Kultur Organ12 STF

5/26/2018 Kultur Organ12 STF

1/53


2/53

Tumbuhansumber utama senyawa2 kimia

yang digunakan untuk farmasi, food additive,

wangi-wangian Industri kimia (industri farmasi) merupakan

industri yang didukung senyawa-senyawa alami

dari tumbuhan, kadang-kadang senyawa ini

tidak tergantikan karena keaktifannya dalam

menyembuhkan.

Potensi untuk sintesis kimia dari tumbuhan

sangat besar, kira-kira 1600 struktur senyawabaru.


3/53

Beberapa tanaman yang menghasilkan metabolit sekunder


4/53

Produksi kimia tanaman ini biasanya

merupakan senyawa metabolisme sekunder,

sebagian besar mempunyai struktur kimiayang kompleks, shg sulit untuk disintesis

secara kimia

Produksi senyawa kimia secara industrial

mahal, terutama senyawa2 kompleks,

sehingga dinilai kurang ekonomis

Oleh karena itu dicarikan suatu solusi untuk

menghasilkan senyawa kimia tersebutmenggunakan teknik perbanyakan secara in

vitro


5/53

Sebelum melakukan perbanyakan met sek

secara in vitro perlu diketahui ekspresi sintesis

senyawa met sek pada keadaan in vivo dan invitro yang tergantung pada tahap-tahap

perkembangannya, misal : Pigmen antosianin

utk Wortel pd umbi, tanaman lainnya pada

bunga atau buah, kadang-kadang daun (in vivo)

Secara in vitro : senyawa vinblastin dan

vincristin (obat kanker darah) : hasilnya lebih

tinggi pada daun yang dihasilkan secara in vitrodibandingkan dengan kalus sehingga

diarahkan untuk pembentukan daun


6/53

Beberapa keuntungan dari pemakaian teknik

kultur jaringan tanaman untuk menghasilkan

metabolit sekunder antara lain :1. Tidak tergantung pada faktor lingkungan

(iklim, hama penyakit, hambatan geografis

dan musim)2. Sistem produksinya dapat diatur, dimana

produksi dilakukan pada saat dibutuhkan

dan jumlah yang diinginkan

3. Kualitas dan hasil produknya lebih konsisten

4. Mengurangi penggunaan lahan


7/53

Hal yang pertama dilakukan untuk

memproduksi met sek sec. in invitro

dilakukan analisis jaringan tanaman untukmengetahui bagian tanaman yang

mempunyai kandungan tertinggi senyawa

yang diinginkanFaktor-faktor yang menentukan kandungan

met sek pada tumbuhan :

a. genetik,

b. umur fisiologis eksplan

c. bagian tanaman


8/53

Teknik kultur jaringan semakin

berkembang dan popular sebagai salah

satu alternatif dari propagasi tanaman

secara vegetatif. Teknik ini meliputi metode propagasi

aseksual dan tujuan utamanya adalah

membuat tanaman lebih unggul.

KULTUR ORGAN


9/53

Keberhasilan pertama dalam kultur in vitrodicapai dalam praktek kultur organ.

Menurut ShabdeMoses & Murhasige(1979), Hannig, pada tahun 1904 telahberhasil mendapatkan kecambahtanamanjenis cruciferdari embrio-embrioyang

diisolasi dari biji yang belum matang(immature).

Pertumbuhan organ yang tidak terbatas didalam kultur in vitro, pertama diperlihatkan

oleh Whitedalam kultur akar tomat sekitartahun 1934.


10/53

Kultur organ merupakan topik yang pentingdalam penelitian antara tahun 1940-1960,

terutama Kultur pucuk atau meristemmempunyai aspek praktis sebagai caraperbanyakan klon yang cepat dan bebaspenyakit.

pada tahun 60 an, kultur akar mendapatperhatian lagi pada beberapa tanamantertentu sehubungan dengan tujuanproduksi bahan metabolit sekunder,

terutama untuk jenis-jenis persenyawaanyang berasosiasi dengan akar.


11/53

Namun kultur akar yang pertumbuhannya

tidak terbatas tersebut, dewasa ini pada

umumnya dipusatkan pada hasiltransformasi denganAgrobacterium

rhizogenesyang merupakan kultur auksin

autotroph.


