LANA KARINE D’ANDRADE SANTANAnbcgib.uesc.br/genetica/admin/images/files/DISSERTAÇÃO LANA 3 V… · LANA KARINE D’ANDRADE SANTANA MONITORAMENTO DE BACTÉRIAS LÁTICAS POR DGGE

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA

MOLECULAR

MONITORAMENTO DE BACTÉRIAS LÁTICAS POR DGGE DURANTE A

FERMENTAÇÃO DE CACAU NO SUL DA BAHIA

LANA KARINE D’ANDRADE SANTANA

ILHÉUS- BAHIA- BRASIL

Maio de 2008

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ILHÉUS- BAHIA- BRASIL

Maio de 2008

Dissertação apresentada à Universidade

estadual de Santa Cruz para obtenção do título

de mestre em Genética e Biologia Molecular.

Área de concentração: Genética e

Biotecnologia.

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Data da defesa: 30 de maio de 2008

______________________________________

Profa. Ana Paula Trovatte Uetanabaro UEFS- BA

__________________________________________ Prof. João Luciano Andrioli

UESC/DCB

__________________________________________

Prof. Julio Cezar de Mattos Cascardo UESC/DCB

__________________________________________ Profa. Rachel Passos Rezende

UESC/DCB

Dissertação apresentada à Universidade

estadual de Santa Cruz para obtenção do título

de mestre em Genética e Biologia Molecular.

Área de concentração: Genética e

Biotecnologia.

http://dgp.cnpq.br/buscaoperacional/detalhepesq.jsp?pesq=8814785068757523

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DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho aos meus pais que participam ativamente, como

grandes amigos, de todas as etapas da minha vida.

v

AGRADECIMENTOS

Finalizar uma jornada é sempre um passo muito difícil! Felizmente encontrei por

todo o meu caminho sustentáculos que formaram uma base para vencer mais uma etapa da

minha vida. Agradeço aos meus pais por investirem e acreditarem em mim, nunca

poupando apoio emocional ou financeiro para realização dos meus sonhos, muitas vezes

renunciando dias e noites para estar comigo nos momentos mais difíceis. Amo meus pais.

Minha eterna gratidão!!!

Agradeço a Rachel pela orientação e pela oportunidade de conviver com uma

pessoa de extrema competência que certamente influenciou muito no meu amadurecimento.

Ajudou-me em todas as etapas do trabalho, dando-me condições para fazer acontecer os

experimentos e ao mesmo tempo me incentivando expandir os meus horizontes. Rachel é

uma pessoa na qual eu enxergava desde inicio da minha vida cientifica como referencial, o

ponto onde eu olhava para querer seguir como pesquisadora. Agradeço ao João por todo

apoio, paciência, atenção, pelas dicas e por muitas vezes por me deixar doida com tanto

conhecimento e idéias, típicas das pessoas geniais (isso me fez estudar muito mais!). Sinto-

me honrada por ter tido o João com co-orientador.

Agradeço aos meus amigos e colegas do laboratório do monitoramento ambiental,

que fizerem da pesquisa algo prazeroso e do ambiente de trabalho uma grande família.

Agradeço em especial ao Ronaldo, a Aninha, ao Eduardo, Dudu e Lizzi que mais que

companheiros de bancada, estiveram presentes em etapas cruciais do meu crescimento

profissional, discutindo novas metodologias, torcendo para que tudo desse certo e vibrando

por cada nova conquista. Guardarei cada rosto de toda essa equipe no coração, foram

certamente momentos maravilhosos e inesquecíveis.

vi

Agradeço aos amigos do laboratório de citogenética, genética molecular, cultura de

tecidos e microbiologia.

Aos tios da minha amiga e colega Adriana, Senhor Rosenilton e Senhora Tereza,

que administram a fazenda São Jorge, onde foi realizada a coleta do experimento, e nunca

mediram esforços para que a minha pesquisa acontecesse. Nunca vi tanta generosidade em

um casal!!!

A coordenação do programa de Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular

pela oportunidade de realização do mestrado, pelo aprendizado em geral, ressaltando a

grande competência do mesmo na busca de melhorias para o curso. Um agradecimento

especial a Luciana (coordenação) e a professora Fernanda Amatto Gaiotto.

Agradeço aos professores do programa pela ajuda, mesmo fora dos horários do

curso, se dispondo a discutir, sanando qualquer duvida.

A toda a equipe da GERLAB e aos meus amados amigos do programa (seria injusto

citar nomes), pois foram muitos momentos de alegrias e de tristezas sempre juntos. Pelo

convívio em geral, meu mais sincero agradecimento.

Em fim, a todos que participaram de forma direta ou indireta da minha jornada, um

grande abraço.

vii



SANTANA, Lana Karine D’Andrade, Monitoramento de bactérias láticas por DGGE

durante a fermentação de cacau no sul da Bahia. ((DDiisssseerrttaaççããoo ddee MMeessttrraaddoo)).. MMeessttrraaddoo

eemm GGeennééttiiccaa ee BBiioollooggiiaa MMoolleeccuullaarr,, UUEESSCC,, IIllhhééuuss--BBAA,, 22000088..

EXTRATO

A fermentação do cacau é realizada por uma comunidade microbiana complexa,

apresentando em toda sua duração intensas reações bioquímicas que determinam

à qualidade das amêndoas e flavour do chocolate. Assim, a fermentação ocorre de

forma dinâmica e apresenta como característica a sucessão microbiana com

formação de diferentes metabólitos. Nas primeiras 36 horas de fermentação do

cacau é predominante à presença de leveduras, posteriormente ocorre o

desenvolvimento de outros organismos como os lactobacilos, bactérias acéticas e

fungos filamentosos. Objetivou-se com esse trabalho o monitoramento da

comunidade de bactérias láticas durante o processo de fermentação do cacau por

meio da técnica de PCR-DGGE. Para isso foi necessário padronizar a extração de

DNA total das amostras com metodologia simples e adaptações nas técnicas de

PCR e DGGE. O uso de técnicas moleculares foi proposto para este estudo,

visando alcançar maior espectro da comunidade de bactérias láticas, uma vez que

uma parte muito pequena dos microrganismos pode ser analisada usando apenas

técnicas microbiológicas tradicionais. O experimento teve as amostras coletadas

na fazenda São Jorge, localizada na rodovia Ilhéus - Uruçuca entre 3 e 8 de

agosto de 2007. Os intervalos entre os tempos de coleta foram de 12 horas,

totalizando 11 amostras. Durante a coleta a temperatura e pH foram aferidos

indicando a relação desses indicadores com a comunidade de bactérias láticas.

Após cada coleta as amostras foram despolpadas e parte enriquecida com caldo

MRS lactobacilos. A diversidade genética foi determinada por meio do perfil de

bandas no gel de DGGE dos produtos amplificados com dois conjuntos de

viii

iniciadores, Lac 1- Lac 2 e Lac 2-Lac 3. O protocolo selecionado para extração de

DNA, com uso de sonicação, choque térmico e extração com fenol- clorofórmio-

álcool- isoamílico (25:24:1), mostrou- se eficiente para as amostras trabalhadas,

sendo o mais rápido, simples e barato dentre os protocolos testados. Todas as

amostras amplificaram para ambos os conjuntos de iniciadores, demonstrando a

presença de bactérias láticas durante todo o processo fermentativo. As amostras

amplificadas por Lac 2–Lac 3, necessitaram de tratamentos especiais, uma vez

que a quantidade de DNA quantificado apresentou-se baixa para as amostras de 0

a 96 horas, apresentando boa amplificação nos dois últimos tempos. Dessa forma

foi necessária uma reamplificação para garantir um melhor resultado. Os

resultados dos géis de DGGE foram avaliados por meio da análise de similaridade

de Dice que demonstrou maior proximidade entre os organismos das primeiras 72

horas, que formam um primeiro grupo, chegando a 85% de similaridade. Um

segundo grupo formado com as horas finais de fermentação possui similaridade

de 65%, sendo que a similaridade entre um grupo e outro é superior a 40% para

todos os iniciadores utilizados, bem como o tipo de amostra (enriquecida ou não).

Palavras chaves: Fermentação, cacau, bactérias láticas, DGGE.

ix

MONITORING OF LACTIC BACTERIA BY DGGE DURING FERMENTAÇÃO OF

COCOA IN SOUTHERN BAHIA

EXTRACT

The fermentation of cocoa is done by a complex community, showing intense

biochemical reactions that determine beans quality and chocolate flavour. The

fermentation is dynamic and presents a microbial succession with the formation of

different training. In the first 36 hours yeasts are predominant, subsequently occurs

the development of other microorganisms such as acid lactic bacteria, acetic

bacteria and filamentous fungi. The objective of this work was monitor the

community of acid lactic bacteria during fermentation of cocoa through PCR-

DGGE. The extraction of DNA total of the samples was standardized with use of

simple methodology and adjustments was done in the techniques of PCR and

DGGE. The use of molecular techniques has been proposed in this study, aimed at

achieving greater spectrum of the community of lactic acid bacteria, since a small

part of microorganisms can be analysed using traditional microbiological

techniques. Samples were collected in São Jorge farm, located in Rodovia Ilhéus -

Uruçuca. The intervals between sampling were 12 hours, up to 11 samples. The

temperature and pH were measured, indicating the relationship of these indicators

with the community of lactic acid bacteria. After each collecting the samples were

processed and part enriched with MRS lactobacilli media. The diversity was

determined by profile of bands reveled by DGGE witch DNA was amplified with two

sets of primers, Lac 1-Lac 2 and Lac 2-Lac 3. For DNA extraction it was used

sonication, thermal shock and extraction with phenol-chloroform-isoamoilic alcohol

(25:24:1). This protocol was effective for the samples worked, and faster, simpler

and cheaper than protocols tested. All samples amplified for both sets of primers,

showing the presence of acid lactic bacteria throughout the fermentation process.

