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II
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
INSTITUTO DE QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
JULIANA BAZZAN ARSAND
DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO DE
SCREENING POR LC-QTOF-MS E MÉTODO
QUANTITATIVO POR LC-MS/MS PARA ANÁLISE DE
ANTIBIÓTICOS DA CLASSE AMINOGLICOSÍDEOS EM
ALIMENTOS DE ORIGEM ANIMAL
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Porto Alegre, fevereiro de 2015.
II
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
INSTITUTO DE QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
JULIANA BAZZAN ARSAND
DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO DE
SCREENING POR LC-QTOF-MS E MÉTODO
QUANTITATIVO POR LC-MS/MS PARA ANÁLISE DE
ANTIBIÓTICOS DA CLASSE AMINOGLICOSÍDEOS EM
ALIMENTOS DE ORIGEM ANIMAL
Dissertação apresentada como requisito parcial
para obtenção do grau de Mestre em Química
Prof. Dra. Carla Sirtori
Orientadora
Prof. Dra. Tânia Mara Pizzolato
Co-orientadora
III
A presente dissertação foi realizada inteiramente pelo autor, exceto as
colaborações as quais serão devidamente citadas nos agradecimentos, no período
entre Março/2013 e Fevereiro/2015, no Instituto de Química da Universidade
Federal do Rio Grande do Sul e no Laboratório Nacional Agropecuário do Rio
Grande do Sul sob Orientação da Professora Doutora Carla Sirtori e co-orientação
da Professora Doutora Tânia Mara Pizzolato. A dissertação foi julgada adequada
para a obtenção do título de Mestre em Química pela seguinte banca examinadora:
Comissão Examinadora:
Dr. Rodrigo Barcellos Hoff – MAPA
Prof. Dr. João Henrique Zimnoch dos Santos – PPGQ/UFRGS
Profa. Dra. Liane Lucy de Lucca Freitas – PPGQ/UFRGS
Juliana Bazzan Arsand
IV
AGRADECIMENTOS
Agradeço à minha família por todo incentivo e apoio para minha qualificação
profissional, por todo amor, exemplo, dedicação e compreensão. Em especial aos meus
pais, que nunca mediram esforços para que еu chegasse até esta etapa da minha vida.
Agradeço às minhas orientadoras, Prof. Dra. Carla Sirtori e Prof. Dra. Tânia
Mara Pizzolato, pelo apoio e confiança durante esses anos, sempre incentivando e
orientando em busca do conhecimento científico e em minha formação como
pesquisadora e como pessoa.
Agradeço ao Dr. Rodrigo Hoff e ao Dr. Fabiano Barreto pela oportunidade de
fazer parte da equipe do Laboratório de Resíduos de Pesticidas e Medicamentos
Veterinários do LANAGRO/RS, bem como pela confiança, aprendizado, amizade e
apoio ao longo destes anos.
Agradeço à todos os meus colegas de laboratório RPM pela ajuda, incentivo,
amizade, companheirismo, pela disponibilidade constante em ajudar, pelos
ensinamentos, pelas correções e revisões de resultados, que foram essenciais para minha
formação e para o desenvolvimento deste trabalho.
Agradeço à amiga Aline Nectoux pela parceria, apoio e pelas horas de estudos
juntas.
Agradeço à CAPES pelo apoio financeiro.
V
SUMÁRIO
Índice de tabelas VIII
Índice de figuras X
Índice de anexos XI
Glossário de siglas e abreviaturas XII
Resumo XIV
Abstract XVI
1. Introdução 1
2. Objetivos 3
2.1 Objetivo geral 3
2.2 Objetivos específicos 3
3. Revisão bibliográfica 4
3.1 Contextualização 4
3.2 Legislação 5
3.3 Aminoglicosídeos 6
3.4 Preparo de amostra 10
3.5 Análise de aminoglicosídeos por cromatografia a líquido acoplada a
espectrometria de massas
11
3.5.1 Separação por cromatografia líquida 11
VI
3.5.2 Cromatografia a líquido acoplada a espectrômetro de massas
triplo quadrupolo (LC-MS/MS) – Método de quantificação
12
3.5.3 Cromatografia a líquido acoplada a espectrômetro de massas
quadrupolo-tempo de voo (LC-qTOF-MS) - Método de triagem
(Screening)
14
4. Materiais e Métodos 15
4.1 Reagentes, padrões e materiais 15
4.2 Preparo das soluções estoque, intermediária e de trabalho 16
4.3 Métodos 17
4.3.1 Análise instrumental 17
4.3.1.1 Cromatografia a líquido acoplada a espectrômetro de massas
triplo quadrupolo (LC-MS/MS)
17
4.3.1.2 Cromatografia a líquido acoplada a espectrômetro de massas
quadrupolo-tempo de voo (LC-qTOF-MS)
19
4.3.2 Avaliação da supressão iônica no LC-MS/MS com ionização
por eletrospray
19
4.3.3 Amostragem 20
4.3.4 Preparação da amostra: extração e clean up 20
4.3.5 Planejamento fatorial 21
4.3.6 Validação do método 22
VII
5. Resultados e Discussão 23
5.1 Parâmetros selecionados para análise por LC-MS/MS 23
5.2 Parâmetros selecionados para análise por LC-QTOF-MS 29
5.3 Determinação da supressão iônica no LC-MS/MS com ionização
por eletrospray
30
5.4 Preparo de amostra 32
5.4.1 Planejamento fatorial 33
5.5 Parâmetros de desempenho do método de quantificação por LC-
MS/MS
40
5.5.1 Limite de detecção e limite de quantificação 40
5.5.2 Linearidade 41
5.5.3 Especificidade 42
5.5.4 Exatidão, Precisão, Limite de Decisão (CCα) e Capacidade de
Detecção (CCβ)
42
5.5.5 Recuperação 45
5.5.6 Extensão de escopo 45
5.6 Parâmetros de desempenho do método qualitativo por LC-QTOF-
MS
48
6. Avaliação de custos 50
7. Conclusões 51
8. Referências 53
VIII
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1. Limite máximo de resíduo (LMR), estabelecidos pela Comissão
Europeia, para os aminoglicosídeos abordados neste trabalho.
6
Tabela 2. Número de formulações contendo aminoglicosídeos disponíveis no
Brasil conforme o Compêndio de Produtos Veterinários - SINDAN (CPVS).
8
Tabela 3. Formas farmacêuticas, vias de administração e períodos de carência
das formulações contendo aminoglicosídeos disponíveis no Brasil.
9
Tabela 4. Variáveis e níveis empregados no planejamento fatorial 24 com
triplicata do ponto central.
21
Tabela 5. Condições experimentais codificadas utilizadas na otimização do
processo extrativo.
22
Tabela 6. Parâmetros de ionização e do analisador utilizados por LC-MS/MS
e LC-qTOF-MS.
24
Tabela 7. Estrutura e fórmula molecular dos analitos em estudo com os
respectivos parâmetros de razão m/z utilizados na análise mediante LC-
MS/MS.
27
Tabela 8. Faixa de m/z para o espectrômetro de massas e tempo de retenção
de cada analito no LC-qTOF-MS.
29
Tabela 9. Variáveis e níveis empregados no delineamento de composto
central e condições experimentais codificadas.
35
Tabela 10. Valores de LMR e nível de validação, LOD e LOQ para cada
analito para leite e músculo bovino, suíno e de frango.
40
Tabela 11. Equações de reta e coeficiente de determinação (r²) para cada
analito em matriz leite.
42
IX
Tabela 12. Valores máximos de coeficiente de variação (CV) inter-dia e intra-
dia de acordo com a concentração teórica dos analitos determinados através
da equação de Horwitz.
43
Tabela 13. Valores determinados para a matriz leite de exatidão, CV intra-
dia, CV inter-dia, recuperação, CCα e CCβ para cada analito nos três níveis de
fortificação (50, 100 e 150 LMR) em três dias.
46
Tabela 14. Valores determinados para a matriz músculo bovino de exatidão,
CV intra-dia, CV inter-dia, recuperação, CCα e CCβ para cada analito nos três
níveis de fortificação (50, 100 e 150 LMR) em três dias.
47
Tabela 15. Valores determinados para a matriz músculo de frango e suíno de
CV, recuperação, CCα e CCβ para cada analito determinados na extensão de
escopo.
48
Tabela 16. Valores CCβ em relação ao LMR para cada analito nas matrizes
leite e músculo (bovino, suíno e de frango).
49
Tabela 17. Estimativa de custo considerando a análise de 100 amostras de
leite, comparando com método publicado por Kaufmann et al.
51
X
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Estrutura química representativa dos aminoglicosídeos. 7
Figura 2. Figura representando o esquema do modo de avaliação da
supressão iônica (circulado na figura) no sistema de LC-MS/MS.
20
Figura 3. Cromatograma dos analitos em estudo obtido no modo SRM
utilizando a coluna HILIC.
25
Figura 4. Cromatograma dos 10 analitos em solvente analisados no modo
SRM nas condições estabelecidas no LC-MS/MS.
26
Figura 5. Gráficos da supressão iônica da neomicina (NEO),
espectinomicina (SPC) e da tobramicina (TBR), comparados com o
cromatograma dos dez analitos em estudo.
31
Figura 6. Supressão iônica da diidroestreptomicina (DHSTR) em músculo
bovino, suíno e de frango.
32
Figura 7. Superfície de resposta e gráfico de contorno obtidos pelo desenho
de composto central para os analitos apramicina (APR), tobramicina (TBR)
e neomicina (NEO). Dados obtidos no software estatístico Minitab 16.
37
Figura 8. Fluxograma do preparo de amostra para a matriz leite. 39
Figura 9. Fluxograma do preparo de amostra para a matriz músculo de
bovino, suíno e frango.
39
Figura 10. Cromatograma no LC-qTOF-MS dos analitos em leite na
concentração do CCβ, considerando as faixas de massa estipuladas e seus
tempos de retenção.
50
XI
ÍNDICE DE ANEXOS
Tabela I. Condições empregadas nos diferentes métodos de extração/clean up
e técnicas cromatográficas publicadas até o presente momento para diferentes
aminoglicosídeos em matrizes de origem animal.
58
Tabela II. Condições cromatográficas avaliadas neste trabalho. 60
Figura I. Supressão iônica em solvente e em extrato branco de leite para cada
analito.
62
Figura II. Supressão iônica em solvente e em extrato branco de músculo
bovino, suíno e de frango para cada analito.
64
Tabela III. Resultados do experimento fatorial para o procedimento de
preparo da amostra para cada analito.
67
Figura III. Cromatogramas dos analitos em amostra de leite mostrando as
respectivas transições e tempos de retenção.
77
Figura IV. Curvas analíticas em matriz com desvio padrão de cada
concentração.
78
XII
GLOSSÁRIO DE SIGLAS E ABREVIATURAS
AMC: amicacina
APR: apramicina
CAD: gás de colisão
CE: energia de colisão
CUR: gás de cortina
CXP: potencial de saída da célula de colisão
DHSTP: diidroestreptomicina
DP: voltagem no orifício de entrada (declustering potential)
DTM: destomicina
EDTA: ácido etilenodiaminotetracético
EP: potencial de entrada
ESI+: eletrospray no modo positivo
FIA: análise de infusão em fluxo
GNT: gentamicina
GS1: gás da fonte 1
GS2: gás auxiliar
HGR: higromicina
HILIC: Cromatografia Líquida de Interação Hidrofílica
IS: voltagem do spray de íons
JSM: josamicina
KAS: kasugamicina
KNM: kanamicina
LANAGRO/RS: Laboratório Nacional Agropecuário do Rio Grande do Sul
LC-MS/MS: Cromatografia a líquido acoplada a Espectrometria de Massas em modo Tandem
LC-qTOF-MS: Cromatografia a líquido acoplada a Espectrometria de Massas por Tempo de Voo
LLE: extração líquido-líquido
LMR: Limite máximo de resíduo permitido
LOD: limite de detecção
LOQ: limite de quantificação
m/z: razão massa/carga
MAPA: Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
XIII
MSPD: dispersão de matriz em fase sólida
NEO: neomicina
NET: netilmicina
NFPA: ácido nonafluorpentanóico
PNCRC: Plano Nacional de Controle de Resíduos e Contaminantes
PRM: paramomicina
RIB: ribostamicina
SPC: espectinomicina
SPE: extração em fase sólida
SRM: monitoramento de reações selecionadas (do inglês selected reaction monitoring)
SSM: sisomicina
STP: estreptomicina
TBR: tobramicina
TCA: ácido tricloroacético
XIV
RESUMO
A presença de compostos de uso veterinário em produtos de origem animal é uma
grande preocupação em termos de saúde pública. A utilização descontrolada de
antibióticos como medicamentos veterinários pode levar ao desenvolvimento de
resistência bacteriana, podendo prejudicar a eficácia destas drogas no uso em humanos.
Os aminoglicosídeos são antibióticos extensivamente utilizados na criação de animais
para o tratamento de infecções bacterianas ou para a promoção do crescimento. A União
Europeia estabeleceu níveis máximos de resíduos permitidos (LMRs) para os
aminoglicosídeos em vários alimentos de origem animal. O governo brasileiro
implementou um plano de controle que avalia os resíduos de medicamentos veterinários
em produtos de origem animal. Neste trabalho, foram desenvolvidos método
quantitativo por cromatografia a líquido acoplada a espectrometria de massas triplo
quadrupolo em modo tandem (LC-MS/MS) e método de screening utilizando
cromatografia a líquido acoplada a espectrometria de massas com analisador por tempo-
de-voo (LC-qTOF-MS) para a determinação simultânea dos aminoglicosídeos
espectinomicina, tobramicina, gentamicina, kanamicina, higromicina, apramicina,
estreptomicina, diidroestreptomicina, amicacina e neomicina em leite e em músculo
bovino, de aves e suíno. Como método de extração utilizou-se procedimento com ácido
tricloroacético e clean up por precipitação a baixa temperatura e C18 a granel. Os
métodos por LC-MS/MS e LC-qTOF-MS foram validados de acordo com a Diretiva da
Comissão Europeia 2002/657/CE. Os resultados obtidos no método quantitativo para
recuperação, precisão, linearidade, especificidade, limites de decisão (CCα) e
capacidades de detecção (CCβ) nestas matrizes foram considerados satisfatórios. Os
dados de limite de detecção (LOD) e limite de quantificação (LOQ) foram estabelecidos
a partir dos LMRs, variando de 5 a 100 ng g-1
para LOD e 12,5 a 250 ng g-1
para LOQ.
As recuperações variaram de 36,8 a 98%, e os coeficientes de variação ficaram entre 0,9
e 20,2%, observando-se que todas as curvas foram feitas com nas próprias matrizes a
fim de minimizar os efeitos de matriz que são intrínsecos para os casos estudados neste
trabalho. Os valores de CCβ obtidos no método qualitativo foram entre 25 e 250 ng g-1
,
considerados satisfatórios para os analitos nessas matrizes. O método proposto mostrou-
se simples, fácil e adequado para a análise de um grande número de amostras por dia a
um baixo custo.
XV
Palavras-chave: resíduos, alimentos de origem animal, LC-MS/MS, LC-qTOF-MS,
aminoglicosídeos, medicamentos veterinários.
XVI
ABSTRACT
The presence of several substances in animal products has been a major public concern.
The use of antibiotics drugs as veterinary medicines might lead to the development of
bacterial resistance, which might undermine the efficacy of these drugs in human use.
The aminoglycosides are antibiotics that have been extensively employed in animal
husbandry for the treatment of bacterial infections, but also as growth promotion. The
European Union has issued strict maximum residue levels (MRLs) for aminoglycosides
in several animal origin products. The Brazilian government implemented a control plan
that assesses the residues of veterinary medicines in animal products. A quantitative
method based on liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC–MS/MS) and a
screening method by liquid chromatography mass spectrometry with time-of-flight
system (LC-qTOF-MS) has been developed for simultaneous determination of the
aminoglycosides spectonomycin, tobramycin, gentamicin, kanamycin, hygromycin,
apramycin, streptomycin, dihydrostreptomycin, amikacin and neomycin in milk and in
bovine, poultry and swine muscles. A simple extraction method was developed using
trichloroacetic acid and clean up with low temperature precipitation and C18 bulk. The
LC–MS/MS and LC-qTOF-MS methods were validated according to the European
Union Commission Directive 2002/657/EC. Adequate performance characteristics were
obtained for recovery, precision, calibration curve, specificity, decision limits (CCα)
and detection capabilities (CCβ) in all matrices tested. The detection limit (LOD) and
limits of quantification (LOQ) was established from MRL ranging from 5 to 100 ng g-1
for LOD and 12.5 to 250 ng g-1
to LOQ. Recoveries ranged from 36.8 to 98.0% and the
coefficient of variation from 0.9 to 20.2%, noting that all curves have been made into
their own matrices in order to minimize the matrix effects which are intrinsic to the
cases studied in this work. The CCβ values obtained in qualitative method were
between 25 and 250 ng g-1
, considered satisfactory for the analytes in those matrices.
The proposed method proved to be simple, easy, and adequate for high-throughput
analysis of a large number of samples per day at low cost.
Keywords: residues, food of animal origin, LC-MS/MS, LC-qTOF-MS,
aminoglycosides, veterinary drugs.
1
1 INTRODUÇÃO
O monitoramento de resíduos de medicamentos veterinários em alimentos de
origem animal é realizado em muitos países a fim de garantir a segurança alimentar e a
conformidade das práticas da medicina veterinária1.
Medicamentos veterinários são amplamente utilizados na criação de animais no
tratamento e prevenção de doenças. O uso extensivo destes medicamentos pode levar ao
armazenamento de resíduos em produtos de origem animal, tais como carne e leite. O
consumo desses produtos contaminados com resíduos de medicamentos veterinários
pode causar reações alérgicas em seres humanos geneticamente predispostos e pode
afetar negativamente o sistema imunológico humano2.
Dentre os vários medicamentos utilizados na medicina veterinária, os
antimicrobianos são empregados tanto devido a sua atividade terapêutica e/ou
profilática bem como aditivos para a promoção do crescimento do animal3. A presença
destes fármacos em alimentos implica no risco de desenvolvimento de resistência entre
as bactérias, que pode diminuir a eficácia dessas drogas como medicamentos de uso
humano. Portanto, é importante dispor de métodos de análise capazes de monitorar o
uso ou abuso potencial destes fármacos nas práticas veterinárias4.
Para cada fármaco, é determinado o seu período de carência, que é o intervalo de
tempo, em horas ou dias, que deve ser observado entre a aplicação do agente e a
liberação para o consumo do produto (carne, leite, ovos e mel) oriundo do animal
tratado. É o período entre a administração do fármaco até a sua biotransformação e
excreção, de acordo com a sua farmacocinética. Nesse período não deve haver o
abatimento do animal ou coleta de leite. Respeitar o período de carência é, portanto,
essencial para que o alimento não possua resíduo do produto em níveis acima do limite
máximo permitido (LMR), de modo a assegurar que a presença de resíduos, quando
existirem, esteja dentro dos limites permitidos, ou seja, aceitável e seguro para a saúde
humana5.
