após a infecção, uma vez que eles são indicados para a

fase aguda da doença. A eficácia dos mesmos é inversamente proporcional ao

tempo após a infecção, isto é, na fase crônica eles apresentam uma eficácia muito

pequena (CUNHA-NETO, CHEVILLARD, 2014; WHO, 2015).

O tratamento farmacológico é prolongado e pouco tolerado pelos pacientes, o

que pode ser justificado pelo limitado uso destes medicamentos devido aos efeitos

colaterais como dermatite alérgica, pruridos, febre, manifestações gastrointestinais

dentre outros (ZINGALES et al., 2014; CHATELAIN, 2017). Esta terapêutica é

indicada também para casos de doença de Chagas congênita e para pacientes com

reativação da doença devido à imunossupressão. Estudos têm mostrado que o

tratamento com estes anti-parasitários pode diminuir a progressão da doença

crônica, porém tais resultados ainda são controversos (NUNES et al., 2013; WHO,

2015).

O estudo de Morillo et al. (2015), também conhecido como BENEFIT

(Avaliação do Benzonidazol para Interrupção da Tripanossomíase, do inglês,

Benznidazole Evaluation for Interrupting Trypanosomiasis), foi realizado com 2.854

pacientes com cardiomiopatia chagásica crônica e teve como objetivo avaliar a

eficácia e segurança do benzonidazol, comparado ao placebo, na redução dos

desfechos clínicos entre esses pacientes. De acordo com este trabalho, o tratamento

com o benzonidazol reduziu significativamente a detecção de parasitos circulantes,

porém, não apresentou diminuição da progressão clínica da deterioração cardíaca.

As contraindicações para o Benzonidazol e o Nifurtimox são para as

gestantes e para pacientes com insuficiênica renal ou hepática. Indivíduos com

distúrbios neurológicos ou psiquiátricos não podem fazer uso do Nifurtimox. Além

disto, os tratamentos específicos para infecções crônicas com sintomas cardíacos e

digestivos também devem ser considerados (DIAS, 2015; WHO, 2015).

O tratamento e o apoio para pacientes na fase crônica têm evoluído nos

últimos anos. Uma vez que a maioria dos casos nesta fase é assintomática, é

necessário um acompanhamento periódico com atendimento médico e exames,

além de uma alimentação saudável e fortalecimento do sistema imunológico para

retardar a progressão da doença. O acesso adequado aos cuidados médicos e

controles clínicos periódicos possibilitam intervenções no momento adequado da

progressão da doença (FIOCRUZ, 2013; DIAS, 2015).

10

Até o momento não existe nenhuma vacina para a doença, mas várias formas

de imunização contra o T. cruzi têm sido testadas utilizando cepas atenuadas,

parasitos fracionados, tripanossomatídeos antigenicamente semelhantes e

moléculas sintéticas. Vários pesquisadores vêm adotando estratégias como as

vacinas de DNA ou vacinas gênicas como uma opção para desenvolver uma vacina

contra a doença de Chagas (ARCE-FONSECA et al., 2015; DIAS, 2015).

Pesquisadores brasileiros desenvolveram uma vacina utilizando vírus recombinantes

com proteínas capazes de induzir a imunidade contra o parasito, a mesma foi

testada em camundongos e apresentou resultados promissores. Porém, ainda é

necessário desenvolver uma formulação segura para o uso em humanos (PEREIRA

et al., 2015)

Outro estudo mostra que uma vacina baseada em peptídeo sintético da

proteína de superfície associada a mucina do T. cruzi é capaz de controlar de

maneira eficaz a infecção por T. cruzi, prolongar a sobrevivência e, possivelmente,

reduzir a progressão da doença em camundongos. No estudo, esta vacina

desencadeou uma estimulação imune ideal, envolvendo respostas tanto humorais

quanto celulares. Porém, são necessários mais estudos para a otimização deste

candidato a vacina (SERNA et al., 2014).

I.5) Epidemiologia da doença de Chagas

Durante o ciclo de vida do T. cruzi, hospedeiros de diferentes espécies podem

ser infectados caracterizando os ciclos silvestre, doméstico e peridoméstico de

transmissão. O ciclo silvestre é caracterizado pela interação entre hospedeiros

invertebrados e vertebrados (marsupiais, carnívoros, roedores, primatas, mamíferos

silvestres dentre outros animais). Os ciclos doméstico e peridoméstico envolvem o

contato entre o homem e o vetor. O ciclo peridoméstico pode ser considerado um elo

entre os ciclos silvestre e doméstico, pois está relacionado com animais domésticos

que são reservatórios do parasito e, triatomíneos silvestres que são atraídos para os

domicílios pela luz e pelo alimento (CÂMARA, 2008).

A dispersão do T. cruzi é bastante ampla no continente Americano,

especialmente o ciclo silvestre do parasito, que se estende desde a Carolina do

Norte e Maryland, EUA, até regiões meridionais do Chile e Argentina. Por sua vez, a

doença de Chagas é mais restrita, limitando-se basicamente às áreas em que, por

11

diferentes circunstâncias bioecológicas e sociais, ocorreu a domiciliação de seus

vetores invertebrados: os triatomíneos. Dessa forma, a circulação original do T. cruzi

compreende apenas a América, em especial a América Latina, e a distribuição

geográfica da doença de Chagas se sobrepõe ao mapa dos triatomíneos

domiciliados (DIAS, 2000).

Dados do Ministério da Saúde apontam que entre as 62 espécies dos vetores

distribuídas nas regiões intradomiciliares e peridomiciliares no Brasil, algumas

espécies podem ser consideradas de relevância epidemiológica como, por exemplo,

Panstrongylus lutzi, Rhodnius nasutus, Rhodnius robustus, Triatoma infestans,

Triatoma brasiliensis, Triatoma pseudomaculata e Triatoma vitticeps (BRASIL,

MINISTÉRIO DA SAÚDE 2015). As espécies que apresentaram maiores taxas de

infecção natural foram T. vitticeps (52,0%) sendo mais frequente nos estados do

Espírito Santo e Minas Gerais; R. robustus (33,3%) apresentando maior frequência

nos estados do Acre, Amazonas, Rondônia e Tocantins; e P. lutzi (29,4%) na região

Nordeste nos estados de Alagoas, Bahia, Ceará, Paraíba, Pernambuco, Piauí, Rio

Grande do Norte e Sergipe (BRASIL, MINISTÉRIO DA SAÚDE 2015).

No Brasil, a região Nordeste é considerada a mais importante para a doença

de Chagas, uma vez que é o local onde as espécies nativas de vetores como T.

brasiliensis (NEIVA, 1911), T. pseudomaculata (CORRÊA, ESPÍNOLA, 1964), P.

lutzi (NEIVA, PINTO, 1926) e R. nasutus (STAL, 1859) são comuns. O T. brasiliensis

é considerado o principal vetor do T. cruzi nas regiões semi-áridas do Nordeste e

está distribuído em todos os estados dessa região, além do Tocantins e Minas

Gerais. Esta espécie é capaz de suportar altas temperaturas, o que favorece sua

adaptação na região Nordeste. O T. brasiliensis está presente em áreas silvestres e

domésticas, porém, é mais encontrado em regiões peridomiciliares. O controle do

vetor nessa região ainda é um problema, uma vez que essa espécie tem capacidade

de ocupar ambientes silvestres, domiciliares e peridomiciliares (COURA, 2015;

ALMEIDA et al., 2016; BARBOSA-SILVA et al., 2016).

A doença de Chagas começou como uma enzootia, na qual o parasito

circulava entre os mamíferos selvagens e os vetores invertebrados e este contato

permaneceu durante séculos. Fatores socioeconômicos e ecológicos como

desmatamentos e assentamentos, migração, padrões de vida, temperatura,

umidade, dentre outros fatores, estão intimamente relacionados ao aparecimento da

doença de Chagas como uma zoonose ou zooantroponose típica no ambiente

12

doméstico, uma vez que a doença aconteceu após a inclusão do homem no habitat

dos vetores. Atualmente, com as mudanças no ambiente devido à ocupação

humana, a doença se tornou um grande problema de saúde pública na América do

Sul, América Central e parte do México e tem atingido áreas não-endêmicas através

da migração de indivíduos infectados (DIAS, 2015; SZAJNMAN et al., 2005).

Estudos indicam que a infecção de humanos com o T. cruzi tem ocorrido

desde os últimos nove milênios em países da região dos Andes. Foram identificadas

sequências de DNA específicas do T. cruzi em tecidos de múmias chilenas, além de

desenhos em cerâmicas peruanas datadas do século XIII ao século XVI que

revelaram possíveis representações da doença de Chagas, como uma cabeça com

edema palpebral unilateral, semelhante ao sinal de Romaña (CARLIER et al., 2002;

AUFDERHEIDE et al., 2004). No entanto, a expansão principal da doença humana

ocorreu entre 200 e 300 anos atrás, devido ao desenvolvimento da agricultura e

pecuária, que provocou a aproximação e o contato dos seres humanos com o

habitat natural dos vetores (AYO et al., 2013). Mudanças ambientais como

desmatamento e perda da biodiversidade de pequenos animais podem sinalizar

mudanças no comportamento dos triatomíneos, indicando o seu deslocamento para

regiões peridomiciliares e aumentando o risco de transmissão (CORASSA et al.,

2016).

De acordo com dados da Organização Mundial de Saúde é estimado que

cerca de 6 a 8 milhões de pessoas estão infectadas com o T. cruzi em todo o

mundo, principalmente na América Latina (WHO, 2015). Embora os programas de

saúde pública tenham reduzido significativamente a prevalência dessa doença na

América Latina nas últimas décadas, o número de infecções continua a se elevar

nos Estados Unidos, nos países europeus e, na região do Pacífico Ocidental. Esses

dados mostram que a doença de Chagas representa um problema relevante no

contexto da saúde pública mundial (BOONEY, 2014).

Estimativas recentes mostram que nos Estados Unidos mais de 300.000

indivíduos estejam infectados com T. cruzi, no Canadá são mais de 5.500, na

Europa e regiões do Pacífico Ocidental são mais de 80.000, no Japão cerca de

3.000 e na Austrália acima de 1.500 pessoas. Esses dados podem trazer uma nova

perspectiva sobre esta doença, uma vez que a mesma tem se tornado um problema

de saúde pública para os países não-endêmicos (AYO, et al., 2013; COURA, VIÑAS,

JUNQUEIRA, 2014).

13

A doença de Chagas é um dos principais problemas de saúde pública nas

Américas, com um custo econômico global de aproximadamente US$ 24 bilhões

(WONG et al., 2016). De acordo com o II Consenso Brasileiro em Doença de

Chagas, lançado durante o 52º Congresso Brasileiro de Medicina Tropical em

Macéio em 2016, o número de pessoas infectadas com o T. cruzi no Brasil varia de

1,9 milhão a 4,6 milhões de pessoas (DIAS et al., 2016). Em 2014, Martins-Melo et

al. publicaram a primeira revisão sistemática sobre a prevalência da doença de

Chagas no Brasil e mostraram que essa doença é mais prevalente em mulheres

(4,2%) maiores de 60 anos (17,7%), residentes na região Nordeste (5,0%) e Sudeste

(5,0%) e em áreas mistas urbana/rural (6,4%). Esse estudo aponta uma diminuição

na taxa de mortalidade de 3,28 para 2,19/100.000 habitantes. Porém, houve

diferenças entre as regiões do Brasil como, por exemplo, no Sudeste, Sul e Centro-

Oeste seguiram o padrão nacional com dimuição das taxas, já no Nordeste houve

um aumento na mortalidade e no Norte essa taxa se manteve estável. Essas

diferenças entre as regiões refletem as desigualdades econômicas, sociais e na

qualidade dos cuidados em saúde, além do reconhecimento da importância do

controle dessa doença.

Assim, a doença de Chagas precisa ser controlada através de várias medidas

para reduzir e eliminar sua transmissão, principalmente transmissão via vetorial, oral,

congênita e através de doação de sangue e órgãos. As medidas de controle,

voltadas para o combate do vetor no ambiente doméstico e peridoméstico através do

tratamento químico das habitações infestadas, obtiveram o maior avanço na década

de 80 (COURA, 2013). Em 1991, foram criadas iniciativas multinacionais para

controle da doença de Chagas como o INCONSUR (Iniciativa do Cone Sul –

Argentina, Bolívia, Brasil, Chile, Paraguai e Uruguai), Iniciativa dos Países Andinos

(IAC – Colômbia, Equador, Peru e Venezuela), e iniciativa dos Países da Região

Amazônica (AMCHA - Bolívia, Brasil, Colômbia, Equador, Guiana Francesa, Peru,

Suriname e Venezuela). Essas iniciativas seriam uma nova abordagem política e

técnica para melhorar os programas nacionais de controle da doença em áreas

endêmicas com o objetivo principal de controlar os vetores domiciliados e selecionar

de forma segura os doadores em bancos de sangue (COURA, VIÑAS, JUNQUEIRA,

2014; DIAS, 2015).

Em 2006, a Organização Pan-Americana de Saúde certificou a interrupção da

transmissão da doença de Chagas através do T. infestans no território brasileiro

14

(FERREIRA e SILVA, 2006). Esse certificado representa um avanço no controle da

doença, mas representa a eliminação de um vetor específico e não a erradicação da

doença, uma vez que existem mais de 150 espécies de triatomíneos espalhadas

pela América Latina capazes de atuar como reservatórios do parasito. Outra

consideração sobre este certificado é que ele traz a falsa idéia de que a doença está

sob controle e que, consequentemente, perdeu visibilidade diante das autoridades e

da população. Dessa forma, o governo tende a priorizar outros problemas de saúde

que têm maior visibilidade pública e política (FERREIRA e SILVA, 2006).

Portanto, o controle dos vetores e dos bancos de sangue deve permanecer e

outras medidas básicas de controle da transmissão da doença também devem ser

adotadas, tais como: tratamento para pacientes nas fases aguda e crônica, medidas

educativas para a população sobre transmissão oral, ênfase na importância do pré-

natal para gestantes infectadas, além da melhora no diagnóstico e no tratamento da

doença (SHIKANAI-YASUDA e CARVALHO, 2012; COURA, 2013; CARLIER et al.,

2015).

I.6) Organização genômica do T. cruzi

O T. cruzi apresenta seu genoma organizado em duas regiões distintas: o

DNA presente no núcleo da célula e o DNA extranuclear presente na única

mitocôndria do parasito denominado de DNA do cinetoplatso ou kDNA (MYLER et

al., 1993). O conteúdo total de DNA em T. cruzi pode variar de 125 a 330

fentogramas por célula incluindo o DNA do cinetoplasto que representa cerca de 23

a 30% do DNA celular total (DEGRAVE et al., 1988; HENRIKSSON et al., 1996;

JUNQUEIRA et al., 2005).

O DNA nuclear do T. cruzi representado pelo clone CL Brener, foi

completamente sequenciado em 2005 (EL-SAYED et al., 2005). A estimativa é que o

tamanho do genoma diplóide esteja entre 106,4 e 110,7Mb (megabases), sendo que

pelo menos 50% do genoma é composto por sequências repetitivas (DNA satélite),

consistindo principalmente por grandes famílias de genes que codificam para

proteínas de superfície, retrotransposons e repetições subteloméricas.

Aproximadamente 60% do genoma parece codificar proteínas, sendo preditos

22.570 produtos gênicos dos quais pouco mais da metade (12.570) representam

cópias alélicas (EL-SAYED et al., 2005).

15

A comparação dos contigs de CL Brener com as reads provenientes do

sequenciamento do genoma do clone Esmeraldo do T. cruzi, possibilitou distinguir

dois haplótipos diferentes em CL Brener, os quais foram chamados de haplótipos

Esmeraldo like e non Esmeraldo like. Esses dois haplótipos mostraram altos níveis

de sintenia gênica, uma vez que a maior parte das diferenças foi devida às

inserções/deleções em regiões intergênicas e subteloméricas e/ou amplificação de

sequências repetitivas (ELSAYED et al., 2005).

Em 2009, Weatherly e colaboradores com o objetivo de gerar uma montagem

em alta resolução para a organização cromossomal do genoma nuclear do T. cruzi

gerou um consenso de cada par de cromossomos homólogos para ambos os

haplótipos. Neste trabalho, os autores montaram inicialmente 11 cromossomos

baseados na sintenia com os cromossomos de T. brucei. Os outros cromossomos

foram montados após o mapeamento de ambas as extremidades de clones de

BAC’s (Bacterial Artificial Chromosomes) que apresentaram sequências de

diferentes contigs ou scaffolds na direção correta. No final deste trabalho foi possível

montar 41 cromossomos, o que corrobora com o número de cromossomos preditos

para o T. cruzi baseados em estudos de PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis)

(BRANCHE et al., 2006; WEATHERLY, BOEHLKE, TARLETON, 2009).

Esta montagem proposta por Weatherly et al. (2009), apresenta 90% dos

genes anotados no genoma e, além disso, foi possível observar que a organização

genômica do T. cruzi é extremamente sintênica com os genomas de T. brucei e L.

major, os quais juntamente com o T. cruzi são conhecidos como Tri-Tryps. Essa

sintenia encontra-se bem conservada em regiões contendo os genes housekeeping,

mas é perdida em regiões de famílias gênicas que codificam para proteínas de

superfície que ocorrem em posições cromossômicas internas não-sintênicas e

regiões subteloméricas. Retroelementos e RNAs estruturais ocorrem também

nessas regiões de baixa sintenia (EL-SAYED et. al., 2005) (Figura 2).

O kDNA, por sua vez, está organizado em uma rede complexa de moléculas

circulares denominadas de maxicírculos e minicírculos. Os minicírculos do kDNA

estão presentes em torno de 10.000 a 20.000 cópias por célula, sendo compostos

por quatro regiões conservadas de 120 a 160pb intercaladas por quatro regiões

variáveis de aproximadamente 280 a 320 pb. As regiões conservadas contêm a

região de replicação do DNA e são também conservadas entre diferentes isolados e

cepas do T. cruzi, já as regiões variáveis codificam pequenos RNAs guia (gRNA),

16

que participam do processo de editoração (adição ou deleção de uridinas) dos

mRNAs das enzimas mitocondriais em T. cruzi (JUNQUEIRA et al., 2005).

Devido ao seu alto número de cópias, os minicírculos constituem como alvos

interessantes para a detecção do parasito em amostras contaminadas através da

Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) (JUNQUEIRA et al., 2005). Eles já foram

empregados para detectar o DNA do parasito em várias amostras biológicas como

sangue de animais experimentalmente infectados (STURM et al., 1989), sangue de

pacientes chagásicos (AVILA et al., 1991, 1993; WINCKER et al., 1994; BURGOS et

al., 2007), e em tecidos cardíaco, esofágico e cólon de pacientes chagásicos

crônicos (VAGO et al., 2000; 2003).

Os maxicírculos, por sua vez, estão presentes em cerca de 20 a 50 cópias por

célula. Eles são semelhantes ao DNA mitocondrial de eucariotos superiores e

apresentam uma região conservada e uma região variável que codifica os RNAs

ribossomais e proteínas relacionadas com a respiração celular. Assim, os

maxicírculos contém os genes das proteínas mitocondriais (citocromo oxidase,

citocromo b, ATPases, NADH desidrogenase) (MYLER et al. 1993;

WESTENBERGER et al., 2006).

Outra característica importante dos maxicírculos é a falta de alguns elementos

fundamentais para a sua tradução, como códons de iniciação ou janelas abertas de

leitura descontínuas, o que é resolvido através de modificação pós-transcricional

como adição e/ou remoção de uridinas (LUKES et al., 2002; WESTENBERGER et

al., 2006).