12/53

Cara Perbanyakan wortel secara kultur jaringan


13/53

Perbanyakan kultur jaringan, daun sebagai eksplan


14/53

Kultur jaringan dengan menggunakan akar sebagai

eksplan


15/53

Kultur Kalus

Kultur kalus merupakan pemeliharaan bagian kecil tanaman

dalam lingkungan buatan yang steril dan kondisi yang terkontrol(Pauls, 1995 dalam Kulkarni, 2000).

Kalus adalah jaringan yang berproliferasi secara terus menerusdan tidak terorganisasi sehingga memberikan penampilan sebagaimassa sel yang bentuknya tidak teratur.

Proliferasi jaringan ini dapat dilakukan secara tidak terbatasdengan cara melakukan subkultur sepotong kecil jaringan kaluspada medium yang segar dengan interval waktu yang teratur(George & Sherrington, 1984).

Kalus diinduksi dengan melukai jaringan tanaman. MenurutGeorge & Sherrington (1984), pemotongan atau pelukaan jaringan

tanaman dapat merangsang pembelahan sel yang berperandalam inisiasi pembentukan kalus.

Kultur kalus ini merupakan materi penting dalam kultur suspensisel tanaman (Allan 1996 dalam Grel, 2002).


16/53


17/53

Untuk menginduksi kalus dari tanaman yang berdaun

lebar, 2,4-D yang sering digunakan adalah pada

konsentrasi 4,513,6 M ( 1,0 3,0 mg/l ). Tetapi Mok

dan Mok ( 1977 ) mendapatkan bahwa lajupertumbuhan dari kalus pada beberapa spesies dan

varietas dari Phaseolus lebih besar bila menggunakan

picloram daripada 2,4-D. Picloram aktif pada

konsentrasi rendah dengan perbedaan konsentrasiyang besar ( George and Sherington, 1984 ).

Menginduksi kalus dari tanaman monokotil lebih sulit (

sebagian rumput-rumputan dan sereal ), konsentrasi

2,4-D yang sering digunakan adalah 9,045,2 M ( 2,010,0 mg/l ) (George and Sherington, 1984 ).


18/53

Kultur Suspensi Sel

Kultur suspensi sel adalah pemeliharaansel, tunggal maupun gabungan beberapasel, dalam medium cair dan lingkunganbuatan yang steril.

Kultur suspensi sel terdiri atas populasi seldengan laju pertumbuhan yang cepatkarena seluruh permukaan sel dapatkontak langsung dengan medium nutrisi.

Hal ini menyebabkan metabolisme sel lebihtinggi jika dibandingkan dengan kulturkalus (George & Sherrington, 1984).


19/53


20/53


21/53


22/53


23/53


24/53


25/53


26/53


27/53


28/53


29/53


30/53


31/53


32/53

Metode kultur suspensi sel dapat digunakansebagai sarana untuk produksi metabolit

sekunder.

Hal ini dapat terjadi karena setiap sel tumbuhanyang diisolasi dari tumbuhan induknyamempunyai potensi genetik dan fisiologi yangsama dengan induknya, atau yang dikenaldengan nama sifat totipotensi.

Sifat ini menyebabkan metabolit sekunder yangdihasilkan oleh tanaman induk dapat puladihasilkan pada sel yang dikultur secara in vitro(Fowler, 1981 dalam Mantell & Smith, 1983).


33/53

Potensi kultur sel untuk

memproduksi metabolit

telah dibuktikan pertama

kali oleh perusahaan farmasi

Amerika Pfizer Inc pada

tahun 1956.

Sedangkan potensi kultur

sel untuk memproduksi

senyawa bermanfaat

terutama untuk obat-

obatan, telah dimulai padaakhir tahun 1960 (Ptiard &

Bariaud-Fontanel, 1987

dalam Sasson, 1991).


