Isolamento e Identificação de Microrganismos

7/18/2019 Isolamento e Identificação de Microrganismos

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Isolamento e identificação de

microorganismos

Patrícia Albuquerque de Andrade



Diversidade Microbiana

Microorganismos estão presentes emcomunidades nos mais diversos

ambientes



Análises de Comunidades

microbianas

Menos de 1% de todas as espécies

de microorganismos existentes são

cultiváveis Desenvolvimento de técnicas de

isolamento e caracterização

Técnicas de enriquecimento A caracterização aprofundada de um

organismos depende do seu cultivo

em culturas puras.



Isolamento e Identificação de

microorganismos Isolamento

◦ Técnicas de assepsia◦ Cultura pura◦ Técnicas de

enriquecimento◦ Coleta, transporte e

armazenamento dasamostras

◦ Técnicas deisolamento◦ Seleção do meio de

cultura

Identificação

◦ Características decultivo

◦ Morfologia◦ Características

antigênicas◦ Características

patogênicas

◦ Característicasbioquímicas◦ Características

genéticas



Técnicas de Esterilidade ou

Assepsia

Conjunto de medidas para prevenir

contaminação durante a manipulação de

culturas e meios de cultura estéreis

Fonte: Brock Biology of Microorganisms



Técnicas de Esterilidade ou

Assepsia

Estabelecer uma área detrabalho

Remover tudo o que nãofor necessário

Limpar a área de trabalhocom um desinfetante antesde começar a trabalhar

Pipetas e garrafas devemestar estéreis

Organizar tudo o que vocêprecisa (frascos, pipetas,pipetador, etc)

Lavar as mãos

Usar luvas e trocá-las comfrequência.

Adaptado de “ At the Bench: a laboratory navigator ”, Kathy Baker, 2005



Câmara de biossegurança (fluxolaminar)

Luz UV

Filtro HEPAFluxo laminar



Coleta e Processamento da

Amostra

O sucesso da identificação depende de comoa amostra é coletada, manuseada earmazenada

Evitar contaminação◦ Uso de recipientes estéreis

◦ Técnica de amostragem

◦ Ex. Coleta de amostras da garganta e nasofaringe

não devem tocar a bochecha, a língua ou saliva Após a coleta a amostra deve ser rapidamente

levada ao laboratório e armazenadaapropriadamente (ex. Refrigerada)



Cultura Pura

Uma cultura contendo um únicomicroorganismo.

http://www.temple.edu/dentistry/admissions/course_descriptions.html

Brock Biology of Microorganisms,



Isolamento de Culturas Puras

Por que isolar/identificar um

microorganismo ?

Que tipo de organismo você pretendeisolar?

◦ Definir a estratégia de isolamento

◦ Definir que tipo de meio de cultura



Técnicas de Isolamento



Plaqueamento de Culturas

Semeadura em superfície

Semeadura em profundidade

Adaptado de Brock Biology of Microorganisms



Plaqueamento de Culturas

Semeadura por esgotamento:obtenção de colônias isoladas



Seleção do meio de cultura

Fatores que influenciam a escolha do meio

de cultura

◦ A origem do material a ser analisado

◦ A espécie que se imagina estar presente na

amostra

◦ As necessidades nutricionais dos organismos

Identificação de uma população mista:

◦ Semeadura em diversos meios e condições para

obtenção do crescimento da maior parte das

espécies contidas na amostra.



Meios Seletivos/Diferenciais

Ágar Verde Brilhate contendo lactose,

sacarose e indicador de pH

Salmonella

E. coli

http://www.microbelibrary.org

Ágar MacConkey(fermentação de

lactose)

E. colic

Serratia marcescens

Não inoculado

Meio MSA (MannitolSalt Agar)

Fermentação demanitol

Staphylococcus. aureus

Staphylococcus epidermidis



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Meios enriquecidos

Placa de Ágar sangue:

contendo bactérias dagarganta humana

Meio enriquecido/diferencial

Ágar chocolate: contém sanguecozido. Usado para oisolamento de N. gonorrhoeae.



Meios Para Fungos

uma mistura simples contendoglicose, uma fonte de nitrogênioinorgânico ou orgânico e alguns

minerais. Em geral esses meios têm uma

concentração maior de açúcar (4%) eum pH menor (3,8 a 5,6)

Uso de antibióticos para inibircrescimento bacteriano

Ex. Sabouraud, YPD



Meios para crescimento de Fungos

Meio Sabouraud – fungos ambientais

Meio ágar sangueHistoplasma capsulatum

Meio YPD (yeast peptone dextrose)

Saccharomyces cerevisiae(True and Lindquist, Nature 407, 477-483



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Identificação de Microorganismos

Como identificar espécimes desconhecidos? Por quê?

