JULIANA MOREIRA SOARES

DIOSMINA INDUZ APOPTOSE DEPENDENTE DE CASPASE EM CÉLULAS DE GLIOBLASTOMA

Rio de Janeiro 2018

JULIANA MOREIRA SOARES

DIOSMINA INDUZ APOPTOSE DEPENDENTE DE CASPASE EM

CÉLULAS DE GLIOBLASTOMA

Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas

Universidade Federal do Rio de Janeiro

Rio de Janeiro - Brasil

2018

Dissertação de mestrado apresentada à

banca, como parte dos requisitos

necessários do Programa de Pós-Graduação

em Ciências Farmacêuticas - Universidade

Federal do Rio de Janeiro.

Orientadora:

Profª. Dra. Luciana Romão

Co-orientadora:

Profª. Dra. Yraima Cordeiro

FICHA CATALOGRÁFICA

JULIANA MOREIRA SOARES

DIOSMINA INDUZ APOPTOSE DEPENDENTE DE CASPASE EM CÉLULAS DE GLIOBLASTOMA

Dissertação de Mestrado apresentada à Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte

dos requisitos necessários à obtenção do grau de mestre em Ciências Farmacêuticas.

Aprovada em: 6 de abril de 2018.

PhD Luciana Ferreira Romão

PhD Yraima Moura Lopes Cordeiro

PhD Patricia Zancan

PhD Camilla Djenne Buarque Muller

PhD Fabio de Almeida Mendes

Rio de Janeiro

2018

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho aos meus pais Antonio e Cristina, ao meu irmão Rafael (in memorian), ao meu namorado e a toda a minha família e amigos que estiveram presentes e me apoiaram ao longo deste período do mestrado.

AGRADECIMENTOS

À Deus Pai e Filho por me darem forças para seguir em frente, por me mostrarem o

caminho certo, por me sustentar nos momentos de dificuldade e por me ajudarem a trilhar

meus caminhos na fé e na esperança.

À minha família! Aos meus pais, Antonio e Cristina, por me ensinarem que através da

educação podemos conquistar nosso espaço no mundo e trilhar nossos caminhos

profissionais. Obrigada por todo o amor, paciência, dedicação e por acreditarem nas minhas

escolhas e me incentivarem ao longo de toda minha vida acadêmica. Ao meu eterno irmão (in

memorian), por me mostrar que não há falta na ausência e que de onde estiver estará torcendo

pelo meu sucesso e intercedendo por mim. Aos meus avós, padrinhos, tios e primos por me

mostrarem que os maiores valores encontramos na família. Obrigada pela torcida de sempre!

Ao meu amado namorado Alexandre por toda paciência, fidelidade, compreensão e amor.

Obrigada por ter aturado meus momentos de estresse, por ouvir minhas lamentações e,

mesmo com a distância continuar me apoiando e incentivando.

À minha orientadora Luciana Romão por acreditar que eu daria conta do projeto

mesmo tendo que dividir meu tempo entre trabalho e mestrado. Obrigada por me aturar e por

acreditar em mim desde a iniciação científica. Obrigada por compreender minhas ausências

nos seminários do grupo, obrigada pela paciência em tirar minhas dúvidas por whatsapp,

obrigada por sempre se preocupar em tirar o melhor dos meus resultados, obrigada pelo seu

perfeccionismo extremo nas correções do artigo e desta dissertação e por compreender meus

horários limitados no laboratório.

À minha coorientadora Yraima Cordeiro por todo o suporte e gentileza ao longo do

mestrado. Obrigada por todas as sugestões no artigo e na dissertação e por ter cedido seu

laboratório para eu apresentar meus resultados. O meu muito obrigada a você e também ao

Lucas por terem realizado as análises in silico e terem tido a paciência de me explicar todo o

resultado.

Eu não poderia deixar também de agradecer a todos do laboratório que fizeram parte

da minha vida acadêmica. Ao professor Vivaldo o meu muito obrigada por ter me aceitado

em seu laboratório como aluna de iniciação científica quando eu ainda estava no terceiro

período da faculdade e por ter me colocado como aluna da Luciana por acreditar que seria

interessante dar continuidade aos projetos com flavonoide. Aos técnicos Rose e Fábio,

obrigada pelo suporte. Rose, obrigada por ser esta super mãe de todos no laboratório e por

sempre estar disposta a ajudar e, principalmente pelo carinho em estar presente em todas as

minhas apresentações sejam de artigo na época do mestrado ou de resultado no TCC e no

Mestrado. Fábio, obrigada por aturar minhas mensagens de manhã cedo perguntando sobre o

material para meus experimentos e pedindo ajuda para encontrar as coisas no laboratório. Aos

meus colegas de laboratório (TODOS DO LMC E LBCG) por escutarem meus problemas,

por ajudarem com dicas nos seminários e por todo o apoio e disponibilidade. Um

agradecimento especial à Bruna Mafra por toda a ajuda com repiques, discussões sobre

flavonoides e figuras no Photoshop. Obrigada a Beatriz por ouvir minhas lamentações as

7:30h no laboratório, a Carla por sempre me ajudar na marcação de horário no fluxo, a

Loraine pela ajuda com microscópio, à Tania por muitas vezes ter sido minha companheira

de sala de fluxo às 8 horas da manhã, ao Bruno por sempre ser solícito ao emprestar a

objetiva e a faloidina, à Diana por todas as dicas de experimentos, à todos os alunos e alunas

da Luciana por assistirem aos meus seminários de resultado e terem contribuído com dicas e

sugestões, ao Fábio Mendes por ter sido revisor no TCC e no Mestrado e por sempre ter sido

tão gentil e generoso em seus comentários, à Denise por ter sido minha primeira orientadora

na iniciação científica e ter me ensinado as técnicas básicas de laboratório. Enfim, meu

muitíssimo obrigada a todos do LMC e LBCG por compreenderem meus horários

alternativos e por terem sempre compartilhado comigo momentos incríveis no laboratório.

À minha chefe, Ana Valverde, que acreditou que eu seria capaz de conciliar mestrado

e meu trabalho na GSK. Obrigada pelo apoio, flexibilidade e compreensão..

Agradeço também a todos os meus amigos que compreenderam meus momentos de

ausência e estresse e que foram sempre muito carinhosos e me incentivaram muito a

perseverar.

À todos aqueles que estiveram presentes na minha vida desde a faculdade até o

mestrado, meu o eterno carinho e o meu MUITO OBRIGADA!

EPÍGRAFE

“Enquanto houver vontade de lutar, haverá esperança de vencer.”

Santo Agostinho

SOARES, Juliana. Diosmina induz apoptose dependente de caspase em células de

glioblastoma. Rio de Janeiro, 2018. Dissertação (Mestrado) - Programa de Pós-graduação em

Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2018.

RESUMO

O glioblastoma é um tumor agressivo e considerado letal dado o alto poder de proliferação, infiltração pelo parênquima cerebral e capacidade de evasão ao tratamento. Apesar dos avanços na terapia convencional (cirurgia, radioterapia e quimioterapia), menos de 5% dos pacientes sobrevivem mais de 5 anos após o diagnóstico. A busca por terapias alternativas capazes de agir sobre tumores e aumentar a sobrevida dos pacientes tem aumentado. Neste contexto, os flavonoides têm se destacado. Pesquisas sugerem que alguns flavonoides exercem atividade antitumoral através de mecanismos anti-proliferativos e de indução de apoptose. O flavonoide diosmina já se mostrou efetivo contra alguns tumores, porém o seu efeito ainda não foi descrito em glioblastoma. O objetivo deste trabalho é avaliar através de ensaios in silico e in vitro o papel da diosmina nas linhagens de glioblastoma humano GBM95, GBM02 e U87. O ensaio in silico indicou que a diosmina não é uma molécula tóxica nem mutagênica. O tratamento com diosmina por 24 e 48 horas nas concentrações de 10, 50, 75, 100 e 150 µM reduziu a viabilidade das células de glioblastoma mas não de astrócitos sadios. O tratamento por 24 horas com 50 e 100 µM reduziu, respectivamente, em 50,6% e 54% a viabilidade de GBM95, 30,5% e 25,8% de GBM02 e não reduziu a viabilidade de U87. Para o tratamento por 48 horas, o mesmo perfil foi observado, não tendo efeito concentração-tempo dependente. Nas mesmas condições foram observadas alterações morfológicas e uma redução na celularidade de GBM95 e GBM02. A diosmina não foi capaz de reduzir a proliferação das células mas, no tratamento por 24 horas, ocorreu um aumento em 47,5% e 43,9% na morte de GBM95 e 26,4% e 22,5% na morte de GBM02 para os tratamentos de 50 e 100 µM, respectivamente. Para 48 horas, a indução de morte foi significativa porém, um pouco menor. Além disso, os resultados indicaram que o processo de morte se deu por indução de apoptose dependente de caspase, uma vez que ocorreu aumento na ativação de caspase-3 clivada nas células após tratamento com diosmina. Nenhum efeito aditivo foi observado com a combinação de diosmina e temozolomida (TMZ). Em conclusão, a diosmina parece ser um composto promissor no tratamento de glioblastoma, porém, mais ensaios são necessários para determinar seu real mecanismo de ação.

Palavras-chave: Glioblastoma, flavonoide, diosmina, apoptose

SOARES, Juliana. Diosmin induces caspase-dependent apoptosis in glioblastoma cells.

Rio de Janeiro, 2018. Master Degree Dissertation - Programa de Pós-graduação em Ciências

Farmacêuticas, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2018.

ABSTRACT

Glioblastoma is an aggressive and lethal tumor characterized by rapid cell proliferation, cerebral parenchyma invasion and treatment resistance. Besides the advances on treatment options, less than 5% of patients survive more than 5 years after diagnosis. In this context, the search for new treatments with natural compounds has increased and, in the last years the flavonoids have stand out. Recently researches suggested that flavonoids have antitumor properties because they could act through inhibition of cells proliferation and/or induction of cells apoptosis. The flavonoid diosmin was described as an anticancer drug for different tumors, but its effects have never been described in glioblastoma cells. The objective of this study is to evaluate through in silico and in vitro assays the role of diosmin on glioblastoma lines GBM95, GBM02 and U87. In silico results indicated that diosmin is neither toxic nor mutagenic. The treatment with 10, 50, 75, 100 and 150 µM diosmin for 24 and 48 hours was able to reduce glioblastoma cells viability but not healthy astrocyte’s viability. The treatment for 24 hours with 50 and 100 µM of diosmin reduced, respectively, 50.6% and 54% of GBM95 viability, 30.5% and 25.8% of GBM02 but did not reduce U87 viability. At 48 hours, the same profile was observed, indicating no time-dose effect. At the same conditions, it was observed morphological alterations and a decrease in GBM95 and GBM02 cellularity. Diosmin was not able to reduce glioblastoma cells proliferation but induced cell death. The cell death assay showed that the treatment for 24 hours increased in 47.5% and 43.9% GBM95 cell death and 26.4% and 22.5% of GBM02 cell death at the concentrations of 50 and 100 µM, respectively. For the 48 hours treatment, the cell death was also significant but a bit lower. Also, the results revealed that diosmin increased the expression of cleaved caspase 3 in GBM95 and GBM02 cells, suggesting that cell death is caused by caspase-dependent apoptosis. No additive effect was observed with the combination of diosmin and temozolomide (TMZ). In summary, diosmin seems to be a promising compound against glioblastoma. However, additional studies are still required to determine the real mechanism of action of this flavonoid on glioblastoma cells.

Keywords: Glioblastoma, flavonoid, diosmin, apoptosis

LISTA DE TABELA

Tabela 1: Análises e predições in silico da molécula do flavonoide diosmina.. .......................58

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: A evolução do glioblastoma primário e secundário.. ................................................23

Figura 2: Relação entre sobrevida, características histológicas e principais mutações associadas com glioblastoma primário e secundário ................................................................24

Figura 3: Estrutura química da TMZ........................................................................................28

Figura 4: Estrutura básica dos flavonoides...............................................................................33

Figura 5: Estrutura química da diosmina (C28H32O15) .............................................................36

Figura 6: Estrutura química da apigenina (C15H10O5)..........................................................38

Figura 7:Estrutura química da rutina (C15H10O5)..................................................................39

Figura 8: Diosmina reduz a viabilidade de células de glioblastoma das linhagens GBM95, GBM02 e U87..........................................................................................................................60

Figura 9: Diosmina não reduz de forma significativa a viabilidade de astrócitos humanos sadios........................................................................................................................................63

Figura 10: A combinação de diosmina e TMZ foi capaz de reduzir a viabilidade de GBM95 e GBM02, mas não houve efeito aditivo pela associação........................................................64

Figura 11: Diosmina altera a morfologia das linhagens GBM95 e GBM02 e reduz o número total destas células....................................................................................................................67

Figura 12: Diosmina não reduziu a proliferação das células GBM95 e GBM02.....................71

Figura 13: Diosmina induz morte em células GBM95 e GBM02............................................73

Figura 14: Diosmina induz apoptose dependente de caspase-3 clivada em células GBM95 e GBM02.................................................................................................................................... 76

Figura 15: Registro CONEP 2340..........................................................................................115

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1 - Prevalência dos 15 tipos de cânceres mais comuns em homens e mulheres no Brasil. .......................................................................... ...........19Erro! Indicador não definido.

Gráfico 2: Estimativas dos números de casos de câncer no Brasil. ..........................................20

Gráfico 3: Sobrevida de pacientes com diferentes tipos de glioma, classificados quanto a sua histologia e grau na escala da OMS. .........................................................................................22

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

Akt: proteína quinase serina/treonina codificada pelo gene AKT, também conhecida como proteína quinase B

AMPK: proteína quinase ativada por monofosfato de adenosina

ATCC: Do inglês American Type Culture Collection

BCL-2: proteína de células B de linfoma tipo 2

BCRP: proteína de resistência em câncer de mama

BP: permeabilidade pela barreira hematoencefálica

BrdU: 5-bromo-2-deoxiuridina

BSA: albumina do soro bovino

CDK9: cinase 9 dependente de ciclina

CO2: dióxido de carbono ou gás carbônico

CONEP: Comissão Nacional de Ética em Pesquisa

CTAA: Centro Nacional de Pesquisa de Tecnologia Agroindustrial de Alimentos

DAPI: 4, 6 – diamino-2-fenilindol

DMEM-F12: meio de cultura Dubelcco’s Modified Eagle Medium

DMSO: Dimetilsulfóxido

DNA: ácido desoxirribonucleico (do inglês, deoxyribonucleic acid)

dUTP: deoxinucleotidil terminal transferase

EdU: 5-etinil-2`- deoxiuridina

EGCG: epigalocatequina- 3-galato

EGFR: Receptors de fatores de crescimento epidérmico

EMBRAPA: Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária

EORTEC: Organização Europeia para Pesquisa e Tratamento do Câncer

ERK: proteína quinase regulada por sinal extracelular

FDA: Agência de Administração de Alimentos e Medicamentos (do inglês, Food and Drug Administration)

GFAP: Proteína glial fibrilar ácida

Gy: Unidade que representa a quantidade de energia de radiação ionizante absorvida por unidade de massa

hHERG: toxicidade cardíaca por inibição do canal regulador de potássio

HJP: permeabilidade pelo jejuno humano

HUCFF: Hospital Universitário Clementino Fraga Filho

IARC: Agência Internacional de Pesquisa em Câncer (do ingles, International Agency for Research on Cancer)

ICB: Instituto de Ciências Biomédicas

IL-10: interleucina 10

INCA: Instituto Nacional do Câncer

JNK: proteína reguladora de autodestruição celular

LaBiME: Laboratório de Biologia Molecular Estrutural

LMC: Laboratório de Morfogênese Celular

logP: coeficiente de partição octanol/água

MAPK: proteína quinase ativada por mitógenos

MDM2: proteína murina reguladora nagativa de p53

MGMT: O6-Metilguanina-DNA-metiltransferase

MMP-2: Metaloproteinase de matriz tipo 2

MRP: proteína associada a resistência a múltiplas drogas

MTT: Brometo Tiazolil Azul de Tetrazólio

Mut: mutagenicidade cromossômica

NCIC: Instituto Nacional de Estudos Clínicos de Câncer no Canada

NO: óxido nítrico

OH: hidroxila

OMS: Organização Mundial da Saúde

p21: proteína reguladora de ciclo celular de massa molecular de 21 kDa

p53: proteína supressora de tumor de massa molecular de 53 kDa

P-gp: transportador de efluxo permeável a glicoproteína

PI3K: enzima fosfoinositídeo-3-quinase

PBS: Tampão fosfato salino

PFA: Paraformaldeído

PM: Peso molecular

PTEN: Gene homólogo de fosfatase e tensina

RB-1: Gene retinoblastoma 1

RMN: Ressonância magnética nuclear

ROS: Espécies reativas de oxigênio

SEER: Vigilâncis, Epidemiologia e Resultados em Estatística do Câncer (do ingles, Surveillance, Epidemiology, and End Results)

SFB: soro fetal bovino

SNC: Sistema Nervoso Central

TGF-β: Fator de crescimento transformante β

TMZ: Temozolomida

TNF-α: fator de necrose tumoral α

TOX aguda: toxicidade aguda em ratos

TUNEL: marcação de fragmentação por dUTP e deoxinucleotidil transferase, do inglês Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling

UFRJ: Universidade Federal do Rio de Janeiro

UICC: União Internacional contra o Câncer (do inglês, International Union Against Cancer)

VEGF: Fator de crescimento endotelial vascular

WHO: Organização Mundial da Saúde (do inglês, World Health Organization)

WNT-β-catenina: fusão do nome do gene de Drosophila wingless e do nome do homólogo vertebrado, integrado (int-1).

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................18

1.1.PERFIL EPIDEMIOLÓGICO DO CÂNCER........................................................18

1.2.TUMORES DE CABEÇA OU DO SNC...............................................................20

1.3.O GLIOBLASTOMA.............................................................................................21

1.4.O TRATAMENTO DO GLIOBLASTOMA.........................................................25

1.4.1. O TRATAMENTO CONVENCIONAL DO GLIOBLASTOMA: CIRURGIA, RADIOTERAPIA E QUIMIOTERAPIA.......................25

1.4.2. NOVAS ESTRATÉGIAS TERAPÊUTICAS NO TRATAMENTO DE GLIOBLASTOMA...............................................................................29

1.5.OS FLAVONOIDES..............................................................................................32

1.6.O FLAVONOIDE DIOSMINA.............................................................................35

1.7.MORTE CELULAR POR APOPTOSE INDUZIDA POR DIOSMINA ................................................................................................................................40

2. JUSTIFICATIVA...............................................................................................................43 3. OBJETIVO.........................................................................................................................45

3.1.OBJETIVO GERAL...............................................................................................45 3.2.OBJETIVOS ESPECÍFICOS.................................................................................45

4. MATERIAL E MÉTODOS...............................................................................................46 4.1.MATERIAL...........................................................................................................46

4.1.1. CÉLULAS TUMORAIS DE GLIOBLASTOMA HUMANO E ASTRÓCITOS SADIOS..................................................................................46

4.1.2. AMOSTRA DE DIOSMINA...........................................................................46 4.1.3. PRINCIPAIS REAGENTES............................................................................47 4.2.MÉTODOS.............................................................................................................47 4.2.1. PROTOCOLO DE CULTURA DE CÉLULAS...............................................47 4.2.2. DILUIÇÃO E TRATAMENTO COM DIOSMINA......................................48 4.2.3. DILUIÇÃO E TRATAMENTO COM TMZ...................................................49

4.2.4. AVALIAÇÃO IN SILICO DAS PROPRIEDADES FARMACOCINÉTICAS E TOXICOLÓGICAS DA DIOSMINA................ .........................................50

4.2.5. ANÁLISE DA VIABILIDADE CELULAR ATRAVÉS DO ENSAIO COLORIMÉTRICO DE MTT.........................................................................50

4.2.6. AVALIAÇÃO DA MORFOLOGIA CELULAR ATRAVÉS DA MARCAÇÃO COM VIMENTINA.................................................................52

4.2.7. ENSAIO DE PROLIFERAÇÃO CELULAR POT KIT CLICK-IT EDU ALEXA FLUOR 488.......................................................................................53

4.2.8. ENSAIO DE MORTE CELULAR COM USO DO KIT IN SITU CELL DEATH DETECTION, TMR RED (TUNEL)...............................................55

4.2.9. ENSAIO DE MORTE CELULAR POR APOPTOSE ATRAVÉS DA MARCAÇÃO POR CASPASE 3 CLIVADA..................................................56

4.2.10. ANÁLISE ESTATÍSTICA...............................................................................57 5. RESULTADOS......................................................................................................58

5.1.DIOSMINA NÃO SE MOSTROU TÓXICA NEM MUTAGÊNICA NAS PREDIÇÕES IN SILICO........................................................................................58

5.2.DIOSMINA REDUZ A VIABILIDADE DE CÉLULAS DE GLIOBLASTOMA.................................................................................................60

5.3.DIOSMINA NÃO REDUZ A VIABILIDADE DE ASTRÓCITOS SADIOS..................................................................................................................62

5.4.A COMBINAÇÃO DE DIOSMINA COM TMZ É CAPAZ DE REDUZIR A VIABILIDADE DE CÉLULAS DE GLIOBLASTOMA, MAS SEM EFEITO ADITIVO...............................................................................................................64

5.5.DIOSMINA ALTERA A MORFOLOGIA E REDUZ A POPULAÇÃO DAS CÉLULAS DE GLIOBLASTOMA.......................................................................66

5.5.1. DIOSMINA ALTERA A MORFOLOGIA DAS CÉLULAS GBM95 E GBM02.............................................................................................................67

5.5.2. DIOSMINA REDUZ O NÚMERO TOTAL DAS CÉLULAS GBM95 E GBM02.............................................................................................................69

5.6.DIOSMINA NÃO FOI CAPAZ DE REDUZIR A PROLIFERAÇÃO DAS CÉLULAS DE GLIOBLASTOMA.......................................................................70

5.7.DIOSMINA INDUZ MORTE DAS CÉLULAS GBM95 E GBM02....................72

5.8.DIOSMINA INDUZ APOPTOSE DEPENDENTE DE CASPASE 3 CLIVADA..............................................................................................................75

6. DISCUSSÃO..........................................................................................................78 7. CONCLUSÕES......................................................................................................98 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................................99 ANEXO A – REGISTRO CONEP N°2340, 2001.....................................................115

18

1. INTRODUÇÃO

1.1. O PERFIL EPIDEMIOLÓGICO DO CÂNCER

O câncer se desenvolve a partir do momento em que células normais sofrem algum

dano no ácido desoxirribonucleico (DNA) e não são mais capazes de corrigi-lo. Desta forma,

essas células com danos em seu conteúdo genético começam a se dividir desordenadamente e

a gerar novas células anormais que circulam pelo sangue ou dão origem a um tumor

(SUDHAKAR, 2009).

Uma questão bastante importante que envolve a patologia do câncer é a distinção

entre um tumor benigno de um tumor maligo. Um tumor é qualquer proliferação anormal de

células que formam uma massa. No entanto, o tumor pode ser considerado benigno ou

maligno. O tumor benigno permanece no local onde surgiu, não é capaz de invadir os tecidos

adjacentes nem se espalhar pelo corpo. Já o tumor maligno apresenta células capazes de se

espalhar e de invadir o tecido de origem e/ou também outros tecidos, formando as chamadas

metástases. Somente estes tumores malignos que dão origem ao câncer (COOPER, 2000).

De acordo com Hanahan e Weinberg, existem seis aspectos essenciais para o

desenvolvimento do câncer: a autossuficiência de crescimento celular, a insensibilidade aos

sinais de inibição do crescimento celular, evasão ao processo de morte celular programada,

replicação celular ilimitada, angiogênese sustentada e invasão tecidual (HANAHAN e

WEINBERG, 2011).

Nas últimas décadas, o câncer ganhou uma enorme dimensão dado ao incremento da

incidência e prevalência da doença bem como os investimentos em tecnologia, iniciativas

médicas de promoção à saúde, detecção precoce, políticas públicas e também incentivo às

pesquisas (ARAUJO NETO et al., 2017; FERREIRA, 2012).

Segundo um levantamento do World Cancer Report (STEWART e WILD, 2014), o

câncer é umas das principais causas de mortes no mundo inteiro. Dados da Organização

Mundial da Saúde (OMS) revelam que ocorrem aproximadamente 14 milhões de novos casos

de câncer por ano em todo o mundo. No Brasil, estimativas recentes do Instituto Nacional do

Cancer (INCA) apontam que ocorreram aproximadamente 600 mil novos casos de câncer no

país entre o biênio de 2016 e 2017. Além disso, a OMS estima que haja um crescimento em

70% no número de novos casos da doença para as próximas duas décadas (WHO, 2015),

19

atingindo em 2030, um número estimado em 27 milhões de novos casos em todo o mundo

(BOYLE e LEVIN, 2008).

