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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
CIÊNCIAS APLICADAS A PRODUTOS PARA SAÚDE
LIDIANE MARTINS MENDES GOMES
INCLUSÃO DE CAROTENOIDES DE PIMENTÃO VERMELHO EM
CICLODEXTRINAS E AVALIAÇÃO DA SUA ESTABILIDADE, VISANDO
APLICAÇÃO EM ALIMENTOS
NITERÓI/RJ
2012
LIDIANE MARTINS MENDES GOMES
INCLUSÃO DE CAROTENOIDES DE PIMENTÃO VERMELHO EM
β-CICLODEXTRINA E AVALIAÇÃO DA SUA ESTABILIDADE, VISANDO
APLICAÇÃO EM ALIMENTOS
. Dissertação de Mestrado apresentada ao
Curso de Mestrado do Programa de Pós-
graduação em Ciências Aplicadas a
Produtos para Saúde da Faculdade de
Farmácia da Universidade Federal
Fluminense, como requisito para
obtenção do grau de Mestre.
Orientadora: Profa Dra. KÁTIA GOMES DE LIMA ARAÚJO
Co-orientadora: Prof ª Dr ª. DEBORAH QUINTANILHA FALCÃO
Niterói
2012
LIDIANE MARTINS MENDES GOMES
INCLUSÃO DE CAROTENOIDES DE PIMENTÃO VERMELHO EM
β-CICLODEXTRINA E AVALIAÇÃO DA SUA ESTABILIDADE, VISANDO
APLICAÇÃO EM ALIMENTOS
BANCA EXAMINADORA
Prof ª. Dra. KÁTIA GOMES DE LIMA ARAÚJO - Orientadora
Universidade Federal Fluminense – UFF
Prof . Dr. ANDERSON JUNGER TEODORO - Membro Titular
Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro - UNIRIO
Prof. Dr. ARMANDO UBIRAJARA OLIVEIRA SABAA SRUR- Membro Titular
Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ
Niterói/RJ
2012
AGRADECIMENTOS
Agradeço a princípio a Deus, pelo dom da vida, por estar sempre
presente nos momentos importantes iluminando meus caminhos e
proporcionando a conclusão de mais uma etapa essencial em
minha vida.
À minha orientadora Kátia Gomes de Lima Araújo, pela
oportunidade de fazer parte de um projeto de pesquisa relacionado
à área de Biotecnologia de Alimentos, pelo incentivo, carinho,
amizade e ensinamentos transmitidos com sua inteligência durante
a trajetória científica.
À minha co-orientadora Deborah Quintanilha Falcão pelos
ensinamentos transmitidos durante o curso, pela sabedoria,
amizade, disposição e auxílio.
À Universidade Federal Fluminense e ao Programa de Pós
Graduação em Ciências Aplicadas a Produtos a Saúde pela
oportunidade de realização do curso.
À Fundação Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de
Nível Superior (CAPES), pela bolsa de mestrado.
À Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado
do Rio de Janeiro (FAPERJ) pelo apoio financeiro permitindo a
realização e concretização deste trabalho.
À professora Josiane Roberto Domingues pelo auxilio nas análises
realizadas no espectrofotômetro do Instituto de Química da UFF,
assim como pelas orientações durante o estágio em docência, pela
sabedoria, carinho e amizade.
À professora Silvana Vianna Rodrigues, do Laboratório de
Cromatografia do Instituto de Química da UFF, pela permissão
para uso do espectrofotômetro de varredura.
Aos Laboratórios de Bromatologia, Tecnologia Farmacêutica e
Controle Físico-Químico da Faculdade de Farmácia da UFF pela
oportunidade de realização do preparo do iogurte, dos estudos de
estabilidade, das etapas de inclusão molecular e pela utilização do
espectrofotômetro.
Ao Laboratório de Cromatografia Líquida de Alimentos da
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA), em
especial ao Dr. Ronoel Godoy e ao Analista Sidney Pacheco pela
realização das etapas de análise cromatográfica do extrato de
pimentão vermelho.
Ao Centro Brasileiro de Pesquisas Físicas (CBPF) pela utilização
do analisador de tamanho de partícula e potencial Zeta e pelas
análises de Infravermelho.
Ao Laboratório de Ressonância Magnética da UFF.
Ao Instituto Nacional de Tecnologia (INT), em especial a Drª
Valéria Gonçalves Costa, pela realização das análises de DSC.
À bolsista de iniciação cientifica Nicolly Petito pelo auxílio
durante a realização de todas as etapas essenciais do trabalho, pelo
carinho, paciência, amizade e pelos momentos de descontração no
laboratório.
Aos meus pais, Rosa e Joaquim, pela educação, amor e apoio,
além da confiança depositada em meus estudos.
Ao meu marido Carlos Gomes, que sempre esteve ao meu lado
durante toda a minha vida acadêmica, acompanhando, e
incentivando as minhas escolhas. Pelo auxílio e ensinamentos
ofertados relacionados formatação do trabalho. Agradeço pelo
companheirismo nos finais de semana no laboratório.
Às amigas e colegas de trabalho do Laboratório de
Biotecnologia de Alimentos (LABIOTEC), Francine Albernaz,
Beatriz Corrêa, Thaís Passos, Isabela Moreira, Roberta Rizzo,
Gabriela Pepe, Nicolly Petito, Vitória Gomes e Fabiana
Lindenberg pela amizade, auxílio, descontração e companheirismo
durante as viagens de congresso.
Ao professor Caio Pinho Fernandes pela disponibilidade, atenção e
ensinamentos ofertados em relação às análises de RMN.
A todos que colaboraram direta ou indiretamente na realização
deste trabalho.
RESUMO
O uso das ciclodextrinas como agente encapsulante é uma tecnologia que melhora a
solubilidade e aumenta a estabilidade de substâncias frente a fatores químicos e ambientais. O
objetivo do presente trabalho foi conduzir a inclusão de carotenoides extraídos do pimentão
vermelho (Capsicum annuum L.) em ciclodextrinas, visando favorecer a sua solubilidade e
estabilidade frente a fatores envolvidos no processamento e armazenamento de alimentos.
Inicialmente, testes foram realizados para escolha dos solventes mais adequados sendo eleita a
mistura etanol: água (90:10), seguida da partição com hexano, para extração dos pigmentos. A
determinação dos principais pigmentos presentes no extrato foi realizada por cromatografia
líquida de alta eficiência (CLAE) identificando-se a capsantina, capsorubina, β-caroteno, β-
criptoxantina, 13-cis- β-Criptoxantina e 9 cis- β- caroteno. Os testes preliminares de inclusão
molecular que foram realizados com α-, β- e metil-β-ciclodextrina, indicaram a β-
ciclodextrina como sendo a mais adequada para dar seguimento aos experimentos. A escolha
do procedimento de inclusão foi feita com base nos resultados obtidos com os ensaios de
caracterização, em especial o rendimento e a eficiência de inclusão. O procedimento de
inclusão molecular entre o extrato e a β-ciclodextrina com sonda de ultra-som demonstrou
maior rendimento (54,48 %) e eficiência de inclusão (62,43%) comparado ao processo com
agitação magnética, que apresentou os valores de 40,49% e 52,95%, respectivamente. Os
complexos obtidos através dos dois procedimentos de inclusão molecular foram
caracterizados por espectrofotometria no infravermelho, ressonância magnética nuclear de
hidrogênio (RMN1H), análise térmica diferencial (DSC), tamanho e distribuição de partícula,
e potencial Zeta. As caracterizações indicaram que sonda de ultra-som promoveu maior
interação entre o extrato e a β-ciclodextrina comparado ao procedimento com agitação
magnética. A atividade antioxidante do extrato e do complexo obtidos foram avaliados pelo
método ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity), e demonstrou que o complexo
apresentou maior atividade antioxidante comparado ao extrato. O complexo obtido por sonda
de ultra-som e o extrato de pimentão vermelho foram utilizados em experimentos para avaliar
o efeito combinado das variáveis pH, temperatura e tempo de aquecimento sobre a
estabilidade da cor, e os resultados demonstraram que o extrato está mais sujeito a ação dos
parâmetros avaliados em comparação ao complexo, indicando que a inclusão em β-
ciclodextrina elevou a estabilidade da cor do extrato do pimentão vermelho em solução. As
mesmas amostras também foram adicionadas em iogurte para avaliar a estabilidade da cor
durante sessenta dias de armazenamento. Os resultados revelaram que o complexo promoveu
maior proteção da cor comparado ao iogurte que recebeu extrato não complexado. Em
conclusão, a inclusão do extrato de pimentão vermelho em β-ciclodextrina usando sonda de
ultra-som foi eficiente para obtenção de complexo com bom rendimento e eficiência de
inclusão, além de colaborar para a elevação da estabilidade da cor frente a parâmetros que
podem estar envolvidos no processamento e armazenamento de alimentos.
Palavras-chave: pimentão vermelho, carotenoides, β-ciclodextrina, inclusão molecular, ultra-
som, agitação magnética.
ABSTRACT
The use of cyclodextrins as encapsulating agent is a technology that improves the solubility
and increases stability of the substances in front of chemical and environmental factors. The
aim of the present work was carry the inclusion of carotenoids obtained from red bell pepper
(Capsicum annuum), in cyclodextrins, ordering promote its solubility and stability in front of
the factors involved in processing and storage of foods. Initially, tests were performed to
choose the most appropriate solvents, being elected the ethanol:water (90:10) mixture,
followed by partition mixture solvents hexane:acetone to extraction of the pigments. The
determination of the major pigments was carried by hight performance liquid chromatography
(HPLC) identifying capsanthin, capsorubin, β-carotene, β-cryptoxanthin, 13-cis-β-
cryptoxanthin and 9 cis-β-carotene. Preliminary tests of molecular inclusion which were
carried with α-,β-and metil-β-cyclodextrins indicated β–cyclodextrins as being more
appropriate to follow up the experiments. The selection of the inclusion procedure was based
on the results obtained with characterizations tests, in particular, the yield and inclusion
efficiency. The procedure inclusion molecular of the extract in β–cyclodextrin by ultrasound
probe showed higher yield (54,48 %) and inclusion efficiency (62,43%) compared to
magnetic stirring,which showed values of 40,49% and 52,95%, respectively. The complexes
obtained by both molecular inclusion procedure were characterized by fourier transform-
infrared spectroscopy, nuclear magnetic resonance (RMN1H), differential scanning
calorimetry (DSC), size and particle distribution and Zeta potential. The characterizations
indicated that the ultrasound probe promoted greater interaction between the extract and β–
cyclodextrin compared to magnetic stirring. The antioxidant activity of the obtained extract
and complex were available by ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) method, and
demonstrated that the complex showed higher antioxidant activity compared to extract. The
complex obtained by ultrasound probe and the extract from red bell pepper were used in the
experiments to asses the combined effect of the variables pH, temperature and heating time on
the color stability, and the results showed that the extract is more liable to the action of these
parameters compared with the complex, indicating that the inclusion in β-cyclodextrin
increased the color stability from the red bell pepper extract while in solution. The same
samples were added in yogurt to assess the color stability during sixty days of storage. The
results revealed that the complex promoted a greater color protection compared to the added
yogurt extract not complexed. In conclusion, the inclusion of the red bell pepper extract in β-
cyclodextrin using ultrasonic homogenizer was efficient to the complex obtention with a good
yield and inclusion efficiency, beside collaborating to the color stability elevation in front of
the parameters that may be involved in the processing and storage of foods.
