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JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS BIOTECNOLÓGICAS PARA A SÍNTESE DE AMINAS QUIRAIS EM CONDIÇÕES DE FLUXO CONTÍNUO Rio de Janeiro 2018

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Page 1: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA

ROTAS BIOTECNOLÓGICAS PARA A SÍNTESE DE AMINAS

QUIRAIS EM CONDIÇÕES DE FLUXO CONTÍNUO

Rio de Janeiro

2018

Page 2: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA

ROTAS BIOTECNOLÓGICAS PARA A SÍNTESE DE AMINAS QUIRAIS EM

CONDIÇÕES DE FLUXO CONTÍNUO

Tese de doutorado apresentada ao curso de Pós-

graduação em Ciências Farmacêuticas, da

Faculdade de Farmácia, da Universidade Federal

do Rio de Janeiro, como requisito parcial à

obtenção do título de Doutor em Ciências

Farmacêuticas.

Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Octavio Mendonça

Alves de Souza

Co-orientador(es): Prof. Dr. Carlos Alberto

Mateus Afonso e Profa. Dra. Ivana Correa Ramos

Leal

Colaborações internacionais: Prof. Dr. Uwe T.

Bornscheuer

Rio de Janeiro

2018

Page 3: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

CIP - Catalogação na Publicação

Elaborado pelo Sistema de Geração Automática da UFRJ com osdados fornecidos pelo(a) autor(a).

S729rSouza, Jonathan Farias Bassut Rotas biotecnológicas para a síntese de aminasquirais em condições de fluxo contínuo / JonathanFarias Bassut Souza. -- Rio de Janeiro, 2018. 165 f.

Orientador: Rodrigo Octavio Mendonça Alves deSouza . Coorientadora: Ivana Correa Ramos Leal. Tese (doutorado) - Universidade Federal do Riode Janeiro, Faculdade de Farmácia, Programa de PósGraduação em Ciências Farmacêuticas, 2018.

1. Biocatálise. 2. Fluxo contínuo. 3. Aminasquirais. I. de Souza , Rodrigo Octavio MendonçaAlves, orient. II. Leal, Ivana Correa Ramos,coorient. III. Título.

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“As defesas de tese são tão assépticas!

Tão puras e tão arrumadas.

E ao mesmo tempo, tão distantes da realidade que as gerou!

Elas não contam a história

Dos fragorosos erros e geniais intuições

Dos tropeções no escuro

E do progresso sem método

Dos inusitados acertos

Ou do sofrimento e da vontade de desistir.

Com início, meio e “happy end”

As teses contam uma história que não ocorreu.

As teses mentem”

- Prof. Reinaldo Carvalho Silva

Page 6: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

AGRADECIMENTOS

Para mim é extremamente difícil escrever essa seção de agradecimentos, pois

mesmo que eu dedicasse páginas inteiras à cada pessoa citada abaixo, minhas

palavras estariam muito aquém do sentimento de gratidão pela importância que elas

tiveram na minha vida e direta ou indiretamente a este trabalho.

Começo então agradecendo à minha mãe, Sonia Farias, por todo apoio e por

ser meu maior exemplo de resiliência. Nos recorrentes dias em que as vicissitudes da

vida me davam motivos para desistir, eu lembrava que minha mãe nunca desistiu e,

se preciso, ela recomeçava de novo e de novo. E ao meu pai, Agenor Bassut, pelo

apoio mesmo naquilo em que não podia entender, pelos conselhos, sermões, as

lágrimas de orgulho que presenciei cair e aquelas caíram por tantos motivos e eu não

estava lá para ver. Eu cheguei até aqui graças às décadas de sacrifícios e suor. E

embora eu não possa trazer-lhes a juventude de volta, minha missão será sempre

tentar construir uma sensação de que os tempos difíceis valeram a pena.

Aos meus irmãos, Emerson, Thayane e Patrick, por todo apoio durante todos

esses anos, pelo carinho e mútua admiração. Pelas diversas situações cotidianas que

moldaram quem eu sou e construíram quem eu ainda quero ser. Pela compreensão

com a minha ausência nas reuniões de família devido às responsabilidades do

doutorado. E aos meus sobrinhos, Thayssa, Yago e Lara, por trazerem a esperança

de que o futuro será melhor.

À minha namorada Erika Ruggio, por todo amor, compreensão e cuidado. Pelo

apoio e incentivo diários. Pelos ouvidos e abraços que fizeram da travessia desse

turbulento período tão mais fácil.

Ao meu orientador, Rodrigo Souza, pelo apoio desde o início dessa jornada. Por

todas as portas abertas, pelas quais serei eternamente grato. Pela confiança que

tornou esse trabalho possível mesmo com todos os obstáculos que se apresentaram.

Tive muita sorte em ter iniciado minha vida acadêmica em um grupo de pesquisa de

excelência como o BossGroup e só tenho a agradecer pela(s) oportunidade(s).

Obrigado!

Page 7: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

À minha co-orientadora, Ivana Leal, por todo incentivo e pelas conversas e,

principalmente, toda a paciência e por estar sempre tão disposta a ajudar, mesmo

quando eu precisava de uma assinatura em cima da hora, o que acontecia

praticamente uma vez por ano, geralmente em dezembro, às vezes durante o recesso.

Muito obrigado!

Ao meu co-orientador, Prof. Carlos Afonso, da Universidade de Lisboa, que me

recebeu tão amistosamente durante minha curta estadia em Lisboa e teve grande

contribuição a este trabalho. Espero que possamos trabalhar juntos novamente.

Obrigado, Professor!

Ao Prof. Uwe Bornscheuer pela parceria e a oportunidade de trabalhar no seu

grupo de pesquisa durante minha breve estadia na Alemanha e por toda sua

contribuição a este trabalho.

Ao Prof. Ivaldo Jr., a quem tenho grande admiração, por toda a ajuda durante

todos esses anos.

A todos do BossGroup pela conversas, risadas e apoio. Foi um grande prazer

estar esses 4 anos na companhia de vocês: Raquel Pinheiro e Stefânia Souza,

obrigado pelo apoio, pelas conversas e por toda ajuda, paciência e até preocupação,

durante todos esses anos. Anderson Aguillón, obrigado pelos bolos, pelas risadas,

pelas ricas conversas, pelo podcast e por ser um ótimo relações públicas. Marcus

Mattos, obrigado pelas longas conversas e pelo suporte no Brasil e na Alemanha.

Marco Macena, obrigado pelas proveitosas discussões sobre qualquer coisa, pelas

risadas e pela confiança em entrar em um carro que eu estou dirigindo (haha). Eloah

Ávila, obrigado pelas risadas e toda a ajuda. E não posso deixar de mencionar os

queridos Alexandre França (“Jonathan, espero não estar incomodando, mas...”),

Viviane Marques, Renata Aguiar, Júlio César, Amanda Miranda, Mauro Gomes,

Larissa Gotardo e Davi Nascimento.

A Ayad Dawood, que teve direta e importante participação nesse trabalho, mas

dificilmente lerá esse agradecimento. Em todo caso, vielen Dank für deine Mühe! Du

hast dazu beigetragen, dass dieser Werk Echt ist. Viel glück und auf Wiedersehen!

A todos os colegas do laboratório do Professor Carlos Afonso, em especial

Angelo Rocha e Carlos Monteiro que fizeram valorosas contribuições a este trabalho.

Page 8: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

À Idima e Euclides, serei sempre grato a vocês por tudo que já fizeram por mim.

Obrigado por todo apoio durante tantos anos.

Aos amigos Allan Melo, Beatriz Oliveira, Carolina Damasceno, Karen Barbosa,

Márcio Toledo, Mateus Oliveira, Thamires Cunha, Tháyna Sisnande, Thiago Tobias,

Rayza Adrielle, Stephanie Bustamante e Úrsula Laino. O apoio de vocês foi de

extrema importância durante a realização desse trabalho e para que eu conseguisse

chegar até o final disso tudo. A amizade de vocês é uma das coisas que mais tenho

orgulho. Obrigado!

Aos amigos que, apesar de distantes, acompanharam toda essa trajetória

diariamente e estavam sempre lá para apoiar, ouvir e aconselhar, fosse nos bons

momentos, nos ruins e nos desenfreadamente desastrosos: Alex Marques, Amanda

Menezes, André Anastácio, Caio Corrêa, Douglas Assis, Fabrícia Ribeiro, Felipe

Antunes, Fernando Henrique, Helio Paiva Neto, Leandro Araújo, Marcella Abreu,

Maria Elisa, Matthews Camargos, Murilo Franco, Osmar Golegã, Renato Jacques,

Rodrigo Cantini, Shi Sagara, Stefhan Rafael, Tarsis Azevedo e Thiago Guariglia.

Obrigado!

À Alexandra Elbakyan, pela luta em prol da democratização do conhecimento.

À minha banca de acompanhamento, Prof. Ivaldo Jr. (Novamente), Profa.

Gizela Dellamora (que tem me acompanhado desde o início da minha trajetória

acadêmica) e à Prof. Melissa Estrada (que desde o meu mestrado faz tão valorosas

contribuições ao meu trabalho).

À banca por aceitar o convite na avaliação desde trabalho.

À Capes e FAPERJ pelo apoio financeiro.

Page 9: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

RESUMO

SOUZA, Jonathan Farias Bassut. Rotas biotecnológicas para a síntese de aminas

quirais em condições de fluxo contínuo. Rio de Janeiro, 2018. Tese– Programa Pós-

graduação em Ciências Farmacêuticas, Faculdade de Farmácia, Universidade

Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2018.

Neste trabalho foram investigadas diferentes rotas biocatalisadas para a síntese

de aminas quirais enantiomericamente puras em condições de fluxo contínuo. Desse

modo, na primeira seção, foram estabelecidas as condições adequadas para a síntese

de biaril aminas através da combinação de uma reação de acoplamento de Suzuki-

Miyaura, em batelada, com subsequente reação de transaminação biocatalisada em

fluxo contínuo. Nesta seção, após triagem com diferentes ω-transaminases, a

transaminase de A. fumigatus foi capaz de reconhecer biaril cetonas como substratos.

Em seguida, diferentes soluções-tampão foram avaliados na reação de Suzuki-

Miyaura, de modo que o meio da reação de acoplamento fosse compatível com a

reação biocatalisada subsequente. Após estabelecidas as condições necessárias, as

transaminases imobilizadas de A. fumigatus (4CHI) e uma variante descoberta por

evolução direcionada (4CHI_I145A) foram utilizadas na obtenção de diversas biaril

aminas quirais tanto em batelada quanto em condições semi-contínuas com

conversões de até 80% em fluxo contínuo e até 99% em batelada.

Na segunda seção desse trabalho, o uso polietilenoglicol (PEG) como agente

acilante foi investigado na resolução cinética da (RS)-1-feniletilamina catalisada pela

lipase de C. antarctica imobilizada em resina acrílica (N435) em fluxo contínuo. Assim,

a (S)-1-feniletilamina foi obtida com 49% de rendimento e >99% de excesso

enantiomérico. O biocatalisador N435 pôde ainda ser utilizado por 40 ciclos sem perda

de atividade. Após o estudo de diferentes metodologias para a recuperação da amina

de configuração (R), a hidrólise da amida formada com o PEG catalisada por solução

ácida apresentou melhor resultado. A (R)-1-feniletilamina foi obtida com 34,9% de

rendimento e 95% de excesso enantiomérico.

Palavras-chave: biocatálise, fluxo contínuo, aminas quirais.

Page 10: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

ABSTRACT

SOUZA, Jonathan Farias Bassut. Biotechnological routes for the synthesis of chiral

amines in continuous flow conditions. Rio de Janeiro, 2018. Thesis – Pharmaceutical

Sciences Postgraduate Program, Faculty of Pharmacy, Federal University of Rio de

Janeiro, Rio de Janeiro, 2018.

In this work, different biocatalyzed routes were investigated for the synthesis of

enantiomerically pure chiral amines under continuous flow conditions. Thus, in the first

section, it was established the proper conditions for the synthesis of biaryl amines by

combining a Suzuki-Miyaura cross-coupling reaction in batch with posterior

biocatalyzed transamination reaction in continuous flow. In order to do this, after

screening with different ω-transaminases, A. fumigatus transaminase were identified

as capable of recognizing biaryl ketones as substrates. Then, different buffer solutions

were evaluated in the Suzuki-Miyaura reaction, so that the coupling reaction medium

was compatible with the subsequent biocatalyzed reaction. After establishment of the

necessary conditions, immobilized A. fumigatus transaminase (4CHI) and a variant

discovered by directed evolution (4CHI_I145A) were used for obtaining chiral biaryl

amines both in batch and in semi-continuous conditions with conversions of up to 80%

in continuous flow and up to 99% in batch.

In the second section of this work, the use of polyethylene glycol (PEG) as the

acylating agent were evaluated in the kinetic resolution of (RS)-1-phenylethylamine

catalyzed by immobilized C. antarctica lipase (N435) under continuous flow conditions.

Thus, (S)-1-phenylethylamine was obtained in 49% yield and >99% enantiomeric

excess. The N435 biocatalyst could be used for 40 cycles without loss of activity. After

investigation of different methodologies for recovering the (R)-amine, chemical

hydrolysis of the PEGylated amine by acidic solution showed the best results. (R)-1-

phenylethylamine was obtained in 34.9% yield and 95% enantiomeric excess.

Keywords: Biocatalysis, Continuous Flow, Chiral amines.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Estrutura de fármacos contendo amina quiral em sua estrutura. ................ 1

Figura 2. Esquema geral de sistemas de fluxo contínuo utilizados em diferentes

processos biocatalisados. ........................................................................................... 4

Figura 3. Tempo de residência. ................................................................................. 5

Figura 4. Síntese de aminas quirais catalisada por ω-TAs realizadas pela empresa

Celgene. ................................................................................................................... 16

Figura 5. Aminas obtidas com o sistema de reciclo do piruvato por uma aminoácido

oxidase. .................................................................................................................... 21

Figura 6. Cromatograma extraído de uma das amostras da reação de síntese

assimétrica catalisada por diferentes transaminases utilizando o sistema LDH/GDH e

espectro de massa utilizado para a identificação dos compostos.. .......................... 51

Figura 7. Abordagens propostas para a síntese de biaril aminas através da

combinação da reação de acoplamento de Suzuki-Miyaura e a transaminação

biocatalisada. ............................................................................................................ 52

Figura 8. A) ácido 2-(ciclohexilamino)-etanosulfônico (CHES); B) complexação do

paládio com a amina básica. .................................................................................... 56

Figura 9. Suporte EZIGtm

ligado à enzima. .............................................................. 57

Figura 10. Substratos selecionados para síntese assimétrica. ................................ 58

Figura 11. Aminas produzidas através da reação de Suzuki seguida de trans-

aminação biocatalisada em condições semi-contínuas. ........................................... 61

Figura 12. Cromatograma obtido após reação de síntese assimétrica de 1c

biocatalisada em fluxo contínuo. Abaixo o espectro de massas identificando a

obtenção do produto. ................................................................................................ 63

Figura 13. Comparação entre o t0 e a amostra após a reação de síntese assimétrica

de 2c. ........................................................................................................................ 66

Figura 14. Representação gráfica da relação entre as frequências vibracionais da

carbonila no espectro de infravermelho (barras) e a conversão (linha) na

transaminação de arilalquil cetonas e piridilalquil cetonas catalisada por

transaminases. ......................................................................................................... 68

Figura 15. Comparação entre o t0 e a amostra após a reação de síntese assimétrica

de 3c. ........................................................................................................................ 69

Figura 16. Polietilenoglicol (PEG). ........................................................................... 71

Page 12: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

Figura 17. Cromatograma da amina extraída após resolução cinética em fluxo

contínuo. ................................................................................................................... 73

Figura 18. Métodos para a recuperação da amina de configuração (R) a partir do

produto da reação entre a amina e o PEG. .............................................................. 75

Figura 19. Cromatograma após a tentativa de hidrólise catalisada por Novozyme 435

mostrando os dois picos referentes a (RS)-1-feniletilamina...................................... 75

Figura 20. Cromatograma após reação de etanólise em duas etapas catalisada por

N435 em tolueno. ..................................................................................................... 76

Figura 21. Cromatograma da amina extraída após a hidrólise com solução ácida. . 78

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LISTA DE ESQUEMAS

Esquema 1. Estratégias para uso de TAs para a síntese de aminas enantio-

mericamente puras. .................................................................................................... 9

Esquema 2. Primeira etapa do mecanismo da reação catalisada por transaminases.

.................................................................................................................................. 10

Esquema 3. Segunda etapa do mecanismo da reação catalisada por transaminases.

.................................................................................................................................. 11

Esquema 4. Esquema adaptado da reação realizada por Skalden et al. (2015). .... 13

Esquema 5. Síntese da sitagliptina por uma ω-TA mutante produzida por Jarvis et al.

(2010) ....................................................................................................................... 15

Esquema 6. Síntese assimétrica de aminas propargílicas. ...................................... 17

Esquema 7. Síntese do intermediário da silodosina. ............................................... 17

Esquema 8. Síntese assimétrica do intermediário do ramatroban por Busto et al.

(2014). ...................................................................................................................... 18

Esquema 9. Esquema da reação no modelo bifásico. ............................................. 20

Esquema 10. Síntese simultânea de (S)-aminoácidos e (R)-aminas com acoplamento

de α- e ω-TAs. (A) sistema AlaTA/ω-TAs. (B) sistemas TyrTA/ω-TA e AspTA/ω-TAs.

.................................................................................................................................. 22

Esquema 11. Reação entre a acetofenona e L-alanina catalisada por uma (S)-TA. 23

Esquema 12. Estratégias para o deslocamento do equilíbrio. ................................. 24

Esquema 13. Síntese quimio-enzimática do suvorexant com ciclização espontânea

pós reação de transaminação................................................................................... 26

Esquema 14. Resolução cinética dinâmica de um derivado do 3-fenil-GABA ......... 26

Esquema 15. Síntese do inibidor da proteína smoothened através da resolução

cinética dinâmica utilizando uma transaminase seguidas de etapas químicas......... 27

Esquema 16. Síntese quimio-enzimática da rivastigmina. ....................................... 27

Esquema 17. Reação de hidrólise catalisada por lipases ........................................ 29

Esquema 18. Mecanismo de reações catalisadas por lipases. ................................ 31

Esquema 19. Resolução cinética e dinâmica catalisada por lipases. ...................... 32

Esquema 20. Resolução cinética do intermediário do indinavir. .............................. 35

Esquema 21. Metodologias empregadas para o deslocamento do equilíbrio de

reações de síntese assimétrica. ............................................................................... 48

Esquema 22. Reação de acoplamento de Suzuki-Miyaura em solução 50% DMF em

Page 14: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

água. ......................................................................................................................... 53

Esquema 23. Síntese da 1-(4-bifenilil)etilamina em condições semi-contínuas

partindo da 4-bromoacetofenona. ............................................................................. 62

Esquema 24. Síntese da 1-(4’-fluoro-4-bifenilil)etilamina (F-1c) em condições semi-

contínuas partindo da 4-bromoacetofenona (1a). ..................................................... 64

Esquema 25. Síntese da 1-(6-fenil-3-piridinil)etilamina (2c) em condições semi-

contínuas partindo da 1-(5-bromopiridin-3-il)etanona (2a). ....................................... 65

Esquema 26. Síntese da 1-(6-fenil-3-piridinil)etilamina (3c) em condições semi-

contínuas partindo da 1(6-bromopiridin-3-il)etanona (3a). ........................................ 67

Esquema 27. Resolução cinética da 1-feniletilamina usando PEG600 diéster como

agente acilante ......................................................................................................... 72

Esquema 28. Hidrólise da amida (R)-2 catalisada por solução ácida. ..................... 77

Page 15: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Nomenclatura de reatores contínuos segundo seu volume de operação. .. 5

Tabela 2. Meia-vida de ω-TAs modificadas a diferentes temperaturas .................... 14

Tabela 3. (R)-Transaminases do kit ECS-ATA da Enzymicals ................................. 37

Tabela 4. Enzimas produzidas e imobilizadas pelo laboratório do professor Uwe T.

Bornscheuer ............................................................................................................. 38

Tabela 5. Tabela com informações sobre os suportes usados. ............................... 39

Tabela 6. Transaminase expressas e imobilizadas em Greifswald (Alemanha)....... 39

Tabela 7. Resolução cinética da (RS)-1-feniletilamina por transaminases imobilizadas

comerciais................................................................................................................. 47

Tabela 8. Reação de síntese assimétrica catalisada por diferentes transaminases

utilizando isopropilamina como doador amino. ......................................................... 49

Tabela 9. Reação de acoplamento cruzado de Suzuki-Miyaura entre a 4-bromo-

acetofenona e o ácido fenilborônico com diferentes bases e catalisadores. ............ 53

Tabela 10. Avaliação de diferentes soluções-tampão na reação de acoplamento de

Suzuki-Miyaura ......................................................................................................... 54

Tabela 11. Avaliação de diferentes concentrações DMF na reação de acoplamento de

Suzuki-Miyaura entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico. .................... 56

Tabela 12. Conversão na síntese assimétrica de diferentes aminas utilizando

transaminases liofilizadas e imobilizadas em diferentes suportes. ........................... 58

Tabela 13. Síntese da 1-(4-bifenilil)etanilamina (1c) em batelada. .......................... 64

Tabela 14. Síntese da 1-(6-fenil-3-piridinil)etilamina (3c) em batelada. ................... 66

Tabela 15. Comparação entre a síntese da 1-(6-fenil-3-piridinil)etilamina (3c) e 1-(4-

bifenilil)etilamina (1c) em batelada. .......................................................................... 69

Tabela 16. Estabilidade do biocatalisador após 40 ciclos de reação ....................... 74

Page 16: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

4CHI – Transaminase de Aspegillus fumigatus

4CHI_I145A – Variante da transaminase de Aspegillus fumigatus

AAO – aminoácido oxidase

AcOEt – Acetato de etila

ADH – Álcool desidrogenase

ADN – Ácido desoxirribonucleico

AlaDH – Alanina desidrogenase

AlaTA – Alanina transaminase

Asp – Aspartato

AspTA – Aspartato transaminase

CDCl3 – Clorofórmio deuterado

CG-DIC – Cromatografia gasosa com detector por ionização de chamas

CG-EM – Cromatografia gasosa acoplada à espectrômetria de massas

CHES - Ácido 2-(ciclohexilamino)etanossulfônico

DMF – dimetilformamida

DMSO – sulfóxido de dimetila

Dopa – L-3,4-diidroxifenilalanina

EC – Enzyme commission number

ee – Excesso enantiomérico

epPCR – Reação em cadeia da polimerase propensa a erros

FDH – Formato desidrogenase

FP – (4R)-Fluoroprolina

GABA – Ácido 4-aminobutanóico

GDH – Glicose desidrogenase

Page 17: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

h – hora(s)

HEPES - Ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfônico

His – Histidina

Hz – Hertz

IPTG - isopropil-3-D-tiogalactopiranosídeo

LDH – Lactato desidrogenase

m3 – metro(s) cúbico

MBTFA - N-metil-bis(trifluoroacetamida)

MeOH – Metanol

mg – miligrama

min – minuto(s)

mmol L-1

– milimol por litro

mol L-1

– mol por litro

MTBE – Éter metil terc-butílico

MBTFA - N-metil-bis(trifluoroacetamida)

N435 – Lipase de Candida antactica B imobilizada em resina acrílica comercializada

pela Novozymes (Novozyme 435)

NAD+ – Dinucleotídeo de nicotinamida e adenina (forma oxidada)

NADH – Dinucleotídeo de nicotinamida e adenina (forma reduzida)

p/p – Peso/peso

Page 18: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

PEA – 1-feniletilamina

PEG – Polietilenoglicol

pH – Potencial hidrogeniônico

PLP – Piridoxal fosfato

PMP – Piridoxamina fosfato

PVA – Álcool polivinílico

RCD – Resolução cinética dinâmica

RLF – Reator de leito fixo

rpm – rotações por minuto

Ser – Serina

SMO – proteína smoothened

TA – Transaminase

TEA – Trietanolamina

THF – Tetraidrofurano

Tr – Tempo de residência

TyrTA – Tirosina transaminase

U g-1

– micromol de produto formado por minuto e por grama de biocatalisador

U mL-1

– micromol de produto por minuto e mililitro do biocatalisador

v/v – Volume/volume

µm – Micrômetro

ω-TA[(4R)-FP] – ω-transaminase incorporada com o aminoácido (4R)-Fluoroprolina.