O câncer é responsável por cerca de 13% de todas as causas de óbito no mundo. No

ano de 2013, foram registradas no Brasil mais de 189 mil mortes pela doença (INCA, 2016).

No mundo, mais de 8 milhões de pessoas morrem de câncer a cada ano (WHO, 2015). Diante

destes dados, é evidente que o câncer é um problema de saúde pública (INCA, 2014).

O gráfico 1 aponta o perfil epidemiológico do câncer no Brasil. Através dos dados

deste gráfico, percebemos que os tumores de próstata em homens e de mama em mulheres

são os mais frequentes, seguidos de câncer de pulmão, intestino e estômago (WHO & IARC -

GLOBOCAN, 2012). Os tumores intracranianos ou do sistema nervoso central (SNC)

aparecem na nona posição.

Gráfico 1: Prevalência dos 15 tipos de cânceres mais comuns em homens e mulheres no Brasil. Os

cânceres de próstata (homem) e mama (mulher) aparecem como os mais prevalentes, seguidos por pulmão,

intestino, estômago, colo uterino, tireoide, esôfago, SNC, cavidade oral, bexiga, pâncreas, fígado, linfoma não-

Hodgkin e leucemia (Adaptado de WHO & IARC - GLOBOCAN, 2012).

20

1.2. OS TUMORES INTRACRANIANOS OU DO SNC Os tumores malignos intracranianos estão entre as mais graves formas de câncer

(GLOBOCAN, 2012) e representam um espectro diversificado de tumores com elevada

morbidade. Sua incidência supera 780 mil novos casos por ano (GRUPO COI, 2014).

Os tumores intracranianos podem ser provenientes de células malignas formadas

diretamente no interior da cabeça, originando assim os chamados tumores intracranianos

primários ou também podem ser provenientes de células de tumores sistêmicos ou que se

formam em outros tecidos, mas que provocam metástase no cérebro (BUTOWSKI, 2015).

Apesar de representarem apenas 2% das neoplasias malignas mais comuns no mundo

(INCA, 2016) e 2,7% das neoplasias malignas mais comuns no Brasil (gráfico 2), os tumores

intracranianos ou do SNC apresentam taxas de incidência e mortalidade crescentes, não

somente no Brasil como em todo o mundo. Desta forma, mesmo que relativamente raras, as

neoplasias de SNC contribuem, de forma significativa, para a mortalidade por câncer (INCA,

2016).

Gráfico 2: Estimativas dos números de casos de câncer no Brasil. O câncer de SNC representa 2,7% dos

tumores no Brasil, com quase 12.000 casos da doença no país (Adaptado de WHO & IARC - GLOBOCAN,

2012).

Dados registrados pela Surveillance, Epidemiology, and End Results (SEER) indicam

que, de 2007 a 2011, a incidência de tumores malignos do SNC variou de 4,75 até 8,62 casos

por 100.000 habitantes nos Estados Unidos e a mortalidade foi de 4,26 por 100.000

21

habitantes (OSTROM et al., 2014). Já no Brasil, estimativas da GLOBOCAN apontam que,

em 2010, o número de mortes causadas por tumores do SNC chegou a mais de 10.000 (WHO

& IARC - GLOBOCAN, 2012).

A rápida evolução clínica dos tumores intracranianos resulta em alterações mentais e

neurológicas, muitas vezes irreversíveis, e que, na maioria das vezes, leva o paciente a óbito

(MUZI et al., 2012). Por estes motivos, os tumores malignos do SNC estão entre os mais

graves tipos de câncer, sendo o glioblastoma o tumor primário intracraniano mais agressivo

(OSTROM et al., 2014).

1.3. O GLIOBLASTOMA Os gliomas malignos são tumores cerebrais primários (LOUIS et al., 2007). Dentre

todos os gliomas malignos, o glioblastoma representa 46,6% desses tumores, sendo o terceiro

tipo de tumor intracraniano mais frequente nos relatos histológicos (OSTROM et al., 2016;

HAAR et al., 2012).

O glioblastoma é um tumor maligno de origem glial composto por astrócitos

neoplásicos indiferenciados (LIMA et al., 2012). As células gliais foram descritas pela

primeira vez por Virchow no século XIX como células de suporte estrutural do sistema

nervoso, sendo os astrócitos exemplos dessas células gliais. Os astrócitos tem papel ativo na

manutenção da fisiologia cerebral, formam a barreira hematoencefálica, participam do

metabolismo de neurotransmissores e também na manutenção do meio extracelular

intracraniano (GOMES et al. 1999). As mutações em genes reguladores do ciclo celular dos

astrócitos (como p53, poroteína RB, MAPK e PI3K) fazem com que estas células adquiram

características malignas, resultando em tumores como o glioblastoma (FURNARI et al.,

2007).

O glioblastoma apresenta uma natureza bastante agressiva, invasiva e tem alta evasão

ao tratamento, sendo considerado como um dos mais letais que acometem os seres humanos.

Seus sintomas clínicos incluem progressivas dores de cabeça, déficit neurológico e

convulsões (LIMA et al., 2012). Este tumor acomete principalmente adultos, sendo a idade

média de diagnóstico de 64 anos (OSTROM et al., 2016).

22

O glioblastoma é considerado um tumor fatal, sendo classificado como um

astrocitoma grau IV de malignidade na escala da OMS que vai de I a IV (BRAT, et al., 2015;

BLEEKER et al., 2012). Conforme apresentado no gráfico 3, aproximadamente 5% dos

pacientes diagnosticados com glioblastoma sobrevivem mais que 5 anos após o diagnóstico e,

mesmo sob tratamento, a maioria vai a óbito nos primeiros 15 meses (BRAT et al., 2015;

THAKKAR, et al., 2014; HAAR et al., 2012).

Gráfico 3: Sobrevida de pacientes com diferentes tipos de glioma, classificados quanto a sua histologia e

grau na escala da OMS. Diferente dos outros gliomas, a sobrevida de pacientes com glioblastoma reduz muito

nos 5 primeros anos pós diagnósstico (Adaptado de BRAT et al., 2015).

O tumor glioblastoma pode ser classificado como primário ou secundário. Conforme

esquematizado na figura 1, o tumor é considerado primário quando já surge como uma

patologia maligna no momento do diagnóstico e é tido como secundário quando se

desenvolve ao longo de 5 a 10 anos a partir de um astrocitoma de baixo grau (MAHER, et al.,

2001). O glioblastoma primário acomete principalmente os pacientes mais velhos e se

apresenta como um tumor agressivo, altamente invasivo e, geralmente, sem qualquer

evidência clínica prévia. Já o glioblastoma secundário acomete pacientes um pouco mais

jovens, que inicialmente apresentavam um astrocitoma de baixo grau que, após um

determinado período de tempo, evoluiu para um glioblastoma maligno (MAHER et al.,

2001).

23

Figura 1: A evolução do glioblastoma primário e secundário (Adaptado de Maher et al., 2001). Esquema

simplificado das origens primária e secundária do glioblastoma e as características clínicas de cada uma das vias

que originam o tumor.

O glioblastoma, seja ele de origem primária ou secundária, é um tumor bastante

heterogêneo, exibindo muitas anormalidades genéticas (HUSE et al, 2001). Segundo os dados

da figura 2, o glioblastoma primário apresenta diferentes alterações genéticas ao longo de sua

progressão, caracterizadas por aumento na expressão de receptores de crescimento

epidérmico (EGFR) e mutação no gene homólogo de fosfatase e tensina (PTEN). O

glioblastoma secundário expressa o fator de crescimento transformante β (TGF-β) e apresenta

mutações no gene supressor de tumor p53. Conforme indicado na figura 2, tanto o

glioblastoma primário quanto o secundário ainda acumulam outras mutações genéticas,

particularmente no gene retinoblastoma (RB-1), contribuindo para a progressão das células

tumorais (LIMA et al., 2012; MAHER et al., 2001).

24

Figura 2 - Relação entre sobrevida, características histológicas e as principais mutações associadas com

glioblastoma primário e secundário (Adaptado de MAHER et al., 2001). Esquema ilustrativo da formação

do glioblastoma primário e do glioblastoma secundário a partir de astrocitomas de baixo grau. As diversas

mutações genética ocasionam em algumas diferenças nas características histológicas de cada tumor e também os

diferencia quanto ao grau de malignidade e sobrevida do paciente.

As mutações genéticas do glioblastoma apresentadas na figura 2 provocam diversas

alterações que acarretam em um descontrole no processo de proliferação celular e evasão das

células a mecanismos de controle e indução de apoptose (CHEN et al., 2012 apud DAVIS et

al., 2016). O elevado poder de proliferação celular, capacidade de infiltração difusa pelo

parênquima cerebral e elevada angiogênese associados à instabilidade genômica, fazem com

que o glioblastoma apresente uma rápida evolução em seu quadro clínico e seja considerado

um dos tumores mais agressivos e letais (MAHER, et al., 2001).

A agressividade do glioblastoma não está associada somente a sua capacidade

infiltrativa, proliferativa e angiogênica. A elevada resistência deste tumor aos tratamentos

também contribui para sua letalidade (RAMIREZ et al., 2013; HAAR, et al., 2012;

SCHMALTZ et al., 2011). Todas essas características juntas fazem com que o glioblastoma

apresente não só uma rápida e letal evolução do quadro clínico, mas também um grande

poder de resistência às drogas utilizadas na terapia antitumoral e baixa efetividade de

tratamento (LIMA et al., 2012; FANG et al., 2012; MAHER et al., 2001).

25

Considerando esta elevada agressividade e a resistência das células de glioblastoma,

se faz necessário cada vez mais estudar alternativas para o tratamento deste tumor. Os

modelos de células humanas estão contribuindo imensamente para o melhor entendimento da

fisiologia do câncer através de ensaios in vitro e, por este motivo, a demanda por modelos de

células de glioblastoma humano está aumentando (XIE et al., 2015).

As linhagens celulares humanas são ferramentas úteis para a pesquisa de novos

tratamentos por serem fáceis de manusear e por apresentarem alta reprodutibilidade (ALLEN

et al., 2016), características essenciais para o desenvolvimento e validação de novos fármacos

anti-tumorais (Xie et al., 2015). Desta forma, pesquisadores do mundo inteiro optam por

trabalhar com linhagens de células comerciais obtidas em bancos repositórios (ALLEN et al.,

2016) ou trabalham com células obtidas através de cirurgias feitas em pacientes adultos (XIE

et al., 2015), como é o caso deste estudo.

1.4. O TRATAMENTO DO GLIOBLASTOMA Apesar dos recentes avanços nas terapias antitumorais, os resultados para o tratamento

do glioblastoma não sofreram mudanças significativas ao longo das últimas décadas e este

tumor permanece sendo maligno, letal e com baixa sobrevida (RAZAVI, et al., 2016;

WILSON, et al., 2014; SIEBZEHNRUBL et al., 2011).

Atualmente, o tratamento clínico do glioblastoma consite em uma cirurgia para a

maior remoção possível da massa tumoral, seguinda de radioterapia e quimioterapia,

principalmente com a temozolomida (TMZ) associada ou não a outros quimioterápicos

adjuvantes (WILSON et al., 2014; WṺRTH et al., 2014).

1.4.1. O TRATAMENTO CONVENCIONAL DO GLIOBLASTOMA: CIRURGIA, RADIOTERAPIA E QUIMIOTERAPIA

Apesar do prognóstico ruim, a cirurgia é a primeira estratégia terapêutica de

tratamento de glioblastoma e é realizada com intuito de promover a maior citoredução

possível da massa tumoral, podendo-se retirar mais de 90% do tumor primário (WṺRTH et

al., 2014).

26

De acordo com Sameer e colaboradores (2017), a remoção cirúrgica de toda a massa

tumoral é capaz de estender a vida dos pacientes idosos (acima de 65 anos) recém-

diagnosticados com glioblastoma em aproximadamente 5 meses a mais (HALANI et al.,

2017). Entretanto, a remoção cirúrgica de toda a extensão do tumor nem sempre é possível

por conta da elevada infiltração da massa tumoral pelo parênquima cerebral, alcançando áreas

de difícil acesso, além do fato do glioblastoma não apresentar uma margem tumoral tão clara

(WILSON et al., 2014; RAMIREZ et al., 2013; LIMA et al., 2012).

A remoção cirúrgica não é considerada curativa, pois, invariavelmente, algumas

células tumorais permanecem nas áreas adjacentes ao tumor e são capazes de proliferar e

migrar, resultando na recorrência e progressão da doença (WILSON et al., 2014; WṺRTH et

al., 2014). Porém, mesmo não sendo curativa, a cirurgia se faz necessária para reduzir o

tumor primário e facilitar a eficácia dos tratamentos pós-cirúrgicos, que consistem no uso da

radioterapia focal e quimioterapia (STUPP et al., 2005 apud WṺRTH et al., 2014).

A radiação é capaz de quebrar as fitas simples e duplas do DNA das células, inibindo

a proliferação tumoral e induzindo morte celular por apoptose (ERIKSSON e STIGBRAND,

2010). De acordo com Barani e Larson (2015), um estudo de 1966 do Instituto de Neurologia

de Montreal (Canadá) foi o primeiro a reportar que a radioterapia era capaz de reduzir

gliomas. De lá até aqui, a radioterapia tem sido uma importante abordagem terapêutica contra

o glioblastoma (BARANI e LARSON, 2015).

O atual padrão de tratamento de glioblastoma com radioterapia é feito através da

aplicação de aproximadamente de 50 a 60 Gy de radiação diretamente na região do tumor.

Esta faixa de radiação ionizante se mostrou eficaz em aumentar a sobrevida de pacientes com

glioblastoma que passaram pela remoção cirúrgica (BARANI e LARSON, 2015). Outros

estudos também já demonstraram o efeito benéfico da radioterapia com doses mais brandas

de radiação em idosos (25 Gy) (HALANI et al., 2017).

A radiação vem sendo investigada como capaz de provocar efeitos positivos no

combate de células tumorais em estudos in vitro. A radiação foi associada com a capacidade

de reduzir a migração e a proliferação de linhagens de células tumorais, além de promover

danos ao seu DNA, estimulando a apoptose (FEOFANOVA et al., 2014). Esses efeitos

positivos da radioterapia já estão sendo empregados em culturas de glioblastoma. O trabalho

de Gomez-Roman e colaboradores mostrou a eficácia da radioterapia em modelo 3D de

27

células de glioblastoma, permitindo entender melhor as limitações do uso da radiação para se

atingir um melhor manejo do tratamento (GOMEZ-ROMAN et al., 2017). O trabalho do

grupo de Pasi mostrou os efeitos positivos da radioterapia no combate as células de

glioblastoma das linhagens T98G e U251. A radiação foi capaz de reduzir a sobrevida e a

proliferação dessas células de forma dose-dependente (PASI et al., 2014).

Durante muitos anos o tratamento clínico do glioblastoma era feito somente com

cirurgia e radioterapia (WILSON et al., 2014). No entanto, em 2004, grupos da Organização

Europeia para Pesquisa e Tratamento do Câncer (EORTEC) e do Instituto Nacional de

Estudos Clínicos de Câncer no Canadá (NCIC) apresentaram um estudo fase 3 comparando a

sobrevida de pacientes que tratavam somente com radioterapia pós-cirúrgica e pacientes que

eram tratados com radioterapia combinada com TMZ. Este estudo mostrou que a sobrevida

de pacientes que só tratavam com radioterapia era de 12,1 meses. Porém, a sobrevida de

pacientes que foram submetidos ao tratamento com radioterapia associada à TMZ se mostrou

maior (14,6 meses) (THAKKAAR et al., 2014).

Além de Thakkaar e colaboradores (2014), outros pesquisadores também

demonstraram que o uso concomitante de radioterapia com TMZ é capaz de estender a vida

dos pacientes. Essa combinação seria, portanto, um tratamento melhor do que o uso

individual de cada uma dessas terapias (HALANI et al., 2017). A partir destas pesquisas foi

possível estabelecer um novo regime de tratamento para pacientes com glioblastoma,

buscando melhorar a sobrevida e a qualidade de vida dos pacientes (WILSON et al., 2014).

Atualmente, a recomendação clínica é o uso do protocolo de Stupp para o tratamento

clínico do glioblastoma. Este protocolo preconiza o uso de 60 Gy de radiação com 75 mg/m2

de TMZ (STUPP et al, 2007).

O quimioterápico TMZ atua como agente alquilante de DNA das células, adicionando

um grupamento metil nas bases purinas, levando ao dano no DNA e indução de morte celular

por apoptose (WILSON et al., 2014).

Quimicamente, a TMZ pertence à classe das imidazotetrazinas. A estrutura

apresentada na figura 3 contém um anel imidazol e é estruturalmente similar à dacarbazina,

um triazeno que também é usado como agente antineoplásico alquilante de DNA (ALMEIDA

et al., 2005). A TMZ é uma molécula lipofílica e apresenta baixo peso molecular (194

28

daltons), sendo facilmente absorvida através da administração oral. Além disso, a molécula é

estável em pH ácido e já foi descrita em modelos animais (PATEL et al., 2003;

AGARWALA e KIRKWOOD, 2000) e também em ensaios clínicos em humanos como

capaz de ultrapassar a barreira hematoencefálica (ZHU et al., 2014; BAKER et al., 1999).

Figura 3: Estrutura química da TMZ. A estrutura da TMZ foi obtida através do programa PubChem

(National Center for Biotechnology Information, 2017).

A TMZ é hoje o quimioterápico de primeira escolha para o tratamento clínico de

glioblastoma por ser lipofílica, por ser capaz de atravessar a barreira hematoencefálica e por

trazer benefícios aos pacientes na prática clínica. No entanto, apesar de sua efetividade, as

células tumorais podem apresentar resistência a este quimioterápico (PINHEIRO et al.,

2016).

O alvo principal da TMZ para provocar seu efeito citotóxico é a O6-metil guanina. No

entanto, o gene de reparo de DNA chamado O-6-Metilguanina-DNA-metiltransferase

(MGMT) é capaz de aumentar a resistência a alquilação do DNA pela remoção do grupo

metil da posição O-6-metil guanina, tornando as células resistentes à ação da TMZ e gerando

uma falha no tratamento (PINHEIRO et al., 2016; THAKKAR et al., 2014; WILSON et al.,

2014). Por este motivo, mesmo sob regime de tratamento, muitos pacientes com glioblastoma

apresentam baixa sobrevida (PATEL et al., 2014).

Com o objetivo de reverter esta resistência à TMZ, uma das estratégias terapêuticas é

sua associação com outros quimioterápicos (PINHEIRO et al., 2016). Por este motivo, as

pesquisas em pacientes com glioblastoma evoluem no sentido da combinação de TMZ não só

com a radioterapia, mas também com diferentes fármacos (HAAR et al., 2012).

29

Conforme mencionado anteriormente, diversos estudos clínicos com pacientes com

glioblastoma mostram que, sozinha, a TMZ apresenta alguns benefícios, porém, o seu uso

concomitante com a radioterapia é capaz de estender ainda mais a sobrevida desses pacientes

(FENG et al., 2017; HALANI et al., 2017; LOMBARDI et al., 2015). Ensaios in vitro

também já mostraram que essa associação de TMZ com radioterapia torna o combate das

células de glioblastoma mais efetivo (KOUKOURAKIS et al., 2016; COMBS et al., 2007).

Além desta associação positiva com a radiação, a TMZ já está sendo estudada em

combinação com outros fármacos antitumorais. Em um relato de caso clínico de paciente com

glioblastoma, a nitrosureia fotemustina foi associada à TMZ e este tratamento mostrou-se

capaz de reverter a resistência à TMZ provocada por alteração em MGMT (GALLO et al.,

2010). O anticorpo monoclonal bevacizumab, bloqueador de fator de crescimento endotelial

vascular (VEGF), apesar de aprovado pelo Food and Drug Administration (FDA) para uso

em monoterapia, também vem apresentando resultados positivos em ensaios clínicos quando

associado com TMZ para o tratamento de pacientes recém-diagnosticados com glioblastoma

(DU et al., 2016; FU et al., 2016; CHINOT et al., 2011). Outros ensaios clínicos e trabalhos

científicos também sugerem que a combinação de interferon-β com TMZ é capaz de

aumentar a eficácia terapêutica pela inativação de MGMT (PARK et al., 2015;

WAKABAYASHI et al., 2008; NATSUME et al., 2008).

De modo geral, a combinação de tratamentos permite aumentar o número de alvos de

ação para tentar contornar a resistência das células tumorais. Porém, algumas células podem

continuar com seus mecanismos de reparo de DNA além de expressar transportadores de

efluxo tais como P-gp, BCRP1 e MRP, o que pode acarretar em um insucesso no tratamento,

aumentando a necessidade de desenvolver tratamentos alternativos capazes de, ao menos,

melhorar a sobrevida dos pacientes com glioblastoma (PINHEIRO et al. 2016).

1.4.2. NOVAS ESTRATÉGIAS TERAPÊUTICAS NO TRATAMENTO DE

GLIOBLASTOMA

Apesar da ressecção cirúrgica e terapia combinada de radioterapia e quimioterapia

consistirem no tratamento convencional de glioblastoma, sabe-se que 70% dos pacientes

apresentam progressão e recorrência da doença (DAVIS, 2016). Por este motivo, a busca por

30

novos fármacos e novas abordagens terapêuticas vem ganhando mais importância no

tratamento de glioblastoma, uma vez que as atuais terapias não permitem prolongar tanto a

vida dos pacientes não somente pela geração de resistência das células como também pela

toxicidade (SOLETTI et al., 2008).

A maior parte dos trabalhos científicos e pesquisas com glioblastoma se voltam para

entender melhor como estas células se desenvolvem e como o ambiente tumoral pode

propiciar novas oportunidades através dos tratamentos alternativos (LIMA et al., 2012).

As altas capacidades proliferativa e invasiva do tumor têm sido alvo de importantes

pesquisas direcionadas na busca de compostos naturais capazes de agir sobre as células

tumorais (HAAR et al., 2012). Além disso, a constante necessidade de desenvolver

alternativas com menores efeitos colaterais faz com que o uso de compostos naturais se torne

uma estratégia no tratamento do câncer (ALI et al., 2012).

Terpenos (RABI e BISHAYEE et al., 2009), alcaloides (LU et al., 2012; PACKER et

al., 1993), taninos (SEERAM et al., 2005), cumarinas (ZHANG et al., 2015) saponinas

(NOTÉ et al., 2015) e flavonoides (CHAHAR et al., 2011; JEONG et al., 2009) são

exemplos de compostos naturais que já vem sendo avaliados em ensaio in vitro quanto a sua

atividade anti-câncer sobre diversos tipos tumorais como tumor de mama, carcinoma, câncer

de cólon, entre outros (KHALID et al., 2016; ALI et al., 2012, BHANOT et al., 2011; CAI et

al., 2004).

Dentre os compostos naturais com atividade antitumoral, os flavonoides têm se

destacado por atuar em vias de sinalização capazes de modular efeitos antiproliferativos,

induzir apoptose, apresentar efeito antioxidante, entre outros (CHAHAR et al., 2011;

NONES et al., 2011).

Os flavonoides quercetina e o epigalocatequina-3-galato (EGCG), por exemplo, vem

sendo amplamente descritos pela sua capacidade de interagir e aumentar a expressão de genes

envolvidos na regulação do ciclo celular, além de agir também sobre proteínas envolvidas nos

processos de proliferação, morte e migração celular. A quercetina já teve seu efeito descrito

sobre indução de apoptose de linhagens de carcinoma, tumor de próstata e de cólon através

do aumento na expressão de proteínas supressoras de tumor p53 e p21 além de atuar sobre a

proliferação celular via proteína cinase regulada por sinal extracelular (ERK) e via proteína

31

cinase B (AKT) (LIAO et al., 2015). Já a EGCG seria capaz de inibir a progressão de

carcinoma hepatocelular via ativação da proteína cinase ativada por 5-adenosina

monofosfatase (AMPK), inibindo assim a proliferação celular (LIAO et al., 2015). Esses

estudos recentes vêm mostrando, portanto, a ação dos flavonoides sobre o ciclo celular

através da interação com proteínas supressoras de tumor como p53 e p21 e sobre atuação

também em vias de sinalização de apoptose mediada por proteínas cinases (LIAO et al.,

2015).

A associação de flavonoides com quimioterápicos também é uma nova abordagem

terapêutica para o combate de tumores. Esta associação tem se mostrado eficaz em reduzir a

resistência das células ao quimioterápico, além de reduzir o risco de recorrência do tumor

(TAYLOR e JABBARZADEH, 2017). Um exemplo de sucesso com essa combinação de

flavonoide com quimioterápicos foi mostrado recentemente pela associação de quercetina

com doxorrubicina. Esta combinação foi efetiva na redução da proliferação de células tronco

de câncer de cólon (ATASHPOUR et al., 2015 apud TAYLOR e JABBARZADEH, 2017).

A quercetina combinada também já se mostrou eficaz no tratamento de glioblastoma.