Key-words: red bell pepper, carotenoids, β-cyclodextrin, molecular inclusion, ultrasound,
magnetic stirring.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Porcentagem de uso de corantes, no mundo, pelas indústrias de alimentos
e bebidas.
20
Figura 2. Estrutura dos corantes artificiais do grupo azo. 21
Figura 3. Estrutura dos corantes artificiais do grupo trifenilmetano. 25
Figura 4. Estrutura dos corantes naturais permitidos para uso em alimentos no
Brasil.
29
Figura 5. Estrutura de alguns carotenoides. 33
Figura 6. Carotenoides precursores de vitamina A. 34
Figura 7. Estrutura das microcápsulas.
41
Figura 8. Descrição esquemática da microencapsulação.
42
Figura 9. Ilustração esquemática da inclusão do p-xileno por uma ciclodextrina. 43
Figura 10. Ligações glicosídicas α-1,4 através de pontes de oxigênio entre duas
moléculas de glicopiranose.
44
Figura 11. Estruturas de α, β e γ ciclodextrinas. 45
Figura 12. Fluxograma das etapas envolvidas no processamento dos pimentões
vermelhos.
50
Figura 13. Etapas de obtenção do extrato: partição com hexano (a e b) e evaporação
do solvente (c)
52
Figura 14. Etapas envolvidas no procedimento de inclusão utilizando dois
procedimentos: (a) solubilização da ciclodextrina em solução de
etanol:água, (b) inclusão molecular utilizando agitação magnética, (c)
inclusão molecular utilizando sonda de ultra-som, (d) filtração a vácuo
em membranas de celulose, (e) obtenção do depósito e (f) liofilização.
56
Figura 15. Extrato de pimentão vermelho obtido com a mistura hexano: acetona (a)
e etanol: água (b)
63
Figura 16. Perfil cromatográfico do extrato de pimentão vermelho, antes (a) e após
(b) a saponificação.
64
Figura 17. Espectros de absorção dos carotenoides presentes no extrato de pimentão
vermelho
65
Figura 18. Espectros de absorção no visível do extrato de pimentão vermelho
diluído nos solventes: etanol (curva azul), hexano (curva vermelha) e
diclorometano (curva verde).
67
Figura 19. Curvas de calibração com extrato solubilizado em etanol (a); extrato
solubilizado em hexano (b) e extrato solubilizado em diclorometano (c).
68
Figura 20. Parâmetros de cor L*, a* e b* avaliados para o extrato e complexo em
antes do tratamento térmico em pH 3 (a), 5 (b) e 7(c).
70
Figura 21. Soluções obtidas após a etapa de homogeneização do extrato em β-ciclodextrina, com agitação magnética (a) e sonda de ultra-som (b).
74
Figura 22. Espectros de infravermelho: β- ciclodextrina (a), extrato de pimentão
vermelho (b), mistura física (c), complexo de inclusão com ultra-som (d)
e complexo de inclusão com agitação magnética (e)
77
Figura 23. Análise Térmica Diferencial (DSC): β- ciclodextrina (verde), extrato de
pimentão vermelho (vermelho), mistura física (azul), complexo de
inclusão com etanol/ultra-som (lilás) e complexo de inclusão com
etanol/agitação magnética (preto)
78
Figura 24. Distribuição do tamanho de partícula: β- ciclodextrina (a), mistura física
(b), complexo de inclusão com ultra-som (c) e complexo de inclusão com
agitação magnética (d).
80
Figura 25. Espectro de RMN1H referente à região do carbono anomérico da (a) β-
ciclodextrina e (b) mistura física.
83
Figura 26. Espectro de RMN1H para (a) β- ciclodextrina, (b) complexo de inclusão
com ultra-som, (c) complexo de inclusão com agitação magnética e (d)
mistura física.
84
Figura 27. Atividade antioxidante do complexo de inclusão e do extrato de
pimentão.
86
Figura 28. Gráficos de Paretto indicando os efeitos do pH, temperatura e tempo de
aquecimento sobre o índice L* das soluções do extrato de pimentão
vermelho e do complexo β-ciclodextrina/extrato
88
Figura 29. Gráficos de Paretto indicando os efeitos do pH, temperatura e tempo de
aquecimento sobre o índice a* das soluções do extrato de pimentão
vermelho e do complexo β-ciclodextrina/extrato
89
Figura 30. Gráficos de Paretto indicando os efeitos do pH, temperatura e tempo de
aquecimento sobre o índice b* das soluções do extrato de pimentão
vermelho e do complexo β-ciclodextrina/extrato
89
Figura 31. Superfícies de resposta mostrando as variações do índice L* para extrato
e complexo em função do tempo e pH (temperatura fixa de 70 °C),
temperatura e pH (tempo fixo de 5 minutos) e tempo e temperatura (pH
fixo no valor de 5)
91
Figura 32. Superfícies de resposta mostrando as variações do índice a* para extrato
e complexo em função do tempo e pH (temperatura fixa de 70 °C),
temperatura e pH (tempo fixo de 5 minutos) e tempo e temperatura (pH
fixo no valor de 5)
92
Figura 33. Superfícies de resposta mostrando as variações do índice b* para extrato
e complexo em função do tempo e pH (temperatura fixa de 70 °C),
temperatura e pH (tempo fixo de 5 minutos) e tempo e temperatura (pH
fixo no valor de 5)
93
Figura 34. Iogurte adicionado do extrato de pimentão vermelho (a) e iogurte
adicionado de complexo (b)
95
Figura 35. Variação do índice L* (grau de azul/amarelo) de iogurtes sem adição de
corante (ISC), extrato bruto (ICE), complexo liofilizado (ICC) e corante
sintético amarelo crepúsculo (ICA) avaliados durante 60 dias (média ±
desvio-padrão)
96
Figura 36. Variação do índice a* (grau de azul/amarelo) de iogurtes sem adição de
corante (ISC), extrato bruto (ICE), complexo liofilizado (ICC) e corante
sintético amarelo crepúsculo (ICA) avaliados durante 60 dias (média ±
desvio-padrão)
97
Figura 37. Variação do índice b* (grau de azul/amarelo) de iogurtes sem adição de
corante (ISC), extrato bruto (ICE), complexo liofilizado (ICC) e corante
sintético amarelo crepúsculo (ICA) avaliados durante 60 dias (média ±
desvio-padrão)
98
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Corantes naturais permitidos no Brasil 28
Tabela 2. Exemplos de pesquisa em nanotecnologia, nanoprodutos e suas
aplicações na produção e controle de alimentos
40
Tabela 3. Composição do gradiente da fase móvel usada nas análises 53
Tabela 4. Variáveis e níveis utilizados no experimento 60
Tabela 5. Combinações de variáveis e níveis a serem usadas no experimento 61
Tabela 6. Resultados das análises de colorimetria do extrato solubilizado em
diferentes solventes
69
Tabela 7. Comparação entre a eficiência de extração e o número de extrações para
os diferentes procedimentos de extração realizados
73
Tabela 8. Comparação entre o rendimento e eficiência de inclusão obtidos por
diferentes procedimentos
74
Tabela 9. Diferenças de deslocamento químico do pico H (em ppm) entre a β-
ciclodextrina e o complexo de inclusão com ultra-som
82
Tabela 10. Diferenças de deslocamento químico do pico H (em ppm) entre a β-
ciclodextrina e o complexo de inclusão com agitador magnético
82
Tabela 11. Diferenças de deslocamento químico do pico H (em ppm) entre a β-
ciclodextrina e a mistura física
83
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 14
2 OBJETIVOS 17
2.1 Objetivo geral 17
2.2 Objetivos específicos 17
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 18
3.1 Importância da cor para a comercialização de alimentos 18
3.2 Corantes utilizados na indústria de alimentos 19
3.2.1 Corantes artificiais 19
3.2.1.1 Corantes do grupo azo 20
3.2.1.2 Corantes do grupo trifenilmetano 25
3.2.2 Corantes naturais 27
3.2.2.1 Características dos principais corantes naturais usados em alimentos 29
3.2.2.2 Carotenoides 32
3.2.2.2.1 Carotenoides encontrados no pime ntão vermelho 35
3.3 Nanotecnologia aplicada a alimentos 38
3.3.1 Inclusão molecular 43
3.3.1.1 Ciclodextrinas 44
3.3.2 Encapsulação de pigmentos 47
4 METODOLOGIA 50
4.1 Material 50
4.2 Processamentos do pimentão e obtenção dos extratos contendo carotenoides 50
4.3 Análises do extrato do pimentão vermelho 52
4.4 Inclusão dos pigmentos do extrato do pimentão em ciclodextrina 55
4.5 Determinação da eficiência de inclusão e caracterização do complexo obtido 57
4.6 Avaliação da estabilidade do complexo de inclusão em sistemas modelos, 59
frente a fatores importantes para o processamento de alimentos
4.7 Avaliação da estabilidade da cor de iogurte adicionado do complexo 61
carotenoides de pimentão/ciclodextrina
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 63
5.1 Obtenção do extrato de pimentão vermelho (Capsicum anumm L) 63
5.2 Análises do extrato de pimentão vermelho 64
5.2.1 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 64
5.2.2 Espectrofotometria de absorção na região do UV- visível 67
5.2.3 Espectrofotometria de reflectância 69
5.2.4 ORAC 71
5.3 Inclusão dos pigmentos de extrato de pimentão vermelho em ciclodextrinas 72
e determinação das eficiências de inclusão
5.4 Caracterização dos complexos obtidos 76
5.4.1 Espectrofotometria no Infravermelho (IV-TF) 76
5.4.2 Análise Térmica Diferencial (DSC) 79
5.4.3 Tamanho e Distribuição de Partículas e Potencial Zeta 80
5.4.4 Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN1H) 82
5.4.5 ORAC 86
5.5 Avaliação da estabilidade do complexo de inclusão em sistema modelo, frente a 87
fatores importantes para o processamento de alimentos
5.6 Avaliação da estabilidade da cor de iogurte adicionado do complexo carotenoides 95
de pimentão/ciclodextrina
6 CONCLUSÃO 100
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 102
1 INTRODUÇÃO
As mudanças ocorridas nos hábitos alimentares da população mundial nas últimas
décadas têm atraído atenção dos órgãos governamentais e da comunidade científica visto que
o elevado consumo de alimentos processados vem contribuindo para o empobrecimento da
dieta e o aparecimento de diversas doenças.
Além de a dieta ter sofrido modificações ao longo dos anos, a tecnologia empregada
pelas indústrias alimentícias com o objetivo de estender a vida de prateleira dos produtos tem
gerado questionamentos quanto à segurança dos aditivos químicos empregados em diversos
alimentos.