A gestão e execução de um programa de monitoramento destinado a identificar
os produtos químicos utilizados na pecuária, para fins de controle de doenças e
promoção de crescimento, são significativamente dependentes da química analítica
durante as etapas de triagem, identificação e confirmação de resíduos de fármacos. Para
2
cumprir os requisitos regulatórios, é necessário empregar métodos analíticos sensíveis,
seletivos e confiáveis2.
Atualmente, as técnicas de cromatografia a líquido acoplada a espectrometria de
massa são muito utilizadas por serem ferramentas poderosas para a análise de resíduos
de medicamentos veterinários6
devido à sua alta sensibilidade, possibilitando a
quantificação em nível de traços (ng g-1
) de resíduos em diferentes matrizes. Aliada à
sensibilidade, apresentam também grande seletividade, pois permitem a identificação
inequívoca dos analitos de interesse, tanto pelo tempo de retenção, como pelo espectro
de massas. Dentre os sistemas de espectrometria de massas acoplados às técnicas
cromatográficas, tem-se o triplo quadrupolo, que é uma técnica em que três quadrupolos
são utilizados em sequência (QqQ-MS ou MS/MS); o sistema de quadrupolo seguido de
analisador de tempo de voo (qTOF-MS), onde os íons produzidos na fonte de ionização
do espectrômetro são acelerados através de um “tubo de voo” para serem identificados e
o íon-trap MS (IT-MSn), quadrupolo tridimensional que captura os íons que são
introduzidos em seu interior e os mantêm “aprisionados” até que uma determinada
radiofrequência seja aplicada e torna os íons de certa razão m/z instáveis, de forma que
são libertados do trap7. Todos estes sistemas são utilizados em estudos confirmatórios e
de quantificação, cada um com sua especificidade.
No que diz respeito aos analitos que foram objeto deste estudo, ou seja, os
antimicrobianos da classe aminoglicosídeos, estes são isolados a partir de espécies de
Streptomyces ou Micromonospora, agindo diretamente na síntese proteica das bactérias.
Como fármacos, são utilizados em gado leiteiro para tratar mastites, no tratamento da
leptospirose em bovinos, ovinos, caprinos e suínos, e também no tratamento de várias
infecções causadas por bactérias gram negativas8. As concentrações séricas observadas
com as doses terapêuticas estão próximas das doses tóxicas (baixo índice terapêutico).
A toxicidade celular é característica comum dos aminoglicosídeos (exceto a
espectinomicina), em função de sua absorção para o meio intracelular. Seus efeitos
tóxicos mais importantes são nefrotoxicidade (dano causado por certas substâncias, nos
rins ao nível glomerular, tubular, intersticial e vascular), ototoxicidade (dano aos
sistemas coclear e/ou vestibular resultante de exposição a substâncias químicas) e
bloqueio neuromuscular9. Logo, o consumo de alimentos de origem animal, tais como o
leite e a carne, que podem conter resíduos de aminoglicosídeos, representa risco
potencial para a saúde dos seres humanos10,11
.
3
Nesse contexto, o monitoramento de resíduos de aminoglicosídeos em amostras
de alimentos faz parte do conjunto de necessidades de implementação no escopo dos
órgãos fiscalizadores. O desenvolvimento de métodos analíticos capazes de detectar e
quantificar os analitos de forma inequívoca e que sejam rápidos, de baixo custo e
gerando a menor quantidade de resíduos possível, é de extrema importância para o
monitoramento do cumprimento da legislação relacionada à presença desses compostos,
garantindo a qualidade e segurança do alimento que chega ao consumidor.
Portanto, foram desenvolvidos e validados neste trabalho métodos para a análise
de dez aminoglicosídeos utilizados na medicina veterinária a fim de detectá-los e
quantificá-los em matrizes de origem animal.
O trabalho foi realizado em colaboração com o Laboratório Nacional
Agropecuário (LANAGRO/RS), no setor de análise de Resíduos de Pesticidas e
Medicamentos Veterinários (RPM) que dispôs de toda a infraestrutura necessária como
material para os métodos de extração/clean up, equipamentos de LC-MS/MS tanto para
screening como para análise quantitativa.
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Desenvolver e validar método de screening por LC-qTOF-MS e método
confirmatório por LC-MS/MS para determinação e quantificação de antibióticos da
classe aminoglicosídeos em leite bovino, músculo de bovino, de suíno e de frango, em
atendimento ao Plano Nacional de Controle de Resíduos e Contaminantes (PNCRC).
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
A partir do objetivo geral descrito, derivam-se os objetivos específicos desse
estudo que foram:
- Estabelecer as condições de análise por cromatografia a líquido acoplada a
espectrometria de massas (LC-qTOF-MS e LC-MS/MS) para os analitos alvo;
- Avaliar métodos de preparo de amostra envolvendo extração/clean up (extração
líquido-líquido (LLE), desproteinização e dispersão em fase sólida) simples, rápidos, de
4
baixo custo e de baixo impacto ambiental, gerando menos resíduo em comparação aos
métodos encontrados na literatura;
- Validar as metodologias desenvolvidas de acordo com as normas específicas
estabelecidas pela Diretiva 2002/657/EC;
- Implementar as metodologias desenvolvidas e validadas para o controle de
qualidade e de fiscalização exigidos pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e
Abastecimento (MAPA), dentro do escopo do PNCRC.
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 CONTEXTUALIZAÇÃO
O aumento dos dados relativos à análise de risco de diferentes substâncias
presentes nos produtos de origem animal levou a uma maior preocupação com a
regulamentação dos níveis máximos de resíduos permitidos de diversos fármacos de uso
veterinário. Neste contexto, o uso de antimicrobianos na medicina veterinária é feito
com finalidade mais ampla do que as tradicionalmente utilizadas em seres humanos.
Além do uso terapêutico e profilático, o médico veterinário emprega os antimicrobianos
na metafilaxia, ou seja, prevenção mediante o uso de antimicrobianos. O uso dos
fármacos de uso veterinário desperta interesse por parte dos consumidores de produtos
de origem animal, quer pela possibilidade real de remanescerem resíduos nos produtos
derivados dos animais tratados, quer por aspectos ligados ao desenvolvimento de
resistência bacteriana em especial no caso dos antibióticos12
.
Considera-se de extrema importância um sistema eficiente de controle sobre
níveis de resíduos, bem como, um programa para controle do uso de medicamentos
veterinários e sua possível presença no final da cadeia alimentar, isto é, quando o
produto chega ao consumidor. Por efeito, torna-se possível o monitoramento de forma
completa que permita a aplicação de políticas eficazes de segurança alimentar12
.
O gerenciamento e a execução de um programa de regulamentação com o
objetivo de identificar os medicamentos utilizados pela pecuária são significativamente
dependentes de métodos de triagem, de identificação e quantificação de resíduos de
medicamentos6.
5
No Brasil, esse gerenciamento é realizado pelo MAPA através do PNCRC,
programa federal de inspeção e fiscalização das cadeias produtivas de alimentos,
baseado em análise de risco, que visa monitorar a efetividade dos controles
implementados pelos sistemas de produção e a respectiva qualidade e segurança dos
produtos de origem animal e vegetal disponibilizados ao comércio e ao consumo. Este
monitoramento oficial é realizado por meio da verificação da presença e dos níveis de
resíduos de substâncias químicas potencialmente nocivas à saúde do consumidor13
.
As análises laboratoriais são realizadas nos laboratórios da Rede Nacional de
Laboratórios Agropecuários (Laboratórios Nacionais Agropecuários – LANAGROs) e
em laboratórios privados ou públicos credenciados pelo MAPA, todos com acreditação
do Inmetro na Norma ABNT NBR ISO/IEC 17025:2005.
3.2 LEGISLAÇÃO
O limite máximo de resíduo permitido (LMR) é definido como a concentração
máxima de resíduo resultante do uso na medicina veterinária em alimentos, expressa em
mg kg-1
, g kg-1
ou ng kg-1
do peso do produto fresco, recomendada ou que se permita
legalmente ou que se reconheça como aceitável na parte interna ou externa de um
alimento . A Tabela 1 mostra o LMR para os aminoglicosídeos abordados neste estudo
em amostras de alimentos de origem animal. Os valores de LMR são estabelecidos e
definidos pelo Codex Alimentarius (órgão ligado à Organização Mundial de Saúde –
OMS) como a concentração máxima de resíduo tolerável no alimento e é baseado na
ingestão diária aceitável (IDA) do composto, definida como a quantidade máxima de
resíduos que, se ingerida diariamente durante toda a vida, não oferece risco apreciável à
saúde, determinada a partir do NOEL (do inglês, no observed effect level), um índice de
toxicidade é determinado no processo de avaliação toxicológica.
A regulamentação é cumprida quando os resíduos estão abaixo do LMR ou
quando o composto não é detectável com a melhor metodologia analítica disponível.
Quando o resíduo é quantificado acima de seu LMR, a amostra é considerada violada.
No caso de medicamentos proibidos ou não aprovados para uso, o menor nível de
detecção obtido com o método de screening é utilizado para definir a necessidade de
análises confirmatórias6.
Para garantir que os antibióticos são usados apenas em situações aprovadas e
para controlar a sua utilização em animais, as amostragens são realizadas nos
6
abatedouros e as amostras avaliadas quanto à presença de resíduos dos fármacos
utilizados na medicina veterinária. Essas análises devem seguir a Diretiva 2002/657/CE
da Comissão Europeia14
e o Guia de Validação do MAPA15
, que estabelecem a
validação de um método analítico através de estudos laboratoriais, avaliando se os
parâmetros de desempenho analítico atendem às exigências para a aplicação analítica
pretendida.
Tabela 1. Limite máximo de resíduo (LMR), estabelecidos pela Comissão Europeia, para
os aminoglicosídeos abordados neste trabalho.
Antibiótico LMR leite
bovino
(µg kg-1
)
LMR músculo bovino,
suíno e de frango
(µg kg-1
)
Estreptomicina 200 500
Diidroestreptomicina 200 500
Apramicina * 1000
Gentamicina 100 50
Kanamicina 150 100
Espectinomicina 200 300
Neomicina 500 500
Amicacina * *
Tobramicina * *
Higromicina * *
(*) Não tem valor de LMR estabelecido. Nos casos em que os valores de LMR não estejam estabelecidos
adotou-se nesse trabalho um valor intermediário relativo aos LMR dos demais analitos.
Fonte: adaptado da Comissão Europeia.
3.3 AMINOGLICOSÍDEOS
Aminoglicosídeos são moléculas constituídas por dois ou mais aminoaçúcares
unidos por ligação glicosídica à hexose ou aminociclitol, que geralmente está em
posição central8, como representado na Figura 1.
7
(A)
(B)
Figura 1. Estrutura química representativa dos aminoglicosídeos. (A) neomicina; (B)
tobramicina. Os asteriscos mostram os grupamentos aminas e as linhas de clivagem
mostram os açúcares de cada molécula.
Fonte: Turnipseed et al, 2009.
Todos os aminoglicosídeos agem pelo mesmo mecanismo, exercendo seu efeito
bactericida ao se ligarem à subunidade 30S do ribossomo, diminuindo a síntese proteica
e levando à leitura incorreta do RNA mensageiro, causando alteração no funcionamento
da membrana celular com saída de constituintes essenciais ao funcionamento da célula,
8
provocando a morte celular. Inibem o crescimento de algumas bactérias gram-positivas
e diversas bactérias gram-negativas9.
Aminoglicosídeos são extensivamente utilizados na criação de animais para o
tratamento de infecções bacterianas ou promoção do crescimento e suas doses
terapêuticas estão próximas às doses tóxicas. A Tabela 2 apresenta um resumo dos
produtos veterinários destinados a aves, bovinos e suínos que possuem
aminoglicosídeos em sua composição utilizados no Brasil atualmente que possuem
registro no MAPA, de acordo com Compêndio de Produtos Veterinários - SINDAN
(CPVS)16
.Várias dessas formulações são utilizadas em diferentes espécies de animais,
logo, muitas delas se repetem entre as três espécies abordadas neste trabalho.
Tabela 2. Número de formulações contendo aminoglicosídeos disponíveis no Brasil
conforme o Compêndio de Produtos Veterinários - SINDAN (CPVS).
Aminoglicosídeo Espécie do animal nº de formulações
contendo o composto
Aves 2
Apramicina Bovinos 1
Suínos 2
Aves 0
Diidroestreptomicina Bovinos 14
Suínos 11
Aves 5
Espectinomicina Bovinos 4
Suínos 7
Aves 3
Estreptomicina Bovinos 36
Suínos 29
Aves 8
Gentamicina Bovinos 21
Suínos 13
Aves 1
Kanamicina Bovinos 0
Suínos 1
Aves 9
Neomicina Bovinos 28
Suínos 13 Fonte: adaptado do Compêndio de Produtos Veterinários - SINDAN (CPVS).
9
Muitas destas formulações veterinárias apresentam associações com outros
fármacos de diferentes classes terapêuticas, mais comumente antiinflamatórios não
esteroidais e antimicrobianos das classes sulfonamidas e β-lactâmicos, o que pode levar
a um aumento do seu período de carência. A maioria das formulações é administrada
por via oral (através de premix que são adicionados na ração ou na água do animal) ou
por via intramuscular profunda. Já quando a indicação é tratamento de mastite em
vacas, existem muitas formulações que utilizam a via de administração intramamária.
Os aminoglicosídeos mais utilizados na medicina veterinária são estreptomicina,
gentamicina e neomicina. Apramicina e diidroestreptomicina são utilizadas
exclusivamente na medicina veterinária, enquanto os demais aminoglicosídeos também
têm uso em humanos. A Tabela 3 apresenta uma síntese das formas farmacêuticas
contendo aminoglicosídeos, via de administração e período de carência.
Tabela 3. Formas farmacêuticas, vias de administração e períodos de carência das
formulações contendo aminoglicosídeos disponíveis no Brasil.
Aminoglicosídeo Formas
farmacêuticas
Vias de
administração
Período de carência
Apramicina pó solúvel oral 28 dias músculo
premix oral 28 dias músculo
Diidroestreptomicina solução injetável intramuscular 30 dias músculo; 3 dias leite
solução injetável intramuscular 30 dias músculo; 3 dias leite
Espectinomicina premix oral 7 dias músculo; 2 dias leite
pomada tópica nenhum
Estreptomicina premix oral 12 dias músculo ; 2 dias leite
solução injetável intramuscular 30 dias músculo; 5 dias leite
suspensão intramamária 14 dias músculo; 4 dias leite
Gentamicina solução injetável intramuscular 30 dias músculo; 4 dias leite
premix oral 14 dias músculo
Kanamicina solução injetável intramuscular 15 dias músculo de ave; 22
dias músculo suíno
Neomicina premix e líquido oral 5 dias músculo; 2 dias leite
suspensão intramamária 5 dias leite
Fonte: adaptado do Compêndio de Produtos Veterinários - SINDAN (CPVS).
10
Portanto, o monitoramento da presença destes compostos em produtos de origem
animal é de extrema importância tanto no que diz respeito à possibilidade de
desenvolvimento de resistência aos antimicrobianos11
, como para garantir a segurança à
saúde humana.
Os aminoglicosídeos representam desafio analítico considerável, devido a isso,
essas substâncias são menos frequentemente analisadas do que outros medicamentos
veterinários. De acordo com Kaufmann e McGlinchey, as principais características que
acarretam inconvenientes nas diferentes etapas de preparo da amostra e análise são: a
elevada polaridade devido aos vários grupamentos amino e hidroxil em suas estruturas,
a ausência de grupos cromóforos e fluoróforos e a tendência a estabelecer fortes
ligações com as proteínas da matriz4,14
. Há indicações que a eficácia de extração se
correlaciona inversamente com o número de aminas primárias na estrutura de um
determinado aminoglicosídeo. Grupos amina adjacentes são capazes de formar quelatos
com vários íons carregados. Esse problema pode ser suprimido pela adição de reagentes
de ligação como complexos com EDTA4.
3.4 PREPARO DE AMOSTRA
De um modo geral, as etapas de extração e clean up, nos procedimentos
analíticos para a determinação de compostos em nível de traços em amostras que
possuem matrizes complexas, são consideradas etapas críticas. Vários métodos de
purificação como extração em fase sólida (SPE)4,10,11,14,18
, SPE on-line17
e dispersão de
matriz em fase sólida (MSPD)19
foram utilizadas para a extração de aminoglicosídeos.
Na maioria dos métodos publicados até o presente momento é utilizada a SPE,
geralmente precedida de extração com solvente orgânico e desproteinização da matriz
com ácido4.10,17,20
. Neste caso, a extração com solvente orgânico como acetonitrila é
usada seguida de clean up com hexano, a fim de retirar a gordura proveniente da matriz3
e a desproteinização é comumente utilizada na extração de antibióticos em matrizes
biológicas para remover possíveis interferentes na análise, melhorando a recuperação
dos analitos de interesse.
Métodos de triagem multirresíduos permitem analisar simultaneamente de forma
qualitativa um grande número de medicamentos de diferentes classes farmacológicas.
11
Alguns destes métodos que incluem aminoglicosídeos, utilizam principalmente a
extração líquido-líquido (LLE)2,3,6,21
.
A Tabela I dos ANEXOS apresenta os principais métodos publicados para a
preparação de amostras visando à determinação de aminoglicosídeos em alimentos de
origem animal. No levantamento realizado, observa-se que, na maioria das
metodologias já publicadas, apenas alguns aminoglicosídeos são analisados. No entanto,
como esta classe de compostos tem grande utilização na medicina veterinária, a inclusão
de todos os aminoglicosídeos disponíveis no mercado em um único procedimento
analítico é fundamental para os órgãos de controle e fiscalização.
3.5 ANÁLISE DE AMINOGLICOSÍDEOS POR CROMATOGRAFIA A
LÍQUIDO ACOPLADA A ESPECTROMETRIA DE MASSAS
O acoplamento da cromatografia a líquido com a espectrometria de massas,
permite a utilização da versatilidade das diferentes combinações dos espectrômetros de
massas existentes do mercado. Neste trabalho, foram utilizados dois destes sistemas que
serão abordados a seguir.
3.5.1 Separação por cromatografia líquida
A separação dos componentes presentes na amostra por cromatografia a líquido
leva em conta o ajuste mais adequado dos parâmetros cromatográficos. Para os
aminoglicosídeos esta etapa requer atenção especial, pois a retenção desses compostos
em coluna de fase reversa é inaqueda devido à sua alta hidrofilicidade10
, dificultando
também a inclusão desses compostos em métodos multirresíduos, onde é analisada
simultaneamente uma gama variada de compostos, com as demais classes de
antimicrobianos utilizadas na medicina veterinária, que têm características mais
apolares.
A utilização de colunas de interação hidrofílica (HILIC), em que uma fase
estacionária fortemente polar é utilizada em combinação com uma fase móvel com alta
porcentagem de solvente orgânico, aparece como alternativa para a separação destes
analitos3,10,18,22,23,24
. Grupos polares ligados na superfície da fase estacionária sofrem
solvatação, retendo o analito mais fortemente. Vale lembrar que a separação
12
cromatográfica está baseada na polaridade e no grau de solvatação dos analitos sendo
que a retenção pode combinar mecanismos de adsorção, partição e de troca iônica25
.
A utilização de um aditivo pareador iônico na fase móvel também atua como
uma poderosa ferramenta para a separação de aminoglicosídeos11
. O pareador iônico faz
uma modificação dinâmica na superfície da fase estacionária, auxiliando na retenção
dos analitos em colunas de fase reversa. Existem vários mecanismos propostos, sendo
classificados basicamente como estequiométricos e não estequiométricos26
.