Um estudo publicado em 2006 apresentou as sequências de DNA dos

maxicírculos de duas cepas do T. cruzi (CL Brener e Esmeraldo). Com este estudo

foi possível observar pouca ou nenhuma variação de nucleotídeos nas regiões

codificantes dos maxicírculos nas duas cepas, mesmo elas apresentando algumas

inserções e/ou deleções cepa-específicas. Os maxicírculos, além das regiões

codificantes, apresentam regiões não codificantes que variam de tamanho entre 4 a

6kb (quilobases), assim como, a presença de um elemento que tem uma sequência

conservada que pode servir como uma origem de replicação (WESTENBERGER et

al., 2006).

17

Figura 2 - Modelo para a organização estrutural dos 41 cromossomos presentes no

genoma do T. cruzi. Figura esquemática mostrando o modelo para representar os 41

cromossomos do genoma do T. cruzi ordenados por tamanho em pares de bases.

Os fragmentos genômicos (contigs e scaffolds) gerados pelo Projeto Genoma do T.

cruzi foram montados em cromossomos baseados em mapas de sintenia de outros

tripanosomatídeos e no sequenciamento de BACs do T. cruzi. Fonte: Adaptado de

Whetherly et al., 2009.

18

I.7) Variabilidade intraespecífica do T. cruzi

O T. cruzi é constituído por um conjunto de populações heterogêneas que

possuem vários clones naturais, que circulam nos ambientes doméstico e silvestre,

entre seres humanos, reservatórios e vetores. Tais populações são complexas e

apresentam variações intraespecíficas demonstradas em níveis biológico,

bioquímico, quimioterápico, imunológico e genético (MILES et al., 2009; ZINGALES

et al., 2012). A variabilidade biológica de diferentes cepas do T. cruzi tem

evidenciado a heterogeneidade dessas populações no que se refere à morfologia, à

taxa de crescimento, à virulência, ao tropismo tecidual, à suscetibilidade a drogas e

à composição antigênica (D’ÁVILA, 2008). Chagas (1909) já havia descrito um

dimorfismo das formas tripomastigotas sanguíneas do T. cruzi (formas delgadas e

largas do parasito), tal fato foi confirmado posteriormente por outros pesquisadores

(SILVA, 1959; BRENER, 1965).

Diversos estudos demonstraram que existem porcentagens diferentes de

formas tripomastigotas delgadas, largas e muito largas no sangue periférico de

animais infectados com diferentes cepas do T. cruzi (BRENER e CHIARI, 1963;

BRENER, 1965). Sabe-se que as formas tripomastigotas delgadas predominam em

cepas de elevada virulência para animais experimentais. As formas delgadas

apresentam macrofagotropismo, desenvolvem parasitemia precoce e são mais

sensíveis à ação de anticorpos circulantes, enquanto as formas largas são mais

frequentes em cepas miotrópicas e de baixa virulência em animais infectados

experimentalmente (BRENER & CHIARI, 1963; BRENER, 1965; BRENER, 1969;

ANDRADE, 1974).

O T. cruzi, segundo Tibayrenc e Ayala (1988), apresenta uma estrutura

populacional e evolução predominantemente clonal. Isso sugere que a reprodução

sexual ou recombinação genética é um fenômeno extremamente raro nesta espécie,

tão raro, que não é capaz de impedir a existência de clones naturais estáveis no

tempo. Tal fato pode explicar a grande variabilidade biológica deste parasito. De

acordo com Tibayrenc e Ayala (1991) essa extensa variabilidade biológica e

genética encontrada nessa espécie pode ser proveniente dos múltiplos contatos

entre os vetores e reservatórios nas áreas endêmicas, os quais possibilitaram

infecções com mais de uma população do T. cruzi, apresentando propriedades

biológicas distintas entre si, e coexistindo dentro de um mesmo hospedeiro, sem

19

recombinação entre eles, formando as populações monoclonais ou multiclonais do

parasito.

A introdução de técnicas de Biologia Molecular baseadas na PCR iniciou uma

nova era no estudo da variabilidade genética do T. cruzi. Através desta estratégia foi

possível amplificar diferentes alvos no T. cruzi, tanto no genoma nuclear como no

kDNA, a fim de classificar as subpopulações dessa espécie de acordo com sua

identidade genética (OLIVE & BEAN, 1999; MACEDO et al., 2001).

Em 2009, durante o XIII Congresso Internacional de Protistologia, XXV

Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Protozoologia e da XXXVI Reunião Anual

de Pesquisa Básica em Doença de Chagas, realizada em Armação dos Búzios, Rio

de Janeiro, Brasil, ficou decidido um novo consenso para a nomenclatura

intraespecífica do T. cruzi. As cepas do T. cruzi são agora referidas como seis

Unidades Taxonômicas Discretas (DTUs) chamadas T. cruzi I a T. cruzi VI

(ZINGALES et al., 2009).

Segundo Zingales et al. (2012) as diferentes DTUs estão associadas com

diferentes ciclos biológicos de transmissão, parecem ter distribuição geográfica

variada e apresentam manifestações clínicas distintas. Estudos atuais mostram que

Tc I é a DTU mais frequente e a maior agente de infecção humana. Esta DTU tem

sido encontrada desde o sul dos Estados Unidos ao norte do Chile e Argentina e,

pode ser transmitida tanto no ciclo doméstico quanto no silvestre. Manifestações

clínicas incluem a cardiomiopatia chagásica e os hospedeiros imunocomprometidos

podem apresentar casos severos de meningoencefalite (ZINGALES et al., 2014;

MARTINEZ-PEREZ et al., 2016). Na região dos países do Cone Sul, DTUs Tc II, Tc

V e Tc VI têm sido associadas com o ciclo doméstico e com a maioria dos casos de

humanos infectados com T. cruzi. Essas DTUs podem causar cardiomiopatia

chagásica e, em alguns casos, podem desenvolver megaesôfago e megacólon. A

DTU Tc III primeiramente foi associada ao ciclo silvestre no Brasil e países

adjacentes e os casos documentados de infecção humana são raros. Já Tc IV

também tem sido associado ao ciclo silvestre e pode estar associado com casos

agudos na região da bacia do rio Amazonas, sendo a segunda DTU mais frequente

encontrada na Venezuela (MARCILI et al., 2009; ZINGALES et al., 2012). Estudos

mostram que Tc V tem sido relatado em 80 a 100% dos casos de transmissão

congênita na Argentina, Bolívia, sul do Brasil, Chile e Paraguai (VIRREIRA et al.,

2006; BURGOS et al., 2007; VALADARES, 2007; CORRALES et al., 2009).

20

1.8) Marcadores moleculares em T. cruzi

O T. cruzi apresenta elevado grau de polimorfismo genético, tanto em nível do

DNA nuclear quanto do kDNA. As técnicas de Biologia Molecular utilizadas no

estudo da variabilidade genética do T. cruzi permitem gerar marcadores genotípicos

polimórficos capazes de confirmar a homogeneidade e/ou heterogeneidade do

parasito (OLIVE & BEAN, 1999; MACEDO et al., 2001).

Diferentes metodologias baseadas na PCR utilizando marcadores multilocais

foram utilizadas para reforçar a variabilidade genética do T. cruzi. Entre estas

técnicas destacam-se a Impressão digital de DNA (MACEDO et al., 1992), o RAPD

(Randomly Amplified Polymorphic DNA) (TIBAYRENC et al., 1993) e o SSR – PCR

(Simple Sequence Repeat – PCR) (OLIVEIRA et al., 1997).

Além disso, com os diversos trabalhos realizados com a utilização da técnica

de PCR amplificando diferentes marcadores unilocais no genoma do T. cruzi, vários

alvos moleculares para a detecção do parasito em amostras biológicas foram

descritos ao longo de décadas de pesquisa, entre os quais podemos citar os

minicírculos presentes no kDNA (AVILA et al., 1991), DNA satélite (MARTINS et al.,

2007), região espaçadora dos genes do mini-éxon (BURGOS et al., 2007), o rDNA

24Sα (SOUTO et al., 1996), o gene para a subunidade II da enzima mitocondrial

Citocromo Oxidase (FREITAS et al., 2006) e os microssatélites (OLIVEIRA et al.,

1998; VALADARES et al., 2008), alvos de estudo deste trabalho.

I.8.1) Microssatélites

Os microssatélites, também conhecidos como STR (Short Tandem Repeats)

são sequências curtas de DNA contendo de 1 a 6 nucleotídeos repetidos em tandem

encontradas no genoma dos organismos eucariotos (LITT, LUTY, 1989; WEBER,

MAY, 1989; TAUTZ, 1989). Eles são considerados poderosos marcadores genéticos

devido a sua abundância, dispersão no genoma e alto grau de polimorfismo de

tamanho. Devido a essas características, são amplamente empregados em análises

de parentesco, caracterização de indivíduos, construção de mapas genéticos de alta

densidade com o objetivo de identificar locos envolvidos em doenças genéticas e

estudos filogenéticos e populacionais (GOLDSTEIN & POLLOCK, 1997; KNAPICK et

21

al., 1998; OLIVEIRA et al., 1998; VALADARES et al., 2008; VALADARES et al.,

2012).

Os microssatélites são classificados quanto ao tamanho da sua repetição,

sendo denominados mono, di, tri, tetra, penta e hexanucleotídeos, para repetições

de um, dois, três, quatro, cinco ou seis pares de bases, respectivamente. Eles

também podem ser classificados quanto à estrutura da repetição, sendo designados

como perfeitos, quando existe somente um motivo de repetição, sem interrupções;

imperfeitos, quando existem bases diferentes intercalando a repetição; e compostos

quando mais de duas repetições perfeitas ou imperfeitas estão separadas por no

máximo 3pb (WEBER, 1990).

O elevado grau de polimorfismo encontrado nos microssatélites é derivado da

variação no número de repetições de um alelo para outro (LITT, LUTY, 1989;

TAUTZ, 1989; WEBER, MAY, 1989). As taxas de mutação para a grande parte dos

locos de microssatélites são comumente de várias ordens de magnitude superiores

às taxas de mutação para outros locos dentro do mesmo genoma, que são na ordem

de 10-9 a 10-10. In vivo a taxa de mutação tem sido calculada em 10-2 por loco por

replicação em Escherichia coli (LEVINSON, GUTMAN, 1987a) e em torno de 10-4 a

10-5 em leveduras (HENDERSON, PETES, 1992). Uma vez que a evolução do DNA

de cópia única é devida, principalmente, ao acúmulo de substituições de bases, o

mecanismo prevalente de mutação de microssatélites é a derrapagem da DNA

Polimerase (HARR, ZANGERL, SCHLÖTTERER, 2000). Nos microssatélites durante

o processo de replicação do DNA, as duas fitas podem deslizar (slippage) uma

sobre a outra devido ao movimento da DNA Polimerase, formando bolhas de DNA

não-pareado. Muitas dessas bolhas são corrigidas pelo sistema de reparo de erros,

mas uma pequena proporção de bolhas não reparadas resulta no ganho ou na perda

de uma unidade repetitiva (LEVINSON & GUTMAN, 1987b; ELLEGREN, 2004).

Os microssatélites têm sido detectados dentro dos genomas de todos os

organismos até agora analisados, principalmente no interior de regiões não

codificantes do genoma (HANCOCK, 1999). Os mesmos podem ser encontrados

também, porém em uma taxa muito menor, em sequências de regiões promotoras e

codificantes (BIGGIN, TJIAN, 1988). Comparando os genomas, os microssatélites

são encontrados com uma frequência maior nos genomas de eucariotos do que em

procariotos (HANCOCK, 1995; FIELD, WILLS, 1998). Além disso, apresentam

22

tamanhos bastante variáveis, resultando em locos genéticos muito mais polimórficos

(HAMADA, PETRINO, KAKUNAGA, 1982).

Os microssatélites apresentam características intrínsecas que facilitam sua

análise e classificação, como por exemplo, o seu pequeno tamanho total em torno

de 100 a 300pb, incluindo as regiões flanqueadoras, o que permite sua amplificação

por PCR visando à variabilidade genética do organismo estudado. Além disso, esses

marcadores são variáveis quanto ao número de repetições de suas sequências

(Variable Number of Tandem Repeats - VNTRs) (ASHLEY, DOW, 1994). Logo, tais

características fazem dos microssatélites poderosos marcadores genéticos, podendo

ser utilizados em estudos filogenéticos e populacionais de vários organismos.

No ramo da parasitologia, os microssatélites têm sido descritos e já foram

analisados em diversos parasitos. Na parasitologia humana pode-se citar a

identificação de microssatélites em diferentes espécies do gênero Plasmodium

(BELKUM et al., 1992) como, a espécie Plasmodium falciparum, parasito

responsável pela malária em humanos (SU, WELLEMS, 1996), em Schistosoma

mansoni, causador da esquistossomose (CORRÊA-OLIVEIRA et al., 2000),

Toxoplasma gondii (AJZENBERG et al., 2002), causador da toxoplasmose, entre

outros. No campo da parasitologia animal pode-se citar a identificação de

microssatélites em Trichinella pseudospiralis, parasito de aves e mamíferos

(ZARLENGA et al., 1996) e Haemonchus contortus, parasito gastrointestinal de

ovinos e caprinos (HOEKSTRA et al., 1997), dentre outros parasitos. Com foco

principal no presente estudo, cita-se também a descrição de microssatélites em

tripanossomatídeos como Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de

Chagas (OLIVEIRA et al., 1998, VALADARES et al., 2008), além de Leishmania spp

(ROSSI et al.,1994; RODRIGUEZ et al.,1997; RUSSEL et al.,1999).

Os primeiros oito locos de microssatélites do T. cruzi foram isolados e

caracterizados, em 1998, a partir de uma biblioteca de DNA gênomico enriquecida

quinze vezes para repetições dinucleotídica do tipo (CA)n do clone CL Brener do T.

cruzi. Tal fato representa um marco histórico nos estudos populacionais do T. cruzi,

uma vez que possibilitou a avaliação da grande diversidade genética nesse parasito,

que não era possível a partir de outros marcadores moleculares utilizados na época

(OLIVEIRA et al., 1998). Este estudo analisou o grau de polimorfismo de oito locos

de microssatélites em diferentes cepas e clones do T. cruzi. Esses marcadores

apresentaram um elevado poder de resolução, uma vez que não foi observada a

23

repetição de um único genótipo multilocal com a análise dessas repetições em 26

amostras (OLIVEIRA et al., 1998) e, posteriormente, em 131 amostras do T. cruzi

(PIMENTA, 2002).

Os resultados dessas análises corroboram para a organização diplóide do

genoma do T. cruzi, uma vez que dentre os clones analisados, todos apresentaram

um único pico indicando homozigose ou dois picos de tamanhos diferentes

indicando heterozigose para os oito locos de microssatélites. Porém, entre as cepas

do T. cruzi, algumas apresentaram mais de dois alelos para determinados locos,

indicando provavelmente uma constituição multiclonal para estas cepas (OLIVEIRA

et al., 1998). As amostras que apresentaram mais de dois alelos foram, na sua

grande maioria, aquelas isoladas de reservatórios e vetores silvestres, ou de

pacientes chagásicos na fase aguda da doença. Essas amostras eram as mesmas

que apresentaram alto grau de variabilidade genética identificada pelas técnicas de

RAPD e SSR-PCR (OLIVEIRA et al., 1997), indicando que o grau de variabilidade

genética observada nessas amostras pode estar intimamente relacionado com uma

possível constituição multiclonal de algumas populações do T. cruzi.

Estes locos de microssatélites também foram utilizados como marcadores

genéticos para a reconstrução filogenética do T. cruzi. Em 2006, Freitas et al.

analisaram 75 amostras do T. cruzi e construíram um gráfico de escala

multidimensional, mostrando claramente o agrupamento das cepas do T. cruzi em

quatro grupos bem definidos: Multidimensional scaling-MDS A (correspondente a

cepas Tc I), MDS C (cepas Tc II), MDS B (cepas Tc III) e MDS BH (cepas híbridas).

Neste trabalho os autores sugeriram um cenário mínimo de evolução onde pelo

menos um evento de hibridação envolvendo Tc II e III que produziram uma progênie

viável (FREITAS et al., 2006).

Os microssatélites do T. cruzi, mesmo sendo hipervariáveis, apresentam

estabilidade em condições de manutenção em laboratório. Os oito locos de

microssatélites foram analisados e não apresentaram diferenças nos tamanhos dos

fragmentos amplificados durante 70 gerações de cultura contínua do clone CL

Brener (MACEDO et al., 2001, 2004).

Apesar dos locos de microssatélites isolados por Oliveira et al. (1998) terem

tido grandes aplicações nos estudos relacionados à estrutura populacional e

filogenia deste parasito, eles apresentaram limitações técnicas devido às

extremidades flanqueadoras curtas que impossibilitam a escolha de novos

24

iniciadores para o uso em ensaios de PCR mais sensíveis, como o Nested PCR

(PIMENTA, 2002; VALADARES, 2007).

Assim, utilizando sequências de DNA depositadas em bancos de dados pelo

Projeto Genoma do T. cruzi, Valadares et al. (2008) identificaram novos locos

constituídos de motivos de tri e tetranucleotídeos que apresentam extremidades

flanqueadoras mais longas e foram utilizadas em ensaios de PCR sensíveis o

suficiente para permitir a amplificação de pequenas quantidades de DNA do T. cruzi

diretamente do tecido cardíaco, sangue, fluido cerebroespinhal e pele de pacientes

possibilitando o diagnóstico molecular da doença de Chagas (VALADARES et al.,

2008) e em células únicas do parasito isoladas por Separação de células ativadas

por fluorescência (do inglês, Fluorescence Activated Cell Sorter - FACS)

(VALADARES et al., 2012).

Devido às características citadas acima, os microssatélites representam uma

técnica rápida, reprodutível e sensível, adequada ao estudo da dinâmica

populacional do T. cruzi e, ainda, é capaz de indicar facilmente se uma cepa é mono

ou multiclonal (OLIVEIRA et al., 1998; MACEDO et al., 2001; 2004; VALADARES et

al., 2008). Além disso, os microssatélites são marcadores unilocais, o que permite a

determinação exata dos alelos presentes em uma cepa e, consequentemente,

permite fazer inferências populacionais mais precisas do que outros marcadores

aleatórios, tais como RAPD e SSR-PCR (OLIVEIRA et al., 1997).

II) JUSTIFICATIVA

26

Desde a sua descoberta no genoma do T. cruzi, os microssátelites mostraram

ser marcadores moleculares extremamente úteis em diversas análises de

variabilidade genética, estrutura populacional e filogenia para este parasito.

Trabalhos realizados por Oliveira et al. (1998) e Valadares et al. (2008) permitiram o

isolamento dos primeiros locos de microssátélites compostos por repetições de di, tri

e tetranucleotídeos no genoma do T. cruzi. Entretanto, estes dois trabalhos

apresentam algumas limitações, as quais foram impostas circunstancialmente na

época em que foram realizados. Por exemplo, o trabalho realizado por Oliveira et al.

(1998) isolou locos de microssatélites compostos por apenas repetições de

dinucleotídeos e com sequências flanqueadoras às repetições muito curtas. Este

fato impossibilita o desenho de novos iniciadores para o seu uso em ensaios de

PCR mais sensíveis como a Nested PCR para a detecção do DNA parasito em

amostras de tecidos provenientes de pacientes chagásicos.

Por sua vez, o trabalho realizado por Valadares et al. (2008) isolou locos de

microssatélites, compostos por repetições de tri e tetranucleotídeos com

extremidades flanqueadoras grandes, contornando desta forma a limitação dos locos

de microssatélites isolados por Oliveira et al. (1998) e permitindo o uso destes locos

em ensaios de Nested PCR utilizando amostras biológicas de pacientes chagásicos.

Entretanto, nesta época, existiam poucas sequências provenientes do genoma do T.

cruzi depositadas em bancos de dados e os locos de microssatélites isolados por

Valadares et al. (2008) tornaram-se restritos ao cromossomo 3 do T. cruzi.

Ademais, estudos anteriores realizados por PIMENTA (2002), FREITAS et al.,

(2006) e VALADARES et al. (2008) utilizando os locos de microssatélites já descritos

demonstraram que para a diferenciação de quaisquer cepas do T. cruzi é necessário

um número mínimo de quatro a cinco locos.