Segundo a Portaria Secretaria de Vigilância em Saúde/Ministério da Saúde 540/97,
aditivo alimentar é definido como qualquer ingrediente adicionado intencionalmente aos
alimentos, sem propósito de nutrir, com o objetivo de modificar as características físicas,
químicas, biológicas ou sensoriais, durante a fabricação, processamento, preparação,
tratamento, embalagem, acondicionamento, armazenagem, transporte ou manipulação de um
alimento. O emprego de aditivos químicos, como o corante, é um dos mais polêmicos avanços
da indústria alimentícia já que seu uso justifica-se por questões de hábitos alimentares, sendo
a aparência do produto a maior justificativa para empregá-lo. Sob o ponto de vista
toxicológico, vários estudos têm sido realizados para verificar os efeitos nocivos ao homem,
já que esses aditivos não são totalmente inofensivos à saúde podendo promover reações
adversas ao consumidor.
Os corantes são aditivos sem valor nutricional, introduzido nos alimentos e bebidas
com o único objetivo de conferir cor, tornando-o mais atrativos aos olhos do consumidor. Por
esse motivo, do ponto de vista da saúde, os corantes artificiais em geral não são
recomendados.
15
Os corantes artificiais permitidos no Brasil englobam aqueles dos grupos azo
(bordeaux S ou amaranto, amarelo crepúsculo, azorrubina, ponceau 4R, tartrazina e vermelho
40) e trifenilmetano (azul brilhante, azul patente V, verde rápido e eritrosina).Várias
publicações discutem os perigos para a saúde e toxicologia de corantes artificiais utilizados
como aditivos em alimentos. Os corantes do grupo azo foram relacionados ao
desenvolvimento de reações alérgicas, urticária, angioedema, indisposição gástrica e vômitos.
Os corantes do grupo trifenilmetano também já foram relatados como causadores de
hipersensibilidade em crianças, eczema e asma e devem ser evitados por indivíduos sensíveis
a purinas.
A indústria alimentícia depara-se com a necessidade de substituir os corantes
artificiais. Para isso, têm sido usados pigmentos naturais de vegetais, microrganismos ou
animais, ou substâncias sintéticas idênticas às naturais. No entanto, os corantes naturais não
são os preferidos para uso em alimentos, por questões de disponibilidade e baixa estabilidade.
O pimentão refere-se a um grupo de cultivares da espécie Capsicum annuum, muito
utilizado na culinária de todo o mundo. Os vários cultivares produzem frutos com diferentes
cores sendo as mais conhecidas a verde, a amarela e a vermelha. No Brasil é uma das mais
importantes hortaliças tanto em termos de volume de produção como em comercialização,
sendo valorizado pela sua cor atraente e sabor forte, propriedades sensoriais além de ser uma
boa fonte de compostos bioativos, como os carotenoides. A cor vermelha intensa é
característica da presença dos carotenoides capsantina e capsorubina, sintetizados durante o
amadurecimento.
Os carotenoides podem ser empregados como corantes em alimentos, no entanto,
diversos fatores relacionados a pH, temperatura, oxigênio, luz e baixa solubilidade em água
prejudicam a sua utilização como aditivo alimentar. A alternativa mais aplicada para aumentar
a estabilidade de carotenoides e permitir sua incorporação em ambiente hidrofílico é a técnica
de encapsulação que promove uma barreira física protegendo o pigmento sendo a inclusão
molecular de carotenoides na cavidade de ciclodextrinas um dos possíveis caminhos para
melhorar a solubilidade e estabilidade frente a fatores ambientais e químicos.
As ciclodextrinas são utilizadas extensivamente como aditivos para aumentar a
solubilidade de componentes orgânicos insolúveis em água a partir da formação do complexo
de inclusão com diversos tipos de moléculas. A formação de complexos altera
significativamente as características do substrato, incluindo modificações na reatividade
química do substrato, fixação de substâncias muito voláteis, melhoria na solubilidade de
compostos, estabilização de substâncias sensíveis à luz, calor e oxidação, proteção da
16
degradação de substâncias por microrganismos, mascaramento de corantes ou pigmentos e
atividade catalítica com substratos. Ocorrem ainda modificações nas propriedades espectrais
do substrato, na reatividade do substrato incluído e ele, inicialmente hidrofóbico, é tornado
hidrofílico sob complexação. A inclusão de substâncias em ciclodextrinas constituiu-se numa
aplicação da nanotecnologia, em função das pequenas dimensões das estruturas formadas com
a complexação. É importante considerar que, com a evolução da nanotecnologia, as
ciclodextrinas possam, pelo seu baixo custo, grande disponibilidade e baixa toxicidade, serem
empregadas para aumentar a solubilidade e a estabilidade dos carotenoides, viabilizando seu
emprego como aditivos alimentares.
Considerando a falta de dados na literatura sobre a estabilidade de complexos de
carotenoides/ciclodextrina com possível aplicação como corantes em alimentos, o presente
trabalho propõe um estudo sobre a inclusão de pigmentos carotenoides extraídos do pimentão
vermelho em ciclodextrinas, avaliando aspectos da sua estabilidade frente a fatores de
importância no processamento e armazenamento de alimentos, visando conhecer a viabilidade
da utilização dos pigmentos naturais do pimentão como corantes em alimentos e contribuir
para que sejam encontrados caminhos para a solução do problema relacionado ao polêmico
uso de corantes artificiais em produtos alimentícios.
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Conduzir a complexação de carotenoides extraídos do pimentão vermelho (Capsicum
annuum L) com ciclodextrinas, visando aplicação em alimentos.
2.2 Objetivos específicos
Extrair e caracterizar, por métodos cromatográficos, os pigmentos carotenoides do
pimentão vermelho;
Obter complexos carotenoides do pimentão/ciclodextrina usando diferentes métodos
de homogeneização;
Caracterizar os complexos obtidos e determinar a eficiência de inclusão;
selecionando um tipo de complexo para prosseguimento nos estudos;
Avaliar a estabilidade do complexo escolhido frente a fatores importantes no
processamento de alimentos (pH, temperatura e tempo);
Adicionar o complexo carotenoides do pimentão/ciclodextrina escolhido em iogurte
e avaliar a sua estabilidade de cor durante a vida útil do produto
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Importância da cor para a comercialização de alimentos
Os órgãos dos sentidos do ser humano captam cerca de 87% de suas percepções pela
visão, 9% pela audição e os 4% restantes por meio do olfato, do paladar e do tato. A
percepção da cor não se refere apenas à habilidade do homem em distinguir a luz de
diferentes comprimentos de onda. A cor é o resultado produzido no cérebro pelo estímulo
recebido quando a energia radiante penetra nos olhos, permitindo a distinção do verde, do
azul, do vermelho e de outras cores (CONSTANT; STRINGUETA; SANDI, 2002).
A cor e a aparência são atributos fundamentais, se não os mais importantes, para a
qualidade dos alimentos. Isso se deve à capacidade humana de perceber com facilidade esses
fatores, os quais são os primeiros a serem avaliados pelos consumidores no momento da
aquisição do produto. O fornecimento aos consumidores de alimentos mais nutritivos, seguros
e mais econômicos é viável, no entanto, se eles não são atraentes, sua aquisição não ocorrerá.
O consumidor também relaciona as cores à qualidade do alimento, as cores específicas das
frutas são associadas à maturação enquanto o vermelho brilhante da carne crua está associada
ao frescor (FENNEMA, 2010).
A função da adição de cores aos alimentos es tá relacionada à restituição da aparência
original (afetada durante as etapas de processamento, embalagem, estocagem ou distribuição),
tornar o alimento visualmente mais atraente (ajudando a identificar o aroma e o sabor
normalmente associados aos produtos), conferir cor aos desprovidos de cor e reforçar as cores
presentes nos alimentos (CONSTANT; STRINGUETA; SANDI, 2002). Sendo assim, o uso
de corantes em produtos alimentícios industrializados é necessário para a obtenção de
produtos com aparência mais próxima à dos alimentos naturais.
19
Corantes são substâncias ou mistura de substâncias que possuem a propriedade de
conferir, intensificar ou restaurar a cor dos alimentos e bebidas (BRASIL, 1997). Existem três
categorias de corantes permitidas na legislação para uso em alimentos: corantes naturais,
corante caramelo e corantes artificiais. Considera-se corante natural aquele obtido a partir de
vegetal ou de animal; corante caramelo aquele obtido a partir da reação de Maillard a partir de
açúcares e corante artificial aquele obtido por síntese orgânica (BRASIL, 1965).
3.2 Corantes utilizados na indústria de alimentos
3.2.1 Corantes artificiais
Com a descoberta dos corantes sintéticos nos séculos XVIII e XIX o interesse das
indústrias pelo uso dos corantes artificiais aumentou, inclusive na tentativa de mascarar
alimentos de baixa qualidade. Desde então, os corantes sintéticos têm sido cada vez mais
usado devido ao fornecimento amplo de uma gama de cores, proporcionando praticamente
todas as tonalidades do espectro visível de cor, além da alta estabilidade (frente a fatores
como luz, oxigênio, pH e calor), alto poder tintorial e custo de produção relativamente baixo
(PRADO; GODOY, 2003).
Os mesmo autores relatam que o emprego de materiais sintéticos para colorir teve
início em 1856 com a síntese do primeiro corante derivado do carvão mineral, desenvolvido
por William Henry Perkin, na Inglaterra. Desde então, nos Estados Unidos e Europa mais de
uma centena de corantes foram desenvolvidos e lançados no mercado. Muitos alimentos
foram coloridos indiscriminadamente, como ketchup, mostardas, geléias, e ainda outros que,
mesmo sob proibição, tiveram adição de corantes, como por exemplo, vinhos brancos de má
qualidade que foram transformados em vinhos tintos, acrescentando-se a eles taninos e
bordeaux S. Já foram relatados acréscimos de corantes artificiais em cervejas, cidras e
aperitivos.
Na Índia, 61,6% dos alimentos analisados em alguns estudos apresentavam em suas
composições corantes não permitidos por aquele país, sendo somente em Calcutá 13,1% dos
alimentos. No Egito ocorreram casos de adulteração de olivas negras com o uso de corantes
artificiais, o que é uma prática ilegal segundo sua legislação. Muitos desses aditivos nunca
foram testados para verificar sua toxicidade ou outros efeitos adversos à saúde da população
(PRADO; GODOY, 2003).
20
A Figura 1 apresenta a distribuição do uso de corantes em alimentos e bebidas no
mundo, mostrando o grande emprego desses aditivos pelas indústrias alimentícias.
Os corantes artificiais permitidos para uso em alimentos no Brasil classificam-se em
dois grupos, são eles: o grupo azo (bordeaux S ou amaranto, amarelo crepúsculo, azorrubina,
ponceau 4R, amarelo tartrazina, vermelho 40) e grupo trifenilmetano (azul brilhante FCF, azul
patente V, verde rápido e eritrosina) (BRASIL,1997).
Os produtos onde estes corantes são mais utilizados são em alimentos processados à
base de cereais, balas, caramelos e similares, coberturas e xaropes para gelados comestívei s e
sobremesas, geléia de cereja, gomas de mascar, iogurtes e leites aromatizados, leites
fermentados aromatizados, leites geleificados aromatizados, licores, preparados líquidos ou
sólidos para refrescos e refrigerantes, produtos de frutas, cereais, legumes e outros
ingredientes para uso em iogurtes, queijo tipo petit-suisse e similares, queijos, recheios de
bombons e similares, produtos de confeitaria, biscoitos e similares, refrescos e refrigerantes,
pós para sobremesas de gelatinas, flans e pudins (BRASIL, 1998).