The samples amplified by Lac 2-Lac 3, required special treatment, since the

amount of DNA quantified was low for the samples from 0 to 96 hours being

necessary a new amplification to achieve a better result. The results of DGGE gels

x

were evaluated by analyzing similarity of Dice that showed greater proximity

between the microorganisms of the first 72 hours, which form the first group,

reaching 85% of similarity. A second group formed in the last hours of fermentation

has similarity of 65%, and the similarity between one group and another is over

40%, considering all the primers used in all types of samples (enriched or not).

Key words: Fermentation, cocoa, lactic acid bacteria, DGGE.

xi

LISTA DE FIGURAS

1. Diagrama da Fermentação lática..................................................................5

2. Fermentação heterolática na qual a oxidação da glicose 6 fosfato a 6

fosfogliconato (que descarboxilado) gera uma pentose fosfato, clivada pela

enzima fosfocetolase, originando triose fosfato e acetilfosfato. A triose

fosfato é convertida a ácido lático enquanto o acetilfosfato recebe os

elétrons do NADH gerado durante a produção de pentose fosfato, sendo

então convertido a etanol sem a produção de ATP......................................5

3. Modelo da estrutura secundária do 16s rRNA de Escherichia coli..............13

4. Cochos de fermentação de cacau: visão superior com divisórias montadas;

visão lateral; visão superior com divisórias parcialmente removidas...........15

5. Seqüência de preparação do gel de DGGE: preparação da cuba,

montagem, lavagem dos poços do gel, aplicação da amostra e corrida em

tampão TAE 1% a temperatura constante de 60°C.....................................18

6. Variação de pH durante no cocho de fermentação durante coleta realizada

nos cochos de fermentação da Fazenda São Jorge....................................19

7. Variação de temperatura da massa de cacau durante a fermentação em

cocho na fazenda São Jorge.......................................................................20

8. Eletroforese em gel de agarose dos produtos de PCR de amostras de polpa

de cacau. Foram utilizados os primers Lac 1 e 2 para as amostras direto da

polpa. A seqüência indicada no gel é formada por (M) marcador molecular

GeneRuler 1Kb DNA Ladder Plus ; (C-) Controle negativo; tempo de coletas

em horas (0; 12; 24; 48; 60; 72; 84; 96; 108; 120; 132)...............................21

xii


de cacau. Foram utilizados os primers Lac 1 e 2 para as amostras

enriquecidas com caldo MRS. A seqüência indicada no gel é formada por

(M) marcador molecular GeneRuler 1Kb DNA Ladder Plus ; (C-) Controle

negativo; tempo de coletas em horas (0; 12; 24; 48; 60; 72; 84; 96; 108;

120; 132).....................................................................................................22


de cacau. Foram utilizados os primers Lac 2 e 3 para as amostras direto da

polpa. A seqüência indicada no gel é formada por (M) marcador molecular


em horas (0; 12; 24; 48; 60; 72; 84; 96; 108; 120; 132)..............................22

11. : Eletroforese em gel de agarose dos produtos de PCR de amostras de

polpa de cacau. Foram utilizados os primers Lac 2 e 3 para as amostras

enriquecidas com caldo MRS. A seqüência indicada no gel é formada por

(M) marcador molecular GeneRuler 1Kb DNA Ladder Plus ; (C-) Controle

negativo; tempo de coletas em horas (0; 12; 24; 48; 60; 72; 84; 96; 108;

120; 132)....................................................................................................23

12. Eletroforese em gel de agarose dos produtos de PCR de amostras de DNA

de polpa de cacau. Foram utilizados os primers Lac 2 e 3 para as amostras

direto da polpa após realização da reamplificação (“Pull de DNA”). A

seqüência indicada no gel é formada por (M) marcador molecular


em horas (0; 12; 24; 48; 60; 72; 84; 96; 108; 120; 132)..............................24


de cacau. Re- amplificação do“Pull de DNA”, realizado com primers Lac 3 e

2 para amostras diretas da polpa. A seqüência indicada no gel é formada

por (M) marcador molecular GeneRuler 1Kb DNA Ladder Plus ; (C-)

Controle negativo; tempo de coletas em horas (0; 12; 24; 48; 60; 72; 84; 96;

108; 120; 132 e a repetição da amostra 24 horas)......................................24

xiii

14. Dinâmica da população de bactérias láticas na fermentação do cacau

através da técnica de DGGE com gradiente 20- 70%, utilizando produtos de

PCR realizados com primers Lac 1 e 2 para amostras obtidas diretamente

da polpa. A seqüência indicada no gel é formada por tempo de coletas em

horas (0; 12; 24; 48; 60; 72; 84; 96; 108; 120; 132). Os traços vermelhos

demonstram como foi realizada a contagem manual de bandas................25



PCR realizados com primers Lac 1 e 2 para amostras obtidas após

enriquecimento. A seqüência indicada no gel é formada por tempo de

coletas em horas (0; 12; 24; 48; 60; 72; 84; 96; 108; 120; 132)..................26



PCR realizados com primers Lac 2 e 3 para amostras obtidas direta da

polpa. A seqüência indicada no gel é formada por tempo de coletas em

horas (0; 12; 24; 48; 60; 72; 84; 96; 108; 120; 132)...................................26


através da técnica de DGGE com gradiente 35- 60%, utilizando 40 μL do

produto de PCR realizado com primers Lac 2 e 3 para amostras

enriquecidas. A seqüência indicada no gel é formada por tempo de coletas

em horas (0; 12; 24; 48; 60; 72; 84; 96; 108; 120; 132).............................27



PCR da re- amplificação do“Pull” de DNA realizados com primers Lac 2 e 3

para amostras diretas da polpa. A seqüência indicada no gel é formada por

tempo de coletas em horas (0; 12; 24; 48; 60; 72; 84; 96; 108; 120;

132)............................................................................................................27

xiv

19. Análise de similaridade da população de bactérias láticas na fermentação

do cacau através da correlação de Dice, utilizando produtos de PCR

realizados com primers Lac 1 e 2 para amostras obtidas diretamente da

polpa............................................................................................................29



realizados com primers Lac 1 e 2 para amostras obtidas após

enriquecimento da polpa..............................................................................30




enriquecimento da polpa.............................................................................30




enriquecimento da polpa.............................................................................31



realizados com primers Lac 3 e 2 para amostras obtidas diretamente da

polpa após re-amplificação..........................................................................32

xv

LISTA DE TABELAS

1. Principais tratamentos e suas funções na extração do DNA microbiano total

para analise da diversidade microbiana (Maciel, 2004)................................7

2. Síntese da correlação de Dice demonstrando a divisão dos grupos...........28

3. Síntese da correlação de Dice demonstrando a similaridade dos grupos...29

xvi

SUMÁRIO

EXTRATO ............................................................................................................vii

EXTRACT..............................................................................................................ix

1. INTRODUÇÃO...................................................................................................1

2. REVISÃO DE LITERATURA.............................................................................3

2.1. Fermentação do cacau..............................................................................3

2.2. Bactérias láticas e fermentação.................................................................4

2.3. Estudos moleculares..................................................................................6

2.4. DGGE.......................................................................................................10

3. MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................. ..14

3.1. Coleta.......................................................................................................14

3.2. Medida de temperatura e pH....................................................................15

3.3. Extração de DNA......................................................................................15

3.4. PCR (Reação em Cadeia da Polimerase)............................................ ..16

3.5. DGGE (Eletroforese em gel com gradiente de desnaturação)............... .17

3.6. Analise de similaridade dos fragmentos de DNA no gel de

poliacrilamida..................................................................................................18

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO.......................................................................18

4.1. pH e temperatura.....................................................................................18

4.2. Extração de DNA e amplificação.............................................................20

4.3. DGGE......................................................................................................23

4.4. Correlação de Dice..................................................................................28

5. CONCLUSÕES................................................................................................33

6. REFÊRENCIAS BIBLIOGRÁFICAS...............................................................34

1

1. INTRODUÇÃO

Os frutos de cacau contêm de 30 a 40 amêndoas que, quando maduras,

são cobertas por uma polpa mucilaginosa com alto teor de glicose, representando

um meio ácido, rico e altamente seletivo para certas linhagens de leveduras,

bactérias acéticas e láticas, bacilos, fungos filamentosos e bactérias formadoras

de esporos. Quando o fruto é aberto, a polpa que recobre a semente é

contaminada naturalmente por microrganismos provenientes principalmente, de

insetos, das mãos de trabalhadores, facas e das paredes dos cochos

contaminados por outras fermentações de cacau. As principais fermentações

ocorridas no processo fermentativo do cacau são: a fermentação alcoólica,

seguida pela fermentação lática e acética, sendo realizadas por leveduras,

bactérias láticas e acéticas respectivamente.