No estequiométrico, o reagente de par iônico de carga oposta a do analito na fase
móvel forma um par iônico neutro, solúvel na fase orgânica, o que leva a um
aumentando da afinidade pela fase estacionária apolar (fase reversa)27
.
No não estequiométrico, o reagente de par iônico é adsorvido na superfície
apolar da fase estacionária com um grupo ionizado orientado na direção do meio
aquoso, atuando como um trocador iônico dinâmico. O analito é então atraído por forças
eletrostáticas para o grupo ionizado28
.
3.5.2 Cromatografia a líquido acoplada a espectrômetro de massas triplo
quadrupolo (LC-MS/MS) – Método de quantificação
O sistema de LC-MS/MS é bastante adequado quando se necessita de elevada
sensibilidade e critérios de identificação mais rigorosos. Quando se utiliza o sistema de
espectrometria de massas em tandem, a quantificação é realizada por SRM (do inglês:
selective reaction monitoring), em que duas transições específicas são utilizadas, sendo
a mais intensa para quantificar e a outra para confirmar a identidade química7. Desta
forma podem-se obter valores de sensibilidade adequados para atender às exigências das
agências de controle internacionais.
Quando da utilização da cromatografia a líquido acoplada a espectrômetro de
massas, a ionização pode se dar de várias formas. Para substâncias mais lábeis em
termos de fragmentação, como é o caso dos antimicrobianos, os sistemas de ionização
mais utilizados são o ESI (do inglês: Eletrospray Ionization) e APCI (do inglês:
Atmospheric Pressure Chemical Ionization). Além disso, a ionização pode ser
conduzida no modo positivo, onde o analito é carregado positivamente, e no modo
negativo, onde é carregado negativamente. De um modo geral, os antimicrobianos
utilizados nesse estudo apresentam melhor resposta quando ionizados no modo
positivo4,10,11,17
, neste caso, o íon molecular terá a estrutura [M+H+].
13
Na ionização ESI, o líquido no qual o analito de interesse se encontra dissolvido
passa através de um capilar, a vácuo, mantido sob alta voltagem. Na saída do capilar são
formadas pequenas gotas altamente carregadas (“spray”) que são dessolvatadas ao se
deslocarem em sentido contrário ao posicionamento de um eletrodo. À medida que
ocorre a dessolvatação, o tamanho das gotas é reduzido até o ponto em que a força de
repulsão entre as cargas similares fica maior que as forças de coesão da fase líquida,
ocorrendo uma “explosão coulômbica”. Os íons gerados são transferidos para o interior
do espectrômetro de massas por uma série de dispositivos de focalização. Na ionização
por APCI, o eluente da coluna cromatográfica passa através de um nebulizador
pneumático no qual gotas são geradas e dessolvatadas. O “spray” formado passa por
uma região aquecida na qual o vapor é seco, formando espécies neutras que passam
através de uma corona de descarga. Um campo é aplicado na corona, e o analito é
ionizado7.
Após a etapa de ionização, os analitos seguem para o analisador. O analisador
híbrido de triplo quadrupolo consiste em dois quadrupolos com um segundo quadrupolo
entre eles que atua como célula de colisão, permitindo a análise de massas em tandem.
Os íons se dirigem desde a fonte de ionização para o primeiro quadrupolo, onde é
selecionado o íon precursor. Após a célula de colisão está disposto um quadrupolo final
e o detector fotomultiplicador. Os instrumentos de triplo quadrupolo têm quatro
possíveis modos de operação: análise dos íons produto (product-ion scan), seguimento
da reação selecionada (SRM- selected reaction monitoring), perda neutra constante
(constant neutral loss) e análise do íon precursor (precursor-ion scan) 7
. Esses quatro
modos de operação correspondem às opções de trabalho dos quadrupolos 1 e 3 em
modo de varredura completa de íons (full scan) ou de monitoramento do íon
selecionado (SIM).
No modo product-ion scan, é feita a varredura dos íons. No primeiro quadrupolo é
isolado o íon de interesse que, em seguida, é fragmentado na célula de colisão. No
quadrupolo final é feita a varredura dos íons produzidos a partir da fragmentação do íon
de interesse para obtenção do espectro de massas. Por sua vez, no modo de operação
SRM, um íon precursor selecionado no primeiro quadrupolo é fragmentado na célula de
colisão e íons produtos são monitorados no quadrupolo final. Já o modo constant
neutral loss permite observar íons que se fragmentam perdendo uma massa de estrutura
química específica e neutra. É realizada no triplo quadrupolo varrendo-se todos os
estágios de MS/MS simultaneamente para comparar as diferenças entre as massas
14
varridas. Finalmente, quando o modo precursor-ion scan é selecionado, a varredura é
realizada quando o primeiro quadrupolo é ajustado para transmitir íons dentro de um
intervalo de m/z de interesse, os quais são fragmentados na célula de colisão, para que
no quadrupolo final sejam transmitidos íons de uma única razão m/z 7.
Após o analisador, se encontra o detector do espectrômetro de massas, sendo que
este último pode ser uma multiplicadora de elétrons, um MCP (do inglês: Multichannel
Plate Detector), entre outros.
3.5.3 Cromatografia a líquido acoplada a espectrômetro de massas
quadrupolo-tempo de voo (LC-qTOF-MS) - Método de triagem
(Screening)
Métodos de triagem para multirresíduos são capazes de analisar qualitativamente
ou semi-quantitativamente analitos de várias classes que possam ser extraídos
simultaneamente no mesmo procedimento de preparo de amostra e analisados no
mesmo método cromatográfico e condições no espetrômetro de massas. Os métodos
multirresíduos quando associados a testes de triagem eficientes, permitem otimizar de
forma bastante relevante a eficiência analítica do laboratório, inclusive sob o ponto de
vista financeiro, pois são capazes de analisar considerável número de compostos em
uma única análise, reduzindo assim, tanto a quantidade de amostra necessária como o
tempo total para obter o resultado.
Um sistema LC-qTOF-MS consiste em um quadrupolo e célula de colisão
adaptado de um instrumento triplo quadrupolo acoplado a um analisador de tempo de
voo com aceleração ortogonal para MS/MS. Consequentemente, o analisador qTOF-MS
tem a capacidade de análise do MS, assim como modos de operação em MS/MS. Em
modo MS/MS, o equipamento seleciona um íon precursor no primeiro quadrupolo, o
qual é fragmentado mediante CID (do inglês collision induced ionization - técnica de
fragmentação de baixa energia), na célula de colisão e realiza a análise de massas dos
íons fragmento no analisador por tempo de voo (TOF, do inglês time of flight),
proporcionando um espectro de massa exata dos íons produto em full-scan. Assim, o
LC-qTOF-MS possibilita o desenvolvimento de métodos de multirresíduos com alta
especificidade na identificação das substâncias por meio da caracterização da massa
exata dos analitos de interesse com quatro algarismos decimais, evitando falsos
positivos. Além disso, permite a exploração pós-análise dos dados da amostra e a
15
avaliação da presença de metabólitos e analitos non-target sem a necessidade de padrão
analítico7.
A ionização ocorre da mesma forma que no LC-MS/MS descrito anteriormente,
e a análise ocorre no analisador TOF, onde a separação dos íons está baseada na terceira
lei de Newton. Fundamentalmente, o princípio de funcionamento deste analisador está
baseado na medida de tempo que levam os íons gerados e acelerados com a mesma
energia na fonte de íons, para alcançar um eletrodo coletor localizado a uma distância
pré-determinada. À medida que os íons possuem a mesma energia, mas diferentes
massas, estes chegarão ao coletor em momentos diferentes, dependendo da sua massa,
carga e energia cinética.
A exatidão na medida das massas proporcionada por um analisador TOF é muito
mais alta que para qualquer outro instrumento, devido a excelente separação e detecção
de íons no tubo de voo, permitindo erros inferiores a 5 ppm na exatidão da medida de
massas dos íons (esse valor é aceito para verificação da composição elementar). Para
alcançar tal exatidão de massas esses instrumentos requerem uma frequente calibração
do espectrômetro de massas. A calibração on-line é vital para evitar flutuações que
podem acontecer durante a realização da análise.
Desta forma, buscando não apenas atender aos parâmetros necessários, no que
diz respeito à sensibilidade e seletividade, este trabalho foi desenvolvido para também
disponibilizar metodologia analítica de screening confiável, que permita a redução no
tempo total de emissão de laudos com relação à presença de resíduos de
aminoglicosídeos em produtos de origem animal, permitindo a inclusão do mesmo no
escopo do PNCRC.
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 REAGENTES, PADRÕES E MATERIAIS
Os padrões dos antimicrobianos utilizados no desenvolvimento do trabalho
foram: sulfato de tobramicina (TBR) (Sigma-Aldrich, grau de pureza 98%), sulfato de
estreptomicina (STR) (Dr Ehrenstorfer, grau de pureza 96%), sesquissulfato de
diidroestreptomicina hidratado (DHSTR) (Dr Ehrenstorfer, grau de pureza 99%), sulfato
16
de kanamicina (KNM) (Dr Ehrenstorfer, grau de pureza 94,5%), hidrato de higromicina
B (HGR) (Dr Ehrenstorfer, grau de pureza 84,3%), sulfato de gentamicina hidratado
(GNT) (Dr Ehrenstorfer, grau de pureza 97%), diidrocloridrato de espectinomicina
pentaidratado (SPC) (Fluka, grau de pureza 99,3%), sulfato de apramicina (APR)
(Fluka, grau de pureza 95%), sulfato de neomicina (NEO) (Dr Ehrenstorfer, grau de
pureza 90%) e hidrato de amicacina (AMC) (Dr Ehrenstorfer, grau de pureza 99%).
Como solventes foram utilizados: água ultrapura (Milli-Q) com resistividade
controlada em 18,2 Mm e acetonitrila grau LC Mass Spec (Tedia, grau de pureza
99,9%) e os demais reagentes empregados foram: ácidotricloroacético (TCA) (Vetec,
grau de pureza ≥ 99%), ácido nonafluorpentanóico (NFPA) (Sigma-Aldrich, grau de
pureza 97%), Chromabond® Sorbent C18 ec, (Macherey-Nagel) e ácido
etilenodiaminotetracético (EDTA) (Vetec).
4.2 PREPARO DAS SOLUÇÕES ESTOQUE, INTERMEDIÁRIA E DE
TRABALHO
As soluções padrão estoque (1 mg mL-1
) individuais foram preparadas
dissolvendo-se em torno de 10 mg do padrão analítico de cada composto em água
ultrapura em balão volumétrico de 10 mL. A massa de cada um dos padrões analíticos
empregados foi corrigida de acordo com a pureza e considerada a massa correspondente
ao cátion do sal, dado que o padrão analítico comercial estava na forma de sal de cada
um dos compostos analisados.
A solução intermediária dos analitos para a matriz leite foi preparada
adicionando 100 L da solução estoque GNT, 150 L da solução estoque KNM, 200
L das soluções estoque SPC, STR e DHSTR, e 500 L das soluções estoque APR,
NEO, AMC, TBR e HGR, em balão volumétrico de 10 mL, completado com água
ultrapura. Esse pool (mistura) é balanceado em função dos diferentes LMRs dos
analitos, o que determina a faixa de trabalho que será utilizada.
A solução de trabalho para leite foi preparada diluindo-se cinco vezes a solução
intermediária. Nas amostras de leite, a adição de 50 L da solução de fortificação em 1,0
mL de amostra equivale a 100 ng g-1
para o analito GNT, 150 ng g-1
para o analito KNM,
200 ng g-1
para SPC, STR e DHSTR, e 500 ng g-1
para os analitos APR, NEO, AMC,
TBR e HGR.
17
Para a matriz músculo, não foi utilizada solução intermediária. A solução de
trabalho consiste em 50 L da solução estoque GNT, 100 L da solução estoque KNM,
000 L das soluções estoque SPC, 500 L das soluções estoque STR, DHSTR, NEO,
AMC, TBR e HGR, e 1000 L da solução estoque APR, em balão volumétrico de 10 mL,
completado com água ultrapura. A adição de 100 L desta solução em 10 g de músculo
equivale a 50 ng g-1
para GNT, 100 ng g-1
para KNM, 300 ng g-1
para SPC, 500 ng g-1
para
STR, DHSTR, NEO, AMC, TBR e HGR, e 1000 ng g-1
para APR.
4.3 MÉTODOS
4.3.1 Análise Instrumental
4.3.1.1 Cromatografia a líquido acoplada a espectrômetro de massas triplo
quadrupolo (LC-MS/MS)
O sistema LC-MS/MS usado foi um cromatógrafo a líquido Agilent 1100 Series
acoplado a um espectrômetro de massas API 5000 Applied Biosystems (AB Sciex,
Foster City, CA).
O desenvolvimento da metodologia por LC-MS/MS foi realizado através da
otimização da fragmentação do analito (infusão), otimização das condições da fonte de
ionização (FIA) e otimização das condições da cromatografia líquida.
Na etapa de infusão utilizou-se o fluxo contínuo do padrão dos analitos na
concentração de 200 ng mL-1
em água, com fluxo de 10 µL min-1
, utilizando uma
seringa conectada a uma bomba, com ionização por eletrospray no modo positivo (ESI
+). A infusão permite que seja vista uma resposta imediata do sinal quando é feita
alguma mudança nos parâmetros de massas e, portanto, é realizada a fim de otimizar a
ionização e fragmentação do analito. Na infusão ocorre a otimização de parâmetros do
equipamento relacionados aos compostos de interesse, como gás de colisão (CAD, que
controla a pressão do gás na célula de colisão), voltagem do orifício de entrada (DP, do
inglês Declustering Potential, controla a voltagem no orifício de entrada do
triploquadrupolo), potencial de entrada (EP, do inglês Entrance Potential, controla o
potencial de entrada dos analitos), potencial de saída da célula de colisão (CXP, do
18
inglês Collision Cell Exit Potential, controla o potencial da saída da célula de colisão) e
energia de colisão (CE, do inglês Collision Energy, controla o potencial aplicado na
célula de colisão).
Em seguida foi realizada análise de infusão em fluxo (FIA, do inglês flow
injection analysis). A análise por FIA consiste em melhorar as condições de ionização
do analito, de forma que a maior parcela possível de moléculas do analito seja
convertida para a forma ionizada. A solução padrão dos analitos foi injetada pelo
amostrador automático na corrente do cromatógrafo a líquido, sem a coluna. Durante o
processo de otimização, múltiplas injeções da solução são feitas, com alteração dos
parâmetros entre as injeções. Essa etapa ocorre na fonte de ionização do equipamento.
Os principais parâmetros otimizados nessa etapa são: gás da fonte (GS1, controla o gás
de nebulização), gás auxiliar (GS2, controla o gás auxiliar), temperatura (TEM,
temperatura do heater), gás de cortina (CUR, do inglês Curtain Gas, o gás com fluxo
entre o curtain plate e o orifício de entrada para o triplo quadrupolo) e voltagem do
spray de íons (IS, do inglês Ion Spray Voltage, controla a voltagem aplicada à agulha
que ioniza a amostra na fonte).
Por fim, foram selecionadas as duas transições mais abundantes de cada composto
(a primeira tomada como quantificadora, e a segunda como qualificadora) e
estabelecido o método de análise no modo SRM. Todos os dados foram processados
no software Analyst versão 1.4.2 (AB Sciex).
Após a otimização das condições da espectrometria de massas, foi realizada a
otimização das condições de cromatografia a líquido. Os fatores que devem ser
considerados é o modo de ionização selecionado, a coluna analítica a ser utilizada (fase
estacionária, diâmetro, comprimento e tamanho de partícula), a fase móvel utilizada,
pois a composição tem de garantir uma boa ionização e uma boa separação
cromatográfica (pH, solventes, aditivos), gradiente da fase móvel e fluxo. A coluna
cromatográfica utilizada foi uma Waters XTerra MS C18 (2,1 × 100 mm, 3,5 µm), com
uma pré-coluna SecurityGuard (Phenomenex) C18 (4,0 × 3,0 mm, 5 μm). Foi utilizada
uma fase móvel binária, onde a aquosa foi 10 mM de NFPA e a orgânica 10 mM de
NFPA em acetonitrila.
19
4.3.1.2 Cromatografia a líquido acoplada a espectrômetro de massas quadrupolo-
tempo de voo (LC-qTOF-MS)
O sistema LC-qTOF-MS usado foi um cromatógrafo líquido Agilent 1100 Series
associado a um espectrômetro de massas API 5600 Applied Biosystems (AB Sciex,
Foster City, CA).
Os parâmetros de ionização foram otimizados a partir dos definidos por LC-
MS/MS, porém, em uma análise por tempo de voo, não são monitorados
exclusivamente os analitos de interesse como no modo SRM, e sim é feito um scan da
amostra e a identificação das substâncias é feita por meio da caracterização da massa
exata (com incerteza no máximo de 5 ppm) dos analitos de interesse e pelo seu tempo
de retenção. Logo, não é feita a otimização de ionização individual para cada analito. A
análise de dados é feita pelo software Multiquant 2.1.1.
4.3.2 Avaliação da supressão iônica no LC-MS/MS com ionização por
eletrospray
A supressão iônica foi determinada por infusão pós-coluna de solução
contendo os analitos de interesse, na concentração de seus LMRs em NFPA 10
mM:água ultrapura:acetonitrila, na proporção de 2:1:1, respectivamente.
Simultaneamente, através da coluna cromatográfica, é realizada a análise do solvente
puro, e, em seguida, de um extrato de matriz branca isento dos analitos de interesse
obtida através do processo de preparo de amostra estabelecido, descrito a seguir. A
primeira análise corresponde à intensidade dos analitos na presença da fase móvel, sem
a presença da matriz, cuja interferência é avaliada pela segunda análise. A Figura 2
apresenta um esquema de como é realizada a avaliação da supressão.
20
Figura 2. Figura representando o esquema do modo de avaliação da supressão iônica
(circulado na figura) no sistema de LC-MS/MS.
Fonte: a autora.
4.3.3 Amostragem
As amostras selecionadas para estudo foram leite bovino e músculo bovino,
suíno e de frango, provenientes de produtores, para análise pelo PNCRC, previamente
analisadas pelo laboratório RPM do LANAGRO/RS.
As amostras foram coletadas por Fiscais Federais Agropecuários seguindo o
procedimento do Manual de Coleta de Amostras do PNCRC/Animal29
, em
estabelecimentos inspecionados em várias regiões do país, de acordo com a
programação anual de análises do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
(MAPA) e, posteriormente, remetidas ao LANAGRO.
As amostras foram coletadas, identificadas, embaladas e lacradas, congeladas,
acondicionadas em caixas isotérmicas e enviadas ao laboratório29
. No laboratório as
amostras são homogeneizadas, uma alíquota de 1 mL de leite e 10 g de músculo, é
separada e congelada novamente até o dia da análise.
4.3.4 Preparação da amostra: extração e clean up
Foram avaliados procedimentos de extração da amostra utilizando soluções de
ácido tricloroacético (TCA) em diferentes concentrações e processos de clean up
utilizando partição com hexano, dispersão em fase sólida e purificação a baixa
temperatura utilizando freezer (-20ºC) e ultrafreezer (-70ºC). Após estudo preliminar, as
21
condições experimentais do método de maior eficiência foram otimizadas mediante a
realização de um planejamento fatorial 24.