3.2.1.1 Corantes do grupo azo
A classe dos corantes sintéticos do grupo azo compreende vários compostos que
apresentam um anel naftaleno ligado a um segundo anel benzeno por uma ligação azo (N=N).
Esses anéis podem conter um, dois ou três grupos sulfônicos. Esse grupo representa a classe
de corantes sintéticos mais importante e mais utilizada em alimentos (PRADO; GODOY,
2003).
Figura 1 - Porcentagem de uso de corantes, no mundo, pelas indústrias
de alimentos e bebidas (DOWNHAM; COLLINS, 2000).
21
As principais estruturas dos corantes artificiais do grupo azo utilizados em alimentos
no Brasil estão representadas na Figura 2.
O amaranto ou bordeaux S é um pó marrom avermelhado que dissolve rapidamente
em água para produzir uma solução vermelho-magenta ou vermelho-azulada. Apresenta boa
estabilidade à luz, calor e ácido, porém descolore em presença de agentes redutores como o
ácido ascórbico e SO2. Alguns estudos são contraditórios quanto à inocuidade carcinogênica
deste corante sendo, por medida de segurança, proibido nos Estados Unidos desde 1976. No
Canadá, é permitido o seu uso, pois sua estrutura química é bastante semelhante a outros
corantes considerados não carcinogênicos. Na Inglaterra seu uso é permitido em caráter
provisório até que se apresentem estudos mais conclusivos. No Japão foi voluntariamente
banido pelas indústrias de alimentos e na União Europeia seu uso é permitido (PRADO;
GODOY, 2003).
Figura 2 - Estrutura dos corantes artificiais do grupo azo
22
Segundo uma revisão realizada por Polônio e Peres (2009), no Município do Rio de
Janeiro, foram coletadas 43 amostras de bebidas não alcoólicas e não gaseificadas (bebidas
isotônicas, preparados sólidos para refresco, guaraná natural e xaropes de groselha). Usando a
técnica de cromatografia líquida de alta eficiência identificaram a presença e o tipo de
corantes. Foram encontrados os corantes amaranto em 37% das amostras, amarelo crepúsculo
em 33% e tartrazina em 28%, respectivamente. O amaranto esteve presente em 50% das
amostras do xarope de groselha em concentração acima da permitida pela legislação,
caracterizando fraude. Os autores alertaram para o fato da quantificação do teor de cora nte ter
sido realizada na amostra diluída como indicado no rótulo, porém, alguns consumidores,
principalmente as crianças, fazem uso desse produto muitas vezes na forma concentrada,
como em coberturas para sorvetes e bolos.
No Japão, foram avaliados se os aditivos alimentares mais consumidos no país
induziam danos no DNA dos ratos. A administração dos aditivos foi oral em até 0,5 x LD 50
(dose letal para 50 % dos animais) ou na dose limite de 2.000 mg/kg. O estudo demonstrou
danos no DNA em órgãos de ratos provocados por alguns aditivos.O amaranto (100 mg/kg)
provocou danos no DNA da bexiga. O corante tartrazina na dose ≥ 10 mg/kg induziu a danos
no DNA do estomago e cólon. Os demais corantes não acarretaram danos estatisticamente
significativos (SASAKI et al., 2002).
O amarelo crepúsculo é muito solúvel em água, apresentando uma solução amarelo-
laranja. Possui boa estabilidade na presença de luz, calor e ácido, sendo incolor na presença
de ácido ascórbico e SO2. Os Estados Unidos, Japão e países da União Europeia permitem seu
emprego em alimentos, já o Canadá permite seu emprego em al guns produtos específicos e
em concentração máxima de 300 ppm. No Brasil, o limite máximo (g /100 g) permitido em
alimentos pela legislação pode variar entre 0,005 e 0,01 g/ 100 g do produto dependendo do
tipo de alimento e a ingestão diária aceitável (IDA) por humanos pode variar entre 0 e 2,5
mg/kg peso corpóreo (PRADO ; GODOY,2003).
Estudo realizado por McCann et al. (2007) avaliou o comportamento hiperativo de
crianças com três e oito/nove anos de idade que receberam bebidas de frutas contendo vários
níveis de corantes. Os autores concluíram que os grupos de crianças que consumiram todas as
bebidas enriquecidas com aditivos apresentaram hiperatividade significativamente elevada
comparada as crianças que consumiram placebo. Os corantes identificados como potenciais
fatores causadores da hiperatividade e déficit de atenção foram o amarelo crepúsculo,
tartrazina, ponceau 4R, carmosina, amarelo de quinoleína e vermelho allura.
O corante tartrazina é um dos mais utilizados em todo o mundo para colorir alimentos,
23
medicamentos e cosméticos. Possui coloração laranja, é extremamente solúvel em água e
apresenta características semelhantes ao amarelo crepúsculo em termos de estabilidade e
descoloração (PRADO ; GODOY, 2003). A ingestão diária aceitável (IDA) por humanos
varia de 0 a 7,5mg /Kg de peso (TANAKA, 2006a).
Nas últimas décadas, estudos relacionados à falta de atenção e hiperatividade têm
atraído pesquisadores devido ao aumento de casos de crianças com esse distúrbio, sendo a
prevalência de 3 % a 5 % em idade escolar. A partir de 1975, deu-se inicio a discussão sobre a
função dos aditivos como desencadeadores da hiperatividade em crianças. Um estudo
realizado por Boris e Mandel (1994), mostrou o papel dos corantes artificiais no aparecimento
do transtorno do déficit de atenção e hiperatividade. Através de uma dieta de exclusão, os
sintomas desapareceram. Crianças atópicas com transtorno do déficit de atenção e
hiperatividade tiveram uma resposta benéfica e significativa com a dieta de eliminação do que
as crianças não atópicas.
Tanaka et al. (2008) avaliaram o efeito do corante tartrazina nos parâmetros
reprodutivo e neurocomportamental em ratos. O corante foi acrescentado à dieta para fornecer
níveis de 0% (controle), 0,05%, 0,15% e 0,45% (83, 259 e 773mg/kg/dia, respectivamente)
em ratos com cinco semanas de idade (geração F0) e nove semanas de idade (geração F1). O
estudo evidenciou que na geração F1, a atividade motora foi mais intensa nos ratos machos e
mais jovens, com a administração de 259 mg/kg/dia. Não foi observado nenhum efeito
adverso da tartrazina em relação à reprodução (tamanho da ninhada, peso da ninhada e relação
do sexo ao nascimento).
Pesquisas realizadas em 486 crianças hiperativas, entre 7 e 13 anos, demonstraram
que 60% reportavam problemas de aumento da hiperatividade quando do consumo de
alimentos e bebidas coloridos artificialmente. Em contraste, de 172 crianças controle apenas
12% apresentavam problemas associados a corantes artificiais. A hiperatividade das crianças
pode ser associada à diminuição de Zn e Fe no plasma sangüíneo e conseqüente aumento
destes na urina, quando em comparação com as crianças controle. Somente crianças
hiperativas apresentaram redução nos níveis de Zn no soro sangüíneo e aumento de Zn na
urina, após consumir os corantes tartrazina e amarelo crepúsculo. O amaranto não apresentou
alterações significativas durante o tempo de observação do experimento, que era de 120
minutos após a ingestão dos alimentos. De 23 crianças que consumiram bebidas contendo
tartrazina, 18 aumentaram os níveis de hiperatividade, 16 se tornaram agressivas e 4 se
tornaram violentas, 2 diminuíram seus movimentos, 12 tiveram diminuição da coordenação
motora e 8 desenvolveram asma ou eczema ( PRADO; GODOY, 2003).
24
No estudo realizado no Kuwait por Husain et al.(2006), foi analisada a ingestão de
corantes artificiais por crianças de 5 a 14 anos, com base em um inquérito dietético
(Recordatório 24 Horas). A amostra foi constituída por 3.141 alunos de ambos os sexos,
distribuídos em 58 escolas. Usando-se a técnica da cromatografia líquida de alta eficiência foi
determinado o teor de corantes em 344 itens consumidos. Compararam-se com as IDAs
recomendadas pela FAO (Food and Agriculture Organization) /OMS (Organização Mundial
da Saúde) no sentido de avaliar o potencial de risco associado ao consumo de corantes
artificiais. Os resultados indicaram que dos nove corantes permitidos, quatro (tartrazina,
amarelo crepúsculo, carmosina, e vermelho brilhante) excederam as IDAs para as crianças de
5 a 8 anos.
O vermelho 40 é um corante monoazo, apresenta boa estabilidade à luz, calor e ácido,
além de ser o corante vermelho mais estável para bebidas na presença do ácido ascórbico, um
agente redutor (PRADO; GODOY, 2003). Porém, o corante vermelho 40, assim como os
outros do grupo azo têm sido associado a possíveis efeitos mutagênicos e carcinogênicos. Nos
países da União Européia e no Canadá o seu uso é permitido.
Dados submetidos à FDA pela empresa possuidora da patente do corante vermelho 40
mostraram que após 41 semanas de observações, num estudo envolvendo 400 camundongos e
cujo tempo de duração deveria ser de 78 semanas, em 6 entre os camundongos alimentados
com rações contendo tal corante desenvolveu-se prematuramente e inesperadamente linfo-
sarcoma (SIMÃO, 1985).
O ponceau 4R possui coloração vermelha, é solúvel em água, produzindo uma solução
vermelho-alaranjada (TANAKA, 2006b).
Em um estudo realizado por Tanaka (2006b), o corante ponceau 4R foi fornecido em
dieta em níveis de 0 (controle), 0,12% e 0,48%, a camundongos de 5 semanas de idade da
geração F 0 até 9 semanas de idade da geração F1, e os efeitos na reprodução e em parâmetros
neurocomportamentais foram avaliados. Não houve efeito adverso do ponceau 4R nos
camundongos de tamanhos menores, pesos menores ou proporção de sexo no nascimento. A
média do peso do corpo da prole dos machos e fêmeas foi aumentada significativamente no
grupo de alta dose nos dias pós-natal 0, 4 e 21. O parâmetro de desenvolvimento
comportamental foi afetado significativamente no 4º dia pós o nascimento, no grupo de altas
doses da prole dos machos. Na performance múltipla no labirinto em água, na geração F1, o
tempo levado foi significativamente mais longo do que nos grupos de dose moderada e
elevada em machos, e estes efeitos foram significativamente relacionados à dose (p < 0,01). O
nível máximo que não provocou a observação de efeitos adversos foi 0,12% na dieta
25
(aproximadamente 205 mg/Kg por dia) para machos na geração F1. Contudo, os níveis
moderados e altos estavam em excesso em relação a ingestão diária aceitável de Ponceau 4R
(0 – 4,0 mg/Kg peso), e a ingestão de ponceau 4R na dieta atual em humanos é muito menor.
Parece, portanto, que no nível de ingestão deste corante sintético é incomum produzir
qualquer efeito adverso reprodutivo ou neurocomportamental em humanos.
O ponceau 4R foi banido do comércio nos Estados Unidos, mas continua a ser
utilizado em outros países. Na Inglaterra, o seu uso é restrito e provisório, nos países da União
Européia e no Japão seu uso é permitido, mas foi voluntariamente banido pelas industriais
japonesas. Isso se deve aos poucos estudos relevantes realizados sobre sua toxidez (PRADO;
GODOY, 2003).