A fermentação lática utiliza açúcares como substrato na produção de ácido

lático, como as demais fermentações ocorrem durante todo o processo, tendo

maior representatividade após 36 horas. Os produtos das fermentações fazem

com que ocorram alterações bioquímicas e morfológicas nas amêndoas de cacau,

tais alterações são responsáveis pela boa qualidade do produto. Uma amêndoa de

cacau bem fermentada exibe no final do processo, coloração marrom ou

parcialmente marrom, observadas em cotilédones bem segmentados. O cacau

fermentado perde a polpa, diminui o amargor e adstringência após torrefação e

auxilia na obtenção do sabor e aroma característico do chocolate. As amêndoas

2

que apresentam casca fortemente aderida aos cotilédones, cor acinzentada e

estrutura compacta indicam uma má fermentação e é classificada como “ardósia”.

Durante a fermentação das amêndoas ocorre a produção de ácidos, álcoois

e enzimas como proteinases, pectinases e estereases, que penetram nas

amêndoas e dão início ao processo de formação do flavour. De acordo com os

padrões de diversidade metabólica e de sucessão microbiana, a fermentação do

cacau pode ser considerada uma comunidade microbiana complexa.

Estas comunidades microbianas têm sido estudadas com objetivos

estruturais e funcionais. No entanto, técnicas de microbiologia tradicionais são

insuficientes para estes estudos por subestimarem a grande diversidade

microbiana e por não mimetizarem as condições ambientais para isolamento de

certos grupos microbianos. Para estes estudos serem mais fidedignos, técnicas

moleculares são atualmente muito utilizadas. Algumas técnicas podem ser usadas

para avaliar a diversidade microbiana pelo uso de seqüências do gene que

codifica o RNAr (DNAr) a partir de amostras ambientais, porém o uso destas só se

fez presente com a reação em cadeia da polimerase (PCR), que revolucionou a

genética molecular por permitir a rápida clonagem e a análise do DNA.

O DGGE (Eletroforese em gel com gradiente de desnaturação) é uma

técnica molecular atualmente muito utilizada no estudo da diversidade. A técnica

promove a desnaturação de fragmentos de DNAr, amplificados por PCR, em gel

de poliacrilamida contendo um gradiente linear de uréia e formamida, e permite

observar a diversidade das populações microbianas, inferindo que a quantidade

de bandas visualizada no gel corresponde ao número de espécies que constituem

as populações. As seqüências podem ser amplificadas a partir de um gene, ou

parte deste, utilizando-se primers gene-específico ou táxon-específico para um

grupo, ou grupos, de microrganismos de interesse. O uso do DGGE vem sendo

disseminado nos últimos anos, demonstrando seu valor não apenas na

caracterização de comunidades complexas, como também para inferir afiliação

filogenética dos membros da comunidade, testar pureza de linhagens, monitorar o

3

isolamento de bactérias a partir de amostras ambientais e estudar a dinâmica de

populações específicas em função de variações ambientais ou das condições

operacionais de um sistema. O presente estudo objetivou a utilização da técnica

de DGGE na investigação de genes ribossomais de microrganismos que realizam

fermentação lática em cacau.

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1. A Fermentação do cacau

O cacaueiro cientificamente conhecido como Theobroma cacao é

comercialmente a principal dentre as 22 espécies do gênero (NAKAYAMA et al.,

1996; SODRE, 2007). Cada fruto de cacau contém de 30 a 40 amêndoas que são

cobertas por uma polpa mucilaginosa branca, ácida, rica em carboidratos, acido

cítrico e pectina (NIELSEN et al., 2005; SCHUWAN, 1998; SCHUWAN e

WHEALS, 2004; ARDHANA e FLEET, 2003; GALVÉZ et al., 2007). As amêndoas

após beneficiadas irão compor o principal componente na fabricação de derivados

e subprodutos do cacau, como o chocolate, podendo também ser transformado

em cosméticos, bebidas finas, geléias, sorvetes e sucos (NAKAYAMA et al., 1996;

SANCHEZ et al., 1985). A boa qualidade das amêndoas depende principalmente

da fermentação que é a principal etapa de beneficiamento do cacau. A microbiota

envolvida, bem como o tempo de fermentação são essenciais para o

desenvolvimento dos precursores do flavour (SAMAH et al., 1993).

Após a colheita os frutos de cacau são quebrados e suas amêndoas são

transportadas e depositadas em locais de fermentação que podem ser

principalmente caixas, bandejas ou pequenos cestos, variando de acordo a região

produtora (NIELSEN et al., 2005; LEHRIAN e PETTERSON, 1983). A

contaminação da massa do cacau ocorre por uma ampla variedade de

microrganismos, provenientes das mãos de trabalhadores rurais, dos cestos

utilizados no transporte, do ar, de ferramentas dos operários, do cocho de

4

fermentação contaminado por fermentações anteriores (JESPERSEN et al., 2004;

NIELSEN et al., 2005) e insetos como formiga e Drosophila (GILBERT, 1980). No

Brasil as amêndoas são fermentadas em caixas de madeira (cochos),

apresentando duração media de 6 dias, sendo submetido periodicamente à

aeração por revolvimento da massa (SCHUWAN et al., 1995). Durante o processo

fermentativo a massa de cacau se encontra em alta atividade microbiana. Na

polpa mucilaginosa são produzidos principalmente álcoois e ácidos em complexas

reações bioquímicas que acabam por difundir os produtos microbianos através

dos cotilédones (SCHUWAN, 1998). Na fermentação da massa ocorre uma

sucessão iniciada predominantemente por leveduras, seguidas de bactérias do

acido lático, bactérias acéticas, Bacillus spp, finalizando com uma população de

fungos filamentosos (ROELOFSEN, 1958; SCHUWAN et al., 1995; ARDANA e

FLEET, 2003; SCHUWAN e WHEALS, 2004; NIELSEN et al., 2005; SCHUWAN,

1998).

No início da fermentação existe uma alta concentração de açúcar e baixo

pH, sendo a microbiota característica de leveduras que convertem a glicose,

frutose e sacarose em etanol. A polpa sofre ação de enzimas pectinolíticas,

liquefazendo-se, e é possível a assimilação de ácido cítrico. Com a diminuição da

viscosidade da polpa e produção de etanol somada ao processo de aeração, o pH

acaba por diminuir, favorecendo o desenvolvimento de bactérias láticas e mais

tarde de bactérias acéticas (NIELSEN et al., 2005; SCHUWAN, 1998).

2.2. Bactérias láticas e Fermentação

As bactérias láticas produzem ácido lático como principal ou único produto

de fermentação (CAMU et al., 2007; CARIONI et al., 2001). Estes são

microrganismos quimiorganotróficos, Gram positivos em forma de bacilos ou

cocos, anaeróbios aerotolerantes, não esporulados e que usualmente não

apresentam motilidade. São representadas por um grupo extenso de organismos,

os quais têm os Lactobacillus e os Streptococcus como os gêneros mais

5

conhecidos (HOLZAPFEL, 2001). Uma importante diferença entre os subgrupos

está relacionada à natureza dos produtos gerados na fermentação. Os

homofermentativos (Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus, Enterococcus,

Lactococcus) geram o ácido lático como produto de fermentação (Figura 1). Os

heterofermentativos (Leuconostoc, Lactobacillus) geram lactato, etanol e CO2

(MADIGAN et al., 2000; EVEN et al., 2001) e são desprovidos da enzima aldolase,

não sendo capazes de clivar a frutose bifosfato em triose fosfato (DRAGONE et

al., 2007). A figura 2 demonstra o esquema da fermentação heterolática.

(http://www.textbookofbacteriology.net/metabolism.html)

Figura 1- Diagrama da Fermentação lática na qual ocorre a clivagem da frutose-

1,6-difosfato pela enzima aldolase, formando duas triose-fosfato, que são

convertidas em lactato via piruvato.

http://www.textbookofbacteriology.net/metabolism.html

6

Figura 2 - Fermentação heterolática na qual a oxidação da glicose 6 fosfato a 6

fosfogliconato (que descarboxilado) gera uma pentose fosfato, clivada pela enzima

fosfocetolase, originando triose fosfato e acetilfosfato. A triose fosfato é convertida

a ácido lático enquanto o acetilfosfato recebe os elétrons do NADH gerado

(http://www.textbookofbacteriology.net/metabolism.html)

http://www.textbookofbacteriology.net/metabolism.html

7

durante a produção de pentose fosfato, sendo então convertido a etanol sem a

produção de ATP.

Na fermentação do cacau o grupo das bactérias láticas apresenta pico de

crescimento entre 18 e 48h (ROELOFSEN, 1958; ARDHANA e FLEET, 2003).

