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JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA
ROTAS BIOTECNOLÓGICAS PARA A SÍNTESE DE AMINAS
QUIRAIS EM CONDIÇÕES DE FLUXO CONTÍNUO
Rio de Janeiro
2018
JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA
ROTAS BIOTECNOLÓGICAS PARA A SÍNTESE DE AMINAS QUIRAIS EM
CONDIÇÕES DE FLUXO CONTÍNUO
Tese de doutorado apresentada ao curso de Pós-
graduação em Ciências Farmacêuticas, da
Faculdade de Farmácia, da Universidade Federal
do Rio de Janeiro, como requisito parcial à
obtenção do título de Doutor em Ciências
Farmacêuticas.
Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Octavio Mendonça
Alves de Souza
Co-orientador(es): Prof. Dr. Carlos Alberto
Mateus Afonso e Profa. Dra. Ivana Correa Ramos
Leal
Colaborações internacionais: Prof. Dr. Uwe T.
Bornscheuer
Rio de Janeiro
2018
CIP - Catalogação na Publicação
Elaborado pelo Sistema de Geração Automática da UFRJ com osdados fornecidos pelo(a) autor(a).
S729rSouza, Jonathan Farias Bassut Rotas biotecnológicas para a síntese de aminasquirais em condições de fluxo contínuo / JonathanFarias Bassut Souza. -- Rio de Janeiro, 2018. 165 f.
Orientador: Rodrigo Octavio Mendonça Alves deSouza . Coorientadora: Ivana Correa Ramos Leal. Tese (doutorado) - Universidade Federal do Riode Janeiro, Faculdade de Farmácia, Programa de PósGraduação em Ciências Farmacêuticas, 2018.
1. Biocatálise. 2. Fluxo contínuo. 3. Aminasquirais. I. de Souza , Rodrigo Octavio MendonçaAlves, orient. II. Leal, Ivana Correa Ramos,coorient. III. Título.
“As defesas de tese são tão assépticas!
Tão puras e tão arrumadas.
E ao mesmo tempo, tão distantes da realidade que as gerou!
Elas não contam a história
Dos fragorosos erros e geniais intuições
Dos tropeções no escuro
E do progresso sem método
Dos inusitados acertos
Ou do sofrimento e da vontade de desistir.
Com início, meio e “happy end”
As teses contam uma história que não ocorreu.
As teses mentem”
- Prof. Reinaldo Carvalho Silva
AGRADECIMENTOS
Para mim é extremamente difícil escrever essa seção de agradecimentos, pois
mesmo que eu dedicasse páginas inteiras à cada pessoa citada abaixo, minhas
palavras estariam muito aquém do sentimento de gratidão pela importância que elas
tiveram na minha vida e direta ou indiretamente a este trabalho.
Começo então agradecendo à minha mãe, Sonia Farias, por todo apoio e por
ser meu maior exemplo de resiliência. Nos recorrentes dias em que as vicissitudes da
vida me davam motivos para desistir, eu lembrava que minha mãe nunca desistiu e,
se preciso, ela recomeçava de novo e de novo. E ao meu pai, Agenor Bassut, pelo
apoio mesmo naquilo em que não podia entender, pelos conselhos, sermões, as
lágrimas de orgulho que presenciei cair e aquelas caíram por tantos motivos e eu não
estava lá para ver. Eu cheguei até aqui graças às décadas de sacrifícios e suor. E
embora eu não possa trazer-lhes a juventude de volta, minha missão será sempre
tentar construir uma sensação de que os tempos difíceis valeram a pena.
Aos meus irmãos, Emerson, Thayane e Patrick, por todo apoio durante todos
esses anos, pelo carinho e mútua admiração. Pelas diversas situações cotidianas que
moldaram quem eu sou e construíram quem eu ainda quero ser. Pela compreensão
com a minha ausência nas reuniões de família devido às responsabilidades do
doutorado. E aos meus sobrinhos, Thayssa, Yago e Lara, por trazerem a esperança
de que o futuro será melhor.
À minha namorada Erika Ruggio, por todo amor, compreensão e cuidado. Pelo
apoio e incentivo diários. Pelos ouvidos e abraços que fizeram da travessia desse
turbulento período tão mais fácil.
Ao meu orientador, Rodrigo Souza, pelo apoio desde o início dessa jornada. Por
todas as portas abertas, pelas quais serei eternamente grato. Pela confiança que
tornou esse trabalho possível mesmo com todos os obstáculos que se apresentaram.
Tive muita sorte em ter iniciado minha vida acadêmica em um grupo de pesquisa de
excelência como o BossGroup e só tenho a agradecer pela(s) oportunidade(s).
Obrigado!
À minha co-orientadora, Ivana Leal, por todo incentivo e pelas conversas e,
principalmente, toda a paciência e por estar sempre tão disposta a ajudar, mesmo
quando eu precisava de uma assinatura em cima da hora, o que acontecia
praticamente uma vez por ano, geralmente em dezembro, às vezes durante o recesso.
Muito obrigado!
Ao meu co-orientador, Prof. Carlos Afonso, da Universidade de Lisboa, que me
recebeu tão amistosamente durante minha curta estadia em Lisboa e teve grande
contribuição a este trabalho. Espero que possamos trabalhar juntos novamente.
Obrigado, Professor!
Ao Prof. Uwe Bornscheuer pela parceria e a oportunidade de trabalhar no seu
grupo de pesquisa durante minha breve estadia na Alemanha e por toda sua
contribuição a este trabalho.
Ao Prof. Ivaldo Jr., a quem tenho grande admiração, por toda a ajuda durante
todos esses anos.
A todos do BossGroup pela conversas, risadas e apoio. Foi um grande prazer
estar esses 4 anos na companhia de vocês: Raquel Pinheiro e Stefânia Souza,
obrigado pelo apoio, pelas conversas e por toda ajuda, paciência e até preocupação,
durante todos esses anos. Anderson Aguillón, obrigado pelos bolos, pelas risadas,
pelas ricas conversas, pelo podcast e por ser um ótimo relações públicas. Marcus
Mattos, obrigado pelas longas conversas e pelo suporte no Brasil e na Alemanha.
Marco Macena, obrigado pelas proveitosas discussões sobre qualquer coisa, pelas
risadas e pela confiança em entrar em um carro que eu estou dirigindo (haha). Eloah
Ávila, obrigado pelas risadas e toda a ajuda. E não posso deixar de mencionar os
queridos Alexandre França (“Jonathan, espero não estar incomodando, mas...”),
Viviane Marques, Renata Aguiar, Júlio César, Amanda Miranda, Mauro Gomes,
Larissa Gotardo e Davi Nascimento.
A Ayad Dawood, que teve direta e importante participação nesse trabalho, mas
dificilmente lerá esse agradecimento. Em todo caso, vielen Dank für deine Mühe! Du
hast dazu beigetragen, dass dieser Werk Echt ist. Viel glück und auf Wiedersehen!
A todos os colegas do laboratório do Professor Carlos Afonso, em especial
Angelo Rocha e Carlos Monteiro que fizeram valorosas contribuições a este trabalho.
À Idima e Euclides, serei sempre grato a vocês por tudo que já fizeram por mim.
Obrigado por todo apoio durante tantos anos.
Aos amigos Allan Melo, Beatriz Oliveira, Carolina Damasceno, Karen Barbosa,
Márcio Toledo, Mateus Oliveira, Thamires Cunha, Tháyna Sisnande, Thiago Tobias,
Rayza Adrielle, Stephanie Bustamante e Úrsula Laino. O apoio de vocês foi de
extrema importância durante a realização desse trabalho e para que eu conseguisse
chegar até o final disso tudo. A amizade de vocês é uma das coisas que mais tenho
orgulho. Obrigado!
Aos amigos que, apesar de distantes, acompanharam toda essa trajetória
diariamente e estavam sempre lá para apoiar, ouvir e aconselhar, fosse nos bons
momentos, nos ruins e nos desenfreadamente desastrosos: Alex Marques, Amanda
Menezes, André Anastácio, Caio Corrêa, Douglas Assis, Fabrícia Ribeiro, Felipe
Antunes, Fernando Henrique, Helio Paiva Neto, Leandro Araújo, Marcella Abreu,
Maria Elisa, Matthews Camargos, Murilo Franco, Osmar Golegã, Renato Jacques,
Rodrigo Cantini, Shi Sagara, Stefhan Rafael, Tarsis Azevedo e Thiago Guariglia.
Obrigado!
À Alexandra Elbakyan, pela luta em prol da democratização do conhecimento.
À minha banca de acompanhamento, Prof. Ivaldo Jr. (Novamente), Profa.
Gizela Dellamora (que tem me acompanhado desde o início da minha trajetória
acadêmica) e à Prof. Melissa Estrada (que desde o meu mestrado faz tão valorosas
contribuições ao meu trabalho).
À banca por aceitar o convite na avaliação desde trabalho.
À Capes e FAPERJ pelo apoio financeiro.
RESUMO
SOUZA, Jonathan Farias Bassut. Rotas biotecnológicas para a síntese de aminas
quirais em condições de fluxo contínuo. Rio de Janeiro, 2018. Tese– Programa Pós-
graduação em Ciências Farmacêuticas, Faculdade de Farmácia, Universidade
Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2018.
Neste trabalho foram investigadas diferentes rotas biocatalisadas para a síntese
de aminas quirais enantiomericamente puras em condições de fluxo contínuo. Desse
modo, na primeira seção, foram estabelecidas as condições adequadas para a síntese
de biaril aminas através da combinação de uma reação de acoplamento de Suzuki-
Miyaura, em batelada, com subsequente reação de transaminação biocatalisada em
fluxo contínuo. Nesta seção, após triagem com diferentes ω-transaminases, a
transaminase de A. fumigatus foi capaz de reconhecer biaril cetonas como substratos.
Em seguida, diferentes soluções-tampão foram avaliados na reação de Suzuki-
Miyaura, de modo que o meio da reação de acoplamento fosse compatível com a
reação biocatalisada subsequente. Após estabelecidas as condições necessárias, as
transaminases imobilizadas de A. fumigatus (4CHI) e uma variante descoberta por
evolução direcionada (4CHI_I145A) foram utilizadas na obtenção de diversas biaril
aminas quirais tanto em batelada quanto em condições semi-contínuas com
conversões de até 80% em fluxo contínuo e até 99% em batelada.
Na segunda seção desse trabalho, o uso polietilenoglicol (PEG) como agente
acilante foi investigado na resolução cinética da (RS)-1-feniletilamina catalisada pela
lipase de C. antarctica imobilizada em resina acrílica (N435) em fluxo contínuo. Assim,
a (S)-1-feniletilamina foi obtida com 49% de rendimento e >99% de excesso
enantiomérico. O biocatalisador N435 pôde ainda ser utilizado por 40 ciclos sem perda
de atividade. Após o estudo de diferentes metodologias para a recuperação da amina
de configuração (R), a hidrólise da amida formada com o PEG catalisada por solução
ácida apresentou melhor resultado. A (R)-1-feniletilamina foi obtida com 34,9% de
rendimento e 95% de excesso enantiomérico.
Palavras-chave: biocatálise, fluxo contínuo, aminas quirais.
ABSTRACT
SOUZA, Jonathan Farias Bassut. Biotechnological routes for the synthesis of chiral
amines in continuous flow conditions. Rio de Janeiro, 2018. Thesis – Pharmaceutical
Sciences Postgraduate Program, Faculty of Pharmacy, Federal University of Rio de
Janeiro, Rio de Janeiro, 2018.
In this work, different biocatalyzed routes were investigated for the synthesis of
enantiomerically pure chiral amines under continuous flow conditions. Thus, in the first
section, it was established the proper conditions for the synthesis of biaryl amines by
combining a Suzuki-Miyaura cross-coupling reaction in batch with posterior
biocatalyzed transamination reaction in continuous flow. In order to do this, after
screening with different ω-transaminases, A. fumigatus transaminase were identified
as capable of recognizing biaryl ketones as substrates. Then, different buffer solutions
were evaluated in the Suzuki-Miyaura reaction, so that the coupling reaction medium
was compatible with the subsequent biocatalyzed reaction. After establishment of the
necessary conditions, immobilized A. fumigatus transaminase (4CHI) and a variant
discovered by directed evolution (4CHI_I145A) were used for obtaining chiral biaryl
amines both in batch and in semi-continuous conditions with conversions of up to 80%
in continuous flow and up to 99% in batch.
In the second section of this work, the use of polyethylene glycol (PEG) as the
acylating agent were evaluated in the kinetic resolution of (RS)-1-phenylethylamine
catalyzed by immobilized C. antarctica lipase (N435) under continuous flow conditions.
Thus, (S)-1-phenylethylamine was obtained in 49% yield and >99% enantiomeric
excess. The N435 biocatalyst could be used for 40 cycles without loss of activity. After
investigation of different methodologies for recovering the (R)-amine, chemical
hydrolysis of the PEGylated amine by acidic solution showed the best results. (R)-1-
phenylethylamine was obtained in 34.9% yield and 95% enantiomeric excess.
Keywords: Biocatalysis, Continuous Flow, Chiral amines.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estrutura de fármacos contendo amina quiral em sua estrutura. ................ 1
Figura 2. Esquema geral de sistemas de fluxo contínuo utilizados em diferentes
processos biocatalisados. ........................................................................................... 4
Figura 3. Tempo de residência. ................................................................................. 5
Figura 4. Síntese de aminas quirais catalisada por ω-TAs realizadas pela empresa
Celgene. ................................................................................................................... 16
Figura 5. Aminas obtidas com o sistema de reciclo do piruvato por uma aminoácido
oxidase. .................................................................................................................... 21
Figura 6. Cromatograma extraído de uma das amostras da reação de síntese
assimétrica catalisada por diferentes transaminases utilizando o sistema LDH/GDH e
espectro de massa utilizado para a identificação dos compostos.. .......................... 51
Figura 7. Abordagens propostas para a síntese de biaril aminas através da
combinação da reação de acoplamento de Suzuki-Miyaura e a transaminação
biocatalisada. ............................................................................................................ 52
Figura 8. A) ácido 2-(ciclohexilamino)-etanosulfônico (CHES); B) complexação do
paládio com a amina básica. .................................................................................... 56
Figura 9. Suporte EZIGtm
ligado à enzima. .............................................................. 57
Figura 10. Substratos selecionados para síntese assimétrica. ................................ 58
Figura 11. Aminas produzidas através da reação de Suzuki seguida de trans-
aminação biocatalisada em condições semi-contínuas. ........................................... 61
Figura 12. Cromatograma obtido após reação de síntese assimétrica de 1c
biocatalisada em fluxo contínuo. Abaixo o espectro de massas identificando a
obtenção do produto. ................................................................................................ 63
Figura 13. Comparação entre o t0 e a amostra após a reação de síntese assimétrica
de 2c. ........................................................................................................................ 66
Figura 14. Representação gráfica da relação entre as frequências vibracionais da
carbonila no espectro de infravermelho (barras) e a conversão (linha) na
transaminação de arilalquil cetonas e piridilalquil cetonas catalisada por
transaminases. ......................................................................................................... 68
Figura 15. Comparação entre o t0 e a amostra após a reação de síntese assimétrica
de 3c. ........................................................................................................................ 69
Figura 16. Polietilenoglicol (PEG). ........................................................................... 71
Figura 17. Cromatograma da amina extraída após resolução cinética em fluxo
contínuo. ................................................................................................................... 73
Figura 18. Métodos para a recuperação da amina de configuração (R) a partir do
produto da reação entre a amina e o PEG. .............................................................. 75
Figura 19. Cromatograma após a tentativa de hidrólise catalisada por Novozyme 435
mostrando os dois picos referentes a (RS)-1-feniletilamina...................................... 75
Figura 20. Cromatograma após reação de etanólise em duas etapas catalisada por
N435 em tolueno. ..................................................................................................... 76
Figura 21. Cromatograma da amina extraída após a hidrólise com solução ácida. . 78
LISTA DE ESQUEMAS
Esquema 1. Estratégias para uso de TAs para a síntese de aminas enantio-
mericamente puras. .................................................................................................... 9
Esquema 2. Primeira etapa do mecanismo da reação catalisada por transaminases.
.................................................................................................................................. 10
Esquema 3. Segunda etapa do mecanismo da reação catalisada por transaminases.
.................................................................................................................................. 11
Esquema 4. Esquema adaptado da reação realizada por Skalden et al. (2015). .... 13
Esquema 5. Síntese da sitagliptina por uma ω-TA mutante produzida por Jarvis et al.
(2010) ....................................................................................................................... 15
Esquema 6. Síntese assimétrica de aminas propargílicas. ...................................... 17
Esquema 7. Síntese do intermediário da silodosina. ............................................... 17
Esquema 8. Síntese assimétrica do intermediário do ramatroban por Busto et al.
(2014). ...................................................................................................................... 18
Esquema 9. Esquema da reação no modelo bifásico. ............................................. 20
Esquema 10. Síntese simultânea de (S)-aminoácidos e (R)-aminas com acoplamento
de α- e ω-TAs. (A) sistema AlaTA/ω-TAs. (B) sistemas TyrTA/ω-TA e AspTA/ω-TAs.
.................................................................................................................................. 22
Esquema 11. Reação entre a acetofenona e L-alanina catalisada por uma (S)-TA. 23
Esquema 12. Estratégias para o deslocamento do equilíbrio. ................................. 24
Esquema 13. Síntese quimio-enzimática do suvorexant com ciclização espontânea
pós reação de transaminação................................................................................... 26
Esquema 14. Resolução cinética dinâmica de um derivado do 3-fenil-GABA ......... 26
Esquema 15. Síntese do inibidor da proteína smoothened através da resolução
cinética dinâmica utilizando uma transaminase seguidas de etapas químicas......... 27
Esquema 16. Síntese quimio-enzimática da rivastigmina. ....................................... 27
Esquema 17. Reação de hidrólise catalisada por lipases ........................................ 29
Esquema 18. Mecanismo de reações catalisadas por lipases. ................................ 31
Esquema 19. Resolução cinética e dinâmica catalisada por lipases. ...................... 32
Esquema 20. Resolução cinética do intermediário do indinavir. .............................. 35
Esquema 21. Metodologias empregadas para o deslocamento do equilíbrio de
reações de síntese assimétrica. ............................................................................... 48
Esquema 22. Reação de acoplamento de Suzuki-Miyaura em solução 50% DMF em
água. ......................................................................................................................... 53
Esquema 23. Síntese da 1-(4-bifenilil)etilamina em condições semi-contínuas
partindo da 4-bromoacetofenona. ............................................................................. 62
Esquema 24. Síntese da 1-(4’-fluoro-4-bifenilil)etilamina (F-1c) em condições semi-
contínuas partindo da 4-bromoacetofenona (1a). ..................................................... 64
Esquema 25. Síntese da 1-(6-fenil-3-piridinil)etilamina (2c) em condições semi-
contínuas partindo da 1-(5-bromopiridin-3-il)etanona (2a). ....................................... 65
Esquema 26. Síntese da 1-(6-fenil-3-piridinil)etilamina (3c) em condições semi-
contínuas partindo da 1(6-bromopiridin-3-il)etanona (3a). ........................................ 67
Esquema 27. Resolução cinética da 1-feniletilamina usando PEG600 diéster como
agente acilante ......................................................................................................... 72
Esquema 28. Hidrólise da amida (R)-2 catalisada por solução ácida. ..................... 77
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Nomenclatura de reatores contínuos segundo seu volume de operação. .. 5
Tabela 2. Meia-vida de ω-TAs modificadas a diferentes temperaturas .................... 14
Tabela 3. (R)-Transaminases do kit ECS-ATA da Enzymicals ................................. 37
Tabela 4. Enzimas produzidas e imobilizadas pelo laboratório do professor Uwe T.
Bornscheuer ............................................................................................................. 38
Tabela 5. Tabela com informações sobre os suportes usados. ............................... 39
Tabela 6. Transaminase expressas e imobilizadas em Greifswald (Alemanha)....... 39
Tabela 7. Resolução cinética da (RS)-1-feniletilamina por transaminases imobilizadas
comerciais................................................................................................................. 47
Tabela 8. Reação de síntese assimétrica catalisada por diferentes transaminases
utilizando isopropilamina como doador amino. ......................................................... 49
Tabela 9. Reação de acoplamento cruzado de Suzuki-Miyaura entre a 4-bromo-
acetofenona e o ácido fenilborônico com diferentes bases e catalisadores. ............ 53
Tabela 10. Avaliação de diferentes soluções-tampão na reação de acoplamento de
Suzuki-Miyaura ......................................................................................................... 54
Tabela 11. Avaliação de diferentes concentrações DMF na reação de acoplamento de
Suzuki-Miyaura entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico. .................... 56
Tabela 12. Conversão na síntese assimétrica de diferentes aminas utilizando
transaminases liofilizadas e imobilizadas em diferentes suportes. ........................... 58
Tabela 13. Síntese da 1-(4-bifenilil)etanilamina (1c) em batelada. .......................... 64
Tabela 14. Síntese da 1-(6-fenil-3-piridinil)etilamina (3c) em batelada. ................... 66
Tabela 15. Comparação entre a síntese da 1-(6-fenil-3-piridinil)etilamina (3c) e 1-(4-
bifenilil)etilamina (1c) em batelada. .......................................................................... 69
Tabela 16. Estabilidade do biocatalisador após 40 ciclos de reação ....................... 74
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
4CHI – Transaminase de Aspegillus fumigatus
4CHI_I145A – Variante da transaminase de Aspegillus fumigatus
AAO – aminoácido oxidase
AcOEt – Acetato de etila
ADH – Álcool desidrogenase
ADN – Ácido desoxirribonucleico
AlaDH – Alanina desidrogenase
AlaTA – Alanina transaminase
Asp – Aspartato
AspTA – Aspartato transaminase
CDCl3 – Clorofórmio deuterado
CG-DIC – Cromatografia gasosa com detector por ionização de chamas
CG-EM – Cromatografia gasosa acoplada à espectrômetria de massas
CHES - Ácido 2-(ciclohexilamino)etanossulfônico
DMF – dimetilformamida
DMSO – sulfóxido de dimetila
Dopa – L-3,4-diidroxifenilalanina
EC – Enzyme commission number
ee – Excesso enantiomérico
epPCR – Reação em cadeia da polimerase propensa a erros
FDH – Formato desidrogenase
FP – (4R)-Fluoroprolina
GABA – Ácido 4-aminobutanóico
GDH – Glicose desidrogenase
h – hora(s)
HEPES - Ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfônico
His – Histidina
Hz – Hertz
IPTG - isopropil-3-D-tiogalactopiranosídeo
LDH – Lactato desidrogenase
m3 – metro(s) cúbico
MBTFA - N-metil-bis(trifluoroacetamida)
MeOH – Metanol
mg – miligrama
min – minuto(s)
mmol L-1
– milimol por litro
mol L-1
– mol por litro
MTBE – Éter metil terc-butílico
MBTFA - N-metil-bis(trifluoroacetamida)
N435 – Lipase de Candida antactica B imobilizada em resina acrílica comercializada
pela Novozymes (Novozyme 435)
NAD+ – Dinucleotídeo de nicotinamida e adenina (forma oxidada)
NADH – Dinucleotídeo de nicotinamida e adenina (forma reduzida)
p/p – Peso/peso
PEA – 1-feniletilamina
PEG – Polietilenoglicol
pH – Potencial hidrogeniônico
PLP – Piridoxal fosfato
PMP – Piridoxamina fosfato
PVA – Álcool polivinílico
RCD – Resolução cinética dinâmica
RLF – Reator de leito fixo
rpm – rotações por minuto
Ser – Serina
SMO – proteína smoothened
TA – Transaminase
TEA – Trietanolamina
THF – Tetraidrofurano
Tr – Tempo de residência
TyrTA – Tirosina transaminase
U g-1
– micromol de produto formado por minuto e por grama de biocatalisador
U mL-1
– micromol de produto por minuto e mililitro do biocatalisador
v/v – Volume/volume
µm – Micrômetro
ω-TA[(4R)-FP] – ω-transaminase incorporada com o aminoácido (4R)-Fluoroprolina.