Principais métodos :

◦ Características de cultivo

◦ Características morfológicas

◦ Características antigênicas

◦ Características patogênicas

◦ Características bioquímicas

◦ Características genéticas



Identificação de Bactérias

Organimos são

identicados através

de chaves

dicotômicas Análise dos

resultados de vários

testes

Normalmente feitossimultaneamente



Características de Cultivo

Plaqueamento

Crescimento em meios enriquecidos,

seletivos, diferenciais, etc

Aerobiose, anaerobiose,

pH, temperatura

Crescimento rápido/lento

Floculação



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Métodos morfológicos

Observação da morfologia da Colônia◦ Textura, forma, pigmentação, velocidade de

crescimento, crescimento em meio líquido.

Observação ao microscópio◦ Morfologia da célula,

◦ Tamanho

◦

coloração simples ou diferencial◦ Presença de determinadas estruturas

(grânulos de armazenamento, endosporos,cápsula, flagelo, etc).



Morfologia da colônia

Imagens da página

microbelibrary.org

é ó



Microscopia

Microscopia de luz Microscopia eletrônica

De campo escuro

De contraste de fase

Fluorescência Confocal

Métodos Microscópicos

Métodos de coloração

Coloração simples;

Coloração diferencial (Gram,coloração álcool ácido resistente)

Coloração especial (coloração

negativa, para esporos, ou para

flagelos)



Características Morfológicas

Morfologia microscópica

Tamanho e forma

◦ Rapidamente feita ao

microscópio (com ou semcoloração)

◦ Pode determinar se

amostra é de procariotos,

fungos ou protozoários

◦ Muitas vezes suficiente

para diagnóstico clínico



Morfologia Microscópica

Agregados celulares◦ As células se aderem após a divisão

binária formando arranjos específicos




Coloração diferencial Coloração de Gram

◦ gram-positivas e gramnegativas

◦ Limita a identidade de ummicroorganismo

◦ Insuficiente para

identificaçãoisoladamente

◦ Ex. E. coli and Salmonella sãosemelhantes após a coloração



Coloração de Gram




Corantes especiais◦ Nanquim para cápsula Ex. Cryptococcus neoformans

◦ Coloração ácido rápida – ácidos

graxos Ex. Mycobacterium



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Testes Bioquímicos

Crescimento em meios diferencias: na presençade um determinado substrato e testado para aprodução de um determinado produto

Fermentação de carboidratos, produção de ácidoou gás e hidrólise de gelatina, albumina ou amido

Em laboratórios de análises clínicas é comum ouso de ‘kits’ miniaturizados que podem detectar

múltiplas características



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Fermentação deCarboidratos

A fermentação é observadapela formação de ácido(mudança de cor do meio)

e produção de gás (bolha) Tubo de ensaio contendo

um tubo de Durham paracoletar as bolhas de gás

Amostras:1. Controle não inoculado

2. Amostra positiva paraácido e gás

3. Amostra positiva paracrescimento, mas semformação de gás ouácido.



Testes Rápidos

ONPG (β galactosidase); ADH (arginine dihydrolase); LDC (lysine decarboxylase); ODC(ornithine decarboxylase); CIT (citrate utilization); H2S (hydrogen disulphide production);URE (urease); TDA ( tryptophan deaminase); IND (indole production); VP (Voges Proskauertest for acetoin); GEL ( gelatin liquefaction); the fermentation of glucose (GLU), mannitol(MAN), inositol (INO), sorbitol (SOR), rhamnose (RHA), sucrose (SAC); Melibiose (MEL),amygdalin (AMY), and arabinose (ARA); and OXI (oxidase).

positive

negative



Diagnóstico sem cultura?

Alguns patógenos◦ Não podem ser isolados

◦ Crescem muito devagar

◦ Isolamento pode ser demorado ouimpossível



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Testes Imunológicos

Interação de um antígeno microbiano comum anticorpo

Testar a presença de um antígeno pode sermais fácil do que testar a presença domicroorganismo

Existem kits de laboratório para a

identificação de diversos microorganismos.



Sorologia

Proteínas e polisacarídeos podemfuncionar como identificadores

Cápsula, glicocálice, flagelo, pili◦ Reação antígeno-anticorpos Ex. Detecção rápida de Streptococcus pyogenes

S l i



Combina-se um

antisoro conhecido

com um

microorganismos

desconhecido

Exemplos:

◦ Aglutinação em

lâmina

◦ ELISA

Uso: HIV, sífilis,

Chagas, sarampo,

hepatite

Sorologia



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Métodos Genotípicos

Análises do material génético demicroorganimos – revolucionou aidentificação e classificação demicroorganismos

Incluem:◦ Amplificação de material genético por PCR

(RT-PCR, RAPD-PCR),

◦ Técnicas de hibridação

◦ Digestão com enzimas de restrição (RFLP)

Em alguns casos é a única maneira deidentificar-se um microorganismo



Sumário

O isolamento e identificação demicroorganismos requer o uso

sistemático de diversas técnicas

microbiológicas, bioquímicas egenéticas

Importância no estudo de

microorganismos ambientais, indústriafarmacêutica, e de alimentos e no

tratamento de doenças infecciosas.

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