Então, devido às limitações dos trabalhos de Oliveira et al. (1998) e Valadares

et al. (2008) e aliado ao fato de que existem poucos locos de microssatélites que

combinam ao mesmo tempo nível de polimorfismo adequado e alta sensibilidade nos

ensaios de PCR (PIMENTA, 2002; VALADARES et al., 2008), torna-se necessário o

isolamento de novos locos de microssatélites no genoma do T. cruzi.

Com o sequenciamento completo do genoma do T. cruzi (EL-SAYED et al.,

2005) e o rearranjo cromossomal para o clone CL Brener disponibilizados no banco

de dados Tritryp DB (WHEATHERLY et al., 2009), atualmente todo o genoma do

27

parasito pode ser explorado permitindo o isolamento de novos locos de

microssatélites em outros cromossomos do T. cruzi, além do cromossomo 3.

Assim, com a realização deste trabalho vislumbra-se encontrar novos locos

de microssatélites com um alto nível de polimorfismo propiciando uma redução no

número de locos de microssatélites de três a quatro para a diferenciação de

quaisquer cepas do T. cruzi, o que diminuirá os custos financeiros e o tempo de

análise para a determinação dos alelos em sequenciador de DNA. Além disso,

espera-se isolar locos de microssatélites que apresentem uma alta sensibilidade nos

ensaios de Nested PCR, os quais poderão ser utilizados como marcadores de

escolha em estudos de diagnóstico molecular da doença de Chagas.

III) OBJETIVOS

29

III.1) Objetivo Geral

Isolar novos locos de microssatélites polimórficos localizados em diferentes

cromossomos do genoma do T. cruzi e aplicá-los em estudos de variabilidade

genética do parasito e no diagnóstico molecular da doença de Chagas.

III.2) Objetivos Específicos

Identificar novos locos de microssatélites localizados em diferentes

cromossomos no genoma do T. cruzi constituídos por motivos de di, tri e

tetranucleotídeos;

Desenhar os iniciadores correspondentes às regiões flanqueadoras dos locos

de microssatélites;

Padronizar os ensaios de PCR;

Avaliar o polimorfismo dos novos locos de microssatélites;

Determinar o tamanho dos alelos dos microssatélites em sequenciador

automático de DNA;

Avaliar parâmetros de genética de populações e de filogenia;

Avaliar a sensibilidade dos ensaios de PCR para os novos locos de

microssatélites;

Aplicar os novos locos de microssatélites em ensaios de Full Nested PCR

empregando amostras de tecido cardíaco de pacientes chagásicos crônicos.

IV) MATERIAIS E MÉTODOS

31

IV.1) Identificação dos novos locos de microssatélites no genoma do T. cruzi

Para a identificação dos novos locos de microssatélites compostos por

repetições de di, tri e tetranucleotídeos no genoma do T. cruzi, as sequências de

DNA correspondentes aos cromossomos 1 ao 11 (exceto o cromossomo 3),

correspondentes ao haplótipo Esmeraldo-like do clone CL Brener, foram compiladas

no banco de dados TriTrypDB

(http://tritrypdb.org/tritrypdb/app/record/organism/TMPTX_tcruCLBrenerEsmeraldo-

like) e, posteriormente, submetidas ao programa Tandem Repeats Finder

(https://tandem.bu.edu/trf/trf.html) (BENSON, 1999).

O clone CL Brener foi escolhido por ser um organismo modelo para diversos

estudos biológicos e genômicos para o T. cruzi, uma vez que seu genoma já foi

sequenciado e publicado (EL-SAYED, 2005).

IV.2) Desenho dos iniciadores correspondentes às regiões flanqueadoras dos

locos de microssatélites

Utilizando o programa Oligo Analyser versão 1.3 disponível no endereço

eletrônico www.idtdna.com/analyzer/applications/oligoanalyzer, foram desenhados

os iniciadores forward e reverse específicos para cada loco de microssatélite

identificado anteriormente. Além disso, este programa permitiu avaliar e adequar

parâmetros primordiais específicos de iniciadores funcionais, dentre os quais, podem

ser citados: tamanho dos iniciadores em pb, porcentagem das bases citosina e

guanina, Tm (Melting Temperature), possibilidade de formação de dímeros com o

próprio iniciador ou com o iniciador correspondente e formação de grampos

(hairpins).

Após isso, na extremidade 5´ de cada iniciador forward foi adicionada a

sequência do iniciador universal M13(-40) marcado com fluoresceína com tamanho

correspondente a 17pb, com a finalidade de facilitar as análises no sequenciador

automático de DNA. Depois de selecionar os iniciadores, estes foram enviados para

a síntese química na empresa IDT (Integrated DNA Technologies) (Belo Horizonte,

MG, Brasil).

http://tritrypdb.org/tritrypdb/app/record/organism/TMPTX_tcruCLBrenerEsmeraldo-like

http://tritrypdb.org/tritrypdb/app/record/organism/TMPTX_tcruCLBrenerEsmeraldo-like

https://tandem.bu.edu/trf/trf.html

http://www.idtdna.com/analyzer/applications/oligoanalyzer

32

IV.3) Padronização dos ensaios de PCR

Para padronização dos ensaios de PCR foram avaliadas as seguintes

variáveis: tampões para a PCR (concentração de NaCl, KCl, MgCl2, Triton X-100 e

pH) e temperaturas de anelamento para os iniciadores durante os ciclos da PCR.

Inicialmente, os ensaios de PCR para os locos TcAT13, TcTG14, TcAC13,

TcCAA9, TcCAG8, TcGCT11, TcAAC8 e TcCTTT7 foram realizados num volume

total de 15μL contendo 10mM Tris HCl pH 8.4, 50mM KCl, 1,5mM MgCl2 0,1% Triton

X-100 (Buffer IB, Phoneutria, Belo Horizonte, MG, Brasil), 1U Taq DNA Polimerase

(Phoneutria), 250μM de cada dNTP, 0,03 μM do iniciador forward, 0,3μM dos

iniciadores reverse e M13 (-40) para cada loco, 3µL de DNA 1ng/µL do clone CL

Brener e quantidade de H2O Mili-Q estéril para completar o volume de 15μL,

recobertos por óleo mineral.

Durante essa fase foi empregada a estratégia de PCR com temperaturas de

anelamento em gradiente para determinar a temperatura de anelamento que

resultasse numa melhor amplificação para cada par de iniciador. Os ciclos de

amplificação da PCR consistiram de uma desnaturação inicial de 94ºC por 3

minutos, outro passo de desnaturação a 94ºC por 30 segundos, temperaturas de

anelamento variando de 48 a 61ºC por 30 segundos e extensão a 72ºC por 30

segundos, num total de 35 ciclos. Após esta etapa uma alíquota de 5μL dos

produtos amplificadas pela PCR foi analisada em eletroforese empregando gel de

poliacrilamida 6% corado com nitrato de prata. Posteriormente, o gel foi visualizado

em fotodocumentador (Loccus Biotecnologia, Cotia, SP, Brasil), fotografado e salvo

como arquivo de imagem.

Os ensaios de PCR para os locos TcTTA15 e TcAAAT9 foram feitos utilizando

um conjunto de 12 tampões do Kit Opti-Prime (Stratagene, La Jolla, Califórnia) cuja

composição encontra-se descrita na Tabela 1. Cada reação foi feita num volume

total de 15μL, sendo que em cada tubo foi adicionado um dos tampões do Kit Opti-

Prime na concentração final de 1x, 1U Taq DNA Polimerase (Phoneutria), 250μM de

cada dNTP, 0,03 μM do iniciador forward, 0,3μM dos iniciadores reverse e M13 (-

40), 3μL de DNA 1ng/μL do clone CL Brener e H2O Mili-Q autoclavada para

completar o volume da reação, recobertos com óleo mineral.

33

Tabela 1 - Composição dos tampões 10x do Kit Opti-Prime utilizados na

padronização dos ensaios de PCR para os locos TcAAAT9 e TcTTA15.

Tampão

OptiPrime

Composição Ph

1 100mM de Tris HCl, 15 mM MgCl2, 250 mM KCl 8,3


3 100mM de Tris HCl, 35mM MgCl2, 250 mM KCl 8,3










34

Os ciclos de amplificação para estes dois últimos locos consistiram de uma

desnaturação inicial a 94°C por 3 minutos, outro passo de desnaturação por 30

segundos a 94ºC, um passo de anelamento a 53°C por 30 segundos e um passo de

extensão a 72ºC por 30 segundos, num total de 35 ciclos. A temperatura de

anelamento para os iniciadores correspondentes a estes dois locos foi baseada nos

valores de Tm dos respectivos iniciadores através das análises feitas no programa

Oligo Analyser.

Após a PCR, uma alíquota das amostras amplificadas empregando os

diferentes tampões de reação foi analisada em eletroforese empregando gel de

poliacrilamida 6% corado com nitrato de prata. O gel foi visualizado em

fotodocumentador (Loccus Biotecnologia), fotografado e salvo como arquivo de

imagem.

Depois da escolha do melhor tampão para a amplificação do fragmento

esperado para os locos de microssatélite TcAAAT9 e TcTTA15, foi realizada a

estratégia de PCR com temperaturas de anelamento em gradiente para determinar a

melhor temperatura de anelamento para os respectivos iniciadores.

Estes ensaios foram realizados num volume total de 15μL contendo 10mM

Tris-HCl pH 9,2, 3,5mM MgCl2, 75mM KCl (Tampão 12 do Kit Opti-Prime) para o

loco TcAAAT9 e 10mM Tris-HCl pH 8.3, 3.5mM MgCl2, 75mM KCl (Tampão 4 do Kit

Opti-Prime) para o loco TcTTA15, 1U Taq DNA Polimerase (Phoneutria), 250μM de

cada dNTP, 0,03μM do iniciador forward, 0,3μM dos iniciadores reverse e M13 (-40),

3μL de DNA 1ng/μL do clone CL Brener, recobertos com óleo mineral.

Os ciclos de amplificação da PCR consistiram de uma desnaturação inicial

94ºC por 3 minutos, outro passo de desnaturação de 94ºC por 30 segundos,

temperaturas de anelamento variando de 48 a 61ºC por 30 segundos e extensão a

72ºC por 1 minuto, totalizando 35 ciclos. Após esta etapa uma alíquota de 5μL dos

produtos amplificadas pela PCR foi analisada em eletroforese empregando gel de

poliacrilamida 6% corado com nitrato de prata. O gel foi visualizado em

fotodocumentador (Loccus Biotecnologia), fotografado e salvo como arquivo de

imagem.

35

IV.4) Avaliação do polimorfismo dos novos locos de microssatélites

Para avaliar o polimorfismo dos novos locos de microssatélites foram

realizados ensaios de PCR empregando DNA de 27 diferentes cepas ou clones do

T. cruzi pertencentes às diferentes linhagens filogenéticas (Tabela 2).

Para os ensaios de PCR dos locos TcAT13, TcTG14, TcAC13, TcCAA9,

TcCAG8, TcGCT11, TcAAC8 e TcCTTT7 foram realizadas reações num volume

total de 15μL contendo 10mM Tris HCl pH 8.4, 50mM KCl, 1,5mM MgCl2 0,1% Triton

X-100 (Buffer IB, Phoneutria), 1U Taq DNA Polimerase (Phoneutria), 250μM de cada

dNTP, 0,03 μM do iniciador forward, 0,3μM dos iniciadores reverse e do iniciador

M13 (-40) para cada loco, 3μL de DNA 1ng/µL de cada cepa ou clone do T. cruzi e

quantidade de H2O Mili-Q estéril suficiente para completar o volume de 15μL,

recobertos com óleo mineral. Já os ensaios de PCR para os locos TcTTA15 e

TcAAAT9 foram feitos com as mesmas condições descritas no item IV.3, porém

foram utilizados os tampões de número 4 e 12 do Kit OptiPrime, respectivamente.

Os ciclos de amplificação da PCR usados para todos os locos foram

baseados na estratégia Step Down. Assim, foram criados dois programas: o primeiro

chamado de Step Down 1 Int. para os locos de microssatélites TcCAA9, TcTTA15,

TcTG14, TcAC13, TcGCT11, TcAAC8, TcCTTT7, sendo composto por um total de

35 ciclos, consistindo de uma etapa de desnaturação inicial a 94ºC por 3 minutos,

outra etapa de desnaturação a 94ºC por 30 segundos, anelamento a 60º por 30

segundos, extensão a 72ºC por 1 minuto. A cada cinco ciclos a temperatura de

anelamento foi decrescida para 59, 58 e 57ºC. A esta última temperatura o número

de ciclos foi aumentado para 20, sendo seguido por uma extensão final dos

iniciadores a 72ºC por 9 minutos.

O segundo Step Down 2 para os locos TcAT13, TcCAG8 e TcAAAT9 sendo

composto por um total de 35 ciclos consistindo de uma etapa de desnaturação inicial

a 94º por 3 minutos, anelamento a 54ºC por 30 segundos, extensão a 72ºC por 1

minuto e desnaturação a 94ºC por 30 segundos. A cada cinco ciclos a temperatura

de anelamento foi decrescida para 53, 52 e 50ºC. A esta última temperatura o

número de ciclos foi aumentado para 20, sendo seguido por uma extensão final dos

iniciadores a 72ºC por 9 minutos.

36

Tabela 2 - Lista das cepas e clones do T. cruzi empregadas neste trabalho.

Cepas / clones Linhagem Filogenética

(ZINGALES et al., 2009)

Origem geográfica

Col1.7G2 Tc I MG/Brasil

Sílvio X10 cl1 Tc I PA/Brasil

G Tc I ND

D11 Tc I ND

RN06 Tc II RN/Brasil


Y Tc II SP/Brasil

YP1 Tc II SP/Brasil

YP2 Tc II SP/Brasil

OCB Tc II ND


JG Tc II MG/Brasil

GOCH Tc II GO/Brasil

Esmeraldo Tc II MG/Brasil

TGO Tc II ND

ABC Tc II MG/Brasil

RN09 Tc III RN/Brasil




231 Tc III MG/Brasil

222 Tc III MG/Brasil

Can III cl1 TcIV PA/Brasil

115 Tc V MG/Brasil

SO3 cl5 Tc V Bolívia

3253 Tc V ND

CL Brener Tc VI MG/Brasil

*ND: não descrito.

37

Os produtos de amplificação gerados para todos os locos foram visualizados

através de uma eletroforese em gel de poliacrilamida 6% corado com nitrato de

prata. O gel foi visualizado em fotodocumentador (Loccus Biotecnologia),

fotografado e salvo como arquivo de imagem.

IV.5) Eletroforese em gel de poliacrilamida

A preparação dos produtos amplificados para serem analisados pela

eletroforese vertical em gel de poliacrilamida 6% não desnaturante consistiu da

adição de 15μL de tampão de amostra 2x (0,025% de azul de bromofenol; 0,025%

de xilenocianol; 30% de glicerol) nos microtubos contendo os 15μL do produto de

amplificação obtido na PCR. Após uma rápida centrifugação das amostras, 10μL

desta diluição foram aplicados em cada canaleta do gel de poliacrilamida 6%.

Os géis foram produzidos a partir da formulação de acrilamida-bisacrilamida

29:1, TBE 5x (Tris-Base 5,4% (m/v), EDTA 2% (v/v) pH 8, Ácido Bórico 2,75% (m/v),

persulfato de amônio 10% e tetrametiletilenodiamino (TEMED) 1% (v/v)). A

eletroforese foi realizada com voltagem constante de 60V durante 4 horas. Após o

tempo necessário para a eletroforese se completar, o gel foi transferido para a

solução fixadora (etanol absoluto 10%, ácido acético 0,5%) durante 10 minutos sob

agitação. Em seguida, transferido para uma solução contendo 0,1% de nitrato de

prata (AgNO3) por 10 minutos. Posteriormente, foi utilizado água Mili-Q para a

lavagem do gel. Por último, o gel foi submetido à solução reveladora para redução

dos íons de prata com 3% (m/v) de hidróxido de sódio (NaOH) e 0,3% de

formaldeído a 37% até a visualização das bandas. O gel, então, foi encaminhado

para o fotodocumentador, analisado e salvo como arquivo de imagem.

Os tamanhos dos fragmentos amplificados para cada loco de microssatélite

foram avaliados através do emprego do marcador de peso molecular (PM) de 25pb

ou de 1kb (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).

IV.6) Determinação do tamanho dos alelos dos microssatélites

Esta etapa do trabalho foi realizada em parceria com o Laboratório de

Bioquímica e Biologia Molecular de Hematófagos, Departamento de Bioquímica da

38

Escola Paulista de Medicina – UNIFESP, sob a coordenação da Profa. Dra.

Aparecida Sadae Tanaka.

Inicialmente foi realizada uma centrifugação rápida das amostras por 30

segundos. Em seguida foi preparada uma mistura dos seguintes reagentes: 8,5μL de

Formamida deionizada (Hi-di Formamide – Applied Biosystems, Foster City, CA,

USA) e 0,5μL do padrão de peso molecular Gene Scan 500 LIZ dye Size Standard

(Applied Biosystems). Este padrão de peso molecular possui 16 fragmentos

marcados com fluoróforos dos seguintes tamanhos 35, 50, 75, 100, 139, 150, 160,

200, 250, 300, 340, 350, 400, 450, 490 e 500 nucleotídeos. Então, nove microlitros

da mistura foram distribuídos em cada poço da microplaca óptica e foi adicionado

1μL do produto da PCR contendo o iniciador M13 (-40) marcado com fluoresceína

na extremidade 5’. As placas foram novamente centrifugadas por 30 segundos.

Para a determinação do tamanho dos alelos dos microssatélites, as amostras

previamente preparadas foram submetidas a uma etapa de desnaturação no

termociclador (Applied Biosystems) sob as seguintes condições: 95ºC por 5 minutos

e 4ºC por 2 minutos. Em seguida as placas foram colocadas no equipamento

Genetic Analyzer 3130xl (Applied Biosystems) e a eletroforese capilar foi iniciada. A

corrida foi realizada a 60°C, durante 40 minutos para cada amostra.

Os alelos para os microssatélites foram detectados sob a forma de picos

através dos cromatogramas gerados pelo sequenciador e seus tamanhos foram

determinados em relação ao padrão de peso molecular Gene Scan 500 LIZ dye Size

Standard (Applied Biosystems) através do programa Peak Scanner™ Software v1.0

(Applied Biosystems).

IV.7) Avaliação dos parâmetros de genética de populações

Para se obter inferências sobre os parâmetros populacionais correspondentes

aos perfis dos microssatélites foi utilizado o programa GenePop versão 1.2

(RAYMOND, ROUSSET, 1995), disponível no endereço eletrônico

http://genepop.curtin.edu.au/. Por este programa foram calculadas as frequências de

alelos, genótipos, homozigose e heterozigose para cada loco de microssatélite. Além

disso, para investigar o nível de associação entre alelos de diferentes locos, foi

aplicado o teste de desequilíbrio de ligação para todas as possíveis comparações

http://genepop.curtin.edu.au/

39

par a par, também realizado pelo GenePop. O teste estatístico do Chi-quadrado foi

utilizado para se estabelecer o valor de p para essa análise.

Através do pacote de programas Arlequin 3.11 (EXCOFFIER et al., 2005)

foram realizadas análises que forneceram os valores para a heterozigosidade

observada (Hobs) e a heterozigosidade esperada (Hesp), referente a cada um dos

nove locos de microssatélites, com seu correspondente intervalo de confiança em

95%. O teste estatístico do Chi-quadrado foi utilizado para se estabelecer o valor de

p para essa análise. Estes cálculos de heterozigosidade foram realizados com o

objetivo de averiguar se os locos de microssatélites se encontram em equilíbrio de

Hardy-Weinberg.

IV.8) Avaliação dos parâmetros de filogenia

As análises de alguns parâmetros de filogenia foram feitas com base nos

dados obtidos com as amplificações dos locos de microssatélites em diferentes

cepas do T. cruzi consideradas como monoclonais.