Sua importância nesse processo esta no fato de que tal grupo de bactérias é

capaz de provocar a redução do pH, inibindo a ação de outros microrganismos e

promove a desnaturação de proteínas (CARIONI et al., 2001). A ação das

bactérias láticas na fermentação do cacau resulta na expulsão da água, que é a

principal responsável pela modificação na textura das amêndoas e na obtenção

dos precursores do flavour característico (CARIONI et al., 2001).

Como resultado da constante aeração e das novas condições da massa de

fermentação, ocorre o crescimento na população de bactérias acéticas que

utilizam o etanol para realizar o metabolismo do ácido acético. A formação de

acido acético e etanol combinada ao aumento da temperatura causa a morte do

embrião levando a fermentação do cacau a suas etapas finais (CAMU et al., 2007;

SCHUWAN et al., 1995).

2. 3. Extração de DNA

Para o estudo convencional de isolamento e cultivo de bactérias láticas faz-

se necessário o uso de meios complexos, os quais possuem exigências

nutricionais de vitaminas, aminoácidos, purinas e pirimidinas (MADIGAN, 2000).

Técnicas de microbiologia tradicionais apesar de serem possíveis para bactérias

láticas apresentam dificuldades como o alto custo, tempo para identificação e

cultivo. Molecularmente as bactérias láticas vêm sendo amplamente estudadas

servindo de modelo genético e apresentando também grande potencial probiótico

(DELLAGLIO et al., 1991; DICKS et al., 1996; GOLDIN et al., 1992; MORI et al.,

1997).

8

Quando se deseja trabalhar com comunidades ambientais complexas faz-

se necessária a extração dos ácidos nucléicos e posterior separação dos demais

constituintes das amostras. As amostras podem passar ainda por diferentes

métodos de purificação. Os métodos de extração de DNA microbiológico estão

baseados na extração direta de todo material microbiano oriundo das amostras

ambientais ou extração após o isolamento dos microrganismos e lise apenas para

obtenção do DNA celular (ROOSE-AMSALEG et al., 2001). A Tabela 1 demonstra

os métodos usuais para extração de DNA.

Os contaminantes como, ácidos húmicos, fulvicos e meios seletivos

utilizados no isolamento, podem vir a interferir no processo de amplificação. Assim

a remoção de substâncias é um importante passo na preparação das amostras

para a PCR (TSAI e OOLLSSOONN, 1992; COUTINHO, et al., 1999; MACIEL, 2004;

FERREIRA, 2007).

Tabela 1 - Principais tratamentos e suas funções na extração do DNA microbiano

total para analise da diversidade microbiana (modificado de MACIEL, 2004).

Tratamento Reagente/processo Função

1. Lise

Objetivo: Romper paredes e membranas levando a liberação do material genético. Pode ser:

*Física

*Quimica

Choque térmico, sinicação, fervura, maceração com N2, etc

Detergentes: dodecil sulfato de sódio (SDS),

Promover o rompimento da parede e membranas celulares através de forças mecânicas

9

*Enzimática

Triton 144, sacorsil, brometo de N- cetil-N,N,N, trimetilamônio (CTAB)

Proteases (Proteinase K) e lisozimas

Dissolver os lipídeos de membrana, solubilizar, dissociar e desnaturar proteínas, inibir

a ação das proteases

Desnaturar proteína de parede e membrana celular e hidrolise do mucopeptídeo

2. Separação do DNA

Objetivo: Separação do DNA dos demais componentes celulares

Solventes orgânicos: fenol clorofórmio; clorofórmio- álcool- isoamílico

Tiocianato de guanidina

Desnaturar proteínas, separar o DNA devido à formação de três fases: orgânica, intermediária (contendo as proteínas desnaturadas) e a aquosa superficial (contendo o DNA)

Agente caotrópico que realiza ligações de hidrogênio com as moléculas de água, causando desestabilização das ligações entre as proteínas solúveis no meio e a água

3. Precipitação do DNA

Objetivo: Precipitação do DNA para ser ressuspendido em menor volume de água ou tampão, concentrando a amostra

Precipitação alcoólica: isopropanol; etanol

Precipitação com sal: acetato de sódio; acetato de amônio

Retirar as moléculas e água das hélices do DNA, provocando sua precipitação

Neutralizar as cargas negativas (fosfato) do DNA, promovendo sua agregação

10

Polietilenoglicol (PEG)

Reduzir o poder de solubilização da água

4. Purificação

Objetivo: Remoção de ácidoa húmicos e fúlvico, matéria orgânica, endonucleases e demais inibidores

Polivinilpirrolidiona (PVP); polivinilpolipirrolidona (PVPP)

Cromatografia de filtração em gel

Cromatografia de adsorção

Colunas de filtração em gel: Sephadex

Absorver compostos fenólicos e húmicos através da formação de ligações de hidrogênio entre os compostos

Através de colunas contendo resina, permite a purificação do DNA, devido à passagem de moléculas menores através dos poros da membrana

Através da utilização de colunas aniônicas, permite a purificação do ácido nucléico após adsorção de DNA por uma matriz de carga positiva

Purificação relativamente rápida. Auxilia na adsorção de substancia como o ácido húmico e matéria orgânica do extrato de DNA

Estudos microbianos, através de técnicas de biologia molecular, sugerem

uma enorme riqueza de populações (TORVISK et al., 1990; AMANN et al., 1995).

As técnicas moleculares para estudo de diversidade são atualmente as grandes

11

chaves para o estudo de microrganismos em amostras ambientais complexas

(NAKATSU, 2000). Permitindo desta forma, identificar e quantificar

microrganismos pela análise de seus genes, disponibilizando as informações

sobre a composição e função de comunidades sem a necessidade de cultivo e

isolamento em cultura pura (STAHL e AMANN, 1991).

2.4. DGGE (Eletroforese em gel com gradiente de desnaturação)

O DGGE (Eletroforese em gel com gradiente de desnaturação) é baseado

na eletroforese de fragmentos de DNAr, amplificados por PCR, em gel de

poliacrilamida contendo um gradiente linear de agentes desnaturantes de DNA

(uréia e formamida) (MUYZER e SMALLA,1998; SINGLER, 2004). Esta é uma

metodologia que permite a separação de fragmentos de DNA com o mesmo

tamanho, porém com seqüências de nucleotídeos diferentes, baseado na

mobilidade eletroforética de uma molécula de DNA parcialmente desnaturada em

géis de poliacrilamida com gradiente crescente de desnaturação. Esta estratégia é

um método convencional que permite observar a estrutura de comunidades

microbianas em amostras ambientais (COUTINHO et al., 1999; SIGLER et al.,

2002), e talvez seja a técnica fingerprint de cultivo independente mais comumente

utilizada para o monitoramento de microrganismos em ecossistemas naturais

(ERCOLINI, 2004).

O DGGE funciona à medida que fragmentos de DNA se movem através de

géis de poliacrilamida contendo um gradiente crescente de desnaturantes, onde

pequenas regiões denominadas domínios de desnaturação sofrem dissociação

das fitas que compõem a dupla hélice do DNA, gerando moléculas parcialmente

desnaturadas com mobilidade eletroforética retardada. Estas moléculas de DNA

continuam a se mover vagarosamente através das concentrações mais altas de

desnaturantes e, desse modo, domínios de desnaturação adicionais sofrem

dissociação das fitas. Variações na composição de bases dentro destes domínios

alteram o seu comportamento de desnaturação, levando a diferenças no padrão

12

de eletroforese no gel gradiente desnaturante (FERREIRA, 2007). Entretanto,

quando o último domínio, ou o mais estável sofre desnaturação, o fragmento tem

suas fitas completamente dissociadas e o poder de resolução do gel é perdido.

Portanto, substituições de base no domínio da molécula de DNA com

comportamento de desnaturação mais alto não podem ser detectadas por DGGE.

Para contornar este problema, uma seqüência de DNA rica em GC (cerca de 40-

45 bases) é acoplada a extremidade 5' do forward primer, no caso de fragmento

amplificado por PCR. Desta maneira, o fragmento inteiro desnatura como um

domínio único e pára de migrar quando encontra seu Tm (melting temperature) no

gel, enquanto a seqüência rica em GC permanece na configuração duplex,

impedindo a completa separação da dupla fita da molécula (FERREIRA 2007,

SANTOS 2007).

O DGGE foi originalmente desenvolvido e aplicado na pesquisa médica a

fim de detectar, identificar e localizar mutações de ponto, naturais ou induzidas

(FISHER e LERMAN, 1983; MYERS et al., 1985).

Esta técnica é de fato bastante versátil e tem sido utilizada para estudar a

estrutura e evolução de comunidades microbianas em solo, mar, rios e águas de

lagos (ERCOLINI, 2004); comunidades complexas como biofilme bacteriano; para

avaliar a distribuição sazonal e de populações ao longo de um gradiente térmico

(VAN BEEK e PRIEST, 2002; FERRIS et al., 2006); para examinar diferenças

entre bactérias que habitam no trato gastrintestinal de grandes variedades de

animais, como ratos, coelhos, galinhas, porcos e humanos (SIMPSON et al.,

2000); e mais recentemente, na microbiologia dos alimentos (ERCOLINI, 2004).