ω-TAdopa – ω-transaminase incorporada com o aminoácido L-3,4-diidroxifenilalanina.

ω-TAdp[(4R)-FP] – ω-transaminase incorporada com o aminoácido (4R)-Fluoroprolina

e L-3,4-diidroxifenilalanina.

Page 19: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO.......................................................................................... 1

1.1 Biocatálise em fluxo contínuo ........................................................ 3

1.2 Transaminases ................................................................................. 8

1.2.1 Mecanismo de reação. ................................................................... 9

1.2.2 Engenharia de proteínas na obtenção de novas transaminases.. 11

1.2.3 Transaminases na síntese de aminas quirais .............................. 15

1.2.4 Resolução cinética catalisada por transaminases ........................ 19

1.2.5 Síntese assimétrica catalisada por transaminases ...................... 22

1.2.6 Processos quimio-enzimáticos envolvendo transaminases. ........ 25

1.2.7 Transaminases em fluxo contínuo ............................................... 28

1.3 Lipases ........................................................................................... 29

1.3.1 Mecanismo de reações catalisadas por lipases ........................... 30

1.3.2 Resolução cinética catalisada por lipases para a produção de amina

quirais enantiomericamente puras. .................................................................... 31

1.3.3 Lipases em fluxo contínuo............................................................ 33

2 OBJETIVO GERAL ................................................................................ 36

2.1 Objetivos específicos .................................................................... 36

3 MATERIAIS E MÉTODOS ...................................................................... 37

3.1 Reagentes....................................................................................... 37

3.2 Enzimas .......................................................................................... 37

3.2.1 Lipases ......................................................................................... 37

3.2.2 Transaminases comerciais........................................................... 37

3.2.3 Transaminases imobilizadas ........................................................ 38

3.2.4 Obtenção das transaminases de A. fumigatus e a variante

4CHI_I145A e imobilização. .............................................................................. 39

3.3 Métodos analíticos ........................................................................ 40

3.3.1 Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa

(UFRJ). .................................................................................................... 40

3.3.2 Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa

(Greifswald universität) ...................................................................................... 41

Page 20: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

3.3.3 Cromatografia gasosa com detector por ionização de chamas

(UFRJ) 41

3.3.4 Cromatografia gasosa com detector por ionização de chamas

(ULisboa) 41

3.4 Equipamentos ................................................................................ 42

3.4.1 Sistemas de Fluxo contínuo (UFRJ) ............................................ 42

3.4.2 Ressonância magnética nuclear .................................................. 42

3.5 Condições reacionais .................................................................... 42

3.5.1 Teste de atividade de ω-transaminases comerciais. .................... 42

3.5.2 Síntese assimétrica usando isopropilamina como doador amino. 43

3.5.3 Síntese assimétrica usando um sistema de deslocamento de

equilíbrio LDH/GDH. .......................................................................................... 43

3.5.4 Reações de acoplamento cruzado de Suzuki-Miyaura ................ 44

3.5.5 Síntese de biaril aminas em condições semi-contínuas ............... 44

3.5.6 Síntese do agente acilante PEG600 (dietil diéster) ........................ 45

3.5.7 Resolução cinética enzimática da (RS)-1-feniletilamina usando

PEG600 (dietil diéster) como agente acilante em condições de fluxo continuo... 45

3.5.8 Hidrólise química para recuperação da (R)-1-feniletilamina......... 46

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO.............................................................. 47

4.1 Transaminases ............................................................................... 47

4.1.1 Avaliação da atividade de transaminases imobilizadas comerciais.

............................................................................................................................ 47

4.1.2 Avaliação das metodologias de deslocamento do equilíbrio para

síntese assimétrica. ........................................................................................... 48

4.1.3 Avaliação das condições para síntese de biaril aminas por reação

de acoplamento de Suzuki-Miyaura e transaminação biocatalisada em cascata

em fluxo contínuo. ............................................................................................. 51

4.1.4 Síntese de biaril aminas por reação de acoplamento de Suzuki-

Miyaura e transaminação biocatalisada em regime semi-contínuo. .................. 60

4.1.5 Conclusões parciais ..................................................................... 70

4.2 Lipase ............................................................................................. 71

4.2.1 Resolução cinética enzimática da (RS)-1-feniletilamina (PEA)

catalisada por lipase usando PEG600-diéster como agente acilante em condições

Page 21: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

de fluxo contínuo. .............................................................................................. 71

4.2.2 Avaliação de metodologias para a recuperação da (R)-1-

feniletilamina; ..................................................................................................... 74

5 CONCLUSÕES....................................................................................... 79

6 REFERÊNCIAS ...................................................................................... 81

ANEXOS ...................................................................................................... 101

Page 22: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

1

1 INTRODUÇÃO Aminas quirais enantiomericamente puras são de grande importância para a

indústria química e farmacêutica pois funcionam como blocos de construção para

compostos bioativos, como por exemplo, para a rivastigmina, utilizada no tratamento

da doença mal de Alzheimer e Parkinson, a sitagliptina, para tratamento da diabetes,

e a tansulosina, indicada para o tratamento dos sintomas da hiperplasia prostática

benigna (figura 1). Esses compostos fazem parte de um mercado que movimenta

bilhões de dólares todo ano (BRENNA et al., 2017; FUCHS et al., 2012, GHISLIERI;

TURNER, 2014, HANSEN et al., 2009).

Figura 1. Estrutura de fármacos contendo amina quiral em sua estrutura.

Entre as metodologias não-enzimáticas mais comumente empregadas para a

obtenção de aminas opticamente ativas, a resolução de aminas racêmicas pela adição

de ácidos carboxílicos quirais é ainda a abordagem mais comum. Entretanto, a busca

por agentes de resolução pode ser problemática, levando ao uso de uma solução de

diversos ânions de ácidos carboxílicos (conhecida como dutch resolution), que tem

como maior desvantagem a impossibilidade de reuso da solução. Outros métodos

comuns são a aminação redutiva e a redução de iminas e enamidas, que têm cetonas

como material de partida, mas tornam necessárias laboriosas etapas para obtenção

do produto final. Além disso, a síntese dos substratos imina e enamida muitas vezes

se mostra complicada (BREUER et al., 2004; GHISLIERI; TURNER, 2014; NUGENT;

EL-SHAZLY, 2010).

N

N

NN

O NH2

F

F

F

F3CSitagliptina N

ON

O

Rivastigmina

MeO

HN

O

EtO

Tansulosina

Page 23: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

2

Nesse contexto, a biocatálise se tornou uma importante ferramenta para a

síntese dessas moléculas por apresentar diversas vantagens em relação aos métodos

químicos tradicionais, como a facilidade de aplicação, o menor impacto ambiental, a

alta seletividade das enzimas e a maior segurança do processo (HOLLMANN et al.,

2011).

Assim, diferentes enzimas têm sido empregadas para obtenção de aminas

assimétricas enantiomericamente puras, entre elas, as lipases e as ω-transaminases

(HÖHNE; BORNSCHEUER, 2009).

Lipases são empregadas, principalmente, em reações de resolução cinética

para separar os enantiomêros de um racemato, considerando que em uma resolução

cinética ideal apenas um dos enantiômeros reage, enquanto o outro permanece

inalterado. Desse modo, esse tipo de reação possui um rendimento máximo teórico

de 50%, a menos que uma etapa de racemização do enantiômero não transformado

seja incluída no processo. À reação de resolução cinética acoplada à etapa de

racemização dá-se o nome de resolução cinética dinâmica (RCD) (ITABAIANA et al.,

2013; DE SOUZA et al., 2015).

Por outro lado, as transaminases produzem aminas quirais por meio de reações

de transaminação, seja por resolução cinética ou desracemização, partindo da amina

racêmica, ou por síntese assimétrica, partindo de uma cetona pró-quiral (HÖHNE;

BORNSCHEUER, UWE T., 2012).

Embora, o uso desses biocatalisadores possua diversas vantagens, algumas

desvantagens ainda persistem e dificultam a aplicação industrial. Elas estão

relacionadas com a baixa estabilidade térmica e operacional dos biocatalisadores,

baixa tolerância a altas concentrações de solventes orgânicos, a pouca

disponibilidade e baixa pureza das enzimas, impactando negativamente no custo.

Assim, a imobilização da enzima é um método amplamente utilizado para o melhora-

mento da estabilidade enzimática e para a recuperação do biocatalisador, sendo

ambos fatores cruciais para a viabilidade econômica do processo. As vantagens da

imobilização são ainda maiores quando esses biocatalisadores são utilizados em

Page 24: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

3

regime contínuo (TRUPPO et al., 2012; TUFVESSON et al., 2015).

Nos últimos anos, a tecnologia de fluxo contínuo tem recebido amplo

reconhecimento como uma interessante ferramenta para a produção de fármacos e

agroquímicos nos moldes do que foi estabelecido como química verde. Desde 2007,

quando o Green Chemistry Institute, parte da American Chemical Society, classificou

o processamento por fluxo contínuo como uma área primária para as atividades de

pesquisa na indústria farmacêutica e de química fina, muitos processos industriais

foram desenvolvidos para uso desta tecnologia. Isso porque reatores de fluxo contínuo

permitem um melhor controle do processo, tornando a reação mais eficiente e,

consequentemente, evitando o desperdício. Assim, a reação em fluxo contínuo tem

se tornado uma importante tecnologia facilitando o uso de enzimas imobilizadas para

produção industrial de, entre outros importantes compostos, aminas quirais

enantiomericamente puras (LEY, 2012; WILES; WATTS, 2012).

1.1 Biocatálise em fluxo contínuo A velocidade no desenvolvimento de processos é um fator essencial na indús-

tria química e farmacêutica. Nesse contexto, a miniaturização possibilita a aceleração

no desenvolvimento, minimizando custos por meio da diminuição da demanda de

substratos dispendiosos e permitindo que diferentes experimentos possam ser

realizados em paralelo (KRÜHNE et al., 2014; TAMBORINI et al., 2017).

Entretanto, existem fatores a serem considerados durante o escalonamento

desses processos, já que sistemas enzimáticos em batelada, quando conduzidos em

larga escala, frequentemente sofrem com cisalhamento das partículas, no caso de

biocatalisadores imobilizados, pela agitação nos reatores ou inativação pela alta

concentração de substrato/produto. Além disso, a quantidade de partículas sólidas

que um reator de batelada consegue lidar é limitada (TUFVESSON et al., 2010). Esses

fatores podem ser facilmente evitados em sistemas contínuos, uma vez que não

apresentam agitação mecânica e o contato do composto inibidor com a enzima é

reduzido devido ao constante bombeamento da solução para fora do reator. O escalo-

Page 25: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

4

namento pode ser alcançado aumentando o volume do reator ou utilizando vários

reatores em paralelo (WEGNER et al., 2012).

De maneira geral, os processos contínuos biocatalisados podem ser classi-

ficados em 2 tipos (figura 2): No primeiro tipo de processo, os reagentes serão

bombeados juntos de um catalisador homogêneo através de sistemas tubulares até

uma coluna ou reator helicoidal. Então, no fim do reator, o produto é coletado,

incluindo o biocatalisador, possíveis subprodutos e substratos que não sofreram

alterações. Assim, uma etapa de separação do catalisador e possíveis subprodutos

será necessária. No segundo tipo de processo contínuo, o reator é preenchido com o

biocatalisador imobilizado enquanto os reagentes fluem através da coluna. Nesse

caso, nenhuma etapa de separação do catalisador é necessária. Além disso, o reuso

do catalisador é possível, tornando esse processo ainda menos dispendioso e mais

adequado aos preceitos da química verde (PORTA et al., 2016; THOMAS et al., 2017;

TSUBOGO et al., 2015; URBAN et al., 2006).

Figura 2. Esquema geral de sistemas de fluxo contínuo utilizados em diferentes processos biocatalisados.

Page 26: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

5

Dependendo do tipo de reator, o volume de operação pode variar de 15 nL a

1L. Assim, a nomenclatura para cada volume de trabalho é dada de acordo com a

escala mostrada na tabela 1 (ITABAIANA et al., 2013; DE SOUZA; MIRANDA, 2014).

Tabela 1. Nomenclatura de reatores contínuos segundo seu volume de operação.

Nomenclatura Volume Nano 15 nL – 10 μL

Micro 10μL – 100μL

Mini 50 μL – 200 μL Meso 100 μL – 10mL

Macro 10 mL – 1L

Diferente do sistema em batelada (no qual o tempo de reação é definido pela

duração na qual a solução é mantida agitando a determinada temperatura), em um

sistema contínuo, o tempo de reação depende da vazão e do volume do reator. Visto

que o meio reacional é bombeado através do reator onde a transformação dos

substratos acontecerá, o tempo de reação é dado pelo período em que a solução

passa pelo interior do reator e é chamado de tempo de residência (Tr). Assim, Tr é

calculado pela razão entre volume total do reator dividido pela velocidade de fluxo com

qual a solução é bombeada (figura 3) (PLUTSCHACK et al., 2017; WEGNER et al.,

2012).

Figura 3. Tempo de residência.

Page 27: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

6

Atualmente, existem diversos tipos de reatores de fluxo contínuo disponíveis

para processos biocatalisados, como reatores de membrana, reatores helicoidais,

microrreatores, reatores de leito fluidizado e reatores de leito fixo, sendo este último

indubitavelmente mais comum (BRENNA et al., 2017; GRUBER et al., 2017;

JAKOVETIĆ et al., 2013; LONG et al., 2005; SÁNCHEZ et al., 2000; XI; XU, 2005).

Em um reator de leito fixo (RLF), que consiste geralmente de uma coluna

cilíndrica preenchida com o biocatalisador, as partículas têm a sua movimentação

restringida. Desse modo, a(s) solução(ões) contendo os substratos pode(m) ser

bombeada(s) para dentro do reator pela parte inferior ou superior da coluna.

Além do baixo custo de produção, facilidade de operação e a alta performance,

esse tipo de reator oferece diversas vantagens. Uma vantagem em relação aos

reatores de batelada é o menor espaço deixado entre as partículas (34% para reatores

de leito fixo e 80-90% para reatores de batelada) (Woodley et al., 1994apudCSAJÁGI

et al., 2008). Assim, a alta concentração do catalisador combinada com a eficiente

transferência de massa no interior do reator leva a tempos de reação menores

(KAMBLE; YADAV, 2017; PLUTSCHACK et al., 2017).

Neste contexto, um fator que deve ser levado em consideração ao utilizar um

reator de leito fixo é o tamanho da partícula do biocatalisador, já que partículas

demasiado pequenas podem aumentar a contrapressão ou entupir a coluna,

impossibilitando a passagem do meio reacional. Por outro lado, partículas grandes

demais podem levar a baixas conversões, considerando que a reação frequentemente

acontece na superfície do biocatalisador (CHUA; SARMIDI, 2004).

Assim, a imobilização da enzima é também um fator extremamente importante

a ser considerado, de modo que um suporte deve apresentar algumas características,

entre as quais: estabilidade térmica e química, grupos funcionais suficientes para a

ligação, facilidade de regeneração e resistência mecânica. O tipo de ligação ao

suporte pode influenciar a estabilidade da enzima e reduzir a lixiviação, ainda que a

lixiviação em fluxo contínuo seja muito menor que em batelada (BOROS et al., 2013;

KUREK et al., 2017; SILVA et al., 2015; DE SOUZA et al., 2016).

Page 28: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

7

Apesar das diversas vantagens advindas do uso de sistemas contínuos

comparado à batelada, como a maior eficiência energética e um menor número de

operações no isolamento do produto, no que concerne à taxa de reação (r), compa-

rações entre processos em fluxo contínuo e batelada podem ser feitas apenas em

valores de conversão próximos. Isso porque, em fluxo contínuo, a concentração subs-

trato/produto na saída do reator é constante, enquanto em batelada a concentração

substrato/produto muda no decorrer da reação, dificultando uma comparação direta.

(BOROS et al., 2013; CSAJÁGI et al., 2008; KAMBLE; YADAV, 2017; DE SOUZA;

MIRANDA, 2014; TAMBORINI et al., 2017)

De maneira geral, a taxa específica de reação (rfluxo) em sistemas contínuos

pode ser calculada segundo a equação 1 e é frequentemente expressa em

mmol min-1

gbiocatalisador

-1. Quando possível, a comparação pode ser feita conside-

rando a taxa específica de reação para processos em batelada, através da equação

2. (CSAJÁGI et al., 2008)

!"#$%& =[P] × f

m./&0121#/314&5

Equação 1. Onde a [P] é a concentração de produto deixando o reator

(frequentemente expresso em mmol mL-1

), f é a vazão (podendo ser expresso em mL

min-1

) e m, a massa do biocatalisador (em g).

!.126#141 =78 × t

m./&0121#/314&5

Equação 2. onde a np é a quantidade de produto (frequentemente expresso em

mmol), t é o tempo (em min) e m, a massa do biocatalisador (em g).

Page 29: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

8

1.2 Transaminases Em um organismo, as transaminases (E.C. 2.6.1.x, também conhecidas como

aminotransferases) são responsáveis pela produção e degradação de aminoácidos.

Esses compostos possuem um papel fundamental no organismo e, por isso, não

surpreende sua importância para a indústria farmacêutica (MCMURRY; BEGLEY,

2005).

O interesse entre pesquisadores sobre o papel da transaminação em reações

metabólicas despertou quando, em 1939, Braunstein et al. demostraram pela primeira

vez a reação de transaminação através da transferência de um grupamento amino

entre um doador aminoácido e um aceptor α-cetoácido utilizando um tecido animal.

Desde então, esse grupo de enzimas vem sendo amplamente estudado devido ao seu

papel biológico. (BRAUNSTEIN, 1939; BRAUNSTEIN; KRITZMANN, 1937)

Embora as transaminases tenham sido descobertas há aproximadamente 60

anos, seu uso para a síntese de substratos não-naturais tem aumentado conside-

ravelmente nos últimos 15 anos. Essas enzimas catalisam a síntese de aminoácidos

quirais por resolução cinética ou por uma síntese assimétrica. No caso de uma

resolução cinética catalisada por transaminases, a reação resulta em um aminoácido

enantiomericamente puro e um cetoácido. Um grupo de transaminases ainda mais

interessante é composto por enzimas capazes de reconhecer substratos sem

qualquer grupo carboxílico (como aminas), as chamadas ω-transaminases (ω-TA)

(HÖHNE; BORNSCHEUER, 2012; PARK et al., 2010).

Como dito anteriormente, a resolução cinética possui um rendimento máximo

teórico de 50%, o que torna a síntese assimétrica mais interessante, pois através

dessa é possível obter o produto com máximo rendimento. No entanto, esse tipo de

reação necessita de técnicas de deslocamento do equilíbrio, visto que o equilíbrio

termodinâmico está deslocado para a formação do substrato. Além disso, uma

desracemização também é possível, sendo uma abordagem útil quando o substrato

pró-estereogênico não está prontamente disponível. Para isso, no caso de aminas,

uma cetona gerada em uma resolução cinética pode ser subsequentemente usada

Page 30: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

9

como substrato em uma síntese assimétrica empregando uma ω-TA de seletividade

oposta (Esquema 1). (FUCHS et al., 2015; GHISLIERI; TURNER, 2014; HÖHNE;

BORNSCHEUER, 2012)

Esquema 1. Estratégias para uso de TAs para a síntese de aminas enantiomericamente puras.

1.2.1 Mecanismo de reação. Conceitualmente, uma transaminação biocatalisada é o processo pelo qual

uma amina/aminoácido reagirá com uma cetona/cetoácido para permutarem seus

grupos funcionais mediados por uma transaminase. O mecanismo pelo qual a reação

ocorre é bem conhecido. E embora transaminases diferentes possam apresentar

R1 R2

NH2

R1 R2

NH2

R1 R2

O+

piruvato alanina~50%

(R)-transaminase

R1 R2

O

R1 R2

NH2

alanina piruvato>99%

(R)-transaminase

Resolução cinética

Síntese assimétrica

R1 R2

NH2

R1 R2

NH2

R1 R2

O

+

piruvato alanina

(R)-transaminase

Desracemização

(S)-transaminase

piruvato alanina

Page 31: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

10

diferentes especificidades em relação ao substrato, o mecanismo se mantém o

mesmo (CASSIMJEE et al., 2015).

Podemos dizer que esse mecanismo ocorre em duas etapas principais:

Na primeira etapa (esquema 2), um doador amino, como o (S)-feniletilamina,

reage com o piridoxal fosfato (PLP), que está reversivelmente ligado à enzima através

de uma Base de Schiff (E-PLP), por uma adição nucleofílica do seu grupamento –NH

na ligação C=N da imina, gerando um intermediário piridoxamina ligado à enzima e a

cetona correspondente, nesse caso, a acetofenona. Então, na segunda etapa

(esquema 3), um segundo substrato carbonilado (aqui usado o piruvato), entra no sítio

ativo onde recebe um grupamento amino transferido do fosfato de piridoxamina (PMP)

ligado à enzima, produzindo o produto amino correspondente (alanina) e regenerando

o cofator piridoxal fosfato para um outro ciclo catalítico.

Esquema 2. Primeira etapa do mecanismo da reação catalisada por transaminases.

Page 32: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

11

Esquema 3. Segunda etapa do mecanismo da reação catalisada por transaminases.

1.2.2 Engenharia de proteínas na obtenção de novas transaminases Apesar das vantagens na utilização de TAs para a produção de aminas

quirais, transaminases provenientes de cepas selvagens podem não apresentar as

características ideais para o processo desejado. Nesses casos, técnicas de

engenharia de proteína como mutagênese sítio-dirigida e evolução direcionada podem

ser empregadas para obtenção de enzimas com as características necessárias.

Quando a estrutura tridimensional da proteína é conhecida, é possível através da

mutagênese sítio dirigida modificar a estrutura da enzima para melhorar a

especificidade pelo substrato/cofator, a enantiosseletividade e estabilidade. Por outro

lado, se a estrutura de raios X do cristal da proteína não está prontamente disponível,

a evolução direcionada pode ser utilizada para obtenção de uma biblioteca genética

de mutagênese aleatória e triagem das enzimas mutantes que apresentem essas

características (HÖHNE et al., 2010).

Um dos objetivos mais comuns na engenharia de proteínas é a melhora da

estabilidade da enzima e especificidade pelo substrato. Para isso, uma abordagem

amplamente utilizada baseada no método de evolução direcionada é a reação em

cadeia da polimerase propensa a erros (error-prone PCR ou epPCR), que introduz

Page 33: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

12

mutações aleatórias em um segmento de ADN. Por exemplo, a termoestabilidade da

transaminase de Arthrobacter citreus foi melhorada e, após 6 rodadas de mutagênese

aleatória, a temperatura ótima passou de 30 ºC para 55 ºC, o que pode facilitar a

remoção de um coproduto volátil e ajudar no deslocamento do equilíbrio. A produ-

tividade também aumentou em 260 vezes, partindo de 5,9 para 1582,8 Ug-1

na produ-

ção da (S)-aminotetralina (CERIOLI et al., 2015; CHO et al., 2006, 2008; HWANG et

al., 2008; HWANG; KIM, 2004; MARTIN; DISANTO; et al., 2007).