4.3.5 Planejamento fatorial
Foi realizado um planejamento fatorial 24
com ponto central para avaliar
variações nas etapas do processo extrativo, sendo que as variáveis foram: volume de
amostra, volume do extrator, concentração de TCA e tempo de refrigeração, assim
como apresentado na Tabela 4. As condições experimentais utilizadas na otimização do
processo extrativo estão na Tabela 5. O fator de resposta utilizado para avaliação foi
área do pico cromatográfico. Os dados foram tratados utilizando a planilha eletrônica
previamente descrita por Teófilo et al30
.
Tabela 4. Variáveis e níveis empregados no planejamento fatorial 24 com triplicata do
ponto central.
Fatores (-) 0 (+)
1 Volume amostra 1 mL 5 mL 9 mL
2 Volume extrator 1:1 1:2 1:3
3 % TCA 5 10 15
4 Tempo congelamento (freezer) 20 min 40 min 60 min
Resposta: área do pico cromatográfico. Fonte: a autora.
22
Tabela 5. Condições experimentais codificadas utilizadas na otimização do processo
extrativo.
Ensaio 1 2 3 4
1 (-) (-) (-) (-)
2 (+) (-) (-) (-)
3 (-) (+) (-) (-)
4 (+) (+) (-) (-)
5 (-) (-) (+) (-)
6 (+) (-) (+) (-)
7 (-) (+) (+) (-)
8 (+) (+) (+) (-)
9 (-) (-) (-) (+)
10 (+) (-) (-) (+)
11 (-) (+) (-) (+)
12 (+) (+) (-) (+)
13 (-) (-) (+) (+)
14 (+) (-) (+) (+)
15 (-) (+) (+) (+)
16 (+) (+) (+) (+)
17 0 0 0 0
18 0 0 0 0
19 0 0 0 0
Fonte: a autora.
4.3.6 Validação do método
O procedimento de validação foi realizado de acordo com a Decisão da
Comissão Europeia 2002/657/EC32
para métodos de resíduos de medicamentos
veterinários. Foram avaliados limite de detecção (LOD), limite de quantificação (LOQ),
CCα, CCβ, especificidade, linearidade, exatidão, precisão intra-dia e inter-dia.
A quantificação é realizada usando curvas de calibração de tipo standard
addition solvent. Amostras brancas são fortificadas com solução padrão e submetidas ao
23
processo extrativo completo. Curvas são preparadas usando o equivalente a 0,0, 0,25,
0,5, 1,0, 1,5 e 2,0 vezes o valor do LMR.
A concentração dos analitos nas amostras é calculada utilizando a equação da
reta, obtida pela injeção dos padrões da curva, plotados como a razão de áreas no eixo
das ordenadas e a razão das concentrações nominais no eixo das abscissas. As amostras
desconhecidas têm sua concentração calculada através da regressão linear, utilizando a
equação da reta obtida.
O procedimento de validação inclui a análise de 21 amostras brancas fortificadas
com solução padrão em três diferentes níveis de concentração (50%, 100% e 150% do
LMR), com a curva de calibração, três tissue standards (extrato de amostras brancas
onde é adicionado a solução padrão na concentração do LMR após processo extrativo),
amostra branca e padrão em solvente. Esse procedimento foi realizado três vezes, em
três dias diferentes. Também foram analisadas 20 amostras brancas diferentes para
avaliar a especificidade.
Para os analitos que não possuem o valor de LMR definido, foi adotada a
concentração de 500 ng g-1
como nível de validação para as matrizes leite e músculo.
Para validação de método qualitativo, a decisão da Comissão Europeia
2002/657/EC preconiza o valor de capacidade de detecção ou CCβ, que representa a
menor quantidade de substância que pode ser detectada, identificada e/ou quantificada
em uma amostra com uma probabilidade de erro aceitável de 5%32
. O procedimento de
validação no LC-qTOF-MS inclui a análise de 20 amostras brancas fortificadas com a
solução de trabalho. Para que o erro seja até 5%, o analito deve ser identificado em pelo
menos 19 das 20 amostras.
Também foi realizada a análise de 20 amostras brancas para a avaliação da
especificidade.
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 PARÂMETROS SELECIONADOS PARA ANÁLISE POR LC-MS/MS
As soluções dos padrões analíticos foram analisadas separadamente para a
otimização de ionização e de fragmentação de cada composto. A ionização por
24
eletrospray no modo positivo (ESI +) foi a que apresentou os melhores resultados para
estes compostos. Todos os analitos obtiveram resposta satisfatória de ionização no
modo positivo (ESI+) devido as suas características estruturais, e a adição de 0,1% de
ácido fórmico melhorou a sensibilidade e resolução. Selecionaram-se as duas transições
mais abundantes de cada analito. A mais intensa foi definida como quantificadora e a
segunda como confirmatória.
Após o ajuste dos parâmetros de ionização, realizou-se a otimização da fonte de
ionização (por FIA). Os resultados estão descritos na Tabela 6, juntamente com os
parâmetros utilizados no LC-qTOF-MS, descritos a seguir.
Tabela 6. Parâmetros de ionização e do analisador utilizados por LC-MS/MS e LC-
qTOF-MS.
Parâmetros LC-MS/MS LC-qTOF-MS
Ioniz
ação
ES
I +
CUR 30 psi 30 psi
GS1 55 psi 55 psi
GS2 55 psi 55 psi
TEM 600ºC 600ºC
IS 5500 eV 5500 eV
Anal
isad
or
CAD 8 psi ̶
EP 10 eV ̶
DP variável 100 eV
CE variável 20 eV
CXP variável ̶
Dwell time 50 msec ̶ CUR: gás de cortina; GS1:gás da fonte 1; GS2: gás auxiliar; TEM: temperatura; IS: voltagem do spray de
íons; CAD: gás de colisão; EP: potencial de entrada; DP: voltagem do orifício de entrada; CE: energia de
colisão; CXP: potencial de saída da célula de colisão. Fonte: a autora.
Posteriormente, foi otimizado o método de separação cromatográfica.
Inicialmente, tentou-se utilizar uma coluna de interação hidrofílica (Hypersil GOLD
HILIC, 150 × 2,1 mm, 5 µm) dado que, assim como mencionado na seção 3.5.1, as
colunas de interação hidrofílica poderiam melhorar a sensibilidade por LC-
MS/MS3,10,18,22,23,24
. Foram avaliadas diversas condições cromatográficas, variando a
25
concentração de tampão e de ácido na fase móvel, como mostra a Tabela II em
ANEXOS. Observou-se que quanto maior a concentração de tampão (acetato de
amônio) e de ácido, melhor a resolução dos picos cromatográficos. Porém, infelizmente
não se obteve sensibilidade satisfatória para as concentrações desejadas, além de
resolução inadequada dos picos cromatográficos, como se pode ver na Figura 3.
Figura 3. Cromatograma dos analitos em estudo obtido no modo SRM utilizando a
coluna HILIC.
Fonte: a autora.
Optou-se então trabalhar com uma coluna de fase reversa utilizando pareador
iônico na fase móvel. Como fase estacionária, foi utilizada uma coluna Waters XTerra
MS C18 (2,1 × 100 mm, 3,5 µm), com temperatura controlada a 40ºC, com pré-coluna
SecurityGuard (Phenomenex) C18 (4,0 × 3,0 mm, 5 μm). Foi utilizada fase móvel
binária, com fluxo de 300 µL min-1
, e o tempo total da análise de 10 minutos. A fase
móvel A foi uma solução aquosa com 10 mM de NFPA (ácido nonafluorpentanóico), e
a fase móvel B, acetonitrila com 10 mM de NFPA. O gradiente para a separação
cromatográfica otimizado consiste de uma composição inicial de 95% da fase A que
decresce linearmente até 10% em 4 minutos. Essa condição é mantida por 4 minutos e,
AMINOGLICOSÍDEOS
1.0 6.0 7.0
3.8e5
Inte
nsity, cp
s
1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0Time, min
3.8e5
Inte
nsity, c
ps
26
em seguida, cresce linearmente até 95% durante 1 minuto e se mantém nessa condição
por mais um minuto, totalizando 10 minutos de análise. O tempo de equilíbrio entre as
análises é de 4 minutos na condição inicial.
A utilização de pareador iônico é necessária devido à alta hidrofilicidade dos
aminoglicosídeos, o que dificulta a sua retenção em colunas de fase reversa
convencionais. A adição de NFPA na fase móvel auxilia na retenção dos analitos na
coluna C18 e facilita sua ionização, aumentando o sinal no MS/MS31
.
Finalmente, foram obtidos os cromatogramas no modo de aquisição SRM
definindo o tempo de retenção de cada analito, como mostra a Figura 4. As condições
de SRM para cada analito estão na Tabela 7.
Figura 4. Cromatograma dos 10 analitos em solvente analisados no modo SRM nas
condições estabelecidas no LC-MS/MS.
Fonte: a autora.
4.0 5.0 6.0 8.0 9.0
1.03e5
Inte
nsity, cp
s
4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0
Time, min
1.03e5
Inte
nsity
, cp
s,
27
Tabela 7. Estrutura e fórmula molecular dos analitos em estudo com os respectivos
parâmetros de razão m/z utilizados na análise mediante LC-MS/MS.
Estrutura molecular Fórmula
molecular
[M+H]+ ID Q3 CE (eV) CXP
(eV)
Espectinomicina
C14H24N2O7 351,0
SPC 1 333,0 23 36
SPC 2 207,0 29 22
Tobramicina
C18H37N5O9 468,2
TBR 1 163,3 31 26
TBR 2 145,0 29 16
Gentamicina
C21H43N5O7 478,2
GNT 1 157,3 30 10
GNT 2 322,4 20 10
Kanamicina
C18H36N4O11 485,2
KNM 1 163,1 33 24
KNM 2 205,2 33 16
Higromicina
C23H29NO12 528,3
HGR 1 177,1 37 26
HGR 2 352,1 29 16
28
Apramicina
C21H41N5O11 540,3
APR 1 217,2 35 24
APR 2 378,2 23 14
Estreptomicina
C21H39N7O12 582,0
STR 1 263,0 43 30
STR 2 246,0 47 26
Diidroestreptomicina
C21H41N7O12 584,0
DHSTR 1 263,0 41 28
DHSTR 2 246,0 47 26
Amicacina
C22H43N5O13 586,2
AMC 1 264,0 35 28
AMC 2 425,3 25 26
Neomicina
C23H46N6O13 615,3
NEO 1 293,1 35 16
NEO 2 323,2 31 18
ID: identificação; Q3: transição; CE: energia de colisão; CXP: potencial de saída da célula de colisão.
Fonte: a autora.
29
5.2 PARÂMETROS SELECIONADOS PARA ANÁLISE POR LC-QTOF-
MS
Durante as análises mediante LC-qTOF-MS, utilizou-se o mesmo método
cromatográfico otimizado para LC-MS/MS.
A faixa de m/z estabelecida para aquisição de dados para o espectrômetro de
massas foi de 100 a 1000 Da. Foi realizada a calibração do espectrômetro de massas
entre cada análise utilizando o calibrante APCI Positive Calibration Solution for the AB
SCIEX TripleTOF Systems de ionização no modo positivo.
A análise por LC-qTOF-MS permite alta especificidade na identificação das
substâncias por meio da caracterização da massa exata dos analitos de interesse com
quatro algarismos decimais considerando um erro de no máximo 5 ppm, além do tempo
de retenção.
Os resultados foram satisfatórios para todos os analitos em ambas as matrizes. A
Tabela 8 apresenta a faixa de m/z e os tempos de retenção de cada analito nas análises
de LC-qTOF-MS.
Tabela 8. Faixa de m/z para o espectrômetro de massas e tempo de retenção de cada
analito no LC-qTOF-MS.
Analito Faixa de m/z Tempo de
Retenção (min)
AMC 586,2906 - 586,2966 6,43
STR 582,2705 - 582,2765 6,34
DHSTR 584,2861 - 584,2921 6,35
SPC 351,1737 - 351,1797 6,20
APR 540,2851 - 540,2911 6,57
TBR 468,2640 - 468,2700 6,53
HGR 528,2300 - 528,2500 6,32
NEO 615,3171 - 615,3231 6,71
KNM 485,2429 - 485,2489 6,47 KNM: kanamicina; STR: estreptomicina; DHSTR: diidroestreptomicina; SPC: espectinomicina; AMC:
amicacina; APR: apramicina; HGR: higromicina; NEO: neomicina; TBR: tobramicina.
Fonte: a autora.
30
5.3 DETERMINAÇÃO DA SUPRESSÃO IÔNICA NO LC-MS/MS COM
IONIZAÇÃO POR ELETROSPRAY
A supressão iônica foi determinada através da infusão pós-coluna da solução de
trabalho dos analitos em solvente, simultaneamente com a análise de solvente puro e do
extrato da matriz definida como branco, através da coluna cromatográfica para avaliar
as interferências da matriz. Observou-se, para a matriz leite, uma área de supressão em
torno de 6 minutos (Figura I em ANEXOS), que poderia interferir na análise visto que o
primeiro analito tem tempo de retenção de 6,32 minutos. Esse comportamento já era
esperado dado que a desvantagem do uso de pareador iônico é justamente causar
supressão iônica. Porém, devido às características dos analitos em questão já
mencionadas anteriormente, a análise na ausência do pareador iônico torna-se inviável.
A Figura 5 apresenta a supressão iônica dos analitos NEO, SPC e TBR em relação ao
cromatograma para os dos dez analitos em estudo, na matriz leite. A NEO tem tempo de
retenção em 6,77 minutos, logo, a faixa de supressão não afeta o seu perfil
cromatográfico. A SPC tem tempo de retenção em 6,32 minutos, coincidindo com a
faixa de supressão. Já a TBR apresenta um perfil um pouco diferente que os demais,
porém, também apresenta zona de supressão entre 6 e 6,5 minutos e seu tempo de
retenção é em 6,7 minutos. Essa supressão não interferiu de forma significativa as
análises dos dez analitos em matriz.
31
Figura 5. Gráficos da supressão iônica da neomicina (NEO), espectinomicina (SPC) e
da tobramicina (TBR), comparados com o cromatograma dos dez analitos em estudo.
Fonte: a autora.
32
Para a matriz músculo também se observa uma área de supressão entre 1,5 e 2
minutos, e outra em torno dos 6 minutos, a qual é mais representativa devido aos
tempos de retenção dos analitos. Observa-se também que o comportamento do sinal foi
bem similar para as três espécies avaliadas. A Figura 6 apresenta a supressão iônica para
a DHSTR em solvente e em músculo bovino, suíno e de frango. A supressão iônica dos
demais analitos está na Figura II em ANEXOS.
Da mesma forma que para a matriz leite, essa supressão já era esperada devida a
utilização do pareador iônico e não se mostrou significante durante as análises.
Figura 6. Supressão iônica da diidroestreptomicina (DHSTR) em músculo bovino,
suíno e de frango.
Fonte: a autora.
5.4 PREPARO DE AMOSTRA
Para o preparo de amostra, utilizou-se extração por desproteinização e diferentes
procedimentos de clean up foram avaliados.
A desproteinização é comumente utilizada na extração de antibióticos em
matrizes biológicas para remover possíveis interferentes na análise, melhorando a
recuperação dos analitos em interesse. Para isso, utiliza-se geralmente solventes
orgânicos como acetonitrila ou ácidos como o ácido tricloroacético (TCA). Kaufmann et
0,00E+00
9,00E+04
0 2 4 6 8 10
SOLVENTE
BOVINO
SUINO
FRANGO
33
al indicam que a integralidade da desproteinização induzida por TCA na extração de
aminoglicosídeos nessas matrizes são critérios importantes. Concentrações abaixo de
2% produzem extratos turvos, dificultando o clean up. Já a utilização de maiores
concentrações de TCA melhoram significativamente a recuperação de alguns
aminoglicosídeos4. Para a etapa de extração, foram avaliadas diferentes concentrações
de TCA em água e acetonitrila. Foram avaliados procedimentos de clean up da amostra
como partição com hexano, dispersão em fase sólida e purificação a baixa temperatura
utilizando freezer (-20ºC) e ultrafreezer (-70ºC).
O TCA promove a desproteinização, comumente usada na extração de
antibióticos em matrizes biológicas onde a remoção de interferências é necessária,
mantendo recuperações adequadas analitos de interesse14
. Na maioria dos casos, utiliza-
se somente acetonitrila para desproteinização, porém isso não se aplica aos
aminoglicosídeos, pois devido a sua alta polaridade, necessitam da presença de água,
mesmo em baixa quantidade, para que o processo de extração seja eficiente.
O procedimento de clean up que obteve melhor resultado foi purificação a -20ºC
seguida de dispersão com C18 a granel. Uma vez escolhidas as condições iniciais, foi
realizado o planejamento fatorial descrito, no item 4.3.5.
5.4.1 Planejamento fatorial
Em um planejamento fatorial são investigadas as influências de todas as
variáveis experimentais de interesse e os efeitos de interação na resposta ou respostas.
Se a combinação de k fatores é investigada em dois níveis, um planejamento fatorial
consistirá de 2k
experimentos. Normalmente, os níveis dos fatores quantitativos são
nomeados pelos sinais – (menos) para o nível mais baixo e + (mais) para o nível mais
alto, porém o que importa é a relação inicial entre o sinal dado e o efeito obtido, não
sendo um critério definido a nomeação dos sinais. Os sinais para os efeitos de interação
de 2ª ordem e de ordem superior entre todas as variáveis do planejamento, realizando
todas as combinações possíveis, são obtidos pelo produto dos sinais originais das
variáveis envolvidas. Desta maneira, é possível construir as colunas de sinais para todas
as interações. Em muitos casos, a realização de repetições autênticas pode ser algo
inconveniente por diversas razões. Para contornar este infortúnio e obter uma boa
estimativa dos erros, um experimento é normalmente incluído no centro do
planejamento, em que o valor médio dos níveis de todas as variáveis é empregado. São
34
os conhecidos experimentos no ponto central (nível zero). Deste modo, é possível
avaliar a significância dos efeitos ou coeficientes, tanto em planejamentos de triagem
(completos ou fracionários) como em metodologias de superfície de resposta. Além
desta vantagem, recomenda-se este tipo de experimento pelas seguintes razões: o risco
de perder a relação não linear entre os intervalos é minimizado e é possível estimar um
modelo razoável e verificar se há falta de ajuste30
.
Os volumes de amostra avaliados foram 1 mL, 5 mL e 9 mL. Os volumes de
solvente extrator foram uma, duas e três vezes o volume da amostra. A concentração do
TCA foi avaliada em 5%, 10% e 15%. Por fim, o tempo de congelamento foi variado
em 20, 40 e 60 minutos.