Esta ainda é ótima ferramenta para monitorar o isolamento de bactérias, e para

detecção de microheterogeneidade em códons de genes de RNAr (WALTER et

al., 2000)

Como muitos métodos moleculares, os passos envolvidos nas análises do

DGGE são mais ou menos consistentes entre diferentes laboratórios, mas não

padronizados. Em geral, os tamanhos de produtos de PCR analisados estão entre

13

200 e 600 pares de bases (pb) e a porcentagem de acrilamida do gel está entre

6% ou 8%. Muitas corridas são realizadas na temperatura de 60º C, através de

concentrações desnaturantes tão baixas quanto 20% a tão altas quanto 70%, ou

mais (uma solução de 100% de desnaturante é definida como 40% [vol/vol] de

formamida e 7M de uréia) (SIGLER et al., 2002). Segundo o mesmo autor, existe

inconsistência na escolha da voltagem aplicada e no tempo de corrida usado para

o DGGE, esta inconsistência é refletida na voltagem e tempos aplicados na

técnica, descritas na literatura em escalas mínimas de 455 V.h (130 V por 3.5h;

COCOLIN et al ., 2001) a 2100 V.h (100 V por 21h; GEJMAN et al., 1998).

O resultado final é um demonstrativo da amostra analisada e que contém

uma série de bandas relativas às espécies microbianas presentes na amostra. A

identificação destas espécies pode ser encontrada pela purificação e

sequenciamento das bandas do perfil de DGGE (FERRIS et al., 2006).

Vários estudos foram conduzidos utilizando a técnica de DGGE para estudo

de bactérias láticas (WALTER et al., 2001; ENDO e OKADA, 2005; CAMU et al.,

2007). Walter e colaboradores em 2001 utilizaram a técnica de DGGE para

fragmentos de DNA obtidos através de amplificação por PCR da região V2 - V3 do

RNA ribossomal 16S (Figura 3). Em seu estudo foram construídos os iniciadores

Lac 1 para amplificação de DNA dos gêneros Lactobacillus, Pediococcus,

Leuconostoc e Weissella e Lac 2 ao qual foi acoplado um grampo de GC de 40

pares de base. Em 2005 Endo e Okada publicaram o uso do iniciador Lac 3 que

utilizando o Lac 2 como reverso, amplifica o DNA de outras bactérias láticas como

Lactococcus, Tetragenococcus, Streptococcus e Enterococcus e se alinha entre

as posições 352 e 370 do rDNA de Escheria coli, também localizado entre as

regiões V2 - V3 do RNA ribossomal. Mostraram que a utilização dos iniciadores

Lac 1, Lac 2 e Lac 3 foi bastante satisfatória para o estudo de bactérias láticas em

shochu (fermentado destilado de arroz e batata).

14

O presente estudo utilizou dos mesmos iniciadores (Lac 1, Lac 2 e Lac 3)

para monitoramento de bactérias láticas através da técnica de DGGE durante a

fermentação de cacau.

15

Figura 3 - Modelo da estrutura secundária do 16S rRNA de Escherichia coli. Fonte:

http://rna.ucsc.edu/rnacenter/ribosome_images.html

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Coleta

As amostras de polpa de cacau foram obtidas a partir de processo

fermentativo realizado em cochos de fermentação (medindo 1,20 m de largura, 90

cm de altura, comprimento variável, drenos laterais com 10 mm de diâmetro e

espaçamento mútuo de 15 cm) na fazenda São Jorge, localizada no Km 20 da

Rodovia Ilhéus-Uruçuca, BA. As amostras foram coletadas em intervalos de 12

horas durante seis dias na safra temporã (Mês de Agosto). Para a amostragem

foram utilizados frascos coletores esterilizados que foram introduzidos diretamente

no cocho (Figura 4), após o revolvimento das amêndoas. As amostras da massa

foram retiradas de três profundidades, superfície, 30 e 60 cm e posteriormente

homogeneizadas. Após cada coleta, cerca de 200 gramas de amêndoas de cacau

eram seqüencialmente despolpadas com o auxílio de despolpador elétrico, sendo

obedecida a equivalência grama por mL da massa fermentativa e água destilada

estéril acrescida de 0,1% de Tween 80. A outra parte da polpa era congelada a –

20°C para posterior análise.

http://rna.ucsc.edu/rnacenter/ribosome_images.html

16

Figura 4 - Cochos de fermentação de cacau: (1) visão superior com divisórias

montadas; (2) visão lateral; (3) visão superior com divisórias parcialmente

removidas.

3.2. Medida de temperatura e pH

Durante intervalos de 12 horas foram aferidos a temperatura e pH da massa

de cacau. Para aferir a temperatura utilizou-se um termômetro de mercúrio que foi

inserido, a cada coleta, na massa de fermentação antes do revolvimento do cocho

a 60 cm de profundidade em três regiões (lateral esquerda, central e lateral

direita). Para aferir o pH da massa foi utilizado potenciômetro (marca Tecnal)

previamente equilibrado com pH 7 e pH 4.

3.3. Extração do DNA

Para a extração de DNA, as amostras da polpa foram homogeneizadas em

vórtex por 30 segundos em média. Uma alíquota de 5 gramas de cada amostra foi

centrifugada a 5000 rpm (rotação por minuto) durante cinco minutos.

Posteriormente as amostras foram lavadas uma vez com tampão TE (tris base,

EDTA) 50/50. Nas primeiras amostras coletadas a 0, 12, 24, 36 horas de

fermentação, eram realizadas seis lavagens com tampão PBS pH 8 a 0,1 M

(K2HPO4 a 1M, KH2PO4 a 1M) e apenas três lavagens para o restante (48, 60, 72,

84, 96, 108 e 120 horas). Após as lavagens as amostras eram acrescidas de 1%

(1) (2) (3)

17

de Tween 80 e submetidas à desfloculação microbiológica por sonicação com

amplitude de 20% e pulsação ausente em duas séries de 40 segundos. Para as

amostras inicias 0, 12, 24, 36 foram utilizadas duas séries de 1 minuto com 6 s de

pulso on e 2 de pulso off. As amostras foram centrifugadas a baixa rotação de 800

rpm por 3 minutos, coletando-se o sobrenadante. Uma nova centrifugação foi

então realizada a 5000 rpm por 5 minutos para obtenção do precipitado. O

precipitado foi suspendido em TESC (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0,1 mM NaCl,

pH 8,3) e submetido à lise enzimática com 3% de proteinase K adicionado de 3%

SDS (dodecil sulfato. de sódio) 20%. Após a lise enzimática foi realizada lise física

em três ciclos de choque térmico (-196°C por 40s seguido de 90°C/5 min), seguido

de extração por fenol- clorofórmio-álcool- isoamilico (25:24:1) da marca Nuclear. O

DNA foi precipitado com 10 % de acetato de sódio e 70% de isopropanol. A

solução foi mantida a – 20°C por 16 horas e posteriormente centrifugada por 10

minutos a 5000 rpm para obtenção do precipitado. O precipitado foi lavado duas

vezes com etanol 70% e suspendido em água ultrapura. As amostras de DNA

foram purificadas em mini-colunas de Sephadex G-200 equilibradas em TE

clássico. Um volume de 350 μL da solução contendo Sephadex foi adicionado às

colunas acrescidos da amostra de DNA. As colunas foram incubadas em banho-

maria a 60°C por 10 minutos e em seguida centrifugadas por 3 minutos a 5000

rpm.

3.4. PCR (Reação em Cadeia da Polimerase)

Para amplificação das amostras e estudos da diversidade e dinâmica das

bactérias láticas utilizaram-se dois conjuntos de iniciadores. O primeiro conjunto

compreende os primers Lac 1 (5’ AGCAGTAGGGAATCTTCCA 3’) e Lac 2

(ATTYCACCGCTACACATG) desenvolvidos por Walter et al. (2001) objetivando a

amplificação de baterias láticas através da técnica de DGGE, abrangendo os

gêneros Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc, Weissella. Ao primer Lac 2 foi

acoplado um grampo GC de 40 pares de base

18

(CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGCCCGGGGGCACCGGGGG) para impedir

a total dissociação das fitas de DNA durante o DGGE. Para o segundo conjunto

utilizou-se o primer Lac 2, validado por walter e colaboradores em 2001, e o Lac 3

(5’ AGCAGTAGGGAATCTTCGG 3’), que foi desenvolvido por Endo e Okada

(2004) objetivando complementar o grupo das bactérias láticas abrangendo cinco

outros gêneros: Lactococcus, Streptococcus, Enterococcus Tetragenococcus,

Vagococcus. Para a amplificação o DNA foi transferido para um tubo Eppendorf

contendo 200 μL, 10 mM do tampão da Taq Polimerase, 2,5 mM de MgCl2, 10

pmol de cada primer (Lac 1 e Lac 2 ou Lac 2 e Lac 3), 200 μM de DNTP, 1,25 U

de Taq polimerase, 1 μL de DNA da amostra e 16,75 μL, formando uma mistura

final de 25 μL. O programa utilizado na reação de PCR foi (para ambos os

conjuntos) iniciado com 94°C por 2 minutos, seguido de 35 ciclos de desnaturação

de 94°C por 30 segundos, anelamento por 1 minuto a 61°C e extensão a 68°C por

1 minuto e extensão final 7 minutos a 68°C, conforme descrito por Walter et al.