ω-TAdopa – ω-transaminase incorporada com o aminoácido L-3,4-diidroxifenilalanina.
ω-TAdp[(4R)-FP] – ω-transaminase incorporada com o aminoácido (4R)-Fluoroprolina
e L-3,4-diidroxifenilalanina.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.......................................................................................... 1
1.1 Biocatálise em fluxo contínuo ........................................................ 3
1.2 Transaminases ................................................................................. 8
1.2.1 Mecanismo de reação. ................................................................... 9
1.2.2 Engenharia de proteínas na obtenção de novas transaminases.. 11
1.2.3 Transaminases na síntese de aminas quirais .............................. 15
1.2.4 Resolução cinética catalisada por transaminases ........................ 19
1.2.5 Síntese assimétrica catalisada por transaminases ...................... 22
1.2.6 Processos quimio-enzimáticos envolvendo transaminases. ........ 25
1.2.7 Transaminases em fluxo contínuo ............................................... 28
1.3 Lipases ........................................................................................... 29
1.3.1 Mecanismo de reações catalisadas por lipases ........................... 30
1.3.2 Resolução cinética catalisada por lipases para a produção de amina
quirais enantiomericamente puras. .................................................................... 31
1.3.3 Lipases em fluxo contínuo............................................................ 33
2 OBJETIVO GERAL ................................................................................ 36
2.1 Objetivos específicos .................................................................... 36
3 MATERIAIS E MÉTODOS ...................................................................... 37
3.1 Reagentes....................................................................................... 37
3.2 Enzimas .......................................................................................... 37
3.2.1 Lipases ......................................................................................... 37
3.2.2 Transaminases comerciais........................................................... 37
3.2.3 Transaminases imobilizadas ........................................................ 38
3.2.4 Obtenção das transaminases de A. fumigatus e a variante
4CHI_I145A e imobilização. .............................................................................. 39
3.3 Métodos analíticos ........................................................................ 40
3.3.1 Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa
(UFRJ). .................................................................................................... 40
3.3.2 Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa
(Greifswald universität) ...................................................................................... 41
3.3.3 Cromatografia gasosa com detector por ionização de chamas
(UFRJ) 41
3.3.4 Cromatografia gasosa com detector por ionização de chamas
(ULisboa) 41
3.4 Equipamentos ................................................................................ 42
3.4.1 Sistemas de Fluxo contínuo (UFRJ) ............................................ 42
3.4.2 Ressonância magnética nuclear .................................................. 42
3.5 Condições reacionais .................................................................... 42
3.5.1 Teste de atividade de ω-transaminases comerciais. .................... 42
3.5.2 Síntese assimétrica usando isopropilamina como doador amino. 43
3.5.3 Síntese assimétrica usando um sistema de deslocamento de
equilíbrio LDH/GDH. .......................................................................................... 43
3.5.4 Reações de acoplamento cruzado de Suzuki-Miyaura ................ 44
3.5.5 Síntese de biaril aminas em condições semi-contínuas ............... 44
3.5.6 Síntese do agente acilante PEG600 (dietil diéster) ........................ 45
3.5.7 Resolução cinética enzimática da (RS)-1-feniletilamina usando
PEG600 (dietil diéster) como agente acilante em condições de fluxo continuo... 45
3.5.8 Hidrólise química para recuperação da (R)-1-feniletilamina......... 46
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO.............................................................. 47
4.1 Transaminases ............................................................................... 47
4.1.1 Avaliação da atividade de transaminases imobilizadas comerciais.
............................................................................................................................ 47
4.1.2 Avaliação das metodologias de deslocamento do equilíbrio para
síntese assimétrica. ........................................................................................... 48
4.1.3 Avaliação das condições para síntese de biaril aminas por reação
de acoplamento de Suzuki-Miyaura e transaminação biocatalisada em cascata
em fluxo contínuo. ............................................................................................. 51
4.1.4 Síntese de biaril aminas por reação de acoplamento de Suzuki-
Miyaura e transaminação biocatalisada em regime semi-contínuo. .................. 60
4.1.5 Conclusões parciais ..................................................................... 70
4.2 Lipase ............................................................................................. 71
4.2.1 Resolução cinética enzimática da (RS)-1-feniletilamina (PEA)
catalisada por lipase usando PEG600-diéster como agente acilante em condições
de fluxo contínuo. .............................................................................................. 71
4.2.2 Avaliação de metodologias para a recuperação da (R)-1-
feniletilamina; ..................................................................................................... 74
5 CONCLUSÕES....................................................................................... 79
6 REFERÊNCIAS ...................................................................................... 81
ANEXOS ...................................................................................................... 101
1
1 INTRODUÇÃO Aminas quirais enantiomericamente puras são de grande importância para a
indústria química e farmacêutica pois funcionam como blocos de construção para
compostos bioativos, como por exemplo, para a rivastigmina, utilizada no tratamento
da doença mal de Alzheimer e Parkinson, a sitagliptina, para tratamento da diabetes,
e a tansulosina, indicada para o tratamento dos sintomas da hiperplasia prostática
benigna (figura 1). Esses compostos fazem parte de um mercado que movimenta
bilhões de dólares todo ano (BRENNA et al., 2017; FUCHS et al., 2012, GHISLIERI;
TURNER, 2014, HANSEN et al., 2009).
Figura 1. Estrutura de fármacos contendo amina quiral em sua estrutura.
Entre as metodologias não-enzimáticas mais comumente empregadas para a
obtenção de aminas opticamente ativas, a resolução de aminas racêmicas pela adição
de ácidos carboxílicos quirais é ainda a abordagem mais comum. Entretanto, a busca
por agentes de resolução pode ser problemática, levando ao uso de uma solução de
diversos ânions de ácidos carboxílicos (conhecida como dutch resolution), que tem
como maior desvantagem a impossibilidade de reuso da solução. Outros métodos
comuns são a aminação redutiva e a redução de iminas e enamidas, que têm cetonas
como material de partida, mas tornam necessárias laboriosas etapas para obtenção
do produto final. Além disso, a síntese dos substratos imina e enamida muitas vezes
se mostra complicada (BREUER et al., 2004; GHISLIERI; TURNER, 2014; NUGENT;
EL-SHAZLY, 2010).
N
N
NN
O NH2
F
F
F
F3CSitagliptina N
ON
O
Rivastigmina
MeO
HN
O
EtO
Tansulosina
2
Nesse contexto, a biocatálise se tornou uma importante ferramenta para a
síntese dessas moléculas por apresentar diversas vantagens em relação aos métodos
químicos tradicionais, como a facilidade de aplicação, o menor impacto ambiental, a
alta seletividade das enzimas e a maior segurança do processo (HOLLMANN et al.,
2011).
Assim, diferentes enzimas têm sido empregadas para obtenção de aminas
assimétricas enantiomericamente puras, entre elas, as lipases e as ω-transaminases
(HÖHNE; BORNSCHEUER, 2009).
Lipases são empregadas, principalmente, em reações de resolução cinética
para separar os enantiomêros de um racemato, considerando que em uma resolução
cinética ideal apenas um dos enantiômeros reage, enquanto o outro permanece
inalterado. Desse modo, esse tipo de reação possui um rendimento máximo teórico
de 50%, a menos que uma etapa de racemização do enantiômero não transformado
seja incluída no processo. À reação de resolução cinética acoplada à etapa de
racemização dá-se o nome de resolução cinética dinâmica (RCD) (ITABAIANA et al.,
2013; DE SOUZA et al., 2015).
Por outro lado, as transaminases produzem aminas quirais por meio de reações
de transaminação, seja por resolução cinética ou desracemização, partindo da amina
racêmica, ou por síntese assimétrica, partindo de uma cetona pró-quiral (HÖHNE;
BORNSCHEUER, UWE T., 2012).
Embora, o uso desses biocatalisadores possua diversas vantagens, algumas
desvantagens ainda persistem e dificultam a aplicação industrial. Elas estão
relacionadas com a baixa estabilidade térmica e operacional dos biocatalisadores,
baixa tolerância a altas concentrações de solventes orgânicos, a pouca
disponibilidade e baixa pureza das enzimas, impactando negativamente no custo.
Assim, a imobilização da enzima é um método amplamente utilizado para o melhora-
mento da estabilidade enzimática e para a recuperação do biocatalisador, sendo
ambos fatores cruciais para a viabilidade econômica do processo. As vantagens da
imobilização são ainda maiores quando esses biocatalisadores são utilizados em
3
regime contínuo (TRUPPO et al., 2012; TUFVESSON et al., 2015).
Nos últimos anos, a tecnologia de fluxo contínuo tem recebido amplo
reconhecimento como uma interessante ferramenta para a produção de fármacos e
agroquímicos nos moldes do que foi estabelecido como química verde. Desde 2007,
quando o Green Chemistry Institute, parte da American Chemical Society, classificou
o processamento por fluxo contínuo como uma área primária para as atividades de
pesquisa na indústria farmacêutica e de química fina, muitos processos industriais
foram desenvolvidos para uso desta tecnologia. Isso porque reatores de fluxo contínuo
permitem um melhor controle do processo, tornando a reação mais eficiente e,
consequentemente, evitando o desperdício. Assim, a reação em fluxo contínuo tem
se tornado uma importante tecnologia facilitando o uso de enzimas imobilizadas para
produção industrial de, entre outros importantes compostos, aminas quirais
enantiomericamente puras (LEY, 2012; WILES; WATTS, 2012).
1.1 Biocatálise em fluxo contínuo A velocidade no desenvolvimento de processos é um fator essencial na indús-
tria química e farmacêutica. Nesse contexto, a miniaturização possibilita a aceleração
no desenvolvimento, minimizando custos por meio da diminuição da demanda de
substratos dispendiosos e permitindo que diferentes experimentos possam ser
realizados em paralelo (KRÜHNE et al., 2014; TAMBORINI et al., 2017).
Entretanto, existem fatores a serem considerados durante o escalonamento
desses processos, já que sistemas enzimáticos em batelada, quando conduzidos em
larga escala, frequentemente sofrem com cisalhamento das partículas, no caso de
biocatalisadores imobilizados, pela agitação nos reatores ou inativação pela alta
concentração de substrato/produto. Além disso, a quantidade de partículas sólidas
que um reator de batelada consegue lidar é limitada (TUFVESSON et al., 2010). Esses
fatores podem ser facilmente evitados em sistemas contínuos, uma vez que não
apresentam agitação mecânica e o contato do composto inibidor com a enzima é
reduzido devido ao constante bombeamento da solução para fora do reator. O escalo-
4
namento pode ser alcançado aumentando o volume do reator ou utilizando vários
reatores em paralelo (WEGNER et al., 2012).
De maneira geral, os processos contínuos biocatalisados podem ser classi-
ficados em 2 tipos (figura 2): No primeiro tipo de processo, os reagentes serão
bombeados juntos de um catalisador homogêneo através de sistemas tubulares até
uma coluna ou reator helicoidal. Então, no fim do reator, o produto é coletado,
incluindo o biocatalisador, possíveis subprodutos e substratos que não sofreram
alterações. Assim, uma etapa de separação do catalisador e possíveis subprodutos
será necessária. No segundo tipo de processo contínuo, o reator é preenchido com o
biocatalisador imobilizado enquanto os reagentes fluem através da coluna. Nesse
caso, nenhuma etapa de separação do catalisador é necessária. Além disso, o reuso
do catalisador é possível, tornando esse processo ainda menos dispendioso e mais
adequado aos preceitos da química verde (PORTA et al., 2016; THOMAS et al., 2017;
TSUBOGO et al., 2015; URBAN et al., 2006).
Figura 2. Esquema geral de sistemas de fluxo contínuo utilizados em diferentes processos biocatalisados.
5
Dependendo do tipo de reator, o volume de operação pode variar de 15 nL a
1L. Assim, a nomenclatura para cada volume de trabalho é dada de acordo com a
escala mostrada na tabela 1 (ITABAIANA et al., 2013; DE SOUZA; MIRANDA, 2014).
Tabela 1. Nomenclatura de reatores contínuos segundo seu volume de operação.
Nomenclatura Volume Nano 15 nL – 10 μL
Micro 10μL – 100μL
Mini 50 μL – 200 μL Meso 100 μL – 10mL
Macro 10 mL – 1L
Diferente do sistema em batelada (no qual o tempo de reação é definido pela
duração na qual a solução é mantida agitando a determinada temperatura), em um
sistema contínuo, o tempo de reação depende da vazão e do volume do reator. Visto
que o meio reacional é bombeado através do reator onde a transformação dos
substratos acontecerá, o tempo de reação é dado pelo período em que a solução
passa pelo interior do reator e é chamado de tempo de residência (Tr). Assim, Tr é
calculado pela razão entre volume total do reator dividido pela velocidade de fluxo com
qual a solução é bombeada (figura 3) (PLUTSCHACK et al., 2017; WEGNER et al.,
2012).
Figura 3. Tempo de residência.
6
Atualmente, existem diversos tipos de reatores de fluxo contínuo disponíveis
para processos biocatalisados, como reatores de membrana, reatores helicoidais,
microrreatores, reatores de leito fluidizado e reatores de leito fixo, sendo este último
indubitavelmente mais comum (BRENNA et al., 2017; GRUBER et al., 2017;
JAKOVETIĆ et al., 2013; LONG et al., 2005; SÁNCHEZ et al., 2000; XI; XU, 2005).
Em um reator de leito fixo (RLF), que consiste geralmente de uma coluna
cilíndrica preenchida com o biocatalisador, as partículas têm a sua movimentação
restringida. Desse modo, a(s) solução(ões) contendo os substratos pode(m) ser
bombeada(s) para dentro do reator pela parte inferior ou superior da coluna.
Além do baixo custo de produção, facilidade de operação e a alta performance,
esse tipo de reator oferece diversas vantagens. Uma vantagem em relação aos
reatores de batelada é o menor espaço deixado entre as partículas (34% para reatores
de leito fixo e 80-90% para reatores de batelada) (Woodley et al., 1994apudCSAJÁGI
et al., 2008). Assim, a alta concentração do catalisador combinada com a eficiente
transferência de massa no interior do reator leva a tempos de reação menores
(KAMBLE; YADAV, 2017; PLUTSCHACK et al., 2017).
Neste contexto, um fator que deve ser levado em consideração ao utilizar um
reator de leito fixo é o tamanho da partícula do biocatalisador, já que partículas
demasiado pequenas podem aumentar a contrapressão ou entupir a coluna,
impossibilitando a passagem do meio reacional. Por outro lado, partículas grandes
demais podem levar a baixas conversões, considerando que a reação frequentemente
acontece na superfície do biocatalisador (CHUA; SARMIDI, 2004).
Assim, a imobilização da enzima é também um fator extremamente importante
a ser considerado, de modo que um suporte deve apresentar algumas características,
entre as quais: estabilidade térmica e química, grupos funcionais suficientes para a
ligação, facilidade de regeneração e resistência mecânica. O tipo de ligação ao
suporte pode influenciar a estabilidade da enzima e reduzir a lixiviação, ainda que a
lixiviação em fluxo contínuo seja muito menor que em batelada (BOROS et al., 2013;
KUREK et al., 2017; SILVA et al., 2015; DE SOUZA et al., 2016).
7
Apesar das diversas vantagens advindas do uso de sistemas contínuos
comparado à batelada, como a maior eficiência energética e um menor número de
operações no isolamento do produto, no que concerne à taxa de reação (r), compa-
rações entre processos em fluxo contínuo e batelada podem ser feitas apenas em
valores de conversão próximos. Isso porque, em fluxo contínuo, a concentração subs-
trato/produto na saída do reator é constante, enquanto em batelada a concentração
substrato/produto muda no decorrer da reação, dificultando uma comparação direta.
(BOROS et al., 2013; CSAJÁGI et al., 2008; KAMBLE; YADAV, 2017; DE SOUZA;
MIRANDA, 2014; TAMBORINI et al., 2017)
De maneira geral, a taxa específica de reação (rfluxo) em sistemas contínuos
pode ser calculada segundo a equação 1 e é frequentemente expressa em
mmol min-1
gbiocatalisador
-1. Quando possível, a comparação pode ser feita conside-
rando a taxa específica de reação para processos em batelada, através da equação
2. (CSAJÁGI et al., 2008)
!"#$%& =[P] × f
m./&0121#/314&5
Equação 1. Onde a [P] é a concentração de produto deixando o reator
(frequentemente expresso em mmol mL-1
), f é a vazão (podendo ser expresso em mL
min-1
) e m, a massa do biocatalisador (em g).
!.126#141 =78 × t
m./&0121#/314&5
Equação 2. onde a np é a quantidade de produto (frequentemente expresso em
mmol), t é o tempo (em min) e m, a massa do biocatalisador (em g).
8
1.2 Transaminases Em um organismo, as transaminases (E.C. 2.6.1.x, também conhecidas como
aminotransferases) são responsáveis pela produção e degradação de aminoácidos.
Esses compostos possuem um papel fundamental no organismo e, por isso, não
surpreende sua importância para a indústria farmacêutica (MCMURRY; BEGLEY,
2005).
O interesse entre pesquisadores sobre o papel da transaminação em reações
metabólicas despertou quando, em 1939, Braunstein et al. demostraram pela primeira
vez a reação de transaminação através da transferência de um grupamento amino
entre um doador aminoácido e um aceptor α-cetoácido utilizando um tecido animal.
Desde então, esse grupo de enzimas vem sendo amplamente estudado devido ao seu
papel biológico. (BRAUNSTEIN, 1939; BRAUNSTEIN; KRITZMANN, 1937)
Embora as transaminases tenham sido descobertas há aproximadamente 60
anos, seu uso para a síntese de substratos não-naturais tem aumentado conside-
ravelmente nos últimos 15 anos. Essas enzimas catalisam a síntese de aminoácidos
quirais por resolução cinética ou por uma síntese assimétrica. No caso de uma
resolução cinética catalisada por transaminases, a reação resulta em um aminoácido
enantiomericamente puro e um cetoácido. Um grupo de transaminases ainda mais
interessante é composto por enzimas capazes de reconhecer substratos sem
qualquer grupo carboxílico (como aminas), as chamadas ω-transaminases (ω-TA)
(HÖHNE; BORNSCHEUER, 2012; PARK et al., 2010).
Como dito anteriormente, a resolução cinética possui um rendimento máximo
teórico de 50%, o que torna a síntese assimétrica mais interessante, pois através
dessa é possível obter o produto com máximo rendimento. No entanto, esse tipo de
reação necessita de técnicas de deslocamento do equilíbrio, visto que o equilíbrio
termodinâmico está deslocado para a formação do substrato. Além disso, uma
desracemização também é possível, sendo uma abordagem útil quando o substrato
pró-estereogênico não está prontamente disponível. Para isso, no caso de aminas,
uma cetona gerada em uma resolução cinética pode ser subsequentemente usada
9
como substrato em uma síntese assimétrica empregando uma ω-TA de seletividade
oposta (Esquema 1). (FUCHS et al., 2015; GHISLIERI; TURNER, 2014; HÖHNE;
BORNSCHEUER, 2012)
Esquema 1. Estratégias para uso de TAs para a síntese de aminas enantiomericamente puras.
1.2.1 Mecanismo de reação. Conceitualmente, uma transaminação biocatalisada é o processo pelo qual
uma amina/aminoácido reagirá com uma cetona/cetoácido para permutarem seus
grupos funcionais mediados por uma transaminase. O mecanismo pelo qual a reação
ocorre é bem conhecido. E embora transaminases diferentes possam apresentar
R1 R2
NH2
R1 R2
NH2
R1 R2
O+
piruvato alanina~50%
(R)-transaminase
R1 R2
O
R1 R2
NH2
alanina piruvato>99%
(R)-transaminase
Resolução cinética
Síntese assimétrica
R1 R2
NH2
R1 R2
NH2
R1 R2
O
+
piruvato alanina
(R)-transaminase
Desracemização
(S)-transaminase
piruvato alanina
10
diferentes especificidades em relação ao substrato, o mecanismo se mantém o
mesmo (CASSIMJEE et al., 2015).
Podemos dizer que esse mecanismo ocorre em duas etapas principais:
Na primeira etapa (esquema 2), um doador amino, como o (S)-feniletilamina,
reage com o piridoxal fosfato (PLP), que está reversivelmente ligado à enzima através
de uma Base de Schiff (E-PLP), por uma adição nucleofílica do seu grupamento –NH
na ligação C=N da imina, gerando um intermediário piridoxamina ligado à enzima e a
cetona correspondente, nesse caso, a acetofenona. Então, na segunda etapa
(esquema 3), um segundo substrato carbonilado (aqui usado o piruvato), entra no sítio
ativo onde recebe um grupamento amino transferido do fosfato de piridoxamina (PMP)
ligado à enzima, produzindo o produto amino correspondente (alanina) e regenerando
o cofator piridoxal fosfato para um outro ciclo catalítico.
Esquema 2. Primeira etapa do mecanismo da reação catalisada por transaminases.
11
Esquema 3. Segunda etapa do mecanismo da reação catalisada por transaminases.
1.2.2 Engenharia de proteínas na obtenção de novas transaminases Apesar das vantagens na utilização de TAs para a produção de aminas
quirais, transaminases provenientes de cepas selvagens podem não apresentar as
características ideais para o processo desejado. Nesses casos, técnicas de
engenharia de proteína como mutagênese sítio-dirigida e evolução direcionada podem
ser empregadas para obtenção de enzimas com as características necessárias.
Quando a estrutura tridimensional da proteína é conhecida, é possível através da
mutagênese sítio dirigida modificar a estrutura da enzima para melhorar a
especificidade pelo substrato/cofator, a enantiosseletividade e estabilidade. Por outro
lado, se a estrutura de raios X do cristal da proteína não está prontamente disponível,
a evolução direcionada pode ser utilizada para obtenção de uma biblioteca genética
de mutagênese aleatória e triagem das enzimas mutantes que apresentem essas
características (HÖHNE et al., 2010).
Um dos objetivos mais comuns na engenharia de proteínas é a melhora da
estabilidade da enzima e especificidade pelo substrato. Para isso, uma abordagem
amplamente utilizada baseada no método de evolução direcionada é a reação em
cadeia da polimerase propensa a erros (error-prone PCR ou epPCR), que introduz
12
mutações aleatórias em um segmento de ADN. Por exemplo, a termoestabilidade da
transaminase de Arthrobacter citreus foi melhorada e, após 6 rodadas de mutagênese
aleatória, a temperatura ótima passou de 30 ºC para 55 ºC, o que pode facilitar a
remoção de um coproduto volátil e ajudar no deslocamento do equilíbrio. A produ-
tividade também aumentou em 260 vezes, partindo de 5,9 para 1582,8 Ug-1
na produ-
ção da (S)-aminotetralina (CERIOLI et al., 2015; CHO et al., 2006, 2008; HWANG et
al., 2008; HWANG; KIM, 2004; MARTIN; DISANTO; et al., 2007).
Através da mesma abordagem, mutantes da ω-transaminase de Vibrio
fluvialis JS17 foram obtidas a partir de mutagênese aleatória para superar a inibição
por cetonas alifáticas, subprodutos de reações de resolução cinética de aminas
quirais. A variante apresentou atividade duas vezes maior frente a aminas alifáticas
de cadeia longa em relação à enzima selvagem, ainda que as atividades das duas
enzimas tenham sido equivalentes para aminas alifáticas de cadeia curta e aminas
aromáticas. A inibição pelo produto também foi evitada na síntese assimétrica do 2-
amino-1-metoxipropano com o uso de uma ω-transaminase obtida por evolução
direcionada. Com a variante mutante foi possível melhorar a conversão de 12% para
65%, sem a necessidade de deslocamento do equilíbrio. Após outras etapas de
evolução direcionada, variantes com melhor estabilidade química e térmica foram
obtidas. Desse modo, a acetona formada pode ser retirada do meio a 50ºC sob
pressão reduzida. Finalmente, o produto (S)-2-amino-1-metoxipropano foi obtido com
93% de rendimento e >99% de excesso enantiomérico após 7 h de reação (YUN et
al., 2005).