O pacote de programas PHYLIP (Phylogeny Inference Package) versão 3.67

(FELSENSTEIN, 2007) foi utilizado para a construção de uma rede de Wagner sem

raiz. Inicialmente, cada um dos dois alelos de cada loco de microssatélite foi

considerado como um estado particular de caracter discreto com múltiplos estados

possíveis. Para fazer inferências filogenéticas, foi considerado que a evolução de

microssatélites segue o modelo de mutação passo a passo, ou seja, um alelo com

‘n’ repetições pode mudar para o alelo n + 1 ou n - 1 (SHRIVER et al., 1993;

VALDES et al., 1993).

Considerando ainda o alelo mais frequente como o estado ancestral, os alelos

variando apenas por uma unidade de repetição foram ordenados de forma adjacente

usando letras. Por exemplo, o alelo mais frequente (d) poderia dar origem aos alelos

adjacentes (c), com uma unidade repetitiva a menos ou (e) com uma unidade

repetitiva a mais, e assim por diante. Dessa forma, a caracterização genotípica para

cada cepa ou clone do parasito foi descrita considerando cada um dos dois alelos

presentes nos locos estudados.

Estes dados foram submetidos ao programa FACTOR, que transformou os

dados de caracteres discretos (com múltiplos estados) em caracteres com dois

estados, 0 ou 1. O arquivo obtido por meio desse programa foi inserido no programa

40

MIX para determinação dos agrupamentos entre as amostras (método de parcimônia

de Wagner). A estratégia do programa MIX para encontrar a árvore ou as árvores

mais parcimoniosas baseia-se em adição e rearranjos de cada OTU (Unidade

Taxonômica Operacional). À medida que cada OTU é adicionada, todas as

topologias possíveis são avaliadas, uma após a outra, e as mais prováveis são

selecionadas.

A construção da Rede de Wagner assume que transformações 0-1 ou 1-0 são

igualmente prováveis e que o estado ancestral é desconhecido. Os níveis de

significância de cada ramificação na rede de Wagner foram obtidos por

bootstrapping (1000 reiterações), utilizando o programa SEQBOOT do pacote de

dados do software PHYLIP. Finalmente, o programa Tree View, versão 1.6.6 (PAGE,

2007), foi utilizado para a visualização da rede de Wagner sem raiz.

IV.9) Aplicação dos novos locos de microssatélites em ensaios de Full Nested

PCR em amostras de tecido cardíaco de pacientes chagásicos crônicos

IV.9.1) Desenho dos iniciadores externos

Para avaliar a sensibilidade dos ensaios de PCR para cada loco de

microssatélite foi necessário o desenho de novos iniciadores, chamados de

iniciadores externos, para que a estratégia de Full Nested PCR pudesse ser

aplicada.

Assim, como citado anteriormente, utilizando o programa Oligo Analyser

versão 1.3 foram desenhados os iniciadores externos forward e reverse específicos

apenas para os locos de microssatélite considerados mais polimórficos. Após a

seleção dos iniciadores, estes foram enviados para a síntese química na empresa

IDT (Integrated DNA Technologies, Belo Horizonte).

IV.9.2) Padronização dos ensaios de PCR para os iniciadores internos e

externos

Foi necessário realizar uma nova padronização dos ensaios de PCR para

avaliar a sensibilidade através da técnica de Full Nested PCR. A padronização nesta

etapa consistiu em selecionar o tampão mais adequado para os ensaios que seriam

41

realizados com os iniciadores internos para os locos TcAC13, TcTG14, TcGCT11,

TcTTA15, TcAAAT9, TcCTTT7 utilizando o conjunto de 12 tampões do Kit Opti-

Prime (Stratagene) cuja composição encontra-se descrita na Tabela 1.

As reações foram feitas em um volume total de 15μL, sendo que em cada

tubo foi adicionado um dos tampões do Kit Opti-Prime na concentração final de 1x,

1U Taq DNA Polimerase (Phoneutria), 250μM de cada dNTP, 0,3μM de cada

iniciador forward e reverse, 3μL de DNA 1ng/μL do clone CL Brener e H2O Mili-Q

estéril para completar o volume da reação, recobertos com óleo mineral.

Os ciclos de amplificação da PCR foram baseados na estratégia Step Down e

foram utilizados os dois programas descritos no item IV.4, o Step Down 1 Int. para

os locos TcAC13, TcTG14, TcGCT11, TcTTA15 e TcCTTT7 e o Step Down 2 para o

loco TcAAAT9.

Para os ensaios utilizando os iniciadores externos específicos para os locos

TcAC13, TcTG14, TcGCT11 e TcCTTT7 foram realizadas reações num volume total

de 15μL contendo 10mM Tris HCl pH 8.4, 50mM KCl, 1,5mM MgCl2 0,1% Triton X-

100 (Buffer IB, Phoneutria), 1U Taq DNA Polimerase (Phoneutria), 250μM de cada

dNTP, 0,3 μM dos iniciadores forward e reverse para cada loco, 3μL de DNA 1ng/µL

do clone CL Brener e quantidade de H2O Mili-Q estéril suficiente para completar o

volume de 15μL, recobertos com óleo mineral. Já os ensaios de PCR com os

iniciadores externos para os locos TcTTA15 e TcAAAT9 foram feitos com as

mesmas condições descritas acima, porém foram utilizados os tampões de número 4

e 12 do Kit Opti-Prime, respectivamente.

Nos ciclos de amplificação para os iniciciadores externos foi utilizado o

programa Step Down 2 para os locos TcTG14, TcGCT11, TcTTA15 e TcAAAT9. Foi

necessário a criação de um novo programa Step Down 1 Ext. para os iniciadores

externos dos locos TcAC13 e TcCTTT7. Este programa foi composto por um total de

35 ciclos consistindo de uma etapa de desnaturação inicial a 94ºC por 3 minutos,

outra etapa de desnaturação a 94ºC por 30 segundos, anelamento a 60º por 30

segundos, extensão a 72ºC por 1 minuto. A cada cinco ciclos a temperatura de

anelamento foi decrescida para 57, 56, 55 e 54ºC. A esta última temperatura o

número de ciclos foi aumentado para 20, sendo seguido por uma extensão final dos

iniciadores a 72ºC por 9 minutos. A Tabela 3 mostra os tampões e o programa

utilizados para cada loco de microssatélite.

42

Após esta etapa uma alíquota de 5μL dos produtos amplificadas pela PCR foi

visualizada através de uma eletroforese em gel de poliacrilamida 6% corado com

nitrato de prata. O gel foi visualizado em fotodocumentador (Loccus Biotecnologia),

fotografado e salvo como arquivo de imagem.

V.9.3) Avaliação da sensibilidade dos ensaios de Full Nested PCR

Após a padronização de um ensaio de PCR que demonstrasse uma

amplificação satisfatória para todos os seis locos de microssatélites, foram

realizados testes de sensibilidade empregando diluições seriadas do DNA genômico

da cepa JG de 1ng/μL até o nível de 10fg/μL (o que corresponde a cerca de 1/20 do

conteúdo de DNA de uma única célula do T. cruzi) (Figura 3).

Para avaliar a sensibilidade dos ensaios de PCR foi empregada a estratégia

Full Nested PCR (Figura 4). Esta técnica é composta por duas etapas de

amplificação: na primeira etapa são utilizados na PCR os iniciadores externos e na

segunda etapa, é realizada uma PCR utilizando o produto oriundo da primeira

amplificação como DNA molde e iniciadores localizados mais internamente em

relação aos usados na primeira amplificação.

Para a primeira amplificação foram utilizados como DNA molde 1 μL de cada

diluição seriada de DNA, em um volume final de 15μL contendo, tampão selecionado

para cada loco como descrito na Tabela 3, 1U Taq DNA Polimerase (Phoneutria),

250μM de cada dNTP, 0,3μM de cada um dos iniciadores externos forward e reverse

específicos para cada loco de microssatélite e quantidade de H2O Mili-Q estéril para

completar o volume de 15μL recoberto por óleo mineral.

Os ciclos no termociclador para a primeira amplificação foram baseados no

programa Step Down 2 para os locos TcTG14, TcGCT11, TcTTA15 e TcAAAT9

descrito no item IV.4 e para os locos TcAC13 e TcCTTT7 foi utilizado o programa

Step Down 1 Ext., decrito no item IV.9.2.

Após a primeira amplificação, 10% do volume do produto de reação foram

submetidos a uma segunda amplificação utilizando o par de iniciadores internos.

Assim, os ensaios de PCR foram realizados em um volume final de 15μL por tubo,

contendo, 1,5μL do produto da primeira amplificação, o tampão selecionado para

cada par de iniciadores internos de cada loco (Tabela 3), 1U Taq DNA Polimerase

(Phoneutria), 250μM de cada dNTP, 0,3μM de cada um dos iniciadores internos

43

Figura 3 - Esquema representativo das diluições seriadas do DNA da cepa JG do T.

cruzi de 1ng/µL até o nível de 10 fg/µL. Partindo de uma solução inicial de DNA na

concentração de 1ng/µL foram feitas diluições sucessivas com o fator de diluição de

10 vezes até no nível de concentração 10 fg/µL, exceto a diluição de 1pg/µL para

200fg/µL, a qual foi feita com o fator de diluição 5 vezes.

44

Figura 4 - Desenho esquemático para a estratégia de Full Nested PCR. O DNA

molde inicial se refere ao DNA das diluições seriadas da cepa JG. A primeira

amplificação utiliza o DNA molde inicial e os iniciadores localizados externamente. A

segunda amplificação utiliza os iniciadores localizados internamente e o produto da

primeira amplificação como DNA molde, resultando num produto final de menor

tamanho comparado ao produto gerado na primeira amplificação. Fonte: Valadares,

2007.

45

Tabela 3 - Tampões e programas no termociclador utilizados para cada loco de microssatélite empregando a estratégia de Full

Nested PCR.

PCR com Iniciadores Externos PCR com Iniciadores Internos

Loco Tampão* Programa Tampão* Programa

TcAC13 Tampão IB Step Down 1 Ext. Tampão 9 Step Down 1 Int.

TcTG14 Tampão IB Step Down 2 Tampão 8 Step Down 1 Int.

TcTTA15 Tampão 4 Step Down 2 Tampão 10 Step Down 1 Int.

TcGCT11 Tampão IB Step Down 2 Tampão 8 Step Down 1 Int.

TcAAAT9 Tampão 12 Step Down 2 Tampão 12 Step Down 2

TcCTTT7 Tampão I Step Down 1 Ext. Tampão 8 Step Down 1 Int.

*O Tampão IB é comercializado pela empresa Phoneutria e os Tampões numerados são do Kit Opti-prime (Stratagene).

46

forward e reverse para cada loco de microssatélite e quantidade de H2O Mili-Q

estéril para completar o volume de 15μL, recobertos com óleo mineral.

Os ciclos no termociclador para a segunda amplificação foram baseados no

programa Step Down 1 Int. para os locos TcAC13, TcTG14, TcGCT11, TcTTA15 e

TcCTTT7 e Step Down 2 para o loco TcAAAT9 descritos no item IV.4. Após esta

etapa uma alíquota de 5μL dos produtos amplificadas pela PCR foi visualizada

através de uma eletroforese em gel de poliacrilamida 6% corado com nitrato de

prata. O gel foi visualizado em fotodocumentador (Loccus Biotecnologia),

fotografado e salvo como arquivo de imagem

IV.9.4) Ensaios de Full Nested PCR em amostras de tecido cardíaco de


Os novos locos de microssatélites foram utilizados em ensaios de Full Nested

PCR utilizando como DNA molde, o DNA extraído de amostras biológicas de

pacientes chagásicos crônicos. Esse DNA foi gentilmente cedido pela professora

Andréa Mara Macedo, Laboratório de Genética Bioquímica, da Universidade Federal

de Minas Gerais.

Foram utilizados fragmentos de tecido cardíaco de 11 pacientes apresentando

cardiopatia chagásica crônica. Os fragmentos de tecidos foram obtidos dos

pacientes quando os mesmos foram submetidos ao transplante cardíaco no Hospital

das Clínicas da Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG.

Imediatamente após a cirurgia, os fragmentos do músculo cardíaco foram

congelados em nitrogênio líquido e mantidos a -80ºC até que o DNA fosse extraído

(Tabela 4).

As amostras de tecidos foram processadas pelo protocolo de lise alcalina com

50mM NaOH, fervura por 10 min, seguido pela neutralização com 130mM Tris HCl

pH 7,0 (ANDRADE et al., 1999) ou alternativamente, o DNA de algumas amostras

dos tecidos humanos foi extraído usando o Kit QiAmp Tissue (Quiagen, CA, USA),

conforme instruções do fabricante.

Os ensaios de Full Nested PCR seguiram o protocolo descrito no item IV.9.3

utilizando como molde o DNA extraído de amostras de tecido cardíaco de pacientes

chagásicos crônicos. Além disso, foi utilizado uma amostra de DNA humano de

paciente não chagásico como controle negativo e como controle positivo foi utilizado

47

o DNA da cepa JG diluído para 1pg/µL. Este DNA humano de paciente não

chagásico foi gentilmente cedido pela professora Nayara Delgado André Bortoleto,

do Laboratório de Genética Molecular da Universidade Federal de São João del Rey

Campus Centro Oeste, Divinópolis, MG.

Os produtos amplificados pela PCR foram visualizados através de uma

eletroforese em gel de poliacrilamida 6% corado com nitrato de prata. O gel foi

visualizado em fotodocumentador (Loccus Biotecnologia), fotografado e salvo como

arquivo de imagem.

Posteriormente, foi feita a estimativa do tamanho dos produtos amplificados

nos ensaios de Full Nested PCR através do software LABIMAGE 1D (Loccus

Biotecnologia). Este software é utilizado para análise de imagens de géis de

eletroforese convencional. Esta análise permite fazer uma estimativa do tamanho

dos produtos amplificados, a qual é obtida através da comparação do produto

amplificado com o tamanho de uma amostra conhecida, no caso, o padrão de peso

molecular aplicado no mesmo gel de poliacrilamida.

48

Tabela 4 - Descrição das amostras isoladas de tecido cardíaco de pacientes

chagásicos crônicos.

Pacientes Data de coleta dos tecidos

A.C.P. 09/12/2013

C.A.S.M. 05/11/2014

F.M.C. 27/01/2014

J.C.S. 19/03/2014

J.F.S. 10/12/2014

J.L.J. 03/12/2014

M.A.S.S. 19/03/2014

M.J.M. 23/04/2014

M.L.F.M. 21/11/2013

T.B.O Fevereiro de 2014

R.V.S. 06/08/2016

V) RESULTADOS

50

V.1) Identificação de novos locos de microssatélites no genoma do T. cruzi

Durante a busca por novos locos de microssatélites foram selecionados locos

que apresentaram motivos de di, tri e tetranucleotídeos, de natureza perfeita e com

número de repetições variando de sete a quinze.

A análise das sequências dos cromossomos de 1 a 11 do clone CL Brener do

T. cruzi, exceto o 3, através do programa Tandem Repeats Finder possibilitou a

seleção de três locos de microssatélites com motivos de dinucleotídeos

(denominados de TcAC13, TcTG14, TcAT13), cinco locos compostos por motivos de

trinucleotídeos (TcCAA9, TcTTA15, TcCAG8, TcGCT11 e TcAAC8) e dois locos

compostos por repetições de tetranucleotídeos (TcAAAT9 e TcCTTT7), totalizando

dez novos locos de microssatélites. Os locos de microssatélites foram assim

denominados conforme o tipo e o número de repetições existentes.

A Tabela 5 e as Figuras 5 e 6 mostram as características destes novos locos

de microssatélites isolados do genoma do T. cruzi.

Tabela 5 - Localização cromossomal para os dez novos locos de microssatélites

selecionados neste trabalho.

Cromossomo Loco Nomenclatura Localização no

cromossomo (pb)

1 (CAA)9 TcCAA9 47018 – 47183

2 (AT)13 TcAT13 107682 – 107840

4 (TTA)15 TcTTA15 143905 – 144058

5 (CAG)8 TcCAG8 98973 – 99191

6 (AAAT)9 TcAAAT9 105054 – 105265

7 (TG)14 TcTG14 345845 – 346003

8 (AC)13 TcAC13 78402 – 78558

9 (GCT)11 TcGCT11 63111 – 63315

10 (AAC)8 TcAAC8 159126 – 159317

11 (CTTT)7 TcCTTT7 446943 – 447116

51

Figura 5 - Locos de microssatélites identificados no genoma do T. cruzi pelo

programa Tandem Repeats Finder. A figura mostra as sequências nucleotídicas para

os novos locos microssatélites TcAT13, TcAC13, TcTG14, TcCAA9, TcTTA15 (em

vermelho), bem como as suas regiões flanqueadoras delimitadas pelos sítios de

anelamento dos iniciadores específicos forward e reverse (em cinza).

52

Figura 6 - Locos de microssatélites identificados no genoma do T. cruzi pelo

programa Tandem Repeats Finder. A figura mostra as sequências nucleotídicas dos

novos locos de microssatélites TcCAG8, TcGCT11, TcAAC8, TcAAAT9, TcCTTT7

(em vermelho), bem como as suas regiões flanqueadoras delimitadas pelos sítios de

anelamento dos iniciadores específicos forward e reverse (em cinza).

53

V.2) Desenho dos iniciadores correspondentes às regiões flanqueadoras dos

locos de microssatélites

O software Oligo Analyzer 3.1 permitiu avaliar e adequar os parâmetros para

iniciadores funcionais às sequências desejadas dos iniciadores forward e reverse

específicos para cada loco de microssatélite. Dentre estes parâmetros, podem ser

destacados: tamanho dos iniciadores que variam de 18 a 24pb, porcentagem das

bases citosina e guanina entre 40 a 60%, Tm (Melting Temperature), possibilidade

de formação de dímeros com o próprio iniciador ou com o iniciador correspondente e

formação de grampos (hairpin) em temperaturas menores que 30°C (dados não

mostrados).

As sequências e algumas características dos iniciadores selecionados para

permitir a amplificação dos locos de microssatélites nos ensaios de PCR podem ser

vistas na Tabela 6. Nesta tabela também são mostrados os tamanhos dos amplicons

esperados para o clone CL Brener do T. cruzi para cada loco de microssatélite que

serviu para monitorar a especificidade das amplificações durante ensaios de PCR.

54

Tabela 6 - Sequências e características dos iniciadores internos utilizados neste trabalho.

Iniciadores

Internos

Sequências dos Iniciadores 5’ - 3’ Tm (Melting

Temperature) °C

% de GC Tamanho do

amplicon (pb)

TcCAA9-F GTTTTCCCAGTCACGACCGGTTGTGTTGGGCAAAC 55,2 55,6

166 TcCAA9-R CAACAGCATCTTCCCTGCC 56,5 57,9

TcAT13-F GTTTTCCCAGTCACGACCTTTTTACGTTGCTCCACACG 54,6 47,6

158 TcAT13-R GGTAGCATGCTGTGGAGAG 55,3 57,9

TcTTA15-F GTTTTCCCAGTCACGACTGAAGCGCTCAGTTTTAGACTC 54,9 45,5

154 TcTTA15-R ACATAAGGGGTCTAGTCTGGG 55,4 52,4

TcCAG8-F GTTTTCCCAGTCACGACCTTCACCCTGTTCCGCTAAAAC 56,2 50

212 TcCAG8-R CCACCGCCTTTTTGAGCAATA 56,1 47,6

TcAAAT9-F GTTTTCCCAGTCACGACTTTAAACAAATGCCCACGATCC 54,1 40,9

219 TcAAAT9-R CCCCCCTTTCAACAACAAAAAC 55,2 45,5

TcTG14-F GTTTTCCCAGTCACGACGGGATATGTGAGGGTTAGCAA 54,2 47,6

159 TcTG14-R GAGAAGGCAAAGCGCAT 53,4 52,9

TcAC13-F GTTTTCCCAGTCACGACTCTTTCTCATCTCCGAGTGGG 56 52,4

157 TcAC13-R CCGCCGCATTTCTCACAA 56,3 55,6

TcGCT11-F GTTTTCCCAGTCACGACCTCAGGCCAGTAATCATGTTG 53,5 47,6

204 TcGCT11-R TGATTCGGAAATGACGATGC 53,3 45

TcAAC8-F GTTTTCCCAGTCACGACCGATCTCAGAATTGAAGGCAG 53,4 47,6

191 TcAAC8-R CATGCATCGCAACTGTTG 52,4 50

TcCTTT7-F GTTTTCCCAGTCACGACGTCCTTTGGTAATGTAGAGGCG 55,4 50

174 TcCTTT7-R CATCGAATGCTTGAAACAACAGG 55 43,5

*Em negrito encontra-se a cauda referente à sequência do iniciador M13 (-40).