34/53

Kultur suspensi sel dapat diperoleh dengan cara

memindahkan kalus dari medium padat ke medium cair

dalam kondisi agitasi selama periode kultur dalam waktu

tertentu.Fungsi Agitasi :

kalus remah akan terpisahkelompok sel dan sel-sel

tunggalmembelah membentuk kelompok-kelompok sel

terpisah lagi membentuk sel-sel tunggal dan kelompok-

keompok sel yang lebih kecil. George & Sherrington (1984)

meningkatkan aerasi, reduksi polaritas tanaman dan dapat

mempertahankan keseragaman distribusi sel-sel dan

kelompok sel di dalam medium (Lim-Ho, 1982 dalam George

& Sherrington 1984), mempengaruhi ukuran agregat, viabilitas dan pertumbuhan

sel. Selain itu pengocokan berfungsi untuk meningkatkan

oksigen.Endress (1994)


35/53

Persiapan Bahan

1. Bahan tanaman :

o Suspensi sel baru disiapkan dengan

cara memipet 5 ml dari suspensi sel

dan dipindahkan ke media baru


36/53

Prosedur Kultur Suspensi Sel


37/53

Teknik Produksi Metabolit Sekunder

melalui Teknik Kultur Jaringan Pada prinsipnya setiap sel memiliki kemampuan untuk

memproduksi senyawa metabolik sekunder yang diproduksioleh tanaman.

Berbagai macam eksplan baik berupa organ dan jaringan daridaun, batang, akar, bunga dan buah dapat digunakan sebagaieksplan.

Setiap jenis tanaman terdapat bagian organ tertentu yang dapat

memproduksi senyawa metabolik sekunder yang diinginkan dalamkuantitas dan kualitas yang memadai.

Misal : Produksi diterpane glycosidayang optimal diperoleh dari

kultur daunNicotiana attenuata (Keinanen dkk. 2001), danproduksi shikoninjuga diperoleh dari kultur akarLithospermumerythrorhizon (Kazufumi 2001).


38/53

Selainjenis eksplan, perbedaan kondisikulturjuga mempengaruhi kualitas dankuantitas senyawa metabolik sekunder yang

dihasilkan Bohm (1980), Verpoorte et.al. (1999), Adnane

et.al., (2001), Kazufumi et.al. (2001) Bohm(1977) dalam Bohm (1980), menyatakan bahwacahaya dan auksinmerupakan dua faktor yangsangat mempengaruhi produksi flavonoid danpigmen lainnya dalam kultur.

Kultur sel dan sel suspensi yang ditanamdalam kondisi terang (dengan pencahayaan)

memproduksi enzim yang berperan dalambiosintesis flavonoid, sehingga produksiflavonoid pada sel tersebut meningkat.


39/53

Dengan memahami faktor-faktor yang mempengaruhikuantitas dan kualitas metabolik sekunder yang diproduksitersebut, optimasi produksi metabolik sekunder dapatdilakukan, antara lain dengan:

a) ImmobilisasiPertumbuhan agregat kalus, sel, dan embrio meningkatpada kultur cair, demikian juga produksi senyawametabolik sekunder.

Pada kultur cair, sintesa dan ekstraksi metabolik sekunderdapat dilakukan secara maksimumtanpa mengganggupertumbuhan sel atau embrio. Hal ini dapat dilakukandengan meletakkan sel pada gel, busa polyurethin,jaring nylondanserat sehingga pada saat diekstrak, selmelekat pada gel, busa polyurethin, jaring nylon dan serattersebut dan tidak ikut keluar bersama medianya.


40/53

b) BiotransformasiTransformasi sel dapat dilakukan secara

biologi,sehingga dapat dihasilkan senyawametabolik sekunder yang diharapkan. Salahsatu contohnya adalah penggunaan enzimyang terdapat dalam sel tanamanuntuk

menghasilkan struktur kimia dari senyawakimia lain yang diletakkan dalam mediakultur.

c) Penggunaan Elicitor

Ragidapat digunakan sebagai elicitor yangmeningkatkan produksi senyawa metaboliksekunder dalam kultur jaringan


41/53

Elisitasi merupakan proses penambahan

elisitor pada sel tumbuhan dengan tujuan

untuk menginduksi dan meningkatkanpembentukan metabolit sekunder

Dalam hal ini adanya interaksi patogen

dengan inangakan menginduksi

pembentukan fitoaleksin pada tumbuhan.

Fitoaleksin itu sendiri merupakan senyawa

antibiotikyang mempunyai berat molekul

rendah, dan dibentuk pada tumbuhan tinggisebagai respons terhadap infeksi mikroba

patogen


42/53

Elisitor selain dapat menginduksi sintesis

fitoaleksin, ternyata dapat juga menginduksi

sintesis metabolit sekunder yang bukanfitoaleksin pada kultur kalus dan sel (Eilert et

al 1986).