Com os mesmos objetivos, a mutagênese sítio dirigida se mostra um método
mais eficiente, eliminando etapas de mutagênese necessárias na evolução
direcionada, além de ter maior especificidade em relação ao processo. Para isso, o
conhecimento da estrutura do sítio ativo da enzima é necessário.
Em 2002, foi observado que o sítio ativo das transaminases é composto por
duas cavidades de tamanhos diferentes. O reconhecimento do substrato depende
então da acomodação nessas duas cavidades, considerando que, além da diferença
13
de tamanho, a cavidade menor possui uma repulsão eletrostática pelo grupo
carboxílico do substrato cetona. Na transaminase de Vibrio fluvialis, por exemplo, os
resíduos triptofano W57 e W147 na cavidade menor maior do sítio ativo são
responsáveis pela baixa promiscuidade da enzima. Sendo assim, a atividade para
substratos maiores que uma metila aumentou consideravelmente quando o triptofano
foi substituído por glicina (CHO et al., 2008; SHIN; KIM, 2002).
Um resultado ainda mais interessante foi observado por Skalden et al. (2015)
que mostrou como a alteração de um único resíduo de aminoácido no sítio ativo pode
modificar até mesmo a enantiopreferência da enzima. O grupo investigava a produção
dos diferentes diasteroisômeros do 1-amino-3-metilciclohexano através de uma
reação em cascata envolvendo um enoato redutase e uma transaminase de Vibrio
fluvialis (Esquema 4). A reação catalisada pela enoato redutase anterior à etapa de
transaminação produz apenas o enantiômero de configuração (S) com alta
seletividade (>99%). Entretando, a transaminase de V. fluvialis apresentou baixa
seletividade e o diasteroisômero de configuração (1R, 3S) foi produzido com apenas
14% de. Assim, durante o exame da estrutura do sítio catalítico da transaminase foi
identificado que uma mudança no resíduo aminoácido Leu56 poderia ter impacto na
enantiosseletividade. Após a alteração de leucina para valina (Leu56Val), um aumento
na seletividade foi observado e o diasteroisômero (1R, 3S) foi obtido com 66% de.
Entretanto, quando a leucina foi alterada para isoleucina (Leu56Ile), a reação catali-
sada pela variante converteu a cetona com preferência contrária (1S, 3S) com 70%
de (SKALDEN et al., 2015).
Esquema 4. Esquema adaptado da reação realizada por Skalden et al. (2015).
O O
Enoato redutase
NH2
13
NH2
+ω-transaminase
NADPH Alanina
(1R, 3S) (1S, 3S)
14
Recentemente, a incorporação de aminoácidos não-canônicos na estrutura da
enzima foi utilizada para melhorar a estabilidade de uma ω-TA de Sphaerobacter
thermophilus e permitir imobilização sítio-específica em quitosana. Para isso, o
aminoácido prolina foi substituído por uma (4R)-fluoroprolina (FP), por conferir um
efeito estabilizador, e uma L-3,4-diidroxifenilalanina (dopa) foi incorporada para
auxiliar na imobilização. Além de melhorar consideravelmente a termoestabilidade da
enzima (tabela 2), após imobilização, as variantes puderam ser utilizadas por até 10
ciclos na resolução cinética de aminas quirais. (DEEPANKUMAR et al., 2015)
Tabela 2. Meia-vida de ω-TAs modificadas a diferentes temperaturas (DEEPANKURMAR et al., 2015)
Biocatalisador Modificação 50ºC (h) 60ºC (h) 70ºC (h) ω-TA -- 19,5 8,1 2,2
ω-TA[(4R)-FP] Prolina substituída por (4R)-FP 31,0 11,5 4,5
ω-TAdopa Adição do aminoácido dopa. 19,4 7,5 2,1
ω-TAdp[(4R)-FP]
Substituição da prolina por
(4R)-FP e adição de dopa
29,5 11,0 4,4
Um exemplo proeminente da aplicação da tecnologia de mutagênese sítio
dirigida é a evolução de uma (R)-ω-TA para a síntese assimétrica da sitagliptina
(esquema 5), um inibidor da dipeptidil-peptidase IV utilizado no tratamento da diabetes
(JARVIS et al., 2010). Após 27 alterações no sítio ativo da ω-TA de Arthrobacter sp, a
variante foi capaz de converter a cetona da sitagliptina com rendimento de 92% e alta
pureza enantiomérica. Esse feito é bastante notável visto que a maioria das
transaminases não aceitam grupamentos maiores que uma metila na posição
adjacente à carbonila (NOBILI et al., 2015). Além da melhor tolerância a solventes
orgânicos e alta concentração de isopropilamina, quando comparado à síntese
química tradicional da sitagliptina, que envolve um catalisador quiral de ródio, o
processo utilizando a enzima mutante teve rendimento 13% maior e reduziu o
desperdício total em 19%.
15
Esquema 5. Síntese da sitagliptina por uma ω-TA mutante produzida por Jarvis et al. (2010)
1.2.3 Transaminases na síntese de aminas quirais Até pouco tempo, dois fatores impediam o uso de transaminases para
biotransformação de substratos não naturais: A pouca disponibilidade de
transaminases ativas com substratos diferentes de α-ceto/α-aminoácidos e a carência
de estratégias para o deslocamento do equilíbrio da reação em direção à formação do
produto, no caso de aminas quirais.
Com o advento de novas técnicas e metodologias para a solução desses
problemas, as transaminases têm se tornado cada vez mais importantes na síntese
de aminas enantiomericamente puras.
As transaminases foram aplicadas pela primeira vez na síntese de aminas
quirais no final da década de 80 por pesquisadores da companhia americana Celgene
Co., que desenvolveram transaminases (R)- e (S)-específicas para produção de
diferentes aminas e cetonas por resolução cinética e síntese assimétrica (Figura 5). A
Celgene demostrou ainda a resolução cinética de aminas na escala de 2,5 m3, embora
tenha apresentado problemas com a inibição da enzima por ambos os substratos
cetona e amina. Além disso, baixas concentrações dos produtos foram obtidas quando
substratos hidrofóbicos foram empregados, visto que a reação ocorria em meio
aquoso (STIRLING et al., 1990, 1992).
16
Figura 4. Síntese de aminas quirais catalisada por ω-TAs realizadas pela empresa Celgene.
Recentemente, transaminases de Arthrobacter sp., Aspergillus terreus e
Chromobacterium violaceum foram identificadas como capazes de converter cetonas
propargílicas aos seus correspondentes aminados (esquema 6). Aminas propargílicas
são importantes blocos de construção para a síntese orgânica, utilizadas na prepa-
ração de heterocíclicos contendo nitrogênio, como 2-aminoimidazóis, oxazolidinonas,
pirimidinonas e triazóis. Embora esses compostos tenham sido relatados como
inibidores irreversíveis de transaminases, as enzimas identificadas foram capazes de
realizar a síntese assimétrica de aminas propargílicas aromáticas com excelente
conversão e excesso enantiomérico. Outras ω-TAs reconhecidas pela ampla
tolerância a substratos, como de Bacillus megaterium, Paracoccus denitrificans,
Pseudomonas putida, Vibrio fluvialis e Arthrobacter citreus, também foram testadas,
porém não foram capazes de transformar o substrato. Foi possível notar que para
substratos suportando grupos doadores de elétrons na posição meta e para a
R1 R2
NH2+ O
R1 R2
NH2
R1 R2
ONH2(S)-TA + +
1) Resolução cinética
2) Síntese assimétrica
R1 R2
O NH2+ (S)-TA
R1 R2
NH2 O+
NH2
X
NNH2NH2
MeO
O
NH2
NR3H2N
OR3
NH2OX
17
conversão foi maior que 90%. Enquanto que substratos portando grupos retiradores
de elétrons no anel aromático obtiveram baixa conversão para todas as TAs utilizadas
(SCHMIDT et al., 2015b).
Esquema 6. Síntese assimétrica de aminas propargílicas. (SCHMIDT et al., 2015b)
O intermediário da pró-droga silodosina, utilizada no tratamento da hiperplasia
benigna da próstata, também foi obtido através de aminação redutiva assimétrica
biocatalisada (esquema 7). Um sistema para reciclo do piruvato utilizando uma alanina
desidrogenase foi empregado e diferentes enzimas foram testadas. O melhor
resultado foi obtido quando a ω-TA de Arthrobacter sp. foi utilizada, levando à
conversão maior que 97% e alta pureza enantiomérica, com mais 97% do enantiomêro
(R). Um outro resultado interessante foi obtido pela ω-TA de Pseudomonas
fluorescens, com conversão de 84% e 97% de excesso do enantiômero (S), embora
a silodosina utilizada pela indústria farmacêutica possua configuração (R). (SIMON et
al., 2014)
Esquema 7. Síntese do intermediário da silodosina.
O
R
(R)- ou (S)-TATampão, pH 7
PLP, 30ºC, 24h
Alanina Piruvato
NH4COOHCO2 H2O+
R: H, p-Me, p-MeO, m-MeO, p-CF3 ou p-Br
NH2
R
AlaDH, FDH
O
(R)-TATampão, pH 7
PLP, 30ºC, 24h10% DMSO
Alanina Piruvato
N
R CN
NH2N
R CN
(reciclo/remoção)
18
Um exemplo interessante aplicado a síntese de fármaco é a síntese do (R)-
2,3,4,9-tetra-hidro-1H-carbazol-3-amina, um intermediário chave para a síntese da
droga antialérgica ramatroban realizada por BUSTO et al., (2014) (esquema 8).
Apenas uma etapa foi necessária para alcançar a amina alvo ao utilizar uma ω-
transaminase como biocatalisador, ao passo que, por via química, 3 etapas seriam
necessárias, segundo trabalhos anteriores. O grupo utilizou uma transaminase de
Arthrobacter evoluída para reconhecer cetonas impedidas estericamente, uma vez
que transaminases provenientes de cepas selvagens não aceitam grupamentos
volumosos. Além disso, a mutante possui alta termoestabilidade comparada à
selvagem, tornando possível o uso de isopropilamina como doador amino e a
consequente evaporação do produto acetona formado. Entretanto, os pesquisadores
notaram ainda que a isopropilamina acabou sendo prejudicial à cetona precursora
levando à formação de vários subprodutos. Sendo assim, o doador amino empregado
foi o (R)-1-feniletilamina. A reação biocatalisada foi completada em 4 h e teve
rendimento de 96% e 97% de excesso enantiomérico usando a enzima alterada por
biologia molecular.
Esquema 8. Síntese assimétrica do intermediário do ramatroban por BUSTO et al. (2014).
(R)-TATampão, pH 7
PLP, 30ºC, 24h
Alanina Piruvato
NH4COOHCO2 H2O+AlaDH, FDH
NH
O
NH
NH2
19
1.2.4 Resolução cinética catalisada por transaminases A resolução cinética catalisada por TAs apresenta algumas vantagens em
relação a síntese assimétrica, como o equilíbrio termodinâmico favorável à formação
do produto, a não necessidade de outras enzimas e a facilidade de aplicação.
Consequentemente, esse tipo de reação já é extensamente estudado e utilizado na
produção de uma série de compostos utilizando enzimas imobilizadas, livres ou
células íntegras (HÖHNE; ROBINS; et al., 2008; KOSZELEWSKI et al., 2010; MALLIN;
MENYES; VORHABEN; HÖHNE, 2013; SHIN; KIM, 2001; TRUPPO et al., 2012).
A resolução cinética catalisada por TAs foi eficiente mesmo em larga escala,
como demostrado por Hanson et al., (2008), que empregaram células de E. coli
expressando uma transaminase (S)-seletiva de Bacillum megaterium SC6394 para
resolver cineticamente 750g de sec-butilamina (0,684 mol L-1
). A amina de
configuração (R) foi obtida com rendimento isolado de 46,6% e excesso enantiomérico
maior que 99%.
Entretanto, além do rendimento máximo limitado a 50%, essas reações sofrem
frequentemente com inibição pelo produto e, desse modo, apesar das vantagens
supracitadas, esses obstáculos podem tornar essa abordagem um pouco menos
interessante.
A inibição pelo produto é uma propriedade intrínseca das transaminases devido
o mecanismo pelo qual a reação acontece. A inibição geralmente resulta de um co-
produto cetona no meio, embora outros produtos carbonilados possam provocar o
mesmo efeito. Por exemplo, ao utilizar (RS)-1-feniletilamina ou até mesmo
benzilamina como doador amino, a enzima pode sofrer inibição pelo co-produto
acetofenona, no caso da (RS)-1-feniletilamina, ou benzaldeído, no caso da
benzilamina, formados no meio (SHIN; KIM, 1997, 2009).
A utilização de um sistema bifásico foi a primeira metodologia utilizada para
superar esse obstáculo apresentada por Shin e Kim (1997) na resolução cinética da
(RS)-1-feniletilamina catalisada por células de B. thuringiensis JS64 (esquema 9).
Após o teste de diversos solventes, um sistema cicloexanona/água (20% v/v) foi esco-
20
lhido. A fase orgânica seria responsável por extrair o produto inibidor do meio aquoso,
além de funcionar como reservatório do substrato α-metilbenzilamina. Considerando
que a (RS)-1-feniletilamina forma uma imina com a cicloexanona, o substrato é libe-
rado para o meio aquoso conforme a reação de resolução cinética prossegue de modo
a garantir um equilíbrio. O piruvato e a L-alanina, por outro lado, se mantêm no meio
aquoso devido a efeitos de carga em pH neutro. Com esse sistema foi possível reduzir
drasticamente a inibição pelo produto e, após 18h, 51,2% de conversão e 95,4% ee
foram alcançados.
Esquema 9. Esquema da reação no modelo bifásico. Adaptado de Shin e Kim (1997).
Os autores descreveram ainda a inibição enzimática devido o contato da
enzima com a fase orgânica, já que para manter o produto inibidor em baixa
concentração em meio aquoso, grande quantidade de solvente orgânico foi utilizada.
Posteriormente, reatores de membrana e reatores de leito fixo foram eficientemente
utilizados para evitar essa inibição pelo contato com fase orgânica.(SHIN, J. S. et al.,
2001; SHIN, J. S. et al., 2001)
Alternativamente, Bea et al., (2010) transformaram o produto inibidor
acetofenona em 1-feniletanol utilizando a oxirredutase endógena de células de Pichia
pastoris GS115 expressando o gene de ω-TA de V. fluvialis JS17. Com esse sistema
foi possível obter a (R)-1-feniletilamina com 52,2% de conversão e excesso enantio-
21
mérico maior que 99% após 6h de reação.
O reciclo do substrato piruvato também pode ser desejável como uma maneira
de tornar o processo mais barato em larga escala. Ademais, o piruvato também pode
atuar inibindo a enzima. Desse modo, um exemplo interessante é o trabalho realizado
por Truppo et al., (2009) com a utilização de uma aminoácido oxidase (AAO) para
reciclar in situ o piruvato adicionado em quantidade catalítica (8 mol%) na presença
de oxigênio molecular. Assim, duas transaminases de seletividades diferentes (ATA-
117, (R)-seletiva, e ATA-113, (S)-seletiva) foram utilizadas alternativamente para a
produção de diferentes aminas aromáticas com máxima conversão e alta pureza
enantiomérica para ambos os enantiômeros em apenas 1 hora (figura 6). Por outro
lado, uma reação controle, onde a AAO não foi empregada, produziu apenas 7,5% do
produto e 8% ee na resolução cinética da feniletilamina.
Figura 5. Aminas obtidas com o sistema de reciclo do piruvato por uma aminoácido oxidase. (TRUPPO et al., 2009)
Outra abordagem para a reutilização do piruvato é a co-expressão de uma ω-
transaminase e uma α-transaminase em uma mesma célula para catalisar a produção
concomitante de aminas e aminoácidos quirais (esquema 10). Nesse caso, o piruvato
22
formado na reação de síntese assimétrica do aminoácido é utilizado como aceptor do
grupamento amino em uma resolução cinética de uma amina quiral. Com esse
sistema, três pares de reações acopladas, como AlaninaTA/ω-TA, TirosinaTA/ω-TA,
e AspartatoTA/ω-TA foram aplicados para a produção de (S)-aminoácidos tais como
(S)-fenilalanina, (S)-homofenilalanina e (S)-aspartato (CHO et al., 2003).
Esquema 10. Síntese simultânea de (S)-aminoácidos e (R)-aminas com acoplamento de α- e ω-TAs. (A) sistema AlaTA/ω-TAs. (B) sistemas TyrTA/ω-TA e AspTA/ω-TAs. Adaptado de Cho et al (2003).
1.2.5 Síntese assimétrica catalisada por transaminases Como dito anteriormente, em uma síntese assimétrica catalisada por
transaminases, um cetoácido reage com um aminoácido intercambiando seus grupos
funcionais. Se uma ω-transaminase é empregada, uma cetona pró-quiral pode ser
usada como substrato para reagir com um doador amino gerando uma amina
enantiomericamente pura.
Durante muito tempo, a síntese assimétrica biocatalisada era inviável. Nesse
tipo de reação, os efeitos de ressonância de elétrons tornam o substrato cetona muito
23
mais estável do que o produto amina, deslocando o equilíbrio da reação em direção
ao substrato. Além disso, a enzima poderia ainda sofrer inibição pelo produto. Por
exemplo, na produção da (S)-1-feniletilamina, utilizando acetofenona e L-alanina,
além da limitação termodinâmica, os produtos (S)-1-feniletilamina e piruvato são muito
mais reativos do que a acetofenona e a L-alanina (esquema 11). Isso sugere que uma
maior inibição pelo produto ocorra na reação entre a acetofenona e a L-alanina do que
entre os produtos cetona e amina correspondentes. No entanto, diversas estratégias
vêm sendo desenvolvidas para superar esse problema (SHIN; KIM, 1998, 1999).
Esquema 11. Reação entre a acetofenona e L-alanina catalisada por uma (S)-TA.
Na síntese da sitagliptina, por exemplo, Jarvis et al. (2010) utilizaram a
isopropilamina como doador amino. Nesse caso, a reação foi realizada a 45ºC
permitindo que a acetona formada fosse destilada do meio sob vácuo. Essa
abordagem, entretanto, encontra dificuldades na sua aplicação em larga escala, onde
a destilação nem sempre é possível, além da alta temperatura requerer enzimas
termoestáveis.
Ao longo dos anos outras metodologias para o deslocamento do equilíbrio e
diminuição da inibição de atividade pelo produto foram desenvolvidas, como a
utilização de resinas de troca iônica, para remoção in situ do produto formado, e o uso
de doadores amino cujo produto formado sofre transformações espontâneas (GREEN
et al., 2014; TRUPPO et al., 2010).
Uma outra abordagem para deslocamento do equilíbrio da reação é a utilização
de uma outra enzima que converta irreversivelmente um dos produtos formados
(esquema 12). Por exemplo, a utilização de uma lactato desidrogenase, que converte
24
o piruvato formado quando a alanina é usada como doador amino em acido lático.
Entretanto, a lactato desidrogenase reduz o piruvato enquanto oxida concomitan-
temente o cofator NADH a NAD+. Por isso, um sistema de regeneração do cofator se
faz necessário e, para esse fim, uma glicose desidrogenase ou uma formato
desidrogenase podem ser utilizadas (KOSZELEWSKI; LAVANDERA; CLAY;
ROZZELL; et al., 2008).
Esquema 12. Estratégias para o deslocamento do equilíbrio.
Alternativamente, quando a alanina é o doador amino escolhido, outra enzima
utilizada é a piruvato descarboxilase, produzindo acetaldeído e CO2 que podem ser
facilmente removidos do meio. Quando comparado ao uso de um lactato
desidrogenase, o uso da piruvato descarboxilase oferece maior vantagem por
dispensar a adição de cofatores e produzir compostos voláteis. De mesmo modo, uma
acetolactato sintase pode ser utilizada convertendo o piruvato em acetoína e CO2.
(HÖHNE; KÜHL; et al., 2008; YUN; KIM, 2008)
Uma alanina desidrogenase também pode ser empregada para reciclar o
piruvato, transformando-o de volta em alanina, um sistema particularmente
R1 R2
O
R1 R2
NH2
R3
NH2
R3
O
NH3Alanina desidrogenase
H2O
ω-TA
(R3 = COOH)
(R3 = COOH)
(R3 = COOH)
(R3= arila, alquila)
Lactato desidrogenase
Piruvato descarboxilase
Álcool desidrogenase
Acetolactato sintase(R3 = COOH)
COOH
OH
H
O+ CO2
R3
O
OH
O
+ CO2
25
interessante por permitir a adição de alanina em quantidade catalítica. Neste caso,
amônia é utilizada como fonte amino para o piruvato. Um sistema de regeneração do
cofator NADH é necessário e, para isso, o já mencionado sistema com uma FDH ou
GDH pode ser empregado. Essas enzimas serão responsáveis pela redução do NAD+
a NADH utilizando um agente redutor Formato ou Glicose. Esse sistema foi utilizado
pela primeira vez por Koszelewski et al. (2008), onde diversas cetonas pró-quirais
foram convertidas nas respectivas aminas com alta conversão e excesso
enantiomérico usando L-alanina como doador amino. Recentemente esse mesmo
sistema foi aplicado na síntese diversas aminas propagílicas e na síntese do
intermediário do fármaco Ramatroban (BUSTO; SIMON, ROBERT C; et al., 2014;
KOSZELEWSKI; LAVANDERA; CLAY; GUEBITZ; et al., 2008; SCHMIDT et al.,
2015a).
Finalmente, uma álcool desidrogenase (ADH) também pode ser utilizada para
transformar o produto cetona inibidor em um álcool. Esse sistema foi aproveitado por
Yun et al., (2003) para produzir (R)-1-feniletanol concomitante a produção da (R)-1-
feniletilamina. A ADH é uma enzima dependente de NADH e, por isso, um sistema de
reciclo de NADH através do acoplamento com uma glicose desidrogenase (GDH) foi
utilizado.
1.2.6 Processos quimio-enzimáticos envolvendo transaminases. Rotas quimio-enzimáticas podem ser um importante método para obtenção de
compostos complexos, reduzindo o impacto da síntese química tradicional e
realizando transformações para as quais não existem enzimas disponíveis (OLIVEIRA
et al., 2014; YURYEV et al., 2011). Um exemplo, é a síntese do suvorexant, um
antagonista duplo-seletivo dos receptores de orexina, usado no tratamento da insônia.
Após a produção do precursor ceto-éster através de etapas químicas, Mangion et al.
(2012) realizaram a transaminação do composto, utilizando a mesma transaminase
evoluída para reconhecer o precursor da sitagliptina, seguida de uma ciclização
espontânea. O resultado foi alcançado em 4 etapas eliminando o uso de solventes
26
halogenados e catalisadores de metais de transição utilizados na síntese tradicional
(esquema 13).
Esquema 13. Síntese quimio-enzimática do suvorexant com ciclização espontânea pós reação de transaminação.
Uma reação de resolução cinética dinâmica (RCD) foi realizada pela primeira
vez com uma transaminase por Koszelewski et al. (2009), aproveitando a racemização
espontânea do substrato para produzir a 4-fenil-2-pirrolidona enantiomericamente
pura. Após etapas químicas, o grupo obteve o derivado do ácido γ-aminobutanóico
(GABA), o 3-fenil-GABA, um aminoácido que atua no sistema nervoso (esquema 14).