Através da mesma abordagem, mutantes da ω-transaminase de Vibrio

fluvialis JS17 foram obtidas a partir de mutagênese aleatória para superar a inibição

por cetonas alifáticas, subprodutos de reações de resolução cinética de aminas

quirais. A variante apresentou atividade duas vezes maior frente a aminas alifáticas

de cadeia longa em relação à enzima selvagem, ainda que as atividades das duas

enzimas tenham sido equivalentes para aminas alifáticas de cadeia curta e aminas

aromáticas. A inibição pelo produto também foi evitada na síntese assimétrica do 2-

amino-1-metoxipropano com o uso de uma ω-transaminase obtida por evolução

direcionada. Com a variante mutante foi possível melhorar a conversão de 12% para

65%, sem a necessidade de deslocamento do equilíbrio. Após outras etapas de

evolução direcionada, variantes com melhor estabilidade química e térmica foram

obtidas. Desse modo, a acetona formada pode ser retirada do meio a 50ºC sob

pressão reduzida. Finalmente, o produto (S)-2-amino-1-metoxipropano foi obtido com

93% de rendimento e >99% de excesso enantiomérico após 7 h de reação (YUN et

al., 2005).

Com os mesmos objetivos, a mutagênese sítio dirigida se mostra um método

mais eficiente, eliminando etapas de mutagênese necessárias na evolução

direcionada, além de ter maior especificidade em relação ao processo. Para isso, o

conhecimento da estrutura do sítio ativo da enzima é necessário.

Em 2002, foi observado que o sítio ativo das transaminases é composto por

duas cavidades de tamanhos diferentes. O reconhecimento do substrato depende

então da acomodação nessas duas cavidades, considerando que, além da diferença

Page 34: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

13

de tamanho, a cavidade menor possui uma repulsão eletrostática pelo grupo

carboxílico do substrato cetona. Na transaminase de Vibrio fluvialis, por exemplo, os

resíduos triptofano W57 e W147 na cavidade menor maior do sítio ativo são

responsáveis pela baixa promiscuidade da enzima. Sendo assim, a atividade para

substratos maiores que uma metila aumentou consideravelmente quando o triptofano

foi substituído por glicina (CHO et al., 2008; SHIN; KIM, 2002).

Um resultado ainda mais interessante foi observado por Skalden et al. (2015)

que mostrou como a alteração de um único resíduo de aminoácido no sítio ativo pode

modificar até mesmo a enantiopreferência da enzima. O grupo investigava a produção

dos diferentes diasteroisômeros do 1-amino-3-metilciclohexano através de uma

reação em cascata envolvendo um enoato redutase e uma transaminase de Vibrio

fluvialis (Esquema 4). A reação catalisada pela enoato redutase anterior à etapa de

transaminação produz apenas o enantiômero de configuração (S) com alta

seletividade (>99%). Entretando, a transaminase de V. fluvialis apresentou baixa

seletividade e o diasteroisômero de configuração (1R, 3S) foi produzido com apenas

14% de. Assim, durante o exame da estrutura do sítio catalítico da transaminase foi

identificado que uma mudança no resíduo aminoácido Leu56 poderia ter impacto na

enantiosseletividade. Após a alteração de leucina para valina (Leu56Val), um aumento

na seletividade foi observado e o diasteroisômero (1R, 3S) foi obtido com 66% de.

Entretanto, quando a leucina foi alterada para isoleucina (Leu56Ile), a reação catali-

sada pela variante converteu a cetona com preferência contrária (1S, 3S) com 70%

de (SKALDEN et al., 2015).

Esquema 4. Esquema adaptado da reação realizada por Skalden et al. (2015).

O O

Enoato redutase

NH2

13

NH2

+ω-transaminase

NADPH Alanina

(1R, 3S) (1S, 3S)

Page 35: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

14

Recentemente, a incorporação de aminoácidos não-canônicos na estrutura da

enzima foi utilizada para melhorar a estabilidade de uma ω-TA de Sphaerobacter

thermophilus e permitir imobilização sítio-específica em quitosana. Para isso, o

aminoácido prolina foi substituído por uma (4R)-fluoroprolina (FP), por conferir um

efeito estabilizador, e uma L-3,4-diidroxifenilalanina (dopa) foi incorporada para

auxiliar na imobilização. Além de melhorar consideravelmente a termoestabilidade da

enzima (tabela 2), após imobilização, as variantes puderam ser utilizadas por até 10

ciclos na resolução cinética de aminas quirais. (DEEPANKUMAR et al., 2015)

Tabela 2. Meia-vida de ω-TAs modificadas a diferentes temperaturas (DEEPANKURMAR et al., 2015)

Biocatalisador Modificação 50ºC (h) 60ºC (h) 70ºC (h) ω-TA -- 19,5 8,1 2,2

ω-TA[(4R)-FP] Prolina substituída por (4R)-FP 31,0 11,5 4,5

ω-TAdopa Adição do aminoácido dopa. 19,4 7,5 2,1

ω-TAdp[(4R)-FP]

Substituição da prolina por

(4R)-FP e adição de dopa

29,5 11,0 4,4

Um exemplo proeminente da aplicação da tecnologia de mutagênese sítio

dirigida é a evolução de uma (R)-ω-TA para a síntese assimétrica da sitagliptina

(esquema 5), um inibidor da dipeptidil-peptidase IV utilizado no tratamento da diabetes

(JARVIS et al., 2010). Após 27 alterações no sítio ativo da ω-TA de Arthrobacter sp, a

variante foi capaz de converter a cetona da sitagliptina com rendimento de 92% e alta

pureza enantiomérica. Esse feito é bastante notável visto que a maioria das

transaminases não aceitam grupamentos maiores que uma metila na posição

adjacente à carbonila (NOBILI et al., 2015). Além da melhor tolerância a solventes

orgânicos e alta concentração de isopropilamina, quando comparado à síntese

química tradicional da sitagliptina, que envolve um catalisador quiral de ródio, o

processo utilizando a enzima mutante teve rendimento 13% maior e reduziu o

desperdício total em 19%.

Page 36: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

15

Esquema 5. Síntese da sitagliptina por uma ω-TA mutante produzida por Jarvis et al. (2010)

1.2.3 Transaminases na síntese de aminas quirais Até pouco tempo, dois fatores impediam o uso de transaminases para

biotransformação de substratos não naturais: A pouca disponibilidade de

transaminases ativas com substratos diferentes de α-ceto/α-aminoácidos e a carência

de estratégias para o deslocamento do equilíbrio da reação em direção à formação do

produto, no caso de aminas quirais.

Com o advento de novas técnicas e metodologias para a solução desses

problemas, as transaminases têm se tornado cada vez mais importantes na síntese

de aminas enantiomericamente puras.

As transaminases foram aplicadas pela primeira vez na síntese de aminas

quirais no final da década de 80 por pesquisadores da companhia americana Celgene

Co., que desenvolveram transaminases (R)- e (S)-específicas para produção de

diferentes aminas e cetonas por resolução cinética e síntese assimétrica (Figura 5). A

Celgene demostrou ainda a resolução cinética de aminas na escala de 2,5 m3, embora

tenha apresentado problemas com a inibição da enzima por ambos os substratos

cetona e amina. Além disso, baixas concentrações dos produtos foram obtidas quando

substratos hidrofóbicos foram empregados, visto que a reação ocorria em meio

aquoso (STIRLING et al., 1990, 1992).

Page 37: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

16

Figura 4. Síntese de aminas quirais catalisada por ω-TAs realizadas pela empresa Celgene.

Recentemente, transaminases de Arthrobacter sp., Aspergillus terreus e

Chromobacterium violaceum foram identificadas como capazes de converter cetonas

propargílicas aos seus correspondentes aminados (esquema 6). Aminas propargílicas

são importantes blocos de construção para a síntese orgânica, utilizadas na prepa-

ração de heterocíclicos contendo nitrogênio, como 2-aminoimidazóis, oxazolidinonas,

pirimidinonas e triazóis. Embora esses compostos tenham sido relatados como

inibidores irreversíveis de transaminases, as enzimas identificadas foram capazes de

realizar a síntese assimétrica de aminas propargílicas aromáticas com excelente

conversão e excesso enantiomérico. Outras ω-TAs reconhecidas pela ampla

tolerância a substratos, como de Bacillus megaterium, Paracoccus denitrificans,

Pseudomonas putida, Vibrio fluvialis e Arthrobacter citreus, também foram testadas,

porém não foram capazes de transformar o substrato. Foi possível notar que para

substratos suportando grupos doadores de elétrons na posição meta e para a

R1 R2

NH2+ O

R1 R2

NH2

R1 R2

ONH2(S)-TA + +

1) Resolução cinética

2) Síntese assimétrica

R1 R2

O NH2+ (S)-TA

R1 R2

NH2 O+

NH2

X

NNH2NH2

MeO

O

NH2

NR3H2N

OR3

NH2OX

Page 38: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

17

conversão foi maior que 90%. Enquanto que substratos portando grupos retiradores

de elétrons no anel aromático obtiveram baixa conversão para todas as TAs utilizadas

(SCHMIDT et al., 2015b).

Esquema 6. Síntese assimétrica de aminas propargílicas. (SCHMIDT et al., 2015b)

O intermediário da pró-droga silodosina, utilizada no tratamento da hiperplasia

benigna da próstata, também foi obtido através de aminação redutiva assimétrica

biocatalisada (esquema 7). Um sistema para reciclo do piruvato utilizando uma alanina

desidrogenase foi empregado e diferentes enzimas foram testadas. O melhor

resultado foi obtido quando a ω-TA de Arthrobacter sp. foi utilizada, levando à

conversão maior que 97% e alta pureza enantiomérica, com mais 97% do enantiomêro

(R). Um outro resultado interessante foi obtido pela ω-TA de Pseudomonas

fluorescens, com conversão de 84% e 97% de excesso do enantiômero (S), embora

a silodosina utilizada pela indústria farmacêutica possua configuração (R). (SIMON et

al., 2014)

Esquema 7. Síntese do intermediário da silodosina.

O

R

(R)- ou (S)-TATampão, pH 7

PLP, 30ºC, 24h

Alanina Piruvato

NH4COOHCO2 H2O+

R: H, p-Me, p-MeO, m-MeO, p-CF3 ou p-Br

NH2

R

AlaDH, FDH

O

(R)-TATampão, pH 7

PLP, 30ºC, 24h10% DMSO

Alanina Piruvato

N

R CN

NH2N

R CN

(reciclo/remoção)

Page 39: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

18

Um exemplo interessante aplicado a síntese de fármaco é a síntese do (R)-

2,3,4,9-tetra-hidro-1H-carbazol-3-amina, um intermediário chave para a síntese da

droga antialérgica ramatroban realizada por BUSTO et al., (2014) (esquema 8).

Apenas uma etapa foi necessária para alcançar a amina alvo ao utilizar uma ω-

transaminase como biocatalisador, ao passo que, por via química, 3 etapas seriam

necessárias, segundo trabalhos anteriores. O grupo utilizou uma transaminase de

Arthrobacter evoluída para reconhecer cetonas impedidas estericamente, uma vez

que transaminases provenientes de cepas selvagens não aceitam grupamentos

volumosos. Além disso, a mutante possui alta termoestabilidade comparada à

selvagem, tornando possível o uso de isopropilamina como doador amino e a

consequente evaporação do produto acetona formado. Entretanto, os pesquisadores

notaram ainda que a isopropilamina acabou sendo prejudicial à cetona precursora

levando à formação de vários subprodutos. Sendo assim, o doador amino empregado

foi o (R)-1-feniletilamina. A reação biocatalisada foi completada em 4 h e teve

rendimento de 96% e 97% de excesso enantiomérico usando a enzima alterada por

biologia molecular.

Esquema 8. Síntese assimétrica do intermediário do ramatroban por BUSTO et al. (2014).

(R)-TATampão, pH 7

PLP, 30ºC, 24h

Alanina Piruvato

NH4COOHCO2 H2O+AlaDH, FDH

NH

O

NH

NH2

Page 40: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

19

1.2.4 Resolução cinética catalisada por transaminases A resolução cinética catalisada por TAs apresenta algumas vantagens em

relação a síntese assimétrica, como o equilíbrio termodinâmico favorável à formação

do produto, a não necessidade de outras enzimas e a facilidade de aplicação.

Consequentemente, esse tipo de reação já é extensamente estudado e utilizado na

produção de uma série de compostos utilizando enzimas imobilizadas, livres ou

células íntegras (HÖHNE; ROBINS; et al., 2008; KOSZELEWSKI et al., 2010; MALLIN;

MENYES; VORHABEN; HÖHNE, 2013; SHIN; KIM, 2001; TRUPPO et al., 2012).

A resolução cinética catalisada por TAs foi eficiente mesmo em larga escala,

como demostrado por Hanson et al., (2008), que empregaram células de E. coli

expressando uma transaminase (S)-seletiva de Bacillum megaterium SC6394 para

resolver cineticamente 750g de sec-butilamina (0,684 mol L-1

). A amina de

configuração (R) foi obtida com rendimento isolado de 46,6% e excesso enantiomérico

maior que 99%.

Entretanto, além do rendimento máximo limitado a 50%, essas reações sofrem

frequentemente com inibição pelo produto e, desse modo, apesar das vantagens

supracitadas, esses obstáculos podem tornar essa abordagem um pouco menos

interessante.

A inibição pelo produto é uma propriedade intrínseca das transaminases devido

o mecanismo pelo qual a reação acontece. A inibição geralmente resulta de um co-

produto cetona no meio, embora outros produtos carbonilados possam provocar o

mesmo efeito. Por exemplo, ao utilizar (RS)-1-feniletilamina ou até mesmo

benzilamina como doador amino, a enzima pode sofrer inibição pelo co-produto

acetofenona, no caso da (RS)-1-feniletilamina, ou benzaldeído, no caso da

benzilamina, formados no meio (SHIN; KIM, 1997, 2009).

A utilização de um sistema bifásico foi a primeira metodologia utilizada para

superar esse obstáculo apresentada por Shin e Kim (1997) na resolução cinética da

(RS)-1-feniletilamina catalisada por células de B. thuringiensis JS64 (esquema 9).

Após o teste de diversos solventes, um sistema cicloexanona/água (20% v/v) foi esco-

Page 41: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

20

lhido. A fase orgânica seria responsável por extrair o produto inibidor do meio aquoso,

além de funcionar como reservatório do substrato α-metilbenzilamina. Considerando

que a (RS)-1-feniletilamina forma uma imina com a cicloexanona, o substrato é libe-

rado para o meio aquoso conforme a reação de resolução cinética prossegue de modo

a garantir um equilíbrio. O piruvato e a L-alanina, por outro lado, se mantêm no meio

aquoso devido a efeitos de carga em pH neutro. Com esse sistema foi possível reduzir

drasticamente a inibição pelo produto e, após 18h, 51,2% de conversão e 95,4% ee

foram alcançados.

Esquema 9. Esquema da reação no modelo bifásico. Adaptado de Shin e Kim (1997).

Os autores descreveram ainda a inibição enzimática devido o contato da

enzima com a fase orgânica, já que para manter o produto inibidor em baixa

concentração em meio aquoso, grande quantidade de solvente orgânico foi utilizada.

Posteriormente, reatores de membrana e reatores de leito fixo foram eficientemente

utilizados para evitar essa inibição pelo contato com fase orgânica.(SHIN, J. S. et al.,

2001; SHIN, J. S. et al., 2001)

Alternativamente, Bea et al., (2010) transformaram o produto inibidor

acetofenona em 1-feniletanol utilizando a oxirredutase endógena de células de Pichia

pastoris GS115 expressando o gene de ω-TA de V. fluvialis JS17. Com esse sistema

foi possível obter a (R)-1-feniletilamina com 52,2% de conversão e excesso enantio-

Page 42: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

21

mérico maior que 99% após 6h de reação.

O reciclo do substrato piruvato também pode ser desejável como uma maneira

de tornar o processo mais barato em larga escala. Ademais, o piruvato também pode

atuar inibindo a enzima. Desse modo, um exemplo interessante é o trabalho realizado

por Truppo et al., (2009) com a utilização de uma aminoácido oxidase (AAO) para

reciclar in situ o piruvato adicionado em quantidade catalítica (8 mol%) na presença

de oxigênio molecular. Assim, duas transaminases de seletividades diferentes (ATA-

117, (R)-seletiva, e ATA-113, (S)-seletiva) foram utilizadas alternativamente para a

produção de diferentes aminas aromáticas com máxima conversão e alta pureza

enantiomérica para ambos os enantiômeros em apenas 1 hora (figura 6). Por outro

lado, uma reação controle, onde a AAO não foi empregada, produziu apenas 7,5% do

produto e 8% ee na resolução cinética da feniletilamina.

Figura 5. Aminas obtidas com o sistema de reciclo do piruvato por uma aminoácido oxidase. (TRUPPO et al., 2009)

Outra abordagem para a reutilização do piruvato é a co-expressão de uma ω-

transaminase e uma α-transaminase em uma mesma célula para catalisar a produção

concomitante de aminas e aminoácidos quirais (esquema 10). Nesse caso, o piruvato

Page 43: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

22

formado na reação de síntese assimétrica do aminoácido é utilizado como aceptor do

grupamento amino em uma resolução cinética de uma amina quiral. Com esse

sistema, três pares de reações acopladas, como AlaninaTA/ω-TA, TirosinaTA/ω-TA,

e AspartatoTA/ω-TA foram aplicados para a produção de (S)-aminoácidos tais como

(S)-fenilalanina, (S)-homofenilalanina e (S)-aspartato (CHO et al., 2003).

Esquema 10. Síntese simultânea de (S)-aminoácidos e (R)-aminas com acoplamento de α- e ω-TAs. (A) sistema AlaTA/ω-TAs. (B) sistemas TyrTA/ω-TA e AspTA/ω-TAs. Adaptado de Cho et al (2003).

1.2.5 Síntese assimétrica catalisada por transaminases Como dito anteriormente, em uma síntese assimétrica catalisada por

transaminases, um cetoácido reage com um aminoácido intercambiando seus grupos

funcionais. Se uma ω-transaminase é empregada, uma cetona pró-quiral pode ser

usada como substrato para reagir com um doador amino gerando uma amina

enantiomericamente pura.

Durante muito tempo, a síntese assimétrica biocatalisada era inviável. Nesse

tipo de reação, os efeitos de ressonância de elétrons tornam o substrato cetona muito

Page 44: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

23

mais estável do que o produto amina, deslocando o equilíbrio da reação em direção

ao substrato. Além disso, a enzima poderia ainda sofrer inibição pelo produto. Por

exemplo, na produção da (S)-1-feniletilamina, utilizando acetofenona e L-alanina,

além da limitação termodinâmica, os produtos (S)-1-feniletilamina e piruvato são muito

mais reativos do que a acetofenona e a L-alanina (esquema 11). Isso sugere que uma

maior inibição pelo produto ocorra na reação entre a acetofenona e a L-alanina do que

entre os produtos cetona e amina correspondentes. No entanto, diversas estratégias

vêm sendo desenvolvidas para superar esse problema (SHIN; KIM, 1998, 1999).

Esquema 11. Reação entre a acetofenona e L-alanina catalisada por uma (S)-TA.

Na síntese da sitagliptina, por exemplo, Jarvis et al. (2010) utilizaram a

isopropilamina como doador amino. Nesse caso, a reação foi realizada a 45ºC

permitindo que a acetona formada fosse destilada do meio sob vácuo. Essa

abordagem, entretanto, encontra dificuldades na sua aplicação em larga escala, onde

a destilação nem sempre é possível, além da alta temperatura requerer enzimas

termoestáveis.

Ao longo dos anos outras metodologias para o deslocamento do equilíbrio e

diminuição da inibição de atividade pelo produto foram desenvolvidas, como a

utilização de resinas de troca iônica, para remoção in situ do produto formado, e o uso

de doadores amino cujo produto formado sofre transformações espontâneas (GREEN

et al., 2014; TRUPPO et al., 2010).

Uma outra abordagem para deslocamento do equilíbrio da reação é a utilização

de uma outra enzima que converta irreversivelmente um dos produtos formados

(esquema 12). Por exemplo, a utilização de uma lactato desidrogenase, que converte

Page 45: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

24

o piruvato formado quando a alanina é usada como doador amino em acido lático.

Entretanto, a lactato desidrogenase reduz o piruvato enquanto oxida concomitan-

temente o cofator NADH a NAD+. Por isso, um sistema de regeneração do cofator se

faz necessário e, para esse fim, uma glicose desidrogenase ou uma formato

desidrogenase podem ser utilizadas (KOSZELEWSKI; LAVANDERA; CLAY;

ROZZELL; et al., 2008).

Esquema 12. Estratégias para o deslocamento do equilíbrio.

Alternativamente, quando a alanina é o doador amino escolhido, outra enzima

utilizada é a piruvato descarboxilase, produzindo acetaldeído e CO2 que podem ser

facilmente removidos do meio. Quando comparado ao uso de um lactato

desidrogenase, o uso da piruvato descarboxilase oferece maior vantagem por

dispensar a adição de cofatores e produzir compostos voláteis. De mesmo modo, uma

acetolactato sintase pode ser utilizada convertendo o piruvato em acetoína e CO2.

(HÖHNE; KÜHL; et al., 2008; YUN; KIM, 2008)

Uma alanina desidrogenase também pode ser empregada para reciclar o

piruvato, transformando-o de volta em alanina, um sistema particularmente

R1 R2

O

R1 R2

NH2

R3

NH2

R3

O

NH3Alanina desidrogenase

H2O

ω-TA

(R3 = COOH)

(R3 = COOH)

(R3 = COOH)

(R3= arila, alquila)

Lactato desidrogenase

Piruvato descarboxilase

Álcool desidrogenase

Acetolactato sintase(R3 = COOH)

COOH

OH

H

O+ CO2

R3

O

OH

O

+ CO2

Page 46: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

25

interessante por permitir a adição de alanina em quantidade catalítica. Neste caso,

amônia é utilizada como fonte amino para o piruvato. Um sistema de regeneração do

cofator NADH é necessário e, para isso, o já mencionado sistema com uma FDH ou

GDH pode ser empregado. Essas enzimas serão responsáveis pela redução do NAD+

a NADH utilizando um agente redutor Formato ou Glicose. Esse sistema foi utilizado

pela primeira vez por Koszelewski et al. (2008), onde diversas cetonas pró-quirais

foram convertidas nas respectivas aminas com alta conversão e excesso

enantiomérico usando L-alanina como doador amino. Recentemente esse mesmo

sistema foi aplicado na síntese diversas aminas propagílicas e na síntese do

intermediário do fármaco Ramatroban (BUSTO; SIMON, ROBERT C; et al., 2014;

KOSZELEWSKI; LAVANDERA; CLAY; GUEBITZ; et al., 2008; SCHMIDT et al.,

2015a).

Finalmente, uma álcool desidrogenase (ADH) também pode ser utilizada para

transformar o produto cetona inibidor em um álcool. Esse sistema foi aproveitado por

Yun et al., (2003) para produzir (R)-1-feniletanol concomitante a produção da (R)-1-

feniletilamina. A ADH é uma enzima dependente de NADH e, por isso, um sistema de

reciclo de NADH através do acoplamento com uma glicose desidrogenase (GDH) foi

utilizado.

1.2.6 Processos quimio-enzimáticos envolvendo transaminases. Rotas quimio-enzimáticas podem ser um importante método para obtenção de

compostos complexos, reduzindo o impacto da síntese química tradicional e

realizando transformações para as quais não existem enzimas disponíveis (OLIVEIRA

et al., 2014; YURYEV et al., 2011). Um exemplo, é a síntese do suvorexant, um

antagonista duplo-seletivo dos receptores de orexina, usado no tratamento da insônia.

Após a produção do precursor ceto-éster através de etapas químicas, Mangion et al.

(2012) realizaram a transaminação do composto, utilizando a mesma transaminase

evoluída para reconhecer o precursor da sitagliptina, seguida de uma ciclização

espontânea. O resultado foi alcançado em 4 etapas eliminando o uso de solventes

Page 47: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

26

halogenados e catalisadores de metais de transição utilizados na síntese tradicional

(esquema 13).

Esquema 13. Síntese quimio-enzimática do suvorexant com ciclização espontânea pós reação de transaminação.

Uma reação de resolução cinética dinâmica (RCD) foi realizada pela primeira

vez com uma transaminase por Koszelewski et al. (2009), aproveitando a racemização

espontânea do substrato para produzir a 4-fenil-2-pirrolidona enantiomericamente

pura. Após etapas químicas, o grupo obteve o derivado do ácido γ-aminobutanóico

(GABA), o 3-fenil-GABA, um aminoácido que atua no sistema nervoso (esquema 14).