3.2.1.2 Corantes do grupo trifenilmetano
Os corantes da classe trifenilmetano (Figura 3) apresentam estrutura básica de três
radicais arila, em geral grupos fenólicos, ligados a um átomo de carbono central e apresentam,
ainda, grupos sulfônicos que lhes conferem alta solubilidade em água (PRADO ; GODOY,
2003).
N
SO3 -
N
SO3Na
NaO3S
N
SO3 -
N
SO3Na
NaO3S
OH
CO2Na
O O
I
I
I
I
NaO
SO3 -
N
SO3
HO
N
++
Azul brilhanteVerde rápido
Eritrosina
+
Azul patente
Figura 3 - Estrutura dos corantes do grupo trifenilmetano
26
O azul brilhante apresenta coloração púrpura e quando dissolvido em água resulta em
uma solução azul esverdeada. É usado como corante artificial em alimentos e possui uma IDA
de 0 – 12,5mg/Kg de peso corpóreo (WALTON et al.,1999).
A excreção do azul brilhante FCF foi investigada em ratos, coelhos e cães após uma
única administração oral (200 mg). Menos de 5% do corante foi absorvido em algumas das
espécies estudadas, com a maioria excretada nas fezes. Posteriormente, estudos foram
realizados com as mesmas espécies e nenhuma absorção e nem metabolismo foi detectado em
ratos ou porcos. Em termos da sua toxicocinética, este composto é absorvido apenas de forma
limitada em todas as espécies estudadas até agora e é excretado praticamente inalterado nas
fezes (ibidem).
O corante artificial eritrosina apresenta coloração vermelha, é muito solúvel em água o
que facilita o seu uso em alimentos, drogas e cosméticos (TANAKA, 2001). O “Joint Expert
Comittee on Food Additivies” (JECFA), classificou a eritrosina como aceitável para uso em
alimentos e determinou, em 1974, uma IDA de 0 a 2,5 mg/kg peso corpóreo (ANTUNES;
ARAÚJO, 2000)
Um estudo realizado com administração de eritrosina na dieta de ratos nos seguintes
níveis: 0 (grupo controle), 0,005, 0,015 e 0,045% a partir de quinta semana de idade da
geração F0 até a nona semana de idade da geração F1.Os parâmetros reprodutivos e
neurocomportamentais foram selecionados para avaliação. Os resultados demonstraram que
este corante apresentou alguns efeitos significantes em tais parâmetros e a alta dose de
eritrosina (0,045%) produziu alguns efeitos no comportamento. Contudo, o nível de alta dose
(67 - 261mg/Kg/dia) foi excedente a IDA para este corante artificial (0 - 0,1mg/Kg de peso
corporal) (TANAKA, 2001).
Segundo a revisão de Walton et al. (1999), a eritrosina induziu alterações nos
hormônios da tireóide em ratos em concentração de 3,3 mg/kg de peso/dia, e, acima deste
nível, adenomas e carcinomas são observados em ratos. Acredita-se que, em ratos, este
corante inibe a conversão de tiroxina (T4) em triiodotironina (T3), resultando em aumento da
produção e liberação de TSH (hormônio estimulante da tireóide) pela glândula pituitária. A
liberação de TSH pode estimular a proliferação de células na tireóide, resultando em
hiperplasia e uma subseqüente formação de tumor.
Abdel-Aziz et al. (1997), avaliaram o efeito da eritrosina na reprodução dos
camundongos machos investigando sua influência na espermatogênese. Os resultados
apontaram redução significativa da atividade da enzima LDH-X (isoenzima dehidrogenase
láctica) no testículo dos animais que ingeriram o corante na dose de 18 mg/kg durante 21 dias
27
consecutivos. A administração do referido corante para o mesmo intervalo de tempo nas doses
de 68 e de 136 mg/kg acentuou ainda mais a alteração. Observou-se redução nos níveis de
espermatozóides entre os camundongos que receberam eritrosina por 21 dias consecutivos nas
doses de 68 mg/kg-1 para 50,8% e de 136mg/kg-1 para 33,9%. Além disso, a mobilidade dos
espermatozóides mostrou diminuição significativa após consumo do corante nas doses de 68 e
de 136 mg/ kg-1 para 57% e 80,5% dos camundongos, respectivamente. A incidência de
espermatozóides com cabeças anormais no grupo controle foi de 19,83%, e de 57,1% e 64,7%
nos grupos que receberam doses de 68 e de 136 mg/kg-1, respectivamente. Nesse estudo, o
corante eritrosina desencadeou ação tóxica em células germinativas dos camundongos machos
interferindo de forma significativa na espermatogênese.
3.2.2 Corantes naturais
Embora os corantes naturais apresentem desvantagens (baixa estabilidade e alto custo)
frente aos corantes artificiais, os naturais têm sido utilizados há anos sem evidências de danos
à saúde. Portanto, apesar das desvantagens, a substituição por corantes naturais é gradativa na
indústria alimentícia, pois conferem ao produto aspecto natural, o que aumenta a aceitação
pelo consumidor (CONSTANT; STRINGUETA; SANDI, 2002). A Tabela 1 apresenta os
corantes naturais permitidos como aditivos alimentares no Brasil (BRASIL, 1977). As
estruturas químicas de alguns corantes naturais permitidos no Brasil estão representadas na
Figura 4.
28
Tabela 1- Corantes naturais permitidos no Brasil.
Classificação Corantes
Orgânico Natural
Curcumina
Riboflavina
Ácido Carmínico
Urzela
Clorofila
Caramelo I,II,III e IV
Carvão vegetal
Vermelho de beterraba, betanina
Antocianinas
Carotenoides:
- α, β e γ-carotenos
- bixina, norbixina
- capsantina, capsorubina
- licopeno
Xantofilas:
- flavoxantina, luteína
- criptoxantina
- rubixantina
- violaxantina
- rodoxantina
- cantaxantina
Fonte: BRASIL, 1977.
29
3.2.2.1 Características dos principais corantes naturais usados em alimentos
O ácido carmínico é extraído a partir de fêmeas do inseto Dactylopius coccus Costa
(cochonilha) que vive como parasita sobre cactus da América Central e América do Sul
(CONSTANT; STRINGUETA; SANDI, 2002). A fêmea se fixa nas plantas onde cresce e se
reproduz, em um ciclo que dura cerca de dois meses (FERRAZ, 2007). O processo de
obtenção do carmim, a partir dos insetos, consiste basicamente na extração aquosa, filtração,
precipitação, secagem, moagem e esterilização, sendo finalmente envasado (TABAR et al.,
OH
OH
OH OH
O
O
Glicose COOH
Ácido Carmínico
O
OH
OH
R2
OH
HO +
R1
Antocianinas
O
O Cantaxantina
O O
OMe
OHOH
MeO
N
H
HOOC COOH
N+
RR
Curcumina
Betalaínas
β-criptoxantina
Figura 4: Estrutura de corantes naturais permitidos para uso em
alimentos no Brasil.
30
2003). O termo cochonilha é empregado para descrever tanto os insetos desidratados como o
corante vermelho. Apresenta solubilidade em água e a sua coloração depende do pH do meio.
Em pH baixo adquire a cor laranja, tornando-se vermelho na faixa de 5,0 a 7,0 e violeta na
região alcalina. Entretanto, apresenta intensidade de coloração relativamente baixa, o que
restringe a sua aplicação comercial (CONSTANT; STRINGUETA; SANDI, 2002).
O corante está presente na maioria dos iogurtes, sorvetes, gelatinas e até em embutidos
de carne. O seu consumo internacional vem aumentando nos últimos anos devido ao uso em
indústrias de alimentos. No Brasil, não se produz carmim porque não existem condições
ideais para a produção de matéria prima que gera o pigmento. Já houve tentativa de
implementação da cultura da cochonilha no Brasil, mas o inseto tornou-se uma praga no
sertão nordestino. A produção do ácido carmínico por meio do processamento dos animais
que infestam o sertão é inviável devido às condições climáticas encontradas na Re gião
Nordeste. A principal origem desse inseto é peruana e atualmente, o Peru concentra a
produção de carmim com cerca de 800 toneladas por ano. O preço do quilo de cochonilhas
previamente secas após a extração é de cerca de 15 a 20 dólares podendo aumentar em safras
menores. Para a extração de um quilo de ácido carmínico é preciso o processamento de seis a
oito quilos de cochonilhas (MORAES, 2005).
Os alimentos aos quais adiciona-se o carmim comercial podem conter resíduos
protéicos do inseto no carmim comercial. Por esta razão, pesquisadores defendem e
comprovam a idéia de que alguns corantes naturais podem apresentar riscos à saúde como
potencial alergênico, incluindo asma e reação anafilática provocada pelo carmim. Assim, uma
comissão científica avalia as IDAs e estipula recomendações de uso seguro, sendo que, para o
corante natural carmim estes valores devem estar na faixa de 0-5,0 mg/kg peso corpóreo/dia.
No Brasil, o corante natural carmim é de uso tolerado em alimentos e bebidas (VOLP,
RENHE ; STRINGUETTA, 2009).
As antocianinas são pigmentos encontrados apenas em vegetais e são dominantes em
muitas frutas e flores. Pertencem ao maior grupo de pigmentos solúveis em água difundido no
reino vegetal e são capazes de absorver fortemente a luz na região do espectro visível,
conferindo uma infinidade de cores entre o laranja, o vermelho, o púrpura e o azul,
dependendo do meio em que se encontram (CONSTANT; STRINGUETA; SANDI, 2002). A
principal desvantagem da utilização do pigmento como corante está relacionada à degradação
sofrida durante a extração do vegetal, processamento e estocagem de alimentos. A degradação
pode ser influenciada por vários fatores: pH, temperatura, enzimas, acido ascórbico, oxigênio,
dióxido de enxofre, íons metálicos (ferro) (RIBEIRO; SERAVALLI, 2007).
31
As betalaínas são pigmentos que contém betacianinas (vermelho) e betaxantinas
(amarelo) e estão presentes em plantas que possuem cores semelhantes às plantas que contêm
antocianinas. Sua cor não é afetada pelo pH, ao contrário do comportamento das antocianinas
(FENNEMA,2010). Elas são hidrossolúveis e a sua estabilidade é influenciada por fatores
como ar, luz, temperatura, pH, radiação, atividade de água e contaminação por íons metálicos.
A temperatura é o fator que mais influencia a estabilidade desse corante durante o
processamento e armazenamento de alimentos. Alguns estudos relataram aumento nas taxas
de degradação da betalaína resultante do aumento de temperatura (AZEREDO, 2009).
Portanto os corantes extraídos de beterraba são adequados apenas para produtos que não
sofram tratamentos térmicos severos como derivados de carne e soja, gelatinas e sorvetes
(RIBEIRO; SERAVALLI, 2007).