Esquema 14. Resolução cinética dinâmica de um derivado do 3-fenil-GABA
27
Posteriormente, uma resolução cinética dinâmica também foi crucial para a
síntese de um inibidor do receptor SMO por Peng et al. (2014) utilizando um ω-TA
produzida pela Codexis. Um importante resultado foi obtido na formação de dois
centros estereogênicos, com configuração anti, em uma única etapa. A partir da
transaminação, mais duas etapas foram necessárias para alcançar o produto. No total,
foram necessárias apenas 5 etapas com rendimento de 40%.
Esquema 15. Síntese do inibidor da proteína smoothened através da resolução cinética dinâmica utilizando uma transaminase seguidas de etapas químicas
.
Outro exemplo de uma rota quimio-enzimática é a síntese da (S)-rivastigmina,
um potente inibidor da colinesterase utilizado para o tratamento do Mal de Alzheimer
e Parkinson, sintetizado por Fuchs et al. (2012). A reação ocorreu em apenas 4
etapas, sem necessidade de etapas de proteção, considerando que a ω-TA de
Paracoccus dentrificans foi capaz de converter o precursor suportando o farmacóforo
polar carbamato ligado ao grupo m-fenólico da molécula (esquema 16). (FUCHS et
al., 2012)
Esquema 16. Síntese quimio-enzimática da rivastigmina. (FUCHS et al., 2012)
28
1.2.7 Transaminases em fluxo contínuo Em 2001, Shin et al. demonstraram pela primeira vez uma reação catalisada
por transaminases em fluxo contínuo. O grupo utilizou um reator de membrana,
contendo o extrato de células de Bacillus theringiensis JS64 com atividade de
transaminase, de modo a superar a inibição da atividade enzimática ocasionada pela
utilização do sistema bifásico no trabalho já mencionado anteriormente. De 2001 até
os dias de hoje, a utilização de transaminases em fluxo contínuo ainda é escassa,
principalmente pela necessidade da adição do cofator PLP (SHIN, J.S. et al., 2001).
Destarte, em 2014, Andrade et al. utilizaram um reator de leito fixo preenchido
com células de E. coli expressando uma (R)-transaminase de Anthobacter sp.
imobilizadas junto do cofator PLP em resina polimérica de metacrilato. O sistema
contou ainda com um cartucho de sílica gel acoplado ao final do reator, de modo que
o produto amina ficasse retido e fosse separado continuamente dos demais
reagentes. Assim, o produto poderia ser recuperado posteriormente ao lavar o
cartucho de sílica gel com metanol. Diferentes aminas foram preparadas com bons
rendimentos e pureza enantiomérica, embora esses resultados tenham sido
alcançados somente após 5 dias de recirculação do meio reacional, devido a baixa
quantidade de biocatalisador utilizada (ANDRADE et al., 2014).
Em 2017, células de E. coli expressando ω-TAs foram imobilizadas em
LentiKats®, partículas de hidrogel em formato de disco, produzidas a partir da
secagem parcial em temperatura ambiente do álcool polivinílico (PVA). As células
imobilizadas foram empacotadas em um reator de leito-fixo miniaturizado
desenvolvido com placas de poli(metracrilato de metila) e o sistema foi aplicado na
síntese assimétrica utilizando acetofenona como aceptor amino. O sistema foi
utilizado por 21 dias mantendo mais de 80% da atividade inicial (BAJIĆ et al., 2017).
No mesmo ano, uma (S)-transaminase de Halomonas elongata foi utilizada
sem a necessidade de um sistema celular (PLANCHESTAINER et al., 2017). A enzima
foi imobilizada covalentemente em resina epóxi e o biocatalisador foi então
29
acondicionado em um reator de leito fixo. A imobilização conferiu a enzima maior
tolerância a solventes orgânicos e, em fluxo contínuo, apresentou uma produtividade
até 33 vezes maior do que na síntese assimétrica em batelada, com tempo reacional
diminuído de 24 h para 5 ciclos de 2 min. A mesma enzima foi utilizada posteriormente
para a oxidação de aminas a aldeídos em fluxo contínuo (CONTENTE et al., 2017).
1.3 Lipases No organismo, as lipases (EC 3.1.1.3) são responsáveis pela hidrólise de
triglicerídeos produzindo ácidos graxos e glicerol (esquema 17). Entretanto, sob
condições com baixo teor de água, a reação de esterificação acontece. Essas enzimas
são hoje as mais amplamente empregadas e estudadas tanto na indústria quanto na
academia (ITABAIANA et al., 2013; JUNIOR et al., 2012; S. DE MIRANDA et al., 2014;
DE SOUZA et al., 2015, 2016, 2017, 2018).
Esquema 17. Reação de hidrólise catalisada por lipases
Na indústria, lipases são utilizadas nos mais diversos setores para a produção
de medicamentos, cosméticos, polímeros, detergentes, biocombustíveis, além da
utilização em diagnósticos médicos e na indústria de alimentos. Espera-se que em
2020, o mercado de lipases movimente cerca de 590 milhões de dólares com uma
taxa de crescimento de 6,2% ao ano (DAIHA et al., 2015; SEDDIGI et al., 2017). Na
literatura, são empregadas em diferentes reações para a produção de uma ampla
variedade de compostos, dentre eles: aminas quirais enantiomericamente puras
30
(ALATORRE-SANTAMARÍA et al., 2008; KAMBLE; YADAV, 2017; VERDUGO et al.,
2011; YAO et al., 2011). Essas enzimas apresentam quimio, régio e enantios-
seletividade e catalisam a síntese de aminas opticamente ativas através da acilação
enantiosseletiva de aminas racêmicas em meio orgânico ou através da hidrólise de
amidas racêmicas em meio aquoso, embora esse último seja mais raro considerando
que longos tempos reacionais podem ser necessários nesse caso (BORNSCHEUER;
KAZLAUSKAS, 2006; GHISLIERI; TURNER, 2014; GOTOR-FERNÁNDEZ et al.,
2006).
1.3.1 Mecanismo de reações catalisadas por lipases Como dito anteriormente, embora o papel fundamental de lipases no organismo
seja a hidrólise de triglicerídeos, em condições com baixa concentração de água, a
reação de esterificação acontece. Assim como para as transaminases, a reação
acontece por um modelo de reação ping-pong bi bi. Isso quer dizer que o substrato
entra ordenadamente no sítio catalítico e é prontamente transformado em produto
(ping-pong) e que dois substratos darão dois produtos (bi bi) no final da reação.
Desse modo, o mecanismo de reações catalisadas por lipases tem a
participação de três resíduos de aminoácidos no sítio catalítico da enzima: A serina, a
histidina e o aspartato.
De maneira geral, o mecanismo se inicia com o ataque nucleofílico do resíduo
serina do sítio catalítico enzimático à carbonila do doador de acila, culminando na
formação do complexo acil-enzima. Posteriormente, o complexo sofre ataque do
nucleófilo (exemplo, a amina) resultando na formação do produto e regeneração da
enzima para um novo ciclo catalítico. O mecanismo é apresentado graficamente no
esquema abaixo.
31
Esquema 18. Mecanismo de reações catalisadas por lipases.
1.3.2 Resolução cinética catalisada por lipases para a produção de amina quirais enantiomericamente puras. Como já definido anteriormente para a resolução cinética catalisada por transa-
minases, em uma resolução cinética ideal apenas um dos enantiômeros reagirá
enquanto o outro permanecerá inalterado. Assim, em uma resolução cinética, a
pureza enantiomérica do produto e do substrato variam no decorrer da reação. E,
como citado anteriormente, essas reações possuem um rendimento máximo teórico
de 50% (BORNSCHEUER; KAZLAUSKAS, 2006; SEDDIGI et al., 2017).
No caso das lipases, para superar essa limitação, uma etapa de racemização
in situ é frequentemente aplicada. Esse processo é chamado resolução cinética
dinâmica (RCD). No entanto, apesar da possibilidade de 100% de rendimento em uma
RCD, os catalisadores utilizados para a etapa de racemização frequentemente sofrem
inativação devido a interação com a enzima ou outros reagentes presentes no meio
reacional. Em alguns casos, esses catalisadores podem interferir negativamente na
etapa de resolução cinética catalisada pela lipase. Assim, para a aplicação de uma
RCD, um estudo criterioso deve ser realizado para atender os parâmetros necessários
32
para a aplicação do processo (FABER, 2011; VERHO; BÄCKVALL, 2015).
Esquema 19. Resolução cinética e dinâmica catalisada por lipases.
A resolução cinética catalisada por lipases é uma abordagem amplamente
estudada para a síntese de aminas quirais enantiomericamente puras. Essa
abordagem vem sendo estudada desde 1997, quando a BASF utilizou a lipase de
Burkholderia plantarii para resolução cinética da 1-feniletilamina empregando
metoxiacetato de etila como agente acilante. A amina de configuração (S) que não
interagiu com a enzima foi recuperada com 99% de excesso enantiomérico, enquanto
a amina (R) foi obtida após hidrólise básica da amida resultante da reação de
resolução cinética (BALKENHOHL et al., 1997).
Esse tipo de reação possui diversas vantagens, como a facilidade de aplicação,
alta atividade e seletividade, permitindo o acesso a ambos os enantiômeros de um
mesmo substrato. Por mérito disso, nos últimos anos, lipases foram utilizadas para
resolver cineticamente diversas aminas quirais, dentre elas, biariletilaminas, α-
aminoésteres, heteroarilaminas, aminas contendo boro e arilalilaminas (ALATORRE-
SANTAMARIA et al., 2009; ALATORRE-SANTAMARÍA et al., 2008; ANDRADE et al.,
2010; KIM et al., 2013; KNEŽEVIĆ et al., 2011).
Frequentemente, parte-se do racemato da amina, uma vez que lipases
dificilmente apresentam atividade para a hidrólise da amida. Assim, a escolha do
33
doador de acila é um fator extremamente importante, considerando que, devido a alta
nucleofilicidade de aminas, estas podem reagir não enzimaticamente com os ésteres
usados como doadores de acila, impactando no excesso enantiomérico. Além disso,
como argumentam Bornscheuer & Kazlauskas (2006), um doador de acila precisa ser
barato, reagir rápido e irreversivelmente na presença da enzima e não reagir na
ausência do biocatalisador. Embora, dificilmente se preencha os três requisitos,
diversos exemplos de doadores de acila podem ser encontrados na literatura, como
ésteres ativados, ésteres enólicos e anidridos (BORNSCHEUER; KAZLAUSKAS,
2006; SYRÉN; HULT, 2011).
Ésteres ativados, como metoxiacetatos de alquila, são frequentemente
utilizados para a acilação enantiosseletiva de aminas, considerando que a reação
ocorre 100 vezes mais rápido do que aquelas que utilizam ésteres não ativados, como
acetato de etila ou butirato de etila. Por outro lado, ésteres enólicos, como acetato de
vinila ou isopropenila, embora amplamente utilizados na resolução cinética de álcoois,
são pouco utilizados para resolução de aminas, uma vez que estes são demasiado
reativos, impactando negativamente a pureza enantiomérica do produto ou levando a
reações indesejadas (FABER, 2011; HIETANEN et al., 2012; DE MIRANDA et al.,
2013).
1.3.3 Lipases em fluxo contínuo Nos últimos anos, a tecnologia de fluxo contínuo tem sido amplamente utilizada
para reações catalisadas por lipases. Diferentes trabalhos exploraram as diferentes
reações catalisadas por esses biocatalisadores. (ITABAIANA et al., 2013; KAMBLE;
YADAV, 2017; KAWAKAMI et al., 2012; SILVA et al., 2015; TODEA et al., 2018)
Recentemente, um estudo utilizando a lipase de Candida antarctica B
imobilizada em resina acrílica (Novozyme 435, N435) concluiu que a produtividade e
a enantiosseletividade de reações de transesterificação em fluxo contínuo são
maiores que as de reações de deacilação, tornando a via por acilação a mais eficiente
em fluxo contínuo (THOMAS et al., 2017).
34
Reações catalisadas por lipases utilizando células íntegras em fluxo contínuo
são muito pouco comuns. Entretanto, em 2013, Tamborini et al. utilizaram micelas
secas de A. oryzae para a resolução cinética do (RS)-flurbiprofeno em fluxo contínuo.
A reação teve produtividade 10 vezes maior do que em batelada, onde limitações de
transferência de massa e reações colaterais são problemas constantes. A micela seca
pôde ser utilizada no reator sem prévia imobilização, o que também é pouco comum.
A imobilização evita a lixiviação do biocatalisador para fora do reator, o que
contaminaria o produto. Importante destacar que o tipo de imobilização também é um
fator a ser considerado, uma vez que este afeta diretamente o efeito da temperatura
na produtividade e seletividade do processo (BOROS et al., 2013; ITABAIANA et al.,
2013). Ainda, vale mencionar que a lixiviação da enzima do suporte é muito menor em
fluxo contínuo do que em batelada (KUNDU et al., 2011).
Outra vantagem na utilização de fluxo contínuo para reações biocatalisadas é
a diminuição da inibição causada pelo produto. Devido a forte inibição sofrida pela
lipase de P. cepaciae na reação de resolução cinética da metil propiotiolactona, em
batelada, Jeong et al. (2000) utilizaram um reator de leito fixo integrado a uma coluna
de extração para diminuir a inibição pelo produto. A inibição foi completamente
superada utilizando esse sistema, embora o rendimento tenha sido de 20%, devido a
perda do produto para a fase aquosa. Após a troca da fase aquosa para uma solução
1 mol L-1
de sulfato de amônio, o produto foi obtido com 40% de rendimento.
Em fluxo contínuo, mesmo usando ésteres não ativados, como acetato de etila,
é possível a obtenção de aminas quirais com alto rendimento e seletividade. Nos
primeiros trabalhos sobre a resolução cinética de aminas quirais em batelada, o
acetato de etila foi utilizado, mas devido a sua baixa reatividade, longos tempos
reacionais eram necessários e baixos rendimentos eram obtidos. Em condições
contínuas, a amida derivada da reação entre a 1-feniletilamina e o acetato de etila foi
obtida com excelente conversão e alto excesso enantiomérico, mesmo em altas
concentrações de substrato (0,9 mol L-1
). O tempo de residência foi de 40 min e o
biocatalisador Novozyme 435 pôde ser usado por 9h sem perda da atividade (DE
35
MIRANDA et al., 2013).
Recentemente, o acetato de etila também foi utilizado como agente acilante na
resolução cinética do 1-amino-2-indanol em fluxo contínuo (esquema 20). A molécula
é um bloco de construção para a síntese do antirretroviral indinavir. E como esperado
o tempo de reação reduziu drasticamente em fluxo contínuo e o produto foi convertido
com excelente pureza enantiomérica. Embora fosse esperada a acetilação na
hidroxila, a enzima reagiu especificamente com o grupamento amino do diasteroisô-
mero (1S,2R) (KIM et al., 2015).
Esquema 20. Resolução cinética do intermediário do indinavir.
NH2
OH
AcOEtNovozyme 435
1:1 EtOAc/THFTempo de residência: 64 min
NH2
OH
NHAc
OH+
(±)-cis-1-amino-2-indanol (+)-(1R,2S) (+)-(1S,2R)
36
2 OBJETIVO GERAL O objetivo central deste trabalho foi a obtenção de aminas quirais
enantiomericamente puras, dentre elas biaril aminas e outros blocos de construção
para fármacos, através de reações biocatalisadas em condições de fluxo contínuo.
2.1 Objetivos específicos Na primeira parte deste trabalho, o objetivo foi a síntese de biaril aminas
enantiomericamente puras a partir de cetonas pró-quirais através da combinação de
uma reação de acoplamento cruzado de Suzuki-Miyaura e a transaminação catalisada
por ω-transaminases em sistema contínuo ou semi-contínuo. Assim, alguns objetivos
específicos foram propostos:
• Triagem de transaminases em busca de atividade para síntese assimétrica dos
compostos de interesse.
• Estudo de sistemas de deslocamento de equilíbrio na reação de síntese
assimétrica biocatalisada.
• Avaliação e otimização das condições ideais para o acoplamento de Suzuki
compatíveis com as condições para a síntese assimétrica biocatalisada.
• Aplicação das condições otimizadas em modo contínuo ou semi-contínuo para
a síntese de biaril aminas.
Na segunda parte deste trabalho, o objetivo foi avaliar o uso do polietilenoglicol
(PEG) como agente acilante para a obtenção de aminas enantiomericamente puras
através da reação resolução cinética catalisada por Novozyme 435 em condições de
fluxo contínuo. Assim, delineamos objetivos específicos:
• Estudo da resolução cinética da (RS)-1-feniletilamina em fluxo contínuo
utilizando PEG600 (diéster) como doador de acila.
• Estudo de metodologias para a recuperação da amina capturada pelo
PEG na etapa de resolução cinética.
37
3 MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 Reagentes
Os solventes foram obtidos pelos fornecedores Vetec®, Merck
® ou Sigma-
Aldrich e utilizados sem nenhuma etapa prévia de purificação. Todos os reagentes
foram obtidos através da Sigma-Aldrich®.
3.2 Enzimas 3.2.1 Lipases
Lipase B de Candida antarctica (Novozym 435®
com 1-2% (p/p) de água e 7000
U/g) produzido pela Novozymes Co. (Dinamarca).
3.2.2 Transaminases comerciais Foram utilizadas nesse trabalho as (R)-transaminases imobilizadas do kit ECS-
ATA-Kit produzido pela Enzymical�
(Alemanha). A tabela 3 mostra a origem das
transaminases. Todas as transaminases foram imobilizadas pelo fornecedor em
suportes Lifetech, de patente da Purolite® por ligação covalente.
Tabela 3. (R)-Transaminases do kit ECS-ATA da Enzymicals
Biocatalisador Transaminase Suporte
ECS-ATA01 Aspergillus fumigatus Lifetech ECR8204F
ECS-ATA02 Gibberella zeae Lifetech ECR8310F
ECS-ATA03 Neosartorya fischeri Lifetech ECR8806F
ECS-ATA04 Aspergillus oryzae Lifetech ECR8204F
ECS-ATA05 Aspergillus terreus Lifetech ECR8204F
ECS-ATA06 Penicillium chrysogenum Lifetech ECR8204F
ECS-ATA07 Mycobacterium vanbaalenii Lifetech ECR8204F
38
A ω-transaminase livre utilizada em reações de resolução cinética e síntese
assimétrica foi adquirida através da Sigma-Aldrich. A enzima é expressa em E. coli,
mas não há informação de organismo de origem. O produto foi descontinuado,
entretanto. (CAS 9030-47-1).
3.2.3 Transaminases imobilizadas Outras transaminases foram produzidas e imobilizadas pelo laboratório do
professor Uwe T. Bornscheuer, na Universidade de Greifswald (Alemanha). A tabela
abaixo mostra detalhes desses biocatalisadores.
Tabela 4. Enzimas produzidas e imobilizadas pelo laboratório do professor Uwe T. Bornscheuer
Biocatalisador Origem da enzima Suporte Vf_lio Vibrio fluvialis Liofilizada
4CHI_E1 Aspergillus fumigatus EziG1TM
4CHI_E2 Aspergillus fumigatus EziG2TM
4CHI_E3 Aspergillus fumigatus EziG3TM
4CHI_CHI Aspergillus fumigatus Quitosana
CVi_E2 Chromobacterium violaceum EziG2TM
CVi_E3 Chromobacterium violaceum EziG3TM
CVi_CHI Chromobacterium violaceum Quitosana
3HMU_E1 Ruegeria pomeroyi EziG1TM
Os suportes EziGTM
, da EnginZyme, são partículas de vidro de porosidade
controlada (GPC) modificadas para ligar facilmente em proteínas marcadas (His6-
Tag). Dependendo do suporte, as partículas são revestidas com polímeros que
conferem mais ou menos hidrofobicidade. A tabela 5 mostra informações mais
detalhadas dos suportes usados.
39
Tabela 5. Tabela com informações sobre os suportes usados.
Suporte Material Revestimento Característica EziG 1 aminoalquil-
GPC de cadeia
longa
-- Hidrofílico
EziG 2 Amino
HybGPCTM
Polímero contendo unidades de 4'-
(clorometil)-estireno
Hidrofóbico
EziG 3 Amino
HybGPCTM
copolímero de estireno e acrilonitrila Semi-
hidrofílico
As transaminases utilizadas nas reações em fluxo contínuo foram obtidas após
cultivo de células de E. coli expressando as respectivas enzimas. Após o cultivo e
rompimento das células, as enzimas foram imobilizadas. Esses procedimentos foram
realizados na Universidade de Greifswald, no laboratório do professor Uwe T.
Bornscheuer. Abaixo detalhes desses biocatalisadores. Os procedimentos de
expressão e imobilização se encontram no tópico 3.2.4.
Tabela 6. Transaminase expressas e imobilizadas em Greifswald (Alemanha)
Biocatalisador Origem da enzima Suporte 4CHI_I145A Variante de A. fumigatus Livre
4CHI_I145A_E2 Variante de A. fumigatus EziG2TM
4CHI Aspergillus fumigatus Livre
4CHI_E2 Aspergillus fumigatus EziG2TM
3.2.4 Obtenção das transaminases de A. fumigatus e a variante 4CHI_I145A e imobilização. O vector pET-22b contendo os genes para a expressão da transaminase de
Aspergillus fumigatus e da variante 4CHI_I145A foram transformados em E. coli BL21
(DE3). A expressão da proteína foi realizada em meio TB (Terrific Broth) com
100 μg mL-1
de ampicilina a 160 rpm e 20 ºC. Após a densidade óptica a λ=600 nm
40
(OD600) atingir 0.7, a expressão foi induzida pela adição de IPTG (2 mmol L-1
). As
culturas foram deixadas para crescer por 18 h e então centrifugadas por 15 min a
4000×g e 4 ºC. Após lavagem com solução tampão HEPES (50 mmol L-1
, pH 7.5)
contendo piridoxal fosfato (PLP) (0,1 mmol L-1
) e 300 mmol L-1
NaCl, a lise celular foi
realizada por sonicação usando um aparelho Sonopuls HD 2070 (Bandelin electronic
GmbH & Co. KG) por 8 min configurado para 50% de ciclo de pulso e 50% de
intensidade. A sonicação foi realizada em gelo e seguida por centrifugação a 12000×g
por 45 min a 48 ºC (em uma centrífuga Sorvall).
Após a remoção do precipitado, a imobilização das enzimas foi realizada
adicionando o suporte ao sobrenadante. A mistura foi agitada a 150 rpm por 30 min.
A solução foi então centrifugada, o precipitado removido e ressupenso em tampão
HEPES contendo PLP (0,1 mmol L-1
). Este processo foi repetido 3 vezes até que o
excesso de tampão foi retirado e o precipitado armazenado a 4 ºC até o uso.
3.3 Métodos analíticos 3.3.1 Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa (UFRJ).
As reações de resolução cinética e síntese assimétrica realizadas no Brasil
foram monitoradas em cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa
(CG-EM), na Universidade Federal do Rio de Janeiro, em um aparelho Shimadzu
modelo GCMS QP-2010 com amostrador automático AOC-20i e equipado com coluna
RTx-5Ms (L=30 m; d=0,25 µm). O programa para integração foi o Labsolutions
fornecido pela Shimadzu.
As condições de análise foram: A temperatura inicial foi ajustada a 60 ºC e
mantida por 1 min e, então, elevada até 290 ºC a uma taxa de 10 ºC por minuto e
mantido por 16 min. A temperatura de injeção foi de 250 ºC. O gás de arraste utilizado
foi hélio.