Os resultados estão expressos na Tabela III em ANEXOS. A variável empregada
como fator de resposta foi a área do pico. Analisando os gráficos da distribuição normal
foi possível verificar que, de um modo geral, as variáveis mais significativas foram a 2
(volume do solvente extrator em relação ao volume da amostra) e a 3 (concentração de
TCA), e que elas são inversas, ou seja, uma apresenta melhor desempenho no nível -1
enquanto a outra no nível +1. Além disso, o efeito da variável 3 foi positivo em 9 dos 10
analitos, o que indica que ela deve ser utilizada no nível +1, ou seja, 15% de TCA. Já a
variável 4 (tempo de congelamento), apesar de não tão significativa para a maioria dos
analitos, se mostrou melhor no nível -1, ou seja, 20 minutos. Assim, as melhores
condições foram: 1 mL de amostra, 1 mL de solvente extrator, 15% de TCA e 20
minutos de congelamento.
Com o menor volume de amostra e o menor volume do extrator obteve-se o
melhor procedimento de extração. Esse dado é importante visto que não há nenhum
procedimento de concentração do extrato devido à inviabilidade de evaporação pela
grande quantidade de fase aquosa do procedimento, o que gera mínima quantidade de
resíduo. Já para a concentração do ácido no extrator, o melhor resultado foi com a maior
concentração (15%). Kaufmann et al. relata a necessidade de ácidos para a extração dos
analitos da matriz4. Em geral, os métodos publicados utilizam concentrações mais
baixas devido à etapa de SPE posterior à extração, onde deve haver a correção do pH
para a eluição4. Para a etapa de clean up utilizando purificação a baixa temperatura, o
menor tempo de congelamento avaliado (20 minutos) obteve melhor resposta, que é
importante quando se considera um laboratório de rotina onde há grande número de
amostras a serem analisadas no menor espaço de tempo possível.
35
Considerando que as variáveis volume do solvente extrator e a concentração de
TCA no solvente extrator foram as mais influentes, foi realizado um desenho de
composto central com quatro pontos axiais e três repetições para o ponto central,
conforme Tabela 9. A análise dos dados e modelagem matemática foi processada
utilizando o software estatístico Minitab 16 (Minitab, State College, PA, EUA) com
delineamento aleatório. A partir dos dados de área dos picos cromatográficos, foi
calculada a regressão, e, os modelos matemáticos foram validados utilizando ANOVA.
Os gráficos de contorno e de superfícies de resposta foram obtidos da mesma forma.
Como a variável 1 utiliza diferentes volumes de solvente extrator, foi feita correção pelo
fator de diluição para a análise dos dados.
Tabela 9. Variáveis e níveis empregados no delineamento de composto central e
condições experimentais codificadas.
Variáveis Axial Central axial
-1,41 -1 0 1 1,41
Variável 1:volume extrator (mL) 0,6 1 2 3 3,4
Variável 2: %TCA 3 5 10 15 17
Experimentos Variável 1 Variável 2
1 -1 -1
2 -1 1
3 1 -1
4 1 1
5 0 0
6 0 0
7 0 0
8 -1,41 0
9 0 -1,41
10 1,41 0
11 0 1,41
TCA: ácido tricloroacético.
Fonte: a autora.
As análises dos modelos para Neomicina, Apramicina e Tobramicina mostraram
adequação aos modelos propostos, ou seja, sem falta de ajuste (Lack-of-Fit) e com
coeficiente de determinação superior a 0,70 (NEO= 0,8074; APR= 0,7319; TBR=
0,7753). As interações dos fatores A e B foram excluídas dos modelos a fim de
36
melhorar sua adequação aos dados experimentais, em função da ausência de
significância estatística (α=0,05). Os componentes quadráticos dos fatores, igualmente,
não apresentaram significância, no entanto, melhoraram seus coeficientes de
determinação. Os componentes lineares dos fatores A e B apresentaram-se
estatisticamente significativos para o modelo da NEO e da TBR, exceção feita a APR
que apresentou significância estatística apenas para o fator B. A superfície de resposta e
o gráfico de contorno para esses analitos estão representados na Figura 7.
A superfície de resposta e o gráfico de contorno do modelo da NEO evidenciam
que há um ponto ótimo experimental (A=0,5-0,8; B= 0,5-1,0), sendo que o fator A e B
chegam a um platô em torno dessa região. O modelo da TBR apresentou aspectos
similares ao modelo da NEO, entretanto, com ausência do platô na região próxima ao
ótimo experimental. A despeito disso, a diluição deve ser considerada, em termos
práticos, pois a quantificação dos analitos é realizada a partir da área do pico
cromatográfico, e quanto maior a diluição realizada no processo de preparo de amostra,
menor será o sinal. Assim, apesar da região ótima ter se mostrado próxima ao nível +1
do fator A (volume de solvente extrator), foi optado por trabalhar no nível -1 para evitar
maiores diluições.
A superfície de resposta da APR evidenciou uma aproximação ao modelo linear
com clara influência do fator B (concentração de TCA). Por meio do gráfico de
contorno fica evidente que o aumento das concentrações de TCA no solvente extrator
leva a um aumento da área do sinal cromatográfico do analito em questão.
Os demais analitos, muito embora tenham apresentado adequação quando ao
parâmetro da falta de ajuste dos modelos, não obtiveram valores de coeficiente de
determinação satisfatório, ou seja, a maior variabilidade experimental não foi explicada
pelos modelos propostos. Visto que os analitos anteriormente analisados são
representativos dos demais, as conclusões obtidas a partir destes foram aplicadas a
todos.
37
Figura 7. Superfície de resposta e gráfico de contorno obtidos pelo desenho de
composto central para os analitos apramicina (APR), tobramicina (TBR) e neomicina
(NEO). Dados obtidos no software estatístico Minitab 16.
Fonte: a autora.
38
A partir dos resultados dos planejamentos fatoriais, estabeleceu-se a condição de
compromisso, ou seja, a melhor condição para analise simultânea dos 10 analitos em
estudo. A partir de 1,00 0,1 mL de leite, adiciona-se 50 µL de solução de EDTA 150
mM, homogeneíza- e mantém-se em repouso por 10 minutos. Em seguida, adiciona-se 1
mL da solução de TCA 15% em acetonitrila:água (1:1) e homogeniza-se. Após as
amostras são mantidas em mesa agitadora durante 20 minutos, e então centrifugadas por
10 minutos a 4.000 rpm. Do sobrenadante resultante, 1 mL é transferido para microtubo
de centrífuga de 1,5 mL e mantido em freezer por 20 minutos, seguido de centrifugação
por 10 minutos a 12.000 rpm. Em seguida, o sobrenadante é transferido para microtubo
de centrífuga de 1,5 mL contendo 25 mg de C18 a granel, agitadas em vórtex e
centrifugadas por 10 minutos a 12.000 rpm. Posteriormente, 500 μL são transferidos
para vial de plástico contendo 500 μL de NFPA 10 mM e 20 μL são analisados no
sistema de LC-MS/MS, conforme fluxograma na Figura 8. A Figura III em ANEXOS
mostra o pico cromatográfico com as duas transições no modo SRM para cada analito
na amostra.
Para a matriz músculo das espécies bovino, suíno e de frango utilizou-se o
mesmo procedimento de extração, porém com algumas alterações. A extração foi
realizada com 10 0,1 g de amostra e 10 mL do solvente extrator. Essa maior
quantidade de amostra é necessária para que a homogeneização no ultra-turrax fique
adequada. O procedimento de clean up não foi alterado. A Figura 9 apresenta o
fluxograma de preparo de amostra para músculo.
A utilização de EDTA é necessária porque alguns aminoglicosídeos tendem a
complexar com metais presentes na matriz24
. Mesmo concentrações relativamente
pequenas de EDTA são suficientes para melhorar a recuperação de compostos afetados4.
Todo o procedimento foi realizado em material de plástico, pois os analitos em
questão tem afinidade com vidro, devido aos vários grupos hidroxilas em suas
estruturas, podendo haver comprometimento dos mesmos.
39
Figura 8. Fluxograma do preparo de amostra para a matriz leite. Fonte: a autora.
Figura 9. Fluxograma do preparo de amostra para a matriz músculo de bovino, suíno e
frango. Fonte: a autora.
40
5.5 PARÂMETROS DE DESEMPENHO DO MÉTODO DE
QUANTIFICAÇÃO POR LC-MS/MS
De acordo com a Diretiva 2002/657/CE da Comissão Europeia, os seguintes
parâmetros foram avaliados: limite de detecção (LOD), limite de quantificação (LOQ),
linearidade, especificidade, recuperação, limite de decisão (CCα), capacidade de
detecção (CCβ), precisão intra-dia e inter-dia e exatidão32
.
5.5.1 Limite de detecção e limite de quantificação
O limite de detecção (LOD) é o resultado único e simples que, associado a uma
probabilidade, pode ser distinguido do valor de um branco adequado. O limite de
quantificação (LOQ) é a menor concentração de analito capaz de ser determinada com
um nível aceitável de precisão e veracidade33
. Os limites de detecção e de quantificação
foram determinados em matrizes brancas fortificadas com a solução de trabalho em
concentrações diluídas. Para o limite de detecção, considera-se a concentração onde a
relação sinal/ruído seja acima de 3, e para o limite de quantificação, acima de 10. Os
valores de LOD e LOQ para cada analito estão apresentados na Tabela 10.
Tabela 10. Valores de LMR e nível de validação, LOD e LOQ para cada analito para
leite e músculo bovino, suíno e de frango.
Leite Músculo bovino, suíno e de frango
Analito
LMR e
nível de
validação
(ng g-1
)
LOD
(ng g-1
)
LOQ
(ng g-1
)
LMR e
nível de
validação
(ng g-1
)
LOD
(ng g-1
)
LOQ
(ng g-1
)
GNT 100 15 25 50 5 12,5
KNM 150 15 37,5 100 15 25
STR 200 30 50 500 50 125
DHSTR 200 20 50 500 50 125
SPC 200 20 50 300 30 75
AMC 500 50 125 500 50 125
APR 500 50 125 1000 100 250
HGR 500 50 125 500 50 125
NEO 500 50 125 500 50 125
TBR 500 50 125 500 50 125 GNT: gentamicina; KNM: kanamicina; STR: estreptomicina; DHSTR: diidroestreptomicina; SPC:
espectinomicina; AMC: amicacina; APR: apramicina; HGR: higromicina; NEO: neomicina; TBR:
tobramicina. Fonte: a autora.
41
5.5.2 Linearidade
Linearidade é a capacidade de o método produzir resultados diretamente
proporcionais à concentração do analito na amostra, dentro de um intervalo
especificado, com curvas de calibração que podem ser adequadamente ajustadas pela
equação de uma reta15
.
A relação matemática utilizada para o cálculo da concentração dos analitos pode
ser obtida usando o modelo conhecido como regressão linear, determinada pelo
método dos mínimos quadrados, representada na equação da reta abaixo:
y = ax + b
Onde:
y = resposta medida (absorbância, altura ou área do pico, etc.);
x = concentração;
a = inclinação da curva de calibração – sensibilidade;
b = interseção com o eixo y, quando x = 0.
A linearidade foi definida a partir das curvas analíticas na matriz com 6 níveis de
concentração, onde o valor do LMR foi utilizado como ponto central. As equações de
reta resultantes para os analitos em leite estão sintetizadas na Tabela 11, juntamente
com o coeficiente de determinação r². As respectivas curvas estão apresentadas na
Figura IV em ANEXOS. Para análise de resíduos, o MAPA utiliza como critério interno
valores de r² superior a 0,95 para que uma equação de reta seja considerada satisfatória.
Todos os analitos apresentaram linearidade satisfatória no intervalo de trabalho
de zero a 2 vezes da concentração do LMR de cada analito em leite e em músculo
bovino, suíno e de frango.
42
Tabela 11. Equações de reta e coeficiente de determinação (r²) para cada analito em
matriz leite.
GNT: gentamicina; KNM: kanamicina; STR: estreptomicina; DHSTR: diidroestreptomicina; SPC:
espectinomicina; AMC: amicacina; APR: apramicina; HGR: higromicina; NEO: neomicina; TBR:
tobramicina.
Fonte: a autora.
5.5.3 Especificidade
A especificidade foi avaliada pela análise de 21 amostras brancas diferentes para
cada matriz a fim de avaliar a presença de possíveis interferentes da amostra. Não foi
identificado nenhum interferente nas amostras nos tempos de retenção dos analitos de
interesse.
5.5.4 Exatidão, Precisão, Limite de Decisão (CCα) e Capacidade de Detecção
(CCβ)
Os valores de exatidão, precisão, CCα e CCβ foram determinados analisando 21
amostras brancas fortificadas com solução padrão em três diferentes níveis de (50%,
100% e 150% do LMR), e em três dias diferentes.
A exatidão reflete a proximidade entre o valor medido e um valor de referência
considerado verdadeiro. A exatidão é determinada comparando a média dos valores para
cada concentração com o seu valor teórico32
. Para concentrações acima de 10 µg kg -1
,
Analito Equação da reta r²
SPC y = 243,05x + 2822,9 0,9988
TBR y = 395,98x + 20670 0,9990
GNT y = 167,8x + 1266,7 0,9980
KNM y = 429,89x + 3972,8 0,9981
HGR y = 210,39x + 5914,5 0,9973
APR y = 185,37x + 4935,1 0,9988
STR y = 78,271x + 160,76 0,9987
DHSTR y = 740,93x + 4012,1 0,9995
AMC y = 98,01x + 1222,3 0,9990
NEO y = 97,098x + 3610,7 0,9969
43
são aceitos valores de recuperação dentro do intervalo de -20% a +10% da concentração
teórica32
. Os resultados foram satisfatórios para todos os analitos nas matrizes validadas.
De acordo com a Diretiva 657/CE/2002, a precisão do método é o grau de
concordância entre resultados de ensaios independentes calculados sob a forma de
coeficiente de variação (CV) 32
. A repetibilidade é o resultado de ensaios independentes
do mesmo método, com o mesmo material de ensaio, no mesmo laboratório, realizado
pelo mesmo operador e utilizando o mesmo equipamento em um mesmo dia. A precisão
intra-dia relaciona os resultados de diferentes replicatas obtidos em um mesmo dia de
análise, e a precisão inter-dia relaciona os resultados obtidos em dias diferentes32
. O
critério utilizado foi a equação de Horwitz, um parâmetro de desempenho normalizado
indicando a aceitabilidade dos métodos de análise no que diz respeito à precisão, ou
seja, o valor de CV máximo aceitável para a concentração teórica.
Para precisão intra-dia, a equação de Horwitz é definida como CV = 2(1 – 0,5 log C)
,
onde C é a concentração teórica34
. A precisão inter-dia é calculada pelo CV intra-dia
multiplicado por 1,5.
A Tabela 12 apresenta os valores máximos de CV em porcentagem estabelecidos
pela equação de Horwitz para as concentrações utilizadas neste trabalho.
Tabela 12. Valores máximos de coeficiente de variação (CV) inter-dia e intra-dia de
acordo com a concentração teórica dos analitos determinados através da equação de
Horwitz.
Concentração
(ng mL-1
)
CV inter-dia
(% máx)
CV intra-dia
(% máx)
25 27,9 18,6
50 25,1 16,7
75 23,6 15,8
100 22,6 15,1
150 21,3 14,2
200 20,4 13,6
250 19,7 13,1
300 19,2 12,8
500 17,8 11,8
750 16,7 11,1
1000 16,0 10,7
1500 15,1 10,1
Fonte: a autora.
44
Os valores calculados estão de acordo para todos os analitos em todas as
matrizes, exceto para a GNT na matriz músculo de frango, em que o CV intra-dia foi de
19,7% na concentração de 50 ng g-1
, enquanto o máximo aceitável segundo a equação
de Horwitz para essa concentração é de 16,7%. Pode-se observar que em alguns casos a
variação foi maior nas análises intra-dia comparado às inter-dia, que teoricamente
seriam maiores, considerando os fatores como variações de temperatura e até mesmo
pequenas variações intrínsecas ao processo de preparo de amostra e análise
instrumental.
O Limite de Decisão (CCα) e Capacidade de Detecção (CCβ) são parâmetros
definidos na Decisão 2002/657/CE que medem o desempenho do procedimento
analítico, levando em consideração a incerteza da medição no nível de concentração no
chamado nível de interesse. CCα significa o limite a partir do qual se pode concluir com
uma probabilidade de erro α que uma amostra é não conforme. CCβ significa o menor
teor de substância que pode ser detectado, identificado e/ou quantificado numa amostra
com uma probabilidade de erro de β. No caso de substâncias com LMR já estabelecido,
a capacidade de detecção é a concentração à qual o método é capaz de detectar
concentrações no LMR com uma certeza estatística de 1 – β. Para substâncias
permitidas, o valor de α e de β é 5%32
.
A incerteza global foi determinada pela metodologia Top-Down, que consiste em
usar a incerteza de reprodutibilidade, obtida em ensaios colaborativos, ou a incerteza de
precisão intermediária (reprodutibilidade intralaboratorial), obtida em estudo de
validação interna, ou ainda de dados de controle de qualidade de longo prazo, como
uma estimação da incerteza do resultado analítico15
. É uma expressão superestimada,
que não discrimina as contribuições gerais e o erro de reprodutibilidade intralaboratorial
do método. Não existe um valor máximo permitido, porém, quanto maior esse valor,
maior a incerteza do método. Os valores de CCα desse trabalho foram satisfatórios,
resultando em incerteza em torno de 13% para leite, 19% para músculo bovino, 15%
para frango e 8% para suíno. Os resultados estão expostos na Tabela 13 para leite,
Tabela 14 para músculo bovino e Tabela 15 para músculo de frango e suíno.
No caso de procedimento analítico já validado, pode ser realizada a extensão de
escopo incluindo novo analito ou matriz. Para a inclusão de nova matriz, os seguintes
estudos devem ser apresentados: linearidade; seletividade, exatidão, recuperação e
precisão, de forma a comprovar que a inclusão de nova matriz não altera o desempenho
45
do método. A determinação de CCα e CCβ deve ser também refeita para a nova
combinação matriz-analito15
.
5.5.5 Recuperação
A recuperação foi determinada considerando a concentração de cada analito no
LMR. O cálculo é feito utilizando o sinal de cada pico do analito, pela comparação entre
amostras de tipo padrão de tecido (do inglês: tissue standard (TS)), considerado como
100% e as amostras com adição de padrão antes da extração (R). Os cálculos foram
realizados de acordo com a seguinte equação:
Recuperação (%) = R / TS × 100
Os resultados de recuperação estão incluídos na Tabela 13 para leite, Tabela 14
para músculo bovino e Tabela 15 para músculo de frango e suíno.
Os valores de recuperação foram satisfatórios, especialmente para a matriz leite,
com valores acima de 85%. Para músculo, os valores foram acima de 56% para bovino
e 54,5% para suíno, no entanto, para alguns analitos os resultados foram ainda
melhores, passando de 90% de recuperação. Os resultados para músculo de frango
foram os que obtiveram menores recuperações, com uma média de 40%.
5.5.6 Extensão de escopo
Após a validação do método para a matriz músculo bovino, foi feita a inclusão
de músculo de frango e suíno. De acordo com o Guia de Validação e Controle de
Qualidade Analítica do MAPA, não é necessário realizar todo o processo de validação
novamente15
. Para cada espécie a ser incluída, é feita uma análise que consiste na curva
analítica, vinte replicadas da amostra fortificadas na concentração do LMR e três TS. A
partir disto, é possível determinar a precisão através do CV, a recuperação e os valores
de CCα e CCβ para cada espécie15
. Também é realizada a análise de vinte amostras
brancas a fim de avaliar a seletividade para essas matrizes. Os resultados estão expostos
na Tabela 15.