(2001). Para as amostras amplificadas com o uso do primer Lac 3 foi necessário

concentrar o produto de PCR. Três reações de 25 μL foram distintamente

precipitadas com 0,1 volumes de acetato de sódio 3 M acrescido de 0,7 volumes

de isopropanol gelado durante 16 horas a –20°C. Após a precipitação as amostras

foram centrifugadas a 5000 rpm por 10 minutos e submetidas a duas lavagens

com etanol 70%. Os precipitados de DNA foram desidratados à temperatura

ambiente e suspendidos com 25 μL de água ultrapura formando um “pool de

DNA”. A partir do “pool de DNA” foi realizada uma amplificação com uso do

mesmo conjunto de primers (LAC 2 e LAC 3). Os produtos de PCR foram

visualizados em transiluminador de luz ultravioleta (KODAK Eletrophoresis

Documentation and Analyses System 290) após eletroforese em gel de agarose

1% (90 V por 40 minutos) previamente corado com brometo de etídio.

19

3.5. DGGE

A técnica de DGGE foi realizada de acordo com Muyzer et al. (2003)

modificado. Para a corrida, 3500 ng de DNA, obtidos a partir de produto de PCR,

foram aplicados em gel vertical de poliacrilimida a 8% (acrilamida-bisacrilamida 37:

5: 1) com gradiente de desnaturação 35 a 60%, 20 a 70% e 20 a 50%. O gradiente

de desnaturação foi formado pela mistura de duas soluções: a solução de 100 %

desnaturante possuindo uréia a 7M e formamida a 40% (v/ v) e a solução 0%

desnaturante com uréia e formamida ausentes. A eletroforese em gel vertical foi

corrida em tampão TAE 1x (0,04 M Tris acetato e 1 mM de EDTA) a 200V por 4 ou

5 horas, mantendo uma temperatura constante de 60°C (Modificado de SINGLER

et al., 2004). A coloração do gel foi realizada com uso de nitrato de prata a 2%

segundo o protocolo de BEIDLER et al. (1982) modificado por CRESTE et al.

(2001). Posteriormente o gel foi escaneado para análise. A figura 5 demonstra a

seqüência de montagem da cuba de DGGE até a corrida do gel de poliacrilamida.

Figura 5 - Sequência de preparação do gel de DGGE: preparação da cuba,

montagem, lavagem dos poços do gel, aplicação da amostra e corrida em tampão

TAE 1% a temperatura constante de 60°C (ARGÔLO, 2007).

20

3.6. Análise de similaridade dos fragmentos de DNA no gel de poliacrilamida

A análise de presença ou ausência de bandas a partir do gel escaneado foi

realizada manualmente, sendo a imagem do gel visualizada no programa

PhotoFiltrer (com uso da ferramenta full screen) e a similaridade entre o padrão de

bandas de cada amostra foi medida através da correlação de Dice utilizando o

programa PAST (disponível em http://folk.uio.no/ohammer/past/).

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1. pH e Temperatura

O pH e a temperatura durante a fermentação do cacau variam de acordo ao

tipo de microrganismo fermentador presente na massa e a quantidade de cacau

contida no cocho. Segundo a literatura, na fermentação de cacau a polpa das

amêndoas encontra-se ácida devido à presença de cerca de 2 a 2,5% de ácido

cítrico. Os resultados médios de pH obtidos no processo fermentativo utilizado

nesse experimento, estão dentro da faixa considerada normal entre 3 e 5, uma vez

que demonstram durante a coleta a variação de pH de 3,34 a 4,98 (Figura 6). Em

um estudo semelhante realizado por Ferreira (2007), foram verificados valores de

pH aproximados a estes (3,7 - 4,84 a 3,4 – 4,94), sendo que as coletas foram

realizadas em safras diferentes ocorridas na mesma fazenda deste experimento.

Os valores encontrados estão também de acordo com outros trabalhos realizados

em fermentação de cacau no mundo (LEHRIAN e PATTERSON, 1983;

JESPERSEN et al., 2004; SCHWAN, 1998; ARDHANA e FLEET, 2003; SAMAH et

al., 1993). Estes valores de pH favorecem o crescimento de microrganismos

http://folk.uio.no/ohammer/past/

21

acidófilos como as leveduras, bactérias láticas e bactérias acéticas inibindo o

crescimento de outros microrganismos. Segundo Passos (1984), a sucessão

microbiana ocorrida na fermentação do cacau é resultado de fatores ambientais

como a temperatura, pH, tensão de oxigênio e substratos presentes na polpa. As

condições iniciais da fermentação favorecem o crescimento de leveduras e

bactérias láticas, entretanto o metabolismo das leveduras intensifica a redução do

pH favorecendo o crescimento de bactérias láticas acidófilas o que explica a maior

concentração desses microrganismos após 18 horas de fermentação (CAMU et

al., 2007; PASSOS, 1984).

0

2

4

6

0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120

Tempo (h)

pH

Figura 6 - Variação de pH da massa de cacau durante a fermentação em cocho na

fazenda São Jorge.

As temperaturas durante a fermentação do cacau nesse experimento,

variaram entre 23°C e 50°C com média de 28,3ºC nas primeiras horas (0, 12, 24,

36) e de 48,2°C para o final da fermentação (48, 60, 72, 84, 96, 108, 120) (Figura

7). Em estudo realizado por Ferreira (2007) foram encontradas temperaturas

22

variando de 25 a 52oC. Camu e colaboradores (2007) observaram médias de

temperatura de 26,3°C (26,0 a 30,0°C) e 43,5°C (42,2 a 47,7°C) iniciais e finais

respectivamente para a fermentação do cacau em Gana. De acordo com a

literatura, a temperatura no cocho eleva-se lentamente no início do processo,

aumentando rapidamente após as primeiras 48 horas, quando atinge os valores

de 40-45ºC, com o revolvimento da massa, esta pode chegar a valores ainda mais

altos (LEHRIAN e PATTERSON, 1983; SCHWAN, 1995; ARDHANA e FLEET,

2003). As bactérias láticas são formadas por aproximadamente 12 gêneros,

apresentando faixa de temperatura ótima entre 20 e 45°C (Hofvendahl e Hahn-

Hägerdal, 2000), sendo que a maioria delas concentra-se a 35°C, temperatura

observada neste experimento durante o segundo dia de fermentação. A Figura 7

mostra a variação de temperatura no processo de fermentação do cacau

observada durante o experimento.

0

10

20

30

40

50

60

0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120

tempo (h)

Te

mp

era

tura

(°C

)

23

Figura 7 - Variação de temperatura da massa de cacau durante a fermentação em

cocho na fazenda São Jorge/ BA.

4.2. Extração de DNA e amplificação

Com o objetivo principal de aplicar o DGGE-PCR, para monitorar a

população de bactérias láticas durante a fermentação de cacau este trabalhou

buscou a otimização de um protocolo de extração de DNA. O protocolo definitivo,

como descrito em materiais e métodos, foi desenvolvido com base em alguns

estudos de extração de DNA de solo e lodo com modificações nos passos de

lavagem e tempos de incubação. Esse protocolo produziu DNA de boa qualidade,

com baixa quantidade de contaminantes, permitindo o estudo da comunidade de

bactérias láticas, independente de cultivo, sendo minimamente modificado de

acordo com o aspecto da massa coletada, ou seja, quanto mais viscoso maior a

quantidade de lavagens com PBS. Os passos de lavagens auxiliados pelo

processo de sonicação corroboraram para a remoção de partículas orgânicas. A

purificação do DNA foi necessária uma vez que em amostras ambientais a

presença de substâncias húmicas ou outros componentes (como uréia, ferro, etc.)

podem inibir a atividade da enzima polimerase ou reter os iniciadores, reduzindo a

sensibilidade da PCR.

A maior parte das técnicas moleculares para detecção, identificação e

classificação de bactérias é baseada na seqüência de nucleotídeos do 16S rRNA

(WALTER et al., 2001; SANCHEZ et al., 1985). Para o monitoramento da

população de bactérias láticas na fermentação do cacau foram utilizados os

indicadores Lac 1 e Lac 2 (16S rRNA), validados em 2001 por Walter e

colaboradores, para amplificação dos gêneros Lactobacillus, Pediococcus,

Leuconostoc, Weissella e Lac 3 também baseado na seqüência 16S (ENDO e

OKADA, 2005), construídos para amplificação de outro grupo de bactérias láticas,

Lactococcus, Streptococcus, Enterococcus, Tetragenococcus e Vagococcus. A

24

partir do DNA total, para as 11 amostras seqüenciais (a cada 12 horas) coletadas,

foram obtidos através da técnica de PCR produtos de aproximadamente 340 pb

(pares de base) para amplificações com primers Lac 1 e 2 e 380 pb para

amplificações com primers Lac 3 e Lac 2, conforme mostrado nas Figuras 8 e 9.

Foi observada a amplificação de bactérias láticas durante toda a fermentação para

ambos os conjuntos de primers, indicando que a comunidade desses

microrganismos esteve amplamente distribuída durante o experimento.