Sua combinação com TMZ foi efetiva no tratamento das linhagens de glioblastoma U251 e

U87 em um estudo in vitro. Neste estudo, foram avaliadas duas linhagens que são resistentes

a TMZ, porém, quando este quimioterápico foi combinado com o flavonoide quercetina,

ocorreu um efeito aditivo que culminou no processo de morte celular por apoptose. Segundo

os autores, a apoptose ocorreu porque a quercetina foi capaz de promover sensibilização das

células tumorais à TMZ, potencializando o efeito do quimioterápico no combate aos tumores

e reduzindo a resistência das células ao tratamento (SANG et al., 2014).

Ao que parece, os flavonoides tanto sozinhos quanto em combinação com agentes

quimioterápicos parecem ser efetivos no combate de tumores, inclusive do glioblastoma. Por

este motivo, estes compostos precisam ser mais estudados para melhor avaliarmos seus

efeitos de forma isolada ou em associação com agentes quimioterápicos já usados na prática

clínica para o tratamento de glioblastoma.

32

1.5. OS FLAVONOIDES O potencial terapêutico anti-câncer de alguns derivados naturais já vem sendo

estudado há algum tempo e, hoje, quase metade dos medicamentos usados nos protocolos

internacionais para o tratamento do câncer apresentam origem de fontes naturais (BHANOT

et al., 2011). Vincristina, vinblastina, paclitaxel, docetaxel, etoposídeo e doxorrubicina são

alguns exemplos de quimioterápicos de origem natural usados no tratamento de diversos

tumores (BHANOT et al., 2011; NOBILI et al., 2009).

Na busca pela descoberta de novos compostos naturais com atividade antitumoral, os

flavonoides estão se destacando por agir em diversas vias que levam a redução da progressão

tumoral, contribuindo assim para prevenção do câncer (HAAR et al., 2012; CHAHAR et al.,

2011). O grupo de Mohammad Mansuri aponta essas moléculas como capazes de prevenir

muitas doenças devido não somente a sua função antioxidante, mas também pela capacidade

de modulação de vias de sinalização celulares como AKT e ERK, além de outras vias que são

cruciais para a patogênese do câncer (MANSURI et al., 2014).

Além dos efeitos modulatórios, o baixo efeito colateral e baixo custo associado aos

flavonoides contribuem de forma positiva para a abertura de novos horizontes através da

exploração destes compostos no tratamento do câncer (DUNG et al., 2012).

Os flavonoides são compostos polifenólicos encontrados em uma grande variedade de

frutas e vegetais comuns à dieta de pessoas com hábitos alimentares saudáveis. Nos vegetais,

esses compostos agem como metabólitos secundários, responsáveis pela pigmentação e,

acredita-se que existam mais de 4000 tipos diferentes de flavonoides na natureza (CHEN et

al., 2016; SAK, 2014; FERREYRA et al., 2012; CHAHAR et al., 2011).

Quimicamente, os flavonoides são compostos cuja estrutura básica (C6-C3-C6)

apresenta-se distribuída em três anéis (A, B e C). Conforme mostrado na figura 4, os anéis A

e B são benzênicos, ou fenólicos quando ligados a um grupamento hidroxila (OH-) em

diferentes posições. Esses anéis A e B estão ligados por um heterociclo oxigenado, o anel C.

A grande variedade de flavonoides encontrados na natureza ocorre através das diversas

combinações possíveis de hidroxilas, metoxilas e glicosilações ligadas à estrutura (CHAHAR

et al., 2011).

33

Figura 4 - Estrutura básica dos flavonoides. A estrutura foi obtida através do programa PubChem. É possível ver na imagem os 3 anéis (A, B e C) compondo o esqueleto básico de todo flavonoide. Diversos radicais podem se ligar a estes anéis, dando origem a diferentes classes de flavonoides (NATIONAL CENTER FOR BIOTECHNOLOGY INFORMATION, 2017).

Os flavonoides estão categorizados em diferentes classes. As principais classes de

flavonoides são: flavonois (Kaempferol e Quercetina), flavonas (Diosmina e Apigenina),

flavanois (Catequina e Epicatequina), antocianinas (Cianidina e Malvidina), flavanonas

(Naringenina e Taxifolina) e isoflavonas (Gliciteina) (KATYAL et al., 2014; SAK, 2014;

FRIEDLI G.L, 2014; HUBER e RODRIGUES-AMAYA, 2008).

As diferenças entre cada classe ocorrem de acordo com o nível de saturação do anel

central C, que pode ser um pirano heterocíclico, formando os flavanois e antocianinas ou uma

pirona, formando os flavonois, flavonas, isoflavonas e flavanonas (KUMAR e PANDEY,

2013; HUBER e RODRIGUES-AMAYA, 2008). Além disso, a posição de grupamentos

hidroxilas, grau de metilação e glicosilação também podem influenciar na estrutura de cada

flavonoide (RODRIGUES DA SILVA et al., 2015). Apesar das classes de flavonoides se

diferenciarem no padrão de substituição do anel C, os compostos individuais, ou seja, cada

flavonoide é diferenciado no padrão de substituição dos anéis A e B (KUMAR e PANDEY,

2013).

Nos últimos anos, os flavonoides têm atraído a atenção de grupos científicos por conta

da descoberta de diversas funções associadas a esses compostos. A natureza dos grupos

substituintes e suas posições na estrutura dos anéis podem influenciar não só na estrutura

final como também determinar sua função. Além disso, a baixa toxicidade gera ainda mais

interesse nas pesquisas (HAVSTEEN, 2002).

34

Dentre os efeitos já descritos e associados aos flavonoides estão sua função

antioxidante (HANCI et al.,2016; LUCA, et al., 2016; MAATOUK et al., 2016;

PROCHAZKOVA et al., 2011), efeito anti-inflamatório (MAATOUK et al., 2016; CADDEO

et al., 2016; SERAFINI et al., 2010), capacidade neuroprotetora (HEMANTH KUMAR et

al., 2016; EL-HORANY et al., 2016; BARRECA et al., 2016), atividade antimicrobiana

(ANSARI et al., 2015; CUSHNIE e LAMB, 2005) e efeito anti-câncer (CHEN et al., 2016;

LEWINSKA et al., 2015; SAK, 2014; SABARINATHAN et al., 2010; JEONG et al., 2009).

Estudos in vitro sugerem que os flavonoides são capazes de penetrar nas células e

modular a atividade celular atenuando dano oxidativo, inibindo proliferação de células

tumorais, induzindo morte celular por apoptose, influenciando em diferentes fases do ciclo

celular e reduzindo angiogênese, contribuindo assim para inibir a progressão tumoral.

Estudos in vivo em modelos animais também têm sugerido um efeito protetor por parte dos

flavonoides contra a iniciação e progressão tumoral. No entanto, os mecanismos precisos

pelos quais esses compostos exercem efeitos benéficos na terapia antitumoral ainda

permanecem incertos (FANTINI et al., 2015; SAK, 2014; ANGST et al., 2013; BARNES,

1998).

O artigo de revisão de Amado e colaboradores mostra que os flavonoides tem sido

grandes aliados no combate de tumores, inclusive do glioblastoma. Os autores também

ressaltaram a capacidade dos flavonoides em modular distintas vias de sinalização envolvidas

no processo de tumorigênese como, por exemplo, proteínas cinases da subfamília

serina/treonina (MAPK), o fator nuclear kβ (NF-kβ) e a via de sinalização intracelular Wnt/β-

catenina. Sendo assim, esses compostos naturais apresentam potencial para a terapia do

câncer, tanto sozinhos quanto em combinação com outros agentes (AMADO et al., 2011).

Conforme mencionado anteriormente, pesquisas recentes têm buscado novas

estratégias terapêuticas através da combinação de flavonoides com a TMZ para o combate de

glioblastoma (LEE, 2017). Um estudo recente mostrou que as formulações lipossomais de

TMZ associada com quercetina foram mais efetivas no combate de células de glioblastoma

da linhagem U87 do que TMZ e quercetina sozinhos (HU et al., 2016). Wang e seus

colaboradores mostraram em um artigo publicado em 2015 que o flavonoide hispidulina

aumenta o efeito antitumoral da TMZ, uma vez que a associação do quimioterápico com o

flavonoide se mostrou mais eficaz do que o tratamento com ambos isoladamente (WANG et

35

al., 2015). Efeito similar foi descrito no trabalho publicado em 2015 por Yang e

colaboradores, onde a combinação de icariina com TMZ foi mais eficaz na redução da

viabilidade de células de glioblastoma U87 do que ambos separados (YANG et al., 2015).

Alguns flavonoides como apigenina, luteolina, quercetina, hispidulina, kaempferol e

catequina foram descritos como indutores de apoptose em células de glioblastoma (KIM et

al., 2016; CHAKRABARTI e RAY, 2016; SANTOS et al, 2015; VIDAK et al., 2015;

JAKUBOWICZ-GIL et al., 2013; DAS et al., 2010). Adicionalmente, a combinação de

alguns destes flavonoides com o quimioterápico TMZ também se mostrou eficaz sobre

diferentes linhagens de glioblastoma humano (HU et al., 2016; WANG et al., 2015; YANG

et al., 2015).

Considerando este contexto positivo com o uso de flavonoides tanto de forma isolada

quanto em combinação com TMZ, se torna importante estudar e compreender o efeito de

destes compostos sobre a viabilidade celular e progressão do glioblastoma com objetivo de

melhor elucidar a atividade antitumoral destes compostos (SANTOS et al, 2015).

1.6. O FLAVONOIDE DIOSMINA A diosmina é um flavonoide encontrado em algumas frutas cítricas como laranja,

tangerina e limão (YOO et al., 2007). De acordo com a monografia publicada pela

Alternative Medicine Review (2004), a diosmina foi isolada pela primeira vez em 1925 a

partir de Scrophularia nodosa, uma planta comumente encontrada na Europa e América do

Norte e conhecida pelo nome popular de erva de São Pedro (Portal Plantas que curam, 2016).

A estrutura química da diosmina é apresentada na figura 5.

36

Figura 5: Estrutura química da diosmina (C28H32O15). A estrutura da diosmina foi obtida através do

programa PubChem (NATIONAL CENTER FOR BIOTECHNOLOGY INFORMATION, 2017).

Quimicamente, a diosmina é definida como 3,5,7-trihidroxi 4-metoxiflavona 7

rutinosideo (C28H32O15) (DUNG et al., 2012; SILAMBARASAN e RAJA, 2012; YOO et al.,

2007) e pertence a classe das flavonas por apresentar no anel C de sua estrutura uma ligação

dupla entre C2 e C3 e nenhum grupamento hidroxila em C3 (figura 5) (HUBER e

RODRIGUEZ-AMAYA, 2008; HARBORNE et al., 1975). Em sua estrutura química, a

diosmina apresenta alguns radicais como um rutenosideo, hidroxilas e metoxilas (GUERRERO

et al., 2012)

A diosmina é um flavonoide análogo à hesperidina (EL-SHAFE e EL-DOMIATY,

2001) e, molecularmente, ambos se diferem pela presença de uma ligação dupla entre dois

átomos de carbono no anel central da diosmina (Alternative Medicine Review, 2004). Na

literatura, ela já foi descrita como um bioflavonoide com propriedades antioxidante, anti-

inflamatória e com capacidade de inibir a síntese de prostaglandinas e tromboxano (TAHIR

et al., 2013; SILAMBARASAN e RAJA, 2012; DUNG et al., 2012; BENAVENTE-

GARCIA e CASTILLO, 2008). As atividades biológicas mais conhecidas da diosmina são a

anti-inflamatória e a protetora vascular, sendo usada a mais de 30 anos no tratamento de

hemorroidas e varizes (SRINIVASAN e PARI, 2012; EL-SHAFAE e EL-DOMIATY, 2001;

HITZENBERGER, 1997).

37

Alguns estudos já demonstraram os efeitos biológicos da diosmina em humanos.

Diana e colaboradores (2000) investigaram o efeito da administração de 450 mg diosmina por

7 dias em pacientes com crise de hemorroida e observaram uma redução em 67% do

sangramento e 79% da dor nos pacientes (DIANA et al, 2000). Em um estudo observacional

prospectivo, pacientes que fizeram uso de um medicamento contendo diosmina tiveram uma

melhora no quadro de hemorroida com diminuição da dor, prurido e sangramento

(MESHIKHES, 2004). Um ensaio clínico de 1996 apresentou os benefícios de um

medicamento contendo 450 mg de diosmina. Neste estudo, foi comparado o tratamento com

diosmina associada a heparina com o tratamento somente feito com a heparina. Os resultados

apontaram um melhor efeito na redução do risco tromboembólico e de hematomas em

pacientes submetidos ao tratamento combinado com diosmina em relação ao tratamento

somente com heparina (TSIMOYIANNIS et al., 1996).

Por ser considerada uma substância segura e não tóxica (HITZENBERGER, 1997), a

diosmina já se encontra presente em medicamentos comercializados para uso contínuo. A

associação de diosmina (450 mg) com um outro flavonoide, a hesperidina (50 mg), formam

os constituintes de um medicamento indicado e prescrito para manifestações de doença

venosa crônica, varizes, edemas e estados pré-ulcerosos nos membros inferiores. Segundo a

bula de dois medicamentos comerciais que contém diosmina em sua formulação, este

flavonoide é capaz de aumentar a velocidade de circulação do sangue nas veias,

normalizando a permeabilidade capilar e reforçando sua resistência (ACHÉ

LABORATÓRIOS FARMACÊUTICOS S.A., 2015; LABORATÓRIOS SERVIER DO

BRASIL LTDA, 2014).

Alguns estudos vêm demonstrando que, além do efeito anti-inflamatório, a diosmina

também é capaz de exercer efeito citotóxico sobre linhagens de células tumorais de próstata

(LEWINSKA et al., 2014), carcinoma hepático (DUNG et al., 2012), tumor de cólon

(TANAKA et al., 2001; TANAKA et al., 1997), tumor de bexiga (YANG et al., 1997), tumor

de esôfago (TANAKA et al., 1997) e melanoma (ÁLVAREZ et al., 2009; MARTÍNEZ et al.,

2005). Estes dados indicam que o flavonoide diosmina pode se tornar um promissor

candidato na prevenção e terapia de alguns tumores por conta do baixo custo associado ao

seu isolamento além da baixa toxicidade e menores efeitos adversos em comparação com a

quimioterapia (JUNIOR et al., 2017; DUNG et al., 2012; TANAKA et al., 1997; YANG et

al., 1997).

38

Apesar de exercer efeito sobre diferentes tipos tumorais, ainda não existem estudos

que avaliam o papel da diosmina sobre células de glioblastoma humano. No entanto, já

existem trabalhos que avaliam o efeito de outros flavonoides pertencentes a mesma classe das

flavonas como a apigenina e a rutina.

A apigenina é um flavonoide abundantemente presente em uvas, laranja e camomila.

A apigenina, mesmo sendo da mesma classe da diosmina, apresenta diferenças estruturais na

molécula. Quimicamente a apigenina é conhecida como 4`,5,7 trihidroxiflavona (C15H10O5).

A apigenina é uma molécula aglicona, enquanto a diosmina, conforme descrito

anteriormente, apresenta um rutenosideo. Recentemente, a apigenina ganhou interesse

particular não só pelas suas propriedades antioxidante, anti-inflamatória e antiviral, mas

também dado a sua capacidade de combater diversos tipos tumorais (SHUKLA e GUPTA,

2010).

Figura 6: Estrutura química da apigenina (C15H10O5). A estrutura foi obtida através do programa PubChem

(NATIONAL CENTER FOR BIOTECHNOLOGY INFORMATION, 2017) .

Santos e colaboradores (2015) mostraram em um estudo recente o efeito citotóxico de

50 µM apigenina sobre a redução da viabilidade e inibição da proliferação de células de

glioblastoma das linhagens GL-15 e U251 (SANTOS et al., 2015). Kim e colaboradores

(2016) também demonstraram que apigenina foi capaz de reduzir o crescimento de células de

glioblastoma U87MG de forma concentração-dependente além de reduzir a migração tanto de

U87MG quanto de U373MG na concentração de 25 µM (KIM et al., 2016). Já Coelho e

colaboradores (2016) mostraram que apigenina, além de reduzir a proliferação e migração

celular através da redução da produção do fator promotor de tumorigênese chamado de fator

de necrose tecidual (TNF-α) e da interleucina 10 (IL-10), citocina envolvida na resposta

imune e na interação das células transformadas com o SNC. Além disso, este mesmo trabalho

39

mostrou que a apigenina também é capaz de induzir apoptose e autofagia em células de

glioma C6 através pelo aumento na expressão de uma espécie reativa de oxigênio, o óxido

nítrico (NO) (COELHO et al., 2016).

A rutina (quercetina-3-rutenosideo) ou vitamina P, assim como a diosmina apresenta

um rutenosídeo na estrutura e também é conhecida por suas propriedades anti-inflamatórias e

vasoreativas, sendo capaz de diminuir a permeabilidade capilar e promover vasoconstricção

nos vasos sanguíneos periféricos (LA CASA et al., 2000). Além destas funções vasculares, a

rutina já foi estudada com efeito antineoplásico. O trabalho de Santos e colaboradores (2015)

mostrou que a rutina foi capaz de reduzir a viabilidade, inibir a proliferação e reduzir a

migração de células de glioblastoma GL-15 pela sua capacidade de diminuir a expressão da

metaloproteínase de matriz do tipo 2 (MMP-2) (SANTOS et al., 2015). Zhang e

colaboradores (2017) mostraram o efeito positivo da combinação da rutina com TMZ na

redução da viabilidade de distintas linhagens de glioblastoma (U87, D54 e U251). Esta

redução na viabilidade se deu porque a rutina foi capaz de bloquear uma resposta protetora

das células tumorais ao inibir a autofagia mediada pela proteína auto-reguladora de destruição

celular JNK (ZHANG et al., 2017).

Figura 7: Estrutura química da rutina (C15H10O5). Essa estrutura foi obtida através do programa PubChem

(NATIONAL CENTER FOR BIOTECHNOLOGY INFORMATION, 2017).

Dado o contexto favorável de alguns flavonoides contra o glioblastoma, entender o

papel destes compostos, quando usados sozinhos ou em combinação com outras drogas, sobre

a viabilidade, crescimento, proliferação e morte de células tumorais se faz necessário para,

40

futuramente, ser possível projetar novos protocolos terapêuticos. Além disso, sabendo-se que

apigenina e rutina, flavonoides que pertencem à classe das flavonas já são conhecidos por seu

efeito citotóxico sobre diferentes linhagens de glioblastoma, é possível inferir que,

possivelmente, outras flavonas, como a diosmina, também possam promover a morte de

células de glioblastoma. Por este motivo, é necessário avaliar o efeito da diosmina em

diferentes linhagens de glioblastoma humano para determinar se este composto é capaz de

induzir processo de morte por apoptose.

1.7. MORTE CELULAR POR APOPTOSE INDUZIDA POR DIOSMINA

Alguns estudos já buscam desvendar as atividades de compostos naturais com

objetivo de descobrir as vias de sinalização pelas quais eles atuam e provocam seus efeitos

sobre a indução de morte das células tumorais por apoptose (KONCZAK et al., 2011 apud

DURAIKANNU e PERUMAL, 2013).

A morte celular programada, também chamada de apoptose é um fenômeno biológico

que garante a homeostasia celular. A manutenção dos organismos multicelulares depende de

um balanço constante da proliferação e morte celular. A desregulação deste processo pode

levar a diversas doenças como o câncer (FESTJENS et al., 2006; DUVAL et al., 1985).

Portanto, o processo de apoptose pode ser considerado crítico para a sobrevivência celular e

ele ocorre após a ativação de uma séria de diferentes fenômenos em resposta a alterações

fisiológicas e patológicas (FESTJENS et al., 2006).

O fenômeno da apoptose é caracterizado pela fragmentação do DNA das células,

presença de alterações morfológicas que levam as células a um formato esférico, células com

núcleo picnótico, além de outros fenômenos como a externalização de fosfatidilserina e

ativação da via das caspases (FESTJENS et al., 2006).

A ativação do processo de apoptose pode ocorrer de duas formas: pela via extrínseca

ou citoplasmática ou pela via intrínseca ou mitocondrial. A via extrínseca é ativada por

ligantes específicos que se ligam a receptores de morte celular na superfície das células e a

receptores ligantes de necrose tumoral, promovendo a agregação de proteínas adaptadoras

que se ligam ao receptor, que por sua vez se liga ao pró-domínio de caspases iniciadoras,

resultando na ativação da pró-caspase 8, que cliva caspase-3, levando ao processo de

41

apoptose. Já a via intrínseca é ativada em resposta a danos ao DNA provocado por radiação,

medicamentos citotóxicos, estresse celular, entre outros fatores. Após o dano celular, ocorrem

respostas como modificações no potencial de membrana e alteração de permeabilidade

celular, levando a liberação de proteínas mitocondriais para o citoplasma e,

consequentemente, ativando caspase-9, que por sua vez desencadeia a ativação das caspases

3, 6 e 7, resultando assim no processo de apoptose (PARRISH et al., 2013; OKADA e MAK,

2004 apud BECCENERI, 2008).

Em geral, o fenômeno da apoptose nas células é iniciado pela cascata das caspases. As

caspases são cisteíno proteases essenciais para iniciação e execução do processo de morte

(FESTJENS et al., 2006). As caspases sinalizam o processo de morte celular programada e

são as proteínas responsáveis por clivar os substratos que levam à condensação e

fragmentação nuclear e externalização de fosfolipídios de membrana que irão sinalizar para

estas células serem fagocitadas por macrófagos (GRIVICICH et al., 2007).

São conhecidas 14 caspases humanas, sendo que seis (caspases 3, 6, 7, 8, 9 e 10)

participam do processo de apoptose. Estas caspases são sintetizadas como precursores

inativos denominados zimogênios que, após um sinal de morte celular, são ativados por

clivagem proteolítica, levando à apoptose (FULDA, 2017; GRIVICICH et al., 2007).

A demonstração de que a apoptose é um mecanismo inato de defesa antineoplásica e

que vários agentes quimioterápicos agem através da indução desse tipo de morte celular

levou a uma intensa investigação dos seus mecanismos moleculares e sua aplicação no

tratamento do câncer (GRIVICICH et al., 2007). Por este motivo, diversos estudos apontam

que a terapia anticâncer efetiva deve atuar através da ativação de vias apoptóticas em células

tumorais, sendo este processo o principal mecanismo pelo qual as células tumorais são

eliminadas. Além disso, a regulação das vias de sinalização de apoptose desencadeadas por

essas terapias anticâncer fornecem informações sobre os mecanismos moleculares que

regulam a resposta das células tumorais (FULDA e DEBATIN, 2013).

De forma geral, um dos fatores que tornam o glioblastoma um tumor agressivo e

maligno é sua capacidade de resistir ao processo de apoptose dada a uma desregulação

intrínseca das células deste tumor. A superexpressão de proteínas oncogênicas como a

proteína murina MDM2, que é reguladora negativa do gene de supressão tumoral 53 (p53), a

desregulação da via de sinalização PI3K/AKT responsável por respostas de sobrevivência

42

celular, a falta de função e mutação da proteína homóloga de fosfatase e tensina (PTEN),

aumento na expressão de NF-kβ e da familia de proteínas de células B de linforma tipo 2

(BCL-2), entre outros fatores, contribuem para redução da apoptose em glioblastoma.

Sabendo-se desta evasão ao processo de apoptose, se torna necessário buscar e estudar

reguladores-chave capazes de induzir a apoptose em células de glioblastoma (VALDÉS-

RIVES et al., 2017).

O trabalho de Das e colaboradores (2010) mostrou que alguns flavonoides são

capazes de desencadear a apoptose em células tumorais de glioblastoma através da

modulação de elementos fundamentais da via de transdução de sinais celulares ligados a este

processo de morte celular programada. De forma geral, muitos flavonoides são tidos como

capazes de exercer atividade reguladora de proteínas cinases e caspases (DAS et al., 2010).

Recentemente, o grupo de Lewinska e colaboradores publicou 2 trabalhos onde

demonstra o efeito da diosmina induzindo morte de células tumorais por apoptose. No

trabalho publicado em 2015, Lewinska mostrou que a diosmina, dentro os outros flavonoides

também estudados, apresentou-se como o maior agente genotóxico contra células da

linhagem DU145 de tumor de próstata, induzindo morte celular por apoptose (LEWINSKA et

al., 2015). No trabalho mais recente de 2017, o mesmo grupo mostrou que a diosmina

induziu apoptose em células MCF-7 de tumor de mama mediada, dentre outros fatores pelo

aumento da expressão de caspases (LEWINSKA et al., 2017).

Acredita-se que através da modulação de vias celulares induzidas por compostos

naturais seja possível descobrir novas alternativas terapêuticas para o tratamento do câncer

(MANSURI et al., 2014). Sabendo-se desses efeitos pró-apoptóticos da diosmina e seu

potencial anti-tumoral, entender os mecanismos pelos quais este flavonoide provoca o

processo de indução de morte celular de glioblastoma é fundamental para o desenvolvimento

de futuras terapias anti-câncer.