46
Tabela 13. Valores determinados para a matriz leite de exatidão, CV intra-dia, CV
inter-dia, recuperação, CCα e CCβ para cada analito nos três níveis de fortificação (50,
100 e 150 LMR) em três dias.
Analito
Nível de
Fortificação
ng g-1
Exatidão
%
CV intra-
dia%
CV inter-
dia%
Recuperação
%
CCα
ng g-1
Incerteza
%
CCβ
ng g-1
100,0 108,3 6,9 0,9
SPC 200,0 102,2 4,9 8,3 88,0 230,8 15,4 261,7
300,0 101,1 3,2 8,2
250,0 104,8 6,1 1,2
TBR 500,0 106,1 4,1 7,5 95,0 564,2 12,8 628,5
750,0 104,8 4,8 5,2
50,0 105,9 9,9 4,3
GNT 100,0 112,5 6,0 11,1 87,0 118,9 18,9 137,9
150,0 104,0 6,6 4,8
75,0 105,3 6,0 1,4
KNM 150,0 105,1 4,0 6,7 92,0 167,4 11,6 184,7
225,0 104,7 4,2 4,7
250,0 106,3 5,0 1,2
HGR 500,0 103,4 5,5 6,2 87,0 565,0 13,0 630,0
750,0 101,8 4,8 5,1
250,0 105,6 5,7 1,6
APR 500,0 104,0 4,6 4,7 94,0 546,2 9,2 592,5
750,0 102,6 3,7 1,8
100,0 105,3 6,8 2,3
STR 200,0 101,8 4,9 5,4 89,0 226,4 13,2 252,7
300,0 100,1 4,3 6,2
100,0 105,9 5,1 1,3
DHSTR 200,0 102,6 4,7 4,7 91,0 225,6 12,8 251,3
300,0 100,6 4,2 6,5
250,0 107,5 6,1 1,4
AMC 500,0 102,1 4,5 5,1 91,0 560,1 12,0 620,2
750,0 101,8 3,8 5,8
250,0 106,9 7,6 4,3
NEO 500,0 108,0 6,0 8,3 93,0 571,6 14,3 643,1
750,0 100,7 2,7 4,7 GNT: gentamicina; KNM: kanamicina; STR: estreptomicina; DHSTR: diidroestreptomicina; SPC:
espectinomicina; AMC: amicacina; APR: apramicina; HGR: higromicina; NEO: neomicina; TBR:
tobramicina. Fonte: a autora.
47
Tabela 14. Valores determinados para a matriz músculo bovino de exatidão, CV intra-
dia, CV inter-dia, recuperação, CCα e CCβ para cada analito nos três níveis de
fortificação (50, 100 e 150 LMR) em três dias.
Analito
Nível de
Fortificação
ng g-1
Exatidão
%
CV intra-
dia%
CV inter-
dia%
Recuperação
%
CCα
ng g-1
Incerteza
%
CCβ
ng g-1
150 115,2 8,9 20,2
SPC 300 98,8 4,1 10,5 69,0 400,8 33,6 501,6
450 98,0 3,0 14,3
250 112,0 7,4 2,3
TBR 500 105,0 3,8 3,7 84,0 577,5 15,5 655,0
750 107,6 2,6 6,1
25 109,0 7,1 3,6
GNT 50 103,7 4,7 6,0 64,3 62,4 24,8 74,9
75 100,8 10,1 4,8
50 107,4 5,5 5,4
KNM 100 100,0 5,8 2,3 57,0 129,3 29,3 158,6
150 104,8 2,2 4,3
250 109,8 4,8 3,3
HGR 500 100,4 4,4 1,8 69,0 587,1 17,4 674,2
750 103,1 1,9 1,4
500 111,2 6,1 4,9
APR 1000 103,4 4,4 1,0 91,0 1187,0 18,7 1374,1
1500 105,8 2,7 4,0
250 109,0 8,8 2,0
STR 500 101,2 4,9 1,5 59,0 592,0 18,4 684,0
750 103,6 3,2 3,0
250 111,5 5,5 3,4
DHSTR 500 102,3 4,2 1,1 81,0 590,1 18,0 680,2
750 104,1 2,8 2,7
250 107,0 6,1 7,0
AMC 500 101,3 3,9 4,8 56,0 563,4 12,7 626,9
750 106,3 3,1 4,6
250 120,5 10,2 10,0
NEO 500 112,3 6,8 6,0 57,0 610,9 22,18 721,8
750 118,1 9,3 4,4 GNT: gentamicina; KNM: kanamicina; STR: estreptomicina; DHSTR: diidroestreptomicina; SPC:
espectinomicina; AMC: amicacina; APR: apramicina; HGR: higromicina; NEO: neomicina; TBR:
tobramicina.
Fonte: a autora.
48
Tabela 15. Valores determinados para a matriz músculo de frango e suíno de CV,
recuperação, CCα e CCβ para cada analito determinados na extensão de escopo.
MÚSCULO DE FRANGO
Analito
Nível de
Fortificação
ng g-1
CV
%
Recuperação
%
CCα
ng g-1
Incerteza
%
CCβ
ng g-1
SPC 300 10,0 40,7 345,5 15,2 300,0
TBR 500 8,1 37,2 564,6 12,9 629,3
GNT 50 19,7 37,1 68,6 37,2 87,2
KNM 100 8,3 36,8 114,0 14,0 128,1
HGR 500 4,3 45,0 538,1 7,6 576,2
APR 1000 5,7 39,6 1099,2 9,9 1198,5
STR 500 12,1 41,5 605,2 21,0 710,3
DHSTR 500 10,0 41,4 586,1 17,2 672,2
AMC 500 5,7 44,2 549,1 9,8 598,3
NEO 500 6,9 38,3 563,1 12,6 626,1
MÚSCULO SUÍNO
Analito
Nível de
Fortificação
ng g-1
CV
%
Recuperação
%
CCα
ng g-1
Incerteza
%
CCβ
ng g-1
SPC 300 3,7 98,0 318,7 6,2 337,4
TBR 500 4,9 71,7 541,2 8,2 582,4
GNT 50 5,3 90,5 54,6 9,1 59,1
KNM 100 5,6 67,0 110,2 10,2 120,5
HGR 500 3,6 89,6 531,2 6,2 562,5
APR 1000 4,2 78,7 1069,4 6,9 1138,7
STR 500 3,5 76,3 530,4 6,1 560,9
DHSTR 500 3,3 97,1 528,5 5,7 557,0
AMC 500 5,3 54,5 547,3 9,5 594,6
NEO 500 6,8 58,6 556,8 11,4 613,7 GNT: gentamicina; KNM: kanamicina; STR: estreptomicina; DHSTR: diidroestreptomicina; SPC:
espectinomicina; AMC: amicacina; APR: apramicina; HGR: higromicina; NEO: neomicina; TBR:
tobramicina.
Fonte: a autora.
5.6 PARÂMETROS DE DESEMPENHO DO MÉTODO QUALITATIVO
POR LC-QTOF-MS
De acordo com a Diretiva 657/CE/2002, os parâmetros de validação para
métodos qualitativos são CCβ e seletividade. O CCβ representa a menor quantidade de
49
substância que pode ser detectada, identificada e/ou quantificada em uma amostra com
uma probabilidade de erro aceitável de 5%32
.
Para a determinação do CCβ, vinte amostras brancas foram fortificadas com a
solução de trabalho em diferentes concentrações para cada analito e analisadas pelo
mesmo método de extração descrito anteriormente. Foi verificada a presença de sinal no
tempo de retenção através da detecção da massa exata de cada analito, tendo-se um erro
aceitável de no máximo uma a cada vinte análises. A razão sinal-ruído do pico
cromatográfico deve ser maior que três. A Tabela 16 resume os valores de CCβ de cada
analito obtidos para as matrizes leite, músculo bovino, suíno e de frango, e a Figura 10
mostra o pico cromatográfico de cada analito na matriz leite considerando a faixa de
massa estabelecida. Os resultados foram satisfatórios para todos os analitos nas
concentrações de 25% de seus LMRs, exceto a gentamicina, pois não foi possível
detectá-la.
A avaliação da seletividade do método foi realizada pela análise de 20 amostras
brancas. Não foram identificados interferentes que pudessem contribuir com erro nos
procedimentos de identificação dos analitos.
Tabela 16. Valores CCβ em relação ao LMR para cada analito nas matrizes leite e
músculo (bovino, suíno e de frango).
Leite Músculo bovino,
suíno e de frango
Analito LMR
(ng g-1
)
CCβ
(ng g-1
)
LMR
(ng g-1
)
CCβ
(ng g-1
)
KNM 150 37,5 100 25
STR 200 50 500 125
DHSTR 200 50 500 125
SPC 200 50 300 75
AMC 500 125 500 125
APR 500 125 1000 250
HGR 500 125 500 125
NEO 500 125 500 125
TBR 500 125 500 125 KNM: kanamicina; STR: estreptomicina; DHSTR: diidroestreptomicina; SPC: espectinomicina; AMC:
amicacina; APR: apramicina; HGR: higromicina; NEO: neomicina; TBR: tobramicina.
Fonte: a autora.
50
Figura 10. Cromatograma no LC-qTOF-MS dos analitos em leite na concentração do
CCβ, considerando as faixas de massa estipuladas e seus tempos de retenção.
KNM: kanamicina; STR: estreptomicina; DHSTR: diidroestreptomicina; SPC: espectinomicina; AMC:
amicacina; APR: apramicina; HGR: higromicina; NEO: neomicina; TBR: tobramicina.
Fonte: a autora.
6 AVALIAÇÃO DE CUSTOS
Elaborou-se uma estimativa de custos para a realização de análise de 100 amostras
de músculo, considerando mais 15 amostras controles, comparando o método proposto
neste trabalho com o método proposto por Kaufmann et al4, onde é utilizado clean up
por SPE. As quantidades e os valores estimados estão expressos na Tabela 17. Pode-se
observar que o método aqui proposto, onde se procurou uma alternativa à SPE, torna-se
muito mais em conta no ponto de vista financeiro, além de todos os aspectos
relacionados ao tempo de análise e geração de resíduos, pois se considerarmos a análise
de 50 amostras por dia, o consumo médio de solventes é de 5 mL por análise de leite e
15 mL por análise de músculo e o tempo de análise é de aproximadamente 15 horas,
51
considerando o tempo de preparo de amostra (aproximadamente 3 horas) e análise
instrumental (10 min de análise mais 4 min de equilíbrio por cada análise).
Tabela 17. Estimativa de custo considerando a análise de 100 amostras de músculo,
comparando com método publicado por Kaufmann et al.
Método proposto neste trabalho Método proposto por Kaufmann et al.
Item Quantidade Valor (R$) Item Quantidade Valor (R$)
acetonitrila 750 mL 36,00 Acetonitrila 4000 mL 192,00
TCA 165 g 122,00 TCA 60 g 45,00
Eppendorf 230 ud 9,20 OASIS MCX 115 ud 4000,00
C18 a
granel 2,9 g 1,83 HFBA 2 mL 55,60
NFPA 800 µL 42,00
Total 211,03 Total 4292,60 Fonte: a autora.
7 CONCLUSÕES
O desenvolvimento de métodos analíticos para determinação de resíduos em
alimentos é de extrema importância para garantir a segurança alimentar ao consumidor.
A determinação de níveis de antibióticos em alimentos, incluindo a classe de
aminoglicosídeos, é uma prioridade e, portanto, o desenvolvimento de métodos cada vez
mais rápidos, confiáveis e sensíveis para sua extração e posterior análise qualitativa e
quantitativa é de grande interesse, já que se encontram em concentrações ínfimas nas
matrizes.
Em relação aos resultados deste trabalho, os objetivos geral e específicos foram
alcançados, pois o método de preparo de amostra proposto apresentou-se adequado para
os parâmetros avaliados, sendo de fácil e rápida execução utilizando pouco volume de
solvente sendo adequado para análise de rotina de um número considerável de amostras
diárias (n ± 50/dia). A realização de um planejamento fatorial permitiu a otimização de
forma eficiente do processo de preparo de amostra. A análise por LC-MS/MS no modo
SRM permitiu a identificação e quantificação dos compostos, sendo uma ferramenta de
análise extremamente sensível e confiável. O screening por LC-qTOF-MS apresentou
52
resultados satisfatórios considerando a razão sinal/ruído para os analitos em matriz na
concentração de 25% de seus LMRs. Além disso, permite adicionar outros compostos
similares futuramente, sendo uma ferramenta útil para análises de rotina,
proporcionando diminuição na quantidade de amostra e aumento da capacidade
laboratorial.
Os métodos desenvolvidos e validados aqui serão implementados no escopo de
análises do PNCRC animal/MAPA, pelo LANAGRO/RS.
53
8 REFERÊNCIAS
1. LEHOTAY, S., MASTOVSKA, K., LIGHTFIELD, A., NUNEZ, A., DUTKO,
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58
ANEXOS
Tabela I. Condições empregadas nos diferentes métodos de extração/clean up e técnicas cromatográficas publicadas
até o presente momento para diferentes aminoglicosídeos em matrizes de origem animal.
Analito Matriz Extração / clean-up Técnica
instrumental
Coluna
Analítica Referência
SPC, STP, DHSTP, AMC,
KNM, PRM, APR, TBR, SSM,
NEO, GNT
rim, fígado,músculo
(bovino), peixe
extração com TCA
seguida de SPE de troca
iônica
UPLC-MS/MS Kinetex C-18 (2.1 mm
x150 mm x2.6 um) 4
SPC, STP, DHSTP, AMC,
KNM, PRM, APR, TBR, GNT
C1,C2 C1a, NEO, HGR
músculo, fígado e rim (suíno
e de frango), mel, leite
bovino
extração com TCA
seguida de SPE LC-ESI-MS/MS
Capcell Pak C18 UG120
(150mm x2.0mm x 5 um) 11
SPC, STP, DHSTP, AMC,
KAN, PRM, APR, TBR, GNT
C1, NEO, HGR, RIB, KAS,
SSM, NET
músculo, fígado (suíno,
bovino e de frango), rim
(bovino e suíno), leite bovino
e ovos
extração com tampão
fosfato seguida de SPE de
troca iônica
LC-MS/MS
CAPCELL PAK ST
(150mm x 2.0 mm x 3
um)
17
STP, DHSTP leite extração com TCA
seguido de SPE LC-ESI-MS/MS
IPC (X Terra MS C18
50mm x2.1mm, 5 um)
HILIC (HILIC Fortis
100mm x3.0mm, 3um)
10
Multiclasses incluindo SPC,
STP, DHSTP músculo de frango LLE LC-ESI-MS/MS
HILIC (ZIC–HILIC
2.1mm x100mm, 3.5 um) 3
Multiclasses incluindo SPC, STP, NEO, GNT, KNM, AMC
músculo bovino LLE LC-ESI-MS/MS ZIC-HILIC (50mm 2.1
mm, 5 um) 6
GNT, NEO frutos do mar SPE LC-ESI-MS/MS C18 20
59
Multiclasses incluindo KNM,
JSM, NEO músculo de frango LLE
Cromatografia de fluxo
turbulento e LC-ESI-
MS/MS
Turbo Flow TM 2
DHSTP, GNT, NEO músculo, rim e fígado de
vitela online SPE LC-ESI-MS/MS Nucleosil C18 25
SPC: espectinomicina; STP: estreptomicina; DHSTP: diidroestreptomicina; AMC: amicacina; KNM: kanamicina; PRM:paramomicina; APR: apramicina, TBR: tobramicina; SSM: sisomicina; NEO: neomicina; GNT: gentamicina; HGR: higromicina; RIB:
ribostamicina; KAS: kasugamicina; NET: netilmicina; DTM: destomicina; JSM: josamicina.
Fonte: a autora.
60
Tabela II. Condições cromatográficas avaliadas neste trabalho.
Condição Coluna FM Gradiente Obs.
A B tempo %B
Hypersil GOLD HILIC, 150 × 2,1 mm,
5 µm
Formiato de amônio 10 mM + 0,1%
ácido fórmico
Acetonitrila + Formiato de amônio
10 mM (10% H2O) + 0,1% ácido
fórmico
6 95 Não reteve todos os
analitos. 1 4 20
10 20
Hypersil GOLD HILIC, 150 × 2,1 mm,
5 µm
Acetato de amônio 10 mM + 0,1%
ácido acético
Acetonitrila + Acetato de amônio
10 mM (10% H2O) + 0,1% ácido
acético
6 95 Não reteve todos os
analitos. 2 4 20
10 20
Hypersil GOLD HILIC, 150 × 2,1 mm,
5 µm
Acetato de amônio 10 mM +1%
ácido acético
Acetonitrila + Acetato de amônio
10 mM (10% H2O) + 1% ácido
acético
6 95 Sem separação entre
os picos, picos com
caudas.
3 4 20
10 20
Hypersil GOLD HILIC, 150 × 2,1 mm,
5 µm
Acetato de amônio 5 mM + 1%
ácido acético
Acetonitrila + Acetato de amônio 5
mM (10% H2O) + 1% ácido acético
6 95 Menor sensibilidade
comparado à
condição 3.
4 4 20
10 20
Hypersil GOLD HILIC, 150 × 2,1 mm,
5 µm
Acetato de amônio 15 mM +1%
ácido acético
Acetonitrila + Acetato de amônio
15 mM (10% H2O) + 1% ácido
acético
6 95 Não houve melhora
em relação à
condição 3.
5 4 20
10 20
Hypersil GOLD HILIC, 150 × 2,1 mm,
5 µm
Acetato de amônio 50 mM +1%
ácido acético
Acetonitrila + Acetato de amônio
50 mM (10% H2O) + 1% ácido acético
6 95 Melhora dos
formatos dos picos.
Sem separação entre eles.
6 4 20
10 20
Hypersil GOLD HILIC, 150 × 2,1 mm,
5 µm
Acetato de amônio 100 mM + 1%
ácido acético
Acetonitrila + Acetato de amônio
100 mM (10% H2O) + 1% ácido
acético
6 95 Aumento de
sensibilidade e leve
separação entre os
picos.
7 4 20
10 20
Hypersil GOLD HILIC, 150 × 2,1 mm,
5 µm
Acetato de amônio 100 mM + 1%
ácido acético Acetonitrila +1% ácido acético
6 95
Baixa resolução. 8 4 20
10 20
Hypersil GOLD HILIC, 150 × 2,1 mm,
5 µm
Formiato de amônio 100 mM + 1%
ácido fórmico
Acetonitrila +Formiato de amônio
10 mM + 1% ácido fórmico
6 95
Picos com caudas. 9 4 20
10 20
Hypersil GOLD HILIC, 150 × 2,1 mm, Formiato de amônio 150 mM + 1% Acetonitrila +Formiato de amônio 6 95 Melhor em relação à
61
10 5 µm ácido fórmico 10 mM + 1% ácido fórmico 4 20 condição 9.
10 20
Hypersil GOLD HILIC, 150 × 2,1 mm,
5 µm
Acetato de amônio 150 mM + 1,5%
ácido fórmico
Acetonitrila + Acetato de amônio
100 mM (10% H2O) + 1% ácido
fórmico
6 95 Aumento de
sensibilidade e leve
separação entre os
picos.