55

V.3) Padronização dos ensaios de PCR

O primeiro procedimento necessário para o desenvolvimento deste trabalho

foi adequar as condições do meio reacional através de padronizações dos ensaios

de PCR para os novos locos de microssatélites. Inicialmente, foi empregada a

estratégia de PCR com temperaturas de anelamento em gradiente com o objetivo de

identificar a melhor temperatura de anelamento para os iniciadores correspondentes

a cada loco de microssatélite.

Através da análise dos géis de poliacrilamida 6%, corados com nitrato de

prata, apresentando os produtos amplificados foi possível selecionar as

temperaturas de anelamento que resultaram nas melhores amplificações para oito

locos de microssatélites: os locos TcAC13, TcTG14, TcCAA9, TcGCT11, TcAAC8 e

TcCTTT7 apresentaram melhores amplificações em temperaturas de anelamento

mais elevadas (57°, 58°, 59° e 60°), enquanto os locos TcAT13 e TcCAG8

amplificaram em temperaturas mais baixas (50°, 52°, 53° e 54°) (Figuras 7, 8, 9 e

10). Dessa forma, selecionamos estas duas faixas de temperaturas de anelamento

para a criação de dois programas no termociclador baseados na estratégia Step

Down que permitissem a amplificação satisfatória para estes locos de

microssatélites.

Os locos TcAAAT9 e TcTTA15 não apresentaram amplificações satisfatórias

somente com a estratégia de PCR com temperaturas de anelamento em gradiente

empregando o Tampão IB (Phoneutria). Então foi necessário realizar a estratégia de

PCR variando as condições salinas e o pH reacional utilizando um conjunto de 12

tampões do Kit Opti-Prime (Stratagene). De acordo com a Figura 11, as

amplificações satisfatórias foram obtidas com o tampão 12 para o loco TcAAAT9 e

com o tampão 4 para o loco TcTTA15. Estes tampões foram selecionados para

prosseguir nos experimentos com os respectivos locos de microssatélites.

Após a escolha do tampão, foi realizada a estratégia de PCR com

temperaturas de anelamento em gradiente para para os locos TcTTA15 e TcAAAT9.

A Figura 12 mostra que o loco TcTTA15 obteve melhores amplificações nas

temperaturas mais elevadas (57 a 60ºC), enquanto que o loco TcAAAT9 amplificou

nas temperaturas mais baixas (50,7º a 55ºC).

56

A

B

Figura 7 - Géis de poliacrilamida 6% corados com nitrato de prata mostrando os

produtos amplificados para novos locos de microssatélites (A) TcAC13 e (B) TcTG14

por meio da estratégia de PCR com temperaturas de anelamento em gradiente. Os

ensaios de PCR para cada loco de microssatélite foram realizados utilizando a

estratégia de temperaturas de anelamento em gradiente variando de 48 a 61ºC que

estão indicadas na parte superior de cada figura. CN: controle negativo. PM: peso

molecular de 25 pb (A) e 1Kb (B) (Invitrogen).

57

A

B


produtos amplificados para novos locos de microssatélites (A) TcAT13 e (B)

TcCAG8 por meio da estratégia de PCR com temperaturas de anelamento em

gradiente. Os ensaios de PCR para cada loco de microssatélite foram realizados

utilizando a estratégia de temperaturas de anelamento em gradiente variando de 48

a 61ºC que estão indicadas na parte superior de cada figura. CN: controle negativo.

PM: peso molecular de 25 pb (Invitrogen).

58

A

B


produtos amplificados para novos locos de microssatélites (A) TcCAA9 e (B)

TcGCT11 por meio da estratégia de PCR com temperaturas de anelamento em




PM: peso molecular de 25 pb em (A) e 1Kb (B) (Invitrogen).

59

A

B


produtos amplificados para novos locos de microssatélites (A) TcAAC8 e (B)

TcCTTT7 por meio da estratégia de PCR com temperaturas de anelamento em




PM: peso molecular de 25 pb (Invitrogen).

60

A

B


produtos amplificados para os novos locos de microssatélites (A) TcTTA15 e (B)

TcAAAT9 empregando o Kit Opti-Prime (Stratagene). Os ensaios de PCR para cada

loco de microssatélite foram realizados utilizando um conjunto de 12 tampões do Kit

Opti-Prime descritos na parte superior de cada figura e empregando a temperatura

de 53°C para os locos. CN: controle negativo (sem DNA). PM: peso molecular de 25

pb (Invitrogen).

61

A

B


produtos amplificados para novos locos de microssatélites (A) TcTTA15 e (B)

TcAAAT9 por meio da estratégia de PCR com temperaturas de anelamento em




PM: peso molecular de 1Kb (A) e 25 pb (B) (Invitrogen).

62

V.4) Avaliação do polimorfismo dos locos de microssatélites

Uma vez que os ensaios de PCR foram padronizados, a próxima etapa deste

trabalho foi a avaliação do polimorfismo de tamanho para os dez locos de

microssatélites. Para cada marcador molecular foram realizadas amplificações por

PCR utilizando inicialmente DNA de 12 diferentes cepas ou clones do T. cruzi

pertencentes às seis diferentes linhagens filogenéticas descritas para este parasito.

Os produtos amplificados foram visualizados em gel de poliacrilamida 6%

corado com nitrato prata e o polimorfismo dos locos de microssatélites foi observado

mediante a detecção de amplicons de diferentes tamanhos entre as cepas do T.

cruzi (Figuras 13, 14, 15, 16 e 17).

O loco TcCAA9 foi excluído das análises de polimorfismo de tamanho devido

ao fato deste loco apresentar uma baixa eficência de amplificação entre as

diferentes cepas do T. cruzi. Então, estas análises foram realizadas para os nove

locos de microssatélites restantes.

Após a confirmação do polimorfismo para estes nove locos de microssatélites,

essa análise foi expandida empregando mais 15 cepas diferentes do T. cruzi,

totalizando 27 cepas do parasito para a etapa de determinação exata do tamanho

dos alelos dos microssatélites em sequenciador automático de DNA.

63

A

B


produtos amplificados para os locos de microssatélites (A) TcAT13 e (B) TcTG14

entre as diferentes cepas do T. cruzi. O polimorfismo é evidenciado pela

visualização dos tamanhos diferentes dos produtos amplificados. Na parte superior

de cada gel são mostradas as diferentes cepas do T. cruzi utilizadas no

experimento. CN: controle negativo. PM: peso molecular de 25 pb (Invitrogen).

64

A

B


produtos amplificados para os locos de microssatélites (A) TcAC13 e (B) TcCAA9





65

A

B


produtos amplificados para os locos de microssatélites (A) TcTTA15 e (B) TcCAG8





66

A

B


produtos amplificados para os locos de microssatélites (A) TcGCT11 e (B) TcAAC8





67

A

B


produtos amplificados para os locos de microssatélites (A) TcAAAT9 e (B) TcCTTT7





68

V.5) Determinação do tamanho dos alelos dos microssatélites

Após a verificação da presença do produto de tamanho esperado para os

locos de microssatélites na etapa de avaliação do polimorfismo, os tamanhos dos

alelos para cada loco de microssatélite foram calculados para as 27 cepas do T.

cruzi analisadas empregando o sequenciador de DNA Genetic Analyzer 3130xl

(Applied Biosystems). Nesta análise, foram retirados 17pb correspondentes à cauda

do iniciador M13 (-40) para o cálculo correto do tamanho dos alelos, os quais são

mostrados na Tabela 7.

As figuras 18 (A), (B) e (C) apresentam os cromatogramas obtidos a partir do

sequenciador automático de DNA mostrando o tamanho dos produtos amplificados

em pares de base. Em A observa-se o perfil do clone CL Brener para o loco

TcAAAT9 que apresentou um único pico, indicando alelos de mesmo tamanho o que

representa uma população monoclonal homozigota; em B o perfil da cepa SO3 cl5

para o loco TcAAC8 que apresentou dois picos de tamanhos diferentes, o que é

indicativo de uma cepa monoclonal heterozigota e em C o perfil da cepa RN06 para

o loco TcGCT11 que apresentou três picos de tamanhos diferentes, o que é

indicativo de uma cepa multiclonal. Os cromatogramas obtidos a partir do

sequenciador mostram o tamanho dos produtos amplificados em pares de base

incluindo os 17pb referentes ao iniciador M13 (-40).

Os dados obtidos na determinação do tamanho dos alelos para os

microssatélites possibilitaram a diferenciação das cepas e clones utilizados neste

trabalho. Porém, os locos de microssatélites não conseguiram diferenciar as cepas

pertencentes à linhagem Tc III e os clones YP1 e YP2. Entretanto, estes locos

apresentaram um nível de polimorfismo adequado entre as outras linhagens do T.

cruzi possibilitando a diferenciação de 16 cepas diferentes com apenas 4 locos

(TcTTA15, TcTG14, TcAC13 e TcGCT11), através de uma análise manual

observando os diferentes perfis de microssatélites entre as cepas.

69

Tabela 7 - Tamanho dos alelos em pares de bases obtidos para os locos de microssatélites entre diferentes cepas de T. cruzi.

Cepas Linhagem TcAT13 TcAC13 TcTG14 TcAAC8 TcCAG8 TcGCT11 TcTTA15 TcAAAT9 TcCTTT7

Col1.7G2 Tc I 158/158 157/157 147/147 166/181 206/206 178/178 131/131 249/249 178/178 Sílvio X10 cl1 Tc I 158/158 149/149 151/151 172/181 206/206 178/178 128/128 197/209 178/182

G Tc I 158/158 147/149 143/143 172/181 206/206 181/181 128/128 249/249 178/178 D11 Tc I 156/160 149/149 n.a. 172/181 206/209 178/178 140/155 249/249 174/178

RN06 Tc II 156/158 153/161 147/161 181/184/190 212/215/233 190/193/202 128/146/149 n.a. 162/174 RN23 Tc II 156/156 155/155 145/161 181/184/190 212/215/233 190/193/202 131/149/152 205/205 162/174

Y Tc II 152/158 151/151 149/149 169/181 212/212 187/190 152/158 197/197 182/182 YP1 Tc II n.a. n.a. 149/149 172/181 212/212 187/190 149/155 n.a. 182/182 YP2 Tc II n.a. n.a. 149/149 n.a. 212/212 n.a. 149/155 201/201 182/182 OCB Tc II 156/156 151/153 145/153 181/190 212/212 187/187 149/149 205/213 178/178 RN08 Tc II 156/156 151/161 147/161 181/184/190 212/215/233 190/193/202 134/152/155 n.a. 162/174

JG Tc II 156/158 157/157 145/155 172/181 209/230 187/187 137/155 197/205 174/178 GOCH Tc II 156/160 151/151 n.a. 181/184 206/209 190/202 155/155 197/217 166/174

Esmeraldo Tc II n.a. n.a. 145/153 181/181 n.a. 178/193 n.a. 197/205 174/174 TGO Tc II 156/158 153/153 139/147 181/190 209/221 187/193 146/164 197/205 174/174 ABC Tc II n.a. 151/155 141/153 181/181 n.a. 187/190 152/155 n.a 178/182 RN19 Tc III 152/158 151/157 129/129 181/181 206/206 178/178 116/116 249/249 170/170 RN09 Tc III 152/158 149/153 129/129 n.a. 209/221 178/178 116/116 n.a. 170/170 RN10 Tc III 152/158 149/149 129/129 172/181 206/206 178/178 116/116 249/249 170/170 RN11 Tc III 152/158 151/157 129/129 172/181 206/206 178/178 116/116 249/249 170/170 231 Tc III 158/158 147/149 129/129 172/181 206/206 178/178 119/122 249/249 166/170 222 Tc III 158/158 147/149 129/129 172/181 206/206 178/178 119/122 249/249 166/170

Can III cl1 TcIV 156/156 147/153 129/129 172/181 203/203 178/178 119/122 249/249 170/186 115 Tc V 158/158 157/157 141/151 181/190 206/206 178/178 122/122 217/217 166/178

SO3Cl5 Tc V 158/158 147/147 129/129 181/190 n.a. 202/202 119/140 217/217 178/182 3253 Tc V 158/158 147/151 129/147 172/181 206/212 178/202 119/149 193/201 166/178

Cl Brener Tc VI 158/158 157/157 129/163 181/190 206/212 178/202 122/155 217/217 166/178

*n.a: não amplificou. Em negrito estão mostradas as cepas consideradas como multiclonais.

70

A

B

C

Figura 18 - Cromatogramas obtidos a partir do sequenciador automático de DNA

Genetic Analyser 3130xl mostrando o tamanho dos produtos amplificados para três

locos de microssatélites. Em (A) CL Brener (TcAAAT9); (B) SO3 cl5 (TcAAC8) e (C)

RN06 (TcGCT11). O padrão de peso molecular utilizado está representado em

amarelo, e a amostra em azul. Os números abaixo dos picos se referem ao tamanho

dos alelos em pares de base incluindo os 17pb referentes ao iniciador M13 (-40).

71

V.6) Avaliação dos parâmetros de genética de populações

Através das análises realizadas pelos programas GenePOP versão 1.2, e

Arlequin versão 3.5.2 considerando os dados correspondentes aos locos de

microssatélites para as 24 cepas monoclonais do T. cruzi, foram calculados a

frequência alélica, genotípica, porcentagem de homozigose e heterozigose, o teste

de desequilíbrio de ligação e as heterozigosidades observadas e esperadas para

cada loco.

A Tabela 8 apresenta a frequência alélica para os novos locos de

microssatélites. Foi observado um total de 66 alelos, com um número médio de 7,3

alelos por loco, variando de 4 para o TcACT13 a 13 para o TcTTA15, os tamanhos

dos alelos variaram de 116 a 249 pb. O loco TcTTA15 foi considerado o loco mais

polimórfico, com 13 alelos, sendo que os alelos mais frequentes foram o de 116 e o

de 155pb com 17,40% cada.

Em seguida tem-se os locos TcGT14 (com 11 alelos), TcAAAT9 (com 8

alelos) e TcAC13, TcAAC8, TcCAG8, TcGCT11 e TcCTTT7 (todos com 6 alelos).

Entretanto, o loco TcAT13 foi o loco menos polimórfico, pois apresentou apenas 4

alelos, sendo o alelo mais comum o de 158pb com frequência de 62,5%.

A frequência genotípica é mostrada na Tabela 9 e de acordo com as análises,

o loco que apresentou maior número de genótipos foi o TcTTA15 com 16 genótipos,

e dentre esses o mais comum foi o genótipo homozigoto 116/116pb apresentando

uma frequência de 17,4%. Em seguida, tem-se os locos TcGT14 e TcAC13 (12),

TcCTTT7 (10) TcAAAT9 (9), TcGCT11 e TcCAG8 (7) e TcAAC8 (6). Já o loco

TcAT13 apresentou o menor número de genótipos, com apenas 5 genótipos, sendo

o mais comum o genótipo homozigoto 158/158pb com uma frequência de 45%.

A Tabela 10 apresenta os resultados para o teste de desequilíbrio de ligação

que mostram valores indicativos de um desequilíbrio de ligação para a maioria das

combinações possíveis par a par para os nove locos analisados, uma vez que os

valores de p foram menores que 0,05. Apenas as combinações do loco TcAAC8 com

os locos TcCTTT7, TcTTA15, TcGCT11, TcCAG8, TcTG14 e TcAC13 e

combinações do loco TcAC13 com os locos TcGCT11 e TcTG14 estão em equilíbrio

de ligação, visto que os valores de p encontrados foram maiores que 0,05, portanto,

não sendo significativos para o teste de desequilíbrio de ligação.

72

Tabela 8 - Frequência alélica em porcentagem para os novos locos de microssatélites.

Alelos TcAT13 TcAC13 TcTG14 TcAAC8 TcCAG8 Alelos TcGCT11 TcTTA15 TcAAAT9 TcCTTT7

152 12,50 178 54,35 29,17% 156 20,00 181 4,35 158 62,50 187 17,40 160 5,00 190 8,70 147 16,60 9,10 193 4,35 2,38 149 23,80 13,64 202 10,85 151 21,40 6,82 116 17,40 153 11,90 6,82 119 10,88 155 2,40 2,27 122 13,01 157 23,80 128 8,70 129 40,91 131 4,35 139 2,27 137 2,17 141 4,55 140 4,35 143 4,55 146 2,17 145 6,82 149 10,88 163 2,27 152 4,35 166 2,27 155 17,40 169 2,27 158 2,17 172 25,00 164 2,17 181 56,82 197 16,67 184 2,27 201 7,14 190 11,37 205 9,52 203 4,76 209 2,38 206 52,40 213 2,38 209 11,90 217 16,67 212 23,80 249 42,86 221 4,76 166 12,50 230 2,3 170 22,90

174 14,60 182 18.75 186 2,08

Numéro de alelos

4 6 11 6 6 6 13 8 6

*Em negrito são mostrados os alelos com maior frequência referentes a cada loco de microssatélite analisado.

73

Tabela 9 - Frequência genotípica em porcentagem para os novos locos de microssatélites.

Genótipo TcAT13 TcAC13 TcTG14 Genótipo TcAAC8 TcCAG8 TcGCT11 TcTTA15 Genótipo TcTTA15 TcAAAT9 TcCTTT7

152/158 25,0 166/181 4,5 131/131 4,35 156/156 10,0 169/181 4,5 137/155 4,35 156/158 10,0 172/181 50,0 140/155 4,35 156/160 10,0 181/181 13,7 146/164 4,35 158/158 45,0 181/184 4,5 149/149 4,35 147/147 4,75 181/190 22,8 149/155 8,7 147/149 14,35 203/203 4,8 152/155 4,35 147/151 4,75 206/206 42,9 152/158 4,35 147/153 4,75 206/209 9,5 155/155 4,35 149/149 14,3 206/212 9,5 193/201 4,76 149/153 4,75 209/221 9,5 197/197 4,76 151/151 9,55 209/230 4,8 197/205 14,3 151/153 4,75 212/212 19,0 197/209 4,76 151/155 4,75 178/178 47,8 197/217 4,76 151/157 9,55 178/193 4,35 201/201 4,76 153/153 4,75 178/202 8,7 205/213 4,76 157/157 19,0 181/181 4,35 217/217 14,29 129/129 36,38 187/187 8,7 249/249 42,85 129/147 4,54 187/190 13,0 166/170 8,33 129/163 4,54 187/193 4,35 166/174 4,15 139/147 4,54 190/202 4,35 166/178 12,5 141/151 4,54 202/202 4,35 170/170 16,7 141/153 4,54 116/116 17,4 170/186 4,16 143/143 4,54 119/122 13,0 174/174 8,33 145/153 9,1 119/140 4,35 174/178 8,33 145/155 4,54 119/149 4,35 178/178 12,5 147/147 4,54 122/122 4,35 178/182 12,5 149/149 13,66 122/155 4,35 182/182 12,5 151/151 4,54 128/128 8,7

Número de genótipos

5 12 12 6 7 9 7 9 (16) 9 10

*Em negrito são mostrados os genótipos com maior frequência referentes a cada loco de microssatélite analisado.