41
3.3.2 Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa (Greifswald universität). As reações de acoplamento de Suzuki-Miyaura com posterior transaminação
biocatalisada foram monitoradas em cromatografia gasosa acoplada à espectrometria
de massa (CG-EM), na Universidade de Greifswald, após derivatização da amostra
com MBTFA em um aparelho Shimadzu modelo GCMS QP-2010 com coluna
HYDRODEX-β-TBDAc (L=25 m; d=0,25 µm). O gás de arraste utilizado foi hélio e o
programa para integração foi o Labsolutions fornecido pela Shimadzu.
As condições de análise foram: A temperatura inicial foi ajustada a 80 ºC e
mantida por 10 min e, então, elevada até 175 ºC a uma taxa de 4 ºC por minuto e
mantido por 13 min. Finalmente, a temperatura foi elevada até 220 ºC a uma taxa de
20 ºC por minuto e mantido por 5 min. O gás de arraste utilizado foi hélio.
3.3.3 Cromatografia gasosa com detector por ionização de chamas (UFRJ). O excesso enantiomérico das reações realizadas no Brasil foi analisado por
cromatografia gasosa com detector por ionização de chamas (CG-DIC) em um
aparelho Shimadzu modelo GCMS QP-2010 com coluna CP-Chirasil-Dex CB. O gás
de arraste utilizado foi hélio.
As condições de análise foram: A temperatura inicial foi ajustada a 105 ºC e
mantida por 9 min e, então, elevada até 180 ºC a uma taxa de 40 ºC por minuto e
mantido por 10 min. O gás de arraste utilizado foi hidrogênio.
3.3.4 Cromatografia gasosa com detector por ionização de chamas (ULisboa). O excesso enantiomérico das reações de resolução cinética catalisada por
lipase, realizadas em Portugal, foi analisado após derivatização em um aparelho
Thermo Scientific FocusGC equipado com coluna quiral HYDRODEX-β-6TBDM
(L=25 m; d=0,25 µm).
As condições de análise foram: A temperatura foi ajustada a 140 ºC e mantida
por 36 min e então alterado a uma taxa de 10 ºC por minuto até 185 ºC e mantido por
5 min. O gás de arraste utilizado foi hélio.
42
3.4 Equipamentos 3.4.1 Sistemas de Fluxo contínuo (UFRJ)
Três sistemas de fluxo contínuo foram utilizados:
Para as reações em fluxo contínuo realizadas no Brasil, foi utilizado o sistema
ASIA da SYRRIS®, composto por bomba e aquecedor.
Para as reações de transaminação em fluxo contínuo realizadas na Alemanha,
foi utilizado uma bomba de seringa KDS Scientific série 100.
Para as reações de resolução cinética catalisadas por Lipase realizadas em
Portugal, foi utilizado uma bomba de seringa modelo NE-1000, da New Era Pump
Systems Inc.
3.4.2 Ressonância magnética nuclear Espectros de RMN foram adquiridos a temperatura ambiente em um Bruker
Avance II+ 300 (1H 300 MHz,
13C 75 MHz) e 400 (
1H 400 MHz,
13C 100 MHz) usando
CDCl3 como solvente e (CH3)4Si (1H) como padrão interno. Deslocamento químico (δ)
reportados em partes por milhão (ppm) e constantes de acoplamento (J) foram
expressas em Hertz (Hz).
3.5 Condições reacionais 3.5.1 Teste de atividade de ω-transaminases comerciais.
O teste de atividade das ω-TAs imobilizadas do kit ECS-ATA da Enzymicals foi
realizado por meio da reação de resolução cinética da (RS)-1-feniletilamina. Para isso,
em um tubo de eppendorf contendo 25 mg da enzima imobilizada foi adicionado 1 mL
de uma solução composta por (RS)-1-feniletilamina (50 mmol L-1
), piruvato de sódio
(50 mmol L-1
) e PLP (1 mmol L-1
) em tampão fosfato (100 mmol L-1
, pH 7). A solução
foi agitada em agitador orbital a 200 rpm por 24 h em uma temperatura de 30 °C. Além
disso, foi preparado também um controle positivo, utilizando 10 mg da ω-TA isolada
expressa em E. coli. e um controle negativo, onde nenhum catalisador foi adicionado.
O conjunto de reações foi interrompido pela adição de uma solução de NaOH
43
(100 μL, 5 mol L-1
) em cada eppendorf. A extração foi feita com acetato de etila
(3 × 200 μL) e as camadas orgânicas foram combinadas e então secas com Na2SO4.
A conversão foi analisada em CG-EM e, após derivatização (5 μL anidridro
trifluoroacético + 5 μL de trietilamina), o excesso enantiomérico foi analisado em
CG-DIC.
3.5.2 Síntese assimétrica usando isopropilamina como doador amino. Para avaliação da síntese assimétrica empregando isopropilamina como
doador amino, em eppendorfs contendo cada um 10 mg das respectivas
transaminases, foi adicionado 0,9 mL de uma solução composta por isopropilamina
(1 mol L-1
), trietanolamina (100 mmol L-1
) e PLP (1 mmol L-1
) em água. O pH foi
ajustado previamente a 7,5 com uma solução de HCl 1 mol L-1
. Então, 0,1 mL de uma
solução de acetofenona 100 mmol L-1
em DMSO foi adicionado aos eppendorfs. A
reação ocorreu em um agitador orbital a 230 rpm por 24 h a 30 ºC.
Ao final, o conjunto de reações foi interrompido pela adição de NaOH (100 μL,
5 mol L-1
) em cada eppendorf. A extração foi feita com acetato de etila (3 × 200 μL) e
as camadas orgânicas foram combinadas e então secas com Na2SO4. A conversão
foi analisada em CG-EM.
3.5.3 Síntese assimétrica usando um sistema de deslocamento de equilíbrio LDH/GDH A síntese da (R)-1-feniletilamina catalisada por ω-TAs empregando um sistema
de deslocamento de equilíbrio LDH/GDH foi avaliada nas condições que se segue: em
tubos de eppendorf contendo 10mg da ω-TAs imobilizada foi adicionado 1 mL de uma
solução composta por DL-alanina (250 mmol L-1
), acetofenona (10 mmol L-1
), NADH
(2 mmol L-1
), uma lactato desidrogenase (90 U mL-1
), uma glicose desidrogenase
(15 U mL-1
), glicose (75 mmol L-1
), PLP (0,1 mmol L-1
) em tampão fosfato
(100 mmol L-1
; pH 7,1). A reação ocorreu em agitador orbital a 200 rpm por 24 h em
uma temperatura de 30 ºC. Também foram preparados o controle negativo, sem
enzima, e o controle positivo, usando 2 mg da transaminase isolada de Vibrio fluvialis.
44
Ao final, o conjunto de reações foi interrompido pela adição de NaOH
(100 μL, 5 mol L-1
) em cada eppendorf. A extração foi feita com acetato de etila
(3 × 200 μL) e as camadas orgânicas foram combinadas e então secas com Na2SO4.
A conversão foi analisada em CG-EM.
3.5.4 Reações de acoplamento cruzado de Suzuki-Miyaura Para estudos das condições ótimas para a reação de acoplamento cruzado de
Suzuki-Miyaura, as condições foram como se segue: 1 mL de uma solução 50%
dimetilformamida (DMF):água adicionada de 4’-bromoacetofenona (5 mmol L-1
), ácido
fenilborônico (7,5 mmol L-1
), o catalisador de paládio (5 mol%) e K2CO3 ou Et3N
(10 mmol L-1
) foi agitada a temperatura ambiente por 10 min. Ao final, uma extração
foi realizada com acetato de etila (3 × 200μL) e as camadas orgânicas foram
combinadas e então secas com Na2SO4. A conversão foi analisada em CG-EM.
As mesmas condições foram utilizadas para os estudos em soluções 50%
DMF:tampão, onde diferentes soluções-tampão foram avaliadas (HEPES pH7 e
CHES pH9 e NaHCO3 pH 9). Além disso, três diferentes catalisadores de paládio
foram avaliados: PdCl2, Pd(AcO)2 e Pd/BaSO4.
As amostras foram extraídas com acetato de etila (3 x 200 µL). As camadas
orgânicas foram secas com Na2SO4 anidro.
3.5.5 Síntese de biaril aminas em condições semi-contínuas Para a síntese das diferentes biaril aminas em condições semi-contínuas, as
condições foram: substrato cetona (2 mmol L-1
), o ácido fenilborônico
(1,5 equivalente), 10 mol% PdCl2 em tampão NaHCO3 (pH 9) com 50% DMF por 2 h
a 50 ºC em agitador orbital. Após a reação de Suzuki, a solução foi diluída, em uma
proporção 1:2, em tampão HEPES (50 mmol L-1
, pH 9) contendo PLP (1 mmol L-1
).
Então, isopropilamina (750 mmol L-1
) foi adicionada à solução.
Um reator foi preenchido com 410 mg do biocatalisador. O sistema foi
condicionado passando tampão pelo interior do sistema a uma vazão de 10 mL h-1
por
45
30 min. Essa etapa foi usada para verificar possíveis vazamentos no reator. A seringa
foi preenchida com a solução da reação de Suzuki e acoplada a bomba. O reator foi
mergulhado em banho de água com temperatura controlada a 30 ºC. A solução foi
então bombeada a uma vazão de 0,1 mL h-1
. O tempo de residência foi de 3,5 h. Ao
final, uma alíquota de 200 µL foi colhida, extraída e derivatizada para análise.
A solução foi extraída e derivatizada como se segue: O procedimento de
extração e derivatização foram como se segue: 100 µL de amostra foram basificados
com uma solução 3 mol L-1
de NaOH até pH >12. A amostra foi extraída com éter metil
terc-butílico (MTBE) (2 x 100 µL contendo o padrão interno 4‘-iodoacetofenona
(0,5 mmol L-1
). As camadas orgânicas foram secas com MgSO4 anidro. A
derivatização foi feita com N-metil-bis(trifluoroacetamida) (MBTFA) (100 µL de
amostra e 7 µL da solução comercial de MBTFA) e agitado por 1 h a 60 °C.
3.5.6 Síntese do agente acilante PEG600 (dietil diéster) O agente acilante foi sintetizado como descrito por Monteiro et al. (2015): 10g
de PEG600-diácido (17 mmol), 125 mL de etanol 96% (V/V) e 2 mL de ácido sulfúrico
(37,5 mmol) foram agitados por 16 h em um balão a 80 ºC. Então, a solução foi
deixada para equilibrar à temperatura ambiente e o etanol foi removido sob vácuo em
um rotavapor. O produto foi ressuspenso em água (50 mL) e 50 mL de uma solução
saturada de bicabornato de sódio foi adicionada. Após extração com diclorometano
(3 x 50 mL), a fase orgânica foi lavada com solução saturada de NaCl (50 mL),
separada e seca com Na2SO4 anidro e, então, filtrado. O solvente foi evaporado e o
produto foi obtido como um óleo incolor (4,085 g, 71%).
3.5.7 Resolução cinética enzimática da (RS)-1-feniletilamina usando PEG600 (dietil diéster) como agente acilante em condições de fluxo continuo
Para a reação de resolução cinética da (RS)-1-feniletilamina em condições de
fluxo contínuo, as condições foram como se segue: Uma solução de 20 mL contendo
46
(RS)-PEA (1, 150 mmol L-1
, 366,8 mg) e PEG600-diéster (150 mmol L-1
, 1,807 g) em
tolueno foi preparada. Um reator de leito fixo de 830 μL de volume interno foi
preenchido com o biocatalisador Novozyme 435 (303 mg). O reator foi mantido em um
forno a 70 ºC e a solução foi bombeada em uma vazão de 27,6 μL min-1
(Tr= 30min).
O volume recolhido foi de 4,6 mL.
O procedimento de extração e derivatização para análise foram como se segue:
200 µL de amostra foram basificados com uma solução 1 mol L-1
de NaOH até pH >12.
A amostra foi extraída com ciclohexano (3 x 100 µL). As camadas orgânicas foram
secas com Na2SO4 anidro. A derivatização foi feita adicionando à amostra 5 µL de
anidrido acético e 5 µL de trietilamina e agitado por 20 min a temperatura ambiente. A
amostra foi lavada com solução aquosa de HCl 1 mol L-1
e extraída com DCM e seca
com Na2SO4 anidro.
3.5.8 Hidrólise química para recuperação da (R)-1-feniletilamina Para a recuperação de (R)-1 do PEG, após a reação de resolução cinética e
extração de (S)-1 do meio com uma solução 1 mol L-1
de HCl, a fase orgânica foi
evaporada. O produto restante ((R)-2) foi adicionado em uma solução contendo 3mL
de metanol e 3mL de uma solução de HCl 6N. A reação foi realizada em um balão
equipado com um condensador de refluxo e agitada a 80 ºC por 16 h. Após
evaporação do metanol, a solução ácida foi extraída com DCM para retirar o PEG. A
fase aquosa foi extraída e derivatizada como descrito.
O procedimento de extração e derivatização para análise do excesso
enantiomérico foram como se segue: 200 µL de amostra foram basificados com uma
solução 1 mol L-1
de NaOH até pH >12. A amostra foi extraída com ciclohexano
(3 x 100 µL). As camadas orgânicas foram secas com Na2SO4 anidro. A derivatização
foi feita adicionando à amostra 5 µL de anidrido acético e 5 µL de trietilamina e agitado
por 20 min a temperatura ambiente. A amostra foi lavada com solução aquosa
1 mol L-1
de HCl e extraída com DCM e seca com Na2SO4 anidro.
47
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1 Transaminases 4.1.1 Avaliação da atividade de transaminases imobilizadas comerciais.
Em um primeiro momento, utilizamos a reação de resolução cinética da
(RS)-1-feniletilamina para testar a atividade das transaminases imobilizadas obtidas
comercialmente. O kit ECS-ATA, da Enzymicals, é composto por 7 (R)-ω-TAs, que
foram recentemente descobertas por homologia através de uma abordagem in silico
(HÖHNE et al., 2010). Comparado com o grande número de (S)-TAs já descobertas e
extensamente estudadas, transaminases com enantiopreferência (R) são extrema-
mente raras. As enzimas do kit são imobilizadas em resinas de metacrilato LifetechTM
,
patente da Purolite®, por ligação covalente (GUO; BERGLUND, 2017; HÖHNE et al.,
2010). O conjunto de reações empregado nesta etapa, adaptado de Martin et al.
(2007), contou ainda com uma (S)-transaminase livre comercial, expressa em E. coli,
e um controle negativo, sem adição de qualquer catalisador. Os resultados são
mostrados na tabela 7.
Tabela 7.Resolução cinética da (RS)-1-feniletilamina por transaminases imobilizadas comerciais.
Entrada Biocatalisador Origem Conversão ee 1 Branco -- -- --
2 E. coli recomb. Sem informação de origem 45% n.a.
3 ECS-ATA01 Aspergillus fumigatus 45% >99 (S)
4 ECS-ATA02 Gibberella zeae 49% >99 (S)
5 ECS-ATA03 Neosartorya fischeri 49% >99 (S)
6 ECS-ATA04 Aspergillus oryzae 4% --
7 ECS-ATA05 Aspergillus terreus 47% >99 (S)
8 ECS-ATA06 Penicillium chrysogenum 33% 43 (S)
9 ECS-ATA07 Mycobacterium vanbaalenii 49% >99 (S)
Condições: (RS)-1-feniletilamina (50 mmol L-1), piruvato de sódio (50 mmol L-1) e PLP (1 mmol L-1) em tampão fosfato (100 mmol L-1, pH 7) a 30 ºC por 24 h. *n.a.: não avaliado.
48
Podemos notar que a maioria das reações apresentou excelentes resultados,
com conversões maiores que 45%. Ainda, considerando que todas as ω-TAs
utilizadas possuem seletividade para o enantiômero (R), observou-se que as enzimas
foram altamente seletivas. As exceções foram os biocatalisadores ECS-ATA04, que
mostrou conversão insuficiente, e ECS-ATA06 que mostrou conversão de 33% (e 43%
ee), provavelmente devido a influência do pH reacional. Segundo a literatura, para
ambos os biocatalisadores, o pH ótimo é acima de 8 e diminuem atividade
abruptamente em pH 7 (SCHÄTZLE et al., 2011). Vale mencionar ainda que, como
dito anteriormente, em uma resolução cinética, o excesso enantiomérico depende da
conversão, o que justifica o baixo valor para o biocatalisador ECS-ATA06 nas
condições estudadas.
4.1.2 Avaliação das metodologias de deslocamento do equilíbrio para síntese assimétrica.
Esquema 21. Metodologias empregadas para o deslocamento do equilíbrio de reações de síntese assimétrica.
49
Em todo esse trabalho, duas metodologias de deslocamento do equilíbrio para
a reação de síntese assimétrica foram utilizadas (esquema 21). A primeira utiliza iso-
propilamina como doador amino. Como dito anteriormente, esse método é bastante
vantajoso, devido o baixo custo do doador amino e o fato da reação gerar acetona no
meio. A acetona pode então ser facilmente removida por aquecimento, evitando uma
possível inibição pelo produto. Além disso, essa metodologia é de simples aplicação
e se encaixa perfeitamente com nossas pretensões de uso em fluxo contínuo. Outra
metodologia de deslocamento do equilíbrio utilizado é o sistema com uma lactato
desidrogenase (LDH) e uma glicose desidrogenase (GDH). Nesse caso, alanina é
utilizada como doador amino. A reação forma piruvato que é rapidamente convertido
para lactato pelo sistema LDH/GDH, deslocando o equilíbrio para a formação do
produto e evitando a inibição pelo produto piruvato (MALIK et al., 2012; SMITH et al.,
2010).
Iniciamos avaliando as transaminases do kit da Enzymicals no método de
deslocamento de equilíbrio 1. Os resultados podem ser conferidos na tabela 8.
Tabela 8. Reação de síntese assimétrica catalisada por diferentes transaminases utilizando isopropilamina como doador amino.
Entrada Biocatalisador Origem Conversão 1 Branco -- --
2 E. coli recomb. Sem informação de origem 46%
3 ECS-ATA01 Aspergillus fumigatus --
4 ECS-ATA02 Gibberella zeae --
5 ECS-ATA03 Neosartorya fischeri --
6 ECS-ATA04 Aspergillus oryzae --
7 ECS-ATA05 Aspergillus terreus --
8 ECS-ATA06 Penicillium chrysogenum --
9 ECS-ATA07 Mycobacterium vanbaalenii --
Condições: Acetofenona (10 mmol L-1), isopropilamina (1 mol L-1), trietanolamina (100 mmol L-1) e PLP (1 mmol L-1), DMSO (10% v/v) em água (o pH foi ajustado para 7,5) a 30 ºC por 5 dias.
50
Como é possível observar, apenas a reação empregando a enzima livre obteve
resultado, com 46% de conversão, considerando que as catalisadas por enzimas
imobilizadas comerciais não foram capazes de converter o substrato. O conjunto de
reações foi monitorado a cada 24h por 5 dias e não houve alteração na conversão em
nenhum caso.
Embora esses resultados pudessem ser justificados no fato de que a alta
concentração de isopropilamina pode causar a inativação de determinadas enzimas,
um efeito bastante conhecido na literatura, ou ainda que o produto acetona formado
na primeira etapa da reação tenha sido o responsável pela inibição da atividade, testes
posteriores mostraram que o mais provável é que as enzimas tenham perdido
atividade após o armazenamento (CASSIMJEE et al., 2010; TRUPPO; ROZZELL; et
al., 2009).
Assim, avaliamos ainda o conjunto de enzimas utilizando o sistema de
deslocamento de equilíbrio 2 (esquema 21). Como esperado, não houve conversão
do substrato. No entanto, nos surpreendemos ao observar a redução da acetofenona
a 1-feniletanol. Na figura 6, podemos observar no cromatograma, dois picos, um
relacionado ao substrato acetofenona e um outro menor, relacionado ao subproduto
1-feniletanol. Uma hipótese para esse efeito é a possibilidade de que o hidreto gerado
pelo sistema de deslocamento tenha atuado em uma adição nucleofílica ao carbono
da carbonila.
51
Figura 6. Cromatograma extraído de uma das amostras da reação de síntese assimétrica catalisada por diferentes transaminases utilizando o sistema LDH/GDH e espectro de massa utilizado para a identificação dos compostos. Condições: DL-alanina (250 mmol L-1), acetofenona (10 mmol L-1), NADH (2 mmol L-1), lactato desidrogenase (90 U mL-1), glicose desidro-genase (15 U mL-1), glicose (75 mmol L-1), PLP (0,1 mmol L-1), 10% DMSO em tampão fosfato (100 mmol L-1; pH 7,1) a 30 ºC por 24 h.
4.1.3 Avaliação das condições para síntese de biaril aminas por reação de acoplamento de Suzuki-Miyaura e transaminação biocatalisada em cascata em fluxo contínuo.
Com o objetivo de obter biaril aminas através da combinação da atividade da
transaminase com a reação de acoplamento C-C de Suzuki-Miyaura em fluxo
contínuo, duas abordagens foram propostas (figura 7): Na abordagem 1, a etapa de
transaminação é realizado anterior à reação de acoplamento cruzado. Enquanto que
na abordagem 2, o inverso acontece. A primeira abordagem é vantajosa em permitir
que a transaminase lide com moléculas menores, uma vez que transaminases
OH
O
O
OH
52
selvagens podem não apresentar atividade para grupamentos volumosos como biaril
cetonas. Por outro lado, essa abordagem torna necessária a busca de condições
ótimas para a reação de acoplamento que sejam compatíveis com o meio provindo da
reação biocatalisada. Já a segunda abordagem, poderia fazer necessária a obtenção
de uma enzima mutante capaz de converter o produto de acoplamento de Suzuki-
Miyaura. Além disso, a reação de transaminação, principalmente a transaminase,
deveria ser compatível com o meio vindo da reação anterior.
Isso posto, decidimos iniciar nossos estudos pela abordagem 1.
Figura 7. Abordagens propostas para a síntese de biaril aminas através da combinação da reação de acoplamento de Suzuki-Miyaura e a transaminação biocatalisada.
53
4.1.3.1 Avaliação das condições ótimas para a reação de acoplamento cruzado de
Suzuki-Miyaura em batelada.
Esquema 22. Reação de acoplamento de Suzuki-Miyaura em solução 50% DMF em água.
Para que a abordagem 1 fosse possível era necessário estabelecer as
condições ótimas para a reação de Suzuki-Miyaura de modo que essa etapa fosse
compatível com a etapa de biocatálise anterior. Assim, iniciamos os nossos estudos
pela avaliação de diferentes catalisadores de paládio e bases para a reação de
acoplamento de Suzuki em água (esquema 22). Baseado no trabalho de Liu et al.
(2011), os catalisadores selecionados neste estudo foram o acetato de paládio
(PdCl2), cloreto de paládio (Pd(OAc)2) e paládio em sulfato de bário (Pd/BaSO4)
enquanto carbonato de potássio e trietilamina foram selecionados como bases. Os
resultados são mostrados na tabela 9.
Tabela 9. Reação de acoplamento cruzado de Suzuki-Miyaura entre a 4-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico com diferentes bases e catalisadores.
Entrada Catalisador Bases Conversãoa
1 PdCl2 K2CO3 89%
2 PdCl2 Et3N 77%
3 Pd(OAc)2 K2CO3 84%
4 Pd(OAc)2 Et3N 57%
5 Pd/BaSO4 K2CO3 --
6 Pd/BaSO4 Et3N --
7 Pd/BaSO4* K2CO3 46%
Condições: 4’-bromoacetofenona (5 mmol L-1), ácido fenilborônico (7,5 mmol L-1), [Pd] (5 mol%) e a base (10 mmol L-1) em solução 50% DMF:água foram agitados em temperatura ambiente por 10 min sob atmosfera. *realizado a 80 ºC por 24 h. aObtido por CG-EM.