Dentre suas propriedades funcionais, as betalaínas são identificadas como um
antioxidante natural. Após estudos de biodisponibilidade, alguns autores sugerem que as
betalaínas estão envolvidas na proteção da partícula de LDL-colesterol contra modificações
oxidativas. Tesoriere et al. (2004) avaliaram as concentrações de vitamina E, β -caroteno e
betalaínas incorporadas nas partículas de LDL-colesterol após a ingestão de 500 g da fruta
“cactus pear” (Opuntia fícus-indica) por 8 voluntários saudáveis. Após a ingestão, as
concentrações de vitamina E e β-caroteno na partícula de LDL-colesterol não modificaram
significativamente, diferentemente da concentração de betalaínas que, quanto mais
incorporavam nas partículas LDL-colesterol, mais resistente ao estresse oxidativo estas
partículas se demonstravam.
A curcumina é o principal corante, com coloração amarelo limão brilhante e
alaranjado, presente nos rizomas da cúrcuma (Curcuma longa). Além de ser utilizada como
corante e condimento, apresenta substâncias antioxidantes que lhe conferem a possibilidade
de emprego em alimentos. A curcumina pura não é ideal para aplicação direta em alimentos,
devido a sua insolubilidade em água sendo necessário convertê-la em forma adequada para
uso, além de ser sensível a luz, fator que usualmente limita o seu emprego em alimentos
(CONSTANT; STRINGUETA; SANDI, 2002).
Dentre seus possíveis efeitos biológicos comprovados por estudos científicos, a
curcumina é um potente antioxidante que protege os componentes celulares contra danos
oxidativos e contra o câncer, principalmente dos cânceres de pele e de mama (BIANCHI;
ANTUNES, 2004; JAYAPRAKASHA; RAO; SAKARIAH, 2006). Tem sido relatada sua
ação na inibição, promoção e progressão de cânceres, pois pode inibir a peroxidação lipídica.
A curcumina do “curry” indiano foi capaz de inibir a angiogênese induzida pelo fator de
32
crescimento de fibroblastos-2 (FGF-2), propriedade importante para a diminuição da
formação de metástases neoplásicas (DOWNHAN ; COLLINS, 2000; FINLEY, 2005).
O corante caramelo apresenta coloração marrom escuro, é obtido a parti r de açúcares
pelo aquecimento a temperatura superior ao seu ponto de fusão (CONSTANT;
STRINGUETA; SANDI, 2002). É um corante muito utilizado em indústrias de bebidas,
principalmente, mas também em produtos cárneos, assados e proteína vegetal texturizada,
podendo ser utilizado para imitar marcas de grelha nos hambúrgueres (WADE, 2006). A
adição de caramelo na formulação de produtos é um desafio visto que a solubilidade dos
ingredientes é dependente do pH e requer conhecimento do ponto isoelétrico dos pigmentos.
Nas bebidas, a precipitação deste corante natural ou aromatizantes sólidos pode ocorrer se não
houver cuidado em conhecer a química dos produtos e sua interação com o caramelo (WADE,
2004).
3.2.2.2 Carotenoides
A denominação carotenoide é derivada do nome científico da cenoura (Daucus
carota). Estes pigmentos podem ser divididos em carotenos contendo apenas carbono e
hidrogênio (carotenoides hidrocarbonados), representados pelos α, β e γ- caroteno, licopeno e
bixina, e em xantofilas, que são compostos de carbono, hidrogênio e oxigênio (carotenoides
oxigenados), representados pela capsorubina, capsantina criptoxantina, zeaxantina, xantofila e
luteína. Junto com as antocianinas, é a classe mais complexa de corantes alimentares naturais,
com cerca de 750 estruturas diferentes já identificadas (MORTENSEN, 2006).
Os carotenoides (Figura 5) constituem um dos mais importantes grupos de pigmentos
naturais devido à larga distribuição, diversidade estrutural e inúmeras funções. São
responsáveis pela coloração amarelo laranja e vermelha das frutas, hortaliças, flores, algas
bactérias, fungos, leveduras e animais, que apesar de não sintetizarem tais moléculas, podem
obtê-las a partir da ingestão dietética (RIBEIRO; SERAVALLI, 2007).
33
Figura 5 – Estrutura de alguns carotenoides.
O principal papel dos carotenoides na dieta dos seres humanos é a sua capacidade de
atuarem como precursores de vitamina A. A atividade vitamínica dos carotenoides é
determinada pela presença do anel β-ionona em sua estrutura. O todo trans-β-caroteno
apresenta dois anéis, enquanto os demais carotenoides apresentam apenas um, sendo 100%
convertido em retinol. Sendo assim, o β-caroteno é considerado como fonte principal de
vitamina A, equivalendo a duas moléculas de retinol (Figura 6) (THURNHAM, 2007).
Embora o β-caroteno apresente a maior atividade de pró-vitamina A, outros de consumo
comum como o α-caroteno e β-criptoxantina também desempenham atividade de pró-
vitamina A (FENNEMA, 2010).
Os benefícios gerados à saúde decorrentes desses compostos incluem a manutenção da
saúde ocular, função epitelial, desenvolvimento embrionário e função do sistema
imunológico. Estima-se que os carotenoides pró-vitamínicos A presentes em frutas e vegetais
forneçam de 30 a 100% da exigência de vitamina das populações humanas (FENNEMA,
2010).
34
Figura 6: Carotenoides precursores de vitamina A (PACHECO, 2009)
Essas substâncias podem estar relacionadas com a redução do risco de
desenvolvimento de doenças como a degeneração macular em mulheres entre 50 e 79 anos de
idade (MOELLER et al., 2006), inibição da atividade carcinogênica (NISHINO et al., 2002)
e redução de cataratas (GALE et al., 2001).
O carotenoide de ocorrência mais comum nos tecidos vegetais é o β-caroteno que
também é utilizado como corante em alimentos. No grupo de aditivos, há também a
capsantina e capsorubina (presentes no pimentão vermelho - Capsicum annuum L.), bixina
(sementes de urucum) e a crocina (presentes no açafrão). Outros carotenoides encontrados em
alimentos incluem zeaxantina, violaxantina, neoxantina e β-criptoxantina (FENNEMA, 2010).
As moléculas de carotenoides possuem um sistema de duplas ligações que constitui o
grupo cromóforo responsável pela cor que proporciona aos alimentos. São ligações carbônicas
conjugadas. O aumento do número de ligações conjugadas resulta em bandas de absorção em
comprimentos de ondas maiores e, neste caso, os carotenoides tornam-se mais vermelhos. As
duplas ligações podem ocorrer na configuração trans ou cis, sendo a forma trans mais
freqüentemente encontrada na natureza. O processamento e a estocagem de alimentos podem
provocar isomerização das moléculas de carotenoides e levar a perda de cor (RIBEIRO;
SERAVALLI, 2007).
35
Apesar das limitações impostas pela instabilidade química, os carotenoides possuem
muitas vantagens, incluindo toxicidade baixa, cores altamente desejáveis e de alta resistência
tintorial e atividade de pró-vitamina A, estabilidade na presença de agentes redutores (ácido
ascórbico) (PARKINSON; BROWN, 1981).
Os carotenoides oxidam com muita facilidade na presença de luz, calor, metais,
enzimas, devido à presença do grande número de ligações duplas conjugadas e, a partir de
reações, ocasionam perdas da sua coloração em alimentos, sendo seus principais mecanismos
de degradação. A estabilidade à oxidação de um pigmento em particular é dependente do seu
ambiente. Em seu ambiente natural, os carotenoides são relativamente estáveis, mas tornam-
se sensíveis à luz e temperatura, sendo facilmente decompostos após trituração do vegetal e
extração com solventes, respectivamente. A cadeia de polienos é o grande responsável pela
instabilidade dos carotenoides, ou seja, a sua susceptibilidade à oxidação por oxigênio ou
peróxidos e isomerização causados pelo calor, luz ou químicos (SCHWEIGGERT et al.
2007).
Além da baixa solubilidade em água, os fatores químicos, físicos e ambientais,
limitam o uso de carotenoides como corante em alimentos. Atualmente, estudos estão sendo
realizados com a finalidade de proteger esses pigmentos frente aos fatores citados
anteriormente e tornando-os dispersíveis em água, facilitando a sua utilização em produtos
alimentícios em substituição aos corantes artificiais.
3.2.2.2.1 Carotenoides encontrados no pimentão vermelho
Valorizado pela sua cor atrativa sendo as mais conhecidas a amarela, verde e
vermelha, e sabor forte, o pimentão (Capsicum anumm, L) é consumido amplamente ao redor
do mundo. No Brasil, como em outros países, é uma das hortaliças mais importantes em
termos de volume de produção e valor comercial. Alem das propriedades sensoriais, é
considerado uma boa fonte de carotenoides (AZEVEDO-MELEIRO;RODRIGUEZ –
AMAYA, 2009).
O cultivo de pimentão (Capsicum anumm, L) é uma atividade significativa para o
setor agrícola brasileiro e de muitos países. No Brasil, é responsável por cerca de 13.000
hectares de área cultivada, com a produção de aproximadamente 280.000 toneladas de frutos,
figurando entre as dez hortaliças mais importantes do Brasil (RIBEIRO; CRUZ, 2002). A
produção de pimentão existe em todos os estados da federação, assumindo lugar de destaque
36
no estado do Rio de Janeiro onde a produção estadual gira em torno de 26,4 toneladas por ano
(CESAR et al., 2007).
Os pimentões também são boas fontes de vitamina C e E, pró-vitamina A, flavonóides
e compostos fenólicos. Esses componentes são antioxidantes e podem reduzir as reações de
oxidação no corpo humano e prevenir várias doenças associadas com oxidação de radical livre
tais como doenças cardiovasculares, câncer e desordens neurológicas (SUN et al., 2007).
O pimentão vermelho tem ganho importância na indústria de processamento de
alimentos devido à presença maciça de pigmentos naturais na polpa de seus frutos maduros.
As xantofilas (capsantina e capsorubina) são os principais carotenoides responsáveis pela
coloração vermelha, respondendo por 65-80% da cor total dos frutos maduros. Tais pigmentos
são empregados como corantes em diversas linhas de produtos alimentícios processados como
molhos, sopas em pó de preparo instantâneo, embutidos de carne, principalmente salsicha e
salame, além de corante em ração para aves (RIBEIRO; CRUZ, 2002).
Os frutos do pimentão vermelho são utilizados, desde os tempos antigos, como fonte
de pigmentos para adicionar ou modificar a coloração dos produtos alimentícios tornando o
mais atrativo e aceitável para o consumidor. Os pigmentos vermelhos do pimentão são
acompanhados por outras xantofilas e carotenos como zeaxantina, β-criptoxantina,
violaxantina, anteraxantina e β-caroteno. O padrão e as concentrações do pigmento
carotenoide variam de acordo com o cultivo e estágio de maturação (SCHWEIGGERT et al.,
2007).
Capsantina e capsorubina contêm um e dois anéis acil-ciclo-pentanol,
respectivamente, e são pigmentos responsáveis pela coloração vermelha da espécie Capsicum
anumm. Durante o amadurecimento dos frutos dessa espécie, os níveis dos pigmentos
capsantina e capsorubina aumentam e ocorre a esterificação desses pigmentos com ácidos
graxos (BIACS et. al., 1989; SANDMANN, ROMER; FRASER, 2006). Os diésteres de
capsantina e capsorubina isolados de C. annuum mostraram ser potentes inibidores de
tumores in vitro, e capsantina e capsantina esterificada (3’-ester e 3,3’ ester) exibiram potente
atividade inibidora de tumores in vivo (MAOKA et al., 2001).