43/53

Elisitor terdiri atas dua kelompok, yaitu elisitorabiotik dan elisitor biotik

1. Elisitor abiotik, bisa berasal dari senyawa

anorganik contoh : radiasi secara fisik, sepertiultraviolet, logam berat, dan detergen

2. Elisator biotic dapat dikelompokkan dalam elisitorendogen, dan elisitor eksogen, yaitu :

a. Elisator endogen, umumnya berasal dari bagian

tumbuhan itu sendiri, seperti bagian dari dinding sel(poligogalakturonat ) yang rusak. Rusaknya dindingsel ini, disebabkan oleh suatu serangan pathogen.Dinding sel yang rusak dan terluka oleh karenaaktivitas enzim hidrolisis dari serangan pathogen.

b. Elisator eksogen, bisa berasal dari dinding jamurmisalnya kitin, atau glukan. Selain itu dapatberupa senyawa yang disintesis, misalnya protein (enzim ) (Salisburry & Ross, 1995 ).

B b liti t l h b ktik b h


44/53

Beberapa penelitian telah membuktikan bahwametode elisitasi dapat meningkatkankandungan fitoaleksin dan metabolit

sekunder lain pada tumbuhan tertentu1. Kandungan fitoaleksin kapsidiol pada kultursel Capsicum annuum dapat ditingkatkansetelah diberi penambahan ekstrak dari spora

dan miselium Gliocladium deliquescens2. Antosianinpada kultur sel Daucus carotadapat ditingkatkan setelah diberi penambahanfiltrat sel dan homogenat dari Escherichiacoli, Staphyllococcus aureus,Saccharomyces cereviseae, dan Candidaalbicans.


45/53

salah satu organ pada tumbuhan yang

banyak mengandung metabolt

sekunder adalah akarpenelitimemperbanyak akar tanaman-tanaman

penghasil metabolit sekunder.

Akar berambut adalah anak akar atau

akar halus dalam istilah kultur jaringandisebut kultur akar berambut.

Kultur akar merupakan kultur jaringan akar yang

hidup dan berdiferensiasi secara terorganisir

membentuk biomasa akar tanpa kehadiran tipe

organ lain dari tanaman seperti batang, tunas atau

daun secara in vitro (Payne et al. 1992)

Kultur Akar Berambut


46/53

T-DNA akan terintegrasi pada kromosom tanamandan akan mengekspresikan gen-gen untukmensintesis senyawa opine, di samping itu T-DNAjuga mengandung onkogen yaitu gen-gen yangberperan untuk menyandi hormon pertumbuhan

auksin dan sitokinin.

Ekspresi onkogen pada plasmid Ri mencirikanpembentukan akar adventif secara besar-besaran pada tempat yang diinfeksi dan

dikenal dengan hairy root (Nilson & Olsson,1997).

Penyerangan terhadap akar oleh bakteriAgrobacterium rhizogenes yangmenyebabkan tumbuhnya akar berambut

secara cepat pada eksplan. akan dapatmenghasilkan metabolit sekunder.

Kultur akar rambut tersebut telah digunakan untuk mempelajari keberadaan

senyawa bioaktif seperti ribosome inactivating protein (RIP) atau senyawa

bioaktif lainnya (alkaloida, flavonoida, poliaetilena dan fitoaleksin) (Toppi et al.

1996; Savary & Flores 1994).


47/53

Akar berambut adalah anak akar yang

berupa akar kecil berbentuk seperti rambut

halus. Kultur akar berambut adalah suatu metode

budidaya akar berambut secara in vitro

dengan kondisi yang terkendali dan aseptis

dimana pada kultur akar ini, akarberdiferensiasi secara terorganisir

membentuk biomasa akar tanpa kehadiran

tipe organ lain dari tanaman seperti batang,tunas atau daun secara in vitro (Payne et al.

1992).