43

2. JUSTIFICATIVA

Segundo dados da International Union Against Cancer (UICC), o câncer é

responsável por cerca de 13% de todas as causas de óbito no mundo (UICC apud INCA,

2008). No Brasil, o câncer é a segunda causa de morte, estando atrás apenas das doenças

cardiovasculares (INCA, 2014). Por esses motivos, nas últimas décadas, o câncer ganhou

uma enorme dimensão, convertendo-se em um problema de saúde pública (FERREIRA,

2012).

Dados recentes mostraram que os custos globais com medicamentos oncológicos

atingiram, em 2015, um valor de 107 bilhões de dólares e tem um valor estimado para 2020

de mais de 150 bilhões de dólares, indicando que, de fato, o custo para o sistema de saúde do

tratamento dos pacientes com câncer é muito alto (KAKUSHADZE et al., 2017). Em uma

pesquisa norte-americana, foi constatado que, antes da aprovação de agentes quimioterápicos

efetivos para o tratamento de gliomas malignos, os custos médicos diretos totais estimados

para cirurgia e radioterapia de pacientes nos Estados Unidos variam de U$ 50600 a U$ 92700

dolares (RAIZER et al., 2015).

O tumor maligno intracraniano mais comum é o glioblastoma (THAKKAR et al.,

2014). Este tumor é extremamente agressivo, infiltrativo e morfologicamente heterogêneo, o

que dificulta seu tratamento (SANTOS et al., 2015; BIASOLI et al., 2014). Atualmente, o

protocolo de tratamento convencional consiste na remoção cirúrgica, seguida de radioterapia

e quimioterapia com TMZ (STUPP et al., 2007). A retirada total do tumor durante a cirurgia

nem sempre é possível e, infelizmente, os tratamentos de radioterapia e quimioterapia

também não são curativos por conta da elevada resistência das células (BIASOLI et al., 2014;

LOPES et al., 1993).

O prognóstico de pacientes com glioblastoma é muito ruim. A sobrevida média dos

pacientes é de 15 meses. Sendo assim, o glioblastoma pode ser considerado um tumor

bastante letal. O prognóstico ruim e a falha terapêutica dos tratamentos convencionais fazem

com que novas terapias capazes de melhorar a qualidade de vida do paciente ganhem força

(BIASOLI et al., 2014; THOMAS et al., 2012). Nesse contexto, Chahar e colaboradores

(2011) destacaram os flavonoides como possíveis novos tratamentos para combater o câncer,

uma vez que estes compostos se destacam por exercer efeitos importantes contra distintos

tumores (CHAHAR et al., 2011), inclusive sobre linhagens de glioblastoma.

44

Mesmo com os avanços recentes nas pesquisas com compostos naturais, estudos

adicionais ainda são necessários uma vez que flavonoides como, por exemplo a diosmina,

poderiam exercer efeito contra o glioblastoma. No entanto, ainda não existem trabalhos que

descrevam o papel da diosmina sobre estas células.

Uma amostra liofilizada de diosmina foi obtida em colaboração com a Empresa

Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA). O flavonoide em questão foi isolado a

partir de cascas de frutas cítricas que seriam descartadas após o uso das frutas para outras

finalidades.

Segundo dados do colaborador Antonio Gomes Soares, um terço dos alimentos

produzidos para consumo humano são perdidos ou desperdiçados em todo o mundo, o que

contabiliza aproximadamente 1,7 bilhões de toneladas de alimentos. O Brasil é um dos países

que mais contribui para os desperdícios de alimentos, apresentando altos níveis de perdas de

frutas e hortaliças (EMBRAPA, 2015). Desta maneira, ao extrair compostos naturais como os

flavonoides a partir de cascas de frutas, produtos considerados de rejeito, se torna possível

dar uma nova utilidade ao alimento e contribuir para a redução dos desperdícios.

Considerando o efeito promissor dos flavonoides sobre linhagens tumorais como o

glioblastoma, a baixa eficácia do tratamento convencional deste tumor e a oportunidade de

avaliar os efeitos de um composto natural isolado de cascas de frutas, tudo isso faz com que

este trabalho ganhe ainda mais relevância.

Analisar o efeito da diosmina sobre linhagens tumorais de glioblastoma humano é

fundamental para o futuro combate deste tumor e para, futuramente, ser possível projetar

protocolos alternativos para seu tratamento.

45

3. OBJETIVO

3.1. OBJETIVO GERAL

O trabalho em questão teve como objetivo principal avaliar o papel do flavonoide

diosmina em células de glioblastoma humano na busca de novas alternativas para a terapia

antitumoral.

3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Para caracterizar o papel da diosmina sobre as células tumorais de glioblastoma se faz

necessário analisar os efeitos do composto sobre a viabilidade celular, proliferação e morte

em diferentes tempos e concentrações de tratamento a fim de determinar seus efeitos sobre as

linhagens tumorais de glioblastoma humano. Por estes motivos, os objetivos específicos deste

trabalho foram:

I. Predizer o perfil toxicológico, a solubilidade e a permeabilidade da diosmina através de análises computacionais;

II. Comparar o efeito citotóxico da diosmina em células tumorais de glioblastoma e em células de astrócitos humanos sadios;

III. Analisar a viabilidade das células de glioblastoma após o tratamento com diosmina sozinha ou em combinação com o quimioterápico TMZ em diferentes tempos e concentrações de tratamento;

IV. Avaliar o efeito da diosmina sobre a proliferação de células de glioblastoma humano;

V. Avaliar efeitos da diosmina na indução de morte celular de glioblastoma humano e determinar se esse mecanismo de morte programada ocorre pelo fenômeno da apoptose;

VI. Observar possíveis alterações na morfologia das células após o tratamento com diosmina.

46

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1. MATERIAL

4.1.1. CÉLULAS TUMORAIS DE GLIOBLASTOMA HUMANO E ASTRÓCITOS SADIOS

Para este trabalho foram selecionadas três linhagens distintas de células de

glioblastoma humano e uma amostra de astrócito humano sadio (linhagem não tumoral).

Todas essas células humanas são bem estabelecidas para cultura in vitro e são descritas

abaixo:

I. Linhagens tumorais de glioblastoma humano GBM95 e GBM02: estas linhagens

foram obtidas a partir de tecidos de pacientes operados no Hospital Universitário

Clementino Fraga Filho (HUCFF) sob aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa

(CONEP 2340 – Anexo 1). Estas linhagens foram caracterizadas pelo grupo do

professor emérito Vivaldo Moura Neto no Laboratório de Morfogênese Celular

(LMC), pertencente ao Instituto de Ciências Biomédicas (ICB) na Universidade

Federal do Rio de Janeiro (UFRJ) (FARIA et al., 2006).

II. Linhagem U87: esta linhagem foi obtida comercialmente da American Type Culture

Collection (ATCC® HTB-14TM) (ATCC, 2016).

III. Astrócitos humanos não tumorais: estas células sadias foram obtidas a partir do tecido

de pacientes operados no HUCFF sob aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa

(Número do protocolo: DAHEICB 015). Estes astrócitos também foram identificados

e caracterizados no LMC através da imunomarcação com proteína glial fibrilar ácida

(GFAP), típica destas células (DINIZ et al., 2014 e 2012).

4.1.2. AMOSTRA DE DIOSMINA

A amostra do flavonoide diosmina (PM = 608,5 g/mol) utilizada neste trabalho foi

obtida através de uma colaboração com o pesquisador Antonio Gomes Soares da

EMBRAPA.

A diosmina foi extraída a partir de cascas de laranja. A extração do flavonoide foi

feita à frio com o uso do solvente metanol. Após a extração, foi feita a evaporação deste

solvente em um condensador para recuperação de parte do metanol. Após a obtenção do

produto final da extração, foi realizado um processo de purificação por cromatografia líquida

47

de alta performace (HPLC) para comparar os produtos com padrões de referência. A

diosmina foi, posteriormente, caracterizada e confirmada através da ressonância magnética

nuclear (RMN). A pureza da amostra final foi de 96%. Todas estas etapas desde o preparo da

amostra até sua identificação foram feitas pelo nosso colaborador no Laboratório de Pós-

colheita de Frutos e Hortaliças no Centro Nacional de Pesquisa de Tecnologia Agroindustrial

de Alimentos (CTAA) da EMBRAPA - Rio de Janeiro - Brasil.

4.1.3. PRINCIPAIS REAGENTES

• TMZ: Sigma-Aldrich/Merck (número do catálogo: T2577) (SIGMA-ALDRICH/MERCK, 2017)

• Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT): Sigma-Aldrich/Merck (número do catálogo: M2128) (SIGMA-ALDRICH/MERCK, 2003)

• Kit Click-it EdU Alexa Fluor 488 (EdU): Thermo Fisher Scientific (número do catálogo: C10337) (INVITROGEN, 2011)

• Kit In Situ Cell Death Detection, TMR red (TUNEL): Life Science Roche (número do catálogo: 12156792910) (LIFE SCIENCE ROCHE, 2016)

• Cleaved Caspase-3 (D175): Cell Signaling Technology (Referência 02/2013 – lote 42) (CELL SIGNALING TECHNOLOGY, 2017)

• Monoclonal Mouse Anti-Vimentin Clone V9: Dako Agilent Pathology Solutions (Referência M0725 – lote 00072909) (DAKO AGILENT PATHOLOGY SOLUTIONS, 2017)

• Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG: Life Technologies (referência A11034, lote 1670152) (THERMO FISHER SCIENTIFIC, 2017)

• Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG: Life Technologies (referência A11030, lote 1661231) (THERMO FISHER SCIENTIFIC, 2017)

4.2. MÉTODOS

4.2.1. PROTOCOLO DE CULTURA E REPIQUE DE CÉLULAS

O LMC tem estabelecido culturas a partir de células de glioblastomas e astrócitos

humano ressecados pela equipe de neurocirurgia do HUCFF. As linhagens tumorais GBM95

e GBM02 e os astrócitos humanos são células caracterizadas e estabelecidas no próprio

48

laboratório (DINIZ et al., 2012; FARIA et al., 2006), com o devido consentimento dos

pacientes. Além disso, a manipulação destas linhagens está de acordo com as normas de ética

do Ministério da Saúde e devidamente registrado pela CONEP (registro de nº 2340, de 2001)

(Anexo A). Já a linhagem tumoral U87 foi obtida comercialmente da ATCC®, um banco de

células que segue normas internacionais de qualidade com certificação ISSO 9001:2008 e

ISO 13485:2003 (ATCC, 2016).

As três linhagens de células tumorais e os astrócitos humanos sadios são mantidos

congelados em nitrogênio líquido e, para a realização dos ensaios, todas as células foram

descongeladas e lavadas em meio Dubelcco’s Modified Eagle com suplemento F12 (DMEM-

F12- Invitrogen), contendo 10% de soro fetal bovino (SFB - Gibco). Em seguida, as células

foram centrifugadas a 1500 rpm (centrífuga Eppendorf 5702R) por 2 minutos e ressuspensas

em meio DMEM-F12. Após a ressuspensão, as células foram transferidas para garrafas de

cultura de 25 cm2 (TPP®) e incubadas em estufa de gás carbônico (CO2) a 37 °C (Thermo

Forma Series II).

Toda a manipulação das linhagens tumorais foi feita em fluxo laminar (ESCO Class II

type B2 - Airstream) e o meio de cultura foi trocado a cada repique até que a cultura atingisse

a confluência necessária para iniciar os experimentos.

Para o repique celular, as células foram tratadas com tripsina 0,25% (Invitrogen) e

colocadas em estufa a 37 °C por 2 minutos ou até soltarem completamente da garrafa. A

tripsina precisou ser inativada com meio DMEM-F12 suplementado com 10% de SFB e as

células foram centrifugadas em tubo tipo Falcon de 15 ml por 2 minutos a 1500 rpm. Após

essa centrifugação, o sobrenadante foi desprezado e as células foram ressuspendidas em meio

DMEM-F12 com 10% SFB. As células ressuspendidas eram contadas em microscópio

invertido (Zeiss telavar 31), com auxílio de uma câmera de neubauer espelhada (SP labor).

4.2.2. DILUIÇÃO E TRATAMENTO COM DIOSMINA

A amostra de diosmina cedida através da colaboração com a EMBRAPA veio sob a

forma de pó liofilizado. O DMSO foi o reagente usado para diluir a amostra de diosmina e,

por este motivo, este solvente serviu como controle de todos os experimentos.

49

Os cálculos de diluição da diosmina em DMSO levaram em consideração seu peso

molecular (PM). A concentração final da solução estoque foi de 50 mM e para gerar esta

solução estoque, o DMSO foi diretamente adicionado ao tubo de polipropileno tipo

Eppendorf de 2 ml contendo o pó liofilizado de diosmina. Todo o processo foi feito dentro de

fluxo laminar e, para garantir a completa homogeneização da amostra, utilizou-se o agitador

de tubos (Vortex Nova Instruments). A amostra de estoque a 50 mM foi armazenada em

geladeira a 4°C.

A partir do estoque foram preparadas novas amostras de diosmina diluídas somente

no dia de realização de cada experimento. Para a realização dos experimentos, as amostras

dos flavonoides a 50 mM foram retiradas da geladeira e novamente diluídas para alcançar as

concentrações finais entre 10 µM a 150 µM. Essa nova diluição foi feita em meio DMEM-

F12 suplementado com 10% de SFB. A concentração final de diosmina para o tratamento das

células variou de acordo com o planejamento experimental de cada ensaio. O controle dos

experimentos foi constituído pelo DMSO, seguindo as mesmas diluições.

4.2.3. DILUIÇÃO E TRATAMENTO COM TMZ

O quimioterápico TMZ foi comprado da empresa Sigma Aldrich. A TMZ foi diluída

em DMSO seguindo o que é preconizada no protocolo do fabricante (SIGMA-

ALDRICH/MERCK, 2017). Os cálculos de diluição levaram em consideração o peso

molecular (PM) e a concentração final da solução estoque foi 50 mM. Todo o processo de

diluição foi feito dentro de fluxo laminar. A amostra de estoque a 50 mM foi armazenada em

freezer a – 20 °C.

A partir do estoque foram preparadas novas amostras de TMZ diluídas somente no dia

da realização de cada experimento. Para a realização dos experimentos, as amostras do

quimioterápico a 50 mM foram retiradas do freezer e novamente diluídas para alcançar as

concentrações finais de 50, 100 e 200 µM. Essa nova diluição foi feita em meio DMEM-F12

com 10% de SFB.

Também foi realizado um tratamento combinando TMZ com diosmina. A TMZ e a

diosmina foram diluídas em meio DMEM-F12 com 10% de SFB. As concentrações deste

50

tratamento foram as seguintes: 50 µM de diosmina combinada com 200 µM de TMZ e 100

µM de diosmina combinada com 200 µM de TMZ.

4.2.4. AVALIAÇÃO IN SILICO DAS PROPRIEDADES FARMACOCINÉTICAS E TOXICOLÓGICAS DA DIOSMINA

As características farmacocinéticas (absorção, distribuição, permeabilidade e

solubilidade) e as características toxicológicas da diosmina foram analisadas através de

predições in silico. Para a realização destas análises computacionais, a estrutura 2D e 3D da

diosmina foi desenhada e otimizada utilizando-se o software gratuito Avogrado

(Pennsylvania, USA - https://avogadro.cc/).

As predições in silico das propriedades famacocinéticas, físico-químicas e

toxicológicas da diosmina foram realizadas através do software ADMET PredictorTM 7.2.0

(Simulations Plus, CA). Para evitar problemas de liberdade conformacional, a estrutura 2D

foi a escolhida para as análises no ADMET. O software de predição foi ajustado ao pH

fisiológico (2 até 7,4) (MARIEB e HOEHN, 2010). O restante das configurações seguiu o

padrão do próprio programa.

4.2.5. ANÁLISE DA VIABILIDADE CELULAR ATRAVÉS DO ENSAIO COLORIMÉTRICO DE MTT

O MTT é um reagente usando para avaliar a citotoxicidade de um composto sobre as

células (FOTAKIS e TIMBRELL, 2006; MOSMANN, 1983). Neste ensaio colorimétrico, o

MTT foi usado para medição da atividade mitocondrial das células tumorais de glioblastoma

humano e dos astrócitos humanos sadios após tratamento somente com a diosmina e também

com a associação deste flavonoide com a TMZ.

Para os ensaios somente com a diosmina, foram plaqueadas 3 x 104 células de

GBM95, GBM02 e U87 e 5 x 104 de astrócitos humanos por poço da placa de 96 poços

(TPP®). Essas células foram mantidas em meio DMEM-F12 com 10% de SFB e colocadas

em estufa de CO2 a 37 °C por 24 horas, tempo necessário para que as células atingirem a

confluência. Em seguida, o meio foi retirado e adicionou-se o tratamento com diosmina,

diluída em meio DMEM-F12 com 10% de SFB no momento do experimento. As

51

concentrações finais da diosmina para este ensaio foram 10, 50, 75, 100 e 150 µM e o tempo

de exposição das células ao tratamento foi de 24 e 48 horas. O controle do experimento foi

constituído pelo solvente DMSO diluído em meio DMEM- F12 com 10% de SFB para atingir

as mesmas concentrações finais usadas para a diosmina.

Para os ensaios da combinação de diosmina com TMZ, foram plaqueadas 3 x 104

células de GBM95 e GBM02 por poço da placa de 96 poços (TPP®). Essas células foram

mantidas em meio DMEM-F12 com 10% de SFB e colocadas em estufa de CO2 a 37 °C por

24 horas, tempo necessário para que as células atingirem a confluência. Em seguida, o meio

foi retirado e adicionou-se o tratamento com a associação de diosmina e TMZ, diluídos em

meio DMEM-F12 com 10% de SFB. As concentrações finais para este ensaio foram 50 µM

de diosmina associada a 200 µM de TMZ e 100 µM de diosmina com 200 µM de TMZ. Este

tratamento foi comparado com o controle composto pelo solvente DMSO e também

comparou-se com os tratamento isolado de diosmina (50 e 100 µM) e TMZ (50, 100 e 200

µM). O tempo de exposição das células a esses tratamentos foi de 24 e 48 horas.

Após as intervenções com diosmina e TMZ isoladamente e com a combinação de

ambas, retirava-se o meio de tratamento e adicionava-se o MTT aos poços da placa. Para tal,

o MTT em pó foi inicialmente diluído em solução de tampão fosfato salino NaCl, Na2HPO4,

KH2PO4 e KCl (PBS - Isofar®) na proporção de 5 ml de PBS para 25 mg do pó de MTT, o

que leva a uma concentração final de 5 mg/ml. Em seguida, é feita nova diluição da solução

de MTT em meio DMEM-F12 na proporção de 5 µL de MTT para 50 µL de meio de cultura.

Dentro do fluxo laminar, a placa contendo as células tratadas com diosmina e com o

controle foi vertida cuidadosamente e aplicou-se 50 µL da solução de MTT diluída em meio

de cultura. Após 2 horas de contato das células com o MTT dentro da estufa, a placa foi

novamente vertida e o produto da reação (sal de formazan) foi dissolvido com 50 µL de

DMSO.

A leitura do ensaio foi feita em leitor de placa ou leitor de Elisa a 560 nm (Perkin

Elmer Multilabel Counter – Victor 3).

Este experimento foi realizado em triplicata e em três ensaios independentes. A

análise estatística utilizada foi ANOVA. Todas as análises de viabilidade foram realizadas

52

com base na porcentagem de células viáveis em relação ao controle (DMSO), normalizado

para 100%.

4.2.6. AVALIAÇÃO DA MORFOLOGIA CELULAR ATRAVÉS DA MARCAÇÃO COM VIMENTINA

A técnica de imunomarcação das células com a vimentina seguiu o protocolo descrito

pelo fabricante (DAKO AGILENT PATHOLOGY SOLUTIONS, 2017). A vimentina é uma

proteína de citoesqueleto e é constituinte dos filamentos intermediários. Esta proteína é

conhecida pela sua capacidade de manutenção da integridade celular e está presente em todo

o citoplasma das células mesenquimais, auxiliando na detecção da estrutura celular

(SATELLI e LI, 2011)

Para a realização das análises da morfologia celular, as células foram dissociadas por

tripsinização, contadas em microscópio invertido e semeadas em lamínulas de vidro (Knittel

Glass – Deckglaser Cover slips 13 mm) dentro da placa de 24 poços (TPP®). Foram

plaqueadas 5 x 104 células por lamínula. As células foram mantidas em estufa de CO2 a 37 °C

por 24 horas, tempo necessário para atingir confluência.

As células tumorais foram tratadas com diosmina por 24 e 48 horas nas concentrações

de 50 e 100 µM. O controle do experimento foi apenas o solvente DMSO nas mesmas

concentrações e tempos de tratamento.

Passado cada tempo de tratamento, as células foram fixadas com paraformaldeído

(PFA) na concentração de 4% por 15 minutos. Após a fixação, as células foram fotografadas

em contraste de fase no microscópio de luz Nikon TE 300 (objetiva de 20x). Foram feitas 10

fotos de campos distintos.

Para a avaliação do citoesqueleto das células, foi realizada a marcação com a

vimentina. Para tal, as células foram permeabilizadas com o reagente Triton X-100 0,1% por

5 minutos, a temperatura ambiente e foi feito bloqueio com a aplicação de soro de albumina

bovina (BSA) a 5% por 30 minutos. A vimentina (Dako Agilent Pathology Solutions) foi

diluída em BSA (1%) e aplicada diretamente sobre as lamínulas. As células foram incubadas

com o anticorpo por um período “overnight” em geladeira.

53

No dia seguinte, as lamínulas foram lavadas três vezes com PBS. Após as lavangens,

foi aplicado por 60 minutos o anticorpo secundário Alexan Fluor 546 goat anti-mouse IgG

(vermelho), que foi diluído em BSA (1%). Passado o tempo do anticorpo secundário, as

lamínulas foram novamentes lavadas com PBS e incubadas com o corante 4-6-diamino-2-

fenilindol (DAPI) por 5 minutos para marcação dos núcleos celulares.

As lamínulas foram montadas sobre uma lâmina de vidro (Objekttrager – Knittel

Glass – Cut edges/frested end) com solução de montagem (Fluoromount G) e foram

observadas em microscópio de luz Nikon TE 300 onde foram feitas 10 fotos de campos

distintos com objetiva de aumento 40x. A montagem computacional das imagens foi

realizada com auxílio do programa Adobe Photoshop cs versão 8.0.1 (Adobe Systems

Incorporated, USA).

Após a marcação com vimentina, foi analisado o comprimento celular através da

ferramenta “Straight” do programa ImageJ, que permite delimitar as extremidades das células

que foram marcadas pela vimentina. Além disso, com o objetivo de verificar a população de

células no controle e comparar com o número total de células após o tratamento com

diosmina, utilisou-se mais uma vez o software ImageJ versão 1.44p (Weyne Rasband

National Institutes of Health, USA) para realizar a contagem dos núcleos celulares corados

por DAPI.

Foram realizados três experimentos individuais em duplicata para avaliar a

morfologia das células. A análise estatística utilizada foi ANOVA.

4.2.7. ENSAIO DE PROLIFERAÇÃO CELULAR POR KIT CLICK-IT EDU ALEXA FLUOR 488

O ensaio de proliferação por EdU é um método sensível que permite avaliar as células

que estão em estado proliferativo. O EdU age se incorporando ao DNA das células durante a

fase de replicação do material genético e é detectado pela reação de um fluoróforo em seu

grupo terminal, gerando a fluorescência quando há reação e, portanto, quando a célula está

em estado de proliferação (SALIC e MITCHISON, 2008). Portanto, o kit Click-it EdU Alexa

Fluor 488 (Thermo Fisher) foi usado neste trabalho para a avaliação dos efeitos da diosmina

54

sobre a proliferação das células tumorais, seguindo o protocolo descrito pelo fabricante

(INVITROGEN, 2011).

Para a realização deste experimento, foram plaqueadas 5 x 104 células de GBM95 e

GBM02 por poço da placa de 24 poços (TPP®), contendo as lamínulas de vidro (Knittel

Glass – Deckglaser Cover slips 13 mm) . Essas células foram mantidas em meio DMEM- F12

com 10% de SFB e colocadas em estufa de CO2 a 37 °C por 24 horas. Em seguida, o meio foi

retirado e adicionou-se o tratamento com diosmina diluída em meio DMEM-F12 com 10% de

SFB. As concentrações finais da diosmina para este ensaio foram 50 e 100 µM e o tempo de

exposição das células ao tratamento foi de 48 horas. O controle do experimento foi o DMSO

também diluído em meio DMEM-F12 com 10% de SFB nas mesmas condições de

tratamento.

Após passadas 42 horas do tratamento com diosmina, aplicou-se o reagente EdU do

kit para agir durante as 6 horas finais do tratamento de 48 horas em estufa de CO2 a 37 °C.

