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ISOLAMENTO E MANIPULAÇÃO
DE UM GENE
ISOLAMENTO E MANIPULAÇÃO
DE UM GENE
• Importância da Engenharia Genética
• Diversidade biológica X Diversidade gênica
•Etapas básicas da Clonagem
•Escolha e amplificação do gene
•Digestão do DNA com Enzimas de Restrição
•Escolha e Estrutura dos plasmídeos
•Ligação dos Insertos
•Transformação de um organismo
•Selecionar os organismos modificados
Importância da Engenharia Genética
Análises de DNA (paternidade, forense, predisposição a doenças).
Melhoramento de culturas e maior produtividade de alimentos (transgênicos).
Produção de Vacinas e Medicamentos Imuno-Biológicos.
Melhoramento de Processos Industriais (áreas de energia, meio ambiente etc)
Volume 409 Number
6822
Pages 745-964
15 February 2001
Vol 291, Issue
5507,
Pages 1145-1434
16 February 2001
Quebra-cabeças de
bilhões de peças...... que montam uma
peça.
Homo sapiens Arabidopsis thaliana Mus musculus Caenorhabitis elegans Drosophila melanogaster
Mycobacterium leprae Vibrio cholerae Plasmodium falciparum Mycobacterium tuberculosis Neisseria meningitidis
Helicobacter pyroli Xylella fastidiosa Bacillus subtilis Chlamydia pneumoniae Pseudomonas aeruginosa
E. coli Saccharomyces cerevisiae Yersinia pestis Salmonella enterica Schizosaccaromyces pombe
Div
ers
idad
e B
ioló
gic
a
Diversidade Biológica X Diversidade gênica
(HAR1) Human Accelerated Region 1
A região HAR1, assim como 98,5% do
nosso genoma, não codifica nenhuma
proteína
Em 6 milhões de anos a evolução
mudou 1% do genoma
Etapas básicas da Clonagem
Preparar o gene ou DNA a ser usado (escolha, amplificação e/ou digestão).
Escolher um vetor de clonagem (molécula de DNA capaz de auto replicar-se).
Essas moléculas geralmente são plasmídios ou DNA viral.
Ligar, covalentemente, estes 2 fragmentos de DNA. A enzima que faz esta ligação
entre o vetor de clonagem e o DNA a ser clonado é a DNA ligase. Esse DNA
composto de moléculas de origem diferente é chamado de DNA recombinante ou
DNA quimérico.
Transferir o DNA recombinante do tubo de ensaio para uma célula hospedeira
que emprestará sua maquinaria enzimática para a replicação deste DNA.
Selecionar ou identificar as células hospedeiras que contém o DNA recombinante.
Etapas básicas da Clonagem
Escolhas Iniciais e Preparação
mRNA
•Purificar o mRNA
•Transcrição reversa (mRNA → cDNA)
DNA
•Purificar o DNA
Amplificação da região ou gene de interesse
DNA
•Purificar o DNA
Digestão do DNA
Clonagem de genes ou trechos de DNA Clonagem de todo o DNA
Transcrição Reversa
•Molde a ser transcrito reversamente (mRNA)
•Transcriptase reversa
•Primer (oligonucleotideo dT = TTTTTTTTTTTT)
•dNTPs (ATP, CTP, TTP, GTP)
•Tampão adequado
Amplificação de DNA(PCR – Reação em cadeia da polimerase)
•Molde de DNA a ser copiado
•DNA polimerase
•Primers (senso e anti-senso)
• dNTPs (ATP, CTP, TTP, GTP)
•Tampão adequado
Digestão de DNA(Endonucleases)
•DNA a ser digerido
•Endonuclease
•Tampão adequado
Análise de fragmentos de DNA(eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida)
•DNA já digerido ou produto de amplificação
•Tampão adequado
•Aplicação no gel e início da corrida (corrente
elétrica)
•Visualização usando molécula fluorescente à luz
UV que liga no DNA (brometo de etídeo)
Análise de fragmentos de DNA(eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida)
Southern e Northern Blot(Identificação de DNA e mRNA em membranas de nylon)
Fragmentos de DNA (ou RNA) separados por peso molecular usando-se eletroforese
em gel são transferidos para membranas.
• A técnica, quando usada para DNA, é chamada de Southern Blot
• A técnica, quando usada para RNA, é chamada de Northern Blot
Southern e Northern Blot
Fingerprint de DNA
Relembrando as etapas iniciais da clonagem
mRNA
•Purificar o mRNA
•Transcrição reversa (mRNA → cDNA)
DNA
•Purificar o DNA
Amplificação da região ou gene de interesse (PCR)
Conferência usando eletroforese
DNA
•Purificar o DNA
Digestão do DNA
Conferência usando eletroforese (só se oriundo de 3)
Clonagem de genes ou trechos de DNA Clonagem de todo o DNA
1 2 3
Etapas seguintes da clonagem
Digestão do DNA Digestão do plasmidio
Ligação
Transformação
Seleção
Ligação(escolha do vetor - plasmídeo)
Ligação(pontas coesivas e não coesivas)
Transformação e Seleção(inserção dos vetores em outros organismos)
As bactérias ainda são os
organismos mais usados para
clonar DNA heterólogo
A seleção pode ser feita pela
habilidade de sobreviver a
antibióticos ou crescer em meios
de cultura pobres em algum
aminoácido ou nutriente
Outras Técnicas: Biblioteca genômica
Uso de
bacteriófagos como
vetores: o fago λ
tem DNA de dupla
fita
Outras Técnicas: Microarrajo de DNA
Outras Técnicas: Microarrajo de DNA
Array de 1046 cDNAs testado
com cDNA marcado de feito de
mRNA de medula óssea. O
nível de hibridização segue as
cores do espectro, com
vermelho sendo a maior
expressão e azul a menor