Os carotenoides presentes no pimentão são isoprenóides com 40 átomos de carbono,
contendo nove duplas ligações conjugadas e uma cadeia de polieno no centro, embora com
diferentes grupos finais cuja mudança das propriedades cromóforas de cada pigmento,
permite a classificação em vermelho ou amarelo (HORNERO-MÉNDEZ; GOMEZ-
LADRON; MÍNGUEZ-MOSQUERA, 2000).
Kim, Park e Hwang (2004) identificaram os principais pigmentos presentes em
37
extratos saponificados de pimentão vermelho (capsantina, capsorubina, zeaxantina, β-
criptoxantina e β-caroteno). Muitos pesquisadores relatam composições diferentes
possivelmente relacionadas ao estágio de amadurecimento e aos cultivares (SUN et al., 2007).
No estágio de amadurecimento, apresentando coloração vermelha, o conteúdo de capsorubina
e capsantina aumentou (HORNERO-MÉNDEZ;GOMEZ-LADRON;MÍNGUEZ-
MOSQUERA, 2000).
Durante o amadurecimento, as xantofilas são progressivamente esterificadas com
ácidos graxos, resultando em uma infinidade de carotenoides não-esterificados e seus
correspondentes mono e diésteres. Devido à esterificação, os carotenoides mais lipofílicos são
mais facilmente incorporados no interior da membrana aumentando o poder de coloração, que
é uma característica importante da qualidade de produtos comerciais (SCHWEIGGERT et al.,
2007).
Kim, Park e Hwang (2004) avaliaram a estabilidade dos pigmentos de pimentão
vermelho em diferentes métodos de secagem e armazenamento. Os resultados demonstraram
que, em relação ao processo de secagem (liofilização) utilizado, os conteúdos de capsantina,
zeaxantina, β-criptoxantina e β-caroteno não apresentaram diferença estatística quando se
utilizou tanto o método de secagem A (70 ºC/6 h ) quanto o método de secagem B ( 80º C/ 5 h
seguido de 60ºC/18 h). Porém, amostras que foram secas pelo método A apresentaram-se
mais estáveis do que o método B durante o armazenamento a 0º e 20ºC. Sob altas
temperaturas, a diferença no método de secagem teve maior influencia na estabilidade até o
segundo mês de armazenamento; após o segundo mês, a temperatura de armazenamento, ao
invés do método de secagem, tornou-se o principal fator relacionado à estabilidade da
capsantina .
Pérez-Gálvez e Mínguez – Mosquera (2001) avaliaram a relação entre a taxa de
degradação e a estrutura dos pigmentos do pimentão em uma mistura de fruto desidratado
com substrato lipídico de diferentes graus de instauração e em diferentes proporções (20 e 40
%). Os resultados revelaram que a capsorubina apresentou menor taxa de auto-oxidação,
podendo ser atribuída a sua propriedade estrutural: os grupos ceto situados no final da cadeia
poliênica, provavelmente, elevam a estabilidade, favorecendo o deslocamento do elétron ao
longo da cadeia de ligações duplas conjugadas. Consequentemente existe menor tendência de
continuidade do processo oxidativo. No caso da capsantina, seu único grupo ceto
provavelmente não contribui para a estabilização, já que concentra a carga do elétron no final
da cadeia próximo ao grupo funcional, aumentando a reatividade e, conseqüentemente, a
oxidação. A baixa taxa de auto-oxidação conferida pelo grupo ceto é uma propriedade
38
interessante tanto no âmbito comercial (menores perdas das propriedades cromáticas,
especialmente a coloração vermelha) quanto nutricional, visto que a incorporação desses
carotenoides via alimentação os torna disponíveis como antioxidantes.
3.3 Nanotecnologia aplicada a alimentos
Em 1959, o físico americano, Richard Feynman, introduziu o conceito de manipulação
da matéria em escala atômica no encontro anual da Sociedade Americana de Física no
“Califórnia Institute of Technology”, servindo como base, anos depois, para o
desenvolvimento da nanotecnologia. Em 1974, Nario Taniguchi, cientista japonês, inventou o
termo nanotecnologia ao descrever a manipulação de partículas com menos de um
micrômetro de diâmetro. A nanotecnologia envolve a pesquisa, desenvolvimento de
tecnologia, e controle das estruturas em escala nanométrica (QUINTANILLA-CARVAJAL et
al. 2009).
A nanotecnologia tem sido aplicada em vários campos, como o eletrônico, o da
comunicação, de produção de energia, da medicina e da indústria de alimentos. As aplicações
da tecnologia na indústria de alimentos podem incluir sistemas de nanopartículas (micelas,
lipossomas, nanoemulsões, nanopartículas de biopolímeros), segurança alimentar, e
biossegurança (CHAU; WU; YEN, 2007). As vendas mundiais de produtos oriundos da
nanotecnologia no setor de alimentos e embalagens cresceu de 150 milhões de dólares em
2002 para 860 milhões de dólares, em 2004 (QUINTANILLA-CARVAJAL et al. 2009). Um
relatório recente divulgado pela empresa de consultoria Científica (HELMUT KAISER
CONSULTANCY, 2006), prevê que até 2012 o valor de mercado global referente às
aplicações nanotecnológicas no setor de alimentos deverá alcançar 5.8 bilhões de dólares
(GREINNER, 2009).
Segundo Chau; Wu; Yen (2007), embora os cientistas afirmem que a indústria de
alimentos já aceitou a nanotecnologia, poucas pesquisas utilizando a tecnologia em questão
foram realizadas em alimentos, e o desenvolvimento global dos nanoalimentos está de fato em
seu estágio inicial, visto que a indústria está percebendo o potencial relacionado a esta
tecnologia. Em 2000, a Kraft Foods iniciou o seu primeiro laboratório de nanotecnologia e o
consórcio “Nanotek” envolvendo 15 universidades
ao redor do mundo e laboratórios de pesquisa nacional (ETC GROUP, 2005).
Em 2004, foi estimado que existiam mais de 180 aplicações da nanotecnologia em
39
vários estágios de desenvolvimento em indústrias de alimentos em todo o mundo (IFST,
2006; PCAST, 2005). Em março de 2006, uma pesquisa de mercado estimou que mais de 200
fabricantes empregavam a nanotecnologia, sendo 59% destes produtos para a saúde e fitness e
9% produtos alimentícios (CHAU, WU ; YEN, 2007).
As atividades de pesquisa relacionadas às aplicações da nanotecnologia no setor de
alimentos inclui o aprimoramento do sabor, cor, “flavor”, textura e consistência dos produtos,
aumento da absorção e biodisponibilidade de nutrientes e compostos bioativos, melhora da
qualidade, vida de prateleira e segurança dos alimentos devido aos materiais de embalagens
com propriedades de barreira e antimicrobianas, nanosensores para rastreabilidade e
monitoramento das condições dos alimentos durante o transporte e armazenamento
(CHAUDHRY et al., 2008).
Exemplos de pesquisas em nanotecnologia, nanoprodutos e suas aplicações na
produção e controle de alimentos, entre 2004 e 2006, estão resumidos na Tabela 2.
40
Tabela 2 - Exemplos de pesquisa em nanotecnologia, nanoprodutos e suas aplicações na
produção e controle de alimentos.
Categoria Exemplos de diferentes aplicações
Processamento de
Alimentos
Embalagens
Liberação de
Nutracêuticos
Segurança e
Desenvolvimento
de sensores
Alimentos e bebidas interativas proporcionando sabores e cores
desejadas pela adição de nanocápsulas.
Desenvolvimento de formulações em escala nanométrica de diferentes
ervas tradicionais pela redução das ervas a pó ou emulsões.
Nanotubos micrométricos, a base de proteína do leite, através de
agregação, possuem potencial para uso como agentes de viscosidade,
geleificação, nanoencapsulação e para liberação controlada de
substâncias.
Adição de nano compostos ou nanopartículas em materiais de
embalagens para garantir melhor proteção dos alimentos pela
modificação da permeabilidade, aumento das propriedades de barreira
contra gás e umidade bem como as mecânicas e de resistência ao
aquecimento, bloqueio da luz ultravioleta, propriedades relacionadas a
eliminação de oxigênio, desenvolvimento de superfícies
antimicrobianas e antifúngicas, incorporação de nanosensores ou
indicadores para monitorar e relatar as condições do alimento
(embalagens “inteligentes”).
A nanotecnologia torna substâncias hidrofílicas solúveis em gordura e
lipofílicas solúveis em água, permitindo que nanopartículas de
ingredientes funcionais (ex:.carotenoides, fitoesteróis e antioxidantes)
fiquem dispersas em água ou sucos da fruta aumentando sua
biodisponibilidade.
Nanopartículas sintéticas de licopeno foram desenvolvidas e aprovadas
pelo FDA para uso em alimentos nos Estados Unidos.
Nanoesferas de proteína do soro de leite (40 nm), que podem ser
internalizadas por células e degradadas no interior das mesmas para
liberação de substâncias bioativas, podem ser usadas como carreadoras
para administração oral de substâncias nutracêuticas, melhorando a sua
biodisponibilidade.
Dispositivos revestidos de proteína, que vibram a uma freqüência
determinada, são novos tipos de sensores de silicone ultrapequenos,
para a detecção de vírus, bactérias e outros patógenos. Quando os
patógenos caem sobre o dispositivo, a alteração de massa causa
alteração na freqüência de vibração, permitindo a detecção rápida.
Nanopartículas de prata tem sido incorporada em diferentes produtos a
partir de ligações a refrigeradores para suprimir a propagação de
bactérias e outros microrganismos.
Fonte: Adaptada de CHAU; WU; YEN, 2007.
41
Apesar do potencial que esta tecnologia tem demonstrado, os aspectos legais
relacionados à manipulação e consumo de materiais de dimensões nanométricas aplicados em
alimentos são importantes para decidir sobre o consumo destes produtos. Atualmente, as
informações disponíveis sobre os riscos associados à manipulação de produtos em escala
nanométrica são limitadas (CHAU; WU; YEN, 2007).
A encapsulação de substâncias, com propósitos diversificados, apresenta-se como uma
das possíveis aplicações da nanotecnologia nos vários setores envolvendo produtos destinados
à saúde. A encapsulação é o processo pelo qual ingredientes ativos são embalados dentro de
um material de parede. O tamanho das partículas formadas pode variar, sendo classificadas
como macrocápsulas (tamanho de partícula (TP) superior a 5.000 µm), microcápsulas (entre
1,0 e 5.000 µm) e nanocápsulas (TP inferior a 1,0 µm) (JAFARI et al., 2008).
Dentre as principais estruturas formadas estão as microcápsulas de núcleo único ou as
microcápsulas de núcleos múltiplos (Figura 7). As primeiras são produzidas geralmente
através de coacervação, secagem em leito fluidizado, co-extrusão de gotas e inclusão
molecular, e o núcleo representa grande proporção da massa da microcápsula (por exemplo,
90% da massa total da cápsula). Em cápsulas de núcleos múltipos, que são produzidas
principalmente através de spray drying, o material do núcleo está disperso através do material
de parede e a área central é ocupada por vácuo, resultante da expansão das partículas nas
etapas finais de secagem. Várias técnicas, que incluem microscopia eletrônica de varredura
podem ser utilizadas para investigar as estruturas externas e internas das microcápsulas
(ibidem).