74

Tabela 10 - Teste de desequilíbrio de ligação entre os nove locos de microssatélites (valores de P).

TcCTTT7 TcAAAT9 TcTTA15 TcGCT11 TcCAG8 TcAAC8 TcTG14 TcAC13

TcAAAT9 0,012

TcTTA15 0,000 0,007

TcGCT11 0,009 0,001 0,000

TcCAG8 0,000 0,024 0,007 0,000

TcAAC8 0,721 0,006 0,062 0,368 0,840

TcTG14 0,000 0,002 0,000 0,000 0,004 0,346

TcAC13 0,032 0,057 0,040 0,088 0,031 0,082 0,449

75

As heterozigosidades observadas (Hobs) e esperadas (Hesp) calculadas para

cada loco são mostradas na Tabela 11. Tais resultados mostraram que houve um

déficit de heterozigosidade observada em relação à esperada, indicando um grande

desvio do equilíbrio de Hardy-Weinberg. Apenas o loco TcAAC8 mostrou estar em

equilíbrio de Hardy-Weinberg, pois apresentou heterozigosidade observada maior

que a esperada.

Já a Tabela 12 apresenta as frequências de homozigose e heterozigose para

os nove locos de microssatélites. De acordo com os dados dessa tabela a maioria

dos locos (TcAT13, TcAC13, TcTG14, TcCAG8, TcGCT11 e TcAAAT9) apresenta

um número maior de homozigotos, o loco TcCTTT7 apresenta 50% de homozigotos

e 50% de heterozigotos e apenas dois locos, o TcAAC8 e o TcTTA15, apresentam

maior quantidade de heterozigotos.

V.7) Avaliação dos parâmetros de filogenia

Para realizar as relações filogenéticas entre as 24 cepas monoclonais

analisadas neste trabalho foi construída uma rede de Wagner sem raiz baseada nos

perfis para os locos de microssatélites. A Figura 19 representa a topologia de uma

das árvores filogenéticas mais parcimoniosas encontradas pelo programa PHYLIP.

Como esperado, os genótipos obtidos com a análise dos perfis dos nove locos de

microssatélites para as 24 cepas monoclonais do T. cruzi permitiram separar os

isolados deste parastio. Esta árvore indicou claramente o agrupamento das cepas

pertencentes às linhagens filogenéticas T. cruzi I, T. cruzi II, T. cruzi III. Entretanto,

não houve uma separação evidente ao analisar a dispersão das cepas pertencentes

às linhagens filogenéticas T. cruzi IV, T. cruzi V e T. cruzi VI.

76

Tabela 11 - Valores de heterozigosidade esperada (Hesp) e observada (Hobs) obtidos

para os novos locos de microssatélites.

Loco Heterozigosidade

Esperada (Hesp)

Heterozigosidade

Observada (Hobs)

TcAT13 0,542 0,500

TcAC13 0,817 0,523

TcTG14 0,804 0,363

TcAAC8 0,613 0,863

TcCAG8 0,665 0,333

TcGCT11 0,665 0,347

TcTTA15 0,903 0,565

TcAAAT9 0,763 0,333

TcCTTT7 0,806 0,500

Tabela 12 - Frequência de homozigose e heterozigose em porcentagem para os

novos locos de microssatélites.

Loco Homozigose Heterozigose

TcAT13 52,63 47,37

TcAC13 57,14 42,86

TcTG14 63,64 36,36

TcAAC8 13,64 86,36

TcCAG8 66,66 33,34

TcGCT11 65,22 34,78

TcTTA15 43,47 56,53

TcAAAT9 66,67 33,33

TcCTTT7 50 50

77

Figura 19 - Rede de Wagner sem raiz proposta para as 24 cepas monoclonais do T. cruzi baseada nos perfis de nove locos de

microssatélites. Rede de Wagner sem raiz construída pelo método de máxima parcimônia através do programa PHYLIP, a partir

dos dados da análise de nove locos de microssatélites (TcAT13, TcAC13, TcTG14, TcAAC8, TcCAG8, TcGCT11, TcTTA15,

TcAAAT9 e TcCTTT7) em 24 cepas monoclonais do T. cruzi.

78

V.8) Aplicação dos novos locos de microssatélites em ensaios de Full Nested

PCR em amostras de tecido cardíaco de pacientes chagásicos crônicos.

V.8.1) Desenho dos iniciadores externos

Os iniciadores externos foram desenhados apenas para os locos

considerados como mais polimórficos. As sequências dos iniciadores externos

selecionadas para permitir a amplificação dos locos de microssatélites nos ensaios

empregando a estratégia de Full Nested PCR, realizados neste trabalho podem ser

vistas na Tabela 13. Nesta tabela também são mostrados os tamanhos dos

amplicons gerados pelos ensaios de PCR com os iniciadores externos para cada

loco de microssatélite.

V.8.2) Padronização dos ensaios de PCR para os iniciadores internos e

externos

Inicialmente foi necessário realizar uma nova padronização dos ensaios de

PCR para avaliar a sensibilidade através da técnica de Full Nested PCR com os

iniciadores internos, uma vez que na padronização utilizada nos estudos de

polimorfismos foi empregado o M13(-40).

As Figuras 20, 21 e 22 mostram os produtos amplificados com os iniciadores

internos para cada loco com cada tampão utilizado do Kit Opti-Prime. Com estes

resultados foi possível selecionar o melhor tampão para cada par de iniciador:

tampão 8 para os locos TcTG14, TcGCT11, TcCTTT7, os tampões 9, 10 e 12 para

os locos TcAC13, TcTTA15 e TcAAAT9, respectivamente.

Os ensaios de PCR empregando os iniciadores externos foram realizados

utilizando as condições descritas no item IV.9.2 e os resultados mostraram

amplicações satisfatórias para todos os pares de iniciadores externos demonstrando

a efetividade dos ensaios de PCR (dados não mostrados).

79

Tabela 13 - Sequências dos iniciadores externos utilizados neste trabalho.

Loco Sequência dos Iniciadores 5’-3’ Tm °C (Melting Temperature) % de GC Tamanho do amplicom (pb)

TcAC13-F TAGATGTGCGCCCAAAACCGT 59,7 52,4 449

TcAC13-R ATCTGCTGCAGG TCGGAGA 58,5 57,9

TcTG14-F GGAGTCCGCAGATCAACGAA 57,2 55,0 346

TcTG14-R GAACTTCACGTGCGTTCTCCT 57,5 52,4

TcGCT11-F CCAACTGTAACACATCTCCGC 56,0 52,4 433

TcGCT11-R CATTCCGTGCTCTTATAGGGC 55,5 52,4

TcTTA15-F GCCTCAGGATCTTAATCGCG 55,6 55,0 357

TcTTA15-R TGGGGAAGGGAGTTCATTC 54,2 52,6

TcAAAT9-F CCTTGTCGTGTATTGCTTTCT 57,2 50,0 425

TcAAAT9-R CCCGAAACGAATGTAGAGGCC 58,0 57,1

TcCTTT7-F GCATGGCTCGAACTGGGAC 58,8 63,2 399

TcCTTT7-R ACGCGCTCTCTATGACTGTGC 59,5 57,1

80

A

B


produtos amplificados para os iniciadores internos dos locos de microssatélites (A)

TcAC13 e (B) TcTG14 empregando o Kit Opti-Prime (Stratagene). Os ensaios de

PCR para cada loco de microssatélite foram realizados utilizando um conjunto de 12

tampões do Kit Opti-Prime descritos na parte superior de cada figura e os ciclos de

amplificações baseados na estratégia StepDown. CN: controle negativo (sem DNA e

sem tampão). PM: peso molecular de 1Kb (Invitrogen).

81

A

B



TcGCT11 e (B) TcTTA15 empregando o Kit Opti-Prime (Stratagene). Os ensaios de





82

A

B



TcAAAT9 e (B) TcCTTT7 empregando o Kit Opti-Prime (Stratagene). Os ensaios de





83

V.8.3) Avaliação da sensibilidade dos ensaios de Full Nested PCR

Após a obtenção de um ensaio de PCR em que ocorresse uma amplificação

satisfatória dos fragmentos esperados para cada um dos locos de microssatélite,

utilizando os inciadores internos e externos, foram realizados testes de sensibilidade

empregando diluições seriadas do DNA genômico da cepa JG desde a concentração

de 1ng/μL até 10 fg/μL através da estratégia de Full Nested PCR.

As Figuras 23, 24, 25, 26, 27 e 28 apresentam a sensibilidade dos novos

locos de microssatélites. Os resultados obtidos com o uso desta estratégia

permitiram detectar o DNA de T. cruzi até ao nível de 200 fentogramas, quantidade

que corresponde ao DNA de uma única célula do parasito. Os locos TcTTA15,

TcAAAT9, TcTG14 e TcGCT11 permitiram a amplificação satisfatória até esse nível.

Além disso, os locos TcAC13 e TcCTTT7 analisados neste trabalho apresentaram

uma maior eficiência de amplificação pela estratégia de Full Nested PCR,

amplificando até ao nível de 100 fentogramas.

84

Figura 23 - Gel de poliacrilamida 6% corado com nitrato de prata mostrando a sensibilidade do loco de microssatélite TcAC13,

através do protocolo de Full Nested PCR, empregando diluições seriadas de DNA da cepa JG do T. cruzi. Nesta figura pode ser

observada amplificação dos fragmentos de 449pb e 157pb referente aos iniciadores externos e internos, respectivamente. O Full

Nested corresponde amplificação com os iniciadores internos usando como DNA molde no ensaio de PCR o produto referente a

primeira amplificação. Na parte superior do gel são mostradas as diluições seriadas utilizadas no experimento CN 1: controle

negativo da primeira amplificação. CN 2: controle negativo Full Nested. PM: peso molecular de 1kb (Invitrogen).

85

Figura 24 - Gel de poliacrilamida 6% corado com nitrato de prata mostrando a sensibilidade do loco de microssatélite TcTG14,






86

Figura 25 - Gel de poliacrilamida 6% corado com nitrato de prata mostrando a sensibilidade do loco de microssatélite TcGCT11,






87

Figura 26 - Gel de poliacrilamida 6% corado com nitrato de prata mostrando a sensibilidade do loco de microssatélite TcTTA15,






88

Figura 27 - Gel de poliacrilamida 6% corado com nitrato de prata mostrando a sensibilidade do loco de microssatélite TcAAAT9,






89

Figura 28 - Gel de poliacrilamida 6% corado com nitrato de prata mostrando a sensibilidade do loco de microssatélite TcCTTT7,






90

V.8.4) Ensaios de Full Nested PCR em amostras de tecido cardíaco de

pacientes chagásicos crônicos

Os novos locos de microssatélites foram utilizados em ensaios de Full Nested

PCR utilizando como DNA molde, o DNA extraído de amostras biológicas de


As Figuras 29, 30 e 31 mostram os resultados da utilização dos novos locos

de microssatélites em ensaios de Full Nested PCR, empregando DNA extraído de

tecido cardíaco de pacientes chagásicos crônicos. De acordo com estas figuras foi

possível observar que todos os locos de microssatélites obtiveram amplificações

satisfatórias, através da estratégia de Full Nested PCR, empregando amostras de

tecido cardíaco de pacientes chagásicos crônicos que apresentam um baixo

conteúdo de DNA do parasito.

A estimativa do tamanho dos produtos amplificados nos ensaios de Full

Nested PCR realizados com DNA de tecido cardíaco de pacientes chagásicos foi

realizada através do software LABIMAGE 1D, e o tamanho aproximado dos produtos

amplificados estão mostrados na Tabela 14.

A análise, através deste software, permite fazer apenas uma estimativa do

tamanho dos produtos amplificados. Logo, não foi possível determinar a quantidade

de alelos, se os mesmos são homo ou heterozigotos e se são mono ou policlonais.

Mesmo assim, os dados obtidos nessa análise possibilitaram a comparação do

produto amplificado com os dados obtidos na avaliação do polimorfismo. Tal

comparação mostrou que grande parte dos tamanhos obtidos foi semelhante aos

tamanhos dos alelos determinados no sequenciador de DNA para as cepas

pertencentes à linhagem filogenética de T. cruzi II.

Na Tabela 14 também são mostrados os percentuais de eficiência da

amplificação para cada loco, a qual foi calculada a partir da quantidade de amostras

amplificadas para cada loco em relação ao número total de amostras utilizadas. De

acordo com esses dados foi possível observar que o loco mais sensível foi o

TcGCT11 com uma eficiência de 81,8%.

91

A

B

Figura 29 - Géis de poliacrilamida 6% corados com nitrato de prata mostrando a

utilização dos locos de microssatélites (A) TcAC13 e (B) TcTG14 através do

protocolo de Full Nested PCR empregando como molde o DNA extraído de tecido

cardíaco de pacientes chagásicos crônicos. Na parte superior estão indicados os

pacientes de onde as amostras de tecido cardíaco foram isoladas. PM: Peso

Molecular de 1Kb (Invitrogen). Controle Positivo: DNA da cepa JG na concentração

de 1pg/µL. DNA humano de paciente não chagásico na concentração de 5ng/ µL

para controle negativo. CN: controles negativos (sem DNA) para a primeira e

segunda amplificações.

92

A

B


utilização dos locos de microssatélites (A) TcGCT11 e (B) TcTTA15 através do





de 1pg/µL. DNA humano de paciente não chagásico na concentração de 5ng/µL



93

A

B


utilização dos locos de microssatélites (A) TcAAAT9 e (B) TcCTTT7 através do





de 1pg/µL. DNA humano de paciente não chagásico na concentração de 5ng/µL



94

Tabela 14 - Tamanho estimado dos produtos amplificados pela estratégia Full

Nested PCR em tecido cardíaco de pacientes chagásicos.

Pacientes TcAC13 TcTG14 TcGCT11 TcTTA15 TcAAAT9 TcCTTT7

A.C.P. 153 153 191 154 225 186

C.A.S.M. 161 157 191 n.a n.a 186

F.M.C. 151 152 203 n.a 216 n.a

J.C.S. 151 157 191 145 203 182

J.F.S. 145 157 191 145 219 180

J.L.J. 151 n.a 203 137 242 n.a

M.A.S.S. 147 155 200 158 228 182

M.J.M. n.a n.a n.a n.a 226 n.a

M.L.F.M. 157 157 203 154 197 161

T.B.O. n.a n.a n.a n.a n.a 165

R.V.S. n.a n.a 201 155 n.a n.a

Eficiência de

amplificação (%)

72,7 63,6 81,8 63,6 72,2 63,6

*n.a: não amplificou.

VI) DISCUSSÃO

96

O T. cruzi é uma espécie que apresenta grande heterogeneidade tanto

genotípica quanto fenotípica, devido ao seu modo de reprodução

predominantemente clonal e, consequentemente, levando as populações a

evoluírem geograficamente isoladas, acumulando mutações e características

próprias. Devido a essa grande variabilidade genética intraespecífica, a estrutura

populacional do T. cruzi não é completamente compreendida. Entretanto, diversos

estudos biológicos e moleculares revelaram uma grande variabilidade genética entre

as cepas do T. cruzi, as quais foram divididas em seis DTUs chamadas de T. cruzi I

a T. cruzi VI (ZINGALES et al., 2009). Segundo Zingales et al. (2012) as diferentes

DTUs estão associadas com diferentes ciclos biológicos de transmissão e parecem

ter distribuição geográfica variada e apresentam manifestações clínicas distintas.

Mesmo com o número elevado de estudos sobre a variabilidade genética do

parasito, a correlação entre as formas clínicas da doença de Chagas e os tipos de

parasitos encontrados ainda não está clara, e os resultados atuais dessa correlação

são bastante controversos. Certamente, os fatores associados aos pacientes estão

envolvidos, mas está cada vez mais evidente que os apectos genéticos do parasito

são fundamentais neste processo (VAGO et al., 2000; LAGES-SILVA et al., 2001;

LAGES-SILVA et al., 2006; D´AVILA et al., 2009).

Apesar de existir um número elevado de marcadores moleculares disponíveis

para a análise da diversidade genética exibida pelo T.cruzi, ainda não foi possível

estabelecer uma correlação segura entre a variabilidade genética desse parasito e

as características clínicas da doença de Chagas (ANDRADE et al., 1999; BAPTISTA

et al., 2006; D’ÁVILA et al., 2006). Dessa forma, quanto maior o número de

marcadores e maior a especificidade dos mesmos, melhor será a investigação

dessas interações entre os indivíduos da espécie T. cruzi, bem como, da relação

entre a genética do parasito e as manifestações clínicas da doença que eles

provocam.

A utilização de microssatélites em estudos de variabilidade genética em T.

cruzi tem demonstrado que estes marcadores são ideais para a identificação e

caracterização de isolados, assim como, para análises filogenéticas. Apesar de já

existir atualmente um número razoável de locos de microssatélites isolados do

genoma do T. cruzi, ainda se torna necessário o isolamento de novos locos, uma

vez que os locos já existentes ou não possuem um nível de polimorfismo adequado

97

ou apresentam uma baixa sensibilidade nos ensaios de PCR (PIMENTA, 2002;

VALADARES et al., 2008).

Diante disso, com o isolamento de novos locos de microssatélites em outros

cromossomos do genoma do T. cruzi com um nível de polimorfismo adequado,

possivelmente, o número de locos de microssatélites empregados para a

diferenciação das cepas do T. cruzi pode reduzir de 4 a 5 para 3 a 4 locos,

diminuindo os custos financeiros dos experimentos e o tempo de análise requerido

para a determinação do tamanho dos alelos em análises populacionais do T. cruzi.

Ademais, a identificação de locos de microssatelites com uma alta sensibilidade nos

ensaios de PCR pode contribuir para o diagnóstico molecular da doença de Chagas.

Com o sequenciamento do genoma do clone CL Brener (EL-SAYED, 2005) foi

possível realizar a montagem de 41 pares cromossômicos em T. cruzi

(WEATHERLY, BOEHLKE, TARLETON, 2009). Assim, baseados nesta organização,

os cromossomos de 1 a 11, exceto o 3, foram selecionados para a identificação dos

locos de microssatélites por serem os menores, devido a uma limitação do programa

Tandem Repeats Finder no que se refere ao tamanho das sequências inseridas no

programa para a busca de locos de microssatélites. Assim, o uso deste programa e

das sequências cromossomais depositadas no banco de dados TryTrip permitiram a

identificação dos novos locos de microssatélites de uma forma mais rápida e menos

trabalhosa, ao contrário do trabalho realizado por Oliveira et al. (1998) que utilizou

técnicas de laboratório que compreendiam várias etapas dispendiosas para a

identificação dos locos de microssatélites.

Os novos locos de microssatélites descritos neste trabalho foram identificados

nos cromossomos de 1 a 11, exceto o 3, e são pertencentes ao haplótipo Esmeraldo

like do clone CL Brener. Isso foi possível devido ao sequenciamento completo do

genoma do clone CL Brener, um clone hídrido do T. cruzi, o qual representa o

organismo modelo para diversos estudos biológicos e genômicos para o parasito. O

háplotipo Esmeraldo like do clone CL Brener, o qual é um representante da linhagem

T. cruzi VI, possui altos níveis de sintenia gênica com haplótipo do clone Esmeraldo

(T. cruzi II) (EL SAYED, 2005). De acordo com Freitas et al. (2006), cepas e clones

da linhagem de T. cruzi VI são consideradas híbridas, apresentando características

das linhagens puras T. cruzi II e T. cruzi III. Entretanto, existem outros trabalhos na

literatura que relatam que cepas hídridas, como CL Brener, são originárias de

eventos de fusão entre as cepas da linhagem T. cruzi I e II (ELIAS et al., 2005

98

WESTENBERGER et al., 2006). Diante disso, o haplótipo Esmeraldo like do clone

CL Brener representa um modelo ideal para ser usado em estudos de diversidade

genética do parasito, pois representa um haplótipo de uma linhagem sabidamente

reconhecida em detrimento do haplótipo non Esmeraldo like, o qual ainda

permanece sob discussão no que diz respeito a sua origem ancestral: se é

proveniente de uma cepa T. cruzi I ou III.