54
Como é possível observar, tanto as reações empregando a PdCl2 quanto o
aquelas mediadas por Pd(OAc)2 levaram a excelentes resultados utilizando ambas as
bases (tabela 9, entrada 1-4), embora os resultados para o K2CO3 tenham sido
melhores. A redução na conversão de reações de acoplamento de Suzuki-Miyaura
quando bases orgânicas são utilizadas, como trietilamina ou piridina, também foi
observado em trabalhos anteriores (LIU et al., 2014; SAIKIA et al., 2015).
Entretanto quando Pd/BaSO4 foi utilizado, nenhum produto foi formado, já que
o Pd/BaSO4 não é ativado a temperatura ambiente. Após elevação da temperatura
para 80 ºC, foi possível obter 46% de conversão, embora a reação tenha levado 24 h
para alcançar esse resultado. Diante disso, optamos por seguir os experimentos
utilizando apenas PdCl2 e Pd(OAc)2 como catalisadores e K2CO3 como base.
4.1.3.2 Avaliação de diferentes soluções-tampão na reação de acoplamento cruzado
de Suzuki-Miyaura em batelada.
Com base nos resultados anteriores, continuamos nossos estudos na escolha
de um tampão que fosse compatível com os dois processos, o de acoplamento
cruzado de Suzuki-Miyaura e a transaminação biocatalisada. A escolha do tampão é
importante já que na reação de transaminação, que precede a reação de acoplamento
de Suzuki (figura 7), o meio tamponado é necessário. Os resultados podem ser vistos
na tabela 10.
Tabela 10. Avaliação de diferentes soluções-tampão na reação de acoplamento de Suzuki-Miyaura
Entrada Catalisador Tampão [mmol L-1] pH Conversão (%)
1 Pd(OAc)2 HEPES 50 8 --
2 Pd(OAc)2 HEPES 25 8 --
3 Pd(OAc)2 HEPES 12,5 8 --
4 Pd(OAc)2 CHES 50 9 --
5 Pd(OAc)2 CHES 25 9 --
6 Pd(OAc)2 CHES 12,5 9 --
7 Pd(OAc)2 Na2PO4 100 7,5 --
8 Pd(OAc)2 NaHCO3 25 9 >99
55
9 PdCl2 HEPES 50 8 --
10 PdCl2 HEPES 25 8 --
11 PdCl2 HEPES 12,5 8 --
12 PdCl2 CHES 50 9 --
13 PdCl2 CHES 25 9 --
14 PdCl2 CHES 12,5 9 --
15 PdCl2 Na2PO4 100 7,5 --
16 PdCl2 NaHCO3 25 9 >99
Condições: 4’-bromoacetofenona (5 mmol L-1), ácido fenilborônico (7,5 mmol L-1), [Pd] (5 mol%), K2CO3
(10 mmol L-1), 50% DMF e tampão (50 mmol L-1) foram agitados em temperatura ambiente por 10 min
sob atmosfera.
Como podemos observar, o tampão NaHCO3 foi o único tampão estudado
compatível com a reação. Desse modo, foi possível obter 100% de conversão do
substrato em apenas 10 min. O efeito da concentração do tampão também foi avaliado
(tabela 10, entradas 1-6 e 9-14), entretanto independente da concentração utilizada
não foi observada a formação de produto para essas soluções. Uma hipótese para
esse efeito é a influência do pH em reações de Suzuki. Essa influência já havia sido
observada em 1994, quando Wallow & Novak argumentaram que esse efeito é
causado pela formação do ânion arilborato em pH >9 e, dado a sua maior reatividade,
a formação deste daria prosseguimento a etapa de transmetalação (WALLOW;
NOVAK, 1994). Entretanto, dados recentes mostram que a reação de Suzuki-Miyaura
envolve a molécula neutra do ácido e não o ânion (SCHMIDT et al., 2011). Ainda
assim, considerando que a reação ocorre em meio bifásico, a formação do ânion
arilborato pode atuar como uma reserva de hidróxido para a fase orgânica, que é
consumido durante a reação, além de diminuir o homo acoplamento do ácido
fenilborônico (LENNOX; LLOYD-JONES, 2013).
Por outro lado, um outro fator parece ter levado à ineficiência de reações em
tampão CHES, apesar do pH 9. A desativação do paládio pode ter ocorrido devido ao
nitrogênio na estrutura do CHES (figura 8a). O par de elétrons disponível do nitrogênio
pode se ligar ao paládio diminuindo a velocidade da reação ou desativando
irreversivelmente o catalisador (figura 8b) (ITOH; MASE, 2005; LI et al., 2016;
THOMPSON et al., 2005).
Diante disso, prosseguimos nossos estudos utilizando o tampão NaHCO3.
56
Figura 8. A) Ácido 2-(ciclohexilamino)-etanosulfônico (CHES); B) Complexação do paládio com a amina básica.
Um último critério de importante avaliação é concentração de DMF. Isso porque
a transaminase possui baixa tolerância a solventes orgânicos, então era interessante
avaliar a concentração de DMF mínima necessária de modo a não haver problemas
de solubilidade na etapa de acoplamento seguinte. Assim, iniciamos com a
concentração de 50% já estudada e diminuímos até 10% de DMF. O resultado pode
ser visto na tabela 11.
Tabela 11. Avaliação de diferentes concentrações DMF na reação de acoplamento de Suzuki-Miyaura entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico.
Entrada Catalisador [DMF] (%) Tempo de reação (min) Conversão (%)
1 Pd(OAc)2 10 10 >99
2 Pd(OAc)2 20 10 >99
3 Pd(OAc)2 30 10 >99
4 Pd(OAc)2 40 10 >99
5 Pd(OAc)2 50 10 >99
6 PdCl2 10 120 65
7 PdCl2 20 10 99
8 PdCl2 30 10 >99
9 PdCl2 40 10 >99
10 PdCl2 50 10 >99
Condições: 4’-bromoacetofenona (5 mmol L-1), ácido fenilborônico (7,5 mmol L-1), [Pd] (5 mol%), K2CO3
(10 mmol L-1), 50% DMF e tampão NaHCO3 (25 mmol L-1; pH 9) foram agitados em temperatura ambi-
ente por 10 min sob atmosfera.
Como podemos notar, mesmo com 10% de DMF em tampão NaHCO3 foi
possível obter máxima conversão. A exceção foi para a reação empregando o cloreto
de paládio com 10% DMF (tabela 11, entrada 6), que converteu apenas 65% do
substrato, mesmo após 2 h. Nesse caso, houve rápida desativação do paládio com
formação de um precipitado de coloração escura.
57
4.1.3.3 Síntese assimétrica utilizando substratos de interesse, em batelada, nas
condições compatíveis com a reação de Suzuki.
Considerando que as transaminases imobilizadas comerciais não tiveram
atividade para os substratos anteriores, adquirimos novas transaminase enviadas pelo
professor Uwe Bornscheuer e iniciamos os testes de atividade para a síntese
assimétrica com alguns substratos selecionados. Esses substratos variavam o
tamanho da cadeia, posição do átomo de bromo e presença ou não de nitrogênio no
anel.
As enzimas adquiridas possuem quatro origens diferentes: a (R)-ω-TAs de
Aspergillus fumigatus e as (S)-ω-TAs de Chromobacterium violaceum, Vibrio fluvialis
e Ruegeria pomeroyi. Algumas dessas enzimas foram recebidas liofilizadas e outras
imobilizadas em diferentes suportes como quitosana ou os suportes EziGTM
(figura 9).
Esse último, produzido pela EnginZyme, são baseados em partículas de vidro com
porosidade controlada e possuem diferentes características de acordo com o
revestimento da partícula. Enquanto EziG1 possui característica hidrofílica e ausência
de revestimento, EziG2 e EziG3 são revestidos por polímeros hidrofóbico e semi-
hidrofílico, respectivamente (CASSIMJEE et al., 2014; MALLIN et al., 2014).
Figura 9. Suporte EziGTM ligado à enzima. Adaptado de (CASSIMJEE et al., 2014)
58
Assim, os 9 diferentes biocatalisadores foram avaliados frente aos quatro
substratos selecionados (figura 10) em condições compatíveis à reação de
acoplamento de Suzuki-Miyaura, utilizando tampão NaHCO3 (pH 9).
Figura 10. Substratos selecionados para síntese assimétrica.
Tabela 12. Conversão na síntese assimétrica de diferentes aminas utilizando transaminases liofilizadas e imobilizadas em diferentes suportes.
Entrada Biocatalisador Origem da enzima Suporte Conversão (%)
2b 3b 4b 5b
1 Sem enzima -- -- -- -- -- --
2 Vf_lio V. fluvialis -- -- -- -- --
3 4CHI_E1 A. fumigatus EziG1TM
4,6 1,9 4,9 2,4
4 4CHI_E2 A. fumigatus EziG2TM
62,3 20,1 70,6 64,6
5 4CHI_E3 A. fumigatus EziG3TM
n.a. n.a. 25,9 �21,3
N
Br
O
N
O
O
Br
Br
O
Br
3-acetil-5-bromopiridina (2a) 3-acetil-6-bromopiridina (3a)
4-(3-bromofenil)-2-butanona (4a) 4-(4-bromofenil)-2-butanona (5a)
R
NH2
R
Oω-transaminase
2a-5a 2b-5b
1-feniletilamina acetofenona
59
6 4CHI_CHI A. fumigatus Quitosana n.a. n.a. -- --
7 CVi_E2 C. violaceum EziG2TM
n.a. n.a. -- --
8 CVi_E3 C. violaceum EziG3TM
-- -- -- --
9 CVi_CHI C. violaceum Quitosana n.a. n.a. -- --
10 3HMU_E1 R. pomeroyi EziG1TM
2,77 -- 2,34 --
Condições: cetona (5 mmol L-1), (RS)-1-feniletilamina (25 mmol L-1), PLP (0,1 mmol L-1), DMF (10%
v/v) e 10 mg da enzima imobilizada ou 3 mg de enzima liofilizada em tampão NaHCO3 (10 mmol L-1,
pH 9) a 30ºC por 48 h. Conversões analisadas por CG-EM. n.a. = não avaliado
Como podemos observar, apenas 4 biocatalisadores apresentaram atividade
para os substratos propostos, sendo 3 deles a (R)-transaminase de A. fumigatus e
uma de R. pomeroyi (tabela 12, entradas 3-5 e 10). O melhor resultado para todos os
substratos foi obtido pelo biocatalisador 4CHI_E2 (tabela 12, entrada 4) e é possível
notar ainda que a atividade foi maior quanto mais hidrofóbico o suporte (tabela 12
entradas 3-5). A natureza do suporte pode afetar o microambiente da enzima com
consequente aumento ou diminuição da atividade enzimática. Nesse caso, a natureza
hidrofóbica do suporte também previne a desnaturação da enzima, principalmente
pela menor interação com o DMF hidrofílico (CASSIMJEE et al., 2014; LIU et al.,
2002). É possível observar também que quando a transaminase de A. fumigatus foi
imobilizada em quitosana não apresentou qualquer atividade para os substratos
propostos (tabela 12, entrada 6). Em trabalhos anteriores, durante a imobilização de
transaminases em quitosana, Mallin et al. (2013) estudaram a mudança do co-emulsi-
ficante hexanol para hexano na tentativa de aumentar a hidrofobicidade do suporte,
que é altamente hidrofílico. Entretanto, para esse suporte, mesmo o aumento da
hidrofobicidade não resultou em aumento da atividade.
Vale notar ainda que a posição do átomo de bromo no anel aromático teve
impacto significativo na atividade da enzima, provavelmente devido à acomodação da
molécula no sítio catalítico, um efeito também observado em trabalhos recentes
(DAWOOD et al., 2018). Como podemos observar, o biocatalisador 3HMU (tabela 12,
entrada 10) mostrou atividade apenas para os substratos com o bromo na posição
60
meta. Além disso, os biocatalisadores baseados na ω-TA de A. fumigatus tiveram um
aumento significativo na atividade para substratos com o bromo nesta mesma
posição.
Posteriormente, testamos ainda a influência da disponibilidade de PLP no meio
reacional. Os biocatalisadores 4CHI_E1 e 3HMU_E1 foram selecionados para avaliar
se a baixa concentração de PLP teria influenciado a baixa atividade desses
biocatalisadores. Assim, a concentração de PLP foi aumentada em 10 vezes,
entretanto, a maior concentração de PLP não teve qualquer impacto na atividade nas
condições estudadas.
4.1.4 Síntese de biaril aminas por reação de acoplamento de Suzuki-Miyaura e transaminação biocatalisada em regime semi-contínuo. Após o estabelecimento das condições ótimas para a reação de acoplamento
de Suzuki compatíveis com a transaminação biocatalisada, iniciamos nossos estudos
para a aplicação das condições ideais em fluxo contínuo. Essa parte do trabalho foi
realizada na Universidade de Greifswald (Ernst-Moritz-Ardnt Greifswald Universität),
na Alemanha, no laboratório do Professor Uwe T. Bornscheuer.
Devido às diferentes condições do laboratório, algumas alterações foram feitas.
Primeiramente, testes anteriores realizados pelo grupo alemão indicavam que a
transaminase de Aspergillus fumigatus (4CHI) poderia ser capaz de converter biaril
cetonas, possibilitando que síntese assimétrica fosse realizada posterior à reação de
Suzuki (Figura 7, abordagem 2). Nesta etapa também foi incluída uma variante da
mesma enzima, a 4CHI_I145A, recém-descoberta pelo grupo através de estudos de
docking e dinâmica molecular.
Para esse conjunto de reações, cloreto de paládio foi selecionado como
catalisador para a reação de Suzuki por apresentar os melhores resultados nos
experimentos anteriores. Como o PdCl2 é um catalisador homogêneo, a síntese das
biaril aminas foi realizada em condições semi-contínuas, com a reação de Suzuki em
batelada seguida da transaminação biocatalisada em fluxo contínuo (figura 7,
61
abordagem 2).
Assim, nosso primeiro passo foi a imobilização da nova ω-TA 4CHI_I145A no
suporte EziG2. Como visto anteriormente, a ω-TA de A. fumigatus apresentou
melhores resultados quando imobilizada nesse suporte. A imobilização foi realizada
imergindo o suporte no extrato enzimático após a desintegração das células cultivadas
por sonicação. Após a imobilização, iniciamos a avaliação do sistema na produção
das aminas propostas (figura 11).
Figura 11. Aminas produzidas através da reação de Suzuki seguida de transaminação biocatalisada em condições semi-contínuas.
4.1.4.1 Síntese assimétrica biocatalisada da 1-(4-bifenilil)etilamina (1c) e 1-(4’fluoro-
4-bifenilil)etilamina (F-1c) em condições semi-contínuas.
Iniciamos então com a produção da 1-(4-bifenil)etilamina em um sistema semi-
contínuo (esquema 23). Assim, a 4-bromoacetofenona (2 mmol L-1
), o ácido
fenilborônico, 10 mol% [Pd] reagiram em tampão NaHCO3 (pH 9) com 50% DMF por
2 h a 50 ºC em agitador orbital. Necessário mencionar que em testes anteriores, a
NH2
N
NH2
N
NH2
NH2
F
1-(4-bifenilil)etilamina (1c) 1-(4'-fluoro-4-bifenilil)etilamina (F-1c)
1-(6-fenil-3-piridinil)etilamina (3c)1-(5-fenil-3-piridinil)etilamina (2c)
62
transaminase de A. fumigatus mostrou tolerância até 25% de DMF. Assim, após a
reação de Suzuki, a solução foi diluída, em uma proporção 1:2, em tampão HEPES
(50 mmol L-1
, pH 9) contendo PLP (1 mmol L-1
). A concentração final do substrato para
a transaminação foi escolhida 1 mmol L-1
para não haver problemas de solubilidade
em 25% DMF. Finalmente, isopropilamina (750 mmol L-1
) foi adicionada à solução,
pois se esperava que a variante 4CHI_I145A aceitasse melhor esse doador amino.
Um reator foi preenchido com 410 mg do biocatalisador e a vazão da bomba
de fluxo contínuo ajustada para 0,1 mL h-1
, resultando em um tempo de residência de
3,5 h. Ao final, a solução foi basificada com uma solução 3 mol L-1
de NaOH a um
pH>12 e extraída com uma solução de MTBE contendo o padrão interno
4-iodoacetofenona. A amostra foi seca com Na2SO4 e derivatizada com MBTFA para
análise em CG-EM.
Esquema 23. Síntese da 1-(4-bifenilil)etilamina em condições semi-contínuas partindo da 4-bromoacetofenona.
No cromatograma obtido através da análise da amostra foi possível observar
uma conversão de 49% com um tempo de residência de 3,5 h a 30ºC. A identificação
do produto foi realizada pela análise do espectro de massas (figura 12).
63
Figura 12. Cromatograma obtido após reação de síntese assimétrica de 1c biocatalisada em fluxo contínuo. Abaixo o espectro de massas identificando a obtenção do produto.
Em trabalhos anteriores, Allwein et al. (2006) obtiveram o composto 1c através
da hidrogenação assimétrica de N-trifluoroacetamidas utilizando catalisadores de
ródio e ligantes quirais. Entretanto, foram necessárias de 3 a 5 etapas para alcançar
o produto desejado. Um resultado mais interessante foi alcançado recentemente por
Gallardo-donaire et al. (2018) que obtiveram diversas aminas enantiomericamente
puras através da aminação redutiva assimétrica de cetonas utilizando um complexo
de Ru e auxiliadores quirais. Os autores alcançaram 1c partindo da biaril cetona
precursora, com 90% de conversão e 87% ee após 16 h de reação.
Realizamos ainda a reação de transaminação em batelada utilizando as
enzimas livres e imobilizadas de A. fumigatus (4CHI) e da variante 4CHI_I145A. As
condições foram similares às realizadas anteriormente, mas em batelada o tempo de
reação foi 24 h. O resultado pode ser visto na tabela 13.
O
I HNO
1c
1b
Padrão interno m/z: 293
O
FF
F
64
Tabela 13. Síntese da 1-(4-bifenilil)etanilamina (1c) em batelada.
Entrada Biocatalisador Conversão (%) 1 4CHI livre 69,1
2 4CHI_I145A Livre 22,8
3 4CHI_E2 59,7
4 4CHI_I145A_E2 47,3
Condições: biaril cetona (1 mmol L-1), isopropilamina (750 mmol L-1), PLP (0,1 mmol L-1), DMF (25% v/v)
e 10 mg da enzima imobilizada, ou 3 mg de enzima liofilizada, em tampão NaHCO3 (10 mmol L-1, pH 9)
a 30 ºC por 24 h. Conversões analisadas por CG-EM.
Como podemos observar, tanto as reações mediadas por ω-TA de A. fumi-
gatus quanto aquelas empregando a variante obtiveram bons resultados em batelada.
Vale destacar que, embora a conversão tenha sido menor para a transaminase de A.
fumigatus após a imobilização (tabela 13, entradas 1 e 3), para a variante a conversão
dobrou (entradas 2 e 4). A comparação direta com a reação em fluxo é complicada,
uma vez que a quantidade de biocatalisador presente nas reações em batelada foi
muito menor, o que garantiu tempos de reação muito menores em condições
contínuas.
Posteriormente, ao mudar o ácido fenilborônico utilizado na reação de Suzuki,
a atividade do biocatalisador pôde ser testada para uma biaril cetona portando um
átomo de flúor em fluxo contínuo.
Esquema 24. Síntese da 1-(4’-fluoro-4-bifenilil)etilamina (F-1c) em condições semi-contínuas partindo da 4-bromoacetofenona (1a).
Neste caso, na reação de síntese assimétrica em fluxo contínuo, a conversão
65
foi 54% (esquema 24), não resultando em um aumento significativo quando
comparado à biaril amina não substituída 1c.
4.1.4.2 Síntese da 1-(5-fenil-3-piridinil)etilamina (2c) em condições semi-contínuas.
Moléculas contendo um centro piridínico são de grande interesse para indústria
química e farmacêutica. Além da sua utilização em diferentes reações na indústria e
na academia, esses compostos estão frequentemente presentes em produtos naturais
com atividade farmacológica. Esses fatores têm atraído o interesse para obtenção
dessas moléculas há anos. (ABUDU REXIT et al., 2016; ALTAF et al., 2015; HILL,
2010; LÓPEZ-IGLESIAS et al., 2016)
Assim, testamos nosso sistema na produção de aminas quirais contendo um
anel piridínico, iniciando com a síntese de 2c (esquema 25). Esse tipo de composto
se mostra bastante desafiador, principalmente na etapa de acoplamento, uma vez que
o nitrogênio presente no anel aromático pode interagir com o catalisador de paládio,
desativando-o ou tornando a reação mais lenta. Por esse motivo, o tempo da reação
de acoplamento foi aumentado para 2 h e a temperatura para 50ºC. (LI et al., 2016;
LIU et al., 2011; THOMPSON et al., 2005)
Esquema 25. Síntese da 1-(6-fenil-3-piridinil)etilamina (2c) em condições semi-contínuas partindo da 1-(5-bromopiridin-3-il)etanona (2a).
Assim, em condições semi-contínuas, o produto desejado foi observado com
uma conversão de 43%. O produto foi identificado através de espectrometria de
N
O
BOH
OH+
N
O10 mol% PdCl, NaHCO3 (25 nM, pH 9)
50% DMF, 50ºC2 horas
TA imobil. (4CHI), PLP
Tampão NaHCO3/HEPES30ºC
3,5h (tempo de residência)
Conversão 43%2a 2b 2c
Br
N
NH2
66
massa e a conversão calculada de acordo com o consumo do substrato. Como
podemos observar na figura 13, para esse substrato também foi possível observar um
pico relativo à transaminação da cetona 2a, o que mostra que a reação de
acoplamento não foi completa.
Figura 13. Comparação entre o T0 e a amostra após a reação de síntese assimétrica de 2c.
Entretanto, a reação em batelada mostrou resultados diferentes. Esses
resultados podem ser observados na tabela 14.
Tabela 14. Síntese da 1-(5-fenil-3-piridinil)etilamina em batelada.
Entrada Biocatalisador Conversão (%) 1 4CHI livre 23,8
2 4CHI_I145A Livre 74,2
3 4CHI_E2 86,8
4 4CHI_I145A_E2 99,3
Condições: biaril cetona (1 mmol L-1), isopropilamina (750 mmol L-1), PLP (0,1 mmol L-1), DMF (25% v/v)
e 10 mg da enzima imobilizada, ou 3 mg de enzima liofilizada, em tampão NaHCO3 (10 mmol L-1, pH 9)
a 30 ºC por 24 h. Conversões analisadas por CG-EM.
67
A transaminase de A. fumigatus livre apresentou atividade menor para esse
substrato do que para os demais avaliados. Entretanto, houve um aumento
considerável na conversão do substrato quando a enzima foi imobilizada, uma
mudança de 24% para 87% na conversão (tabela 14, entradas 1 e 3). Por outro lado,
a variante 4CHI_I145A livre apresentou uma atividade melhor do que a de tipo
selvagem e, após a imobilização, converteu quase que completamente o substrato. É
provável que esse efeito seja relacionado à troca do biocalisador por lotes mais novos.
No entanto, os resultados em batelada coincidem com aqueles observados para
substratos com grupos volumosos na posição meta. Essa maior atividade esta
relacionada com a acomodação da molécula no sítio catalítico.
4.1.4.3 Síntese assimétrica biocatalisada da 1-(6-fenil-3-piridinil)etilamina (3c) em
condições semi-contínuas.
Esquema 26. Síntese da 1-(6-fenil-3-piridinil)etilamina (3c) em condições semi-contínuas partindo da 1(6-bromopiridin-3-il)etanona (3a).