As amplificações com os primers Lac 2 e Lac 3 apresentaram menor

rendimento de DNA que as amostras amplificadas com primers Lac 1 e Lac 2,

principalmente para as amostras representantes de 0 a 96 horas de fermentação

(Figuras 8 e 9). Sugere-se neste caso a ocorrência de baixo o número de

seqüências alvo buscada pelos iniciadores ou o baixo número de representantes

desse grupo na amostra e, dessa forma, após a amplificação, obtivemos amostras

de DNA muito diluído.

Figura 8 - Eletroforese em gel de agarose dos produtos de PCR amplificados

pelos primers Lac 1 e Lac 2 em amostras de polpa de cacau. A seqüência

indicada no gel é formada por (M) marcador molecular GeneRuler 1Kb DNA

M C- 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120

25

Ladder Plus ; (C-) Controle negativo; tempo de coletas em horas (0; 12; 24; 48; 60;

72; 84; 96; 108; 120; 132).

Figura 9 - Eletroforese em gel de agarose dos produtos de PCR amplificados com

primers Lac 2 e Lac 3 a partir de amostras de polpa de cacau. A seqüência

indicada no gel é formada por (M) marcador molecular GeneRuler 1Kb DNA

Ladder Plus ; (C-) Controle negativo; tempo de coletas em horas (0; 12; 24; 48; 60;

72; 84; 96; 108; 120; 132).

4.3. DGGE

M C- 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120

26

Para os experimentos com DGGE foi considerado que cada banda no gel

de poliacrilamida representa um microrganismo diferente. Neste sentido observou-

se que a sensibilidade do DGGE é variável e dependente da quantidade do

produto de PCR aplicado no gel de poliacrilamida. O DNA pouco amplificado

apresenta no gel de DGGE um perfil com menor quantidade de bandas, em

contraponto, DNA em excesso dificulta a visualização por fusão de bandas, como

mostrado nas horas 108 e 120 da Figura 13. Para obtenção de um bom perfil de

bandas em gel de poliacrilamida foi necessária uma aplicação média de 3500 ng

de DNA. Para as amostras amplificadas com os iniciadores Lac 2 e Lac 3, foi

necessário aumentar a concentração de DNA através de reamplificação (Figura

10), uma vez que, a quantidade máxima de DNA corrida em gel de DGGE foi de

1500 ng para as amostras 0, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96. A capacidade da

canaleta do gel de poliacrilamida é de 45 μL e a concentração média de DNA para

as amostras amplificadas com uso dos indicadores Lac 2 e Lac 3 foi de 50 ng/μL.

Dessa forma, com uso de 5-7 μL de corante, não foi atingida a quantidade ideal de

DNA a ser aplicado, podendo assim ter subestimado a quantidade real de bandas

no gel.

Figura 10 - Eletroforese em gel de agarose dos produtos de PCR de amostras de

polpa de cacau obtidas após reamplificação do “Pool de DNA” amplificados com

primers Lac 3 e Lac 2. A seqüência indicada no gel é formada por (M) marcador

M C- 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 24

27

molecular GeneRuler 1Kb DNA Ladder Plus ; (C-) Controle negativo; tempo de

coletas em horas (0; 12; 24; 36; 48; 60; 72; 84; 96; 108; 120 e a repetição da

amostra 24 horas).

O DGGE com os primers Lac 1 e Lac 2 indicaram número total de onze

bandas no gel, onde o número máximo de onze bandas foi observado entre 36 e

48 horas, como observados na Figura 11 e na Tabela 2. Schwuam (2004),

utilizando método convencional de cultivo, afirmou que as bactérias láticas teriam

pico de crescimento no segundo dia de fermentação. Camu et al. (2007)

encontraram número máximo de bandas após 48 horas para a fermentação de

cacau ocorrida em Gana, estando este trabalho de acordo com os resultados por

eles observados. A temperatura de crescimento das bactérias láticas varia entre

20 e 45°C a depender da espécie (Hofvendahl e Hahn-Hägerdal, 2000), isso

ocorre nas primeiras 48 horas de fermentação nesse estudo. O maior grupo de

bactérias láticas concentra-se na faixa de 35-38°C, faixa abrangida nesse estudo

entre 36 e 48 horas de fermentação. Durante esse período (36 a 48 horas) o pH é

reduzido devido à ação da atividade metabólica das leveduras, favorecendo o

crescimento das bactérias láticas que podem ainda, a depender da espécie,

alterar o padrão de fermentação, desviando da via homo para heterolática, como

ocorre com os Lactobacillus bulgaricus (CARVALHO et al., 2005). O fato de que

no segundo dia de fermentação encontram-se as condições ideais de crescimento

de bactérias láticas explica a semelhança de resultados relacionados ao aumento

da diversidade nas primeiras horas entre os autores, mesmo considerando as

diferenças de localidades, condições temporais e técnicas de análise utilizadas

nos experimentos. Além disso, as bactérias láticas podem desviar o fluxo do

metabolismo de açúcares em direção à formação de exopolissacarídeos como

resposta a variações no pH do meio e dessa forma alguns grupos bacterianos

tornam-se capazes de permanecerem até o fim da fermentação (LIU, 2003). Essa

diversidade de metabólitos pode variar a depender dos microrganismos presentes

28

na fermentação e da região em estudo e assim obter diferenças no flavour após

torrefação.

Outro fato que justifica a maior diversidade de bactérias láticas no segundo

dia de fermentação do cacau é que elas são bastante exigentes quanto às

condições de crescimento. Os açúcares representam as melhores fontes de

carbono para estas bactérias, havendo também necessidade de fonte de

nitrogênio, vitaminas e sais minerais para o bom desempenho da fermentação

lática. Desta forma a maior concentração de açúcar na fermentação do cacau

encontra-se nas primeiras horas, sendo gradativamente diminuída durante o

processo (HAULY et al., 2003).

Foi observado que para os primes Lac 1 e Lac 2, nenhum microrganismo

permaneceu constante durante toda a fermentação (Figura 11), porém três

conjuntos seqüenciais de bandas mereceram destaque, duas bandas surgiram no

inicio da fermentação e mantiveram-se até 72 horas (47°C) e outra que surgiu

após 36 horas (36°C) e permaneceu até o final da fermentação (50°C).

Com os primers Lac 2 e Lac 3 foram visualizadas número máximo de doze

bandas distintas em gel de DGGE, onde o tempo com maior diversidade foi de 108

horas apresentando nove bandas (Tabela 4). Foi também observado na Tabela 4

que três espécies de microrganismos estiveram presentes durante toda a

fermentação, mostrando-se resistentes e/ou adaptadas às variações ocorridas na

massa de cacau durante o processo. Outra espécie representativa aparece na

etapa inicial e permanece na fermentação até a temperatura da massa atingir

47°C no tempo de 72 horas. O número maior de bandas em 108 horas pode ser

explicado pela concentração de DNA aplicado para amostras nesse tempo e no

tempo de 120 horas (3500 ng), enquanto que para o restante das amostras foram

aplicadas quantidades inferiores (1500 ng). Para amostras reamplificadas, o

número total de bandas presentes foi de vinte e oito (Tabela 6 e Figura 15),

considerando assim que provavelmente o número de bactérias presentes foi

29

consideravelmente superior aos até então estudados nesse trabalho. Os tempos

que apresentaram maiores números de bandas foram 24 e 72 horas com dezoito

bandas, seguido a amostra de 36 horas com dezessete conforme observado na

Figura 15 e Tabela 6. Seis espécies mantiveram-se presente durante toda a

fermentação para as amostras reamplificadas, mas 8 espécies diferentes

apresentaram breve passagem em apenas um tempo de fermentação, podendo

ser observada na planilha da Figura 18 como as bandas B, G, H, I, J, K, N, AA. As

Tabelas 2, 4 e 6 representam o perfil de bandas observadas com auxílio do

programa PhotoFiltre, conforme utilizadas nas planilhas do programa PAST e

adotados para análise dos géis de DGGE correspondente.

30

Figura 11 - Dinâmica da população de bactérias láticas na fermentação do cacau

através da técnica de DGGE com gradiente 20- 70%, utilizando produtos de PCR

realizados com primers Lac 1 e 2. A sequência indicada no gel refere-se ao tempo

de coletas em horas (0; 12; 24; 48; 60; 72; 84; 96; 108; 120; 132). As letras

demonstram a identificação manual de bandas com uso do PhotoFiltre.

0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120

A

B

C D E

F

G

H

I

J

K

31

Tabela 2 - Alinhamento de bandas adotada no programa PAST para amostras

amplificadas com primers Lac 1 e Lac 2, onde “0” indica ausência de banda e “1”

indica presença.