Esquema 14. Resolução cinética dinâmica de um derivado do 3-fenil-GABA

Page 48: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

27

Posteriormente, uma resolução cinética dinâmica também foi crucial para a

síntese de um inibidor do receptor SMO por Peng et al. (2014) utilizando um ω-TA

produzida pela Codexis. Um importante resultado foi obtido na formação de dois

centros estereogênicos, com configuração anti, em uma única etapa. A partir da

transaminação, mais duas etapas foram necessárias para alcançar o produto. No total,

foram necessárias apenas 5 etapas com rendimento de 40%.

Esquema 15. Síntese do inibidor da proteína smoothened através da resolução cinética dinâmica utilizando uma transaminase seguidas de etapas químicas

.

Outro exemplo de uma rota quimio-enzimática é a síntese da (S)-rivastigmina,

um potente inibidor da colinesterase utilizado para o tratamento do Mal de Alzheimer

e Parkinson, sintetizado por Fuchs et al. (2012). A reação ocorreu em apenas 4

etapas, sem necessidade de etapas de proteção, considerando que a ω-TA de

Paracoccus dentrificans foi capaz de converter o precursor suportando o farmacóforo

polar carbamato ligado ao grupo m-fenólico da molécula (esquema 16). (FUCHS et

al., 2012)

Esquema 16. Síntese quimio-enzimática da rivastigmina. (FUCHS et al., 2012)

Page 49: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

28

1.2.7 Transaminases em fluxo contínuo Em 2001, Shin et al. demonstraram pela primeira vez uma reação catalisada

por transaminases em fluxo contínuo. O grupo utilizou um reator de membrana,

contendo o extrato de células de Bacillus theringiensis JS64 com atividade de

transaminase, de modo a superar a inibição da atividade enzimática ocasionada pela

utilização do sistema bifásico no trabalho já mencionado anteriormente. De 2001 até

os dias de hoje, a utilização de transaminases em fluxo contínuo ainda é escassa,

principalmente pela necessidade da adição do cofator PLP (SHIN, J.S. et al., 2001).

Destarte, em 2014, Andrade et al. utilizaram um reator de leito fixo preenchido

com células de E. coli expressando uma (R)-transaminase de Anthobacter sp.

imobilizadas junto do cofator PLP em resina polimérica de metacrilato. O sistema

contou ainda com um cartucho de sílica gel acoplado ao final do reator, de modo que

o produto amina ficasse retido e fosse separado continuamente dos demais

reagentes. Assim, o produto poderia ser recuperado posteriormente ao lavar o

cartucho de sílica gel com metanol. Diferentes aminas foram preparadas com bons

rendimentos e pureza enantiomérica, embora esses resultados tenham sido

alcançados somente após 5 dias de recirculação do meio reacional, devido a baixa

quantidade de biocatalisador utilizada (ANDRADE et al., 2014).

Em 2017, células de E. coli expressando ω-TAs foram imobilizadas em

LentiKats®, partículas de hidrogel em formato de disco, produzidas a partir da

secagem parcial em temperatura ambiente do álcool polivinílico (PVA). As células

imobilizadas foram empacotadas em um reator de leito-fixo miniaturizado

desenvolvido com placas de poli(metracrilato de metila) e o sistema foi aplicado na

síntese assimétrica utilizando acetofenona como aceptor amino. O sistema foi

utilizado por 21 dias mantendo mais de 80% da atividade inicial (BAJIĆ et al., 2017).

No mesmo ano, uma (S)-transaminase de Halomonas elongata foi utilizada

sem a necessidade de um sistema celular (PLANCHESTAINER et al., 2017). A enzima

foi imobilizada covalentemente em resina epóxi e o biocatalisador foi então

Page 50: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

29

acondicionado em um reator de leito fixo. A imobilização conferiu a enzima maior

tolerância a solventes orgânicos e, em fluxo contínuo, apresentou uma produtividade

até 33 vezes maior do que na síntese assimétrica em batelada, com tempo reacional

diminuído de 24 h para 5 ciclos de 2 min. A mesma enzima foi utilizada posteriormente

para a oxidação de aminas a aldeídos em fluxo contínuo (CONTENTE et al., 2017).

1.3 Lipases No organismo, as lipases (EC 3.1.1.3) são responsáveis pela hidrólise de

triglicerídeos produzindo ácidos graxos e glicerol (esquema 17). Entretanto, sob

condições com baixo teor de água, a reação de esterificação acontece. Essas enzimas

são hoje as mais amplamente empregadas e estudadas tanto na indústria quanto na

academia (ITABAIANA et al., 2013; JUNIOR et al., 2012; S. DE MIRANDA et al., 2014;

DE SOUZA et al., 2015, 2016, 2017, 2018).

Esquema 17. Reação de hidrólise catalisada por lipases

Na indústria, lipases são utilizadas nos mais diversos setores para a produção

de medicamentos, cosméticos, polímeros, detergentes, biocombustíveis, além da

utilização em diagnósticos médicos e na indústria de alimentos. Espera-se que em

2020, o mercado de lipases movimente cerca de 590 milhões de dólares com uma

taxa de crescimento de 6,2% ao ano (DAIHA et al., 2015; SEDDIGI et al., 2017). Na

literatura, são empregadas em diferentes reações para a produção de uma ampla

variedade de compostos, dentre eles: aminas quirais enantiomericamente puras

Page 51: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

30

(ALATORRE-SANTAMARÍA et al., 2008; KAMBLE; YADAV, 2017; VERDUGO et al.,

2011; YAO et al., 2011). Essas enzimas apresentam quimio, régio e enantios-

seletividade e catalisam a síntese de aminas opticamente ativas através da acilação

enantiosseletiva de aminas racêmicas em meio orgânico ou através da hidrólise de

amidas racêmicas em meio aquoso, embora esse último seja mais raro considerando

que longos tempos reacionais podem ser necessários nesse caso (BORNSCHEUER;

KAZLAUSKAS, 2006; GHISLIERI; TURNER, 2014; GOTOR-FERNÁNDEZ et al.,

2006).

1.3.1 Mecanismo de reações catalisadas por lipases Como dito anteriormente, embora o papel fundamental de lipases no organismo

seja a hidrólise de triglicerídeos, em condições com baixa concentração de água, a

reação de esterificação acontece. Assim como para as transaminases, a reação

acontece por um modelo de reação ping-pong bi bi. Isso quer dizer que o substrato

entra ordenadamente no sítio catalítico e é prontamente transformado em produto

(ping-pong) e que dois substratos darão dois produtos (bi bi) no final da reação.

Desse modo, o mecanismo de reações catalisadas por lipases tem a

participação de três resíduos de aminoácidos no sítio catalítico da enzima: A serina, a

histidina e o aspartato.

De maneira geral, o mecanismo se inicia com o ataque nucleofílico do resíduo

serina do sítio catalítico enzimático à carbonila do doador de acila, culminando na

formação do complexo acil-enzima. Posteriormente, o complexo sofre ataque do

nucleófilo (exemplo, a amina) resultando na formação do produto e regeneração da

enzima para um novo ciclo catalítico. O mecanismo é apresentado graficamente no

esquema abaixo.

Page 52: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

31

Esquema 18. Mecanismo de reações catalisadas por lipases.

1.3.2 Resolução cinética catalisada por lipases para a produção de amina quirais enantiomericamente puras. Como já definido anteriormente para a resolução cinética catalisada por transa-

minases, em uma resolução cinética ideal apenas um dos enantiômeros reagirá

enquanto o outro permanecerá inalterado. Assim, em uma resolução cinética, a

pureza enantiomérica do produto e do substrato variam no decorrer da reação. E,

como citado anteriormente, essas reações possuem um rendimento máximo teórico

de 50% (BORNSCHEUER; KAZLAUSKAS, 2006; SEDDIGI et al., 2017).

No caso das lipases, para superar essa limitação, uma etapa de racemização

in situ é frequentemente aplicada. Esse processo é chamado resolução cinética

dinâmica (RCD). No entanto, apesar da possibilidade de 100% de rendimento em uma

RCD, os catalisadores utilizados para a etapa de racemização frequentemente sofrem

inativação devido a interação com a enzima ou outros reagentes presentes no meio

reacional. Em alguns casos, esses catalisadores podem interferir negativamente na

etapa de resolução cinética catalisada pela lipase. Assim, para a aplicação de uma

RCD, um estudo criterioso deve ser realizado para atender os parâmetros necessários

Page 53: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

32

para a aplicação do processo (FABER, 2011; VERHO; BÄCKVALL, 2015).

Esquema 19. Resolução cinética e dinâmica catalisada por lipases.

A resolução cinética catalisada por lipases é uma abordagem amplamente

estudada para a síntese de aminas quirais enantiomericamente puras. Essa

abordagem vem sendo estudada desde 1997, quando a BASF utilizou a lipase de

Burkholderia plantarii para resolução cinética da 1-feniletilamina empregando

metoxiacetato de etila como agente acilante. A amina de configuração (S) que não

interagiu com a enzima foi recuperada com 99% de excesso enantiomérico, enquanto

a amina (R) foi obtida após hidrólise básica da amida resultante da reação de

resolução cinética (BALKENHOHL et al., 1997).

Esse tipo de reação possui diversas vantagens, como a facilidade de aplicação,

alta atividade e seletividade, permitindo o acesso a ambos os enantiômeros de um

mesmo substrato. Por mérito disso, nos últimos anos, lipases foram utilizadas para

resolver cineticamente diversas aminas quirais, dentre elas, biariletilaminas, α-

aminoésteres, heteroarilaminas, aminas contendo boro e arilalilaminas (ALATORRE-

SANTAMARIA et al., 2009; ALATORRE-SANTAMARÍA et al., 2008; ANDRADE et al.,

2010; KIM et al., 2013; KNEŽEVIĆ et al., 2011).

Frequentemente, parte-se do racemato da amina, uma vez que lipases

dificilmente apresentam atividade para a hidrólise da amida. Assim, a escolha do

Page 54: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

33

doador de acila é um fator extremamente importante, considerando que, devido a alta

nucleofilicidade de aminas, estas podem reagir não enzimaticamente com os ésteres

usados como doadores de acila, impactando no excesso enantiomérico. Além disso,

como argumentam Bornscheuer & Kazlauskas (2006), um doador de acila precisa ser

barato, reagir rápido e irreversivelmente na presença da enzima e não reagir na

ausência do biocatalisador. Embora, dificilmente se preencha os três requisitos,

diversos exemplos de doadores de acila podem ser encontrados na literatura, como

ésteres ativados, ésteres enólicos e anidridos (BORNSCHEUER; KAZLAUSKAS,

2006; SYRÉN; HULT, 2011).

Ésteres ativados, como metoxiacetatos de alquila, são frequentemente

utilizados para a acilação enantiosseletiva de aminas, considerando que a reação

ocorre 100 vezes mais rápido do que aquelas que utilizam ésteres não ativados, como

acetato de etila ou butirato de etila. Por outro lado, ésteres enólicos, como acetato de

vinila ou isopropenila, embora amplamente utilizados na resolução cinética de álcoois,

são pouco utilizados para resolução de aminas, uma vez que estes são demasiado

reativos, impactando negativamente a pureza enantiomérica do produto ou levando a

reações indesejadas (FABER, 2011; HIETANEN et al., 2012; DE MIRANDA et al.,

2013).

1.3.3 Lipases em fluxo contínuo Nos últimos anos, a tecnologia de fluxo contínuo tem sido amplamente utilizada

para reações catalisadas por lipases. Diferentes trabalhos exploraram as diferentes

reações catalisadas por esses biocatalisadores. (ITABAIANA et al., 2013; KAMBLE;

YADAV, 2017; KAWAKAMI et al., 2012; SILVA et al., 2015; TODEA et al., 2018)

Recentemente, um estudo utilizando a lipase de Candida antarctica B

imobilizada em resina acrílica (Novozyme 435, N435) concluiu que a produtividade e

a enantiosseletividade de reações de transesterificação em fluxo contínuo são

maiores que as de reações de deacilação, tornando a via por acilação a mais eficiente

em fluxo contínuo (THOMAS et al., 2017).

Page 55: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

34

Reações catalisadas por lipases utilizando células íntegras em fluxo contínuo

são muito pouco comuns. Entretanto, em 2013, Tamborini et al. utilizaram micelas

secas de A. oryzae para a resolução cinética do (RS)-flurbiprofeno em fluxo contínuo.

A reação teve produtividade 10 vezes maior do que em batelada, onde limitações de

transferência de massa e reações colaterais são problemas constantes. A micela seca

pôde ser utilizada no reator sem prévia imobilização, o que também é pouco comum.

A imobilização evita a lixiviação do biocatalisador para fora do reator, o que

contaminaria o produto. Importante destacar que o tipo de imobilização também é um

fator a ser considerado, uma vez que este afeta diretamente o efeito da temperatura

na produtividade e seletividade do processo (BOROS et al., 2013; ITABAIANA et al.,

2013). Ainda, vale mencionar que a lixiviação da enzima do suporte é muito menor em

fluxo contínuo do que em batelada (KUNDU et al., 2011).

Outra vantagem na utilização de fluxo contínuo para reações biocatalisadas é

a diminuição da inibição causada pelo produto. Devido a forte inibição sofrida pela

lipase de P. cepaciae na reação de resolução cinética da metil propiotiolactona, em

batelada, Jeong et al. (2000) utilizaram um reator de leito fixo integrado a uma coluna

de extração para diminuir a inibição pelo produto. A inibição foi completamente

superada utilizando esse sistema, embora o rendimento tenha sido de 20%, devido a

perda do produto para a fase aquosa. Após a troca da fase aquosa para uma solução

1 mol L-1

de sulfato de amônio, o produto foi obtido com 40% de rendimento.

Em fluxo contínuo, mesmo usando ésteres não ativados, como acetato de etila,

é possível a obtenção de aminas quirais com alto rendimento e seletividade. Nos

primeiros trabalhos sobre a resolução cinética de aminas quirais em batelada, o

acetato de etila foi utilizado, mas devido a sua baixa reatividade, longos tempos

reacionais eram necessários e baixos rendimentos eram obtidos. Em condições

contínuas, a amida derivada da reação entre a 1-feniletilamina e o acetato de etila foi

obtida com excelente conversão e alto excesso enantiomérico, mesmo em altas

concentrações de substrato (0,9 mol L-1

). O tempo de residência foi de 40 min e o

biocatalisador Novozyme 435 pôde ser usado por 9h sem perda da atividade (DE

Page 56: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

35

MIRANDA et al., 2013).

Recentemente, o acetato de etila também foi utilizado como agente acilante na

resolução cinética do 1-amino-2-indanol em fluxo contínuo (esquema 20). A molécula

é um bloco de construção para a síntese do antirretroviral indinavir. E como esperado

o tempo de reação reduziu drasticamente em fluxo contínuo e o produto foi convertido

com excelente pureza enantiomérica. Embora fosse esperada a acetilação na

hidroxila, a enzima reagiu especificamente com o grupamento amino do diasteroisô-

mero (1S,2R) (KIM et al., 2015).

Esquema 20. Resolução cinética do intermediário do indinavir.

NH2

OH

AcOEtNovozyme 435

1:1 EtOAc/THFTempo de residência: 64 min

NH2

OH

NHAc

OH+

(±)-cis-1-amino-2-indanol (+)-(1R,2S) (+)-(1S,2R)

Page 57: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

36

2 OBJETIVO GERAL O objetivo central deste trabalho foi a obtenção de aminas quirais

enantiomericamente puras, dentre elas biaril aminas e outros blocos de construção

para fármacos, através de reações biocatalisadas em condições de fluxo contínuo.

2.1 Objetivos específicos Na primeira parte deste trabalho, o objetivo foi a síntese de biaril aminas

enantiomericamente puras a partir de cetonas pró-quirais através da combinação de

uma reação de acoplamento cruzado de Suzuki-Miyaura e a transaminação catalisada

por ω-transaminases em sistema contínuo ou semi-contínuo. Assim, alguns objetivos

específicos foram propostos:

• Triagem de transaminases em busca de atividade para síntese assimétrica dos

compostos de interesse.

• Estudo de sistemas de deslocamento de equilíbrio na reação de síntese

assimétrica biocatalisada.

• Avaliação e otimização das condições ideais para o acoplamento de Suzuki

compatíveis com as condições para a síntese assimétrica biocatalisada.

• Aplicação das condições otimizadas em modo contínuo ou semi-contínuo para

a síntese de biaril aminas.

Na segunda parte deste trabalho, o objetivo foi avaliar o uso do polietilenoglicol

(PEG) como agente acilante para a obtenção de aminas enantiomericamente puras

através da reação resolução cinética catalisada por Novozyme 435 em condições de

fluxo contínuo. Assim, delineamos objetivos específicos:

• Estudo da resolução cinética da (RS)-1-feniletilamina em fluxo contínuo

utilizando PEG600 (diéster) como doador de acila.

• Estudo de metodologias para a recuperação da amina capturada pelo

PEG na etapa de resolução cinética.

Page 58: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

37

3 MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 Reagentes

Os solventes foram obtidos pelos fornecedores Vetec®, Merck

® ou Sigma-

Aldrich e utilizados sem nenhuma etapa prévia de purificação. Todos os reagentes

foram obtidos através da Sigma-Aldrich®.

3.2 Enzimas 3.2.1 Lipases

Lipase B de Candida antarctica (Novozym 435®

com 1-2% (p/p) de água e 7000

U/g) produzido pela Novozymes Co. (Dinamarca).

3.2.2 Transaminases comerciais Foram utilizadas nesse trabalho as (R)-transaminases imobilizadas do kit ECS-

ATA-Kit produzido pela Enzymical�

(Alemanha). A tabela 3 mostra a origem das

transaminases. Todas as transaminases foram imobilizadas pelo fornecedor em

suportes Lifetech, de patente da Purolite® por ligação covalente.

Tabela 3. (R)-Transaminases do kit ECS-ATA da Enzymicals

Biocatalisador Transaminase Suporte

ECS-ATA01 Aspergillus fumigatus Lifetech ECR8204F

ECS-ATA02 Gibberella zeae Lifetech ECR8310F

ECS-ATA03 Neosartorya fischeri Lifetech ECR8806F

ECS-ATA04 Aspergillus oryzae Lifetech ECR8204F

ECS-ATA05 Aspergillus terreus Lifetech ECR8204F

ECS-ATA06 Penicillium chrysogenum Lifetech ECR8204F

ECS-ATA07 Mycobacterium vanbaalenii Lifetech ECR8204F

Page 59: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

38

A ω-transaminase livre utilizada em reações de resolução cinética e síntese

assimétrica foi adquirida através da Sigma-Aldrich. A enzima é expressa em E. coli,

mas não há informação de organismo de origem. O produto foi descontinuado,

entretanto. (CAS 9030-47-1).

3.2.3 Transaminases imobilizadas Outras transaminases foram produzidas e imobilizadas pelo laboratório do

professor Uwe T. Bornscheuer, na Universidade de Greifswald (Alemanha). A tabela

abaixo mostra detalhes desses biocatalisadores.

Tabela 4. Enzimas produzidas e imobilizadas pelo laboratório do professor Uwe T. Bornscheuer

Biocatalisador Origem da enzima Suporte Vf_lio Vibrio fluvialis Liofilizada

4CHI_E1 Aspergillus fumigatus EziG1TM

4CHI_E2 Aspergillus fumigatus EziG2TM

4CHI_E3 Aspergillus fumigatus EziG3TM

4CHI_CHI Aspergillus fumigatus Quitosana

CVi_E2 Chromobacterium violaceum EziG2TM

CVi_E3 Chromobacterium violaceum EziG3TM

CVi_CHI Chromobacterium violaceum Quitosana

3HMU_E1 Ruegeria pomeroyi EziG1TM

Os suportes EziGTM

, da EnginZyme, são partículas de vidro de porosidade

controlada (GPC) modificadas para ligar facilmente em proteínas marcadas (His6-

Tag). Dependendo do suporte, as partículas são revestidas com polímeros que

conferem mais ou menos hidrofobicidade. A tabela 5 mostra informações mais

detalhadas dos suportes usados.

Page 60: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

39

Tabela 5. Tabela com informações sobre os suportes usados.

Suporte Material Revestimento Característica EziG 1 aminoalquil-

GPC de cadeia

longa

-- Hidrofílico

EziG 2 Amino

HybGPCTM

Polímero contendo unidades de 4'-

(clorometil)-estireno

Hidrofóbico

EziG 3 Amino

HybGPCTM

copolímero de estireno e acrilonitrila Semi-

hidrofílico

As transaminases utilizadas nas reações em fluxo contínuo foram obtidas após

cultivo de células de E. coli expressando as respectivas enzimas. Após o cultivo e

rompimento das células, as enzimas foram imobilizadas. Esses procedimentos foram

realizados na Universidade de Greifswald, no laboratório do professor Uwe T.

Bornscheuer. Abaixo detalhes desses biocatalisadores. Os procedimentos de

expressão e imobilização se encontram no tópico 3.2.4.

Tabela 6. Transaminase expressas e imobilizadas em Greifswald (Alemanha)

Biocatalisador Origem da enzima Suporte 4CHI_I145A Variante de A. fumigatus Livre

4CHI_I145A_E2 Variante de A. fumigatus EziG2TM

4CHI Aspergillus fumigatus Livre

4CHI_E2 Aspergillus fumigatus EziG2TM

3.2.4 Obtenção das transaminases de A. fumigatus e a variante 4CHI_I145A e imobilização. O vector pET-22b contendo os genes para a expressão da transaminase de

Aspergillus fumigatus e da variante 4CHI_I145A foram transformados em E. coli BL21

(DE3). A expressão da proteína foi realizada em meio TB (Terrific Broth) com

100 μg mL-1

de ampicilina a 160 rpm e 20 ºC. Após a densidade óptica a λ=600 nm

Page 61: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

40

(OD600) atingir 0.7, a expressão foi induzida pela adição de IPTG (2 mmol L-1

). As

culturas foram deixadas para crescer por 18 h e então centrifugadas por 15 min a

4000×g e 4 ºC. Após lavagem com solução tampão HEPES (50 mmol L-1

, pH 7.5)

contendo piridoxal fosfato (PLP) (0,1 mmol L-1

) e 300 mmol L-1

NaCl, a lise celular foi

realizada por sonicação usando um aparelho Sonopuls HD 2070 (Bandelin electronic

GmbH & Co. KG) por 8 min configurado para 50% de ciclo de pulso e 50% de

intensidade. A sonicação foi realizada em gelo e seguida por centrifugação a 12000×g

por 45 min a 48 ºC (em uma centrífuga Sorvall).

Após a remoção do precipitado, a imobilização das enzimas foi realizada

adicionando o suporte ao sobrenadante. A mistura foi agitada a 150 rpm por 30 min.

A solução foi então centrifugada, o precipitado removido e ressupenso em tampão

HEPES contendo PLP (0,1 mmol L-1

). Este processo foi repetido 3 vezes até que o

excesso de tampão foi retirado e o precipitado armazenado a 4 ºC até o uso.

3.3 Métodos analíticos 3.3.1 Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa (UFRJ).

As reações de resolução cinética e síntese assimétrica realizadas no Brasil

foram monitoradas em cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa

(CG-EM), na Universidade Federal do Rio de Janeiro, em um aparelho Shimadzu

modelo GCMS QP-2010 com amostrador automático AOC-20i e equipado com coluna

RTx-5Ms (L=30 m; d=0,25 µm). O programa para integração foi o Labsolutions

fornecido pela Shimadzu.

As condições de análise foram: A temperatura inicial foi ajustada a 60 ºC e

mantida por 1 min e, então, elevada até 290 ºC a uma taxa de 10 ºC por minuto e

mantido por 16 min. A temperatura de injeção foi de 250 ºC. O gás de arraste utilizado

foi hélio.