As condições para a síntese de 3c (esquema 26) foram as mesmas aplicadas
anteriormente. Após a etapa de síntese assimétrica, a amostra foi extraída e
derivatizada como já descrito e analisada em CG-EM. A conversão observada para
esse produto foi de 80%. Quando comparada com seu análogo sem o nitrogênio no
anel, a melhora na conversão é devido ao efeito retirador de elétrons do N no anel
aromático. O efeito do nitrogênio presente no anel em reações de transaminação
biocatalisada foi demostrado por López-Iglesias et al. (2016), que por análise
espectroscópica, observou um correlação entre a conversão e a frequência vibracional
NBr
O
BOH
OH+N
O
N
NH210 mol% PdCl,
NaHCO3 (25 nM, pH 9)
50% DMF, 50ºC2 horas
TA imobil. (4CHI), PLP
Tampão NaHCO3/HEPES30ºC
3,5h (tempo de residência)
Conversão 80%3a 3b 3c
68
na banda da carbonila no espectro de infravermelho (figura 14). O efeito foi ainda
maior quando um átomo de cloro estava ligado ao anel piridínico.
Figura 14. Representação gráfica da relação entre as frequências vibracionais da carbonila no espectro
de infravermelho (barras) e a conversão (linha) na transaminação de arilalquil cetonas e piridilalquil
cetonas catalisada por transaminases. Adaptado de López-iglesias et al. (2016)
Como mostra a figura 15, foi possível observar no cromatograma um pico
relacionado ao produto de transaminação de 3a, mostrando que a reação de Suzuki
não foi completa mesmo com o aumento no tempo reacional. Esse efeito já era
esperado, como discutido anteriormente, para estruturas contendo piridina em
reações de acoplamento de Suzuki.
69
Figura 15. Comparação entre o T0 e a amostra após a reação de síntese assimétrica de 3c.
A reação em batelada também foi realizada. Nesse caso utilizando a enzima
selvagem imobilizada em Ezig2TM
e a variante 4CHI_I145A imobilizada no mesmo
suporte.
Tabela 15. Comparação entre a síntese da 1-(6-fenil-3-piridinil)etilamina (3c) e 1-(4-bifenilil)etilamina (1c) em batelada.
Entrada Produto Biocatalisador Conversão (%) 1 3c 4CHI_E2 64,5
2 1c 4CHI_E2 59,7
3 3c 4CHI_I145A_E2 54,8
4 1c 4CHI_I145A_E2 47,3
Condições: biaril cetona (1 mmol L-1), isopropilamina (750 mmol L-1), PLP (0,1 mmol L-1), DMF (25% v/v)
e 10 mg da enzima imobilizada, ou 3 mg de enzima liofilizada, em tampão NaHCO3 (10 mmol L-1, pH 9)
a 30 ºC por 24 h. Conversões analisadas por CG-EM.
Como podemos observar na tabela 14, comparando com a síntese assimétrica
de 1c, em batelada, a diferença de atividade relativa a presença do nitrogênio no anel
se mostra um pouco mais sutil, tanto para a enzima selvagem quando para a variante.
70
4.1.5 Conclusões parciais As condições necessárias para produção de biaril aminas quirais através da
combinação da clássica reação de acoplamento de Suzuki-Miyaura e uma
transaminação catalisada por ω-transaminases foram desenvolvidas em condições
semi-contínuas e em batelada.
Na etapa de acoplamento, avaliamos diferentes bases e catalisadores de Pd.
Nas condições estudadas, os melhores resultados foram obtidos quando K2CO3 foi
utilizado como base, enquanto que as reações catalisadas por PdCl2 e Pd(OAc)2
apresentaram conversões similares. Ainda, dentre todas as soluções-tampão
avaliadas, o tampão NaHCO3 foi o único compatível com ambas as etapas do
processo. Na etapa de transaminação, as reações catalisadas pela transaminase de
A. fumigatus apresentaram os melhores resultados e, nesse caso, a hidrofobicidade
dos suportes aos quais as enzimas foram imobilizadas teve impacto significativo na
atividade enzimática, sendo maior quanto mais hidrofóbico o suporte.
Assim, 4 diferentes biaril aminas foram obtidas com conversões de 43-80% em
fluxo contínuo, dependendo da estrutura do substrato, e 23-99% em batelada,
dependendo da enzima utilizada, estrutura do substrato e forma de uso do
biocatalisador (imobilizada ou livre). De maneira geral, melhores conversões foram
alcançadas quando compostos com grupamentos na posição meta foram utilizados
em relação àqueles contendo grupamentos na posição para, provavelmente devido a
uma melhor acomodação no sítio catalítico da transaminase. Além disso, um efeito
retirador de elétrons conferido pelo nitrogênio presente no anel aromático foi indicado
como responsável pela maior conversão de compostos contendo um anel piridínico
na etapa de transaminação, embora tenham sido observadas conversões ligeiramente
menores na etapa de acoplamento para essas estruturas.
71
4.2 Lipase 4.2.1 Resolução cinética enzimática da (RS)-1-feniletilamina (PEA) catalisada
por lipase usando PEG600-diéster como agente acilante em condições de fluxo contínuo. O polietilenoglicol (PEG, figura 16) tem sido extremamente utilizado e estudado
em síntese orgânica. O PEG é um polímero comercializado em um amplo espectro de
pesos moleculares (geralmente de 200 a 4000) e sua aplicação é extremamente
versátil, sendo utilizado desde suporte para imobilização de catalisadores a solvente.
Além disso, devido a sua baixa volatilidade, alta solubilidade em água e baixa
solubilidade em solventes orgânicos apolares, o PEG tem sido empregado para
auxiliar o isolamento de produtos por extração ou destilação. Nesse contexto, o PEG
se destaca por ser um polímero barato, termicamente estável, não tóxico e de fácil
recuperação. (CHANDRASEKHAR et al., 2006; CIPOLATTI et al., 2014; PAPER,
2015; PIRES et al., 2017)
Figura 16. Polietilenoglicol (PEG).
Desse modo, o PEG vem sendo utilizado em reações de resolução cinética
enzimática principalmente como suporte para o substrato, embora essas reações
geralmente sejam para resolução cinética de álcoois. (NOGAWA et al., 2006;
OKUDOMI et al., 2007; SHIMOJO et al., 2004)
Na resolução cinética de aminas quirais, a escolha do agente acilante é um
fator extremamente importante. Na resolução de álcoois, ésteres enólicos, como
acetato de vinila, são os mais utilizados. Isso porque o enol formado na reação
tautomeriza, formando acetaldeído, mantendo o sentido da reação direcionado para
formação do produto e evitando uma eventual inibição pelo produto. Entretanto,
72
devido a alta nucleofilicidade de aminas, a reação não enzimática com o agente
acilante pode ocorrer, comprometendo a pureza enantiomérica do produto (HARA et
al., 2013; WEBER et al., 1999). Assim, ésteres não ativados, como acetato de etila,
podem ser utilizados, mas frequentemente conduzem a baixos rendimentos.
Anidridos de ácidos carboxílicos também são comumente utilizados como doadores
de acila. Em trabalho anteriores, diferentes anidridos foram utilizados e levaram a
desativação da lipase utilizada ao serem hidrolisados pela água da preparação
enzimática, diminuindo a quantidade de água disponível no meio, essencial para a
atividade enzimática. (BORNSCHEUER; KAZLAUSKAS, 2006).
Por outro lado, o polietilenoglicol é um polímero de fácil acesso e pode funcionar
como agente acilante na resolução cinética de aminas quirais. Além disso, o PEG
funciona como um doador de acila bivalente, uma vez que pode reagir com o substrato
nas duas extremidades.
Assim, utilizamos o PEG600-diéster como agente acilante para a reação de
resolução cinética da (RS)-1-feniletilamina catalisada pela Novozyme 435 em
condições de fluxo contínuo (esquema 27). Essa parte do trabalho foi realizada na
Universidade de Lisboa, sob co-orientação do Prof. Dr. Carlos A. M. Afonso.
Esquema 27. Resolução cinética da 1-feniletilamina usando PEG600 diéster como agente acilante
Devido a viscosidade do PEG, tolueno foi utilizado como solvente. Assim,
prosseguimos nossos experimentos com a lipase de Candida antactica B imobilizada
em resina acrílica (Novozyme 435; N435) que já é extensamente estudada na
literatura e reconhecida como um biocatalisador termoestável e eficiente.
73
Para a reação em fluxo contínuo, uma bomba de seringa modelo NE-1000, da
New Era Pump SystemsInc., foi utilizada. O reator de leito fixo possuía um volume
interno de 830 μL e foi preenchido com 303 mg do biocatalisador. Assim, o meio
reacional contendo a (RS)-PEA e o agente acilante PEG600-diéster foram bombeados
para dentro do reator a uma temperatura de 70ºC.
Em nossos testes iniciais, um tempo de residência de 30 min foi suficiente para
converter praticamente todo o enantiômero (R). Assim, segundo análise em GC
equipado com coluna quiral, o enantiômero de configuração (S), que não interagiu
com a enzima, foi recuperado o excesso enantiomérico >99% (figura 17). Além disso,
o rendimento foi de 49%. Assim, em termos de produtividade para esse enantiômero,
foi possível produzir 6,69×10-3
mmol /min×gN435.
Figura 17. Cromatograma da amina extraída após resolução cinética em fluxo contínuo.
A estabilidade do biocatalisador também foi testada (tabela 16). Para isso
alíquotas foram retiradas a cada 5 ciclos de reação (150 min). O experimento mostrou
que a enzima foi capaz de preservar a atividade por pelo menos 40 ciclos de reação
(20 h).
NH2
27.15
21.72
16.28
10.85
-0.020.00 9.10 18.20 27.30 36.40 45.50
(mVolt)
Tempo (min)
NH2
74
Tabela 16. Estabilidade do biocatalisador após 40 ciclos de reação
Entrada Ciclos ee de (S)-1 (%)a
1 5 98
2 10 98
3 15 99
4 20 >99
5 25 >99
6 30 >99
7 35 >99
8 40 >99
Condições: (RS)-PEA (1, 150 mmol L-1); PEG600-diéster (150 mmol L-1) em tolueno a 70 ºC. Reator de leito fixo preenchido com 303 mg de N435. Tr = 30 min. aDeterminado com CG-DIC equipado com coluna quiral.
Comparativamente, Päiviö et al. (2012) resolveram cineticamente diversas
aminas quirais em um sistema livre de solvente. Os biocatalisadores Novozyme 435
e CAL-B imobilizada pelo método sol-gel foram utilizados. Em testes de reuso,
utilizando a 1-feniletilamina, como substrato, e o metoxiacetato de isopropila, como
agente acilante, os biocatalisadores foram reutilizados por 5 ciclos, sendo cada ciclo
o tempo necessário para atingir 50% de conversão (6h). Entretanto, houve perda
significativa da atividade a partir do segundo ciclo para ambos os catalisadores. Em
outro trabalho, quando acetato de etila foi utilizado como agente acilante, para a
mesma concentração de substrato, a conversão foi de 46%. Todavia, nesse mesmo
trabalho, a concentração do substrato foi aumentada para 900min, diminuindo a
conversão para 42%, mas aumentando a produção da amida em 11 vezes. A enzima
pôde ser utilizada por 9 h sem perda da atividade (DE MIRANDA et al., 2013).
4.2.2 Avaliação de metodologias para a recuperação da (R)-1-feniletilamina; Com o objetivo de recuperar a amina de configuração (R) que reagiu com o PEG,
diferentes metodologias foram testadas em batelada: A hidrólise da amida catalisada
por N435 (figura 18.a), a etanólise em etapa única e em múltiplas etapas catalisada
por N435 na presença e ausência de solvente (Figura 18.b) e a clássica hidrólise
catalisada por ácido (figura 18.c).
75
Figura 18. Métodos para a recuperação da amina de configuração (R) a partir do produto da reação entre a amina e o PEG.
Assim, nossa primeira tentativa de recuperação da amina foi a hidrólise
utilizando o biocatalisador N435. Esse método é interessante pois utiliza o mesmo
catalisador da etapa de resolução cinética. Além disso, ter um catalisador heterogêneo
nos permitiria executar essa etapa também em fluxo contínuo. Assim, o biocatalisador
foi deixado para reagir com o substrato por 72 h sob agitação magnética a 50 ºC.
Figura 19. Cromatograma após a tentativa de hidrólise catalisada por Novozyme 435 mostrando os dois picos referentes a (RS)-1-feniletilamina.
NH2
0.00 9.10 18.20 27.30 36.40 45.50
Tempo (min)
NH2
76
Infelizmente, como é possível notar na figura 19, dois picos foram observados,
provavelmente resíduos da (RS)-1-feniletilamina da etapa anterior. Sendo assim,
nenhuma amina foi recuperada utilizando esse método.
Outra abordagem testada foi a etanólise catalisada pela Novozyme 435. Para
isso, 239 mg de (R)-1, 3 equiv. de etanol 96% (v/v) e 10% (p/p) do biocatalisador N435
foram agitados a 30 ºC sem adição de qualquer solvente. Após 96 h de reação, nenhu-
ma amina foi recuperada.
Assim, imaginamos que a quantidade de etanol poderia estar sendo danosa
para a enzima (HERNÁNDEZ-MARTÍN; OTERO, 2008). Desse modo, baseado no
trabalho de Rodrigues et al. (2010), avaliamos a etanólise em duas etapas. As
condições foram as mesmas aplicadas anteriormente, mas dessa vez 1/3 do etanol
foi adicionado no início da reação e 2/3 após 6 h de reação. A reação foi mantida por
96 h e o uso de tolueno como solvente também foi avaliado. Infelizmente, nenhuma
amina foi recuperada. A figura 48 mostra o cromatograma obtido, no qual só se
observou picos referente a (RS)-1-feniletilamina proveniente de contaminação.
Figura 20. Cromatograma após reação de etanólise em duas etapas catalisada por N435 em tolueno.
NH2
0.00 9.10 18.20 27.30 36.40 45.50
Tempo (min)
NH2
77
Apesar de nossos esforços, como dito anteriormente, lipases dificilmente
catalisam a quebra de ligações amida. Syrén et al. (2011) propuseram que isso
acontece porque lipases/esterases carecem de uma ligação de hidrogênio, existente
em amidases/proteases, entre o nitrogênio do substrato e a enzima, responsável pela
estabilização no estado de transição. Ainda que algumas lipases, como a CAL-A e
CAL-B, possam catalisar a hidrólise/etanólise de amidas, a reação pode durar
semanas.
Finalmente, nossa última abordagem para a recuperação da amina foi uma
clássica hidrólise catalisada por solução ácida (esquema 28). Assim, após a reação
de resolução cinética em fluxo contínuo, uma amostra de 4,6mL foi recolhida. A amina
de configuração (S) foi extraída e a solução remanescente evaporada sob vácuo,
revelando a amida derivada da reação com o PEG.
Esquema 28. Hidrólise da amida (R)-2 catalisada por solução ácida.
O produto da reação de resolução cinética foi adicionado a um balão contendo
uma solução 6N de HCl em metanol (50% v/v). A solução foi agitada sob refluxo a
80ºC por 16 h. Após evaporação e extração do PEG, a (R)-1-feniletilamina foi
recuperada com 65,9% de rendimento, se considerarmos apenas a (R)-1-
feniletilamina como material de partida ou 34,9%, considerando que o material de
partida era o racemato da amina. Abaixo podemos observar o cromatograma da amina
recuperada (figura 21), onde um pico menor da amina de configuração (S) também
está presente, provavelmente devido a contaminação do passo anterior. O excesso
enantiomérico nessa etapa foi de 95%.
78
Figura 21. Cromatograma da amina extraída após a hidrólise com solução ácida.
Embora a hidrólise por solução ácida tenha sido eficiente na recuperação da
amina de configuração (R), esse método possui a desvantagem de também hidrolisar
o PEG de volta a sua forma diácido, impossibilitando o seu reuso para um novo ciclo
de reações. Ainda que, em testes anteriores em nosso laboratório, o PEG600-diácido
tenha funcionado como agente acilante com bons rendimentos.
Concluindo, o uso do PEG como agente acilante se mostra uma alternativa
barata, prática e eficiente para a separação dos enantiômeros de aminas racêmicas.
Aliado à tecnologia de fluxo contínuo esse método se torna ainda mais interessante.
NH2
31.30
25.00
18.69
12.39
6.08
-0.02 0.00 9.10 18.20 27.30 36.40 45.50
(mVolt)
Tempo (min)
NH2
79
5 CONCLUSÕES Aqui apresentamos duas abordagens para a produção de aminas enantiome-
ricamente puras em condições de fluxo contínuo envolvendo diferentes biocata-
lisadores.
O uso de transaminase para a produção de aminas quirais ainda é
relativamente recente se comparado ao uso de outros biocatalisadores, como as
lipases. Embora ainda exista a dificuldade em encontrar transaminases com atividade
para substratos volumosos, neste trabalho, após triagem com diferentes TAs, foi
possível a obtenção de biaril aminas em condições semi-contínuas. Para isso,
desenvolvemos com sucesso as condições necessárias para que a, já clássica,
reação de acoplamento de Suzuki-Miyaura fosse compatível com a reação
biocatalisada. Além disso, descobrimos que a transaminase de A. fumigatus, bem
como a sua recém-descoberta variante, possuía atividade para biaril cetonas. Desse
modo, diferentes aminas foram produzidas, incluindo moléculas contendo piridina em
seu esqueleto.
Nas condições utilizadas para a reação de acoplamento de Suzuki-Miyaura, as
biaril cetonas precursoras foram obtidas em temperatura ambiente com catalisadores
de paládio livre de ligantes complexos. As biaril cetonas foram produzidas com
máxima conversão, com exceção para as piridinas que tiveram conversões pouco
abaixo, um resultado já esperado para esse tipo de molécula. Ainda, as reações de
transaminação foram realizadas em fluxo contínuo obtendo excelentes resultados.
Nas reações de resolução cinética catalisada por lipase em fluxo contínuo,
utilizamos o PEG600-diéster como agente acilante. Essa metodologia se mostrou
eficaz para separação de enantiômeros. O PEG é um composto barato e já
amplamente utilizado em síntese orgânica. Assim, neste trabalho, apresentamos pela
primeira vez o uso do PEG para a separação dos enantiômeros da (RS)-1-
feniletilamina.
Devido à forte ligação amida formada na etapa de acilação biocatalisada, uma
catálise ácida foi utilizada para recuperação do enantiômero (R) ligado ao PEG. Em
80
ambas as etapas, os enantiômeros foram recuperados com excelentes rendimentos e
pureza enantiomérica.
81
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ANEXOS
Cromatogramas obtidos por GC-MS A. Resolução cinética catalisada por transaminases do Kit ATA-ECS
Figura A1. Cromatograma da reação de resolução cinética da 1-feniletilamina catalisada pela enzima recombinante de E. coli. Tempo de residência – 5,5 min (1-feniletilamina); 5,7 min (acetofenona).
Figura A2. Cromatograma do controle negativo (branco) da reação de resolução cinética da 1-feniletilamina na ausência de enzima. Tempo de residência – 5,5 min (1-feniletilamina); 5,7 min (acetofenona).
Figura A3. Cromatograma da reação de resolução cinética da 1-feniletilamina catalisada pela enzima ECS-ATA01.Tempo de residência – 5,5 min (1-feniletilamina); 5,7 min (acetofenona).
102
Figura A4. Cromatograma da reação de resolução cinética da 1-feniletilamina catalisada pela enzima ECS-ATA02.Tempo de residência – 5,5 min (1-feniletilamina); 5,7 min (acetofenona).
Figura A5. Cromatograma da reação de resolução cinética da 1-feniletilamina catalisada pela enzima ECS-ATA03.Tempo de residência – 5,5 min (1-feniletilamina); 5,7 min (acetofenona).
Figura A6. Cromatograma da reação de resolução cinética da 1-feniletilamina catalisada pela enzimaECS-ATA04.Tempo de residência – 5,5 min (1-feniletilamina); 5,7 min (acetofenona).
Figura A7. Cromatograma da reação de resolução cinética da 1-feniletilamina catalisada pela enzima
103
ECS-ATA05.Tempo de residência – 5,5 min (1-feniletilamina); 5,7 min (acetofenona).
Figura A8. Cromatograma da reação de resolução cinética da 1-feniletilamina catalisada pela enzima ECS-ATA06.Tempo de residência – 5,5 min (1-feniletilamina); 5,7 min (acetofenona).
Figura A9. Cromatograma da reação de resolução cinética da 1-feniletilamina catalisada pela enzima ECS-ATA07.Tempo de residência – 5,5 min (1-feniletilamina); 5,7 min (acetofenona).
B. Síntese assimétrica da 1-feniletilamina catalisada por transaminases do Kit ATA-ECS utilizando isopropilamina como doador amino.
Figura B1. Cromatograma da reação de síntese assimétrica da 1-feniletilamina catalisada pela enzima recombinante de E. coli utilizando isopropilamina como doador amino. Tempo de residência – 5,5 min
104
(1-feniletilamina); 5,7 min (acetofenona).
Figura B2. Cromatograma do controle negativo (branco) da reação de síntese assimétrica da 1-feniletilamina na ausência de enzima utilizando isopropilamina como doador amino. Tempo de residência –5,7 min (acetofenona).
Figura B3. Cromatograma da reação de síntese assimétrica da 1-feniletilamina catalisada pela enzima ECS-ATA01 utilizando isopropilamina como doador amino. Tempo de residência –5,7 min (acetofenona).
Figura B4. Cromatograma da reação de síntese assimétrica da 1-feniletilamina catalisada pela enzima ECS-ATA02 utilizando isopropilamina como doador amino. Tempo de residência –5,7 min
105
(acetofenona).
Figura B5. Cromatograma da reação de síntese assimétrica da 1-feniletilamina catalisada pela enzima ECS-ATA03 utilizando isopropilamina como doador amino. Tempo de residência –5,7 min (acetofenona).
Figura B6. Cromatograma da reação de síntese assimétrica da 1-feniletilamina catalisada pela enzima ECS-ATA04 utilizando isopropilamina como doador amino. Tempo de residência –5,7 min (acetofenona).
Figura B7. Cromatograma da reação de síntese assimétrica da 1-feniletilamina catalisada pela enzima ECS-ATA05 utilizando isopropilamina como doador amino. Tempo de residência –5,7 min
106
(acetofenona).
Figura B8. Cromatograma da reação de síntese assimétrica da 1-feniletilamina catalisada pela enzima ECS-ATA06 utilizando isopropilamina como doador amino. Tempo de residência –5,7 min (acetofenona).
Figura B9. Cromatograma da reação de síntese assimétrica da 1-feniletilamina catalisada pela enzimaECS-ATA01 utilizando isopropilamina como doador amino. Tempo de residência – 5,5 min (1-feniletilamina); 5,7 min (acetofenona).
C. Síntese assimétrica da 1-feniletilamina catalisada por transaminases do Kit ATA-ECS.
Figura C1. Cromatograma da reação de síntese assimétrica da 1-feniletilamina catalisada pela enzima recombinante de E. coli utilizando um sistema de deslocamento de equilíbrio LDH/GDH. Tempo de
107
residência – 5,65 min (1-feniletanol); 5,7 min (acetofenona).
Figura C2. Cromatograma do controle negativo (branco) da reação de síntese assimétrica da 1-feniletilamina na ausência de enzima utilizando um sistema de deslocamento de equilíbrio LDH/GDH. Tempo de residência –5,7 min (acetofenona).
Figura C3. Cromatograma da reação de síntese assimétrica da 1-feniletilamina catalisada pela enzima ECS-ATA01 utilizando um sistema de deslocamento de equilíbrio LDH/GDH. Tempo de residência –5,7 min (acetofenona).
Figura C4. Cromatograma da reação de síntese assimétrica da 1-feniletilamina catalisada pela enzima ECS-ATA02 utilizando um sistema de deslocamento de equilíbrio LDH/GDH. Tempo de residência –
108
5,7 min (acetofenona).