Após passadas essas últimas 6 horas, as células foram fixadas ainda na placa com PFA 4%

por 15 minutos em temperatura ambiente.

Após a fixação, as lamínulas são retiradas da placa e, a elas adiciona-se a solução de

bloqueio com BSA 3% por 10 minutos. Em seguida, adicionou-se o coquetel reacional de

detecção do kit Click-it EdU Alexa Fluor 488, deixando-o agir por 30 minutos. O preparo do

coquetel reacional seguiu o protocolo e a ordem descritos no manual do fabricante

(INVITROGEN, 2011).

Depois do tempo de ação do coquetel de detecção, as lamínulas foram lavadas por três

vezes com a solução de BSA 3%. Após as lavagens, adiciona-se o último reagente do kit

Click-it EdU Alexa Fluor 488, o corante marcador do DNA nuclear Hoechst 3334. Este

corante agiu por 30 minutos.

A montagem das lamínulas é feita sobre uma lâmina de vidro (Objekttrager – Knittel

Glass – Cut edges/frested end) com solução de montagem (Fluoromount G). As lâminas

foram observadas em microscópio de fluorescência Nikon TE 300. Foram escolhidos dez

campos de cada lamínula para serem fotografados ao microscópio. A montagem

computacional das imagens foi realizada com auxílio do programa Adobe Photoshop cs

versão 8.0.1.

55

Foram realizados três experimentos independentes em duplicata. A quantificação do

número de células presentes nas imagens foi feita com auxílio do programa computacional

ImageJ e a análise estatística utilizada foi ANOVA.

4.2.8. ENSAIO DE MORTE CELULAR COM USO DO KIT IN SITU CELL DEATH DETECTION, TMR RED (TUNEL)

O ensaio do TUNEL é um método usado para marcar os fragmentos de DNA. O

reagente deoxinucleotidil transferase (dUTP) se liga aos terminais onde ocorreu quebra das

fitas de DNA e, o fluoróforo permite a marcação dos núcleos celulares que sofreram algum

processo de fragmentação do seu DNA e condensação de cromatina resultantes do processo

de morte celular (HAN et al., 2013; LIFE SCIENCE ROCHE, 2006). Portanto, o método do

TUNEL pode ser considerado como um ensaio sensível de detecção de células mortas

(ELMORE, 2007; LAING et al., 2006). Sendo assim, o kit In Situ Cell Death Detection, TMR

red (Life Science Roche) foi usado para a avaliação dos efeitos da diosmina sobre a indução

de morte das células tumorais, seguindo o protocolo descrito no manual do fabricante (LIFE

SCIENCE ROCHE, 2016).

Foram plaqueadas 5 x 104 células de GBM95 e GBM02 por poço da placa de 24

poços (TPP®), contendo as lamínulas de vidro (Knittel Glass – Deckglaser Cover slips 13

mm). Essas células foram mantidas em meio DMEM-F12 com 10% de SFB e colocadas em

estufa de CO2 a 37 °C por 24 horas. Em seguida, o meio foi retirado e adicionou-se o

tratamento com diosmina diluída em meio DMEM-F12 com 10% de SFB. As concentrações

finais da diosmina para este ensaio foram 50 e 100 µM e o tempo de exposição das células ao

tratamento foi de 24 e 48 horas. O controle do experimento foi realizado utilizando-se DMSO

nas mesmas condições.

Depois de passado o tempo de tratamento, as células foram fixadas com PFA 4% por

30 minutos e lavadas com PBS. Em seguida, as lamínulas foram retiradas dos poços da placa

e adicionou-se a solução permeabilizante contendo Triton X-100 0,1% e citrato de sódio

0,1%. A solução de permeabilização foi deixada sobre as células por aproximadamente 5

minutos em geladeira. Em seguida, aplicou-se a solução reacional contendo o reagente dUTP

diluído no tampão do próprio kit. Este reagente agiu por 1 hora em estufa CO2 a 37 °C,

56

protegido da luz. Depois de passados os 60 minutos de reação, as lamínulas foram lavadas

com PBS e aplicou-se por 5 minutos o corante DAPI para marcação dos núcleos celulares.

A montagem das lamínulas é feita sobre uma lâmina de vidro (Objekttrager – Knittel

Glass – Cut edges/frested end) com solução de montagem (Fluoromount G). As lâminas

foram observadas em microscópio de fluorescência Nikon TE 300 e foram fotografados dez

campos de cada lamínula. A montagem computacional das imagens foi realizada com auxílio

do programa Adobe Photoshop cs versão 8.0.1.

Foram realizados três experimentos independentes em duplicata. A quantificação do

número de células mortas presentes nas imagens foi feita no programa ImageJ e a análise

estatística utilizada foi ANOVA.

4.2.9. ENSAIO DE MORTE CELULAR POR APOPTOSE ATRAVÉS DA MARCAÇÃO POR CASPASE-3 CLIVADA

A ativação das caspases é um importante marcador de danos celulares e indicador do

processo de morte celular programada. Em ensaios celulares, a ativação da via da caspase-3

clivada é usada como indicativo de apoptose. A caspase-3 em sua forma ativa é usada para

detecção do processo de apoptose uma vez que esta protease é efetora da cascata de execução

do processo, sendo, portanto um marcador de entrada das células na via apoptótica (BD

BIOSCIENCES, 2012). Sendo assim, neste trabalho, a caspase-3 clivada (Cell Signaling

Technology) foi usada para confirmação do processo de morte celular por apoptose

dependente de caspase após tratamento das células tumorais com o flavonoide diosmina. Este

ensaio seguiu o protocolo descrito no manual do fabricante (CELL SIGNALING

TECHNOLOGY, 2017).

Foram plaqueadas 5 x 104 células de GBM95 e GBM02 por poço da placa de 24

poços (TPP®), contendo as lamínulas de vidro (Knittel Glass – Deckglaser Cover slips 13

mm). Essas células foram mantidas em meio DMEM-F12 com 10% de SFB e colocadas em

estufa de CO2 a 37 °C por 24 horas. Em seguida, o meio foi retirado e adicionou-se o

tratamento com diosmina diluída em meio DMEM-F12 com 10% de SFB. As concentrações

finais da diosmina para este ensaio foram 50 e 100 µM e o tempo de exposição das células ao

57

tratamento foi de 24 e 48 horas. Para o controle utilisou-se o DMSO nas mesmas

concentrações e tempos.

Depois de passado o tempo de cada tratamento, as células foram fixadas com PFA 4%

por 15 minutos e lavadas com PBS. Em seguida, as lamínulas foram retiradas dos poços da

placa e adicionou-se a solução permeabilizante contendo Triton X-100 0,1%. A solução de

permeabilização foi deixada sobre as células por aproximadamente 5 minutos em temperatura

ambiente. Em seguida, foi feito o bloqueio com aplicação de BSA 1% por 30 minutos.

O anticorpo (caspase-3 clivada) foi diluído em BSA 1% e aplicado sobre as células.

As lamínulas foram mantidas por um período “overnight” em geladeira. No dia seguinte, as

células foram encubadas por 60 minutos com o anticorpo secundário Alexa Fluor 488 goat

anti-rabbit IgG (verde) também diluído em BSA 1%. Passado o tempo do anticorpo

secundário, as lamínulas foram lavadas com solução salina PBS e, em seguida, aplicou-se o

corante DAPI por 5 minutos para marcação nuclear.

A montagem das lamínulas foi feita sobre uma lâmina de vidro (Objekttrager – Knittel

Glass – Cut edges/frested end) com solução de montagem (Fluoromount G). As lâminas

foram observadas em microscópio de fluorescência Nikon TE 300 e foram fotografados dez

campos de cada lamínula com objetiva de aumento 40x. A montagem computacional das

imagens foi realizada com auxílio do programa Adobe Photoshop cs versão 8.0.1.

Foram realizados três experimentos independentes em duplicata e a quantificação do

número de células apoptóticas foi feita no programa ImageJ. A análise estatística utilizada foi

ANOVA.

4.2.10. ANÁLISE ESTATÍSTICA

Todas as repetições dentro de um mesmo experimento foram avaliadas e a média e

desvio padrão de cada um foram calculados e agrupados para análise estatística. Foi realizada

a análise One-way ANOVA, seguida por teste Tukey. Todas estas análises foram realizadas

com auxílio do programa Graphpad Prism versão 7 (Graphpad Software Inc, USA). Os

parâmetros estatísticos foram usados para determinar as diferenças e corrigir as múltiplas

comparações entre cada grupo. Valores menores que 0,05 (p<0,05) já foram considerados

estatisticamente significativos.

58

5. RESULTADOS

5.1. DIOSMINA NÃO SE MOSTROU TÓXICA NEM MUTAGÊNICA NAS PREDIÇÕES IN SILICO

As análises in silico foram realizadas com objetivo de determinar algumas predições

farmacocinéticas e toxicológicas do comportamento da diosmina no organismo humano. A

tabela 1 apresenta os resultados das principais predições feitas a partir da molécula 2D da

diosmina, simulando seu perfil farmacocinético e toxicológico em pH fisiológico através do

programa computacional ADMET PredictorTM.

Tabela 1: Análises e predições in silico da molécula do flavonoide diosmina. Descrição dos resultados das

análises computacionais in silico para a molécula 2D da diosmina realizados no programa ADMET Predictor

7.2.0. Os principais parâmetros farmacocinéticos e toxicológicos da diosmina estão descritos na tabela 1.

PMa Doadores

ligação hidrogênio

Aceptores ligação de hidrogênio

Log pb BPc HJPd hHERGe Tox agudaf

Teste de

Ames Mutg Hepato

Toxh

608,5 8 15 Polar

(- 0,18) baixa Baixa não Não não não Não

a: peso molecular; b: coeficiente de distribuição octanol-água; c: penetração pela barreia hematoencefálica; d: permeabilidade pelo jejuno

humano; e: toxicidade cardíaca por inibição do canal hHERG K+ em humanos; f: Toxicidade aguda em ratos (LD50); g: mutagenicidade

cromossômica; h: toxicidade hepática

O perfil farmacocinético da diosmina está apresentado na tabela 1. Os dados indicam

que a diosmina não apresenta uma boa permeabilidade pelo jejuno humano dado não somente

pelo valor baixo de Peff (Peff = 0,1), mas também pela elevada lipofilicidade, comprovada pelo

baixo valor do coeficiente de partição octanol-água (logP = -0,18).

As predições farmacocinéticas também indicaram que a diosmina parece ter uma

baixa biodisponibilidade oral. Isto pode ocorrer dado ao alto peso molecular (PM = 608,5).

Além disso, a molécula da diosmina apresenta um número elevado de doadores e aceptores

de ligação de hidrogênio por conta da presença de grupamentos hidroxila, metoxila e o

glicosídeo ligados à estrutura. Todos esses grupamentos contribuem para o aumento da área

de superfície polar da diosmina e, consequentemente, ocorre uma redução da absorção oral e

permeabilidade pelos tecidos.

59

Outro dado farmacocinético importante que foi analisado pelo software

computacional foi a capacidade de penetração pela barreira hematoencefálica. Os dados

preditivos apresentados na tabela 1 indicam que a diosmina parece ter baixa permeabilidade

pela barreira hematoencefálica. Isto também pode ser explicado pela elevada área de

superfície polar e alto peso molecular do composto.

Além das características físicoquímicas, o programa ADMET PredictorTM também foi

capaz de realizar as análises de toxicidade em ratos e camundongos e a análise de uma

possível capacidade mutagênica por parte da diosmina através da predição do teste de Ames

(AMES et al., 1973). De forma geral, os resultados das análises toxicológicas foram bastante

promissores, pois indicaram que a diosmina não apresenta toxicidade aguda para ratos, uma

vez que a dose letal encontrada de 451,86 mg/kg é maior do que o valor de referência de 320

mg/kg. Além disso, a diosmina também não foi tóxica para camundongos, uma vez que sua

dose tóxica (560,80 mg/kg/dia) foi bem superior ao valor de referência (35 mg/kg/dia),

indicando que o compostos não seria capaz de induzir carcinogênese em 50% da população

desses animais. Ademais, as predições in silico também mostraram que a diosmina não foi

capaz de inibir os canais de potássio tipo hERG nem foi capaz de elevar os níveis plasmáticos

de pelo menos duas enzimas hepáticas e, portanto, não apresenta nem cardiotoxicidade nem

hepatotoxicidade.

Em relação à avaliação da mutagenicidade, o programa conseguiu simular o teste de

Ames. Os resultados da predição deste teste mostraram que a diosmina não parece ser um

composto mutagênico, uma vez que não foi capaz de provocar alterações cromossomiais nas

cinco cepas de Salmonella typhimurium avaliadas pelo software (T98, T100, T97+1537,

T1535 e T102+wp2).

As análises in silico também foram usadas com objetivo de medir a capacidade de

ionização da diomina em pH fisiológico de 2 até 7,4. De acordo com o resultado, a diosmina

não sofre ionização nesta faixa de pH. Somente em pHs acima do fisiológico (8,7 e 9,6)

parece haver geração de microespécies ionizáveis. Desta forma, a diosmina permaneceu na

forma desprotonada nas simulações em pH fisiológico.

60

5.2. DIOSMINA REDUZ A VIABILIDADE DE CÉLULAS DE GLIOBLASTOMA

Foi realizado um ensaio colorimétrico de MTT para avaliar possíveis efeitos

citotóxicos da diosmina na redução da viabilidade das células tumorais de glioblastoma

humano das linhagens GBM95, GBM02 e U87.

Para a realização dos ensaios de viabilidade com diosmina, as células tumorais de

glioblastoma GBM95, GBM02 e U87 foram expostas ao tratamento com diosmina em

concentrações crescentes de 10, 50, 75, 100 e 150 µM nos tempos de 24 e 48 horas. O mesmo

foi feito com o controle constituído somente pelo solvente DMSO, veículo de diluição da

amostra de diosmina. A atividade mitocondrial das células viáveis foi medida por

absorbância e expressa através da porcentagem de células viáveis em relação ao controle.

A figura 8 apresenta os resultados do ensaio de viabilidade por MTT com as três

linhagens tumorais de glioblastoma.

Figura 8 - Diosmina reduz a viabilidade de células de glioblastoma das linhagens GBM95, GBM02 e U87. Ensaio de viabilidade por MTT realizado com as linhagens de glioblastoma humano GBM95, GBM02 e U87 após o tratamento com concentrações crescentes do flavonoide diosmina (10, 50, 75, 100 e 150 µM) por 24 e 48 horas. O controle foi constituído pelo solvente DMSO. 8a: Viabilidade das células GBM95 em relação ao controle. 8b: Viabilidade das células GBM02 em relação ao controle. 68: Viabilidade das células U87 em relação ao controle. Os resultados representam a média e o desvio padrão de três experimentos em triplicata. * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001 em comparação com o controle.

Através dos gráficos a, b e c apresentados na figura 8 foi possível ver que a diosmina

reduz a viabilidade das linhagens tumorais GBM95, GBM02 e U87, respectivamente. O

flavonoide em questão foi capaz de exercer efeito citotóxico sobre as células GBM95 e

GBM02 tanto no tratamento de 24 quanto no de 48 horas. Já para a linhagem U87, somente

61

no maior tempo de exposição (48 horas) é que as células se mostraram sensíveis ao

tratamento com diosmina.

De acordo com os dados da figura 8a, o tratamento de 24 horas promove, em relação

ao controle, uma redução na viabilidade das células GBM95 em 50,6%, 51,2% e 54% para as

concentrações de 50, 75 e 100 µM, respectivamente. Já para a maior concentração de

diosmina (150 µM), a redução da viabilidade foi de 44,2%, também em relação ao controle.

No tratamento por 48 horas, a redução na viabilidade celular de GBM95 foi de 49,9%,

62,6%, 60,2% e 59,3% para as concentrações de 50, 75, 100 e 150 µM, respectivamente.

Desta forma, é possível perceber que, tanto para 24 horas quanto para 48 horas, houve, em

todas as condições de tratamento, uma redução de mais de 50% da viabilidade de GBM95.

Além disso, foi possível notar que não parece ocorrer uma diminuição da viabilidade das

células GBM95 de forma concentração dependente (figura 8a). Mesmo havendo uma redução

maior da viabilidade desta linhagem no tempo de 48 horas em relação ao de 24 horas, não é

possível afirmar que haja um efeito tempo dependente, visto que, não houve significância

estatística.

A figura 8b mostra que, em comparação com o controle, o tratamento por 24 horas

com o flavonoide diosmina promoveu redução da viabilidade de GBM02 em 30,3%, 30,5%,

27,4%, 25,8% e 29% para as concentrações de 10, 50, 75, 100 e 150 µM, respectivamente. Já

no tratamento por 48 horas, a redução da viabilidade da linhagem GBM02 foi de 25,5%,

33,4%, 28,5%, 32,6% e 48% para as concentrações de 10, 50, 75, 100 e 150 µM,

respectivamente. Dessa forma, é possível notar que a diosmina foi capaz de exercer efeito

citotóxico reduzindo em mais ou menos 30% a viabilidade da linhagem GBM02. Também foi

possível observar que não houve um efeito tempo-concentração dependente por parte da

diosmina sobre esta linhagem.

A figura 8c apresenta os resultados da análise do efeito citotóxico da diosmina sobre a

linhagem comercial de glioblastoma humano (U87). Os dados indicam que a diosmina exerce

efeito citotóxico significativo sobre as células U87 em todas as concentrações do tratamento

realizado em 48 horas. Esse efeito citotóxico parece ser maior nas concentrações

intermediárias de 50, 75 e 100 µM, onde foi vista uma redução de 38,1%, 45,2%, 40,6%,

respectivamente. Já na concentração de 10 µM a diosmina provocou uma redução um pouco

menor (24,7%). Comparativamente, a maior concentração de diosmina (150 µM) parece não

62

exercer um efeito mais pronunciado sobre a viabilidade de U87, mostrando uma redução de

22,5% e assim descartando o efeito concentração-dependente. A exposição das células U87 à

diosmina por 24 horas não provocou diminuição da viabilidade de forma significativa.

Apesar de ocorrer redução da viabilidade em todas as células de glioblastoma

analisadas, este efeito citotóxico não foi igual entre elas. Nota-se que, a diosmina foi capaz de

reduzir a viabilidade das células GBM95 de forma mais expressiva, uma vez que chegou a

atingir reduções de mais de 60% em algumas condições de tratamento (figura 8a), enquanto

que o efeito sobre as células GBM02 e U87 foi em torno de 25 a 45% (figuras 8b e 8c).

De forma geral, os resultados do ensaio de viabilidade por MTT sugerem que a

diosmina apresenta um efeito citotóxico nas três linhagens avaliadas. Comparativamente, o

flavonoide em questão foi mais citotóxico e, portanto, mais eficaz sobre GBM95, provocando

uma diminuição maior da atividade mitocondrial em relação a linhagem GBM02. Já a

linhagem U87 pareceu ser um pouco mais resistente, pois, somente com um maior tempo de

exposição à diosmina é que esta linhagem teve sua viabilidade reduzida.

5.3 DIOSMINA NÃO REDUZ A VIABILIDADE DE ASTRÓCITOS SADIOS

Após a avaliação do efeito da diosmina sobre a redução da viabilidade de células de

diferentes linhagens tumorais de glioblastoma, o mesmo ensaio de MTT foi realizado com os

astrócitos humanos a fim de verificar o efeito deste composto não somente em células

tumorais, mas também em células não tumorais e sadias.

A figura 7 apresenta os resultados do ensaio de viabilidade realizado com astrócitos

humanos sadios submetidos ao tratamento por 24 e 48 horas com concentrações crescentes do

flavonoide diosmina (10, 50, 75, 100 e 150 µM). A atividade mitocondrial das células viáveis

foi medida por absorbância e expressa através da porcentagem de células viáveis em relação

ao controle.

63

Figura 9 – Diosmina não reduz de forma significativa a viabilidade de astrócitos humanos sadios. Ensaio de viabilidade por MTT em astrócitos humanos após o tratamento por 24 e 48 com diosmina nas concentrações de 10, 50, 75, 100 e 150 µM. No controle foi utilizado somente o solvente DMSO nas mesmas concentrações. Os resultados representam a média e o desvio padrão de três experimentos em triplicata. * p<0,05, em comparação com o controle.

Os resultados da figura 9 mostram que a diosmina não foi capaz de exercer um efeito

citotóxico tão pronunciado sobre os astrócitos. Quando comparamos com o controle, o

tratamento com diosmina por 24 horas parece não influenciar na viabilidade destas células

sadias em nenhuma das concentrações testadas. Já no tratamento destas células sadias com a

diosmina por 48 horas, apenas duas concentrações foram capazes de reduzir um pouco a

viabilidade dos astrócitos. Foi observada uma redução de 12,3% para o tratamento com 10

µM e 15,4% para o tratamento com 100 µM.

Apesar da diosmina provocar uma ligeira diminuição da viabilidade dos astrócitos,

observa-se que, comparativamente com as linhagens tumorais GBM95, GBM02 e U87, a

redução provocada pelo flavonoide nessas células não tumorais foi bem inferior, não

ultrapassando 15,4% (figura 9). Por este motivo, os resultados sugerem que o efeito

citotóxico da diosmina sobre astrócitos não tumorais é menor do que sobre as linhagens

tumorais, o que pode indicar certa seletividade do composto para as células tumorais de

glioblastoma.

64

5.4 A COMBINAÇÃO DE DIOSMINA COM TMZ É CAPAZ DE REDUZIR A VIABILIDADE DE CÉLULAS DE GLIOBLASTOMA, MAS SEM EFEITO ADITIVO

Sabendo-se a diosmina exerce efeito citotóxico contra células de glioblastoma, se

torna importante comparar o efeito deste flavonoide com o efeito provocado pelo

quimioterápico de escolha no tratamento deste tumor, ou seja, a TMZ. Por este motivo,

realizamos também o ensaio de viabilidade por MTT com as células GBM95 e GBM02 após

tratamento com diosmina combinada com TMZ. O objetivo desta análise foi entender se esta

combinação destes fármacos seria capaz de reduzir de forma significativa a viabilidade das

células tumorais e também poder comparar o efeito de ambas as drogas sozinhas.

Para este experimento, tomamos como base os ensaios de viabilidade anteriores e

optamos por seguir com as linhagens GBM95 e GBM02, estabelecidas no LMC. Além disso,

através dos outros ensaios também conseguimos triar apenas duas concentrações de diosmina

(50 e 100 µM). Portanto, para a realização do ensaio de vabilidade para o tratamento

combinado, as células tumorais GBM95 e GBM02 foram expostas a diosmina nas

concentrações de 50 e 100 µM e a TMZ nas concentrações de 50, 100 e 200 µM e também a

combinação de ambas as drogas (50 µM de diosmina com 200 µM de TMZ e 100 µM de

diosmina com 200 µM de TMZ). Os tempos de exposição a todos esses tratamentos foi de 24

e 48 horas.

A figura 10 apresenta os efeitos citotóxicos do tratamento isolado de diosmina e TMZ

em comparação com o tratamento combinado para as linhagens tumorais GBM95 e GBM02.

Figura 10 – A combinação de diosmina e TMZ foi capaz de reduzir a viabilidade de GBM95 e GBM02,

mas não houve efeito aditivo pela associação. Ensaio de viabilidade celular por MTT com as células tumorais

GBM95 e GBM02 após o tratamento por 24 e 48 horas somente com diosmina (50 e 100 µM) e TMZ (50, 100 e

200 µM) e também com a combinação de ambas (50 µM diosmina com 200 µM TMZ e 100 µM diosmina com

65

200 µM TMZ). O controle foi constituído do solvente DMSO. 10a: Viabilidade das células GBM95 após o

tratamento com diosmina e TMZ. 10b: Viabilidade das células GBM02 após tratamento com diosmina e TMZ.

Os resultados representam a média e o desvio padrão de três experimentos em triplicata. * p<0,05; ** p<0,01;

*** p<0,001 em comparação com o controle.

Assim como apresentado na figura 8a, os resultados do gráfico 10a apontam que a

diosmina foi capaz de reduzir em aproximadamente 50% a viabilidade das células GBM95

nas concentrações de 50 e 100 µM tanto em 24, quanto em 48 horas de tratamento. Já a TMZ,

somente a partir do tratamento por 48 horas na concentração de 200 µM que começa a

provocar efeito citotóxico na linhagem tumoral GBM95, reduzindo em 20% a viabilidade de

GBM95 (figura 10a).

Quando associamos a diosmina com TMZ, foi possível observar efeito sobre a

redução da viabilidade tumoral nos dois tratamentos propostos. A combinação de 50 µM de

diosmina com 200 µM de TMZ levou a uma redução de 23% e 29% da viabilidade de

GBM95 nos tempos de 24 e 48 horas, respectivamente (figura 10a). Resultado semelhante foi

observado para o tratamento com 100 µM de diosmina combinado com 200 µM de TMZ

onde o tratamento por 24 horas reduziu 31% e por 48 horas reduziu 25%. Sendo assim, não

parece ter ocorrido um efeito concentração-tempo dependente para os tratamentos de GBM95

com a combinação diosmina e TMZ.