Page 62: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

41

3.3.2 Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa (Greifswald universität). As reações de acoplamento de Suzuki-Miyaura com posterior transaminação

biocatalisada foram monitoradas em cromatografia gasosa acoplada à espectrometria

de massa (CG-EM), na Universidade de Greifswald, após derivatização da amostra

com MBTFA em um aparelho Shimadzu modelo GCMS QP-2010 com coluna

HYDRODEX-β-TBDAc (L=25 m; d=0,25 µm). O gás de arraste utilizado foi hélio e o

programa para integração foi o Labsolutions fornecido pela Shimadzu.

As condições de análise foram: A temperatura inicial foi ajustada a 80 ºC e

mantida por 10 min e, então, elevada até 175 ºC a uma taxa de 4 ºC por minuto e

mantido por 13 min. Finalmente, a temperatura foi elevada até 220 ºC a uma taxa de

20 ºC por minuto e mantido por 5 min. O gás de arraste utilizado foi hélio.

3.3.3 Cromatografia gasosa com detector por ionização de chamas (UFRJ). O excesso enantiomérico das reações realizadas no Brasil foi analisado por

cromatografia gasosa com detector por ionização de chamas (CG-DIC) em um

aparelho Shimadzu modelo GCMS QP-2010 com coluna CP-Chirasil-Dex CB. O gás

de arraste utilizado foi hélio.

As condições de análise foram: A temperatura inicial foi ajustada a 105 ºC e

mantida por 9 min e, então, elevada até 180 ºC a uma taxa de 40 ºC por minuto e

mantido por 10 min. O gás de arraste utilizado foi hidrogênio.

3.3.4 Cromatografia gasosa com detector por ionização de chamas (ULisboa). O excesso enantiomérico das reações de resolução cinética catalisada por

lipase, realizadas em Portugal, foi analisado após derivatização em um aparelho

Thermo Scientific FocusGC equipado com coluna quiral HYDRODEX-β-6TBDM

(L=25 m; d=0,25 µm).

As condições de análise foram: A temperatura foi ajustada a 140 ºC e mantida

por 36 min e então alterado a uma taxa de 10 ºC por minuto até 185 ºC e mantido por

5 min. O gás de arraste utilizado foi hélio.

Page 63: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

42

3.4 Equipamentos 3.4.1 Sistemas de Fluxo contínuo (UFRJ)

Três sistemas de fluxo contínuo foram utilizados:

Para as reações em fluxo contínuo realizadas no Brasil, foi utilizado o sistema

ASIA da SYRRIS®, composto por bomba e aquecedor.

Para as reações de transaminação em fluxo contínuo realizadas na Alemanha,

foi utilizado uma bomba de seringa KDS Scientific série 100.

Para as reações de resolução cinética catalisadas por Lipase realizadas em

Portugal, foi utilizado uma bomba de seringa modelo NE-1000, da New Era Pump

Systems Inc.

3.4.2 Ressonância magnética nuclear Espectros de RMN foram adquiridos a temperatura ambiente em um Bruker

Avance II+ 300 (1H 300 MHz,

13C 75 MHz) e 400 (

1H 400 MHz,

13C 100 MHz) usando

CDCl3 como solvente e (CH3)4Si (1H) como padrão interno. Deslocamento químico (δ)

reportados em partes por milhão (ppm) e constantes de acoplamento (J) foram

expressas em Hertz (Hz).

3.5 Condições reacionais 3.5.1 Teste de atividade de ω-transaminases comerciais.

O teste de atividade das ω-TAs imobilizadas do kit ECS-ATA da Enzymicals foi

realizado por meio da reação de resolução cinética da (RS)-1-feniletilamina. Para isso,

em um tubo de eppendorf contendo 25 mg da enzima imobilizada foi adicionado 1 mL

de uma solução composta por (RS)-1-feniletilamina (50 mmol L-1

), piruvato de sódio

(50 mmol L-1

) e PLP (1 mmol L-1

) em tampão fosfato (100 mmol L-1

, pH 7). A solução

foi agitada em agitador orbital a 200 rpm por 24 h em uma temperatura de 30 °C. Além

disso, foi preparado também um controle positivo, utilizando 10 mg da ω-TA isolada

expressa em E. coli. e um controle negativo, onde nenhum catalisador foi adicionado.

O conjunto de reações foi interrompido pela adição de uma solução de NaOH

Page 64: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

43

(100 μL, 5 mol L-1

) em cada eppendorf. A extração foi feita com acetato de etila

(3 × 200 μL) e as camadas orgânicas foram combinadas e então secas com Na2SO4.

A conversão foi analisada em CG-EM e, após derivatização (5 μL anidridro

trifluoroacético + 5 μL de trietilamina), o excesso enantiomérico foi analisado em

CG-DIC.

3.5.2 Síntese assimétrica usando isopropilamina como doador amino. Para avaliação da síntese assimétrica empregando isopropilamina como

doador amino, em eppendorfs contendo cada um 10 mg das respectivas

transaminases, foi adicionado 0,9 mL de uma solução composta por isopropilamina

(1 mol L-1

), trietanolamina (100 mmol L-1

) e PLP (1 mmol L-1

) em água. O pH foi

ajustado previamente a 7,5 com uma solução de HCl 1 mol L-1

. Então, 0,1 mL de uma

solução de acetofenona 100 mmol L-1

em DMSO foi adicionado aos eppendorfs. A

reação ocorreu em um agitador orbital a 230 rpm por 24 h a 30 ºC.

Ao final, o conjunto de reações foi interrompido pela adição de NaOH (100 μL,

5 mol L-1

) em cada eppendorf. A extração foi feita com acetato de etila (3 × 200 μL) e

as camadas orgânicas foram combinadas e então secas com Na2SO4. A conversão

foi analisada em CG-EM.

3.5.3 Síntese assimétrica usando um sistema de deslocamento de equilíbrio LDH/GDH A síntese da (R)-1-feniletilamina catalisada por ω-TAs empregando um sistema

de deslocamento de equilíbrio LDH/GDH foi avaliada nas condições que se segue: em

tubos de eppendorf contendo 10mg da ω-TAs imobilizada foi adicionado 1 mL de uma

solução composta por DL-alanina (250 mmol L-1

), acetofenona (10 mmol L-1

), NADH

(2 mmol L-1

), uma lactato desidrogenase (90 U mL-1

), uma glicose desidrogenase

(15 U mL-1

), glicose (75 mmol L-1

), PLP (0,1 mmol L-1

) em tampão fosfato

(100 mmol L-1

; pH 7,1). A reação ocorreu em agitador orbital a 200 rpm por 24 h em

uma temperatura de 30 ºC. Também foram preparados o controle negativo, sem

enzima, e o controle positivo, usando 2 mg da transaminase isolada de Vibrio fluvialis.

Page 65: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

44

Ao final, o conjunto de reações foi interrompido pela adição de NaOH

(100 μL, 5 mol L-1

) em cada eppendorf. A extração foi feita com acetato de etila

(3 × 200 μL) e as camadas orgânicas foram combinadas e então secas com Na2SO4.

A conversão foi analisada em CG-EM.

3.5.4 Reações de acoplamento cruzado de Suzuki-Miyaura Para estudos das condições ótimas para a reação de acoplamento cruzado de

Suzuki-Miyaura, as condições foram como se segue: 1 mL de uma solução 50%

dimetilformamida (DMF):água adicionada de 4’-bromoacetofenona (5 mmol L-1

), ácido

fenilborônico (7,5 mmol L-1

), o catalisador de paládio (5 mol%) e K2CO3 ou Et3N

(10 mmol L-1

) foi agitada a temperatura ambiente por 10 min. Ao final, uma extração

foi realizada com acetato de etila (3 × 200μL) e as camadas orgânicas foram

combinadas e então secas com Na2SO4. A conversão foi analisada em CG-EM.

As mesmas condições foram utilizadas para os estudos em soluções 50%

DMF:tampão, onde diferentes soluções-tampão foram avaliadas (HEPES pH7 e

CHES pH9 e NaHCO3 pH 9). Além disso, três diferentes catalisadores de paládio

foram avaliados: PdCl2, Pd(AcO)2 e Pd/BaSO4.

As amostras foram extraídas com acetato de etila (3 x 200 µL). As camadas

orgânicas foram secas com Na2SO4 anidro.

3.5.5 Síntese de biaril aminas em condições semi-contínuas Para a síntese das diferentes biaril aminas em condições semi-contínuas, as

condições foram: substrato cetona (2 mmol L-1

), o ácido fenilborônico

(1,5 equivalente), 10 mol% PdCl2 em tampão NaHCO3 (pH 9) com 50% DMF por 2 h

a 50 ºC em agitador orbital. Após a reação de Suzuki, a solução foi diluída, em uma

proporção 1:2, em tampão HEPES (50 mmol L-1

, pH 9) contendo PLP (1 mmol L-1

).

Então, isopropilamina (750 mmol L-1

) foi adicionada à solução.

Um reator foi preenchido com 410 mg do biocatalisador. O sistema foi

condicionado passando tampão pelo interior do sistema a uma vazão de 10 mL h-1

por

Page 66: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

45

30 min. Essa etapa foi usada para verificar possíveis vazamentos no reator. A seringa

foi preenchida com a solução da reação de Suzuki e acoplada a bomba. O reator foi

mergulhado em banho de água com temperatura controlada a 30 ºC. A solução foi

então bombeada a uma vazão de 0,1 mL h-1

. O tempo de residência foi de 3,5 h. Ao

final, uma alíquota de 200 µL foi colhida, extraída e derivatizada para análise.

A solução foi extraída e derivatizada como se segue: O procedimento de

extração e derivatização foram como se segue: 100 µL de amostra foram basificados

com uma solução 3 mol L-1

de NaOH até pH >12. A amostra foi extraída com éter metil

terc-butílico (MTBE) (2 x 100 µL contendo o padrão interno 4‘-iodoacetofenona

(0,5 mmol L-1

). As camadas orgânicas foram secas com MgSO4 anidro. A

derivatização foi feita com N-metil-bis(trifluoroacetamida) (MBTFA) (100 µL de

amostra e 7 µL da solução comercial de MBTFA) e agitado por 1 h a 60 °C.

3.5.6 Síntese do agente acilante PEG600 (dietil diéster) O agente acilante foi sintetizado como descrito por Monteiro et al. (2015): 10g

de PEG600-diácido (17 mmol), 125 mL de etanol 96% (V/V) e 2 mL de ácido sulfúrico

(37,5 mmol) foram agitados por 16 h em um balão a 80 ºC. Então, a solução foi

deixada para equilibrar à temperatura ambiente e o etanol foi removido sob vácuo em

um rotavapor. O produto foi ressuspenso em água (50 mL) e 50 mL de uma solução

saturada de bicabornato de sódio foi adicionada. Após extração com diclorometano

(3 x 50 mL), a fase orgânica foi lavada com solução saturada de NaCl (50 mL),

separada e seca com Na2SO4 anidro e, então, filtrado. O solvente foi evaporado e o

produto foi obtido como um óleo incolor (4,085 g, 71%).

3.5.7 Resolução cinética enzimática da (RS)-1-feniletilamina usando PEG600 (dietil diéster) como agente acilante em condições de fluxo continuo

Para a reação de resolução cinética da (RS)-1-feniletilamina em condições de

fluxo contínuo, as condições foram como se segue: Uma solução de 20 mL contendo

Page 67: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

46

(RS)-PEA (1, 150 mmol L-1

, 366,8 mg) e PEG600-diéster (150 mmol L-1

, 1,807 g) em

tolueno foi preparada. Um reator de leito fixo de 830 μL de volume interno foi

preenchido com o biocatalisador Novozyme 435 (303 mg). O reator foi mantido em um

forno a 70 ºC e a solução foi bombeada em uma vazão de 27,6 μL min-1

(Tr= 30min).

O volume recolhido foi de 4,6 mL.

O procedimento de extração e derivatização para análise foram como se segue:

200 µL de amostra foram basificados com uma solução 1 mol L-1

de NaOH até pH >12.

A amostra foi extraída com ciclohexano (3 x 100 µL). As camadas orgânicas foram

secas com Na2SO4 anidro. A derivatização foi feita adicionando à amostra 5 µL de

anidrido acético e 5 µL de trietilamina e agitado por 20 min a temperatura ambiente. A

amostra foi lavada com solução aquosa de HCl 1 mol L-1

e extraída com DCM e seca

com Na2SO4 anidro.

3.5.8 Hidrólise química para recuperação da (R)-1-feniletilamina Para a recuperação de (R)-1 do PEG, após a reação de resolução cinética e

extração de (S)-1 do meio com uma solução 1 mol L-1

de HCl, a fase orgânica foi

evaporada. O produto restante ((R)-2) foi adicionado em uma solução contendo 3mL

de metanol e 3mL de uma solução de HCl 6N. A reação foi realizada em um balão

equipado com um condensador de refluxo e agitada a 80 ºC por 16 h. Após

evaporação do metanol, a solução ácida foi extraída com DCM para retirar o PEG. A

fase aquosa foi extraída e derivatizada como descrito.

O procedimento de extração e derivatização para análise do excesso

enantiomérico foram como se segue: 200 µL de amostra foram basificados com uma

solução 1 mol L-1

de NaOH até pH >12. A amostra foi extraída com ciclohexano

(3 x 100 µL). As camadas orgânicas foram secas com Na2SO4 anidro. A derivatização

foi feita adicionando à amostra 5 µL de anidrido acético e 5 µL de trietilamina e agitado

por 20 min a temperatura ambiente. A amostra foi lavada com solução aquosa

1 mol L-1

de HCl e extraída com DCM e seca com Na2SO4 anidro.

Page 68: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

47

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1 Transaminases 4.1.1 Avaliação da atividade de transaminases imobilizadas comerciais.

Em um primeiro momento, utilizamos a reação de resolução cinética da

(RS)-1-feniletilamina para testar a atividade das transaminases imobilizadas obtidas

comercialmente. O kit ECS-ATA, da Enzymicals, é composto por 7 (R)-ω-TAs, que

foram recentemente descobertas por homologia através de uma abordagem in silico

(HÖHNE et al., 2010). Comparado com o grande número de (S)-TAs já descobertas e

extensamente estudadas, transaminases com enantiopreferência (R) são extrema-

mente raras. As enzimas do kit são imobilizadas em resinas de metacrilato LifetechTM

,

patente da Purolite®, por ligação covalente (GUO; BERGLUND, 2017; HÖHNE et al.,

2010). O conjunto de reações empregado nesta etapa, adaptado de Martin et al.

(2007), contou ainda com uma (S)-transaminase livre comercial, expressa em E. coli,

e um controle negativo, sem adição de qualquer catalisador. Os resultados são

mostrados na tabela 7.

Tabela 7.Resolução cinética da (RS)-1-feniletilamina por transaminases imobilizadas comerciais.

Entrada Biocatalisador Origem Conversão ee 1 Branco -- -- --

2 E. coli recomb. Sem informação de origem 45% n.a.

3 ECS-ATA01 Aspergillus fumigatus 45% >99 (S)

4 ECS-ATA02 Gibberella zeae 49% >99 (S)

5 ECS-ATA03 Neosartorya fischeri 49% >99 (S)

6 ECS-ATA04 Aspergillus oryzae 4% --

7 ECS-ATA05 Aspergillus terreus 47% >99 (S)

8 ECS-ATA06 Penicillium chrysogenum 33% 43 (S)

9 ECS-ATA07 Mycobacterium vanbaalenii 49% >99 (S)

Condições: (RS)-1-feniletilamina (50 mmol L-1), piruvato de sódio (50 mmol L-1) e PLP (1 mmol L-1) em tampão fosfato (100 mmol L-1, pH 7) a 30 ºC por 24 h. *n.a.: não avaliado.

Page 69: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

48

Podemos notar que a maioria das reações apresentou excelentes resultados,

com conversões maiores que 45%. Ainda, considerando que todas as ω-TAs

utilizadas possuem seletividade para o enantiômero (R), observou-se que as enzimas

foram altamente seletivas. As exceções foram os biocatalisadores ECS-ATA04, que

mostrou conversão insuficiente, e ECS-ATA06 que mostrou conversão de 33% (e 43%

ee), provavelmente devido a influência do pH reacional. Segundo a literatura, para

ambos os biocatalisadores, o pH ótimo é acima de 8 e diminuem atividade

abruptamente em pH 7 (SCHÄTZLE et al., 2011). Vale mencionar ainda que, como

dito anteriormente, em uma resolução cinética, o excesso enantiomérico depende da

conversão, o que justifica o baixo valor para o biocatalisador ECS-ATA06 nas

condições estudadas.

4.1.2 Avaliação das metodologias de deslocamento do equilíbrio para síntese assimétrica.

Esquema 21. Metodologias empregadas para o deslocamento do equilíbrio de reações de síntese assimétrica.

Page 70: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

49

Em todo esse trabalho, duas metodologias de deslocamento do equilíbrio para

a reação de síntese assimétrica foram utilizadas (esquema 21). A primeira utiliza iso-

propilamina como doador amino. Como dito anteriormente, esse método é bastante

vantajoso, devido o baixo custo do doador amino e o fato da reação gerar acetona no

meio. A acetona pode então ser facilmente removida por aquecimento, evitando uma

possível inibição pelo produto. Além disso, essa metodologia é de simples aplicação

e se encaixa perfeitamente com nossas pretensões de uso em fluxo contínuo. Outra

metodologia de deslocamento do equilíbrio utilizado é o sistema com uma lactato

desidrogenase (LDH) e uma glicose desidrogenase (GDH). Nesse caso, alanina é

utilizada como doador amino. A reação forma piruvato que é rapidamente convertido

para lactato pelo sistema LDH/GDH, deslocando o equilíbrio para a formação do

produto e evitando a inibição pelo produto piruvato (MALIK et al., 2012; SMITH et al.,

2010).

Iniciamos avaliando as transaminases do kit da Enzymicals no método de

deslocamento de equilíbrio 1. Os resultados podem ser conferidos na tabela 8.

Tabela 8. Reação de síntese assimétrica catalisada por diferentes transaminases utilizando isopropilamina como doador amino.

Entrada Biocatalisador Origem Conversão 1 Branco -- --

2 E. coli recomb. Sem informação de origem 46%

3 ECS-ATA01 Aspergillus fumigatus --

4 ECS-ATA02 Gibberella zeae --

5 ECS-ATA03 Neosartorya fischeri --

6 ECS-ATA04 Aspergillus oryzae --

7 ECS-ATA05 Aspergillus terreus --

8 ECS-ATA06 Penicillium chrysogenum --

9 ECS-ATA07 Mycobacterium vanbaalenii --

Condições: Acetofenona (10 mmol L-1), isopropilamina (1 mol L-1), trietanolamina (100 mmol L-1) e PLP (1 mmol L-1), DMSO (10% v/v) em água (o pH foi ajustado para 7,5) a 30 ºC por 5 dias.

Page 71: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

50

Como é possível observar, apenas a reação empregando a enzima livre obteve

resultado, com 46% de conversão, considerando que as catalisadas por enzimas

imobilizadas comerciais não foram capazes de converter o substrato. O conjunto de

reações foi monitorado a cada 24h por 5 dias e não houve alteração na conversão em

nenhum caso.

Embora esses resultados pudessem ser justificados no fato de que a alta

concentração de isopropilamina pode causar a inativação de determinadas enzimas,

um efeito bastante conhecido na literatura, ou ainda que o produto acetona formado

na primeira etapa da reação tenha sido o responsável pela inibição da atividade, testes

posteriores mostraram que o mais provável é que as enzimas tenham perdido

atividade após o armazenamento (CASSIMJEE et al., 2010; TRUPPO; ROZZELL; et

al., 2009).

Assim, avaliamos ainda o conjunto de enzimas utilizando o sistema de

deslocamento de equilíbrio 2 (esquema 21). Como esperado, não houve conversão

do substrato. No entanto, nos surpreendemos ao observar a redução da acetofenona

a 1-feniletanol. Na figura 6, podemos observar no cromatograma, dois picos, um

relacionado ao substrato acetofenona e um outro menor, relacionado ao subproduto

1-feniletanol. Uma hipótese para esse efeito é a possibilidade de que o hidreto gerado

pelo sistema de deslocamento tenha atuado em uma adição nucleofílica ao carbono

da carbonila.

Page 72: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

51

Figura 6. Cromatograma extraído de uma das amostras da reação de síntese assimétrica catalisada por diferentes transaminases utilizando o sistema LDH/GDH e espectro de massa utilizado para a identificação dos compostos. Condições: DL-alanina (250 mmol L-1), acetofenona (10 mmol L-1), NADH (2 mmol L-1), lactato desidrogenase (90 U mL-1), glicose desidro-genase (15 U mL-1), glicose (75 mmol L-1), PLP (0,1 mmol L-1), 10% DMSO em tampão fosfato (100 mmol L-1; pH 7,1) a 30 ºC por 24 h.

4.1.3 Avaliação das condições para síntese de biaril aminas por reação de acoplamento de Suzuki-Miyaura e transaminação biocatalisada em cascata em fluxo contínuo.

Com o objetivo de obter biaril aminas através da combinação da atividade da

transaminase com a reação de acoplamento C-C de Suzuki-Miyaura em fluxo

contínuo, duas abordagens foram propostas (figura 7): Na abordagem 1, a etapa de

transaminação é realizado anterior à reação de acoplamento cruzado. Enquanto que

na abordagem 2, o inverso acontece. A primeira abordagem é vantajosa em permitir

que a transaminase lide com moléculas menores, uma vez que transaminases

OH

O

O

OH

Page 73: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

52

selvagens podem não apresentar atividade para grupamentos volumosos como biaril

cetonas. Por outro lado, essa abordagem torna necessária a busca de condições

ótimas para a reação de acoplamento que sejam compatíveis com o meio provindo da

reação biocatalisada. Já a segunda abordagem, poderia fazer necessária a obtenção

de uma enzima mutante capaz de converter o produto de acoplamento de Suzuki-

Miyaura. Além disso, a reação de transaminação, principalmente a transaminase,

deveria ser compatível com o meio vindo da reação anterior.

Isso posto, decidimos iniciar nossos estudos pela abordagem 1.

Figura 7. Abordagens propostas para a síntese de biaril aminas através da combinação da reação de acoplamento de Suzuki-Miyaura e a transaminação biocatalisada.

Page 74: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

53

4.1.3.1 Avaliação das condições ótimas para a reação de acoplamento cruzado de

Suzuki-Miyaura em batelada.

Esquema 22. Reação de acoplamento de Suzuki-Miyaura em solução 50% DMF em água.

Para que a abordagem 1 fosse possível era necessário estabelecer as

condições ótimas para a reação de Suzuki-Miyaura de modo que essa etapa fosse

compatível com a etapa de biocatálise anterior. Assim, iniciamos os nossos estudos

pela avaliação de diferentes catalisadores de paládio e bases para a reação de

acoplamento de Suzuki em água (esquema 22). Baseado no trabalho de Liu et al.

(2011), os catalisadores selecionados neste estudo foram o acetato de paládio

(PdCl2), cloreto de paládio (Pd(OAc)2) e paládio em sulfato de bário (Pd/BaSO4)

enquanto carbonato de potássio e trietilamina foram selecionados como bases. Os

resultados são mostrados na tabela 9.

Tabela 9. Reação de acoplamento cruzado de Suzuki-Miyaura entre a 4-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico com diferentes bases e catalisadores.

Entrada Catalisador Bases Conversãoa

1 PdCl2 K2CO3 89%

2 PdCl2 Et3N 77%

3 Pd(OAc)2 K2CO3 84%

4 Pd(OAc)2 Et3N 57%

5 Pd/BaSO4 K2CO3 --

6 Pd/BaSO4 Et3N --

7 Pd/BaSO4* K2CO3 46%

Condições: 4’-bromoacetofenona (5 mmol L-1), ácido fenilborônico (7,5 mmol L-1), [Pd] (5 mol%) e a base (10 mmol L-1) em solução 50% DMF:água foram agitados em temperatura ambiente por 10 min sob atmosfera. *realizado a 80 ºC por 24 h. aObtido por CG-EM.