Figura C5. Cromatograma da reação de síntese assimétrica da 1-feniletilamina catalisada pela enzima ECS-ATA03 utilizando um sistema de deslocamento de equilíbrio LDH/GDH. Tempo de residência – 5,65 min (1-feniletanol); 5,7 min (acetofenona).
Figura C6. Cromatograma da reação de síntese assimétrica da 1-feniletilamina catalisada pela enzima ECS-ATA04 utilizando um sistema de deslocamento de equilíbrio LDH/GDH. Tempo de residência – 5,65 min (1-feniletanol); 5,7 min (acetofenona).
Figura C7. Cromatograma da reação de síntese assimétrica da 1-feniletilamina catalisada pela enzima ECS-ATA05 um sistema de deslocamento de equilíbrio LDH/GDH. Tempo de residência – 5,65 min (1-
109
feniletanol); 5,7 min (acetofenona).
Figura C8. Cromatograma da reação de síntese assimétrica da 1-feniletilamina catalisada pela enzima ECS-ATA06 um sistema de deslocamento de equilíbrio LDH/GDH. Tempo de residência –5,7 min (acetofenona).
Figura C9. Cromatograma da reação de síntese assimétrica da 1-feniletilamina catalisada pela enzima ECS-ATA07 utilizando um sistema de deslocamento de equilíbrio LDH/GDH. Tempo de residência – 5,65 min (1-feniletanol); 5,7 min (acetofenona).
Estudos de diferentes bases e catalisadores de paládio na reação de acoplamento de Suzuki-Miyaura
Figura D1. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por cloreto de paládio em meio 1:1 DMF/água utilizando trietilamina como base. Tempo de residência dos picos identificados: 7,2 min (4’bromoacetofenona); 7,6 min (bifenila); 9,8 min
110
(4’fenilacetofenona).
Figura D2. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por cloreto de paládio em meio 1:1 DMF/água utilizando carbonato de potássio como base. Tempo de residência: 7,2 min (4’bromoacetofenona); 7,6 min (bifenila); 9,8 min (4’fenilacetofenona).
Figura D2. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por cloreto de paládio em meio 1:1 DMF/água utilizando trietilamina como base. Tempo de residência: 7,2 min (4’bromoacetofenona); 7,6 min (bifenila); 9,8 min (4’fenilacetofenona).
Figura D3. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por acetato de paládio em meio 1:1 DMF/água utilizando carbonato de potássio como base. Tempo de residência dos picos identificados: 7,2 min (4’bromoacetofenona); 7,6 min
111
(bifenila); 9,8 min (4’fenilacetofenona).
Figura D4. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por acetato de paládio em meio 1:1 DMF/água utilizando trietilamina como base. Tempo de residência dos picos identificados: 7,2 min (4’bromoacetofenona); 7,6 min (bifenila); 9,8 min (4’fenilacetofenona).
Figura D5. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por paládio suportado em sulfato de bário em meio 1:1 DMF/água utilizando carbonato de potássio como base. Tempo de residência dos picos identificados: 7,2 min (4’bromoacetofenona);
Figura D6. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por paládio suportado em sulfato de bário em meio 1:1 DMF/água utilizando trietilamina como base. Tempo de residência dos picos identificados: 7,2 min (4’bromoacetofenona);
112
D. Avaliação de diferentes soluções-tampão na reação de acoplamento de Suzuki-Miyaura em batelada.
Figura E1. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por acetato de paládio em meio 1:1 DMF/Tampão HEPES (50mM, pH8).Tempo de residência dos picos identificados: 7,2 min (4’bromoacetofenona); 7,6 min (bifenila);
Figura E2. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por acetato de paládio em meio 1:1 DMF/Tampão HEPES (25mM, pH8).Tempo de residência dos picos identificados: 7,2 min (4’bromoacetofenona); 7,6 min (bifenila);
Figura E3. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por acetato de paládio em meio 1:1 DMF/Tampão HEPES (12,5mM, pH8).Tempo de residência dos picos identificados: 7,2 min (4’bromoacetofenona); 7,6 min (bifenila);
Figura E4. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por acetato de paládio em meio 1:1 DMF/Tampão CHES (50mM, pH9).Tempo
113
de residência dos picos identificados: 7,2 min (4’bromoacetofenona); 7,6 min (bifenila);
Figura E5. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por acetato de paládio em meio 1:1 DMF/Tampão CHES (25mM, pH9).Tempo de residência dos picos identificados:7,2 min (4’bromoacetofenona); 7,6 min (bifenila); 9,8 min (4’fenilacetofenona).
Figura E6. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por acetato de paládio em meio 1:1 DMF/Tampão CHES (12,5mM, pH9).Tempo de residência dos picos identificados: 7,2 min (4’bromoacetofenona); 7,6 min (bifenila);
Figura E7. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por acetato de paládio em meio 1:1 DMF/Tampão Na2PO4 (100mM, pH7,5).(método alterado) Tempo de residência dos picos identificados: 6,1 min (4’bromoacetofenona);
114
6,6min (bifenila);
Figura E8. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por acetato de paládio em meio 1:1 DMF/Tampão NaHCO3 (25mM, pH9).(método alterado) Tempo de residência dos picos identificados: 6,6 min (bifenila); 9, min (4’fenilacetofenona).
Figura E9. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por cloreto de paládio em meio 1:1 DMF/Tampão HEPES (50mM, pH8).Tempo de residência dos picos identificados: 7,2 min (4’bromoacetofenona); 7,6 min (bifenila);
Figura E10. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por cloreto de paládio em meio 1:1 DMF/Tampão HEPES (25mM, pH8).Tempo de residência dos picos identificados: 7,2 min (4’bromoacetofenona);
Figura E11. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por cloreto de paládio em meio 1:1 DMF/Tampão HEPES (12,5mM,
115
pH8).Tempo de residência dos picos identificados: 7,2 min (4’bromoacetofenona);
Figura E12. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por cloreto de paládio em meio 1:1 DMF/Tampão CHES (50mM, pH9).Tempo de residência dos picos identificados: 7,2 min (4’bromoacetofenona); 7,6 min (bifenila);
Figura E13. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por cloreto de paládio em meio 1:1 DMF/Tampão CHES (25mM, pH9).Tempo de residência dos picos identificados: 7,2 min (4’bromoacetofenona); 7,6 min (bifenila);
Figura E14. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por cloreto de paládio em meio 1:1 DMF/Tampão CHES (12,5mM, pH9).Tempo de residência dos picos identificados: 7,2 min (4’bromoacetofenona);
Figura E15. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por cloreto de paládio em meio 1:1 DMF/Tampão Na2PO4 (100mM, pH7,5).(método alterado) Tempo de residência dos picos identificados: 6,1 min (4’bromoacetofenona);
116
6,6min (bifenila);
Figura E16. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por cloreto de paládio em meio 1:1 DMF/Tampão NaHCO3 (25mM, pH9).(método alterado)Tempo de residência dos picos identificados:); 6,6 min (bifenila); 9,6 min (4’fenilacetofenona).
E. Estudos de diferentes concentrações de DMF na reação de acoplamento de Suzuki-Miyaura.
Figura F1. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por acetato de paládio em meio 10% DMF/TampãoNaHCO3 (25mM, pH9).Tempo de residência dos picos identificados: 9,8 min (4’fenilacetofenona).
Figura F2. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por acetato de paládio em meio 20% DMF/Tampão NaHCO3 (25mM,
117
pH9).Tempo de residência dos picos identificados: 9,8 min (4’fenilacetofenona).
Figura F3. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por acetato de paládio em meio 30% DMF/Tampão NaHCO3 (25mM, pH9).Tempo de residência dos picos identificados: 9,8 min (4’fenilacetofenona).
Figura F4. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por acetato de paládio em meio 40% DMF/Tampão NaHCO3 (25mM, pH9).Tempo de residência dos picos identificados: 9,8 min (4’fenilacetofenona).
Figura F5. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por acetato de paládio em meio 50% DMF/Tampão NaHCO3 (25mM,
118
pH9).Tempo de residência dos picos identificados: 9,8 min (4’fenilacetofenona).
Figura F6. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por cloreto de paládio em meio 10% DMF/Tampão NaHCO3 (25mM, pH9).
Figura F7. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por cloreto de paládio em meio 20% DMF/Tampão NaHCO3 (25mM, pH9).Tempo de residência dos picos identificados: 9,8 min (4’fenilacetofenona).
Figura F8. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por cloreto de paládio em meio 30% DMF/Tampão NaHCO3 (25mM, pH9).
Figura F9. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por cloreto de paládio em meio 40% DMF/Tampão NaHCO3 (25mM,
119
pH9).Tempo de residência dos picos identificados: 9,8 min (4’fenilacetofenona).
Figura F10. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por cloreto de paládio em meio 50% DMF/Tampão NaHCO3 (25mM, pH9).Tempo de residência dos picos identificados: 9,8 min (4’fenilacetofenona).
F. Síntese assimétrica utilizando substratos de interesse, em batelada, nas condições compatíveis com a reação de Suzuki.
- Síntese assimétrica partindo da 3-acetil-5-bromopiridina (2a)
Figura G1. Cromatograma do controle negativo da reação de síntese assimétrica partindo da3-acetil-5-bromopiridina (2a) na ausência de enzima utilizando(RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 8,2 min (3-acetil-5-bromopiridina).
Figura G2. Cromatograma da reação de síntese assimétrica partindo da 3-acetil-5-bromopiridina (2a) catalisada pela enzima livre de V. fluvialis utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo
120
de residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 8,2 min (3-acetil-5-bromopiridina).
Figura G3. Cromatograma da reação de síntese assimétrica partindo da 3-acetil-5-bromopiridina (2a) catalisada pelo biocatalisador 4CHI_E1 utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 4,1 min (acetofenona); 8,2 min (3-acetil-5-bromopiridina); 9,3 min (1-(5-bromo-3-piridinil)etilamina).
Figura G4. Cromatograma da reação de síntese assimétrica partindo da 3-acetil-5-bromopiridina (2a) catalisada pelo biocatalisador 4CHI_E2 utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 4,1 min (acetofenona); 8,2 min (3-acetil-5-bromopiridina); 9,3 min (1-(5-bromo-3-piridinil)etilamina).
Figura G5. Cromatograma da reação de síntese assimétrica partindo da 3-acetil-5-bromopiridina (2a) catalisada pelo biocatalisador CVi_E3 utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de
121
residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 8,2 min (3-acetil-5-bromopiridina).
Figura G6. Cromatograma da reação de síntese assimétrica partindo da 3-acetil-5-bromopiridina (2a) catalisada pelo biocatalisador 3HMU_E1 utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 8,2 min (3-acetil-5-bromopiridina).
- Síntese assimétrica partindo da 3-acetil-6-bromopiridina (3a)
Figura G7. Cromatograma do controle negativo da reação de síntese assimétrica da 3-acetil-6-bromopiridina (3a) na ausência de enzima utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 9 min (3-acetil-6-bromopiridina).
Figura G8. Cromatograma da reação de síntese assimétrica da 3-acetil-6-bromopiridina (3a) catalisada pela enzima livre de V. fluvialis utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de
122
residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 9 min (3-acetil-6-bromopiridina).
Figura G9. Cromatograma da reação de síntese assimétrica da 3-acetil-6-bromopiridina (3a) catalisada pelo biocatalisador 4CHI_E1 utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 9 min (3-acetil-6-bromopiridina).
Figura G10. Cromatograma da reação de síntese assimétrica da 3-acetil-6-bromopiridina (3a) catalisada pelo biocatalisador 4CHI_E2 utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 4,1 min (acetofenona); 9 min (3-acetil-6-bromopiridina); 10,1 min (1-(6-bromo-3-piridinil)etilamina).
Figura G11. Cromatograma da reação de síntese assimétrica da 3-acetil-6-bromopiridina (3a) catalisada pelo biocatalisador CVi_E3 utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de
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residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 9 min (3-acetil-6-bromopiridina).
Figura G12. Cromatograma da reação de síntese assimétrica da 3-acetil-6-bromopiridina (3a) catalisada pelo biocatalisador 3HMU_E1 utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 9 min (3-acetil-6-bromopiridina).
- Síntese assimétrica partindo da 4-(3-bromofenil)-2-butanona (4a)
Figura G13. Cromatograma do controle negativo da reação de síntese assimétrica partindo da 4-(3-bromofenil)-2-butanona (4a) na ausência de enzima utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 11,1 min (4-(3-bromofenil)-2-butanona).
Figura G14. Cromatograma da reação de síntese assimétrica partindo da 4-(3-bromofenil)-2-butanona (4a) catalisada pela enzima livre de V. fluvialis utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 11,1 min (4-(3-bromofenil)-2-
124
butanona).
Figura G15. Cromatograma da reação de síntese assimétrica partindo da 4-(3-bromofenil)-2-butanona (4a) catalisada pelo biocatalisador 4CHI_E1 utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de residência dos picos identificados:3,9 min (1-feniletilamina); 4,1 min (acetofenona), 11,1 min (4-(3-bromofenil)-2-butanona) 11,3 min (4-(3-bromofenil)-2-butilamina.
Figura G16. Cromatograma da reação de síntese assimétrica partindo da 4-(3-bromofenil)-2-butanona (4a) catalisada pelo biocatalisador 4CHI_E2 utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de residência dos picos identificados:3,9 min (1-feniletilamina); 4,1 min (acetofenona), 11,1 min (4-(3-bromofenil)-2-butanona) 11,3 min (4-(3-bromofenil)-2-butilamina.
Figura G17. Cromatograma da reação de síntese assimétrica partindo da 4-(3-bromofenil)-2-butanona (4a) catalisada pelo biocatalisador 4CHI_E3 utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 4,1 min (acetofenona), 11,1 min (4-(3-bromofenil)-2-butanona) 11,3 min (4-(3-bromofenil)-2-butilamina.
Figura G18. Cromatograma da reação de síntese assimétrica partindo da 4-(3-bromofenil)-2-butanona (4a) catalisada pelo biocatalisador 4CHI_CHI utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino.
125
Tempo de residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 11,1 min (4-(3-bromofenil)-2-butanona).
Figura G19. Cromatograma da reação de síntese assimétrica da 3-acetil-5-bromopiridina (2a) catalisada pelo biocatalisador CVi_E2 utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 11,1 min (4-(3-bromofenil)-2-butanona).
Figura G20. Cromatograma da reação de síntese assimétrica partindo da 4-(3-bromofenil)-2-butanona (4a) catalisada pelo biocatalisador CVi_E3 utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 11,1 min (4-(3-bromofenil)-2-butanona).
Figura G21. Cromatograma da reação de síntese assimétrica partindo da 4-(3-bromofenil)-2-butanona (4a) catalisada pelo biocatalisador CVi_CHI utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 11,1 min (4-(3-bromofenil)-2-butanona).
Figura G22. Cromatograma da reação de síntese assimétrica partindo da 4-(3-bromofenil)-2-butanona (4a) catalisada pelo biocatalisador 3HMU_E1 utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 11,1 min (4-(3-bromofenil)-2-
126
butanona).
- Síntese assimétrica partindo 4-(4-bromofenil)-2-butanona (5a)
Figura G23. Cromatograma do controle negativo da reação de síntese assimétrica partindo da 4-(4-bromofenil)-2-butanona (5a) na ausência de enzima utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 11,1 min (4-(4-bromofenil)-2-butanona).
Figura G24. Cromatograma da reação de síntese assimétrica partindo da 4-(4-bromofenil)-2-butanona (5a) catalisada pela enzima livre de V. fluvialis utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 11,1 min (4-(4-bromofenil)-2-butanona).
Figura G25. Cromatograma da reação de síntese assimétrica partindo da 4-(4-bromofenil)-2-butanona (5a) catalisada pelo biocatalisador 4CHI_E1 utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 11,1 min (4-(4-bromofenil)-2-
127
butanona).
Figura G26. Cromatograma da reação de síntese assimétrica partindo da 4-(4-bromofenil)-2-butanona (5a) catalisada pelo biocatalisador 4CHI_E2 utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de residência dos picos identificados:3,9 min (1-feniletilamina); 4,1 min (acetofenona), 11,1 min (4-(3-bromofenil)-2-butanona) 11,3 min (4-(4-bromofenil)-2-butilamina.
Figura G27. Cromatograma da reação de síntese assimétrica partindo da 4-(4-bromofenil)-2-butanona (5a) catalisada pelo biocatalisador 4CHI_E3 utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 4,1 min (acetofenona), 11,1 min (4-(4-bromofenil)-2-butanona) 11,3 min (4-(4-bromofenil)-2-butilamina.
Figura G28. Cromatograma da reação de síntese assimétrica partindo da 4-(4-bromofenil)-2-butanona (5a) catalisada pelo biocatalisador 4CHI_CHI utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 11,1 min (4-(4-bromofenil)-2-butanona).
Figura G29. Cromatograma da reação de síntese assimétrica partindo da 4-(4-bromofenil)-2-butanona (5a) catalisada pelo biocatalisador CVi_E2 utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo
128
de residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 11,1 min (4-(4-bromofenil)-2-butanona).
Figura G30. Cromatograma da reação de síntese assimétrica partindo da 4-(4-bromofenil)-2-butanona (5a) catalisada pelo biocatalisador CVi_E3 utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 11,1 min (4-(4-bromofenil)-2-butanona).
Figura G31. Cromatograma da reação de síntese assimétrica partindo da 4-(4-bromofenil)-2-butanona (5a) catalisada pelo biocatalisador CVi_CHI utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 11,1 min (4-(4-bromofenil)-2-butanona).
Figura G32. Cromatograma da reação de síntese assimétrica partindo da 4-(4-bromofenil)-2-butanona (5a) catalisada pelo biocatalisador 3HMU_E1 utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 11,1 min (4-(4-bromofenil)-2-butanona).
G. Síntese de biaril aminas por reação de acoplamento de Suzuki-Miyaura e transaminação biocatalisada em regime semi-contínuo
Figura H1. Comparação entre os cromato gramas da reação de síntese da 1-(4-bifenilil)etilamina em
129
fluxo contínuo. Em preto, a reação no tempo 0. Em rosa, amostra obtida após 3 h de tempo de residência.
Figura H2. Comparação entre os cromato gramas da reação de síntese da 1-(4’fluoro-4-bifenilil)etilamina em fluxo contínuo. Em preto, a reação no tempo 0. Em rosa, amostra obtida após 3 h de tempo de residência.
Figura H3. Comparação entre os cromatograma da reação de síntese da 1-(6-fenil-3-piridinil)etilamina em fluxo contínuo. Em preto, a reação no tempo 0. Em rosa, amostra obtida após 3 h de tempo de residência.
Figura H4. Comparação entre os cromato gramas da reação de síntese da 1-(5-fenil-3-piridinil)etilamina em fluxo contínuo.
H. Resolução cinética catalisada pela lipase de Candida antactica B imobilizada em resina acrílica (N435).
130
Figura I1. Cromatograma do primeiro ciclo da reação de resolução cinética da (RS)-1-feniletilamina usando PEG600 diéster como agente acilante em fluxo contínuo.
Figura I2. Cromatograma da reação de resolução cinética da (RS)-1-feniletilamina usando PEG600 diéster como agente acilante em fluxo contínuo. Ciclo 10.
Figura I3. Cromatograma da reação de resolução cinética da (RS)-1-feniletilamina usando PEG600 diéster como agente acilante em fluxo contínuo. Ciclo 15.
Figura I4. Cromatograma da reação de resolução cinética da (RS)-1-feniletilamina usando PEG600
131
diéster como agente acilante em fluxo contínuo. Ciclo 20.
Figura I5. Cromatograma da reação de resolução cinética da (RS)-1-feniletilamina usando PEG600 diéster como agente acilante em fluxo contínuo. Ciclo 30.
Figura I6. Cromatograma da reação de resolução cinética da (RS)-1-feniletilamina usando PEG600 diéster como agente acilante em fluxo contínuo. Ciclo 35.
Figura I7. Cromatograma da reação de resolução cinética da (RS)-1-feniletilamina usando PEG600 diéster como agente acilante em fluxo contínuo. Ciclo 40.
132
Espectro de massas obtidos em GC-MS
Figura J1. Espectro de massas da 1-feniletilamina.
Figura J2. Espectro de massas da acetofenona.
Figura J3. Espectro de massas da 4’-bromoacetofenona
Figura J4. Espectro de massas da 4’-fenilacetofenona
Figura J5. Espectro de massas da 2a
133
Figura J6. Espectro de massas da 3a
Figura J7. Espectro de massas da 4a
Figura J8. Espectro de massas da 5a
Figura J9. Espectro de massas da 2b
Figura J10. Espectro de massas da 3b
134
Figura J11. Espectro de massas dam-3b
Figura J12. Espectro de massas da p-3b
Figura J13. Espectro de massas da 1-(4-bifenilil)etilamina derivatizada.
Figura J14. Espectro de massas da1-(4’-fluoro-4-bifenilil)etilamina derivatizada.
Figura J15. Espectro de massas da 1-(6-fenil-3-piridinil)etilamina derivatizada.
135
Figura J16. Espectro de massas da 1-(5-fenil-3-piridinil)etilamina derivatizado
136
CROMATOGRAMAS CG-DIC
Figura K1. Cromatograma dos padrões (R)-1-feniletilamina e acetofenona. Tempo de residência – 14,6 min (1-feniletilamina derivatizada) e 5,3 (acetofenona).
Figura K2. Cromatograma do controle negativo (branco) da reação de resolução cinética da 1-feniletilamina na ausência de enzima. Tempo de residência – 14,6 min ((R)-1-feniletilamina) e 14,9 min
137
((S)-1-feniletilamina).
Figura K3. Cromatograma da reação de resolução cinética da 1-feniletilamina catalisada pela enzima ECS-ATA01. Tempo de residência dos picos identificados – 5,3 (acetofenona)e 14,9 min ((S)-1-feniletilamina).
Figura K4. Cromatograma da reação de resolução cinética da 1-feniletilamina catalisada pela enzima ECS-ATA02.Tempo de residência dos picos identificados – 5,3 (acetofenona)e 14,9 min ((S)-1-feniletilamina).
Figura K5. Cromatograma da reação de resolução cinética da 1-feniletilamina catalisada pela enzima ECS-ATA03.Tempo de residência dos picos identificados – 5,3 (acetofenona)e 14,9 min ((S)-1-
138
feniletilamina).
Figura K6. Cromatograma da reação de resolução cinética da 1-feniletilamina catalisada pela enzima ECS-ATA04.Tempo de residência dos picos identificados – 5,3 (acetofenona), 14,6 min ((R)-1-feniletilamina) e 14,9 min ((S)-1-feniletilamina).
Figura K7. Cromatograma da reação de resolução cinética da 1-feniletilamina catalisada pela enzima ECS-ATA05.Tempo de residência dos picos identificados – 5,3 (acetofenona)e 14,9 min ((S)-1-feniletilamina).
Figura K8. Cromatograma da reação de resolução cinética da 1-feniletilamina catalisada pela enzima ECS-ATA06.Tempo de residência dos picos identificados – 5,3 (acetofenona), 14,6 min ((R)-1-
139
feniletilamina) e 14,9 min ((S)-1-feniletilamina).
Figura K9. Cromatograma da reação de resolução cinética da 1-feniletilamina catalisada pela enzima ECS-ATA07.Tempo de residência dos picos identificados – 5,3 (acetofenona)e 14,9 min ((S)-1-feniletilamina).
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Espectro de Ressonância Magnética Nuclear (RMN)
Figura L1. RMN C13 do PEG600-diéster
141
Figura L2. RMN H1 do PEG600-diéster.
142
DIREITOS AUTORAIS DE USO DE IMAGEM
Figura M1. Direito de uso de imagem para a figura 1 deste trabalho.
143
Figura M2. Direito de uso de imagem para a figura 30 deste trabalho.