LACEN PR – Divisão de Produtos

Microbiologia de Alimentos

Wanda Sikorski Moscalewski

RESOLUÇÃO – RDC nº. 12 (02/01/2001)ANVISA/MS

Regulamento técnico sobre padrões microbiológicos para alimentos.

Ambito de Aplicação:

Alimentos destinados ao consumo humano.

Excluem-se:

A ) produtos alimentícios e toxinas de origem microbiana (micotoxinas) para os quais existem padrões definidos em legislação específica.

B) Matérias – primas alimentares e produtos semi-elaborados identificados com os seguintes dizeres: “inadequados para o consumo humano na forma como se apresentam”

ou

“não destinados para o consumo humanos na forma como se apresentam”

ANEXO I ⇒ PADRÕES MICROBIOLÓGICOS SANTIÁRIOS

Leite pasteurizado – Grupo 8 a.a

ANEXO II ⇒ INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

Definições:

Unidade amostral : porção ou embalagem individual a ser analisada, tomado de forma totalmente aleatória de uma partida como parte da amostra geral.

Amostra indicativa: composta por um número de unidades amostrais inferior ao estabelecido no plano amostral

Amostra representativa: constituída por um determinado número de unidades amostrais estabelecido de acordo com o plano amostral

Situações de aplicação dos planos de amostragem:

Amostra representativa: na avaliação de lotes e ou partidas

Amostra indicativa: Quando nos pontos de venda ou de qualquer forma de exposição ao consumo o lote ou partida do produto estiver fracionado;

Amostra indicativa:

Ou quando o número total de unidades do lote for igual ou inferior a 100 (cem) unidades;

Ou quando o produto estiver a granel.

PLANO DE AMOSTRAGEM

n : número de unidades a serem colhidas aleatoriamente de um mesmo lote e analisadas individualmente.

( exceção: técnica de presença ou ausência)

c = é o número máximo aceitável de unidades de amostras com contagens entre m e M ( plano de três classes).

Nos casos em que o padrão microbiológico seja expresso por “Ausência”, c = 0 (aplica-se plano duas classes).

m = é o limite que , em um plano de três classes, separa o lote aceitável do produto ou o lote com qualidade intermediária

M = é o limite que, em plano de duas classes, separa o produto aceitável do inaceitável.

Em um plano de três classes, separa o lote com qualidade intermediária do lote inaceitável.

Valores acima de M são inaceitáveis.

TIPOS DE PLANOS DE AMOSTRAGEM

A) PLANO DE DUAS CLASSES:

Quando a unidade amostral a ser analisada pode ser classificada como aceitável ou inaceitável, em função do limite designado por M.

É aplicável para limites qualitativos.

B) PLANO DE TRES CLASSES:

Quando a unidade amostral a ser analisada pode ser classificada como:

aceitável,

qualidade intermediária aceitável ou

inaceitável,

em função dos limites m e M, com um limite para c (resultados entre m e M). Nenhuma unidade pode ter resultado > M.

Leite PasteurizadoLeite Pasteurizado

Aus Aus Salmonella Salmonella sp 25 sp 25 mL mL

44Coliformes a 45 º CColiformes a 45 º C mLmL

Tolerância para Tolerância para Amostra IndicativaAmostra Indicativa

MicrorganismoMicrorganismo

Tolerância para amostra Tolerância para amostra representativarepresentativa

--AusênciaAusência0 0 55Salmonella Salmonella sp/ sp/ 25 g25 g

44221155Coliformes a Coliformes a 45ºC45ºC

MMmmccnnMicrorganismoMicrorganismo

Metodologias para amostragem, colheita, acondicionamento, transporte e para análise microbiológica de amostras de produtos alimentícios devem obedecer ao disposto pelo:

Codex Alimentarius;

Ïnternational Comission on Microbiological Specifications for Foods”(ICMSF)

Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods

Standard Methods for the Examination of Dairy Products daAPHA

Bacteriological Analytical Manual of Food and Drug Aministration, editado pela Association of Official Analytical Chemists (FDA/AOAC)

Outras metodologias internacionalmente reconhecidas .

Quando utilizar outros métodos laboratoriais , ou modificações devem ser validados

(estudos comparativos intra e inter laboratoriais) e

registros dos processos de validação devem estar disponíveis.

PROCEDIMENTOS: METODOLOGIA

Amostras devem ser coletadas em suas embalagens originais não violadas, observando a quantidade mínima de 200 g ou 200 mL por unidade amostral.

Alimentos comercialmente estéreis : cada amostra indicativa deve ser composta de no mínimo 3 (três) unidades do mesmo lote, para fins analíticos.

Quando se tratar da aplicação do plano de amostragem estatístico, efetuar a colheita de no mínimo, 3 conjuntos de unidades amostrais.

Obs.:

Dispensa-se a colheita da amostra sempre que o produto estiver alterado e ou deteriorado.