Os resultados para a linhagem GBM02 (figura 10b) indicaram o mesmo perfil

observado para GBM95, onde a diosmina sozinha reduz aproximadamente 40% da

viabilidade das células tanto na concentração de 50 quanto na de 100 µM, enquanto que o

tratamento somente com TMZ só começa a reduzir a viabilidade de forma significativa a

partir da concentração 200 µM do tratamento por 48 horas (redução de 14%) (figura 10b).

Em relação ao tratamento combinado, a associação de 200 µM de TMZ com 50 µM

de diosmina por 24 horas provocou uma redução de 16% na viabilidade de GBM02. Já este

mesmo tratamento por 48 horas provocou uma redução da viabilidade de 29%. Para a

combinação de 200 µM de TMZ com 100 µM de diosmina, a redução da viabilidade foi de

22% e 19% para os tempos de 24 e 48 horas, respectivamente.

De modo geral, estes resultados mostraram que a combinação de diosmina com TMZ

reduz de forma significativa a viabilidade das linhagens de glioblastoma e foi mais efetiva do

66

que o tratamento somente com o quimioterápico TMZ. No entanto, esta combinação não foi

tão efetiva como imaginávamos, uma vez que não houve efeito aditivo. Isto quer dizer que,

mesmo sendo efetiva a combinação não provocou um efeito mais pronunciado sobre a

redução da viabilidade. Ou seja, nossos resultados apontaram que a diosmina sozinha foi

mais efetiva na redução da viabilidade tumoral do que a combinação com TMZ dada a

ausência de sinergismo entre os compostos.

5.5 DIOSMINA ALTERA A MORFOLOGIA E REDUZ A POPULAÇÃO DAS CÉLULAS DE GLIOBLASTOMA

Tendo em vista o efeito citotóxico da diosmina sobre as células do glioblastoma, é

fundamental avaliar se ocorre alteração da morfologia destas células após o tratamento com o

flavonoide. Imagens de contraste de fase e fluorescência foram usadas para as análises

morfológicas das células GBM95 e GBM02. Neste ensaio, avaliamos visualmente a

morfologia das células e também realizamos a medição do comprimento e do número total de

células.

Para a análise da morfologia, as células GBM95 e GBM02 foram tratadas com

diosmina nas concentrações de 50 e 100 µM por 24 e 48 horas. Após o tratamento, foram

feitas imagens de contraste de fase e imagens da imunomarcação com vimentina, proteína

constituinte dos filamente intermediários e, portanto, um marcador de citoesqueleto. A figura

11 apresenta os resutados das análises morfológicas feitas com as células de glioblastoma,

onde foi possível analisar o comprimento das células e a população total, em comparação

com o controle (DMSO).

67

Figura 11 – Diosmina altera a morfologia das linhagens GBM95 e GBM02 e reduz o número total destas

células. Análise da morfologia e da população de células GBM95 e GBM02 após o tratamento por 24 e 48 horas

com diosmina nas concentrações de 50 e 100 µM. O solvente DMSO foi usado como controle do experimento.

11a: Imagens de microscopia de contraste de fase (escala de cinza) e imunomarcação com vimentina (vermelho)

das células GBM95. 11b: Comprimento (em micrômetros) das células GBM95. 11c: Número total de células

GBM95 em relação ao controle. 11d: Imagens de microscopia de contraste de fase (escala de cinza) e

imunomarcação com vimentina (vermelho) para linhagem GBM02. 9e: Comprimento (em micrômetros) das

células GBM02. 9f: Número total de células GBM02 em relação ao controle. Barra de calibração: 50 µm. Os

resultados representam a média e o desvio padrão de três experimentos em triplicata. * p<0,05; ** p<0,01; ***

p<0,001 em comparação com o controle.

5.5.1 DIOSMINA ALTERA A MORFOLOGIA DAS CÉLULAS GBM95 E GBM02

As figuras 11a e 11d apresentam, respectivamente, as imagens de contraste de fase

(escala de cinza) e das marcações com vimentina (em vermelho) para as linhagens GBM95 e

68

GBM02 após tratamento com o flavonoide diosmina. De acordo com estas imagens, é

possível verificar certa alteração na morfologia das células. Diferente do controle, as duas

linhagens quando tratadas apresentaram células menores e disformes.

As células GBM95 e GBM02 tratadas com DMSO se assemelhavam às caracterizadas

por Faria e colaboradores (2006), estando, portanto, dentro dos padrões morfológicos

esperados das linhagens (FARIA et al., 2006). Já as células tratadas com diosmina nos

diferentes tempos e concentrações estavam fora dos padrões morfológicos. Enquanto que no

controle as células apareciam fusiformes e afiladas, nos tratamentos as células pareciam

menores, menos afiladas e com um formato mais poligonal, ou seja, apresentando uma

citoarquitetura distinta do esperado para a linhagem (figura 11a e 11d). Além disso,

visualmente, esta alteração morfológica foi mais pronunciada na linhagem GBM02 do que na

linhagem GBM95.

Após medição do comprimento das células (em micrômetros), constatou-se que a

diosmina parece realmente provocar uma diminuição no comprimento de GBM95 e GBM02,

ou seja, estas células perdem seu formato original e adquirem um tamanho menor após o

tratamento (figura 11b e 11e). Para a linhagem GBM95, a redução no comprimento celular

foi de 56% para o tratamento com 50 µM de diosmina e 50% para a concentração de 100 µM,

ambos em 24 horas. Para o tratamento por 48 horas, a redução foi de 53% e 60% para as

concentrações de 50 e 100 µM, respectivamente (figura 11b). Assim, pode-se dizer que a

diosmina reduz em mais da metade o comprimento das células GBM95. Para a linhagem

GBM02, o tratamento por 24 horas com diosmina nas concentrações de 50 e 100 µM levou a

uma redução significativa de 50% do comprimento das células. Já no tratamento por 48

horas, a redução do comprimento foi de apenas 27% (figura 11e).

De forma geral, a análise do comprimento das células corroborou o que foi sugerido

através das imagens de contraste de fase e das imunomarcações com vimentina. Os resultados

da análise morfológica mostram que, de fato, a diosmina altera o citoesqueleto das linhagens

GBM95 e GBM02, reduzindo de forma significativa o comprimento destas células.

69

5.5.2 DIOSMINA REDUZ O NÚMERO TOTAL DE CÉLULAS GBM95 E GBM02

Através das imagens de contraste de fase apresentadas nas figuras 11a e 11b, é

possível notar uma diminuição no número total de células após o tratamento com diosmina.

Além disso, o ensaio de viabilidade por MTT mostrou que houve um efeito citotóxico

provocado por este flavonoide nas linhagens GBM95 e GBM02. Por este motivo, se torna

importante avaliar se a diosmina é capaz de promover uma redução na população de células,

uma vez que esta diminuição pode estar associada a um efeito positivo do flavonoide na

inibição da proliferação celular e/ou indução de processo de morte celular (OUHTIT et al.,

2013).

Conforme indicado na figura 11a, parece haver uma redução no número de células

GBM95 tratadas com diosmina. As imagens de contraste de fase mostram que há mais

espaços vazios e sem células nos tratamentos com o flavonoide do que no controle. Sendo

assim, para comprovar estes dados, foi realizada a contagem do número de células totais

marcadas pelo corante nuclear DAPI.

O gráfico mostrado na figura 11c indica que houve uma redução de 40,1% do total de

células quando expostas por 24 horas à diosmina na concentração de 50 µM e uma redução

de 38,2% quando tratadas com 100 µM. Na exposição por 48 horas ao flavonoide a

concentração de 50 µM provocou uma redução de 37,7% na população total de GBM95. Já o

tratamento com 100 µM levou a uma redução de apenas 25,3% da população destas células

tumorais. Portanto, os resultados da contagem de células GBM95 indicam que, tanto no

tratamento com 50 µM, quanto no de 100 µM parece haver uma redução do número de

células totais em relação ao controle. Para o tempo de 24 horas, a diosmina levou a uma

diminuição significativa de mais ou menos 40%. Já para o tempo de 48 horas, somente na

concentração de 50 µM a diosmina foi capaz de provocar uma diminuição significativa

(40%). Para o tratamento com 100 µM, apesar de observarmos uma tendência de diminuição,

os resultados não se mostraram estatisticamente siginifcativos em relação ao controle (figura

11c).

De maneira similar, as imagens da figura 11d sugerem que a diosmina também foi

capaz de reduzir a população de células GBM02 pois, igualmente observamos mais espaços

vazios nos tratamentos do que no controle. O resultado foi apresentado no gráfico da figura

70

11f. O resultado da contagem de GBM02 mostra uma diminuição de 36,7% do total de

células quando expostas por 24 horas à diosmina na concentração de 50 µM e uma redução

de 30,4% quando tratada com 100 µM. Na exposição por 48 horas, na menor concentração,

foi observada uma redução de 31,8% na população total de GBM02 e na maior concentração,

a redução foi de 42,5%. Desta forma, os resultados indicam que em todas as condições de

tratamento parece haver uma redução do número de células GBM02 de forma significativa

em relação ao controle (figura 11f).

De forma geral, pode-se dizer que o flavonoide diosmina provoca uma redução no

número total de células das duas linhagens de glioblastoma. Porém, esta diminuição não

parece ocorrer de forma tempo ou concentração depente, uma vez que todas as condições de

tratamento apresentaram perfil bem semelhante.

Considerando que a diosmina exerce efeito citotóxico sobre as células GBM95 e

GBM02 e esta citotoxicidade provoca alterações morfológicas e também reduz o número

total de células, se torna fundamental entender se este flavonoide provoca estas alterações por

ser capaz de agir sobre a inibição da proliferação ou sobre a indução de morte celular.

5.6 DIOSMINA NÃO FOI CAPAZ DE REDUZIR A PROLIFERAÇÃO DAS CÉLULAS DE GLIOBLASTOMA

Alguns flavonoides como a diosmina já foram descritos na literatura como capazes de

provocar inibição da proliferação celular de tumores (LEWINSKA et al., 2015). Dessa

maneira, com objetivo de verificar se após o tratamento com a diosmina as células tumorais

GBM95 e GBM02 sofriam uma redução em sua proliferação, foi realizado o ensaio de

incorporação de EdU, análogo de timidina que se liga ao DNA das células que estão em fase

de replicação do material genético (SALIC e MITCHISON, 2008).

As células GBM95 e GBM02 foram expostas ao tratamento com diosmina em duas

concentrações diferentes (50 e 100 µM) por 48 horas. O mesmo planejamento experimental

foi feito com o controle, constituído somente pelo solvente DMSO.

O efeito da diosmina sobre a inibição da proliferação das células tumorais foi

expresso através da porcentagem de células em proliferação, ou seja, marcadas com Click-it

EdU (verde), em relação ao número total de células que foram capazes de incorporar o

71

corante Hoechst (azul). A figura 12 apresenta as imagens representativas do ensaio realizado

com as linhagens GBM95 e GBM02 e os gráficos da quantificação das células proliferativas.

Figura 12: Diosmina não reduziu a proliferação das células GBM95 e GBM02. Ensaio de proliferação celular por incorporação de EdU após o tratamento das células GBM95 e GBM02 com diosmina nas concentrações de 50 e 100 µM por 48 horas. O solvente DMSO foi usado como controle deste experimento. 12a: Imagens ilustrativas das marcações de EdU (verde) e Hoechst (azul) para linhagem GBM95. 12b: Porcentagem de células GBM95 em estado de proliferação (em relação ao controle). 12c: Imagens ilustrativas das marcações de EdU (verde) e Hoechst (azul) para linhagem GBM02. 12d: Porcentagem de células GBM02 em estado de proliferação (em relação ao controle). Barra de calibração: 50 µm. Os resultados representam a média e o desvio padrão de três experimentos independentes. Nenhum resultado foi estatisticamente significativo.

As figuras 12a e 12c apresentam as imagens de microscopia das células que

incorporaram EdU e, portanto, são consideradas células em estado de proliferação. Através

das imagens mostradas na figura 10a nota-se que não há uma diferença de marcação por EdU

após o tratamento com diosmina, em relação ao controle para a linhagem GBM95. O mesmo

pode ser notado na figura 10c para a linhagem GBM02. Tanto no tratamento de 50 quanto no

de 100 µM por 48 horas, as células continuaram incorporando EdU, ou seja, continuaram

proliferando.

Por meio dos gráficos apresentados nas figuras 12b e 12d é possível notar que o

tratamento com diosmina por 48 horas realmente não reduziu de forma significativa a

capacidade proliferativa de GBM95 e GBM02, respectivamente.

De acordo com o resultado do gráfico da figura 12b, em relação ao controle, somente

na maior concentração de 100 µM que parece haver algum efeito de redução da proliferação

72

para a linhagem GBM95 (aproximadamente 5% de redução em relação ao controle). O

resultado do gráfico da figura 12d também indica que a mesma concentração de diosmina

também parece reduzir a proliferação da linhagem GBM02 (10% em relação ao controle). No

entanto, ambos os resultado não se mostraram estatisticamente significativos, indicando que,

apesar da tendência, a diosmina parece não atuar inibindo a proliferação destas linhagens de

glioblastoma. Sendo assim, é possível inferir que o efeito citotóxico provocado por este

flavonoide deve estar associado a indução de morte celular.

5.7 DIOSMINA INDUZ MORTE DAS CÉLULAS GBM95 E GBM02

Sabendo-se que a diosmina reduz a viabilidade das células de glioblastoma GBM95 e

GBM02 e ainda provoca alterações morfológicas nestas linhagens, mas não inibe sua

proliferação, se faz necessário entender se o efeito citotóxico provocado nas células ocorre

por indução de morte celular.

A diosmina já foi descrita na literatura como capaz de induzir morte celular em

células de tumores de mama e próstata (LEWINSKA et al., 2016; LEWINSKA et al., 2015).

Com o objetivo de analisar o efeito da diosmina sobre a indução de morte em células de

glioblastoma, foi realizado o ensaio de TUNEL. Através deste ensaio, se torna possível

detectar a fragmentação do DNA e, consequentemente, avaliar a indução de morte celular

(ELMORE, 2007; KONOREV et al., 2004).

Para o ensaio de TUNEL, células GBM95 e GBM02 foram tratadas por 24 e 48 horas

com 50 e 100 µM de diosmina. O controle foi constituído do veículo DMSO. O efeito da

diosmina foi expresso através da porcentagem de células tumorais mortas, ou seja, marcadas

com o reagente TUNEL (vermelho), em relação ao total de células marcadas pelo corante

nuclear DAPI (azul).

A figura 13 mostra as imagens de GBM95 e GBM02 tiradas em microscópio de

fluorescência e os gráficos da quantificação das células que estão sofrendo o processo de

morte após o tratamento com diosmina.

73

Figura 13: Diosmina induz morte em células GBM95 e GBM02. Análise da morte celular provocada pelo tratamento das células de glioblastoma GBM95 e GBM02 com diosmina nas concentrações de 50 e 100 µM por 24 e 48 horas. O solvente DMSO foi usado como controle. 13a: Imagens representativas das células GBM95 marcadas com TUNEL (vermelho) e DAPI (azul). 13b: Porcentagem de células GBM95 que estão sofrendo morte celular (em relação ao controle). 13c: Imagens representativas das células GBM02 marcadas com TUNEL (vermelho) e DAPI (azul). 13d: Porcentagem de células GBM02 que estão sofrendo morte celular (em relação ao controle). Barra de calibração: 50 µm. Os resultados representam a média e o desvio padrão de três experimentos em triplicata. * p<0,05; ** p<0,01.

A figura 13a e 13c apresentam, respectivamente, as imagens representativas das

células GBM95 e GBM02 que incorporaram TUNEL, ou seja, células que tiveram seu DNA

fragmentado após o tratamento com diosmina. Os resultados da figura 13a sugerem que a

diosmina tanto na concentração de 50 quanto na de 100 µM por 24 e 48 horas foi capaz de

induzir morte na linhagem tumoral GBM95, uma vez que são observadas mais células

TUNEL positivas nas imagens dos tratamentos do que nas imagens do controle. De forma

similar, a figura 13c mostra que também parece haver mais células GBM02 TUNEL positivas

74

nas imagens dos tratamentos do que nos controles, sugerindo que o flavonoide em questão é

capaz de provocar morte desta linhagem de glioblastoma.

Os gráficos das figuras 13b e 13d apresentam a quantificação deste experimento de

morte celular por TUNEL. Os resultados da figura 13b indicam que o tratamento por 24 horas

com diosmina na menor concentração (50 µM) levou a um aumento da porcentagem de

células GBM95 mortas de 47,5%, enquanto que, na maior concentração (100 µM), a

porcentagem de aumento da morte foi de 43,9%. Já para o tratamento com exposição de 48

horas, a porcentagem de aumento das células GBM95 mortas foi de 31,1% para a

concentração de 50 µM e 33,4% para 100 µM, ambas em relação ao controle (DMSO). Da

mesma forma, o gráfico apresentado na figura 13d indica que o tratamento de GBM02 por 24

horas com diosmina na concentração de 50 µM levou a um aumento significativo da

porcentagem de células mortas (26,4%) enquanto que, na maior concentração (100 µM),

apesar de haver um aumento das células mortas de 22,5%, este não foi estatisticamente

significativo. Já no tratamento por 48 horas, ambas as concentrações foram capazes de

provocar um aumento significativo no número de células GBM02 mortas (25,1% em 50 µM e

27,5% em 100 µM).

De maneira geral, os dados constataram que o tratamento com diosmina foi capaz de

fragmentar o DNA das células, provocando assim a morte de GBM95 e GBM02. Os

resultados ainda indicaram que não parece haver um efeito concentração-tempo dependente

uma vez que a porcentagem de aumento nas células mortas é praticamente igual para todas as

condições de tratamento.

Comparativamente, o efeito da diosmina sobre a indução de morte celular para a

linhagem GBM95 parece ser um pouco maior do que o efeito sobre a indução de morte em

GBM02. Os dados apontam que, após o tratamento com o flavonoide, a porcentagem de

células GBM95 mortas variou de 30 a quase 50%. No entanto, para a linhagem GBM02, esta

variação é de aproximadamente 25%. Sendo assim, o resultado do ensaio de morte celular por

TUNEL parece refletir e atestar o efeito citotóxico do ensaio de viabilidade por MTT. Além

disso, este ensaio também ajudou a corroborar os resultados da contagem de células, onde foi

visto uma diminuição do número total após tratamento com diosmina. Sendo assim, pode-se

dizer que tanto as células GBM95 quanto as células GBM02 estão sofrendo fragmentação de

seu DNA e, consequentemente estão sofrendo morte após tratamento com a diosmina.

75

5.8 DIOSMINA INDUZ APOPTOSE DEPENDENTE DE CASPASE EM CÉLULAS GBM95 E GBM02

Tendo em vista os resultados do ensaio do TUNEL que mostraram a capacidade da

diosmina em induzir morte das células GBM95 e GBM02, se torna especialmente

interessante entender se este efeito está ocorrendo por ativação da via das caspases e,

portanto, através do processo de apoptose dependente de caspase.

Com o objetivo de verificar um possível efeito da diosmina sobre a indução de morte

celular por apoptose, foi analisada a ativação da caspase-3 clivada, protease efetora da

cascata de iniciação de apoptose e, portanto, marcador deste fenômeno nas células. Para a

realização deste ensaio, as células GBM95 e GBM02 foram tratadas com diosmina por 24 e

48 horas nas concentrações de 50 e 100 µM. O resultado foi expresso através da porcentagem

de células apoptóticas, ou seja, que expressam caspase-3 clivada (verde), em relação ao total

de células marcadas pelo corante nuclear DAPI (azul).

A figura 14 mostra as imagens de microscopia de fluorescência feitas com as células

GBM95 e GBM02 e os gráficos da quantificação da expressão de caspase-3 clivada após o

tratamento com diosmina.

76

Figura 14: Diosmina induz apoptose dependente de caspase-3 clivada em células GBM95 e GBM02. Análise da mosrte celular dependente de caspase provocada pelo tratamento das células de glioblastoma GBM95 e GBM02 com diosmina nas concentrações de 50 e 100 µM por 24 e 48 horas. O solvente DMSO foi usado como controle. 14a: Imagens representativas das células GBM95 marcadas por caspase-3 clivada (verde) e DAPI (azul). 14b: Porcentagem de células GBM95 que estão sofrendo morte celular por apoptose (em relação ao controle). 14c: Imagens representativas das células GBM02 marcadas por caspase-3 clivada (verde) e DAPI (azul). 14d: Porcentagem de células GBM02 que estão sofrendo morte celular por apoptose (em relação ao controle). Barra de calibração: 50 µm. Os resultados representam a média e o desvio padrão de três experimentos em triplicata. * p<0,05; ** p<0,01.

A figura 14a e 14c sugerem que, em relação ao controle, há um aumento no número

de células GBM95 e GBM02 expressando caspase-3 clivada, indicando que estas linhagens

estão sofrendo morte por apoptose dependente de caspase.

Os gráficos apresentados na figura 14b e 14d corroboram o que foi indicado pelas

imagens, mostrando que, após o tratamento com diosmina, há um aumento na expressão de

caspase-3 clivada nas células GBM95, fato este que não aconteceu de forma expressiva nas

77

células do controle. Apesar dos tratamentos por 24 horas mostrarem que mais de 2% das

células GBM95 foram capazes de expressar caspase-3 clivada, cabe destacar que somente o

tratamento com 100 µM de diosmina por 48 horas se mostrou estatisticamente significativo

pois quase 5% das células desta linhagem expressaram caspase-3 clivada (figura 14b). Em

relação a linhagem GBM02, o tratamento com diosmina por 24 horas nas concentrações de

50 e 100 µM fez com que mais de 17% destas células expressassem caspase-3 clivada.

Enquanto que no tratamento por 48 horas, somente na maior concentração (100 µM) que

houve uma expressão significativa de caspase-3 clivada (11%) em GBM02 (figura 14d).

Comparativamente, as células GBM02 tiveram uma maior ativação da caspase-3 no

desencadeamento do processo de apoptose, em relação a linhagem GBM95. Porém, é

possível dizer que ambas as linhagens sofrem apoptose após o tratamento com o flavonoide

diosmina porque houve ativação significativa desta proteína efetora do processo de morte

programada. Pode-se dizer que os resultados deste ensaio de morte por apoptose (figura 14)

auxiliaram na validação dos resultados do ensaio de morte por TUNEL (figura 13), pois, foi

possível confirmar que o processo de fragmentação do DNA que foi analisado anteriormente

está, neste caso, associado ao fenômeno de apoptose.

78

6 DISCUSSÃO

O glioblastoma é o tipo mais comum dos tumores malignos intracranianos, sendo

também o mais agressivo (KLEIHUES et al., 2002). Essa malignidade está intimamente

associada a sua elevada proliferação, habilidade de difusão e infiltração pelo parênquima

cerebral e pela sua capacidade de supressão das respostas anti-tumorais (SANTOS et al.,

2015). Dadas estas características, este tumor se torna refratário aos tratamentos

quimioterápicos convencionais, o que contribui ainda mais para a baixa expectativa de vida

dos pacientes (ALONSO et al., 2003).

Ramos e colaboradores mostraram a capacidade de alguns compostos polifenólicos

em atuar sobre vias do processo de tumorigênese (RAMOS, 2008). Igualmente, Batra e

Sharma destacam que os flavonoides são compostos polifenólicos capazes de agir em

diferentes eventos associados ao câncer (BATRA e SHARMA, 2013). Por esse motivo, os

flavonoides vêm sendo amplamente estudados como alternativas no tratamento de tumores

(WENZEL et al., 2000).

Este trabalho buscou entender o efeito da diosmina na viabilidade, morfologia,

proliferação e morte das células de glioblastoma humano. Através dos resultados foi possível

perceber que a diosmina é capaz de exercer efeito citotóxico sobre o glioblastoma. O

flavonoide foi capaz de promover uma redução da viabilidade celular, uma alteração na

morfologia das células e uma diminuição do número total de células GBM95 e GBM02.

Todos estes fatos foram ocasionados pela indução de morte por apoptose. Em contrapartida,

não foi observado o mesmo efeito citotóxico nos astrócitos humanos, que não tiveram sua

viabilidade reduzida pelo tratamento com a diosmi na nas mesmas condições.

Ao longo dos últimos anos, muitos investigadores mostraram a capacidade de alguns

flavonoides em interferir na atividade metabólica de glioblastoma. Através de ensaios in

vitro, pesquisadores já descreveram o efeito desses compostos sobre a inibição da

proliferação celular, redução da migração e indução do processo de apoptose em células de

glioblastoma humano (KIM et al., 2016; LI et al., 2016; SANTOS et al., 2015). No entanto,

ainda não existem dados publicados que descrevam os efeitos da diosmina sobre o

glioblastoma.

79

O objetivo principal do processo da descoberta de novos fármacos é encontrar

moléculas com boas propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas (EGAN et al., 2000).