11 4 20
10 20
Hypersil GOLD HILIC, 150 × 2,1 mm,
5 µm
Acetato de amônio 250 mM + 1,5%
ácido fórmico Acetonitrila +0,2% ácido fórmico
6 95 Sem melhoria.
Sensibilidade ainda
insuficiente.
12 4 20
10 20
Kinetex HILIC 100A 100 × 2,1 mm, 2,6
µm
Acetato de amônio 250 mM + 1,5%
ácido fórmico Acetonitrila +0,2% ácido fórmico
6 95
Sem melhoria. 13 4 20
10 20
14 Waters XTerra MS C18 2,1 × 100 mm,
3,5 µm NFPA 10 mM Acetonitrila + NFPA 10 mM
4 5 Melhor condição
avaliada. Separação
dos picos
cromatográficos,
melhor resolução dos picos e maior
sensibilidade.
4 90 8 90 9 5
10 5
Fonte: a autora.
62
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
SPC
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
APR
0,00E+00
1,00E+04
2,00E+04
3,00E+04
4,00E+04
5,00E+04
6,00E+04
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
TBR
-100
0
100
200
300
400
500
600
700
800
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
STR
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
GNT
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
DHSTR
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
KNM
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
AMC
63
Legenda: Matriz Solvente
Figura I. Supressão iônica em solvente e em extrato branco de leite para
cada analito. GNT: gentamicina; KNM: kanamicina; STR: estreptomicina; DHSTR: diidroestreptomicina;
SPC: espectinomicina; AMC: amicacina; APR: apramicina; HGR: higromicina; NEO:
neomicina; TBR: tobramicina.
Fonte: a autora.
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
HGR
-1000
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
NEO
64
0,00E+00
1,00E+04
2,00E+04
3,00E+04
4,00E+04
5,00E+04
6,00E+04
0 2 4 6 8 10
SOLVENTE
BOVINO
SUINO
FRANGO
SPC
0,00E+00
1,00E+04
2,00E+04
3,00E+04
4,00E+04
5,00E+04
6,00E+04
7,00E+04
0 2 4 6 8 10
SOLVENTE
BOVINO
SUINO
FRANGO
TBR
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0 2 4 6 8 10
SOLVENTE
BOVINO
SUINO
FRANGO
GNT
65
0
5000
10000
15000
20000
25000
0 2 4 6 8 10
SOLVENTE
BOVINO
SUINO
FRANGO
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
0 2 4 6 8 10
SOLVENTE
BOVINO
SUINO
FRANGO
0,00E+00
1,00E+04
2,00E+04
3,00E+04
4,00E+04
5,00E+04
6,00E+04
0 2 4 6 8 10
SOLVENTE
BOVINO
SUINO
FRANGO
KNM
HGR
APR
66
Figura II. Supressão iônica em solvente e em extrato branco de músculo bovino,
suíno e de frango para cada analito. GNT: gentamicina; KNM: kanamicina; STR:
estreptomicina; SPC: espectinomicina; AMC: amicacina; APR: apramicina; HGR: higromicina; NEO:
neomicina; TBR: tobramicina. Fonte: a autora.
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0 2 4 6 8 10
SOLVENTE
BOVINO
SUINO
FRANGO
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
0 2 4 6 8 10
SOLVENTE
BOVINO
SUINO
FRANGO
AMC
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000
50000
0 2 4 6 8 10
SOLVENTE
BOVINO
SUINO
FRANGO
STR
NEO
67
Tabela III. Resultados do experimento fatorial para o procedimento de
preparo da amostra para cada analito.
Identificação:
Respostas Estimadas Erro t ( 2 ) p
Ensaio X1 X2 X3 X4 y ŷ SG Média 174489 ± 1277,333 136,6 5E-05
1 -1 -1 -1 -1 2,36E+05 245952,0 1 162,5 ± 2783,882 0,058 0,9588
2 1 -1 -1 -1 2,80E+05 260864,5 SG 2 -97837,5 ± 2783,882 35,14 0,0008
3 -1 1 -1 -1 1,51E+05 131864,5 SG 3 21587,5 ± 2783,882 7,754 0,0162
4 1 1 -1 -1 1,18E+05 127952,0 SG 4 -41087,5 ± 2783,882 14,76 0,0046
5 -1 -1 1 -1 2,73E+05 253864,5 SG 12 -33337,5 ± 2783,882 11,98 0,0069
6 1 -1 1 -1 2,52E+05 261952,0 SG 13 -13412,5 ± 2783,882 4,818 0,0405
7 -1 1 1 -1 1,63E+05 172952,0 SG 14 12412,5 ± 2783,882 4,459 0,0468
8 1 1 1 -1 1,24E+05 104864,5 SG 23 -19412,5 ± 2783,882 6,973 0,02
9 -1 -1 -1 1 1,03E+05 112952,0 SG 24 23412,5 ± 2783,882 8,41 0,0138
10 1 -1 -1 1 2,11E+05 191864,5 SG 34 14837,5 ± 2783,882 5,33 0,0334
11 -1 1 -1 1 1,56E+05 136864,5 124 -9587,5 ± 2783,882 3,444 0,075
12 1 1 -1 1 9,13E+04 101252,0 134 4337,5 ± 2783,882 1,558 0,2595
13 -1 -1 1 1 2,33E+05 213864,5 SG 234 -21662,5 ± 2783,882 7,781 0,0161
14 1 -1 1 1 2,36E+05 245952,0 SG 1234 14337,5 ± 2783,882 5,15 0,0357
15 -1 1 1 1 1,17E+05 126952,0 0,05
16 1 1 1 1 1,21E+05 101864,5
17 0 0 0 0 1,45E+05 174489,5
18 0 0 0 0 1,49E+05 174489,5 50 50
19 0 0 0 0 1,56E+05 174489,5
20 0 0 0 0 n° de parâmetros (p) 15
21 0 0 0 0 n° total de observações (n) 19
n° de níveis (m) 17
0,05
FV SQ nGL MQ Fcalc. p
Regressão 6E+10 14 4,31E+09 3,092 0,142417
Resíduos 6E+09 4 1,4E+09
F. Ajuste 6E+09 2 2,76E+09 89,05 SG 0,011105
Erro Puro 6E+07 2 31000000
Total 7E+10 18
% variação explicada 91,54
% máx. de variação explicável 99,91
Apramicina
Planejamento Fatorial Completo 24 com Ponto Central
Todas as Interações
Análise de Variância - Modelo Linear
16/10/2014
Efeitos
Data:
Planejamento
Parâmetros para a ANOVA
Nível de significância (α)
Nível de significância (α)
1
2
3
4 12
13
14
23
24
34
124 134
234
1234
-2
-1,5
-1
-0,5
0
0,5
1
1,5
2
-120000 -80000 -40000 0 40000
Val
or
no
rmal
esp
erad
o
Efeitos
Gráfico de Probabilidade Normal
68
Identificação:
Respostas Estimadas Erro t ( 2 ) p
Ensaio X1 X2 X3 X4 y ŷ SG Média 120842,1 ± 606,97698 199,09 3E-05
1 -1 -1 -1 -1 1,37E+05 145179,6 1 -2100 ± 1322,8757 1,5875 0,2533
2 1 -1 -1 -1 1,47E+05 134754,6 SG 2 -71800 ± 1322,8757 54,276 0,0003
3 -1 1 -1 -1 7,81E+04 65854,6 SG 3 35675 ± 1322,8757 26,968 0,0014
4 1 1 -1 -1 6,86E+04 76779,6 SG 4 -6625 ± 1322,8757 5,008 0,0376
5 -1 -1 1 -1 2,05E+05 192754,6 SG 12 -22050 ± 1322,8757 16,668 0,0036
6 1 -1 1 -1 1,81E+05 189179,6 SG 13 -11525 ± 1322,8757 8,7121 0,0129
7 -1 1 1 -1 1,09E+05 117179,6 SG 14 10075 ± 1322,8757 7,616 0,0168
8 1 1 1 -1 8,38E+04 71554,6 SG 23 -22775 ± 1322,8757 17,216 0,0034
9 -1 -1 -1 1 7,02E+04 78379,6 SG 24 10825 ± 1322,8757 8,1829 0,0146
10 1 -1 -1 1 1,64E+05 151754,6 34 -1350 ± 1322,8757 1,0205 0,4148
11 -1 1 -1 1 1,16E+05 103754,6 SG 124 -16875 ± 1322,8757 12,756 0,0061
12 1 1 -1 1 5,94E+04 67579,6 134 900 ± 1322,8757 0,6803 0,5665
13 -1 -1 1 1 1,83E+05 170754,6 SG 234 -8800 ± 1322,8757 6,6522 0,0219
14 1 -1 1 1 1,83E+05 191179,6 SG 1234 15850 ± 1322,8757 11,981 0,0069
15 -1 1 1 1 9,31E+04 101279,6 0,05
16 1 1 1 1 8,78E+04 75554,6
17 0 0 0 0 1,08E+05 120842,1
18 0 0 0 0 1,09E+05 120842,1 50 50
19 0 0 0 0 1,13E+05 120842,1
20 0 0 0 0 n° de parâmetros (p) 15
21 0 0 0 0 n° total de observações (n) 19
n° de níveis (m) 17
0,05
FV SQ nGL MQ Fcalc. p
Regressão 3E+10 14 2,414E+09 4,5947 0,0758111
Resíduos 2E+09 4 525374704
F. Ajuste 2E+09 2 1,044E+09 149,11 SG 0,0066619
Erro Puro 1E+07 2 7000000
Total 4E+10 18
% variação explicada 94,146
% máx. de variação explicável 99,961
Amicacina
Planejamento Fatorial Completo 24 com Ponto Central
Todas as Interações
Análise de Variância - Modelo Linear
17/10/2014
Efeitos
Data:
Planejamento
Parâmetros para a ANOVA
Nível de significância (α)
Nível de significância (α)
1
2
3
4
12
13
14
23
24
34
124
134
234
1234
-2
-1,5
-1
-0,5
0
0,5
1
1,5
2
-80000 -60000 -40000 -20000 0 20000 40000 60000
Val
or
no
rmal
esp
erad
o
Efeitos
Gráfico de Probabilidade Normal
69
Identificação:
Respostas Estimadas Erro t ( 2 ) p
Ensaio X1 X2 X3 X4 y ŷ SG Média 159731,6 ± 2558,0969 62,442 0,0003
1 -1 -1 -1 -1 1,93E+05 203219,1 1 -7837,5 ± 5575,2429 1,4058 0,295
2 1 -1 -1 -1 1,97E+05 180631,6 SG 2 -107637,5 ± 5575,2429 19,306 0,0027
3 -1 1 -1 -1 9,58E+04 79431,6 SG 3 42387,5 ± 5575,2429 7,6028 0,0169
4 1 1 -1 -1 9,63E+04 106519,1 4 -12162,5 ± 5575,2429 2,1815 0,1609
5 -1 -1 1 -1 2,95E+05 278631,6 12 -16087,5 ± 5575,2429 2,8855 0,102
6 1 -1 1 -1 2,38E+05 248219,1 13 -20662,5 ± 5575,2429 3,7061 0,0657
7 -1 1 1 -1 1,36E+05 146219,1 14 14287,5 ± 5575,2429 2,5627 0,1245
8 1 1 1 -1 1,00E+05 83631,6 SG 23 -33362,5 ± 5575,2429 5,984 0,0268
9 -1 -1 -1 1 1,09E+05 119219,1 24 16087,5 ± 5575,2429 2,8855 0,102
10 1 -1 -1 1 2,16E+05 199631,6 34 -4337,5 ± 5575,2429 0,778 0,518
11 -1 1 -1 1 1,43E+05 126631,6 124 -20462,5 ± 5575,2429 3,6702 0,0669
12 1 1 -1 1 8,28E+04 93019,1 134 3712,5 ± 5575,2429 0,6659 0,574
13 -1 -1 1 1 2,53E+05 236631,6 234 -8587,5 ± 5575,2429 1,5403 0,2634
14 1 -1 1 1 2,32E+05 242219,1 1234 20462,5 ± 5575,2429 3,6702 0,0669
15 -1 1 1 1 1,09E+05 119219,1 0,05
16 1 1 1 1 1,09E+05 92631,6
17 0 0 0 0 1,39E+05 159731,6
18 0 0 0 0 1,56E+05 159731,6 50 50
19 0 0 0 0 1,35E+05 159731,6
20 0 0 0 0 n° de parâmetros (p) 15
21 0 0 0 0 n° total de observações (n) 19
n° de níveis (m) 17
0,05
FV SQ nGL MQ Fcalc. p
Regressão 7E+10 14 4,799E+09 4,7586 0,0715137
Resíduos 4E+09 4 1,009E+09
F. Ajuste 4E+09 2 1,893E+09 15,223 0,0616395
Erro Puro 2E+08 2 124333333
Total 7E+10 18
% variação explicada 94,336
% máx. de variação explicável 99,651
Planejamento Fatorial Completo 24 com Ponto Central
Todas as Interações
Análise de Variância - Modelo Linear
17/10/2014
Efeitos
Data:
Planejamento
Parâmetros para a ANOVA
Nível de significância (α)
Nível de significância (α)
Diidroestreptomicina
1
2
3
4 12
13
14
23
24
34
124
134
234
1234
-2
-1,5
-1
-0,5
0
0,5
1
1,5
2
-150000 -100000 -50000 0 50000
Val
or
no
rmal
esp
erad
o
Efeitos
Gráfico de Probabilidade Normal
70
Identificação:
Respostas Estimadas Erro t ( 2 ) p
Ensaio X1 X2 X3 X4 y ŷ SG Média 33600 ± 411,88484 81,576 0,0002
1 -1 -1 -1 -1 3,93E+04 42700,0 SG 1 -4012,5 ± 897,6822 4,4698 0,0466
2 1 -1 -1 -1 2,20E+04 21512,5 2 212,5 ± 897,6822 0,2367 0,8349
3 -1 1 -1 -1 4,05E+04 40012,5 3 2662,5 ± 897,6822 2,966 0,0974
4 1 1 -1 -1 2,91E+04 32500,0 4 -3287,5 ± 897,6822 3,6622 0,0671
5 -1 -1 1 -1 3,32E+04 32712,5 SG 12 -6937,5 ± 897,6822 7,7282 0,0163
6 1 -1 1 -1 3,68E+04 40200,0 13 1962,5 ± 897,6822 2,1862 0,1604
7 -1 1 1 -1 4,86E+04 52000,0 SG 14 9212,5 ± 897,6822 10,263 0,0094
8 1 1 1 -1 2,08E+04 20312,5 SG 23 -7262,5 ± 897,6822 8,0903 0,0149
9 -1 -1 -1 1 1,00E+04 13400,0 24 -1712,5 ± 897,6822 1,9077 0,1967
10 1 -1 -1 1 3,70E+04 36512,5 34 537,5 ± 897,6822 0,5988 0,6101
11 -1 1 -1 1 4,54E+04 44912,5 124 -562,5 ± 897,6822 0,6266 0,5949
12 1 1 -1 1 2,32E+04 26600,0 134 837,5 ± 897,6822 0,933 0,4493
13 -1 -1 1 1 3,98E+04 39312,5 SG 234 -5037,5 ± 897,6822 5,6117 0,0303
14 1 -1 1 1 3,82E+04 41600,0 SG 1234 13212,5 ± 897,6822 14,718 0,0046
15 -1 1 1 1 1,64E+04 19800,0 0,05
16 1 1 1 1 3,40E+04 33512,5
17 0 0 0 0 4,00E+04 33600,0
18 0 0 0 0 4,34E+04 33600,0 50 50
19 0 0 0 0 4,07E+04 33600,0
20 0 0 0 0 n° de parâmetros (p) 15
21 0 0 0 0 n° total de observações (n) 19
n° de níveis (m) 17
0,05
FV SQ nGL MQ Fcalc. p
Regressão 2E+09 14 122234911 1,7351 0,3154957
Resíduos 3E+08 4 70447813
F. Ajuste 3E+08 2 137672292 42,711 SG 0,0228775
Erro Puro 6E+06 2 3223333,3
Total 2E+09 18
% variação explicada 85,862
% máx. de variação explicável 99,677
Planejamento Fatorial Completo 24 com Ponto Central
Todas as Interações
Análise de Variância - Modelo Linear
17/10/2014
Efeitos
Data:
Planejamento
Parâmetros para a ANOVA
Nível de significância (α)
Nível de significância (α)
Gentamicina
1
2
3
4
12
13
14
23
24
34 124
134
234
1234
-2
-1,5
-1
-0,5
0
0,5
1
1,5
2
-10000 -5000 0 5000 10000 15000
Val
or
no
rmal
esp
erad
o
Efeitos
Gráfico de Probabilidade Normal
71
Identificação:
Respostas Estimadas Erro t ( 2 ) p
Ensaio X1 X2 X3 X4 y ŷ SG Média 290578,9 ± 3055,0505 95,114 0,0001
1 -1 -1 -1 -1 3,83E+05 396078,9 1 -15125 ± 6658,3281 2,2716 0,1511
2 1 -1 -1 -1 3,40E+05 315953,9 SG 2 -168375 ± 6658,3281 25,288 0,0016
3 -1 1 -1 -1 1,82E+05 157953,9 SG 3 73875 ± 6658,3281 11,095 0,008
4 1 1 -1 -1 1,77E+05 190078,9 4 -22375 ± 6658,3281 3,3605 0,0783
5 -1 -1 1 -1 4,92E+05 467953,9 SG 12 -34625 ± 6658,3281 5,2003 0,035
6 1 -1 1 -1 4,19E+05 432078,9 13 -20375 ± 6658,3281 3,0601 0,0923
7 -1 1 1 -1 2,58E+05 271078,9 14 27875 ± 6658,3281 4,1865 0,0526
8 1 1 1 -1 2,07E+05 182953,9 SG 23 -46625 ± 6658,3281 7,0025 0,0198
9 -1 -1 -1 1 1,80E+05 193078,9 SG 24 34125 ± 6658,3281 5,1252 0,036
10 1 -1 -1 1 3,77E+05 352953,9 34 375 ± 6658,3281 0,0563 0,9602
11 -1 1 -1 1 2,81E+05 256953,9 SG 124 -49625 ± 6658,3281 7,4531 0,0175
12 1 1 -1 1 1,53E+05 166078,9 134 -1375 ± 6658,3281 0,2065 0,8555
13 -1 -1 1 1 4,27E+05 402953,9 234 -26125 ± 6658,3281 3,9237 0,0592
14 1 -1 1 1 4,24E+05 437078,9 SG 1234 41125 ± 6658,3281 6,1765 0,0252
15 -1 1 1 1 2,26E+05 239078,9 0,05
16 1 1 1 1 2,11E+05 186953,9
17 0 0 0 0 2,46E+05 290578,9
18 0 0 0 0 2,68E+05 290578,9 50 50
19 0 0 0 0 2,70E+05 290578,9
20 0 0 0 0 n° de parâmetros (p) 15
21 0 0 0 0 n° total de observações (n) 19
n° de níveis (m) 17
0,05
FV SQ nGL MQ Fcalc. p
Regressão 2E+11 14 1,289E+10 5,7824 0,0513657
