lactamase

5/11/2018 lactamase - slidepdf.com

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O câncer colorretal é o terceiro câncer mais comum em homens emulheres nos Estados Unidos hoje. American Cancer Societyprojeções para 2008 estimam que 150 mil casos de câncer colorretalirá ocorrer, levando a vida de aproximadamente um terço daquelesdiagnosticados. Estratégias para melhor combater o câncer colo-retal

seria de grande benefício na redução da taxa de mortalidade destadoença.

Metodologia atual usando entrega de drogas específicas por meio deanticorpos (ADEPT) ou gene-dirigido pró-droga terapia (GDEPT) écapaz de ativar a pró-fármacos especificamente em locations.1precisos, 2 O benefício de uma estratégia ADEPT ou GDEPT é que asconcentrações elevada do agente quimioterapêutico desejado podemser entregues diretamente para as células infectadas, evitando sualiberação em regiões benigna.

Esta estratégia é representado na literatura por meio do uso de um b-lactamase (BL) para ativar b-lactâmicos pró-fármacos com base,visando especificamente a infecção ou doença.3-5 Uma classe b-lactâmicos particular, as cefalosporinas, têm-se revelado muitorepórter útil de sinalização, e antibacteriano compostos que sãocapazes de permanecer dormente até que a ativação por um (Fig. 1)bL 0,6-9 Muitos compostos quimioterápicos utilizando o andaimecephem têm sido relatados, incluindo: mitomicina C, 4 mostardas denitrogênio, 3,10 - 13 doxarubacin, 14,15 compostos de platina, 16taxol5 e um derivado da vimblastina alcalóide da vinca. 17

Estes compostos foram testados in vivo e mostrar atividadepromissora contra o câncer de várias linhas quando usado emconjunto com uma estratégia de ADEPT. Embora muitos dosconjugados pró-fármaco acima mencionados foram avaliados in vivo,a FDA aprovou medicamentos comuns para o câncer colorretal, 5-fluorouracil (5-FU), não foi avaliada de forma análoga. 5-fluorouracil éum componente principal do usado atualmente câncer colorretalterapia regime FOLFOX, juntamente com oxaliplatina e folínicoCapacidade acid.18 especificamente para oferecer 5-fluorouracil para

as células cancerosas fornece proteção para as regiões benigna aoalvejar as concentrações de medicamentos para as áreas depreocupação. Seria um benefício para criar um simples, a síntesedireta de um pró-fármaco cefalosporina-5-fluorouracil, que podementão ser avaliada in vivo. Descrevemos aqui uma síntese fácil de umpró-fármaco cefalosporina-5-fluorouracil, que mostra estabilidade emambientes aquosos até que seja ativado por uma b-lactamase.

A fim de criar um conjugado 5-FU-cefalosporina, foi de fundamentalimportância para determinar a maneira pela qual 5-FU poderia ser

anexado à posição 30 da cefalosporina. Mais frequentemente do quenão a droga de escolha está ligada ao carbono 30 pelo uso de um

linker carbonato ou carbamato que se decompõe em expulsão do pró-



droga para produzir o composto desejado livre. Em alguns casos, ocomposto pode ser ligado diretamente à posição 30 através de umareação de deslocamento entre um grupo de 30 e deixando umnucleófilo adequado. Com os dois meios de ligação que são iguais, ofator decisivo foi a disponibilidade de um material comercial de

partida que levou à rota mais direta sintéticos. 7-Amino-3-chlormethyl-3-cephem-4-carboxílico p-methoxybenzyl éster (3) foiselecionado como um material de partida adequado (Otsuka, Osaka Japão).

Cephem 3, desde um núcleo que poderia ser modificado para o pró-fármaco desejado (Esquema 1). Este material de partida foi passíveisde penhora direta de 5-FU via deslocamento do cloreto de 30 com 5-FU. Tratamento de 3 com 2-tiofeno cloreto de acetil e 2,6 lutidina-proporcionaram o intermediário em quatro yield.8 excelente, 19 com

o composto 4 em mãos era desejado em seguida, anexar 5-FU. Istoprovou ser mais difícil do que se pensava inicialmente. Figura 1 e Esquema A principal dificuldade com o uso de 5-FU em reações orgânicas é suainsolubilidade relativa em todos os solventes orgânicos comuns. Alémde sua baixa solubilidade, foi motivo de preocupação que ambas asamida e imida posições poderiam atuar como nucleófilo, dandoorigem a regioisômeros. Para superar essas duas restrições, a

proteção do nitrogênio amida com t-butil carbamato (Boc) foiperformed.20, 21 A proteção Boc aumentou 5 - solubilidade FU aomesmo tempo, limitar a imida funcionar como o nucleófilo único. Comos compostos 2 e 4 na mão, de acoplamento direto para a posição 30foi tentada. Foi observado que quando se utiliza carbonato e basesamina terciária, bem como piridina, isomerização parcial do núcleocephem ocorreu produzindo uma mistura de isômeros D2 eD3. Formação do isômero D2 inativa do composto, tendo o nitrogêniodo b-lactâmicos de conjugação com a posição 30, bloqueando assim aliberação do composto anexado na ativação bL. Uma solução comum

para este problema é a oxidação do enxofre cephem para restaurar oisômero D3 ativa, seguido pela redução de volta para otioéter. Oxidação do composto 5 contendo uma mistura de isômerosD2 e D3 foi presumido para restaurar conjugation.22 Observou-se, noentanto, que a oxidação do enxofre ponte não foi possível, tal comooutros sistemas relacionados, fornecendo nenhum traço do sulfóxidocomo um produto .