A amostra deve ser enviada ao laboratório devidamente identificada e em condições adequadas para análise, especificando as seguintes informações:

Data, hora da colheita

Temperatura (quando pertinente) no momento da colheita e transporte

Motivo da colheita

Finalidade e tipo de análise

Condições da amostra no ponto da colheita

Outros dados que possam auxiliar as atividades analíticas

No laboratório a amostra é submetida àinspeção para avaliar se apresenta condições para realização da análise microbiológica.

Não deve ser realizada análise, expedindo-se laudo referente àcondição da amostra quando:

•Os dados que acompanham a amostra revelarem que a

mesma, no ponto de colheita, se encontrava em condições

inadequadas de conservação ou acondicionamento;

•Quando a amostra embalada apresentar sinais de violação;

•A amostra apresentar alterações ou deterioração visível;

•Quando a identificação da amostra não cumprir com o

disposto anteriormente.

Exceção :

•casos de DTA para rastreamento de microrganismos patogênicos ou toxina.

•(acompanhamento de relatório adicional)

ANEXO II : INTERPRETAÇÃO

Produtos em condiProdutos em condiçõções sanites sanitáárias satisfatrias satisfatóóriasrias:

Quando os resultado forem iguais ou inferiores aos do anexo I

CONCLUSÃO:

PRODUTO ( A. I. ) OU LOTE (A. R.) DE ACORDO COM OS PADRÕES LEGAIS VIGENTES

Produtos em condições sanitárias insatisfatórias

Quando os resultado forem superiores aos do anexo I

CONCLUSÃO:

PRODUTO ( A. I. ) OU LOTE (A. R.)

IMPRÓPRIA PARA O CONSUMO HUMANO POR APRESENTAR.......

(definir os resultados e parâmetros não atendidos do ANEXO I)

(definir o patógeno ou a toxina que representa perigo severo para o consumo)

MÉTODO UTILIZADO PARA QUANTIFICAÇÃO DE COLIFORMES A 45ºC:

TÉCNICA DA DETERMINAÇÃO DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL (NMP)

TAMBÉM DENOMINADA TÉCNICA DOS TUBOS MÚLTIPLOS.

MÉTODO OFICIAL QUE SE BASEIA EM ESTIMATIVA FUNDAMENTADA EM PROBABILIDADE.

O NMP É UMA ESTIMATIVA DA DENSIDADE DE MICRORGANISMOS VIÁVEIS EM UMA AMOSTRA.

VANTAGEM: PERMITE MELHOR REVITALIZAÇÃO DOS MICRORGANISMOS DEBILITADOS,

A AMOSTRA A SER ANALISADA, APÓS HOMOGENEIZAÇÃO, É SEMEADA EM PELO MENOS TRÊS DILUIÇÕES SERIADAS.

DE CADA UMA DESSAS DILUIÇÕES, ALÍQUOTAS IGUAIS SÃO TRANSFERIDAS PARA 3 TUBOS CONTENDO O MEIO DE CULTURA ESCOLHIDO.

TODOS OS TUBOS SÃO INCUBADOS, A LEITURA É BASEADA NA PRESENÇA DE GÁS (VISUALIZADA EM TUBOS DE DURHAN)

PELO NÚMERO DE TUBOS POSITIVOS POR mL DO PRODUTO, TENDO COMO BASE A TABELA DE HOSKINS PARA 3 TUBOS.

O ARRANJO DE TUBOS POSITIVOS DAS 3 DILUIÇÕES É TRANSPOSTO PARA TABELAS ESTATÍSTICAS, QUE INCLUEM OS LIMITES DE CONFIANÇA DOS NÚMEROS MAIS PROVÁVEIS DE MICRORGANISMOS PESQUISADOS EM FUNÇÃO DA TABELA.

Tabela De NMP com limite de confiança de Tabela De NMP com limite de confiança de 95%(Diluição 1, 0,1 e 0,01 95%(Diluição 1, 0,1 e 0,01 mLmL))

> 480> 480> 15> 15> 110> 11033--33--33

21210,70,74,34,333--11--00

38381,51,56,46,433--00--22

13130,70,73,93,933--00--11

15151,01,02,82,822--22--11

8,98,90,70,72,02,02 2 --11--11

22< 0,05< 0,050,40,411-- 00--00

0,90,9< 0,05< 0,050,30,300--00--11

< 0,9< 0,9< 0,05< 0,05< 0,3< 0,300--00--00

SuperiorSuperiorInferior Inferior NMP /NMP /mLmLCombinação Combinação de positivosde positivos

ConfiançaConfiança95%Limite de 95%Limite de

Fonte: FDA 6 ª Ed.

Significado do NMP de coliformes a 45ºC > 4/ mL

•Produção em condições higiênicas inadequadas ( matéria-prima é fundamental);

•Pasteurização deficiente;

•Indicará contaminação posterior à pasteurização;

•Exposição do produto beneficiado à temperaturas superiores a 10ºC.

PESQUISA DE SALMONELLA SPP:

Método utilizado: presença ou ausência/ 25 mL

Fases:

Pré-enriquecimento

Enriquecimento em caldo seletivo (2)

Plaqueamento seletivo diferencial (2)

Confirmação bioquímica e sorológica

Significado da presença de Salmonella na amostra:

Processamento de pasteurização impróprio ou contaminação pós pasteurização