Page 75: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

54

Como é possível observar, tanto as reações empregando a PdCl2 quanto o

aquelas mediadas por Pd(OAc)2 levaram a excelentes resultados utilizando ambas as

bases (tabela 9, entrada 1-4), embora os resultados para o K2CO3 tenham sido

melhores. A redução na conversão de reações de acoplamento de Suzuki-Miyaura

quando bases orgânicas são utilizadas, como trietilamina ou piridina, também foi

observado em trabalhos anteriores (LIU et al., 2014; SAIKIA et al., 2015).

Entretanto quando Pd/BaSO4 foi utilizado, nenhum produto foi formado, já que

o Pd/BaSO4 não é ativado a temperatura ambiente. Após elevação da temperatura

para 80 ºC, foi possível obter 46% de conversão, embora a reação tenha levado 24 h

para alcançar esse resultado. Diante disso, optamos por seguir os experimentos

utilizando apenas PdCl2 e Pd(OAc)2 como catalisadores e K2CO3 como base.

4.1.3.2 Avaliação de diferentes soluções-tampão na reação de acoplamento cruzado

de Suzuki-Miyaura em batelada.

Com base nos resultados anteriores, continuamos nossos estudos na escolha

de um tampão que fosse compatível com os dois processos, o de acoplamento

cruzado de Suzuki-Miyaura e a transaminação biocatalisada. A escolha do tampão é

importante já que na reação de transaminação, que precede a reação de acoplamento

de Suzuki (figura 7), o meio tamponado é necessário. Os resultados podem ser vistos

na tabela 10.

Tabela 10. Avaliação de diferentes soluções-tampão na reação de acoplamento de Suzuki-Miyaura

Entrada Catalisador Tampão [mmol L-1] pH Conversão (%)

1 Pd(OAc)2 HEPES 50 8 --

2 Pd(OAc)2 HEPES 25 8 --

3 Pd(OAc)2 HEPES 12,5 8 --

4 Pd(OAc)2 CHES 50 9 --

5 Pd(OAc)2 CHES 25 9 --

6 Pd(OAc)2 CHES 12,5 9 --

7 Pd(OAc)2 Na2PO4 100 7,5 --

8 Pd(OAc)2 NaHCO3 25 9 >99

Page 76: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

55

9 PdCl2 HEPES 50 8 --

10 PdCl2 HEPES 25 8 --

11 PdCl2 HEPES 12,5 8 --

12 PdCl2 CHES 50 9 --

13 PdCl2 CHES 25 9 --

14 PdCl2 CHES 12,5 9 --

15 PdCl2 Na2PO4 100 7,5 --

16 PdCl2 NaHCO3 25 9 >99

Condições: 4’-bromoacetofenona (5 mmol L-1), ácido fenilborônico (7,5 mmol L-1), [Pd] (5 mol%), K2CO3

(10 mmol L-1), 50% DMF e tampão (50 mmol L-1) foram agitados em temperatura ambiente por 10 min

sob atmosfera.

Como podemos observar, o tampão NaHCO3 foi o único tampão estudado

compatível com a reação. Desse modo, foi possível obter 100% de conversão do

substrato em apenas 10 min. O efeito da concentração do tampão também foi avaliado

(tabela 10, entradas 1-6 e 9-14), entretanto independente da concentração utilizada

não foi observada a formação de produto para essas soluções. Uma hipótese para

esse efeito é a influência do pH em reações de Suzuki. Essa influência já havia sido

observada em 1994, quando Wallow & Novak argumentaram que esse efeito é

causado pela formação do ânion arilborato em pH >9 e, dado a sua maior reatividade,

a formação deste daria prosseguimento a etapa de transmetalação (WALLOW;

NOVAK, 1994). Entretanto, dados recentes mostram que a reação de Suzuki-Miyaura

envolve a molécula neutra do ácido e não o ânion (SCHMIDT et al., 2011). Ainda

assim, considerando que a reação ocorre em meio bifásico, a formação do ânion

arilborato pode atuar como uma reserva de hidróxido para a fase orgânica, que é

consumido durante a reação, além de diminuir o homo acoplamento do ácido

fenilborônico (LENNOX; LLOYD-JONES, 2013).

Por outro lado, um outro fator parece ter levado à ineficiência de reações em

tampão CHES, apesar do pH 9. A desativação do paládio pode ter ocorrido devido ao

nitrogênio na estrutura do CHES (figura 8a). O par de elétrons disponível do nitrogênio

pode se ligar ao paládio diminuindo a velocidade da reação ou desativando

irreversivelmente o catalisador (figura 8b) (ITOH; MASE, 2005; LI et al., 2016;

THOMPSON et al., 2005).

Diante disso, prosseguimos nossos estudos utilizando o tampão NaHCO3.

Page 77: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

56

Figura 8. A) Ácido 2-(ciclohexilamino)-etanosulfônico (CHES); B) Complexação do paládio com a amina básica.

Um último critério de importante avaliação é concentração de DMF. Isso porque

a transaminase possui baixa tolerância a solventes orgânicos, então era interessante

avaliar a concentração de DMF mínima necessária de modo a não haver problemas

de solubilidade na etapa de acoplamento seguinte. Assim, iniciamos com a

concentração de 50% já estudada e diminuímos até 10% de DMF. O resultado pode

ser visto na tabela 11.

Tabela 11. Avaliação de diferentes concentrações DMF na reação de acoplamento de Suzuki-Miyaura entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico.

Entrada Catalisador [DMF] (%) Tempo de reação (min) Conversão (%)

1 Pd(OAc)2 10 10 >99

2 Pd(OAc)2 20 10 >99

3 Pd(OAc)2 30 10 >99

4 Pd(OAc)2 40 10 >99

5 Pd(OAc)2 50 10 >99

6 PdCl2 10 120 65

7 PdCl2 20 10 99

8 PdCl2 30 10 >99

9 PdCl2 40 10 >99

10 PdCl2 50 10 >99

Condições: 4’-bromoacetofenona (5 mmol L-1), ácido fenilborônico (7,5 mmol L-1), [Pd] (5 mol%), K2CO3

(10 mmol L-1), 50% DMF e tampão NaHCO3 (25 mmol L-1; pH 9) foram agitados em temperatura ambi-

ente por 10 min sob atmosfera.

Como podemos notar, mesmo com 10% de DMF em tampão NaHCO3 foi

possível obter máxima conversão. A exceção foi para a reação empregando o cloreto

de paládio com 10% DMF (tabela 11, entrada 6), que converteu apenas 65% do

substrato, mesmo após 2 h. Nesse caso, houve rápida desativação do paládio com

formação de um precipitado de coloração escura.

Page 78: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

57

4.1.3.3 Síntese assimétrica utilizando substratos de interesse, em batelada, nas

condições compatíveis com a reação de Suzuki.

Considerando que as transaminases imobilizadas comerciais não tiveram

atividade para os substratos anteriores, adquirimos novas transaminase enviadas pelo

professor Uwe Bornscheuer e iniciamos os testes de atividade para a síntese

assimétrica com alguns substratos selecionados. Esses substratos variavam o

tamanho da cadeia, posição do átomo de bromo e presença ou não de nitrogênio no

anel.

As enzimas adquiridas possuem quatro origens diferentes: a (R)-ω-TAs de

Aspergillus fumigatus e as (S)-ω-TAs de Chromobacterium violaceum, Vibrio fluvialis

e Ruegeria pomeroyi. Algumas dessas enzimas foram recebidas liofilizadas e outras

imobilizadas em diferentes suportes como quitosana ou os suportes EziGTM

(figura 9).

Esse último, produzido pela EnginZyme, são baseados em partículas de vidro com

porosidade controlada e possuem diferentes características de acordo com o

revestimento da partícula. Enquanto EziG1 possui característica hidrofílica e ausência

de revestimento, EziG2 e EziG3 são revestidos por polímeros hidrofóbico e semi-

hidrofílico, respectivamente (CASSIMJEE et al., 2014; MALLIN et al., 2014).

Figura 9. Suporte EziGTM ligado à enzima. Adaptado de (CASSIMJEE et al., 2014)

Page 79: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

58

Assim, os 9 diferentes biocatalisadores foram avaliados frente aos quatro

substratos selecionados (figura 10) em condições compatíveis à reação de

acoplamento de Suzuki-Miyaura, utilizando tampão NaHCO3 (pH 9).

Figura 10. Substratos selecionados para síntese assimétrica.

Tabela 12. Conversão na síntese assimétrica de diferentes aminas utilizando transaminases liofilizadas e imobilizadas em diferentes suportes.

Entrada Biocatalisador Origem da enzima Suporte Conversão (%)

2b 3b 4b 5b

1 Sem enzima -- -- -- -- -- --

2 Vf_lio V. fluvialis -- -- -- -- --

3 4CHI_E1 A. fumigatus EziG1TM

4,6 1,9 4,9 2,4

4 4CHI_E2 A. fumigatus EziG2TM

62,3 20,1 70,6 64,6

5 4CHI_E3 A. fumigatus EziG3TM

n.a. n.a. 25,9 �21,3

N

Br

O

N

O

O

Br

Br

O

Br

3-acetil-5-bromopiridina (2a) 3-acetil-6-bromopiridina (3a)

4-(3-bromofenil)-2-butanona (4a) 4-(4-bromofenil)-2-butanona (5a)

R

NH2

R

Oω-transaminase

2a-5a 2b-5b

1-feniletilamina acetofenona

Page 80: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

59

6 4CHI_CHI A. fumigatus Quitosana n.a. n.a. -- --

7 CVi_E2 C. violaceum EziG2TM

n.a. n.a. -- --

8 CVi_E3 C. violaceum EziG3TM

-- -- -- --

9 CVi_CHI C. violaceum Quitosana n.a. n.a. -- --

10 3HMU_E1 R. pomeroyi EziG1TM

2,77 -- 2,34 --

Condições: cetona (5 mmol L-1), (RS)-1-feniletilamina (25 mmol L-1), PLP (0,1 mmol L-1), DMF (10%

v/v) e 10 mg da enzima imobilizada ou 3 mg de enzima liofilizada em tampão NaHCO3 (10 mmol L-1,

pH 9) a 30ºC por 48 h. Conversões analisadas por CG-EM. n.a. = não avaliado

Como podemos observar, apenas 4 biocatalisadores apresentaram atividade

para os substratos propostos, sendo 3 deles a (R)-transaminase de A. fumigatus e

uma de R. pomeroyi (tabela 12, entradas 3-5 e 10). O melhor resultado para todos os

substratos foi obtido pelo biocatalisador 4CHI_E2 (tabela 12, entrada 4) e é possível

notar ainda que a atividade foi maior quanto mais hidrofóbico o suporte (tabela 12

entradas 3-5). A natureza do suporte pode afetar o microambiente da enzima com

consequente aumento ou diminuição da atividade enzimática. Nesse caso, a natureza

hidrofóbica do suporte também previne a desnaturação da enzima, principalmente

pela menor interação com o DMF hidrofílico (CASSIMJEE et al., 2014; LIU et al.,

2002). É possível observar também que quando a transaminase de A. fumigatus foi

imobilizada em quitosana não apresentou qualquer atividade para os substratos

propostos (tabela 12, entrada 6). Em trabalhos anteriores, durante a imobilização de

transaminases em quitosana, Mallin et al. (2013) estudaram a mudança do co-emulsi-

ficante hexanol para hexano na tentativa de aumentar a hidrofobicidade do suporte,

que é altamente hidrofílico. Entretanto, para esse suporte, mesmo o aumento da

hidrofobicidade não resultou em aumento da atividade.

Vale notar ainda que a posição do átomo de bromo no anel aromático teve

impacto significativo na atividade da enzima, provavelmente devido à acomodação da

molécula no sítio catalítico, um efeito também observado em trabalhos recentes

(DAWOOD et al., 2018). Como podemos observar, o biocatalisador 3HMU (tabela 12,

entrada 10) mostrou atividade apenas para os substratos com o bromo na posição

Page 81: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

60

meta. Além disso, os biocatalisadores baseados na ω-TA de A. fumigatus tiveram um

aumento significativo na atividade para substratos com o bromo nesta mesma

posição.

Posteriormente, testamos ainda a influência da disponibilidade de PLP no meio

reacional. Os biocatalisadores 4CHI_E1 e 3HMU_E1 foram selecionados para avaliar

se a baixa concentração de PLP teria influenciado a baixa atividade desses

biocatalisadores. Assim, a concentração de PLP foi aumentada em 10 vezes,

entretanto, a maior concentração de PLP não teve qualquer impacto na atividade nas

condições estudadas.

4.1.4 Síntese de biaril aminas por reação de acoplamento de Suzuki-Miyaura e transaminação biocatalisada em regime semi-contínuo. Após o estabelecimento das condições ótimas para a reação de acoplamento

de Suzuki compatíveis com a transaminação biocatalisada, iniciamos nossos estudos

para a aplicação das condições ideais em fluxo contínuo. Essa parte do trabalho foi

realizada na Universidade de Greifswald (Ernst-Moritz-Ardnt Greifswald Universität),

na Alemanha, no laboratório do Professor Uwe T. Bornscheuer.

Devido às diferentes condições do laboratório, algumas alterações foram feitas.

Primeiramente, testes anteriores realizados pelo grupo alemão indicavam que a

transaminase de Aspergillus fumigatus (4CHI) poderia ser capaz de converter biaril

cetonas, possibilitando que síntese assimétrica fosse realizada posterior à reação de

Suzuki (Figura 7, abordagem 2). Nesta etapa também foi incluída uma variante da

mesma enzima, a 4CHI_I145A, recém-descoberta pelo grupo através de estudos de

docking e dinâmica molecular.

Para esse conjunto de reações, cloreto de paládio foi selecionado como

catalisador para a reação de Suzuki por apresentar os melhores resultados nos

experimentos anteriores. Como o PdCl2 é um catalisador homogêneo, a síntese das

biaril aminas foi realizada em condições semi-contínuas, com a reação de Suzuki em

batelada seguida da transaminação biocatalisada em fluxo contínuo (figura 7,

Page 82: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

61

abordagem 2).

Assim, nosso primeiro passo foi a imobilização da nova ω-TA 4CHI_I145A no

suporte EziG2. Como visto anteriormente, a ω-TA de A. fumigatus apresentou

melhores resultados quando imobilizada nesse suporte. A imobilização foi realizada

imergindo o suporte no extrato enzimático após a desintegração das células cultivadas

por sonicação. Após a imobilização, iniciamos a avaliação do sistema na produção

das aminas propostas (figura 11).

Figura 11. Aminas produzidas através da reação de Suzuki seguida de transaminação biocatalisada em condições semi-contínuas.

4.1.4.1 Síntese assimétrica biocatalisada da 1-(4-bifenilil)etilamina (1c) e 1-(4’fluoro-

4-bifenilil)etilamina (F-1c) em condições semi-contínuas.

Iniciamos então com a produção da 1-(4-bifenil)etilamina em um sistema semi-

contínuo (esquema 23). Assim, a 4-bromoacetofenona (2 mmol L-1

), o ácido

fenilborônico, 10 mol% [Pd] reagiram em tampão NaHCO3 (pH 9) com 50% DMF por

2 h a 50 ºC em agitador orbital. Necessário mencionar que em testes anteriores, a

NH2

N

NH2

N

NH2

NH2

F

1-(4-bifenilil)etilamina (1c) 1-(4'-fluoro-4-bifenilil)etilamina (F-1c)

1-(6-fenil-3-piridinil)etilamina (3c)1-(5-fenil-3-piridinil)etilamina (2c)

Page 83: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

62

transaminase de A. fumigatus mostrou tolerância até 25% de DMF. Assim, após a

reação de Suzuki, a solução foi diluída, em uma proporção 1:2, em tampão HEPES

(50 mmol L-1

, pH 9) contendo PLP (1 mmol L-1

). A concentração final do substrato para

a transaminação foi escolhida 1 mmol L-1

para não haver problemas de solubilidade

em 25% DMF. Finalmente, isopropilamina (750 mmol L-1

) foi adicionada à solução,

pois se esperava que a variante 4CHI_I145A aceitasse melhor esse doador amino.

Um reator foi preenchido com 410 mg do biocatalisador e a vazão da bomba

de fluxo contínuo ajustada para 0,1 mL h-1

, resultando em um tempo de residência de

3,5 h. Ao final, a solução foi basificada com uma solução 3 mol L-1

de NaOH a um

pH>12 e extraída com uma solução de MTBE contendo o padrão interno

4-iodoacetofenona. A amostra foi seca com Na2SO4 e derivatizada com MBTFA para

análise em CG-EM.

Esquema 23. Síntese da 1-(4-bifenilil)etilamina em condições semi-contínuas partindo da 4-bromoacetofenona.

No cromatograma obtido através da análise da amostra foi possível observar

uma conversão de 49% com um tempo de residência de 3,5 h a 30ºC. A identificação

do produto foi realizada pela análise do espectro de massas (figura 12).

Page 84: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

63

Figura 12. Cromatograma obtido após reação de síntese assimétrica de 1c biocatalisada em fluxo contínuo. Abaixo o espectro de massas identificando a obtenção do produto.

Em trabalhos anteriores, Allwein et al. (2006) obtiveram o composto 1c através

da hidrogenação assimétrica de N-trifluoroacetamidas utilizando catalisadores de

ródio e ligantes quirais. Entretanto, foram necessárias de 3 a 5 etapas para alcançar

o produto desejado. Um resultado mais interessante foi alcançado recentemente por

Gallardo-donaire et al. (2018) que obtiveram diversas aminas enantiomericamente

puras através da aminação redutiva assimétrica de cetonas utilizando um complexo

de Ru e auxiliadores quirais. Os autores alcançaram 1c partindo da biaril cetona

precursora, com 90% de conversão e 87% ee após 16 h de reação.

Realizamos ainda a reação de transaminação em batelada utilizando as

enzimas livres e imobilizadas de A. fumigatus (4CHI) e da variante 4CHI_I145A. As

condições foram similares às realizadas anteriormente, mas em batelada o tempo de

reação foi 24 h. O resultado pode ser visto na tabela 13.

O

I HNO

1c

1b

Padrão interno m/z: 293

O

FF

F

Page 85: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

64

Tabela 13. Síntese da 1-(4-bifenilil)etanilamina (1c) em batelada.

Entrada Biocatalisador Conversão (%) 1 4CHI livre 69,1

2 4CHI_I145A Livre 22,8

3 4CHI_E2 59,7

4 4CHI_I145A_E2 47,3

Condições: biaril cetona (1 mmol L-1), isopropilamina (750 mmol L-1), PLP (0,1 mmol L-1), DMF (25% v/v)

e 10 mg da enzima imobilizada, ou 3 mg de enzima liofilizada, em tampão NaHCO3 (10 mmol L-1, pH 9)

a 30 ºC por 24 h. Conversões analisadas por CG-EM.

Como podemos observar, tanto as reações mediadas por ω-TA de A. fumi-

gatus quanto aquelas empregando a variante obtiveram bons resultados em batelada.

Vale destacar que, embora a conversão tenha sido menor para a transaminase de A.

fumigatus após a imobilização (tabela 13, entradas 1 e 3), para a variante a conversão

dobrou (entradas 2 e 4). A comparação direta com a reação em fluxo é complicada,

uma vez que a quantidade de biocatalisador presente nas reações em batelada foi

muito menor, o que garantiu tempos de reação muito menores em condições

contínuas.

Posteriormente, ao mudar o ácido fenilborônico utilizado na reação de Suzuki,

a atividade do biocatalisador pôde ser testada para uma biaril cetona portando um

átomo de flúor em fluxo contínuo.

Esquema 24. Síntese da 1-(4’-fluoro-4-bifenilil)etilamina (F-1c) em condições semi-contínuas partindo da 4-bromoacetofenona (1a).

Neste caso, na reação de síntese assimétrica em fluxo contínuo, a conversão

Page 86: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

65

foi 54% (esquema 24), não resultando em um aumento significativo quando

comparado à biaril amina não substituída 1c.

4.1.4.2 Síntese da 1-(5-fenil-3-piridinil)etilamina (2c) em condições semi-contínuas.

Moléculas contendo um centro piridínico são de grande interesse para indústria

química e farmacêutica. Além da sua utilização em diferentes reações na indústria e

na academia, esses compostos estão frequentemente presentes em produtos naturais

com atividade farmacológica. Esses fatores têm atraído o interesse para obtenção

dessas moléculas há anos. (ABUDU REXIT et al., 2016; ALTAF et al., 2015; HILL,

2010; LÓPEZ-IGLESIAS et al., 2016)

Assim, testamos nosso sistema na produção de aminas quirais contendo um

anel piridínico, iniciando com a síntese de 2c (esquema 25). Esse tipo de composto

se mostra bastante desafiador, principalmente na etapa de acoplamento, uma vez que

o nitrogênio presente no anel aromático pode interagir com o catalisador de paládio,

desativando-o ou tornando a reação mais lenta. Por esse motivo, o tempo da reação

de acoplamento foi aumentado para 2 h e a temperatura para 50ºC. (LI et al., 2016;

LIU et al., 2011; THOMPSON et al., 2005)

Esquema 25. Síntese da 1-(6-fenil-3-piridinil)etilamina (2c) em condições semi-contínuas partindo da 1-(5-bromopiridin-3-il)etanona (2a).

Assim, em condições semi-contínuas, o produto desejado foi observado com

uma conversão de 43%. O produto foi identificado através de espectrometria de

N

O

BOH

OH+

N

O10 mol% PdCl, NaHCO3 (25 nM, pH 9)

50% DMF, 50ºC2 horas

TA imobil. (4CHI), PLP

Tampão NaHCO3/HEPES30ºC

3,5h (tempo de residência)

Conversão 43%2a 2b 2c

Br

N

NH2

Page 87: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

66

massa e a conversão calculada de acordo com o consumo do substrato. Como

podemos observar na figura 13, para esse substrato também foi possível observar um

pico relativo à transaminação da cetona 2a, o que mostra que a reação de

acoplamento não foi completa.

Figura 13. Comparação entre o T0 e a amostra após a reação de síntese assimétrica de 2c.

Entretanto, a reação em batelada mostrou resultados diferentes. Esses

resultados podem ser observados na tabela 14.

Tabela 14. Síntese da 1-(5-fenil-3-piridinil)etilamina em batelada.

Entrada Biocatalisador Conversão (%) 1 4CHI livre 23,8

2 4CHI_I145A Livre 74,2

3 4CHI_E2 86,8

4 4CHI_I145A_E2 99,3

Condições: biaril cetona (1 mmol L-1), isopropilamina (750 mmol L-1), PLP (0,1 mmol L-1), DMF (25% v/v)

e 10 mg da enzima imobilizada, ou 3 mg de enzima liofilizada, em tampão NaHCO3 (10 mmol L-1, pH 9)

a 30 ºC por 24 h. Conversões analisadas por CG-EM.

Page 88: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

67

A transaminase de A. fumigatus livre apresentou atividade menor para esse

substrato do que para os demais avaliados. Entretanto, houve um aumento

considerável na conversão do substrato quando a enzima foi imobilizada, uma

mudança de 24% para 87% na conversão (tabela 14, entradas 1 e 3). Por outro lado,

a variante 4CHI_I145A livre apresentou uma atividade melhor do que a de tipo

selvagem e, após a imobilização, converteu quase que completamente o substrato. É

provável que esse efeito seja relacionado à troca do biocalisador por lotes mais novos.

No entanto, os resultados em batelada coincidem com aqueles observados para

substratos com grupos volumosos na posição meta. Essa maior atividade esta

relacionada com a acomodação da molécula no sítio catalítico.

4.1.4.3 Síntese assimétrica biocatalisada da 1-(6-fenil-3-piridinil)etilamina (3c) em

condições semi-contínuas.

Esquema 26. Síntese da 1-(6-fenil-3-piridinil)etilamina (3c) em condições semi-contínuas partindo da 1(6-bromopiridin-3-il)etanona (3a).