Desta forma, o presente trabalho, através do programa Tandem Repeats

Finder (TRF), identificou dez novos locos de microssatélites em diferentes

cromossomos no genoma do T. cruzi: TcAT13, TcAC13, TcTG14, TcAAC8, TcCAA9,

TcCAG8, TcGCT11, TcTTA15, TcAAAT9 e TcCTTT7. Todos estes locos apresentam

uma natureza perfeita, pois microssatélites perfeitos são considerados mais

polimórficos que os imperfeitos. Assim, nestas análises foram descartados os locos

de microssatélites imperfeitos e compostos.

Além disso, foram isolados apenas os microssatélites compostos por motivos

di, tri e tetranucleotídeos, uma vez que estes são os motivos de microssatélites

empregados com maior frequência em estudos de diversidade genética dos

organismos e são considerados mais polimórficos. De acordo com a literatura, a

variação no número de unidades repetitivas tem sido descrita como sendo

inversamente proporcional ao tamanho da unidade repetitiva (SCHÖTTERER e

TAUTZ, 1992; CHAKRABORTY et al., 1997). Isto é, as repetições de mono, di, tri e

tetranucleotídeos são mais polimórficas que as repetições de penta e

hexanucleotídeos. Portanto, foram desprezados os microssatélites de 1, 5 e 6 pares

de bases encontrados pelo programa TRF.

Uma grande vantagem de utilizar sequências de DNA depositadas em bancos

de dados é que essas sequências são provenientes de bibliotecas que utilizam

vetores como, por exemplo, os cosmídeos, capazes de abrigar insertos de grande

tamanho. Isso possibilita que as extremidades flanqueadoras dos locos de

microssatélites presentes nestas sequências sejam bastante amplas (VALADARES,

2007). Dessa forma, os novos locos de microssatélites apresentam regiões

flanqueadoras longas permitindo amplas oportunidades no desenho de iniciadores

internos e externos e suas aplicações em ensaios de PCR mais sensíveis.

Os 10 locos de microssatélites, apresentados neste trabalho, foram

selecionados também de acordo com as características de suas regiões

flanqueadoras. Foram utilizados critérios para selecionar uma região flanqueadora

99

de boa qualidade, como por exemplo, a inexistência de sequências repetitivas

próximas aos microssatélites e a existência de regiões com quantidades em torno de

50% de nucleotídeos guanina e citosina para permitir o desenho de iniciadores com

temperaturas de anelamento que permitissem maior especificidade nos ensaios de

PCR. Nas análises, foi comum encontrar nas proximidades dos locos de

microssatélites várias sequências repetitivas, principalmente de mononucleotídeos,

inviabilizando a escolha de vários dos locos identificados pelo programa TRF.

Os iniciadores utilizados neste trabalho foram desenhados seguindo alguns

critérios específicos estabelecidos pela Florida State University (2004): a) o tamanho

dos iniciadores deve estar entre 18 e 24 bases para garantir a especificidade e

reduzir o risco de anelamentos inespecíficos; b) composição de bases: a quantidade

de bases citosina (C) e guanina (G) entre 40 e 60% para assegurar temperaturas de

anelamento adequadas aos ensaios de PCR; c) evitar trincas de bases repetidas; d)

evitar a formação de estruturas secundárias como a ocorrência de dímeros; e)

construir um arranjo de bases que permita uma temperatura de anelamento entre 52

e 65°C, sendo crucial que as temperaturas de anelamento dos dois iniciadores

sejam bem próximas (FLORIDA STATE UNIVERSITY, 2004). Obedecendo a esses

critérios, os quais também foram usados para a seleção dos locos, foram

desenhados com sucesso os iniciadores forward e reverse internos e externos para

cada loco de microssatélite isolado neste trabalho.

Após a identificação dos novos locos de microssatélites e o desenho dos

iniciadores internos, foi iniciada a etapa de padronização dos ensaios de PCR. Nesta

fase do trabalho foi utilizada a estratégia de PCR com temperaturas de anelamento

em gradiente para detectar a melhor temperatura de anelamento para os iniciadores

correspondentes a cada loco de microssatélite. Além de selecionar a melhor

temperatura de anelamento para os locos de microssatélites, a padronização

possibilitou a seleção das condições ideais para permitir níveis satisfatórios de

amplificação específica para cada loco.

Durante a padronização dos ensaios de PCR foi utilizada a técnica de adição

de uma cauda fluorescente proposta por Oetting et al. (1995), a qual consiste na

marcação dos fragmentos de PCR com fluoróforos presentes no iniciador universal,

o M13(-40), cuja sequencia corresponde à cauda. A amplificação é realizada com

três iniciadores: o forward contendo na extremidade 5´a sequência do M13, o

iniciador reverse e o iniciador M13 marcado com fluorescência. A reação de PCR

100

ocorre em duas etapas. Na primeira, os fragmentos são amplificados de forma usual,

a partir dos iniciadores forward e reverse. Estes fragmentos contêm a cauda M13 na

extremidade 5´. Na sequência, são incluídos ciclos adicionais de amplificação, com o

objetivo de inserir o iniciador M13 marcado com fluorescência nos fragmentos

amplificados pelos ciclos anteriores. Por isso, nos ensaios de PCR a concentração

dos iniciadores forward foi 10 vezes menor que a concentração do M13(-40) e do

reverse, atuando apenas nos primeiros ciclos da PCR. A utilização desta técnica

possibilita a visualização dos fragmentos amplificados tanto em géis de

poliacrilamida quanto em eletroforese capilar automatizada. Sendo assim, a

utilização desta técnica facilita e reduz bastante os custos, uma vez que a cauda

M13 com a marcação com o fluoróforo pode ser adicionada a vários iniciadores ao

invés de marcar cada iniciador (SCHUELKE, 2000).

Na época em que foram realizadas as padronizações iniciais para os locos de

microssatélites tinha-se disponível apenas o Tampão IB (Phoneutria) (10mM Tris-

HCL pH 8,4, 50mM KCL, 1,5mM MgCl2, 0,1% Triton X-100). Por isso, partiu-se direto

para a estratégia de PCR com temperatura de anelamento em gradiente para os

ensaios de padronização. Os locos TcAT13, TcAC13, TcTG14, TcAAC8, TcCAA9,

TcCAG8, TcGCT11, TcCTTT7 obtiveram amplificações satisfatórias utilizando este

tampão.

Porém, os locos TcTTA15 e TcAAAT9 não obtiveram resultados positivos com

as condições testadas inicialmente. Então, foi necessário realizar a estratégia de

PCR variando as condições salinas e o pH reacional utilizando um conjunto de 12

tampões do Kit Opti-Prime (Stratagene). Os tampões deste kit apresentam diferentes

concentrações de MgCl2, de KCl e diferentes pHs. De acordo com a literatura, o

MgCl2 funciona como um cofator para a enzima DNA Polimerase, mas também pode

afetar as temperaturas de desnaturação das fitas de DNA e o anelamento dos

iniciadores. Altas concentrações desse reagente podem ser responsáveis pelo

aparecimento de produtos inespecíficos formados pelo aumento excessivo da

atividade enzimática e pela formação de dímeros dos iniciadores (OLIVEIRA, 2007).

As concentrações de KCl também são importantes para as reações de PCR, pois

este sal neutraliza a carga negativa do DNA estabilizando a estrutura do DNA em fita

dupla. Além disso, o pH ideal para a atividade da Taq DNA Polimerase é 7,4, porém,

com o aumento da temperatura pelo termociclador o pH do tampão diminui

levemente (OLIVEIRA, 2007). Logo valores de pH superiores a 8,0 devem ser

101

utilizados para obter um pH ideal durante a reação. A partir dessas considerações, a

utilização do Kit Opti-Prime se mostrou como uma opção ideal para selecionar o

tampão mais adequado para os ensaios de PCR.

A partir dos dados da padronização também foi possível selecionar as

melhores temperaturas de anelamento e criar no termociclador programas baseados

na estratégia Step Down. Tal estratégia promove especificidade e rendimento

máximo nos ensaios de PCR, quando comparada às técnicas de PCR

convencionais. Por isso, ela foi escolhida para ser utilizada na avaliação do

polimorfismo e nos demais ensaios de PCR deste trabalho. Além disso, há a

praticidade da estratégia, uma vez que vários locos podem ser amplificados

utilizando apenas um programa, não sendo necessário um programa para cada loco

de microssatélite.

Após a padronização dos ensaios de PCR para todos os locos, foram

iniciados os experimentos para a avaliação do polimorfismo dos novos locos de

microssatélites. O polimorfismo dos microssatélites pode ser observado através de

uma simples inspeção visual dos géis de poliacrilamida 6% corados com nitrato de

prata, onde podem ser visualizados produtos amplificados de diferentes tamanhos

entre as cepas do T. cruzi. A partir das análises qualitativas dos géis, foi possível

observar que seis locos (TcAC13, TcTG14, TcGCT11, TcTTA15, TcAAAT9 e

TcCTTT7) mostraram uma diferença mais evidente dos tamanhos dos produtos

amplificados para cada cepa utilizada, demonstrando que estes locos seriam mais

polimórficos em detrimento dos outros.

Este polimorfismo demonstrado pelos microssatélites é proveniente da

variação no número de unidades repetitivas de um alelo para outro (LITT e LUTY,

1989; TAUTZ,1989; WEBER e MAY, 1989). Isso pode ocorrer devido a um

deslizamento (slippage) entre as fitas de DNA, quando a DNA Polimerase passa por

regiões de microssatélites, acarretando num acréscimo ou diminuição das unidades

repetitivas durante o processo de replicação. Um outro mecanismo que explica o

polimorfismo é a recombinação, através de um evento chamado crossing over

desigual que ocorre dentro das repetições dos microssatélites entre cromátides no

mesmo cromossomo. Este evento pode provocar a deleção de unidades repetitivas

em uma fita de DNA e inserção em outra, gerando um alto nível de polimorfismo (LI

et al., 2004). Entretanto, o mecanismo mais aceito para a variabilidade no tamanho

102

dos microssatélites está relacionado ao slippage da DNA Polimerase durante a

replicação do DNA.

No presente trabalho, com os dados obtidos das análises de genética das

populações foi possível determinar a frequência alélica que também caracteriza o

polimorfismo dos microssatélites. Dessa forma, o loco TcTTA15 foi considerado o

loco mais polimórfico, uma vez que apresentou maior número de alelos, e o loco

TcAT13 foi o loco menos polimórfico, pois apresentou apenas 4 alelos. Tal resultado

contradiz a literatura (SCHÖTTERER e TAUTZ, 1992; CHAKRABORTY et al., 1997),

dado que as repetições dinucleotídeos seriam mais polimórficas que as repetições

com tri e tetranucleotídeos.

Os microssatélites são considerados poderosos marcadores genéticos devido

ao seu alto grau de polimorfismo de tamanho. Essa característica levou vários

pesquisadores a utilizarem os microssatélites para analisar a diversidade do T. cruzi,

disseminando o uso destes marcadores (D’ÁVILA et al., 2009; CÂMARA et al.,

2010). Uma análise genética por tipagem com microssatélites de 135 amostras do

parasito mostrou que as populações de Tc I derivadas de animais silvestres das

Américas do Norte, Central e do Sul, apresentavam expressiva diversidade, além de

apresentar uma estruturação espacial em nível continental (LLEWELLYN et al.,

2009). Além disso, Ramírez et al. (2013) utilizando análises de microssatélites

demonstrou a discriminação das DTUs do ciclo silvestre Tc I e Tc IV nos surtos de

trasmissão oral da doença de Chagas.

Durante a fase de avaliação do polimorfismo, o loco com motivo de

trinucleotídeo TcCAA9 não mostrou amplificação satisfatória em todas as cepas

pertencentes às seis linhagens filogenéticas do T. cruzi. Então, foram feitas

modificações nas condições dos ensaios de PCR tais como, utilização de outros

tampões, outras enzimas Taq DNA Polimerases, além de outras condições dos

ciclos de amplificação. Mesmo após várias tentativas, não foi possível a obtenção de

um resultado satisfatório com o loco em questão, sendo assim, o loco TcCAA9 foi

excluído das demais análises deste trabalho.

Uma explicação para a baixa eficiência de amplificação para o loco TcCAA9

pode estar relacionada com mutações nos sítios de anelamento na extremidade 3´

dos iniciadores nas diferentes cepas analisadas. Além disso, os iniciadores foram

desenhados com base na sequência obtida a partir do clone CL Brener, então existe

a possibilidade de que em outros clones e cepas do parasito a região de ligação dos

103

iniciadores apresente mutações que podem impedir o correto anelamento e a

amplificação desses locos de microssatélites (D’ÁVILLA, 2008). Sendo assim, seria

necessário o desenho de novos iniciadores específicos para que este loco seja

utilizado em análises de variabilidade genética.

Após a confirmação do polimorfismo para os novos locos de microssatélites,

essa análise foi expandida empregando mais 15 cepas diferentes do T. cruzi,

totalizando 27 cepas do parasito. Essa análise, por sua vez, foi necessária para a

determinação mais refinada do grau de polimorfismo e do número exato de alelos

para cada loco de microssatélite que foi realizada em sequenciador automático de

DNA.

Para a determinação precisa do tamanho de cada alelo amplificado para os

locos de microssatélites é necessário realizar uma eletroforese desnaturante, na

qual os fragmentos migram somente na forma de fita simples, eliminando os

heteroduplexes. Estas estruturas são formadas quando se tem a renaturação de

fitas de DNA, originadas de alelos heterozigotos com diferentes unidades repetitivas,

ocasionando a formação de alças dentro dos fragmentos amplificados que diferem

em sua migração na eletroforese em gel de poliacrilamida. A maioria dos locos de

microssatélites (TcTG14, TcAC13, TcCAA9, TcTTA15, TcCAG8, TcGCT11,

TcAAAT9 e TcCTTT7) apresentaram a formação de heteroduplexes, o que reforça a

necessidade da eletroforese desnaturante.

A determinação do tamanho dos alelos é extremamente importante para as

análises de filogenia, de genética de populações e para a caracterização dos locos

de microssatélites. Esta etapa foi realizada através de eletroforese capilar em

sequenciador automático de DNA e os dados foram obtidos sob a forma de

cromatogramas e foram analisados pelo programa Peak Scanner™ Software v1.0.

Para o cálculo correto do tamanho dos alelos dos microssatélites foi necessário

retirar os 17pb correspondentes à cauda do iniciador M13 (-40). Sendo assim, a

determinação exata do tamanho dos alelos foi realizada e seus dados foram

mostrados na Tabela 7.

Conforme esperado, foram encontrados diferentes perfis para as cepas

empregadas neste trabalho, uma vez que o T. cruzi é um organismo

predominantemente diplóide. De acordo com as análises, foram detectados para as

cepas do T. cruzi perfis de um pico, representando uma cepa monoclonal

homozigota (presença de uma única população do parasito apresentando os alelos

104

do mesmo tamanho), perfil de dois picos que é indicativo de uma cepa monoclonal

heterozigota (presença de uma única população do parasito apresentando os alelos

de tamanhos diferentes) e o perfil de três ou mais picos indicando uma cepa

multiclonal (presença de mais de uma população apresentando diferentes alelos)

(Figura 18). Estes resultados corroboram com os dados encontrados por Oliveira et

al. (1998) e Pimenta (2002), que demostraram que o T. cruzi é um organismo

diplóide e que as cepas analisadas apresentaram perfis semelhantes aos obtidos no

presente trabalho. Outro estudo realizado por Câmara et al. (2010) também

identificou a presença de perfis de um, dois, três ou mais picos em isolados do T.

cruzi provenientes de triatomíneos e de pacientes infectados no semiárido do Rio

Grande do Norte.

Entretanto, com o nível de polimorfismo apresentado pelos locos de

microssatélites isolados neste trabalho, não foi possível diferenciar as cepas da

linhagem Tc III provenientes de uma mesma região como, por exemplo, as cepas

RN09, RN10, RN11 e RN19 que são do estado Rio Grande do Norte e as cepas 222

e 231 que são de Minas Gerais. As cepas Tc III das duas regiões analisadas

apresentaram uma conservação dos alelos para todos os locos de microssatélites,

demonstrando que são cepas muito homogêneas geneticamente. Em um estudo

anterior, Câmara et al. (2010) utilizaram seis locos de microssatélites polimórficos

para a análise das cepas RN09, RN10, RN11 e RN19 e demonstraram uma

tendência de repetição de alelos para a maioria dos locos analisados entre estas

cepas, demonstrando também que são geneticamente muito semelhantes. Este fato,

provavelmente, pode estar relacionado com alguma particularidade do genoma

destas cepas ainda não elucidada. Porém, quando se compara os perfis de

microssatélites das cepas Tc III das duas regiões analisadas foi possível diferenciá-

las através dos locos TcAC13, TcAT13, TcTTA15 e TcCTTT7. Isso mostrou que as

cepas Tc III, apesar de serem muito homogêneas dentro de uma mesma região,

podem apresentar diferenças quando são provenientes de regiões diferentes. Além

disso, os locos isolados neste trabalho também não possibilitaram a diferenciação

dos clones YP1 e YP2. Este dado corrobora os achados de Oliveira et al. (1998) no

qual os clones YP1 e YP2 também apresentaram o mesmo perfil. Estes clones são

derivados da cepa Y e, consequentemente, suas características são muito

parecidas, ou exatamente as mesmas, o que pode ter impossibilitado a

diferenciação das mesmas com os locos de microssatélites.

105

Apesar disso, foi possível diferenciar as 16 cepas monoclonais restantes

pertencentes às outras diferentes linhagens filogenéticas do T. cruzi com apenas 4

locos de microssatélites, sendo eles o TcTTA15, TcTG14, TcAC13 e o TcGCT11,

mostrando que estes locos apresentaram um nível de polimorfismo adequado para a

diferenciação das demais cepas do parasito empregadas no estudo.

A partir da obtenção dos alelos para os microssatélites para as diferentes

cepas, foi iniciada a avaliação dos parâmetros de genética de populações. Para

estas análises foram utilizados cálculos matemáticos para as frequências alélicas e

genotípicas, índice de homozigose e heterozigose, a heterozigosidade observada

(Hobs) e esperada (Hesp) e desequilíbrio de ligação entre os locos e testes de

equilíbrio de Hardy-Weinberg.

Na análise das frequências alélicas, foi observado um total de 66 alelos,

variando de 116 a 249pb. A frequência alélica corresponde ao número ou proporção

dos diferentes alelos em cada loco, e pode ser utilizada como parâmetro para a

caracterização do nível de polimorfismo para cada marcador. Dessa forma, o loco

TcTTA15 foi considerado o mais polimórfico (13 alelos), enquanto que o TcAT13 foi

o menos polimórfico (4 alelos).

A análise da frequência genotípica também pode ser utilizada para

caracterizar a variabilidade genética dos locos analisados. Neste trabalho, o loco

que apresentou o maior número de genótipos foi o TcTTA15 com 16 genótipos e o

loco TcAT13 apresentou o menor número de genótipos, com apenas 5 genótipos,

corroborando os resultados obtidos com as frequências alélicas. O número total de

genótipos exibido por um determinado loco também se encontra diretamente

relacionado ao seu grau de polimorfismo genético entre os indivíduos analisados.