48/53

Akar yang dikulturkan

1. Akar normal

2. Akar transgenik

Kultur akar normal diperoleh dengan menanam ujung akartanaman atau kecambah secara in vitro dalam media yang

mengandung zat pengatur tumbuh tanaman

kultur akar transgenik diperoleh dengan menanam akar rambut

(hairy root) yang dihasilkan dari transformasi genetik denganbantuan Agrobacterium rhizogenes

Aplikasi Kultur Akar Berambut


49/53

Aplikasi Kultur Akar BerambutTeknik ini merupakan suatu pilihan kultur organ yangdigunakan ketika metabolit sekunder tidak dapat dihasilkanoleh sel. Metabolit sekunder umumnya muncul saat sel telahterdiferensiasi.

Metode1. Pemilihan eksplan2. Eksplan dicuci lalu disterilkan dengan sterilan, kemudian dibilasdengan air steril selanjutnya ditumbuhkan dalam media padat yangsesuai.3. Eksplan yang dipilih kemudian dikecambahkan dalam media padatselama waktu yang ditentukan.4. Inokulasi bakteriAgrobacterium rhizogenes strain LBA9457 ditumbuhkan dalam mediayeast manitol broth (YMB) padat yang tersusun dari yeast extract (0,4g/l), manitol (10 g/l), NaCl (0,1 g/l), MgSO4.7H2O (0,2 g/l), KH2PO4(0,5 g/l), dan agar-agar (7 g/l) sebagai bahan pemadat. Induksipembentukan akar rambut dilakukan dengan cara menusukkan jarumpreparat yang telah dicelupkan ke koloni bakteri umur 3 hari ke bagianhipokotil dari eksplan.


50/53

Hal yang perlu diperhatikan dalam

melakukan kultur akar berambut antaralain:1. Galur Agrobacterium rhizogenes2. spesies tanaman

3. sumber eksplan dan4. komposisi mediumKeempatnya berpengaruh terhadap inisiasi,pertumbuhan, perkembangan dan vigor akar

rambut

Keuntungan Kultur Akar Berambut:


51/53

Keuntungan Kultur Akar Berambut:1. Hasilnya yang relatif seragam2. Memiliki kestabilan genetik yang tinggi.3. Mudah dilakukan elisitasi untuk peningkatan jumlah produksimetabolit sekunder.

4. Kapasitas metabolit sekunder lebih besar daripada tanamanasal.5. Merupakan metode yang ideal untuk mempelajarikandungan senyawa aktif yang diproduksi tanamankarenaakar rambut dapat melakukan sintesis senyawa aktif yangdiinginkan dan dapat tumbuh stabil dalam media in vitro

6. Prosesnya yang relatif mudah yaitu penggunaan mediauntuk tumbuh tidak memerlukan penambahan zat pengaturtumbuh.7. Mudah untuk memanipulasi berbagai faktor dalam kultur

jaringan yang digunakan dengan tujuan untuk meningkatkanproduksi biomasa atau senyawa aktif yang diinginkan.

Manipulasi yang dapat dilakukan antara lain seleksi galur akarrambut yang produktif, optimasi kondisi media kultur dan induksiproduksi senyawa aktif dengan perlakuan elisitasi (Fu 1999).8. Kultur akar ini bisa di regenerasi. sedangkan pada kultur sel,viabilitas sel dapat hilang dengan beberapa kali subkultur.


52/53

Kerugian Kultur Akar Berambut:1. Pembentukan akar berambut tidaklah mudah karenakeberhasilan transformasinya rendah.2. Tidak semua yang dihasilkan oleh kultur akar berambut

adalah metabolit sekunder yang kita inginkan, sehinggahasil metabolit sekunder dari kultur akar berambut tidakdapat dipastikan.3. Rendahnya tingkat keberhasilan transformasi eksplandengan Agrobacterium rhizogenes dan pertumbuhannyayang lambat

4. Sulitnya scaling-up dengan rancang bangun bioreaktor.

Untuk meningkatkan produktivitas kultur akar berambut inidapat dilakukan salah satunya adalah dengan caraelisitasi menggunakan elisitorpada sel tumbuhandengan tujuan untuk menginduksi dan meningkatkanpembentukan metabolit sekunder.


53/53

Gambar 1. Bioreaktor tipeAirlift Reactors. a. regulator voltase,

b.aerator, c. rotameter, d. filter udara, e. kolombioreaktor, f. tutup leher angsa, g. keran pengeluaran.

Documents

Kultur Organ12 STF