As condições para a síntese de 3c (esquema 26) foram as mesmas aplicadas

anteriormente. Após a etapa de síntese assimétrica, a amostra foi extraída e

derivatizada como já descrito e analisada em CG-EM. A conversão observada para

esse produto foi de 80%. Quando comparada com seu análogo sem o nitrogênio no

anel, a melhora na conversão é devido ao efeito retirador de elétrons do N no anel

aromático. O efeito do nitrogênio presente no anel em reações de transaminação

biocatalisada foi demostrado por López-Iglesias et al. (2016), que por análise

espectroscópica, observou um correlação entre a conversão e a frequência vibracional

NBr

O

BOH

OH+N

O

N

NH210 mol% PdCl,

NaHCO3 (25 nM, pH 9)

50% DMF, 50ºC2 horas

TA imobil. (4CHI), PLP

Tampão NaHCO3/HEPES30ºC

3,5h (tempo de residência)

Conversão 80%3a 3b 3c

Page 89: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

68

na banda da carbonila no espectro de infravermelho (figura 14). O efeito foi ainda

maior quando um átomo de cloro estava ligado ao anel piridínico.

Figura 14. Representação gráfica da relação entre as frequências vibracionais da carbonila no espectro

de infravermelho (barras) e a conversão (linha) na transaminação de arilalquil cetonas e piridilalquil

cetonas catalisada por transaminases. Adaptado de López-iglesias et al. (2016)

Como mostra a figura 15, foi possível observar no cromatograma um pico

relacionado ao produto de transaminação de 3a, mostrando que a reação de Suzuki

não foi completa mesmo com o aumento no tempo reacional. Esse efeito já era

esperado, como discutido anteriormente, para estruturas contendo piridina em

reações de acoplamento de Suzuki.

Page 90: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

69

Figura 15. Comparação entre o T0 e a amostra após a reação de síntese assimétrica de 3c.

A reação em batelada também foi realizada. Nesse caso utilizando a enzima

selvagem imobilizada em Ezig2TM

e a variante 4CHI_I145A imobilizada no mesmo

suporte.

Tabela 15. Comparação entre a síntese da 1-(6-fenil-3-piridinil)etilamina (3c) e 1-(4-bifenilil)etilamina (1c) em batelada.

Entrada Produto Biocatalisador Conversão (%) 1 3c 4CHI_E2 64,5

2 1c 4CHI_E2 59,7

3 3c 4CHI_I145A_E2 54,8

4 1c 4CHI_I145A_E2 47,3

Condições: biaril cetona (1 mmol L-1), isopropilamina (750 mmol L-1), PLP (0,1 mmol L-1), DMF (25% v/v)

e 10 mg da enzima imobilizada, ou 3 mg de enzima liofilizada, em tampão NaHCO3 (10 mmol L-1, pH 9)

a 30 ºC por 24 h. Conversões analisadas por CG-EM.

Como podemos observar na tabela 14, comparando com a síntese assimétrica

de 1c, em batelada, a diferença de atividade relativa a presença do nitrogênio no anel

se mostra um pouco mais sutil, tanto para a enzima selvagem quando para a variante.

Page 91: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

70

4.1.5 Conclusões parciais As condições necessárias para produção de biaril aminas quirais através da

combinação da clássica reação de acoplamento de Suzuki-Miyaura e uma

transaminação catalisada por ω-transaminases foram desenvolvidas em condições

semi-contínuas e em batelada.

Na etapa de acoplamento, avaliamos diferentes bases e catalisadores de Pd.

Nas condições estudadas, os melhores resultados foram obtidos quando K2CO3 foi

utilizado como base, enquanto que as reações catalisadas por PdCl2 e Pd(OAc)2

apresentaram conversões similares. Ainda, dentre todas as soluções-tampão

avaliadas, o tampão NaHCO3 foi o único compatível com ambas as etapas do

processo. Na etapa de transaminação, as reações catalisadas pela transaminase de

A. fumigatus apresentaram os melhores resultados e, nesse caso, a hidrofobicidade

dos suportes aos quais as enzimas foram imobilizadas teve impacto significativo na

atividade enzimática, sendo maior quanto mais hidrofóbico o suporte.

Assim, 4 diferentes biaril aminas foram obtidas com conversões de 43-80% em

fluxo contínuo, dependendo da estrutura do substrato, e 23-99% em batelada,

dependendo da enzima utilizada, estrutura do substrato e forma de uso do

biocatalisador (imobilizada ou livre). De maneira geral, melhores conversões foram

alcançadas quando compostos com grupamentos na posição meta foram utilizados

em relação àqueles contendo grupamentos na posição para, provavelmente devido a

uma melhor acomodação no sítio catalítico da transaminase. Além disso, um efeito

retirador de elétrons conferido pelo nitrogênio presente no anel aromático foi indicado

como responsável pela maior conversão de compostos contendo um anel piridínico

na etapa de transaminação, embora tenham sido observadas conversões ligeiramente

menores na etapa de acoplamento para essas estruturas.

Page 92: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

71

4.2 Lipase 4.2.1 Resolução cinética enzimática da (RS)-1-feniletilamina (PEA) catalisada

por lipase usando PEG600-diéster como agente acilante em condições de fluxo contínuo. O polietilenoglicol (PEG, figura 16) tem sido extremamente utilizado e estudado

em síntese orgânica. O PEG é um polímero comercializado em um amplo espectro de

pesos moleculares (geralmente de 200 a 4000) e sua aplicação é extremamente

versátil, sendo utilizado desde suporte para imobilização de catalisadores a solvente.

Além disso, devido a sua baixa volatilidade, alta solubilidade em água e baixa

solubilidade em solventes orgânicos apolares, o PEG tem sido empregado para

auxiliar o isolamento de produtos por extração ou destilação. Nesse contexto, o PEG

se destaca por ser um polímero barato, termicamente estável, não tóxico e de fácil

recuperação. (CHANDRASEKHAR et al., 2006; CIPOLATTI et al., 2014; PAPER,

2015; PIRES et al., 2017)

Figura 16. Polietilenoglicol (PEG).

Desse modo, o PEG vem sendo utilizado em reações de resolução cinética

enzimática principalmente como suporte para o substrato, embora essas reações

geralmente sejam para resolução cinética de álcoois. (NOGAWA et al., 2006;

OKUDOMI et al., 2007; SHIMOJO et al., 2004)

Na resolução cinética de aminas quirais, a escolha do agente acilante é um

fator extremamente importante. Na resolução de álcoois, ésteres enólicos, como

acetato de vinila, são os mais utilizados. Isso porque o enol formado na reação

tautomeriza, formando acetaldeído, mantendo o sentido da reação direcionado para

formação do produto e evitando uma eventual inibição pelo produto. Entretanto,

Page 93: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

72

devido a alta nucleofilicidade de aminas, a reação não enzimática com o agente

acilante pode ocorrer, comprometendo a pureza enantiomérica do produto (HARA et

al., 2013; WEBER et al., 1999). Assim, ésteres não ativados, como acetato de etila,

podem ser utilizados, mas frequentemente conduzem a baixos rendimentos.

Anidridos de ácidos carboxílicos também são comumente utilizados como doadores

de acila. Em trabalho anteriores, diferentes anidridos foram utilizados e levaram a

desativação da lipase utilizada ao serem hidrolisados pela água da preparação

enzimática, diminuindo a quantidade de água disponível no meio, essencial para a

atividade enzimática. (BORNSCHEUER; KAZLAUSKAS, 2006).

Por outro lado, o polietilenoglicol é um polímero de fácil acesso e pode funcionar

como agente acilante na resolução cinética de aminas quirais. Além disso, o PEG

funciona como um doador de acila bivalente, uma vez que pode reagir com o substrato

nas duas extremidades.

Assim, utilizamos o PEG600-diéster como agente acilante para a reação de

resolução cinética da (RS)-1-feniletilamina catalisada pela Novozyme 435 em

condições de fluxo contínuo (esquema 27). Essa parte do trabalho foi realizada na

Universidade de Lisboa, sob co-orientação do Prof. Dr. Carlos A. M. Afonso.

Esquema 27. Resolução cinética da 1-feniletilamina usando PEG600 diéster como agente acilante

Devido a viscosidade do PEG, tolueno foi utilizado como solvente. Assim,

prosseguimos nossos experimentos com a lipase de Candida antactica B imobilizada

em resina acrílica (Novozyme 435; N435) que já é extensamente estudada na

literatura e reconhecida como um biocatalisador termoestável e eficiente.

Page 94: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

73

Para a reação em fluxo contínuo, uma bomba de seringa modelo NE-1000, da

New Era Pump SystemsInc., foi utilizada. O reator de leito fixo possuía um volume

interno de 830 μL e foi preenchido com 303 mg do biocatalisador. Assim, o meio

reacional contendo a (RS)-PEA e o agente acilante PEG600-diéster foram bombeados

para dentro do reator a uma temperatura de 70ºC.

Em nossos testes iniciais, um tempo de residência de 30 min foi suficiente para

converter praticamente todo o enantiômero (R). Assim, segundo análise em GC

equipado com coluna quiral, o enantiômero de configuração (S), que não interagiu

com a enzima, foi recuperado o excesso enantiomérico >99% (figura 17). Além disso,

o rendimento foi de 49%. Assim, em termos de produtividade para esse enantiômero,

foi possível produzir 6,69×10-3

mmol /min×gN435.

Figura 17. Cromatograma da amina extraída após resolução cinética em fluxo contínuo.

A estabilidade do biocatalisador também foi testada (tabela 16). Para isso

alíquotas foram retiradas a cada 5 ciclos de reação (150 min). O experimento mostrou

que a enzima foi capaz de preservar a atividade por pelo menos 40 ciclos de reação

(20 h).

NH2

27.15

21.72

16.28

10.85

-0.020.00 9.10 18.20 27.30 36.40 45.50

(mVolt)

Tempo (min)

NH2

Page 95: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

74

Tabela 16. Estabilidade do biocatalisador após 40 ciclos de reação

Entrada Ciclos ee de (S)-1 (%)a

1 5 98

2 10 98

3 15 99

4 20 >99

5 25 >99

6 30 >99

7 35 >99

8 40 >99

Condições: (RS)-PEA (1, 150 mmol L-1); PEG600-diéster (150 mmol L-1) em tolueno a 70 ºC. Reator de leito fixo preenchido com 303 mg de N435. Tr = 30 min. aDeterminado com CG-DIC equipado com coluna quiral.

Comparativamente, Päiviö et al. (2012) resolveram cineticamente diversas

aminas quirais em um sistema livre de solvente. Os biocatalisadores Novozyme 435

e CAL-B imobilizada pelo método sol-gel foram utilizados. Em testes de reuso,

utilizando a 1-feniletilamina, como substrato, e o metoxiacetato de isopropila, como

agente acilante, os biocatalisadores foram reutilizados por 5 ciclos, sendo cada ciclo

o tempo necessário para atingir 50% de conversão (6h). Entretanto, houve perda

significativa da atividade a partir do segundo ciclo para ambos os catalisadores. Em

outro trabalho, quando acetato de etila foi utilizado como agente acilante, para a

mesma concentração de substrato, a conversão foi de 46%. Todavia, nesse mesmo

trabalho, a concentração do substrato foi aumentada para 900min, diminuindo a

conversão para 42%, mas aumentando a produção da amida em 11 vezes. A enzima

pôde ser utilizada por 9 h sem perda da atividade (DE MIRANDA et al., 2013).

4.2.2 Avaliação de metodologias para a recuperação da (R)-1-feniletilamina; Com o objetivo de recuperar a amina de configuração (R) que reagiu com o PEG,

diferentes metodologias foram testadas em batelada: A hidrólise da amida catalisada

por N435 (figura 18.a), a etanólise em etapa única e em múltiplas etapas catalisada

por N435 na presença e ausência de solvente (Figura 18.b) e a clássica hidrólise

catalisada por ácido (figura 18.c).

Page 96: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

75

Figura 18. Métodos para a recuperação da amina de configuração (R) a partir do produto da reação entre a amina e o PEG.

Assim, nossa primeira tentativa de recuperação da amina foi a hidrólise

utilizando o biocatalisador N435. Esse método é interessante pois utiliza o mesmo

catalisador da etapa de resolução cinética. Além disso, ter um catalisador heterogêneo

nos permitiria executar essa etapa também em fluxo contínuo. Assim, o biocatalisador

foi deixado para reagir com o substrato por 72 h sob agitação magnética a 50 ºC.

Figura 19. Cromatograma após a tentativa de hidrólise catalisada por Novozyme 435 mostrando os dois picos referentes a (RS)-1-feniletilamina.

NH2

0.00 9.10 18.20 27.30 36.40 45.50

Tempo (min)

NH2

Page 97: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

76

Infelizmente, como é possível notar na figura 19, dois picos foram observados,

provavelmente resíduos da (RS)-1-feniletilamina da etapa anterior. Sendo assim,

nenhuma amina foi recuperada utilizando esse método.

Outra abordagem testada foi a etanólise catalisada pela Novozyme 435. Para

isso, 239 mg de (R)-1, 3 equiv. de etanol 96% (v/v) e 10% (p/p) do biocatalisador N435

foram agitados a 30 ºC sem adição de qualquer solvente. Após 96 h de reação, nenhu-

ma amina foi recuperada.

Assim, imaginamos que a quantidade de etanol poderia estar sendo danosa

para a enzima (HERNÁNDEZ-MARTÍN; OTERO, 2008). Desse modo, baseado no

trabalho de Rodrigues et al. (2010), avaliamos a etanólise em duas etapas. As

condições foram as mesmas aplicadas anteriormente, mas dessa vez 1/3 do etanol

foi adicionado no início da reação e 2/3 após 6 h de reação. A reação foi mantida por

96 h e o uso de tolueno como solvente também foi avaliado. Infelizmente, nenhuma

amina foi recuperada. A figura 48 mostra o cromatograma obtido, no qual só se

observou picos referente a (RS)-1-feniletilamina proveniente de contaminação.

Figura 20. Cromatograma após reação de etanólise em duas etapas catalisada por N435 em tolueno.

NH2

0.00 9.10 18.20 27.30 36.40 45.50

Tempo (min)

NH2

Page 98: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

77

Apesar de nossos esforços, como dito anteriormente, lipases dificilmente

catalisam a quebra de ligações amida. Syrén et al. (2011) propuseram que isso

acontece porque lipases/esterases carecem de uma ligação de hidrogênio, existente

em amidases/proteases, entre o nitrogênio do substrato e a enzima, responsável pela

estabilização no estado de transição. Ainda que algumas lipases, como a CAL-A e

CAL-B, possam catalisar a hidrólise/etanólise de amidas, a reação pode durar

semanas.

Finalmente, nossa última abordagem para a recuperação da amina foi uma

clássica hidrólise catalisada por solução ácida (esquema 28). Assim, após a reação

de resolução cinética em fluxo contínuo, uma amostra de 4,6mL foi recolhida. A amina

de configuração (S) foi extraída e a solução remanescente evaporada sob vácuo,

revelando a amida derivada da reação com o PEG.

Esquema 28. Hidrólise da amida (R)-2 catalisada por solução ácida.

O produto da reação de resolução cinética foi adicionado a um balão contendo

uma solução 6N de HCl em metanol (50% v/v). A solução foi agitada sob refluxo a

80ºC por 16 h. Após evaporação e extração do PEG, a (R)-1-feniletilamina foi

recuperada com 65,9% de rendimento, se considerarmos apenas a (R)-1-

feniletilamina como material de partida ou 34,9%, considerando que o material de

partida era o racemato da amina. Abaixo podemos observar o cromatograma da amina

recuperada (figura 21), onde um pico menor da amina de configuração (S) também

está presente, provavelmente devido a contaminação do passo anterior. O excesso

enantiomérico nessa etapa foi de 95%.

Page 99: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

78

Figura 21. Cromatograma da amina extraída após a hidrólise com solução ácida.

Embora a hidrólise por solução ácida tenha sido eficiente na recuperação da

amina de configuração (R), esse método possui a desvantagem de também hidrolisar

o PEG de volta a sua forma diácido, impossibilitando o seu reuso para um novo ciclo

de reações. Ainda que, em testes anteriores em nosso laboratório, o PEG600-diácido

tenha funcionado como agente acilante com bons rendimentos.

Concluindo, o uso do PEG como agente acilante se mostra uma alternativa

barata, prática e eficiente para a separação dos enantiômeros de aminas racêmicas.

Aliado à tecnologia de fluxo contínuo esse método se torna ainda mais interessante.

NH2

31.30

25.00

18.69

12.39

6.08

-0.02 0.00 9.10 18.20 27.30 36.40 45.50

(mVolt)

Tempo (min)

NH2

Page 100: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

79

5 CONCLUSÕES Aqui apresentamos duas abordagens para a produção de aminas enantiome-

ricamente puras em condições de fluxo contínuo envolvendo diferentes biocata-

lisadores.

O uso de transaminase para a produção de aminas quirais ainda é

relativamente recente se comparado ao uso de outros biocatalisadores, como as

lipases. Embora ainda exista a dificuldade em encontrar transaminases com atividade

para substratos volumosos, neste trabalho, após triagem com diferentes TAs, foi

possível a obtenção de biaril aminas em condições semi-contínuas. Para isso,

desenvolvemos com sucesso as condições necessárias para que a, já clássica,

reação de acoplamento de Suzuki-Miyaura fosse compatível com a reação

biocatalisada. Além disso, descobrimos que a transaminase de A. fumigatus, bem

como a sua recém-descoberta variante, possuía atividade para biaril cetonas. Desse

modo, diferentes aminas foram produzidas, incluindo moléculas contendo piridina em

seu esqueleto.

Nas condições utilizadas para a reação de acoplamento de Suzuki-Miyaura, as

biaril cetonas precursoras foram obtidas em temperatura ambiente com catalisadores

de paládio livre de ligantes complexos. As biaril cetonas foram produzidas com

máxima conversão, com exceção para as piridinas que tiveram conversões pouco

abaixo, um resultado já esperado para esse tipo de molécula. Ainda, as reações de

transaminação foram realizadas em fluxo contínuo obtendo excelentes resultados.

Nas reações de resolução cinética catalisada por lipase em fluxo contínuo,

utilizamos o PEG600-diéster como agente acilante. Essa metodologia se mostrou

eficaz para separação de enantiômeros. O PEG é um composto barato e já

amplamente utilizado em síntese orgânica. Assim, neste trabalho, apresentamos pela

primeira vez o uso do PEG para a separação dos enantiômeros da (RS)-1-

feniletilamina.

Devido à forte ligação amida formada na etapa de acilação biocatalisada, uma

catálise ácida foi utilizada para recuperação do enantiômero (R) ligado ao PEG. Em

Page 101: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

80

ambas as etapas, os enantiômeros foram recuperados com excelentes rendimentos e

pureza enantiomérica.

Page 102: JONATHAN FARIAS BASSUT SOUZA ROTAS …

81

6 REFERÊNCIAS ABUDU REXIT, A.; LUO, S.; MAILIKEZATI, M. Chiral phosphoric acid-catalyzed

enantioselective reductive amination of 2-pyridyl ketones: Construction of Structurally

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ANEXOS

Cromatogramas obtidos por GC-MS A. Resolução cinética catalisada por transaminases do Kit ATA-ECS

Figura A1. Cromatograma da reação de resolução cinética da 1-feniletilamina catalisada pela enzima recombinante de E. coli. Tempo de residência – 5,5 min (1-feniletilamina); 5,7 min (acetofenona).

Figura A2. Cromatograma do controle negativo (branco) da reação de resolução cinética da 1-feniletilamina na ausência de enzima. Tempo de residência – 5,5 min (1-feniletilamina); 5,7 min (acetofenona).

Figura A3. Cromatograma da reação de resolução cinética da 1-feniletilamina catalisada pela enzima ECS-ATA01.Tempo de residência – 5,5 min (1-feniletilamina); 5,7 min (acetofenona).

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Figura A4. Cromatograma da reação de resolução cinética da 1-feniletilamina catalisada pela enzima ECS-ATA02.Tempo de residência – 5,5 min (1-feniletilamina); 5,7 min (acetofenona).

Figura A5. Cromatograma da reação de resolução cinética da 1-feniletilamina catalisada pela enzima ECS-ATA03.Tempo de residência – 5,5 min (1-feniletilamina); 5,7 min (acetofenona).

Figura A6. Cromatograma da reação de resolução cinética da 1-feniletilamina catalisada pela enzimaECS-ATA04.Tempo de residência – 5,5 min (1-feniletilamina); 5,7 min (acetofenona).

Figura A7. Cromatograma da reação de resolução cinética da 1-feniletilamina catalisada pela enzima

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ECS-ATA05.Tempo de residência – 5,5 min (1-feniletilamina); 5,7 min (acetofenona).

Figura A8. Cromatograma da reação de resolução cinética da 1-feniletilamina catalisada pela enzima ECS-ATA06.Tempo de residência – 5,5 min (1-feniletilamina); 5,7 min (acetofenona).

Figura A9. Cromatograma da reação de resolução cinética da 1-feniletilamina catalisada pela enzima ECS-ATA07.Tempo de residência – 5,5 min (1-feniletilamina); 5,7 min (acetofenona).

B. Síntese assimétrica da 1-feniletilamina catalisada por transaminases do Kit ATA-ECS utilizando isopropilamina como doador amino.

Figura B1. Cromatograma da reação de síntese assimétrica da 1-feniletilamina catalisada pela enzima recombinante de E. coli utilizando isopropilamina como doador amino. Tempo de residência – 5,5 min

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(1-feniletilamina); 5,7 min (acetofenona).

Figura B2. Cromatograma do controle negativo (branco) da reação de síntese assimétrica da 1-feniletilamina na ausência de enzima utilizando isopropilamina como doador amino. Tempo de residência –5,7 min (acetofenona).

Figura B3. Cromatograma da reação de síntese assimétrica da 1-feniletilamina catalisada pela enzima ECS-ATA01 utilizando isopropilamina como doador amino. Tempo de residência –5,7 min (acetofenona).

Figura B4. Cromatograma da reação de síntese assimétrica da 1-feniletilamina catalisada pela enzima ECS-ATA02 utilizando isopropilamina como doador amino. Tempo de residência –5,7 min

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(acetofenona).

Figura B5. Cromatograma da reação de síntese assimétrica da 1-feniletilamina catalisada pela enzima ECS-ATA03 utilizando isopropilamina como doador amino. Tempo de residência –5,7 min (acetofenona).

Figura B6. Cromatograma da reação de síntese assimétrica da 1-feniletilamina catalisada pela enzima ECS-ATA04 utilizando isopropilamina como doador amino. Tempo de residência –5,7 min (acetofenona).

Figura B7. Cromatograma da reação de síntese assimétrica da 1-feniletilamina catalisada pela enzima ECS-ATA05 utilizando isopropilamina como doador amino. Tempo de residência –5,7 min

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(acetofenona).

Figura B8. Cromatograma da reação de síntese assimétrica da 1-feniletilamina catalisada pela enzima ECS-ATA06 utilizando isopropilamina como doador amino. Tempo de residência –5,7 min (acetofenona).

Figura B9. Cromatograma da reação de síntese assimétrica da 1-feniletilamina catalisada pela enzimaECS-ATA01 utilizando isopropilamina como doador amino. Tempo de residência – 5,5 min (1-feniletilamina); 5,7 min (acetofenona).

C. Síntese assimétrica da 1-feniletilamina catalisada por transaminases do Kit ATA-ECS.

Figura C1. Cromatograma da reação de síntese assimétrica da 1-feniletilamina catalisada pela enzima recombinante de E. coli utilizando um sistema de deslocamento de equilíbrio LDH/GDH. Tempo de

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residência – 5,65 min (1-feniletanol); 5,7 min (acetofenona).

Figura C2. Cromatograma do controle negativo (branco) da reação de síntese assimétrica da 1-feniletilamina na ausência de enzima utilizando um sistema de deslocamento de equilíbrio LDH/GDH. Tempo de residência –5,7 min (acetofenona).

Figura C3. Cromatograma da reação de síntese assimétrica da 1-feniletilamina catalisada pela enzima ECS-ATA01 utilizando um sistema de deslocamento de equilíbrio LDH/GDH. Tempo de residência –5,7 min (acetofenona).

Figura C4. Cromatograma da reação de síntese assimétrica da 1-feniletilamina catalisada pela enzima ECS-ATA02 utilizando um sistema de deslocamento de equilíbrio LDH/GDH. Tempo de residência –

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5,7 min (acetofenona).