Bandas

Amostras

A B C D E F G H I J K

0 0 0 1 1 0 0 1 1 1 1 0

12 0 0 1 1 0 0 1 1 1 1 0

24 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1

36 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

48 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

60 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0

72 0 0 1 1 1 1 0 0 1 1 0

84 0 0 0 0 1 1 0 0 1 0 0

96 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0

108 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0

120 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0

32

4.4. Correlação de Dice

Os índices de correlações do Dice consideram a presença ou ausência de bandas,

na qual é estabelecida uma matriz de similaridade (DICE), utilizada para

construção de um dendrograma pelo modelo Unweigthed Pair Group Method

Arithmetic Average (UPGMA). Conforme observado na Figura 12, a análise da

correlação de DICE dividiu a fermentação em dois grupos. O primeiro grupo foi

formado pelas primeiras horas de fermentação que abrangeu de 0 a 72 horas e

apresentou similaridade de 72%, o segundo grupo (84 a 120 horas) apresentou

similaridade de 60%. No primeiro grupo ocorreu similaridade de 100% entre 0 e 12

horas e entre 36 e 48 horas, indicando que tais amostras apresentaram o mesmo

perfil de bandas, ou seja, como consideramos cada banda como um

microrganismo diferente, a microbiota manteve-se inalterada nesses intervalos de

tempos. Para o segundo grupo a similaridade de 100% foi observada entre 108 e

120 horas. Como já discutido, as condições da massa de cacau nas etapas iniciais

favorecem a maior parte dos gêneros de bactérias láticas e dessa forma apresenta

um grupo mais homogêneo e com similaridade de bandas mais alta. A

similaridade entre os grupos foi de 42%, o que pode indicar uma gradação no

surgimento de novos grupos e não uma mudança abrupta na microbiota

amplificada pelos indicadores em questão. A Tabela 3 demonstra a similaridade

par a par entre as horas de fermentação para amostras amplificadas com os

primers Lac 1 e Lac 2.

33

1,2 2,4 3,6 4,8 6 7,2 8,4 9,6 10,8 12

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

Sim

ilarity

84

96

108

120

72

24

36

48

60

12

0

Figura 12 - Gráfico da similaridade da população de bactérias láticas na

fermentação de cacau através da correlação de Dice, utilizando produtos de PCR

amplificados com primers Lac 1 e Lac 2.

34

Tabela 3 - Distância da matriz de Dice usando UPGMA para amostras

amplificadas com primers Lac 1 e Lac 2.

Amostras

em unidades de tempo (h) 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120

0 0 0 75 75 75 75 72 42 42 42 42

12 0 0 75 75 75 75 72 42 42 42 42

24 75 75 0 88 88 87 72 42 42 42 42

36 75 75 88 0 0 87 72 42 42 42 42

48 75 75 88 0 0 87 72 42 42 42 42

60 75 75 87 87 87 0 72 42 42 42 42

72 72 72 72 72 72 72 0 42 42 42 42

84 42 42 42 42 42 42 42 0 60 60 60

96 42 42 42 42 42 42 42 60 0 86 86

108 42 42 42 42 42 42 42 60 86 0 0

120 42 42 42 42 42 42 42 60 86 0 0

35



amplificados com primers Lac 2 e 3. A seqüência indicada no gel refere-se ao

tempo de coletas em horas (0; 12; 24; 36; 48; 60; 72; 84; 96; 108; 120; 132). As

letras indicadas na figura representam as bandas visualizadas com auxilio do

programa PhotoFiltre.

0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120

A B

B2

C

D

E F

G H

I J

K

36

Tabela 4 - Planilha indicando o alinhamento de bandas utilizado no programa

PAST para amostras amplificadas com primers Lac 2 e Lac 3, onde “0” indica

ausência de banda e “1” indica presença.

Bandas

Amostras (h) A B B2 C D E F G H I J K

0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1

12 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0

24 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1

36 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1

48 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1

60 0 0 1 0 0 1 0 1 1 1 1 0

72 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 1 0

84 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0

96 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0

108 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 0

120 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 0

37

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

0,64

0,68

0,72

0,76

0,8

0,84

0,88

0,92

0,96

Sim

ilarity

108

120

72

84

96

60

24

0 36

48

12

Figura 14 - Gráfico da similaridade da população de bactérias láticas na

fermentação do cacau através da correlação de Dice, utilizando produtos de PCR

amplificados com primers Lac 2 e Lac 3 para amostras obtidas direto da polpa.

A Figura 14 demonstra a similaridade de Dice para os primers Lac 2 e Lac

3, a qual se apresenta em um gráfico mais ramificado que o da Figura 12. Para os

primers Lac 2 e Lac 3 foi observada similaridade superior a 84% nas primeiras 48

horas de fermentação, sendo que 0, 24, 36 e 48 horas apresentaram similaridade

de 100%. Não foi observada na Figura 16, similaridade inferior a 64% entre os

tempos de fermentação. Apenas as amostras de 108 e 120 horas apresentaram-

38

se mais heterogêneas, diferindo-se das demais horas, resultado provável da

quantidade de DNA aplicada no gel. A Tabela 5 demonstra a análise par a par da

similaridade de Dice para amostras amplificadas com primers Lac 2 e Lac 3.


amplificadas com primers Lac 2 e Lac 3.

Amostras

em unidades de

tempo (h)

0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120

0 0 84 0 0 0 77 69 69 69 64 64

12 84 0 84 84 84 77 69 69 69 64 64

24 0 84 0 0 0 77 69 69 69 64 64

36 0 84 0 0 0 77 69 69 69 64 64

48 0 84 0 0 0 77 69 69 69 64 64

60 77 77 77 77 77 0 69 69 69 64 64

72 69 69 69 69 69 69 0 85 80 64 64

84 69 69 69 69 69 69 85 0 80 64 64

96 69 69 69 69 69 69 80 80 0 64 64

108 64 64 64 64 64 64 64 64 64 0 93

120 64 64 64 64 64 64 64 64 64 93 0

39



da reamplificação do “Pool de DNA” realizados com primers Lac 2 e Lac 3. A

seqüência indicada no gel é formada por tempo de coletas em horas (0; 12; 36;

24; 48; 60; 72; 84; 96; 108; 120).

0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120

40

Tabela 6 - Planilha indicando o alinhamento de bandas utilizadas no programa PAST

para amostras amplificadas com primers Lac 2 e Lac 3, onde “0” indica ausência de

banda e “1” indica presença.

A B C D E F G H I J K L M N O P Q R S T U V W X Y Z AA AB

0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 1 0 0 1 1 1 0 0 1

12 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1

24 1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1

36 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1

48 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0

60 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0

72 0 0 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1

84 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0

96 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0

108 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 1

120 0 1 0 0 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0

41

1,2 2,4 3,6 4,8 6 7,2 8,4 9,6 10,8 12

0,6

0,7

0,8

0,9

1S

imila

rity

120

108

72

84

96

12

24

36

0 48

60

Figura 16 - Análise de similaridade da população de bactérias láticas na

fermentação do cacau através da correlação de Dice, utilizando produtos de PCR

realizados com primers Lac 3 e Lac 2 para amostras obtidas diretamente da polpa

após reamplificação.

42

O dendograma para reamplificação (Figura 16) não apresentou nenhum

índice de similaridade de 100%, indicando maior diversidade entre os dias de

fermentação do cacau. Porém foi observada proximidade superior a 78% entre as

primeiras 96 horas, e como ocorrido no dendograma mostrado na Figura 16, para

o mesmo conjunto de primers, as amostras 108 e 120 apresentaram-se mais

heterogênea, apresentando similaridade de 57% para a amostra 120 e 64% para

108 horas. Dessa forma podemos considerar que apesar da quantidade de DNA

ter influenciado no maior padrão de bandas das amostras 108 e 120 da Figura 13,

essas amostras apresentam os menores índices de similaridades entre os tempos

de fermentação para o conjunto de indicadores Lac 2 e Lac 3. A Tabela 7 mostra a

similaridade par a par das amostras reamplificadas com primers Lac 2 e Lac 3.


amplificadas com primers Lac 2 e Lac 3 após reamplificação.

Amostras

em unidades de tempo (h) 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120

0 0 85 85 85 78 78 82 82 82 64 58

12 85 0 91 91 78 78 82 82 82 64 58

24 85 94 0 0 78 78 82 82 82 64 58

36 85 94 0 0 78 78 82 82 82 64 58

48 78 78 78 78 0 95 78 78 78 64 58

60 78 78 78 78 95 0 78 78 78 64 58

72 82 82 82 82 78 78 0 83 83 64 58

84 82 82 82 82 78 78 83 0 90 64 58

96 82 82 82 82 78 78 83 90 0 64 58

108 64 64 64 64 64 64 64 64 64 0 58

43

120 58 58 58 58 58 58 58 58 58 58 0

44

5. CONCLUSÕES

A extração de DNA padronizada com posterior amplificação enzimática por

PCR, demonstrou ser eficaz na detecção de bactérias láticas durante as

diferentes etapas da fermentação do cacau, sendo que essas bactérias estão

presentes durante todo o processo;

Foi verificado durante o experimento que há uma dinâmica na população de

bactérias láticas na fermentação do cacau, existindo microrganismos que

permanecem durante toda a fermentação e outros que participam de etapas

variáveis a depender das condições do ambiente;

A similaridade na população de bactérias nos diferentes dias de fermentação

do cacau apresenta-se alta, mantendo correlação superior a 40% até o fim da

fermentação;

A quantidade de DNA aplicada no gel de poliacrilamida influencia o padrão

de bandas, sendo necessária uma padronização da quantidade de DNA para

obtenção de melhores resultados.

45

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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