Pode-se racionalizar este observando que o cephem contém um anelmuito enrugada em que a porção 5-FU poderia bloquear abordagemdo oxidante, resultando em nenhuma reação. Neste ponto, qualquerapego da fracção 5-FU necessários para fornecer um isômero únicodevido à incapacidade da seqüência de oxidação / redução para



restaurar a conjugação necessária. Um relatório anterior haviamostrado que silanoate trimetil potássio (KOSiMe3) poderia ser usadopara executar a reação acilação produzindo 4 sem formação doisômero D2.

23 De fato, o uso de KOSiMe3 como a base estequiométrica naformação do composto 5, desde que o isômero D3 em yield.24 bomFoi então possível para desproteção ácidas de ambas as metades eBoc pmethoxybenzyl de 5 fornecendo o composto final em yield.25alta O uso de KOSiMe3 na reação de deslocamento diretoproporcionado uma rota fácil para o 6 desejado em 3 etapaslinear. Esta rota para cephem derivados evita a seqüência deoxidação / redução que tradicionalmente tem dominado em síntesesde semelhante compostos.

Estratégias e ADEPT GDEPT para combater a doença têm a distintavantagem de que o pró-fármaco é ativada especificamente em áreasde infecção benigna enquanto as regiões são deixados relativamenteintocado. Para qualquer estratégia ou ADEPT GDPET para ser bemsucedido, o pró-fármaco deve primeiro ser estável sob condições não-ativação, mas rapidamente ativadas nas condições desejadas. Nocaso de 6 isso equivaleria ao composto adormecidos até influenciadopor uma bL. Além da ativação específica por bL, é importante verificarse 6 é um bom substrato para bL pela avaliação dos seusfundamentais parâmetros cinéticos. Composto 6 foi preparado emsolução estoque 10 mg / mL e posteriormente diluído para todos osexperimentos in vitro. Para primeiro verificar se o composto pode serespecificamente ativados somente na presença de um bL, um ensaiode HPLC foi pré-formada.

O pró-fármaco substrato 26 6 foi incubado em tampão fosfato (50mM, pH 7,0) por 12 horas a 28 _C sob condições de ativação e não-ativação. Os resultados mostram que 6, na presença de bL, foicompletamente clivadas a 5-FU e as cefalosporinas hidrolisadoenquanto 6 era de outra maneira estável na ausência de bL (Fig. 2). Figura 2 Para avaliar melhor o quão eficiente é um substrato para a 6 bLacima, os parâmetros cinéticos foram medidos usando um ensaioanteriormente described.13 Determinou-se que tinha um compostode seis molhabilidade molar (e) de 9640 lmol_1 cm_1, o quepossibilitou monitoramento de b-lactâmicos hidrólise a 267nm. Composto 6 foi avaliado em relação ao disponívelcomercialmente Enterobacter cloacae b-lactamase (EClbL) (Sigma, St.Louis, MO). Velocidades iniciais foram medidos em concentrações

variando de 6 (LM 25-250) e ajuste para a equação de Michaelis-Menton para estabelecer Km e Vmax.Composto 6 foi encontrado para



ter um quilômetro de 95,4 lm e uma Vmax de 3,21 lmol min_1 mg_1,que comparam favoravelmente ao relatado anteriormentecefalosporina conjugates.3, 4,13 Para determinar o rendimento de 5-FU quando 6 é ativado, uma reação de 6 com o EClbL foi executadoem condições idênticas às do ensaio de estabilidade anterior. Os

produtos desta reação foram comparados a uma curva padrão deconcentrações conhecidas de 5-FU para determinar o percentual de5-FU lançado usando o HPLC previamente estabelecidos method.26Foi determinado que compõem 6 é ativado para 5-FU em um 78 ± 2%de rendimento.

Os dados combinados mostram que compostos 6 é um bom substratopara um bL, a ativação ocorre de uma maneira eficiente e compostos6 é estável em um ambiente aquosa neutra, até que seja ativado pelobL (Fig. 2).

Nós projetamos uma síntese direta de uma BL-ativável 5-FU-cefalosporina conjugado para liberar o agente citotóxico 5-FU. Preparação deste composto foi facilmente alcançado através deuma atenção especial a dois passos-chave na síntese. A proteção donitrogênio amida 5-FU com um grupo Boc melhorada solubilidade emsolventes orgânicos e evitar a formação de regioisômeros. Segundo, ouso de KOSiMe3 na cephem 30 cloreto de reação de deslocamentotranscorreu sem formação do isômero D2, contornando a oxidaçãohabitual ea seqüência de redução de enxofre no cephem pararestaurar o vínculo D3 dupla. O uso de KOSiMe3 oferece umaabordagem geral para a fixação de metades química nucleofílica nocarbono 30, mantendo o cephem D3 intacta.

A estabilidade do composto 6 na ausência de um bL e sua favoráveisparâmetros cinéticos para a hidrólise na sua presença demonstrar opotencial de compostos de 6 a ser utilizada em estratégias ADEPT ouGDEPT contra uma série de linhas de células humanas de carcinoma,e abrir o caminho para a sua avaliação, in vivo.

Agradecimentos

Agradecemos uma doação de sementes do Instituto para ananobiotecnologia na Universidade Johns Hopkins de apoiofinanceiro. Otsuka Chemical Corporation (Osaka, Japão) é agradeceu adoação de uma amostra de 7-amino-3-clorometil-3-cephem-4-carboxílico p-metóxi-benzil ester. Agradecemos a T. Soka paradiscussões úteis na preparação para o vivo em aplicações doconjugado.

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