Resíduos 9E+09 4 2,229E+09
F. Ajuste 9E+09 2 4,28E+09 24,136 SG 0,0397842
Erro Puro 4E+08 2 177333333
Total 2E+11 18
% variação explicada 95,292
% máx. de variação explicável 99,813
Higromicina
Planejamento Fatorial Completo 24 com Ponto Central
Todas as Interações
Análise de Variância - Modelo Linear
17/10/2014
Efeitos
Data:
Planejamento
Parâmetros para a ANOVA
Nível de significância (α)
Nível de significância (α)
1
2
3
4 12
13
14
23
24
34
124
134
234
1234
-2
-1,5
-1
-0,5
0
0,5
1
1,5
2
-200000 -150000 -100000 -50000 0 50000 100000
Val
or
no
rmal
esp
erad
o
Efeitos
Gráfico de Probabilidade Normal
72
Identificação:
Respostas Estimadas Erro t ( 2 ) p
Ensaio X1 X2 X3 X4 y ŷ SG Média 131752,6 ± 1277,3327 103,15 9E-05
1 -1 -1 -1 -1 1,60E+05 165552,6 1 -2337,5 ± 2783,8822 0,8397 0,4895
2 1 -1 -1 -1 1,66E+05 153790,1 SG 2 -73212,5 ± 2783,8822 26,299 0,0014
3 -1 1 -1 -1 9,75E+04 85290,1 SG 3 34637,5 ± 2783,8822 12,442 0,0064
4 1 1 -1 -1 8,24E+04 87952,6 SG 4 -15012,5 ± 2783,8822 5,3926 0,0327
5 -1 -1 1 -1 2,16E+05 203790,1 SG 12 -21462,5 ± 2783,8822 7,7096 0,0164
6 1 -1 1 -1 2,01E+05 206552,6 13 -10862,5 ± 2783,8822 3,9019 0,0598
7 -1 1 1 -1 1,22E+05 127552,6 14 10237,5 ± 2783,8822 3,6774 0,0666
8 1 1 1 -1 9,58E+04 83590,1 SG 23 -21487,5 ± 2783,8822 7,7185 0,0164
9 -1 -1 -1 1 7,95E+04 85052,6 SG 24 13112,5 ± 2783,8822 4,7101 0,0422
10 1 -1 -1 1 1,69E+05 156790,1 34 2412,5 ± 2783,8822 0,8666 0,4775
11 -1 1 -1 1 1,17E+05 104790,1 SG 124 -13387,5 ± 2783,8822 4,8089 0,0406
12 1 1 -1 1 7,07E+04 76252,6 134 -2837,5 ± 2783,8822 1,0193 0,4153
13 -1 -1 1 1 1,93E+05 180790,1 234 -8212,5 ± 2783,8822 2,95 0,0983
14 1 -1 1 1 1,89E+05 194552,6 SG 1234 15287,5 ± 2783,8822 5,4914 0,0316
15 -1 1 1 1 1,05E+05 110552,6 0,05
16 1 1 1 1 9,74E+04 85190,1
17 0 0 0 0 1,08E+05 131752,6
18 0 0 0 0 1,19E+05 131752,6 50 50
19 0 0 0 0 1,15E+05 131752,6
20 0 0 0 0 n° de parâmetros (p) 15
21 0 0 0 0 n° total de observações (n) 19
n° de níveis (m) 17
0,05
FV SQ nGL MQ Fcalc. p
Regressão 3E+10 14 2,458E+09 4,0179 0,0944411
Resíduos 2E+09 4 611692155
F. Ajuste 2E+09 2 1,192E+09 38,464 SG 0,0253395
Erro Puro 6E+07 2 31000000
Total 4E+10 18
% variação explicada 93,361
% máx. de variação explicável 99,832
Kanamicina
Planejamento Fatorial Completo 24 com Ponto Central
Todas as Interações
Análise de Variância - Modelo Linear
17/10/2014
Efeitos
Data:
Planejamento
Parâmetros para a ANOVA
Nível de significância (α)
Nível de significância (α)
1
2
3
4 12
13
14
23
24
34
124
134 234
1234
-2
-1,5
-1
-0,5
0
0,5
1
1,5
2
-80000 -60000 -40000 -20000 0 20000 40000 60000
Val
or
no
rmal
esp
erad
o
Efeitos
Gráfico de Probabilidade Normal
73
Identificação:
Respostas Estimadas Erro t ( 2 ) p
Ensaio X1 X2 X3 X4 y ŷ SG Média 146831,6 ± 2591,1794 56,666 0,0003
1 -1 -1 -1 -1 1,16E+04 -3818,4 1 23262,5 ± 5647,3445 4,1192 0,0542
2 1 -1 -1 -1 8,37E+04 82794,1 SG 2 48112,5 ± 5647,3445 8,5195 0,0135
3 -1 1 -1 -1 1,95E+05 194094,1 SG 3 62337,5 ± 5647,3445 11,038 0,0081
4 1 1 -1 -1 2,85E+05 269581,6 SG 4 -105837,5 ± 5647,3445 18,741 0,0028
5 -1 -1 1 -1 2,45E+05 244094,1 12 -8462,5 ± 5647,3445 1,4985 0,2727
6 1 -1 1 -1 2,84E+05 268581,6 13 -5087,5 ± 5647,3445 0,9009 0,4627
7 -1 1 1 -1 3,05E+05 289581,6 14 -14262,5 ± 5647,3445 2,5255 0,1275
8 1 1 1 -1 2,54E+05 253094,1 SG 23 -48637,5 ± 5647,3445 8,6125 0,0132
9 -1 -1 -1 1 1,17E+05 101581,6 SG 24 -55562,5 ± 5647,3445 9,8387 0,0102
10 1 -1 -1 1 8,95E+04 88594,1 SG 34 -65837,5 ± 5647,3445 11,658 0,0073
11 -1 1 -1 1 1,15E+05 114094,1 124 9562,5 ± 5647,3445 1,6933 0,2325
12 1 1 -1 1 9,38E+04 78381,6 SG 134 38437,5 ± 5647,3445 6,8063 0,0209
13 -1 -1 1 1 8,67E+04 85794,1 SG 234 40037,5 ± 5647,3445 7,0896 0,0193
14 1 -1 1 1 1,30E+05 114581,6 1234 12462,5 ± 5647,3445 2,2068 0,1581
15 -1 1 1 1 7,16E+04 56181,6 0,05
16 1 1 1 1 1,13E+05 112094,1
17 0 0 0 0 9,09E+04 146831,6
18 0 0 0 0 1,13E+05 146831,6 50 50
19 0 0 0 0 1,06E+05 146831,6
20 0 0 0 0 n° de parâmetros (p) 15
21 0 0 0 0 n° total de observações (n) 19
n° de níveis (m) 17
0,05
FV SQ nGL MQ Fcalc. p
Regressão 1E+11 14 8,96E+09 4,5663 0,0765934
Resíduos 8E+09 4 1,962E+09
F. Ajuste 8E+09 2 3,797E+09 29,762 SG 0,032508
Erro Puro 3E+08 2 127570000
Total 1E+11 18
% variação explicada 94,111
% máx. de variação explicável 99,809
Planejamento Fatorial Completo 24 com Ponto Central
Todas as Interações
Análise de Variância - Modelo Linear
17/10/2014
Efeitos
Data:
Planejamento
Parâmetros para a ANOVA
Nível de significância (α)
Nível de significância (α)
Neomicina
1
2
3
4
12 13
14 23
24 34
124
134 234
1234
-2
-1,5
-1
-0,5
0
0,5
1
1,5
2
-150000 -100000 -50000 0 50000 100000
Val
or
no
rmal
esp
erad
o
Efeitos
Gráfico de Probabilidade Normal
74
Identificação:
Respostas Estimadas Erro t ( 2 ) p
Ensaio X1 X2 X3 X4 y ŷ SG Média 131431,6 ± 1737,1079 75,661 0,0002
1 -1 -1 -1 -1 1,76E+05 178706,6 1 -5125 ± 3785,9389 1,3537 0,3085
2 1 -1 -1 -1 1,66E+05 155131,6 SG 2 -72750 ± 3785,9389 19,216 0,0027
3 -1 1 -1 -1 8,95E+04 78631,6 SG 3 21700 ± 3785,9389 5,7317 0,0291
4 1 1 -1 -1 1,01E+05 103706,6 4 -12075 ± 3785,9389 3,1894 0,0858
5 -1 -1 1 -1 2,19E+05 208131,6 12 -9350 ± 3785,9389 2,4697 0,1322
6 1 -1 1 -1 1,74E+05 176706,6 13 -9650 ± 3785,9389 2,5489 0,1256
7 -1 1 1 -1 1,16E+05 118706,6 14 12025 ± 3785,9389 3,1762 0,0865
8 1 1 1 -1 9,09E+04 80031,6 SG 23 -19525 ± 3785,9389 5,1572 0,0356
9 -1 -1 -1 1 9,91E+04 101806,6 24 11650 ± 3785,9389 3,0772 0,0914
10 1 -1 -1 1 1,64E+05 153131,6 34 4850 ± 3785,9389 1,2811 0,3286
11 -1 1 -1 1 1,25E+05 114131,6 SG 124 -19700 ± 3785,9389 5,2035 0,035
12 1 1 -1 1 7,67E+04 79406,6 134 8250 ± 3785,9389 2,1791 0,1612
13 -1 -1 1 1 1,85E+05 174131,6 234 -10875 ± 3785,9389 2,8725 0,1028
14 1 -1 1 1 1,92E+05 194706,6 1234 13975 ± 3785,9389 3,6913 0,0662
15 -1 1 1 1 9,50E+04 97706,6 0,05
16 1 1 1 1 9,90E+04 88131,6
17 0 0 0 0 1,01E+05 131431,6
18 0 0 0 0 1,13E+05 131431,6 50 50
19 0 0 0 0 1,15E+05 131431,6
20 0 0 0 0 n° de parâmetros (p) 15
21 0 0 0 0 n° total de observações (n) 19
n° de níveis (m) 17
0,05
FV SQ nGL MQ Fcalc. p
Regressão 3E+10 14 2,163E+09 3,4073 0,1226628
Resíduos 3E+09 4 634846513
F. Ajuste 2E+09 2 1,212E+09 21,146 SG 0,0451553
Erro Puro 1E+08 2 57333333
Total 3E+10 18
% variação explicada 92,263
% máx. de variação explicável 99,651
Espectinomicina
Planejamento Fatorial Completo 24 com Ponto Central
Todas as Interações
Análise de Variância - Modelo Linear
17/10/2014
Efeitos
Data:
Planejamento
Parâmetros para a ANOVA
Nível de significância (α)
Nível de significância (α)
1
2
3
4
12 13
14
23
24
34
124
134
234
1234
-2
-1,5
-1
-0,5
0
0,5
1
1,5
2
-80000 -60000 -40000 -20000 0 20000 40000
Val
or
no
rmal
esp
erad
o
Efeitos
Gráfico de Probabilidade Normal
75
Identificação:
Respostas Estimadas Erro t ( 2 ) p
Ensaio X1 X2 X3 X4 y ŷ SG Média 15158,42 ± 656,54599 23,088 0,0019
1 -1 -1 -1 -1 1,77E+04 19272,2 1 -613,75 ± 1430,9088 0,4289 0,7098
2 1 -1 -1 -1 2,05E+04 18718,4 SG 2 -12273,75 ± 1430,9088 8,5776 0,0133
3 -1 1 -1 -1 8,27E+03 6488,4 3 4958,75 ± 1430,9088 3,4655 0,0741
4 1 1 -1 -1 8,24E+03 9812,2 4 -1866,25 ± 1430,9088 1,3042 0,3221
5 -1 -1 1 -1 3,41E+04 32318,4 12 -1663,75 ± 1430,9088 1,1627 0,3649
6 1 -1 1 -1 2,11E+04 22672,2 13 -2446,25 ± 1430,9088 1,7096 0,2295
7 -1 1 1 -1 1,14E+04 12972,2 14 2728,75 ± 1430,9088 1,907 0,1968
8 1 1 1 -1 8,26E+03 6478,4 23 -4491,25 ± 1430,9088 3,1387 0,0883
9 -1 -1 -1 1 8,80E+03 10372,2 24 2033,75 ± 1430,9088 1,4213 0,2911
10 1 -1 -1 1 1,97E+04 17918,4 34 -78,75 ± 1430,9088 0,055 0,9611
11 -1 1 -1 1 1,27E+04 10918,4 124 -3421,25 ± 1430,9088 2,391 0,1393
12 1 1 -1 1 6,36E+03 7932,2 134 2281,25 ± 1430,9088 1,5943 0,2519
13 -1 -1 1 1 2,29E+04 21118,4 234 -1028,75 ± 1430,9088 0,7189 0,5468
14 1 -1 1 1 2,64E+04 27972,2 1234 181,25 ± 1430,9088 0,1267 0,9108
15 -1 1 1 1 8,69E+03 10262,2 0,05
16 1 1 1 1 9,09E+03 7308,4
17 0 0 0 0 1,28E+04 15158,4
18 0 0 0 0 1,79E+04 15158,4 50 50
19 0 0 0 0 1,31E+04 15158,4
20 0 0 0 0 n° de parâmetros (p) 15
21 0 0 0 0 n° total de observações (n) 19
n° de níveis (m) 17
0,05
FV SQ nGL MQ Fcalc. p
Regressão 1E+09 14 67887399 4,3461 0,0831021
Resíduos 6E+07 4 15620366
F. Ajuste 5E+07 2 23050733 2,8145 0,2621577
Erro Puro 2E+07 2 8190000
Total 1E+09 18
% variação explicada 93,831
% máx. de variação explicável 98,383
Planejamento Fatorial Completo 24 com Ponto Central
Todas as Interações
Análise de Variância - Modelo Linear
17/10/2014
Efeitos
Data:
Planejamento
Parâmetros para a ANOVA
Nível de significância (α)
Nível de significância (α)
Estreptomicina
1
2
3
4 12
13
14
23
24
34
124
134
234
1234
-2
-1,5
-1
-0,5
0
0,5
1
1,5
2
-15000 -10000 -5000 0 5000 10000
Val
or
no
rmal
esp
erad
o
Efeitos
Gráfico de Probabilidade Normal
76
Fonte: adaptado de Teófilo et al.
Identificação:
Respostas Estimadas Erro t ( 2 ) p
Ensaio X1 X2 X3 X4 y ŷ SG Média 391842,1 ± 3379,5048 115,95 7E-05
1 -1 -1 -1 -1 4,61E+05 480342,1 1 20375 ± 7365,4599 2,7663 0,1096
2 1 -1 -1 -1 7,76E+05 719217,1 SG 2 -161875 ± 7365,4599 21,978 0,0021
3 -1 1 -1 -1 5,43E+05 486217,1 3 -4625 ± 7365,4599 0,6279 0,5942
4 1 1 -1 -1 3,93E+05 412342,1 SG 4 -178875 ± 7365,4599 24,286 0,0017
5 -1 -1 1 -1 5,65E+05 508217,1 SG 12 -101125 ± 7365,4599 13,73 0,0053
6 1 -1 1 -1 5,73E+05 592342,1 SG 13 -32375 ± 7365,4599 4,3955 0,0481
7 -1 1 1 -1 3,87E+05 406342,1 14 -1625 ± 7365,4599 0,2206 0,8459
8 1 1 1 -1 3,02E+05 245217,1 SG 23 -57625 ± 7365,4599 7,8237 0,0159
9 -1 -1 -1 1 2,39E+05 258342,1 24 25625 ± 7365,4599 3,4791 0,0736
10 1 -1 -1 1 3,84E+05 327217,1 SG 34 81875 ± 7365,4599 11,116 0,008
11 -1 1 -1 1 3,03E+05 246217,1 SG 124 38375 ± 7365,4599 5,2101 0,0349
12 1 1 -1 1 2,04E+05 223342,1 134 28125 ± 7365,4599 3,8185 0,0622
13 -1 -1 1 1 4,58E+05 401217,1 234 -20625 ± 7365,4599 2,8002 0,1074
14 1 -1 1 1 4,76E+05 495342,1 1234 -16875 ± 7365,4599 2,2911 0,1491
15 -1 1 1 1 2,47E+05 266342,1 0,05
16 1 1 1 1 2,58E+05 201217,1
17 0 0 0 0 2,75E+05 391842,1
18 0 0 0 0 3,00E+05 391842,1 50 50
19 0 0 0 0 3,01E+05 391842,1
20 0 0 0 0 n° de parâmetros (p) 15
21 0 0 0 0 n° total de observações (n) 19
n° de níveis (m) 17
0,05
FV SQ nGL MQ Fcalc. p
Regressão 3E+11 14 2,388E+10 1,6153 0,3437581
Resíduos 6E+10 4 1,478E+10
F. Ajuste 6E+10 2 2,935E+10 135,24 SG 0,0073402
Erro Puro 4E+08 2 217000000
Total 4E+11 18
% variação explicada 84,97
% máx. de variação explicável 99,89
Tobramicina
Planejamento Fatorial Completo 24 com Ponto Central
Todas as Interações
Análise de Variância - Modelo Linear
17/10/2014
Efeitos
Data:
Planejamento
Parâmetros para a ANOVA
Nível de significância (α)
Nível de significância (α)
1
2
3
4
12
13
14
23
24
34
124 134
234 1234
-2
-1,5
-1
-0,5
0
0,5
1
1,5
2
-200000 -150000 -100000 -50000 0 50000 100000
Val
or
no
rmal
esp
erad
o
Efeitos
Gráfico de Probabilidade Normal
77
Figura III. Cromatogramas dos analitos em amostra de leite mostrando as
respectivas transições e tempos de retenção. Fonte: a autora.
78
GNTy = 167,28x + 1266,7
R2 = 0,998
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
0 50 100 150 200
KNM
y = 429,98x + 3972,8
R2 = 0,9981
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
0 50 100 150 200 250 300
SPC
y = 243,05x + 2822,9
R2 = 0,9988
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
0 50 100 150 200 250 300 350 400
STRy = 78,271x + 160,76
R2 = 0,9987
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
0 50 100 150 200 250 300 350 400
(A) (B)
(C)
(D)
79
DHSTR
y = 740,93x + 4012,1
R2 = 0,9995
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
0 50 100 150 200 250 300 350 400
AMC
y = 98,01x + 1222,3
R2 = 0,999
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
0 200 400 600 800 1000
APR
y = 185,37x + 4935,1
R2 = 0,9988
0
50000
100000
150000
200000
250000
0 200 400 600 800 1000
HGRy = 210,39x + 5914,5
R2 = 0,9973
0
50000
100000
150000
200000
250000
0 200 400 600 800 1000
(E)
(F)
(G)
(H)
80
Figura IV. Curvas analíticas em matriz com desvio padrão de cada concentração. (A) GNT, (B) KNM, (C) SPC,
(D) STR, (E) DHSTR, (F) AMC, (G) APR, (H) HGR, (I) NEO, (J) TBR. Fonte: a autora.
NEO
y = 97,098x + 3610,7
R2 = 0,9969
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
0 200 400 600 800 1000
TBR
y = 395,98x + 20670
R2 = 0,999
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
450000
500000
0 200 400 600 800 1000
(I)
(J)
![[curso, UFRGS],](https://img.document.onl/doc/110x75/55cf98d7550346d03399f776/curso-ufrgs.jpg)