Desta maneira, se torna importante entender o perfil da molécula da diosmina e avaliar seu

potencial antes de investigar seus efeitos in vitro sobre as células e glioblastoma.

Com o intuito avaliar o perfil farmacocinético e toxicológico da diosmina foram

realizadas, em colaboração com o Laboratório de Biologia Molecular Estrutural (LaBiME),

liderado pela professora Yraima Cordeiro, predições in silico usando a molécula 2D da

diosmina. De acordo com Ekins e colaboradores (2007), as simulações computacionais

realizadas através de análises in silico são bastante úteis para a otimização de novas

moléculas e ajudam a prever características de absorção, distribuição, metabolismo e

toxicidade (EKINS et al., 2007). Além disso, essas análises computacionais são capazes de

fornecer informações importantes de compostos como os flavonoides, ajudando a prever seus

possíveis usos como agentes antitumorais (AHMAD et al., 2012). Nesse contexto, o

programa ADMET PredictorTM 7.2.0 (Simulations Plus, CA) foi utilizado para as análises in

silico da diosmina, garantindo assim a possibilidade de se entender melhor algumas

características da molécula e garantir sua segurança para os posteriores ensaios in vitro.

Os parâmetros farmacocinéticos analisados computacionalmente são bastante usados

para otimizar a seleção e desenvolvimento de possíveis candidatos a fármacos e, estes

parâmetros se tornaram os potenciais focos de pesquisas de novas drogas (CHENG et al.,

2008). A absorção oral, o peso molecular, a eficácia, seletividade e toxicidade são alguns dos

principais parâmetros que ajudam a determinar um bom candidato a novo fármaco (EGAN et

al., 2000). Por conta disso, buscamos extrair estas informações a partir das análises

computacionais.

Os resultados das análises in silico para diosmina mostraram que sua molécula

apresenta elevado peso molecular, elevada polaridade e presença de grupamentos que

aumentam ainda mais a superfície polar da molécula. Todas essas características da diosmina

contribuíram para sua baixa penetração pelo jejuno humano e baixa absorção oral.

A biodisponibilidade oral é a principal característica que se busca avaliar em novos

compostos. A solubilidade em água e a permeabilidade são tidas como propriedades capazes

de interferir nessa absorção oral e na atividade biológica de compostos (EL-KATTAN e

VARMA, 2012; SANGSTER, 1989). Dahan e colaboradores (2009) ressaltaram que, de

80

forma geral, a absorção oral e absorção pelo trato gastrointestinal sofrem ainda a influência

de diversos fatores fisicoquímicos como tamanho da molécula, ligações de hidrogênio, entre

outros (DAHAN et al., 2009).

A solubilidade da diosmina em água foi avaliada através do coeficiente de partição

octanol-água ou logP. Os resultados das análises computacionais para diosmina mostraram

que o logP foi abaixo de zero, indicando que trata-se de um composto polar (MARTINS et

al., 2013). Esta elevada polaridade da diosmina pode interferir em sua permeabilidade

tecidual, uma vez que as membranas são compostas de uma bicamada de lipídeos apolares e,

portanto, moléculas polares não permeiam de forma passiva pela membrana (LODISH et al.,

2000). Ademais, já foi descrito na literatura que moléculas polares apresentam maior

dificuldade para penetrar através das junções entre as camadas de células epiteliais do trato

gastrointestinal (RENUKUNTLA et al., 2013), justificando também a baixa permeabilidade

pelo jejuno humano que foi constatada nas predições in silico para a diosmina.

O alto peso molecular também é capaz de influenciar negativamente na

biodisponibilidade oral de algumas moléculas (MOTLEKAR, et al., 2005). Moléculas com

peso molecular acima de 500 g/mol podem apresentar uma baixa absorção por via oral

(LIPINSKI et al., 1997). Considerando que o peso molecular da diosmina é de 608,5 g/mol e,

portanto, acima de 500, sua biodisponibilide oral fica reduzida.

A estrutura das moléculas e a presença de grupamentos e radicais também pode

influenciar negativamente a permeabilidade e a absorção. A existência de muitos grupos

doadores ou aceptores de ligaçãos de hidrogênio podem prejudicar a biodisponibilidade dos

compostos no organismo humano (LIPINSKI et al., 1997). De acordo com as regras de

Lipinski (1997), a biosdisponibilidade oral de uma molécula é baixa quando ela possui mais

de 5 doadores de ligação de hidrogênio e/ou mais de 10 aceptores de ligação de hidrogênio

(LIPINSKI et al., 1997). A diosmina apresentou nas análises in silico números superiores de

doadores e aceptores de ligação de hidrogênio (PUBCHEM DATABASE). Desta maneira,

sua baixa permeabilidade pelo jejuno e baixa absorção oral também podem ser explicadas por

estas características da estrutura da molécula da diosmina que aumentam sua superfície polar.

Considerando as características de solubilidade em água, baixa permeabilidade pelo

trato gastrointestinal e o elevado peso molecular, talvez a administração oral da diosmina não

seja a melhor opção para este composto. A literatura mostra que, de modo geral, os

81

flavonoides trazem diversos benefícios à saúde humana, mas, por outro lado, eles apresentam

baixa biodisponibilidade oral por sofrerem processos de metilação, sulfatação e

glucoronidação ao longo do trato gastrointestinal (THILAKARATHNA e RUPASINGHE,

2013). A variação do pH ao longo do sistema gástrico contribui para estes processos de

degradação. Além disso, acredita-se também que os microorganimos da flora intestinal são

capazes de degradar os flavonoides, contribuindo também para uma baixa biodisponibilidade

(BILIA et al., 2014).

Os resultados da análise in silico também mostraram que a diosmina apresenta baixa

penetração pela barreira hematoencefálica. Isso pode ser mais uma vez explicado pelo

elevado peso molecular, alta superfície polar e baixa permeabilidade pelas membranas. No

entanto, em pacientes com glioblastoma a barreira hematoencefálica se encontra rompida. A

elevada infiltração do tumor é capaz de provocar uma fragilidade vascular que ocasiona o

rompimento da barreira (DUBOIS et al., 2014). Esta fragilidade acabaria por facilitar a

penetração de drogas na cabeça do paciente. Sendo assim, essa baixa penetração da diosmina

identificada através das análises in silico não seria um impeditivo, umaz vez que, o

rompimento da barreira já facilitaria a permeabilidade da diosmina.

Apesar de todas essas características farmacocinéticas desfavoráveis, já existem

medicamentos comerciais contendo diosmina como princípio ativo. Aqui neste trabalho, a

concentração máxima de diosmina na solução estoque foi de 25 mg. Já nas formulações

comerciais, a concentração de diosmina varia de 450 mg até 900 mg. Estes medicamentos,

conforme já mencionado anteriormente, são administrados por via oral e apresentam eficácia

comprovada (ACHÉ LABORATÓRIOS FARMACÊUTICOS S.A., 2015;

LABORATÓRIOS SERVIER DO BRASIL LTDA, 2014). Desta forma, pode-se dizer que a

via oral é hoje a administração de escolha para a diosmina. No entanto, futuramente pode ser

mais interessante pensar em novas formas de administrar ou novas formas de se otimizar a

diosmina para evitar problemas de biodisponibilidade. Isso seria possível pelo fato dos dados

das predições in silico também terem mostrado que a molécula da diosmina não sofre

ionização nos diferentes pHs fisiológicos (2 – 7,4).

Uma possível nova alternativa para administração da diosmina poderia ser feita

diretamente através da aplicação do flavonoide no cérebro do paciente logo após a remoção

da massa tumoral. Esta estratégia terapêutica já vem sendo usada no tratamento de pacientes

82

com glioblastoma e consiste na administração local de substâncias, ou seja, aplicação direta

na cabeça do paciente (PERRY et al., 2007). Perry e colaboradores descreveram de forma

positiva os resultados da administração de carmustina diretamente no cérebro de pacientes

com glioblastoma após a cirurgia de remoção do tumor (PERRY et al., 2007). Acredita-se

que esta administração local é uma boa opção para os problemas relacionados à solubilidade

de compostos, sendo também uma forma de garantir a chegada da droga diretamente ao local

do tumor (PERRY et al., 2007). Como a análise in silico mostrou que a diosmina não se

ioniza no pH fisiológico, esta forma de administração local pode ser uma alternativa para

driblar os problemas identificados nas predições computacionais para a absorção oral.

Uma outra alternativa seria através o uso de nanocarreadores capazes de facilitar a

penetração de compostos pelas membranas e tecidos, além de melhorar problemas

relacionados à solubilidade (BILIA et al., 2014). O grupo de Garner comparou a

administração de um medicamento contendo os flavonoides diosmina e hesperidina (Daflon®

500 mg) em micropartículas com o mesmo medicamento não particulado e os resultados

indicaram que as partículas melhoraram a absorção da diosmina, contribuindo para uma

maior eficácia (GARNER et al., 2001). Assim, ministrar a diosmina em nanocarreadores

pode contribuir para aumentar sua biodisponibilidade.

Além das características farmacocinéticas, a administração de um medicamento

requer que este seja seguro. Por este motivo, as análises in silico também foram usadas para

avaliamos a toxicidade da diosmina e seu potencial mutagênico. De acordo com Raies e Bajic

(2016), as predições toxicológicas são úteis para complementar os ensaios in vitro e in vivo e

são necessários para identificar possíveis efeitos danosos do composto aos seres humanos

e/ou animais (RAIES AND BAJIC, 2016). Os resultados deste trabalho indicam que a

diosmina não é tóxica para camundongos, o que facilita no futuro a aplicação deste composto

em ensaios in vivo. Além disso, os resultados indicaram que a diosmina não apresenta

capacidade cardiotóxica ou mutagênica. Esta não toxicidade e não mutagenicidade da

diosmina já era, de certa forma, esperada visto que ela já é usada na prática clínica para o

tratamento de pacientes com problemas de hemorroida, varizes e outras afecções venosas

(MESHIKHES, 2004; DIANA et al., 2000).

Os resultados das analises de toxicidade corroboraram o que já foi descrito

anteriormente. Em 1994, Meyer avaliou a segurança de um medicamento contendo 500 mg

83

de diosmina e descobriu que os parâmetros hemodinâmicos não foram influenciados pela

administração do composto, mesmo quando a administração foi feita de forma prolongada

(MAYER, O.C., 1994). Hitzenberg também avaliou a tolerabilidade da diosmina e seus

resultados indicaram que ela é um composto seguro e não tóxico para uso em humanos no

tratamento de problemas vasculares e de circulação (HITZENBERGER, 1997).

Dada a eficácia terapêutica e a não toxicidade, a diosmina já é hoje uma opção

terapêutica para pacientes com problemas de circulação venosa (DIOSMIN MONOGRAPH,

2004). No entanto, a indicação da diosmina para o tratamento do câncer e, em especial do

glioblastoma, ainda não foi descrito na literatura. Levando em consideração os resultados

positivos das predições in silico realizadas neste trabalho, é possível sugerir que este

flavonoide apresenta um bom potencial para ensaios in vitro em células de glioblastoma e,

por este motivo, resolvemos seguir estudando os efeitos da diosmina com intuito de avaliar

sua capacidade de agir sobre a viabilidade, proliferação e morte de células tumorais.

Sabendo-se que a diosmina apresenta baixa toxicidade, se torna ainda mais

interessante estudar o papel da diosmina em células de linhagens de glioblastoma humano.

Porém, como ainda não existem dados na literatura que descrevam seus efeitos sobre estas

células, não existe um consenso de quais as melhores concentrações e quais os tempos ideais

de exposição a este composto em ensaios in vitro. Por esta razão, foi necessário tomar como

base as condições de tratamento de outros grupos de pesquisa que também utilizam

flavonoides no combate de células tumorais.

O trabalho publicado em 2013 pelo grupo Jukubowicz-Gil et al. utilizou as

concentrações de 1, 5, 10, 25, 50 e 100 µM para tratar a célula de glioblastoma T98G com o

flavonoide quercetina. Porém, somente a partir da concentração de 10 µM que os autores

puderam notar os efeitos do composto (JUKUBOWICZ-GIL et al., 2013). Amado e

colaboradores avaliaram o papel do flavonoide isoquercetrina sobre células GBM95 nas

concentrações de 25, 50 e 100 µM por 24, 48 e 72 horas de exposição (AMADO et al., 2009),

observando efeito em todas as condições de tratamento. O grupo Das et al. mostrou que a

flavona apigenina parece exercer efeito citotóxico em células de glioblastoma das linhagens

U87 e T98G na concentração de 50 µM por 24 horas (DAS et al., 2010). Igualmente, Cheng e

colaboradores mostraram que outra flavona, a luteolina, também foi capaz de provocar

84

citotoxicidade nas linhagens U87 e T98G nas concentrações de 40 e 50 μM após 24 horas de

tratamento (CHENG et al., 2013).

Na literatura, a diosmina vem sendo empregada no combate de diferentes tumores e as

concentrações de tratamento parecem variar de acordo com a linhagem tumoral. No trabalho

de Lewinska et al., foi avaliado o potencial genotóxico da diosmina em células DU145 de

câncer de próstata. As concentrações de diosmina neste estudo variaram de 50 a 250 µM. No

entanto, somente a partir da concentração de 100 µM foram observados os efeitos deste

flavonoide sobre redução da viabilidade, inibição da proliferação celular e indução de

apoptose (LEWINSKA et al., 2015). Já no trabalho de Dung e colaboradores, a diosmina foi

capaz de agir sobre células HA22T de carcinoma hepático nas concentrações de 5, 20, 40, 80

e 120 µM, provocando redução da viabilidade celular, inibição da migração e redução na

expressão de genes reguladores da proliferação do tumor (DUNG et al., 2012).

Considerando os estudos com flavonoides em linhagens de glioblastoma e também os

estudos com a diosmina em diferentes linhagens tumorais, foi possível iniciar as análises para

avaliação do potencial citotóxico da diosmina sobre as células GBM95, GBM02, U87 e

astrócitos humanos sadios nas concentrações de 10, 50, 75, 100 e 150 µM nos tempos

variados de 24 e 48 horas. Porém, além da concentração, outra questão relacionada ao

tratamento das células é a diluição do flavonoide.

Alguns grupos de pesquisa optam por manter o estoque dos flavonoides em DMSO e

diluir a amostra em meio sem soro para cada experimento (DU et al., 2015; WANG et al.,

2015). Porém, nosso grupo optou por diluir a amostra de diosmina, previamente estocada em

uma solução com DMSO, no mesmo meio de cultura das células tumorais (DMEM-F12

acrescido de 10% de SFB). Isto quer dizer que neste trabalho nós optamos por diluir a

amostra em meio suplementado com SFB, garantindo assim a presença de todos os fatores

necessários para o crescimento das células. Dessa forma, evitamos um resultado falso

positivo provocado pelo estresse celular que pode ocorrer em tratamentos sem SFB. Acredita-

se que o meio sem adição de SFB poderia influenciar no tratamento e aumentar esse estresse

celular, contribuindo ainda mais para a redução na viabilidade das células e para um resultado

que se afastaria do normal (HATKEVICH et al., 2014).

O primeiro ensaio realizado com a amostra de diosmina foi o de viabilidade celular,

usado para avaliar o efeito da diosmina sobre a viabilidade das linhagens de glioblastoma

85

humano GBM95, GBM02 e U87. Os resultados deste ensaio sugeriram que a diosmina

parece exercer efeito citotóxico sobre todas as três linhagens. No entanto, o efeito não ocorre

na mesma proporção. A linhagem GBM95 se mostrou mais sensível à diosmina do que as

outras duas linhagens, sofrendo uma redução maior da viabilidade. Já a linhagem U87 se

mostrou a mais resistente. E para as três linhagens não foi observado efeito concentração-

tempo dependente por parte da diosmina nas condições avaliadas. O grupo de Lewinska

também comparou o efeito da diosmina em distantas linhagens de câncer de mama (MCF-7,

MDA-MB-231 e SK-BR-3) e também observou que o flavonoide agia de forma diferente

sobre cada uma, sendo a MCF-7 a linhagem mais sensível dentre todas. Porém, diferente dos

resultados deste trabalho, no caso do trabalho de Lewinska, foi observado um efeito

concentração dependente (LEWINSKA et al., 2017).

A diferença de efeito no tratamento de linhagens tumorais com compostos naturais já

foi previamente descrita. Tilaoui e colaboradores mostrarm que a artemisinina apresentava

uma citotoxicidade distinta entre as linhagens de mastocitoma e adenocarcinoma de rins e

esta diferença não estava relacionada à concentração do composto e sim ao tipo de interação

molecular da droga com a célula (TILAOUI et al., 2014). Talvez esta diferença de interação

possa explicar a disparidade do efeito citotóxico provocado pela diosmina em cada uma das

linhagens de glioblastoma.

No caso das linhagens de glioblastoma estudadas neste trabalho, as diferenças

morfológicas entre elas são poucas, uma vez que GBM95, GBM02 e U87 são

histologicamente classificadas como glioblastoma. A linhagem GBM95 foi caracterizada por

nosso grupo como uma neoplasia glial de localização temporal, ocasionalmente

multinucleada, com elevada mitose e proliferação difusa de astrócitos fibrilares. A linhagem

GBM02, também caracterizada no LMC, foi descrita como uma neoplasia glial de localização

temporal com pleomorfismo nuclear e muitos astrócitos gemistocíticos (FARIA et al., 2006).

Já a linhagem U87 é comercial, composta por células gliais neoplásicas imortalizadas e foi

descrita por Ponten e Macintyre como uma linhagem composta por células mais alargadas,

com focos de necrose e com um crescimento celular mais lento (PONTEN e MACINTYRE,

1968).

Considerando apenas as caracterísricas morfológicas fica difícil explicar a diferença

de sensibilidade entre as linhagens estudas. No caso da linhagem U87, por ser uma linhagem

86

comercial e com mais passagens, isto por ter contribuído de alguma forma para as células

terem se tornado mais resistentes ao tratamento. Além disso, a U87 já foi descrita como uma

linhagem resistente a tratamentos quimioterápicos dada a presença de genes de efluxo como o

MDR (HAN et al., 2016). No entanto, a explicação mais plausível deve estar na diferença de

mutações genéticas associadas a cada uma das linhagens. As linhagens de glioblastoma

possuem uma série de mutações que proporcionam às células vantagens seletivas de

crescimento que promovem a sobrevivência, proliferação (RAMIREZ et al., 2013) e

resistência a terapias tradicionais e novas (FURNARI et al., 2007). No entanto, ainda não

existem estudos que comparem as alterações mutagênicas entre as linhagens GBM95 e

GBM02.

Levando em consideração esta capacidade da diosmina em reduzir a viabilidade das 3

linhagens de glioblastoma avaliadas, nosso grupo achou importante comparar se o efeito

citotóxico ocorre também ocorria sobre astrócitos humanos sadios, ou seja, células de cabeça

não tumorais. Surpreendentemente, nas condições avaliadas neste trabalho, os resultados

sugeriram que a diosmina não foi citotóxica aos astrócitos. Ou seja, parece haver uma certa

seletividade da diosmina para células tumorais. Esta possível seletividade da diosmina aos

tumores e não as células sadias, já foi descrita na literatura para outras células. O grupo de

Dung e colaboradores avaliaram o efeito da diosmina em células de carcinoma hepático,

comparando também seus efeitos sobre células não tumorais (hepatócitos sadios de

camundongos). Os resultados sugeriram que, nas mesmas concentrações de tratamento, a

diosmina só seria capaz de reduzir a viabilidade das células tumorais, sem prejuízo na

viabilidade das células sadias (DUNG et al., 2012), dando indícios de um possível efeito

citotóxico seletivo para o tumor.

Apesar da diosmina não se mostrar citotóxica a algumas células não tumorais, ainda

não é possível afirmar que este composto tenha somente as células tumorais como alvo. São

necessários mais estudos para entender se a diosmina é ou não mais seletiva para as células

tumorais do que para as células sadias. Porém, os resultados obtidos através destes ensaios de

viabilidade já são suficientes para seguir investigando os efeitos da diosmina no combate do

glioblastoma.

Tomando como base os resultados dos ensaios preliminares de viabilidade que

mostraram que a diosmina exercia efeito sobre o glioblastoma, mas que este não parecia

87

ocorrer de forma concentração-tempo dependente, optou-se por selecionar para os ensaios

subsequentes apenas as concentrações de 50 e 100 µM e os tempos de exposição de 24 e 48

horas. Além disso, optou-se também por continuar as análises somente com as linhagens de

glioblastoma caracterizadas no LMC (GBM95 e GBM02), não incluindo a linhagem

comercial U87, pois as diferenças foram mínimas entre elas.

Após a análise da viabilidade das células de glioblastoma com a diosmina, optamos

por investigar se a combinação da diosmina com a TMZ seria ou não eficaz sobre as mesmas

células. Considerando que na prática clínica o tratamento de pacientes com glioblastoma é

feito com o quimioterápico TMZ (HOTTINGER et al., 2014), se torna interessante comprar

seu efeito com o da diosmina nas mesmas condições experimentais e também avaliar o efeito

da associação de ambos para entender se o flavonoide sozinho ou combinado com o

quimioterápico são boas opções de tratamento alternativo para o glioblastoma, uma vez que

esta prática de comparar o efeito de compostos naturais sozinhos e em combinação com TMZ

já vem sendo demonstrado de forma positiva em outros trabalhos (MATIAS et al., 2017;

COELHO et al., 2016; JAKUBOWICZ-GIL et al., 2013).

Apesar do protocolo convencional de tratamento do glioblastoma consistir na cirurgia

para remoção do tumor seguida do uso concomitante da TMZ com a radioterapia (STUPP et

al., 2007), a sobrevida dos pacientes é baixa e, por isso, novas pesquisas vêm estudando o

efeito da associação de TMZ com flavonoides em busca de novas estratégias para o

tratamento do glioblastoma (LEE, 2017). Estudos recentes apontaram que a associação de

TMZ com quercetina, por exemplo, é capaz de exercer um efeito melhor sobre a indução de

morte em células de glioblastoma do que as drogas utilizadas de forma individual, pois o

flavonoide seria responsável por sensibilizar as células tumorais e aumentar a eficácia do

tratamento quimioterápico, reduzindo a resistência a TMZ (HU et al., 2016; SANG et al.,

2014; JAKUBOWICZ-GIL et al., 2013).

Para entender qual a melhor concentração de TMZ a ser usada no ensaio in vitro,

recorremos à literatura. Alguns autores já mostraram o efeito da TMZ em células de

glioblastoma em estudos in vitro. Sang e colaboradores detectaram que concentrações a partir

de 100 µM TMZ foram capazes de provocar redução da viabilidade de células de

glioblastoma U251 (SANG et al., 2014). Lin e colaboradores também mostaram o efeito da

TMZ em concentrações semelhantes provocando efeito na inibição da proliferação de células

88

de glioblastoma U87 (LIN et al., 2012). Um trabalho recente do nosso grupo associou TMZ

com um composto natural, a naftoquinina shiconina, para combater células GBM02. Neste

trabalho, nosso grupo mostrou que para esta linhagem de glioblastoma, a menor concentração

de TMZ que é capaz de exercer efeito sobre as células é de 200 µM (MATIAS et al., 2017).

Tomando como base estes dados da literatura, optamos por trabalhar com as concentrações de

50, 100 e 200 µM de TMZ para tratar as linhagens GBM95 e GBM02 nos tempos de 24 e 48

horas. Com essas três condições, estaríamos utilizando a TMZ nas mesmas concentrações

usadas para a diosmina nos ensaios anteriores e também a concentração mínima capaz de

provocar efeito sobre estas linhagens de glioblastoma (200 µM), conforme descrito por

Matias e colaboradores (MATIAS et al., 2017).

Os resultados do ensaio e viabilidade mostraram que o tratamento de GBM95 e

GBM02 somente com diosmina levou a uma diminuição da viabilidade celular. Em

contrapartida, o tratamento somente com TMZ só se mostrou efetivo na maior concentração

de 200 µM por 48 horas. Mesmo sendo o quimioterápico de escolha para o tratameneto

clínico do glioblastoma, em ensaios in vitro este composto não apresenta efeitos tão

pronunciados (MATIAS et al., 2017; ZHANG et al., 2017). Somente em concentrações

muito elevadas e até tóxicas entre 1000 – 8000 µM que a TMZ se torna realmente efetiva e

provoca morte celular (BORHANI et al., 2017).

Sabendo-se desta baixa efetividade da TMZ sozinha em ensaios in vitro, muitos

autores tem tentado associar a TMZ com outros compostos naturais, inclusive flavonoides,

com o intuito de vencer a resistência das células e aumentar a eficácia do tratamento (LEE,

2017; MATIAS et al., 2017).