Figura C5. Cromatograma da reação de síntese assimétrica da 1-feniletilamina catalisada pela enzima ECS-ATA03 utilizando um sistema de deslocamento de equilíbrio LDH/GDH. Tempo de residência – 5,65 min (1-feniletanol); 5,7 min (acetofenona).

Figura C6. Cromatograma da reação de síntese assimétrica da 1-feniletilamina catalisada pela enzima ECS-ATA04 utilizando um sistema de deslocamento de equilíbrio LDH/GDH. Tempo de residência – 5,65 min (1-feniletanol); 5,7 min (acetofenona).

Figura C7. Cromatograma da reação de síntese assimétrica da 1-feniletilamina catalisada pela enzima ECS-ATA05 um sistema de deslocamento de equilíbrio LDH/GDH. Tempo de residência – 5,65 min (1-

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feniletanol); 5,7 min (acetofenona).

Figura C8. Cromatograma da reação de síntese assimétrica da 1-feniletilamina catalisada pela enzima ECS-ATA06 um sistema de deslocamento de equilíbrio LDH/GDH. Tempo de residência –5,7 min (acetofenona).

Figura C9. Cromatograma da reação de síntese assimétrica da 1-feniletilamina catalisada pela enzima ECS-ATA07 utilizando um sistema de deslocamento de equilíbrio LDH/GDH. Tempo de residência – 5,65 min (1-feniletanol); 5,7 min (acetofenona).

Estudos de diferentes bases e catalisadores de paládio na reação de acoplamento de Suzuki-Miyaura

Figura D1. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por cloreto de paládio em meio 1:1 DMF/água utilizando trietilamina como base. Tempo de residência dos picos identificados: 7,2 min (4’bromoacetofenona); 7,6 min (bifenila); 9,8 min

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(4’fenilacetofenona).

Figura D2. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por cloreto de paládio em meio 1:1 DMF/água utilizando carbonato de potássio como base. Tempo de residência: 7,2 min (4’bromoacetofenona); 7,6 min (bifenila); 9,8 min (4’fenilacetofenona).

Figura D2. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por cloreto de paládio em meio 1:1 DMF/água utilizando trietilamina como base. Tempo de residência: 7,2 min (4’bromoacetofenona); 7,6 min (bifenila); 9,8 min (4’fenilacetofenona).

Figura D3. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por acetato de paládio em meio 1:1 DMF/água utilizando carbonato de potássio como base. Tempo de residência dos picos identificados: 7,2 min (4’bromoacetofenona); 7,6 min

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(bifenila); 9,8 min (4’fenilacetofenona).

Figura D4. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por acetato de paládio em meio 1:1 DMF/água utilizando trietilamina como base. Tempo de residência dos picos identificados: 7,2 min (4’bromoacetofenona); 7,6 min (bifenila); 9,8 min (4’fenilacetofenona).

Figura D5. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por paládio suportado em sulfato de bário em meio 1:1 DMF/água utilizando carbonato de potássio como base. Tempo de residência dos picos identificados: 7,2 min (4’bromoacetofenona);

Figura D6. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por paládio suportado em sulfato de bário em meio 1:1 DMF/água utilizando trietilamina como base. Tempo de residência dos picos identificados: 7,2 min (4’bromoacetofenona);

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112

D. Avaliação de diferentes soluções-tampão na reação de acoplamento de Suzuki-Miyaura em batelada.

Figura E1. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por acetato de paládio em meio 1:1 DMF/Tampão HEPES (50mM, pH8).Tempo de residência dos picos identificados: 7,2 min (4’bromoacetofenona); 7,6 min (bifenila);

Figura E2. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por acetato de paládio em meio 1:1 DMF/Tampão HEPES (25mM, pH8).Tempo de residência dos picos identificados: 7,2 min (4’bromoacetofenona); 7,6 min (bifenila);

Figura E3. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por acetato de paládio em meio 1:1 DMF/Tampão HEPES (12,5mM, pH8).Tempo de residência dos picos identificados: 7,2 min (4’bromoacetofenona); 7,6 min (bifenila);

Figura E4. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por acetato de paládio em meio 1:1 DMF/Tampão CHES (50mM, pH9).Tempo

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de residência dos picos identificados: 7,2 min (4’bromoacetofenona); 7,6 min (bifenila);

Figura E5. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por acetato de paládio em meio 1:1 DMF/Tampão CHES (25mM, pH9).Tempo de residência dos picos identificados:7,2 min (4’bromoacetofenona); 7,6 min (bifenila); 9,8 min (4’fenilacetofenona).

Figura E6. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por acetato de paládio em meio 1:1 DMF/Tampão CHES (12,5mM, pH9).Tempo de residência dos picos identificados: 7,2 min (4’bromoacetofenona); 7,6 min (bifenila);

Figura E7. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por acetato de paládio em meio 1:1 DMF/Tampão Na2PO4 (100mM, pH7,5).(método alterado) Tempo de residência dos picos identificados: 6,1 min (4’bromoacetofenona);

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6,6min (bifenila);

Figura E8. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por acetato de paládio em meio 1:1 DMF/Tampão NaHCO3 (25mM, pH9).(método alterado) Tempo de residência dos picos identificados: 6,6 min (bifenila); 9, min (4’fenilacetofenona).

Figura E9. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por cloreto de paládio em meio 1:1 DMF/Tampão HEPES (50mM, pH8).Tempo de residência dos picos identificados: 7,2 min (4’bromoacetofenona); 7,6 min (bifenila);

Figura E10. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por cloreto de paládio em meio 1:1 DMF/Tampão HEPES (25mM, pH8).Tempo de residência dos picos identificados: 7,2 min (4’bromoacetofenona);

Figura E11. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por cloreto de paládio em meio 1:1 DMF/Tampão HEPES (12,5mM,

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pH8).Tempo de residência dos picos identificados: 7,2 min (4’bromoacetofenona);

Figura E12. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por cloreto de paládio em meio 1:1 DMF/Tampão CHES (50mM, pH9).Tempo de residência dos picos identificados: 7,2 min (4’bromoacetofenona); 7,6 min (bifenila);

Figura E13. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por cloreto de paládio em meio 1:1 DMF/Tampão CHES (25mM, pH9).Tempo de residência dos picos identificados: 7,2 min (4’bromoacetofenona); 7,6 min (bifenila);

Figura E14. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por cloreto de paládio em meio 1:1 DMF/Tampão CHES (12,5mM, pH9).Tempo de residência dos picos identificados: 7,2 min (4’bromoacetofenona);

Figura E15. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por cloreto de paládio em meio 1:1 DMF/Tampão Na2PO4 (100mM, pH7,5).(método alterado) Tempo de residência dos picos identificados: 6,1 min (4’bromoacetofenona);

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6,6min (bifenila);

Figura E16. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por cloreto de paládio em meio 1:1 DMF/Tampão NaHCO3 (25mM, pH9).(método alterado)Tempo de residência dos picos identificados:); 6,6 min (bifenila); 9,6 min (4’fenilacetofenona).

E. Estudos de diferentes concentrações de DMF na reação de acoplamento de Suzuki-Miyaura.

Figura F1. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por acetato de paládio em meio 10% DMF/TampãoNaHCO3 (25mM, pH9).Tempo de residência dos picos identificados: 9,8 min (4’fenilacetofenona).

Figura F2. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por acetato de paládio em meio 20% DMF/Tampão NaHCO3 (25mM,

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pH9).Tempo de residência dos picos identificados: 9,8 min (4’fenilacetofenona).

Figura F3. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por acetato de paládio em meio 30% DMF/Tampão NaHCO3 (25mM, pH9).Tempo de residência dos picos identificados: 9,8 min (4’fenilacetofenona).

Figura F4. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por acetato de paládio em meio 40% DMF/Tampão NaHCO3 (25mM, pH9).Tempo de residência dos picos identificados: 9,8 min (4’fenilacetofenona).

Figura F5. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por acetato de paládio em meio 50% DMF/Tampão NaHCO3 (25mM,

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pH9).Tempo de residência dos picos identificados: 9,8 min (4’fenilacetofenona).

Figura F6. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por cloreto de paládio em meio 10% DMF/Tampão NaHCO3 (25mM, pH9).

Figura F7. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por cloreto de paládio em meio 20% DMF/Tampão NaHCO3 (25mM, pH9).Tempo de residência dos picos identificados: 9,8 min (4’fenilacetofenona).

Figura F8. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por cloreto de paládio em meio 30% DMF/Tampão NaHCO3 (25mM, pH9).

Figura F9. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por cloreto de paládio em meio 40% DMF/Tampão NaHCO3 (25mM,

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pH9).Tempo de residência dos picos identificados: 9,8 min (4’fenilacetofenona).

Figura F10. Cromatograma da reação de acoplamento entre a 4’-bromoacetofenona e o ácido fenilborônico catalisada por cloreto de paládio em meio 50% DMF/Tampão NaHCO3 (25mM, pH9).Tempo de residência dos picos identificados: 9,8 min (4’fenilacetofenona).

F. Síntese assimétrica utilizando substratos de interesse, em batelada, nas condições compatíveis com a reação de Suzuki.

- Síntese assimétrica partindo da 3-acetil-5-bromopiridina (2a)

Figura G1. Cromatograma do controle negativo da reação de síntese assimétrica partindo da3-acetil-5-bromopiridina (2a) na ausência de enzima utilizando(RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 8,2 min (3-acetil-5-bromopiridina).

Figura G2. Cromatograma da reação de síntese assimétrica partindo da 3-acetil-5-bromopiridina (2a) catalisada pela enzima livre de V. fluvialis utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo

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de residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 8,2 min (3-acetil-5-bromopiridina).

Figura G3. Cromatograma da reação de síntese assimétrica partindo da 3-acetil-5-bromopiridina (2a) catalisada pelo biocatalisador 4CHI_E1 utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 4,1 min (acetofenona); 8,2 min (3-acetil-5-bromopiridina); 9,3 min (1-(5-bromo-3-piridinil)etilamina).

Figura G4. Cromatograma da reação de síntese assimétrica partindo da 3-acetil-5-bromopiridina (2a) catalisada pelo biocatalisador 4CHI_E2 utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 4,1 min (acetofenona); 8,2 min (3-acetil-5-bromopiridina); 9,3 min (1-(5-bromo-3-piridinil)etilamina).

Figura G5. Cromatograma da reação de síntese assimétrica partindo da 3-acetil-5-bromopiridina (2a) catalisada pelo biocatalisador CVi_E3 utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de

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residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 8,2 min (3-acetil-5-bromopiridina).

Figura G6. Cromatograma da reação de síntese assimétrica partindo da 3-acetil-5-bromopiridina (2a) catalisada pelo biocatalisador 3HMU_E1 utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 8,2 min (3-acetil-5-bromopiridina).

- Síntese assimétrica partindo da 3-acetil-6-bromopiridina (3a)

Figura G7. Cromatograma do controle negativo da reação de síntese assimétrica da 3-acetil-6-bromopiridina (3a) na ausência de enzima utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 9 min (3-acetil-6-bromopiridina).

Figura G8. Cromatograma da reação de síntese assimétrica da 3-acetil-6-bromopiridina (3a) catalisada pela enzima livre de V. fluvialis utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de

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residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 9 min (3-acetil-6-bromopiridina).

Figura G9. Cromatograma da reação de síntese assimétrica da 3-acetil-6-bromopiridina (3a) catalisada pelo biocatalisador 4CHI_E1 utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 9 min (3-acetil-6-bromopiridina).

Figura G10. Cromatograma da reação de síntese assimétrica da 3-acetil-6-bromopiridina (3a) catalisada pelo biocatalisador 4CHI_E2 utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 4,1 min (acetofenona); 9 min (3-acetil-6-bromopiridina); 10,1 min (1-(6-bromo-3-piridinil)etilamina).

Figura G11. Cromatograma da reação de síntese assimétrica da 3-acetil-6-bromopiridina (3a) catalisada pelo biocatalisador CVi_E3 utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de

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residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 9 min (3-acetil-6-bromopiridina).

Figura G12. Cromatograma da reação de síntese assimétrica da 3-acetil-6-bromopiridina (3a) catalisada pelo biocatalisador 3HMU_E1 utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 9 min (3-acetil-6-bromopiridina).

- Síntese assimétrica partindo da 4-(3-bromofenil)-2-butanona (4a)

Figura G13. Cromatograma do controle negativo da reação de síntese assimétrica partindo da 4-(3-bromofenil)-2-butanona (4a) na ausência de enzima utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 11,1 min (4-(3-bromofenil)-2-butanona).

Figura G14. Cromatograma da reação de síntese assimétrica partindo da 4-(3-bromofenil)-2-butanona (4a) catalisada pela enzima livre de V. fluvialis utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 11,1 min (4-(3-bromofenil)-2-

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butanona).

Figura G15. Cromatograma da reação de síntese assimétrica partindo da 4-(3-bromofenil)-2-butanona (4a) catalisada pelo biocatalisador 4CHI_E1 utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de residência dos picos identificados:3,9 min (1-feniletilamina); 4,1 min (acetofenona), 11,1 min (4-(3-bromofenil)-2-butanona) 11,3 min (4-(3-bromofenil)-2-butilamina.

Figura G16. Cromatograma da reação de síntese assimétrica partindo da 4-(3-bromofenil)-2-butanona (4a) catalisada pelo biocatalisador 4CHI_E2 utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de residência dos picos identificados:3,9 min (1-feniletilamina); 4,1 min (acetofenona), 11,1 min (4-(3-bromofenil)-2-butanona) 11,3 min (4-(3-bromofenil)-2-butilamina.

Figura G17. Cromatograma da reação de síntese assimétrica partindo da 4-(3-bromofenil)-2-butanona (4a) catalisada pelo biocatalisador 4CHI_E3 utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 4,1 min (acetofenona), 11,1 min (4-(3-bromofenil)-2-butanona) 11,3 min (4-(3-bromofenil)-2-butilamina.

Figura G18. Cromatograma da reação de síntese assimétrica partindo da 4-(3-bromofenil)-2-butanona (4a) catalisada pelo biocatalisador 4CHI_CHI utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino.

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Tempo de residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 11,1 min (4-(3-bromofenil)-2-butanona).

Figura G19. Cromatograma da reação de síntese assimétrica da 3-acetil-5-bromopiridina (2a) catalisada pelo biocatalisador CVi_E2 utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 11,1 min (4-(3-bromofenil)-2-butanona).

Figura G20. Cromatograma da reação de síntese assimétrica partindo da 4-(3-bromofenil)-2-butanona (4a) catalisada pelo biocatalisador CVi_E3 utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 11,1 min (4-(3-bromofenil)-2-butanona).

Figura G21. Cromatograma da reação de síntese assimétrica partindo da 4-(3-bromofenil)-2-butanona (4a) catalisada pelo biocatalisador CVi_CHI utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 11,1 min (4-(3-bromofenil)-2-butanona).

Figura G22. Cromatograma da reação de síntese assimétrica partindo da 4-(3-bromofenil)-2-butanona (4a) catalisada pelo biocatalisador 3HMU_E1 utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 11,1 min (4-(3-bromofenil)-2-

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butanona).

- Síntese assimétrica partindo 4-(4-bromofenil)-2-butanona (5a)

Figura G23. Cromatograma do controle negativo da reação de síntese assimétrica partindo da 4-(4-bromofenil)-2-butanona (5a) na ausência de enzima utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 11,1 min (4-(4-bromofenil)-2-butanona).

Figura G24. Cromatograma da reação de síntese assimétrica partindo da 4-(4-bromofenil)-2-butanona (5a) catalisada pela enzima livre de V. fluvialis utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 11,1 min (4-(4-bromofenil)-2-butanona).

Figura G25. Cromatograma da reação de síntese assimétrica partindo da 4-(4-bromofenil)-2-butanona (5a) catalisada pelo biocatalisador 4CHI_E1 utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 11,1 min (4-(4-bromofenil)-2-

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butanona).

Figura G26. Cromatograma da reação de síntese assimétrica partindo da 4-(4-bromofenil)-2-butanona (5a) catalisada pelo biocatalisador 4CHI_E2 utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de residência dos picos identificados:3,9 min (1-feniletilamina); 4,1 min (acetofenona), 11,1 min (4-(3-bromofenil)-2-butanona) 11,3 min (4-(4-bromofenil)-2-butilamina.

Figura G27. Cromatograma da reação de síntese assimétrica partindo da 4-(4-bromofenil)-2-butanona (5a) catalisada pelo biocatalisador 4CHI_E3 utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 4,1 min (acetofenona), 11,1 min (4-(4-bromofenil)-2-butanona) 11,3 min (4-(4-bromofenil)-2-butilamina.

Figura G28. Cromatograma da reação de síntese assimétrica partindo da 4-(4-bromofenil)-2-butanona (5a) catalisada pelo biocatalisador 4CHI_CHI utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 11,1 min (4-(4-bromofenil)-2-butanona).

Figura G29. Cromatograma da reação de síntese assimétrica partindo da 4-(4-bromofenil)-2-butanona (5a) catalisada pelo biocatalisador CVi_E2 utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo

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de residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 11,1 min (4-(4-bromofenil)-2-butanona).

Figura G30. Cromatograma da reação de síntese assimétrica partindo da 4-(4-bromofenil)-2-butanona (5a) catalisada pelo biocatalisador CVi_E3 utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 11,1 min (4-(4-bromofenil)-2-butanona).

Figura G31. Cromatograma da reação de síntese assimétrica partindo da 4-(4-bromofenil)-2-butanona (5a) catalisada pelo biocatalisador CVi_CHI utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 11,1 min (4-(4-bromofenil)-2-butanona).

Figura G32. Cromatograma da reação de síntese assimétrica partindo da 4-(4-bromofenil)-2-butanona (5a) catalisada pelo biocatalisador 3HMU_E1 utilizando (RS)-1-feniletilamina como doador amino. Tempo de residência dos picos identificados: 3,9 min (1-feniletilamina); 11,1 min (4-(4-bromofenil)-2-butanona).

G. Síntese de biaril aminas por reação de acoplamento de Suzuki-Miyaura e transaminação biocatalisada em regime semi-contínuo

Figura H1. Comparação entre os cromato gramas da reação de síntese da 1-(4-bifenilil)etilamina em

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fluxo contínuo. Em preto, a reação no tempo 0. Em rosa, amostra obtida após 3 h de tempo de residência.

Figura H2. Comparação entre os cromato gramas da reação de síntese da 1-(4’fluoro-4-bifenilil)etilamina em fluxo contínuo. Em preto, a reação no tempo 0. Em rosa, amostra obtida após 3 h de tempo de residência.

Figura H3. Comparação entre os cromatograma da reação de síntese da 1-(6-fenil-3-piridinil)etilamina em fluxo contínuo. Em preto, a reação no tempo 0. Em rosa, amostra obtida após 3 h de tempo de residência.

Figura H4. Comparação entre os cromato gramas da reação de síntese da 1-(5-fenil-3-piridinil)etilamina em fluxo contínuo.

H. Resolução cinética catalisada pela lipase de Candida antactica B imobilizada em resina acrílica (N435).

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Figura I1. Cromatograma do primeiro ciclo da reação de resolução cinética da (RS)-1-feniletilamina usando PEG600 diéster como agente acilante em fluxo contínuo.

Figura I2. Cromatograma da reação de resolução cinética da (RS)-1-feniletilamina usando PEG600 diéster como agente acilante em fluxo contínuo. Ciclo 10.

Figura I3. Cromatograma da reação de resolução cinética da (RS)-1-feniletilamina usando PEG600 diéster como agente acilante em fluxo contínuo. Ciclo 15.

Figura I4. Cromatograma da reação de resolução cinética da (RS)-1-feniletilamina usando PEG600

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diéster como agente acilante em fluxo contínuo. Ciclo 20.

Figura I5. Cromatograma da reação de resolução cinética da (RS)-1-feniletilamina usando PEG600 diéster como agente acilante em fluxo contínuo. Ciclo 30.

Figura I6. Cromatograma da reação de resolução cinética da (RS)-1-feniletilamina usando PEG600 diéster como agente acilante em fluxo contínuo. Ciclo 35.

Figura I7. Cromatograma da reação de resolução cinética da (RS)-1-feniletilamina usando PEG600 diéster como agente acilante em fluxo contínuo. Ciclo 40.

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Espectro de massas obtidos em GC-MS

Figura J1. Espectro de massas da 1-feniletilamina.

Figura J2. Espectro de massas da acetofenona.

Figura J3. Espectro de massas da 4’-bromoacetofenona

Figura J4. Espectro de massas da 4’-fenilacetofenona

Figura J5. Espectro de massas da 2a

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Figura J6. Espectro de massas da 3a

Figura J7. Espectro de massas da 4a

Figura J8. Espectro de massas da 5a

Figura J9. Espectro de massas da 2b

Figura J10. Espectro de massas da 3b

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Figura J11. Espectro de massas dam-3b

Figura J12. Espectro de massas da p-3b

Figura J13. Espectro de massas da 1-(4-bifenilil)etilamina derivatizada.

Figura J14. Espectro de massas da1-(4’-fluoro-4-bifenilil)etilamina derivatizada.

Figura J15. Espectro de massas da 1-(6-fenil-3-piridinil)etilamina derivatizada.

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Figura J16. Espectro de massas da 1-(5-fenil-3-piridinil)etilamina derivatizado

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CROMATOGRAMAS CG-DIC

Figura K1. Cromatograma dos padrões (R)-1-feniletilamina e acetofenona. Tempo de residência – 14,6 min (1-feniletilamina derivatizada) e 5,3 (acetofenona).

Figura K2. Cromatograma do controle negativo (branco) da reação de resolução cinética da 1-feniletilamina na ausência de enzima. Tempo de residência – 14,6 min ((R)-1-feniletilamina) e 14,9 min

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((S)-1-feniletilamina).

Figura K3. Cromatograma da reação de resolução cinética da 1-feniletilamina catalisada pela enzima ECS-ATA01. Tempo de residência dos picos identificados – 5,3 (acetofenona)e 14,9 min ((S)-1-feniletilamina).

Figura K4. Cromatograma da reação de resolução cinética da 1-feniletilamina catalisada pela enzima ECS-ATA02.Tempo de residência dos picos identificados – 5,3 (acetofenona)e 14,9 min ((S)-1-feniletilamina).

Figura K5. Cromatograma da reação de resolução cinética da 1-feniletilamina catalisada pela enzima ECS-ATA03.Tempo de residência dos picos identificados – 5,3 (acetofenona)e 14,9 min ((S)-1-

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feniletilamina).

Figura K6. Cromatograma da reação de resolução cinética da 1-feniletilamina catalisada pela enzima ECS-ATA04.Tempo de residência dos picos identificados – 5,3 (acetofenona), 14,6 min ((R)-1-feniletilamina) e 14,9 min ((S)-1-feniletilamina).

Figura K7. Cromatograma da reação de resolução cinética da 1-feniletilamina catalisada pela enzima ECS-ATA05.Tempo de residência dos picos identificados – 5,3 (acetofenona)e 14,9 min ((S)-1-feniletilamina).

Figura K8. Cromatograma da reação de resolução cinética da 1-feniletilamina catalisada pela enzima ECS-ATA06.Tempo de residência dos picos identificados – 5,3 (acetofenona), 14,6 min ((R)-1-

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feniletilamina) e 14,9 min ((S)-1-feniletilamina).

Figura K9. Cromatograma da reação de resolução cinética da 1-feniletilamina catalisada pela enzima ECS-ATA07.Tempo de residência dos picos identificados – 5,3 (acetofenona)e 14,9 min ((S)-1-feniletilamina).

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Espectro de Ressonância Magnética Nuclear (RMN)

Figura L1. RMN C13 do PEG600-diéster

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Figura L2. RMN H1 do PEG600-diéster.

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DIREITOS AUTORAIS DE USO DE IMAGEM

Figura M1. Direito de uso de imagem para a figura 1 deste trabalho.

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Figura M2. Direito de uso de imagem para a figura 30 deste trabalho.