A heterozigosidade de um marcador é a probabilidade de um indivíduo ser

heterozigoto no respectivo loco, ou seja, apresentar diferentes cópias alélicas, sendo

dependente do número de alelos e da frequência destes alelos na população. O

desvio observado entre a heterozigosidade esperada (He) e heterozigosidade

observada (Ho), pode ser um indicativo da dinâmica populacional, além de indicar

um desvio do equilíbrio de Hardy-Weinberg. De acordo com o princípio de Hardy-

Weinberg, as frequências alélicas e genotípicas permanecem constantes de uma

geração para a seguinte, e quando isso acontece, é dito que uma população está

em equilíbrio. Isso é observado em uma população com reprodução ao acaso, em

106

que não há seleção natural, mutação, migração ou deriva genética (NICHOLAS,

2011)

O presente trabalho através da Tabela 11 mostra que houve um déficit de

heterozigosidade observada em relação à esperada para a maioria dos locos

(valores de p menores que 0,05), indicando um grande desvio do equilíbrio de

Hardy-Weinberg e apenas o loco TcAAC8 mostrou estar em equilíbrio de Hardy-

Weinberg (valores de p maiores que 0,05).

Outro parâmetro avaliado foi o desequilíbrio de ligação, que é a associação

não aleatória de alelos em dois ou mais locos. Os resultados obtidos neste trabalho

mostrados na Tabela 10 sugerem valores indicativos de desequilíbrio de ligação

para a maioria das combinações possíveis par a par para os novos locos analisados,

indicando que os alelos para os locos de microssatélites estão ligados. Porém, as

combinações com o loco TcAAC8 e algumas combinações com o loco TcAC13

apresentam valores de p maiores que 0,05 confirmando a hipótese de que estes

locos na população estudada estariam em equilíbrio de ligação.

Assim, os novos locos de microssatélites isolados neste trabalho

apresentaram um nível de polimorfismo adequado entre as diferentes cepas de T.

cruzi, a maioria deles apresentou grandes desvios do equilíbrio de Hardy-Weinberg

e desequilíbrio de ligação, e tais resultados sugerem que os genótipos são

transmitidos de geração para geração em blocos haplotípicos. Dessa forma os

resultados deste trabalho corroboram com a hipótese de que o T. cruzi apresenta

evolução predominantemente clonal e que o modo de reprodução sexual neste

parasito é raro (TIBAYRENC e AYALA, 2002).

Um estudo realizado por Baptista et al. (2014) baseado em marcadores

nucleares (microssatélites) e mitocondriais (COII) empregando parâmetros de

genética populacional comparou dois grupos de isolados de T. cruzi II: um

proveniente de diferentes regiões da América Latina e outros obtidos exclusivamente

de pacientes do Estado de Minas Gerais. Neste trabalho, os autores mostraram

através da análise de alguns parâmetros de genética de populações, que as

distâncias geográficas e/ou barreiras físicas podem influenciar na redução de

oportunidades para a reprodução sexual entre as cepas do T. cruzi, logo, afetando

as taxas de recombinação entre elas, uma vez que os isolados de Minas Gerais

mostraram estar em equilíbrio de ligação de Hardy-Weinberg e níveis de

recombinação entre elas foram substancialmente elevados. Sendo assim, ao se

107

comparar cepas do T. cruzi isoladas de diferentes regiões geográficas uma

reprodução predominante clonal pode ser indicada erroneamente.

Os resultados obtidos neste trabalho principalmente para o loco TcAAC8

demonstraram que populações do T. cruzi provenientes de diferentes regiões podem

estar em equilíbrio de Hardy-Weinberg e de ligação sugerindo a possibilidade de

ocorrência de eventos de recombinação entre estas populações.

A frequência de homozigose e heterozigose pode ser utilizada para verificar

se a população estudada estaria relacionada ao efeito Wahlund. De acordo com

esse fenômeno, a mistura de indivíduos provenientes de duas populações com

frequências alélicas diferentes causa um déficit de heterozigotos. O efeito Wahlund

pode ser observado quando os indivíduos de uma população são provenientes de

subpopulações geneticamente segregadas, além disso, os desequilíbrios dos

marcadores genéticos contribuíram para uma subestimativa da ocorrência de sexo e

recombinação na população estudada (WAHLUND,1928). No presente trabalho, seis

dos nove locos apresentaram um déficit de heterozigotos (TcAT13, TcAC13,

TcTG14, TcCAG8, TcGCT11 e TcAAAT9), o loco TcCTTT7 apresentou número igual

de homo e heterozigotos e apenas dois locos (TcAAC8 e TcTTA15) mostraram

maior número de heterozigotos. Dessa forma, de uma maneira geral, os locos que

apresentaram um déficit de heterozigose, os quais foram a maioria, são consistentes

com uma subestruturação da população conduzida pelo efeito Wahlund, onde são

encontrados níveis excessivos de homozigose.

Os dados correspondentes aos novos locos de microssatélites também foram

utilizados na avaliação de parâmetros de filogenia. As cepas multiclonais foram

excluídas dessa análise, uma vez que elas são constituídas por uma mistura de

populações do parasito que são geneticamente distintas. Tal fato inviabiliza a

construção da árvore filogenética, pois não é possível separar os alelos

pertencentes aos diferentes clones. Logo, o modelo de mutação passo a passo,

assumido nas análises, não pode ser aplicado para o cálculo da distância genética

dessas amostras.

Os perfis de microssatélites obtidos para as 24 cepas monoclonais do T. cruzi

foram utilizadas em análises filogenéticas através da construção de uma rede de

Wagner sem raiz. A topologia da árvore filogenética, representada na Figura 19,

indicou claramente o agrupamento das cepas pertencentes às linhagens

filogenéticas T. cruzi I, II e, III, evidenciando que os microssatélites são marcadores

108

que apresentam grande utilidade em abordagens filogenéticas. Porém, não houve

uma separação evidente ao analisar a dispersão das cepas pertencentes às

linhagens filogenéticas T. cruzi V e T. cruzi VI. Isso pode estar relacionado com a

origem evolucionária destas cepas, visto que as cepas de T. cruzi V e T. cruzi VI são

consideradas como cepas hibrídas. De acordo com Freitas et al. (2006), essas

cepas seriam formadas por eventos de hibridação entre cepas de linhagens T. cruzi

II e T. cruzi III, pois elas compartilham características entre estas duas linhagens

filogenéticas parentais. Porém, de acordo com Westenberger et al. (2006) as cepas

híbridas seriam formadas pela fusão entre Tc I e Tc II, uma vez que tais cepas

apresentam associação com os maxicírculos das duas linhagens parentais. Dados

do genoma nuclear também suportam a hipótese de eventos de fusão entre Tc I e

Tc II para a formação das cepas híbridas (ELIAS et al., 2005). No presente trabalho

as cepas híbridas ficaram mais próximas de Tc I e Tc II do que de Tc II e Tc III, o

que corrobora com os estudos de Westenberger et al. (2006) e de Elias (2005). Já

as cepas da linhagem de T. cruzi IV são de ocorrência rara na natureza e existem

poucos exemplares e estudos relacionados às mesmas. Logo, elas são as cepas

menos compreendidas entre as DTUs descritas para o T. cruzi (MILES et al., 2009;

ZINGALES et al., 2009).

Além disso, neste trabalho foi empregado um número reduzido de cepas do T.

cruzi (24) em comparação com outros trabalhos, como de Freitas et al., (2006) que

utlizaram 75 amostras e o de Pimenta (2002) que utilizou 131 amostras. Para

ocorrer um agrupamento mais robusto entre as cepas de uma determinada linhagem

seria necessário um número maior de amostras. Provavelmente, se fossem

adicionadas nas abordagens filogenéticas mais cepas do T. cruzi, ocorreria uma

maior definição no agrupamento das cepas pertencentes às linhagens Tc V e VI.

Outro ponto importante ao analisar a Rede Wagner sem raiz foi a separação

das linhagens relacionadas ao ciclo doméstico (Tc II, Tc V e Tc VI) das linhagens

relacionadas ao ciclo silvestre (Tc I, Tc III e Tc IV).

Alguns estudos utilizando locos de microssatélites realizaram análises

filogenéticas em isolados de triatomíneos e de pacientes chagásicos no Rio Grande

do Norte, e em amostras de T. cruzi isoladas de pacientes de Minas Gerais e Goiás,

tais análises indicaram a presença de três agrupamentos distintos: um formado por

isolados T. cruzi III, outro associado à linhagem T. cruzi I e o terceiro grupo foi

formado por isolados da linhagem T.cruzi II. Tais resultados foram semelhantes aos

109

encontrados neste trabalho, evidenciando o agrupamento das cepas pertencentes

às linhagens Tc I, Tc II e Tc III (D’ÁVILA, 2008; CÂMARA et al., 2010).

A próxima etapa deste trabalho foi a aplicação dos novos locos de

microssatélites em ensaios de Full Nested PCR em amostras de tecido cardíaco de

pacientes chagásicos crônicos. Para esta fase, foram selecionados apenas os seis

locos mais polimórficos: TcAC13, TcTG14, TcGCT11, TcTTA15, TcAAAT9,

TcCTTT7. Para a realização deste procedimento, primeiramente foram desenhados

pares extras de iniciadores localizados mais externamente para os locos de

microssatélites, chamados de iniciadores externos descritos na Tabela 13. O

desenho desses iniciadores foi possível devido às amplas extremidades

flanqueadoras dos novos locos de microssatélites.

A partir daí, foi empregada a estratégia de Full Nested PCR que apresenta

alta sensibilidade e especificidade. Com o uso desta técnica a sensibilidade da

reação em detectar o DNA do parasito pode ser aumentada em cerca de 100 a 1000

vezes maior em relação à sensibilidade de uma PCR convencional (VALADARES,

2007). Estudos como o de Ribeiro et al. (2016), empregando a PCR convencional e

Full Nested PCR, identificaram o DNA do T. cruzi nas amostras testadas

confirmando a sensibilidade e especificidade desta estratégia. O baixo conteúdo de

parasitos em amostras biológicas de pacientes chagásicos, principalmente na fase

crônica da doença de Chagas, requer a utilização de estratégias mais sensíveis

envolvendo a detecção do parasito nessas amostras. Logo, a estratégia de Full

Nested PCR utilizando os novos locos de microssatélites mostra-se ideal para esta

função (VALADARES, 2007).

Neste trabalho foi necessária uma nova padronização para os ensaios

realizados com os iniciadores internos, uma vez que na padronização realizada

inicialmente para investigar o polimorfismo foi utilizado o iniciador M13(-40). Os

ensaios com os iniciadores internos com a cauda de M13 empregando a estratégia

de Full Nested PCR apresentaram uma baixa sensibilidade até no nível de 10

picogramas de DNA, nível este inadequado para as análises em amostras biológicas

de pacientes chagásicos. Por este motivo, o ensaio de PCR com M13 foi retirado e

uma nova padronização para a escolha do tampão mais adequado para os

iniciadores internos de cada loco foi realizada. Os iniciadores externos apresentaram

amplificações satisfatórias com as condições utilizadas anteriormente para os

110

iniciadores internos (programa no termociclador e tampão reacional), assim estas

condições foram mantidas nos ensaios de Full Nested PCR.

Após a padronização para os iniciadores internos e externos, foram realizados

testes de sensibilidade empregando o protocolo de Full Nested PCR e diluições

seriadas do DNA genômico da cepa JG de 1ng/μL até o nível de 10fg/μL. As

diluições seriadas foram realizadas até 10fg/μL, pois nesta condição teria uma

quantidade mínima de DNA inviabilizando um resultado positivo nas amplificações.

Já as diluições de 200 e 100fg/μL foram feitas, pois correspondem, em média, ao

DNA de uma única célula do parasito (presença dos dois alelos para cada

microssatélite) e a metade da quantidade de DNA de um único parasito (presença

de apenas um alelo), respectivamente.

Os resultados obtidos com os ensaios de Full Nested PCR permitiram

detectar o DNA do T. cruzi até ao nível de 200 fentogramas, quantidade que

corresponde ao DNA de uma única célula do parasito. Os locos TcTTA15, TcAAAT9,

TcTG14 e TcGCT11 foram amplificados satisfatoriamente até este nível. Além disso,

os locos TcAC13 e TcCTTT7 analisados neste trabalho apresentaram uma maior

eficiência de amplificação pela estratégia de Full Nested PCR amplificando até ao

nível de 100 fentogramas. Dessa forma, os novos locos de microssatélites se

mostraram sensíveis o suficiente para amplificar quantidades limitantes de DNA do

parasito, podendo ser utilizados diretamente em amostras de DNA provenientes de

amostras biológicas de pacientes chagásicos.

A estratégia de Full Nested PCR tem sido utilizada em ensaios de PCR com

amostras de DNA extraídas de tecidos de pacientes chagásicos com outros

marcadores moleculares como kDNA e DNA satélite (ANDRADE et al., 2016;

MARCON et al., 2011). O estudo realizado por Marcon et al. (2011), empregando tal

estratégia com o marcador DNA satélite detectou e quantificou o DNA de T. cruzi em

tecidos de pacientes chagásicos crônicos, demonstrando que T. cruzi está presente

em órgãos-alvo e pode causar danos aos mesmos de acordo com a resposta imune

de cada indivíduo. Porém, o uso de microssatélites na estratégia de Full Nested

PCR apresenta algumas vantagens em relação a estes marcadores, pois como são

localizados no genoma nuclear e unilocais permitem determinar, exatamente, os

alelos presentes em uma cepa e, além disso, informar sobre a constituição mono ou

multiclonal para as cepas presentes nos tecidos dos pacientes.

111

Em outro trabalho, utilizando a metodologia de Full Nested PCR com o

marcador DNA satélite, foi possível analisar a eficácia do tratamento etiológico com

benzonidazol através da detecção do DNA do parasito. Este estudo mostrou falha

terapêutica para 14 (48,3%) dos 29 indivíduos analisados, os quais apresentaram

resultados positivos da Full Nested PCR (AGUIAR et al., 2011). Adicionalmente,

outros pesquisadores demonstraram através da Full Nested PCR 86% de

positividade em 50 amostras de pacientes com doença de Chagas na fase crônica,

confirmados por testes sorológicos (MARCON et al., 2002).

Os resultados obtidos no presente trabalho mostraram que todos os locos de

microssatélites testados obtiveram amplificações satisfatórias através da estratégia

de Full Nested PCR, empregando amostras de tecido cardíaco de pacientes

chagásicos crônicos que apresentam um baixo conteúdo de DNA do parasito. Além

disso, os microssatélites isolados neste trabalho confirmaram a especificidade para

T. cruzi, visto que não foram encontradas amplificações utilizando o DNA humano de

paciente não chagásico como controle negativo dos ensaios de PCR. Os ensaios

Full Nested PCR com DNA extraído de tecido cardíaco de pacientes chagásicos

crônicos foram realizados em triplicata, a fim de garantir a efetividade das reações.

O sucesso dos ensaios de PCR diretamente em tecidos humanos infectados

pode ser limitado por vários fatores como, pequena quantidade de parasitos nos

tecidos infectados e a variação da sensibilidade dos ensaios de PCR de cada loco

de microssatélite. Levando isso em consideração, o objetivo deste trabalho foi

detectar T. cruzi diretamente em amostras de tecido cardíaco de pacientes

chagásicos crônicos. Através da metodologia descrita para o Full Nested PCR foi

possível amplificar DNA de T. cruzi na maioria das amostras analisadas. Logo, os

novos locos de microssatélites deste trabalho são sensíveis o suficiente para

detectar quantidades mínimas de DNA do parasito em amostras de pacientes

crônicos, viabilizando o uso destes marcadores em estudo de diagnóstico molecular

para a doença de Chagas.

Conforme observado nas Figuras 29, 30 e 31 o loco que apresentou o maior

número de amplificações positivas foi o TcGCT11, amplificando 9 amostras

biológicas de pacientes chagásicos crônicos. Durante a avaliação de sensibilidade

dos ensaios de PCR os locos que apresentaram maior sensibilidade, isto é,

amplificaram até o nível de 100 fg/µL foram o TcAC13 e TcCTTT7. Entretanto ao

serem utilizados em ensaios de Full Nested PCR com DNA de amostras de tecido

112

cardíaco de pacientes chagásicos crônicos eles amplificaram 8 e 7 amostras,

respectivamente. Os demais locos amplificaram de 7 a 8 amostras, indicando de

uma maneira geral, que o nível de sensibilidade foi bastante similar entre os locos de

microssatélites.

Após a detecção do DNA do parasito em tecidos de pacientes infectados, o

ideal seria realizar a determinação exata do tamanho dos alelos através do

sequenciador automático de DNA. Para tal procedimento seria necessário marcar

com fluorescência um dos iniciadores internos para cada loco utilizado neste

trabalho, porém, isso não foi possível, uma vez que não se tinha recursos

financeiros suficientes para fazer a marcação fluorescente. Então, como alternativa

foi utilizado o software LABIMAGE 1D para fazer uma análise preliminar do tamanho

dos fragmentos amplificados.

As análises das imagens dos amplicons nos géis de poliacrilamida permitiram

determinar o tamanho aproximado dos produtos amplificados para cada loco,

entretanto, não foi possível determinar a quantidade de alelos, se são homozigotos

ou heterozigotos, ou se as cepas do T. cruzi nos tecidos dos pacientes são mono ou

policlonais. Mesmo assim, os dados obtidos com tais análises permitiram a

comparação entre os tamanhos encontrados nas amostras de tecidos e as amostras

das cepas amplificadas na avaliação do polimorfismo.

De acordo com os resultados desta etapa, as amplificações para o loco

TcAC13 apresentaram amplicons de tamanhos idênticos aos encontrados para as

cepas pertencentes à todas as linhagens filogenéticas do T. cruzi, sendo que a

maioria das amplificações apresentaram tamanhos pertencentes às cepas do T.

cruzi II. Os resultados obtidos para os locos TcTG14 e TcTTA15 mostraram

amplificações de dois pacientes com tamanhos iguais aos pertencentes às cepas do

T. cruzi II. Os resultados para os locos TcAAAT9, TcCTTT7 e TcGCT11

apresentaram valores próximos aos obtidos para T. cruzi II. Dessa forma, de acordo

com os resultados deste trabalho, grande parte dos tecidos analisados,

provavelmente, estaria infectado com populações do parasito pertencentes à

linhagem T. cruzi II. Porém, para a identificação das cepas seria necessário a

determinação exata do tamanho dos alelos amplificados pelos locos de

microssatélites através do sequenciador de DNA para se fazer uma associação mais

prudente entre as cepas do T. cruzi e as amplificações encontradas nos tecidos dos

pacientes.

113

O presente trabalho apresenta resultados que corroboram com várias

evidências que demonstraram que apenas as cepas T. cruzi II estariam relacionadas

com a infecção no homem no Brasil, principalmente no estado de Minas Gerais, de

onde são os pacientes analisados neste trabalho (DI NÓIA et al., 2002;

BUSCÁGLIA, DI NÓIA, 2003; FREITAS, et al., 2005; D’ÁVILA et al., 2009; CÂMARA

et al., 2010). Entretanto, o trabalho realizado por Valadares et al. (2008) mostrou

uma grande variabilidade genotípica para as cepas infectantes, uma vez que cepas

T. cruzi I, II e V também são capazes de infectar e causar a doença em humanos,

pois, neste trabalho, foram analisadas amostras tanto do Brasil como da Argentina.

O estudo de Zingales (2011) indica a prevalência do T. cruzi I em pacientes do

México, América Central, países do Norte da América do Sul e Amazônia, enquanto

que T. cruzi V pode ser encontrado em pacientes da Bolívia, Chile, Argentina e

Paraguai.

VII) CONCLUSÕES

115

Neste trabalho foram isolados novos locos de microssatélites em diferentes

cromossomos do T. cruzi, que podem ser considerados efetivos marcadores

moleculares para este parasito, pois se mostraram úteis em estudos de

polimorfismo, genética de populações e filogenia. Além disso, seis destes novos

locos apresentaram sensibilidade suficiente para detectar o DNA do parasito em

amostras de tecido cardíaco de pacientes chagásicos crônicos, contribuindo para o

diagnóstico molecular da doença de Chagas.

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ISOLAMENTO E APLICAÇÕES DE MICROSSATÉLITES … · Primeiramente gostaria de agradecer a Deus, por estar presente em todos os momentos da minha vida. Por me dar força e sabedoria