Matias e colaboradores testaram a associação da TMZ (200 µM) com a shiconina e

mostraram que a TMZ sozinha não foi capaz de reduzir a viabilidade das células de

glioblastoma da linhagem GBM02. No entanto, sua combinação com o composto natural

shiconina apresentava efeito sobre as células, fazendo com que elas ficassem mais sensíveis

ao tratamento quimioterápico. A associação de TMZ com flavonoides também parece ser

bem efetiva. Já foi estudada a combinação de TMZ com quercetina sobre células de

glioblastoma U87 e os resultados indicaram que a combinação foi mais efetiva do que ambos

os compostos sozinhos (LEE, 2017). O trabalho de Sang e colaboradores (2014) mostrou que

a combinação de 30 µM de quercetina com 100 µM de TMZ também foi efetiva na redução

89

da viabilidade de células U251 e U87, provocando morte celular por apoptose. No entanto,

quando a TMZ foi usada a 100 µM sem associação, não foi capaz de provocar os mesmos

efeitos na linhagem nestas linhagens. Somente em doses mais elevadas de (200 e 400 µM)

que a TMZ sozinha foi capaz de reduzir a viabilidade tumoral (SANG et al., 2014).

O grupo de Jakubowicz-Gil comparou o efeito de diversas concentrações de TMZ

sozinha com diversas concentrações de quercetina também sozinha e depois comparou com a

associação de TMZ e quercetina em concentrações menores. Os resultados deste trabalho

mostraram que, quando usada individualmente, a TMZ só foi capaz de induzir

significativamente a morte das células T98G a partir da concentração de 50 µM, enquanto

que a quercetina sozinha foi capaz de induzir o mesmo efeito a partir da concentração de 100

µM. A associação de ambos os compostos induziu processo de morte celular de forma mais

pronunciada, indicando que a combinação, neste caso, foi mais efetiva e permitiu uma

redução na concentração de TMZ (JAKUBOWICZ-GIL et al., 2013). Tendo estes dados

como base e sabendo que ainda não existem estudos na literatura que associem ou comparem

o uso de TMZ com diosmina no combate de glioblastoma, optamos por analisar esta

combinação. Os resultados deste trabalho indicaram que a associação provocou uma redução

da viabilidade de GBM95 e GBM02, enquanto que a TMZ sozinha não foi tão efetiva no

combate destas linhagens. Estes dados mostram que, da mesma forma que Sang (2014) e

Jukunowicz-Gil (2013) a associação de TMZ com o flavonoide é mais efetiva que TMZ

isoladamente (SANG et al., 2014; JAKUBOWICZ-GIL et al., 2013). No entanto,

esperávamos que a associação fosse melhor do que a adiministração individual da diosmina e

isto não foi o que ocorreu uma vez que obervamos que o tratamento somente com diosmina

foi ainda mais efetivo do que a combinação. Neste caso, é possível dizer que não há um

sinergismo ou efeito aditivo com a associação dos compostos e, possivelmente, a diosmina

não foi capaz de sensibilizar as células GBM95 e GBM02 à TMZ, não revertendo a

resistência ao quimioterápico. Sendo assim, optamos por seguir este trabalho tratando as

células somente com a diosmina, uma vez que este flavonoide sozinho é capaz de provocar

efeito citotóxico e reduzir de forma significativa a viabilidade das células de glioblastoma

humano.

Após a avaliação do potencial citotóxico, é importante entender como este efeito é

provocado e se o flavonoide é ou não capaz de alterar o citoesqueleto de GBM95 e GBM02,

uma vez que se sabe que o efeito citotóxico de flavonoides pode provocar alterações

90

morfológicas nas células (TOUIL et al., 2009). Alterações morfológicas em células de

glioblastoma também já foram observadas após tratamento com flavonoides (SANTOS et al.,

2015). Segundo dados de Santos e colaboradores, imagens de contraste de fase e imagens de

imunomarcação para GFAP sugeriram que os flavonoides 3,4 dihidroxiflavona, crisina,

kaempferol, apigenina, quercetina e rutina foram capazes de provocar alterações

morfológicas em células de glioblastoma GL-15, tornando o corpo celular mais alargado

(SANTOS et al., 2015). Considerando estes dados da literatura, o presente trabalho também

buscou avaliar possíveis alterações na morfologia das células GBM95 e GBM02 provocadas

pelo tratamento com o flavonoide diosmina.

As imagens da imunomarcação com vimentina mostraram que tanto as células

GBM95 quanto a GBM02 pareciam sofrer mudança em sua morfologia. Foi possível

observar uma redução no comprimento celular. Além disso, as células perderam as

características morfológicas descritas e caracterizadas previamente por nosso grupo (FARIA

et al., 2006).

Com objetivo de confirmar as alterações morfológicas, avaliamos o tamanho das

células medindo seu comprimento (em micrômetros) após o tratamento com a diosmina. O

objetivo desta análise era comparar o tamanho das células tratadas com o tamanho das células

do controle. Os resultados desta medição apontam que ocorre uma redução significativa do

comprimento das células GBM95 e GBM02 após o tratamento com a diosmina. Esta

alteração do comprimento celular de tumores provocada por flavonoides já foi previamente

estudada. O flavonoide apigenina já foi descrito como capaz de provocar alterações

morfológicas em células tumorais. Isoda e colaboradores mostraram que células K562 de

leucemia crônica sofriam um aumento de tamanho após tratamento com diferentes

concentrações de apigenina por 3 dias (ISODA et al., 2014). Santos e colaboradores (2015)

mostraram que alguns flavonoides, inclusive a apigenina que pertence à mesma classe da

diosmina é capaz de promover alterações morfológicas em células de glioblastoma GL-15.

Os resultados deste trabalho indicaram que as células GL-15 apresentavam um corpo celular

mais alongado, emissão de processos citoplasmáticos, além de retração citoplasmática

(SANTOS et al., 2015).

Nossos dados demonstraram que além desta alteração morfológica no comprimento,

parecia haver uma diminuição da celularidade, ou seja, um número menor de células dado ao

91

fato das imagens apresentarem mais espaços vazios nos tratamentos com diosmina do que

nos controles (DMSO). Os resultados da quantificação realmente comprovaram a redução na

população de células após o tratamento de GBM95 e GBM02 com diosmina. Esta redução

foi, de certa forma, compatível com a redução apresentada nos ensaios de viabilidade e pode

ser considerado um resultado positivo, uma vez que o glioblastoma é um tumor conhecido

por sua rápida proliferação celular e elevada agressividade (COELHO et al., 2016).

Segundo Ouhtit e colaboradores, pode haver uma associação entre essa redução do

número de células com a diminuição da proliferação celular ou aumento do processo de

indução de morte (OUHTIT et al., 2013). Tendo em vista o efeito citotóxico da diosmina

sobre as linhagens tumorais de glioblastoma humano, mas não sobre as células sadias, se

torna importante avaliar os efeitos deste flavonoide tanto sobre a diminuição da proliferação

quanto sobre o processo de indução de morte em células de glioblastoma.

Na literatura é possível encontrar trabalhos que descrevem o potencial citotóxico de

flavonoides através da inibição da proliferação celular. Segundo estudos in vitro recentes, a

isoquercetrina, a quercetina e a rutina são exemplos de flavonoides que apresentam efeitos

antiproliferativos sobre diferentes linhagens de glioblastoma. Amado et al. mostrou que a

isoquercetrina é capaz de agir sobre células de glioblastoma GBM95 inibindo sua

proliferação (AMADO et al., 2009). O grupo de Braganhol exibiu o efeito antiproliferativo

da quercetina sobre a linhagem de glioma U138MG. Segundo os dados de Braganhol e

colaboradores, a exposição das células à quercetina levou a uma redução do número total de

células de forma tempo dependente (BRAGANHOL et al., 2006). Já o flavonoide rutina

parece agir inibindo de forma significativa a proliferação da linhagem de glioblastoma GL-15

(SANTOS et al., 2011).

A diosmina já foi descrita como capaz de agir inibindo a proliferação de outras

linhagens tumorais. Um estudo recente apresentou resultados da diosmina inibindo a

proliferação de células de tumor de próstata DU145 (LEWISKA et al., 2015). Outro estudo

mostrou o efeito da diosmina sobre a proliferação de células de hepatocarcinoma. Os

resultados de Dung e colaboradores sugerem que a diosmina é capaz de inibir a proliferação

de carcinoma hepático através da redução na expressão de genes reguladores do processo de

proliferação como Cdk, c-Fos e c-Myc, além de aumentar a expressão do gene supressor de

tumor p53 (DUNG et al., 2012).

92

Além dos efeitos sobre a proliferação celular, alguns autores já vêm destacando a

capacidade de certos flavonoides em induzir morte das células de glioblastoma. Pozsgai e

colaboradores e também o grupo de Jakubowicz-Gil mostraram que a quercetina é capaz de

agir induzindo apoptose em linhagens de glioblastoma U251 e T98G (POZSGAI et al., 2013;

JAKUBOWICZ-GIL et al., 2013). Outro flavonoide que também parece induzir apoptose é o

kaempferol. Segundo dados de Sharma et al., o kaempferol foi capaz de aumentar a

expressão de moléculas pró-apoptóticas e ativar caspase-3 em células de glioblastoma

U87MG, LN229 e T98G, além de provocar estresse oxidativo por geração de espécies

reativas de oxigênio (ROS) (SHARMA et al., 2007). A diosmina também já foi descrita

como um flavonoide capaz de induzir morte celular em distintas linhagens tumorais através

de ensaios in vitro (RAJASEKAR et al., 2016; LEWINSKA et al., 2015; KUNTZ et al.,

1999).

Considerando que os flavonoides são compostos com capacidade tanto de inibir a

proliferação quanto de provocar morte celular e que, em especial a diosmina já foi descrita

com estas duas funções, julgamos necessário entender por qual mecanismo a diosmina estaria

induzindo efeito citotóxico sobre as células de glioblastoma. Por este motivo, buscamos

avaliar tanto o efeito da diosmina sobre a proliferação quanto sobre a indução de morte nas

linhagens GBM95 e GBM02.

Pelo fato de diversos flavonoides já terem sido amplamente descritos com potencial

antiproliferativo, investigamos em primeiro lugar se a diosmina também era capaz de exercer

este efeito. Porém, os resultados do ensaio de proliferação mostraram que, apesar da diosmina

induzir a inibição da proliferação de algumas linhagens tumorais, ela não parecia ser capaz de

reduzir de forma significativa a proliferação das células de glioblastoma GBM95 e GBM02.

Isto pode ser explicado pelo fato dessas células apresentarem uma elevada capacidade

proliferativa (SANTOS et al., 2015; FARIA et al., 2006), o que poderia dificultar o

tratamento com o flavonoide diosmina.

Levando em conta o fato da diosmina não exercer efeito significativo sobre a inibição

da proliferação de GBM95 e GBM02, mas tendo em conta sua capacidade de reduzir a

viabilidade destas linhagens, passamos a suspeitar de que o efeito citotóxico da diosmina se

dava pela indução de morte. Por este motivo, seguimos com o ensaio de morte celular em

busca de comprovar este efeito da diosmina.

93

Nos últimos anos, alguns autores já descreveram o processo de morte de diferentes

linhagens de glioblastoma (YUAN et al., 2014; HAN et al., 2013; GONDI et al., 2011). O

resultado que obtivemos no ensaio de morte indicou que a diosmina foi capaz de provocar um

aumento na porcentagem de células GBM95 e GBM02 que sofreram morte, ou seja, que

tinham seu DNA fragmentado e, consequentemente, eram marcadas pelo reagente. Todas as

condições de tratamento se mostraram efetivas sobre as células tumorais, indicando que,

possivelmente, a diosmina age sobre estas linhagens promovendo efeito indutor de morte.

Alguns estudos já vêm demonstrando através de ensaios in vitro a capacidade da diosmina em

induzir morte celular (especialmente pelo processo de apoptose) em outras linhagens

tumorais como tumor de próstata (LEWINSKA et al., 2014), carcinoma hepático (DUNG et

al., 2012) e melanoma (ÁLVAREZ et al., 2009).

Um estudo recente de um grupo de pesquisadores da Índia mostrou através de ensaio

de Western Blot a capacidade do flavonoide diosmina de provocar apoptose em tumor bucal

animal por aumento na expressão das caspases 3 e 9, proteases essenciais durante o processo

de morte celular programada das células. Além disso, a diosmina parece ser capaz de modular

a via STAT-3, controlando assim a expressão de genes indutores de apoptose (RAJASEKAR

et al., 2016). Já Lewinska et al. apresentou em seu trabalho a capacidade da diosmina em

induzir apoptose em células de tumor de próstata. Este trabalho mostrou que não só houve um

aumento na população de células mortas, como também foi observada uma elevada

porcentagem das células em apoptose tardia na (LEWINSKA et al., 2014). Entretanto,

mesmo já tendo alguns dados publicados, o real mecanismo de ação pelo qual a diosmina

promove indução de morte de células tumorais ainda não foi bem descrito.

Sabe-se que a diosmina é um flavonoide pertencente ao subgrupo das flavonas e, estas

são conhecidas por apresentarem diversas atividades biológicas como efeito antioxidante e

anti-inflamatório, já explorados pela medicina através de medicamentos para tratamento de

varizes e hemorroida (DIANA et al, 2000). Entretanto, seus efeitos antitumorais ainda estão

sendo estudados (SINGH et al., 2014).

A apigenina é amplamente conhecida por suas propriedades anti-tumorais. Segundo

Singh e colaboradores, ela exibe efeito citotóxico sobre diversos tumores como

neuroblastoma, carcinoma de cólon, câncer de mama e próstata, entre outros (SINGH et al.,

2014). No entanto, apesar da literatura científica envolvendo a aplicação desta flavona no

94

combate de células de glioblastoma ainda ser recente, os resultados já apontam sua

capacidade em estimular a apoptose em glioblastoma T98G e U87, mas não das células de

astrócitos humanos sadios (DAS et al., 2010). Outros trabalhos também já apontaram a

apigenina como um flavonoide como capaz de reduzir o crescimento e a viabilidade de

células de glioblastoma além de induzir apoptose (CHEN et al., 2016; KIM et al., 2016).

Outra flavona, a luteolina também parece atuar de forma citotóxica sobre células U87MG e

T98G (CHEN et al., 2016).

De acordo com Walle (2014), a estrutura dos flavonoides pode influenciar no seu

efeito sobre células tumorais (WALLE, 2004) e, por este motivo, é possível que outras

flavonas também exerçam efeito de indução de morte sobre células de glioblastoma. Nesse

contexto, o presente trabalho se torna interessante por, não somente descrever o papel de

diosmina sobre o glioblastoma, mas também por buscar entender se, assim como outras

flavonas, a diosmina é um promissor candidato ao tratamento do tumor através de ensaios in

vitro.

O resultado deste estudo para o ensaio de morte pode ser considerado promissor.

Porém, além de mostrar que a diosmina age induzindo a morte de GBM95 e GBM02, é

fundamental caracterizar melhor a via de ação pelo qual este flavonoide atua para

desencadear o processo de morte nestas linhagens. Neste contexto, passamos a suspeitar que

o efeito de redução da viabilidade, redução da celularidade e as alterações morfológicas

ocorridas com as células tratadas com diosmina estariam ocorrendo através do processo de

morte por apoptose. Além disso, segundo Susan Elmore (2007), é possível, durante a morte

por apoptose, observar além da fragmentação do DNA, algumas alterações na morfologia das

células como, por exemplo, encolhimento de seu tamanho (ELMORE, 2007), semelhante ao

que observamos nas análises morfológicas.

A fragmentação do DNA é uma característica do processo de morte por apoptose

(DARZYNKIEWICZ et al., 2008). Porém, esta característica não é seletiva somenta para

células que sofreram morte por apoptose. Outro processo de morte, como por exemplo a

necrose, também provoca fragmentação do DNA e, desta forma, identificamos uma limitação

do ensaio morte celular do nosso trabalho pois, avaliamos inicialemnte as células que estão

com DNA fragmentado (JEROME et al., 2000). Levando em consideração esta limitação, se

95

tornava interessante analisar outro método capaz de confirmar a morte especificamente por

apoptose e, por este motivo, optamos por analisar a expressão de caspase-3 clivada.

A caspase-3 clivada é considerada um marcador universal de apoptose porque sua

atividade é necessária para a maioria dos eventos morfológicos e bioquímicos associados à

apoptose. De forma geral, a apoptose é orquestrada pelas caspases, uma família de cisteíno

proteases que clivam seus substratos de resíduos de ácido aspártico. A caspase-3 é umas

destas proteases que, quando estimulada sofre clivagem autolítica para se tornar ativa

(CROWLEY e WATERHOUSE, 2016). Alguns trabalhos já usam a caspase-3 clivada para

analisar os efeitos de compostos em induzir apoptose em glioblastoma (JU et al., 2013; DAS

et al., 2010).

Neste trabalho, usamos a caspase-3 clivada e, portanto, ativada para identificar se o

processo de morte provocado pela diosmina nas células de glioblastoma ocorria, de fato, por

apoptose dependente de caspase-3 clivada. Os resultados indicaram que, em comparação com

o controle, houve um aumento na expressão desta caspase nas linhagens GBM95 e GBM02

quando tratadas com a diosmina. A linhagem GBM02 expressou mais caspase-3 clivada do

que a linhagem GBM95. No entanto, ambas apresentaram uma expressão significativa em

relação ao controle e isto já indica que a apoptose está envolvida no processo de morte.

A indução de apoptose em células de glioblastoma provocada por flavonoides já foi

descrita na literatura. A quercetina é um exemplo de flavonoide já caracterizado como capaz

de induzir morte celular por apoptose em diferentes linhagens de glioblastoma (PAN et al.,

2015; BADZIUL et al., 2014; JAKUBOWICZ-GIL et al., 2013). No trabalho de Badziul e

colaboradores, a quercetina foi capaz de induzir processo de apoptose em células de

glioblastoma T98G através do aumento da atividade de caspase-3 e caspase-9 (BADZIUL et

al., 2014). De forma semelhante, Pan e colaboradores mostraram que distintas concentrações

de quercetina foram capazes de provocar apoptose em células de glioblastoma das linhagens

U87 e U251 (PAN et al., 2015).

O efeito pró-apoptótico de alguns flavonoides pode contribuir para a inibição do

crescimento e progressão tumoral. No entanto, a diosmina ainda não foi descrita na literatura

com efeitos pró-apoptóticos em células de glioblastoma. Apesar disto, ela já foi descrita em

ensaios in vitro como capaz de induzir apoptose em outras linhagens como, por exemplo,

células de câncer de mama (LEWINSKA et al., 2017) e também de próstata (LEWINSKA et

96

al., 2014). Estudos in vivo também apontam o efeito pró-apoptótico da diosmina em células

de feocromocitoma de ratos (DHOLAKIYA e BENZEROUAL., 2011) e em células de

carcinoma de boca de hamsters (RAJASEKAR et al., 2016).

No estudo in vitro do grupo de Lewinska, o efeito apoptótico se deu através do

aumento da expressão de múltiplas caspases após o tratamento de células humanas MCF-7 de

câncer de mama com o flavonoide diosmina (LEWINSKA et al., 2017). De forma similar, o

trabalho de Rajasekar mostrou que a diosmina também é capaz de aumentar a expressão das

caspases 3 e 9 em células animais de carcinoma de boca (RAJASEKAR et al., 2016). Essa

ativação da cascata das caspases é uma etapa crítica para a execução da morte celular

(FULDA e DEBATIN, 2013) e os resultados com a diosmina indicam que ela parece ser um

flavonoide promissor no combate de diversas linhagens tumorais.

O efeito pró-apoptótico em células de glioblastoma já foi descrito para os flavonoides

apigenina e luteolina, pertencentes a mesma classe da diosmina (STUMP et al., 2017;

WANG et al., 2017). O grupo de Stump mostrou que a apigenina foi capaz de inibir a

expressão do marcador anti-apoptótico Bcl-xL em linhagens de glioblastoma U1242 e U87.

Segundo os autores, este resultado sugere o envolvimento da caspase-9 na ativação do

processo de apoptose nessas linhagens tumorais (STUMP et al., 2017). De forma análoga, os

dados de Wang e colaboradores mostraram que o flavonoide luteolina, também em

concentrações menores que 80 µM, foi capaz de aumentar a expressão de caspase-3 clivada,

provocando, portanto, apoptose nas células U251 e U87 (WANG et al., 2017).

Tomando como base o efeito pró-apoptótico da diosmina sobre as células GBM95 e

GBM02 e o efeito de outras flavonas sobre outras linhagens de glioblastoma, pode estar

havendo um efeito de classe. O trabalho de Polier e colaboradores (2011) mostrou que

flavonas e moléculas de estrutura semelhante como a wogonina apresentavam efeito indutor

de apoptose em células de leucemia mieloide pela inibição de cinase 9 dependente de ciclina

(CDK9) (POLIER et al., 2011). Sabendo-se destes dados, pode-se dizer que os flavonoides

pertencentes à classe das flavonas são promissores no combate do glioblastoma.

Os resultados deste trabalho apontam que a diosmina age sobre as células de

glioblastoma através da indução do processo de apoptose. Desta maneira, é possível sugerir

que a o mecanismo de ação pelo qual a diosmina estaria agindo sobre as células tumorais

seria a via intrínseca da apoptose, uma vez que o flavonoide estaria causando um dano ao

97

DNA das células, estimulando a fragmentação e, com isso, haveria um processo de alteração

da morfologia das células, liberação de proteínas mitocondriais para o citoplasma, ativação de

caspase-9, que por sua vez desencadeia a ativação de caspase-3, resultando no processo de

morte celular por apoptose.

De forma geral, as terapias antitumorais atuais são, em sua maioria, capazes de induzir

morte celular ativando elementos chave do processo de apoptose. Na maior parte das vezes,

as moléculas efetoras do processo são as caspases (FULDA e DEBATIN, 2013). Por este

motivo, os resultados deste trabalho se tornam importantes para garantir que a inibição da

progressão tumoral se dá, de fato, através da indução de morte provocada pela diosmina.

A indução de morte por apoptose induzida pela diosmina nas células GBM95 e

GBM02 pode contribuir de forma significativa para a inibição da progressão destes tumores.

Já se sabe que a inibição da progressão tumoral por apoptose é muito importante,

principalmente quando consideramos tumores como o glioblastoma que é conhecido por ter o

mecanismo de morte programada bastante reduzido dada a elevada malignidade das células

(STUMP et al., 2017).

A princípio, nosso trabalho é o primeiro a descrever o efeito pró-apoptótico da

diosmina em células de glioblastoma humano GBM95 e GBM02. De maneira geral, este

trabalho contribuiu para analisar o papel da diosmina sobre células tumorais e entender seus

efeitos. Além disso, é possível dizer que identificamos que o efeito citotóxico da diosmina in

vitro ocorreu pela indução de morte por apoptose dependente de caspase-3 clivada. A

diosmina também foi responsável por reduzir o número de células viáveis e por alterar o

citoesqueleto das células tumorais. Sendo assim, o flavonoide diosmina parece ser um

composto efetivo e promissor no combate do glioblastoma.

98

7 CONCLUSÕES

Este trabalho procurou entender o papel da diosmina em células de glioblastoma

humano. Através dos resultados é possível concluir que:

• A diosmina é eficaz na redução da viabilidade das células de glioblastoma

GBM95, GBM02 e U87, provocando um efeito citotóxico nestas linhagens;

• A diosmina não se mostrou capaz de reduzir de forma significativa a viabilidade

dos astrócitos humanos sadios, indicando uma possível seletividade deste

composto às células tumorais;

• As células GBM95 e GBM02, quando tratadas com diosmina sofrem uma

diminuição em sua população além de também sofrerem alterações em seu

comprimento e, portanto, em sua morfologia como um todo;

• A diosmina não foi capaz de inibir a proliferação celular das linhagens GBM95 e

GBM02, em nenhuma das condições de tratamento avaliadas;

• O tratamento com diosmina é capaz de provocar fragmentação no DNA das

células GBM95 e GBM02, induzindo morte celular;

• A indução de morte nas células GBM95 e GBM02 provocada pela diosmina

ocorreu pela ativação da via das caspases e consequentemente, ocorre através do

processo de apoptose dependente de caspase-3 clivada;

• As predições in silico indicam que, apesar da diosmina apresentar um perfil

farmacocinético pouco favorável, este composto pode ser considerado seguro

uma vez que não apresenta cardiotoxicidade, não parece ser carcinogênico para

ratos e camundongos e também não se mostrou mutagênico.

De forma geral, os resultados obtidos através deste trabalho indicam que a diosmina é

um flavonoide bastante promissor no combate do glioblastoma. Porém, os mecanismos reais

pelos quais esse composto atua sobre o tumor e as vias de sinalização ativadas no processo de

apoptose ainda não foram bem descritos, sendo necessários mais estudos para entender

melhor o papel da diosmina sobre células de glioblastoma para, futuramente, ser possível

projetar novos protocolos de tratamento do glioblastoma.

99

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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ANEXO A - REGISTRO CONEP N°2340, 2001

Figura 15 - Registro CONEP 2340. Registro de aprovação de uso de células humanas para fins de pesquisa.