Várias técnicas têm sido desenvolvidas para a obtenção de materiais alimentícios
encapsulados, como mostra a Figura 8. Carboidratos, proteínas do leite e diversos
biopolímeros constituem as três principais classes de materiais usados para
microencapsulação (ibidem).
Figura 7 – Estruturas de microcápsulas (JAFARI et al., 2008)
42
Os métodos físicos e físico-químicos mencionados na figura 8 fornecem partículas
com diâmetros na faixa de 3 a 800 μm. Em contraste, o método de inclusão molecular ocorre
em nível molecular, onde moléculas individuais são aprisionadas ou incluídas dentro da
Amidos (maltodextrinas, amidos modificados),
proteínas (proteínas do leite, gelatina), gomas, outros materiais (ciclodextrinas,
lipossomas)
Propriedades: Baixa reatividade com o material de
núcleo, proteger contra fatores ambientais durante o processamento e a estocagem,boa economia e
funcionalidade, completa liberação do material de núcleo sob condições desejadas, boas propriedades reológicas e solubilidade
Microencapsulação
Métodos físicos: spray drying,
spray cooling, leito fluidizado, extrusão, liofilização, co-extrusão
Métodos químicos: inclusão molecular,
polimerização interfacial
Métodos físico-químicos:
coacervação,
aprisionamento em lipossomas
Material de parede
Microcápsulas
Material de núcleo
Objetivos: Reduzir reatividade a fatores externos
(luz, O 2, água), melhorar manipulação e propriedades de fluxo, controlar o tempo de liberação, mascarar sabores desagradáveis
Substâncias de aroma, óleos, aditivos alimentares, substâncias
e ingredientes bioativos
Figura 8 – Descrição esquemática da microencapsulação (JAFARI et al., 2008)
43
cavidade presente em moléculas de carreadores. Os carreadores deste tipo mais conhecidos
são as ciclodextrinas (REINECCIUS; REINECCIUS; PEPPARD, 2002).
3.3.1 Inclusão molecular
A inclusão molecular ocorre em nível molecular, utilizando ciclodextrinas como
carreadores. As ciclodextrinas são oligossacarídeos cíclicos compostos de diversas unidades
de glicose. Forma-se uma estrutura em anel, caracterizada por uma superfície externa
hidrofílica (polar) e uma cavidade hidrofóbica (apolar) permitindo a formação de complexos
de inclusão com vários compostos (LÓPEZ-DE-DICASTILLO et al., 2010),
A formação do complexo depende de um ajuste geométrico entre a molécula a ser
incluída e a cavidade da molécula hospedeira, além da afinidade química entre ambas. O
número de unidades de glicose da ciclodextrina determina o diâmetro interno e o volume da
cavidade. Assim, a β-ciclodextrina é adequada para formar complexos com compostos
aromáticos e heterocíclicos (AZEREDO, 2005).
A inclusão de uma molécula hóspede na cavidade da ciclodextrina consiste
basicamente de uma substituição das moléculas de água presentes no seu interior por
moléculas de menor polaridade que a água (Figura 9). O processo é energeticamente
favorecido pela interação da molécula hóspede com a cavidade hidrofóbica do hospedeiro
(ASTRAY, 2009).
Figura 9 – Ilustração esquemática da inclusão do p-xileno por uma ciclodextrina
(MATIOLI; MORAES; ZANIN, 2000).
Considera-se que a força motriz para a complexação deve ser resultado de vários
efeitos: substituição de um estado energeticamente desfavorável, resultante da interação
polar/apolar entre as moléculas de água incluídas e a cavidade hidrofóbica da ciclodextrina,
por um estado energético mais favorável criado pela interação apolar-apolar entre a molécula
44
hóspede e a cavidade da ciclodextrina), interações Van der Waals entre o hóspede e a
ciclodextrina e ligações de hidrogênio entre a molécula hóspede e a ciclodextrina (ASTRAY,
2009).
A formação de complexos de inclusão altera significativamente as características do
substrato. Estas alterações incluem modificações na reatividade química do substrato, fixação
de substâncias muito voláteis, melhoria na solubilidade de compostos, estabilização de
substâncias sensíveis à luz, calor e oxidação, proteção da degradação por microrganismos,
mascaramento ou remoção dos aromas indesejáveis e estabilidade de pigme ntos naturais.
(VENTURINI et al., 2008).
3.3.1.1 Ciclodextrinas
As ciclodextrinas são formadas pela ação de enzimas denominadas ciclodextrina-
glicosil transferases sobre o amido, sendo este o processo utilizado na produção industrial das
mesmas. O processo de obtenção das ciclodextrinas consiste de quatro fases: cultura do
microrganismo que produz a enzima ciclodextrina glicosil transferase; separação,
concentração e purificação da enzima do meio de fermentação; conversão enzimática do
amido pré-hidrolizado na mistura de dextrinas cíclicas e acíclicas; e separação das
ciclodextrinas da mistura, sua purificação e cristalização. Enzimas ciclodextrina-glicosil
transferase degradam o amido e produzem reações intramoleculares sem a participação da
água. No processo, dextrinas cíclicas e acíclicas são formadas, que são oligossacarídeos de
tamanho intermediário. A forma cíclica produzida ou ciclodextrinas são formadas pela ligação
entre unidades de glicose que constitui a dextrina. A união é feita através de pontes de
oxigênio de ligações glicosídicas α-1,4 (Figura 10) (ASTRAY, 2009).
Existem três tipos de ciclodextrinas naturais obtidas com maior rendimento, a α-
Figura 10 – Ligações glicosídicas α -1,4 através de pontes de oxigênio
entre duas moléculas de glicopiranose (ASTRAY, 2009).
45
ciclodextrina, β- ciclodextrina e a γ- ciclodextrina, com 6, 7 e 8 unidades de glicose,
respectivamente (Figura 11). Estes compostos possuem em sua estrutura grupos hidrolixas
primários e secundários orientados para o exterior. Assim, possuem exterior hidrofílico
(polar) podendo dissolver-se na água com facilidade, ao mesmo tempo em que disponibiliza
uma cavidade interna hidrofóbica (apolar). Tal cavidade permite às ciclodextrinas complexar
moléculas que apresentem dimensões compatíveis e alterar suas propriedades físico-químicas,
como solubilidade em água, estabilidade e biodisponibilidade (FRACETO et al., 2007).
Figura 11– Estruturas de α, β e γ ciclodextrinas (ASTRAY, 2009).
Em termos de absorção, as ciclodextrinas são metabolizadas principalmente pela flora
do cólon e os seus produtos de degradação são posteriormente metabolizados e absorvidos
como os do amido. A principal diferença entre o metabolismo do amido e o das ciclodextrinas
é que o amido é degradado no intestino delgado, enquanto que as ciclodextrinas são
degradadas no cólon. Já as ciclodextrinas metiladas, apresentam a particularidade de serem
resistentes às amilases bacterianas do trato gastrointestinal, sendo eliminadas íntegras pelas
fezes (SALTÃO; VEIGA, 2001).
Até a década de 1930 a sua utilização em humanos era discutível, uma vez que,
aparentemente, apresentavam toxicidade elevada. Apenas a partir de 1970, estudos
toxicológicos adequados foram realizados e garantiram a segurança no seu uso, levando a um
aumento significativo nas pesquisas nesta área (VENTURINI et al., 2008).
Estudos de toxicidade mostraram que são moléculas seguras quando administradas por
via oral. Em doses superiores a 600 mg/kg a β-ciclodextrina não revelou qualquer efeito
adverso no peso corporal, no crescimento, nos valores dos índices bioquímicos e
46
hematológicos de ratos e cães, não sendo observado mutagenicidade ou teratogenicidade com
doses inferiores a 400 mg/kg (SZEJTLI, 1990).
As ciclodextrinas são capazes de formar complexos do tipo receptor-substrato,
servindo como um ambiente único para reações químicas e habilidade para formar complexos
de inclusão com várias substâncias. Por este motivo, vem sendo muito utilizada em produtos
industriais, tecnológicos e em métodos analíticos. A partir de uma seleção da ciclodextrina
apropriada, ela pode ser utilizada como ingrediente de fármacos, em alimentos ou cosméticos
(VENTURINI et al., 2008).
Os aspectos legais do uso de ciclodextrina em alimentos diferem entre países. Nos
Estados Unidos, as α-, β- e γ-ciclodextrinas são incluídas na lista de aditivos “generally
recognized as safe” (GRAS), que compreende a lista de aditivos alimentares que são
reconhecidos como seguros pelo FDA. No Japão, as ciclodextrinas são reconhecidas como
produtos naturais e sua comercialização no setor de alimentos é restrito apenas pelas
considerações de pureza. Na Austrália e Nova Zelândia, a α- e γ-ciclodextrinas foram
classificadas como alimentos novos a partir de 2004 e 2003, respectivamente (CRAVOTTO et
al., 2006). No Brasil, a β-ciclodextrina é reconhecida como aditivo para alimentos com a
função de estabilizante e espessante (BRASIL, 2006) e a α-ciclodextrina está incluída na lista
de novos ingredientes da ANVISA desde 2009 (BRASIL, 2009).
A recomendação para o nível máximo de β-ciclodextrina em alimentos é de
5 mg/kg peso corpóreo por dia. Para α e γ-ciclodextrinas nenhuma ingestão diária aceitável
(IDA) foi definida (ASTRAY, 2009).
Nos últimos anos, ciclodextrinas têm sido recomendadas para aplicações no
processamento e como aditivos em alimentos com os seguintes objetivos: proteger compostos
lipofílicos que são sensíveis a degradação térmica, por ação da luz ou do oxigênio, solubilizar
corantes alimentares e vitaminas; estabilizar fragrâncias, aroma, vitaminas e óleo essenciais
contra mudanças desconhecidas; suprimir odores ou sabores desfavoráveis e conseguir uma
liberação adequada de certos constituintes alimentares (VENTURINI et al., 2008)
O sabor influencia a satisfação do consumidor e o consumo de alimentos. Alguns
fatores como o armazenamento, materiais de embalagem e ingredientes em alimentos
freqüentemente causam modificações no sabor pela redução da intensidade de compostos
responsáveis pelo aroma ou a produção de componentes ativos no sabor. Portanto, a
encapsulação de ingredientes voláteis antes de usá-lo em alimentos e bebidas é benéfica para
limitar essas alterações. Atualmente, diversos produtos comerciais são encapsulados, porém
aqueles envolvendo a formação de complexos de inclusão molecular ciclodextrina/sabor
47
oferece um grande potencial para a proteção de materiais voláteis e/ou flavorizantes instáveis,
presentes em alimentos submetidos ao processamento industrial. A adição de β-ciclodextrina
como estabilizante pode reter alguns compostos aromáticos em matrizes de alimentos durante
os processos térmicos (cozimento, pasteurização e esterilização comercial) (JOUQUAND ;
DUCRUET; GIAMPAOLI, 2004).
A formação de complexos de inclusão com ciclodextrinas pode proteger alguns
componentes lipofílicos dos alimentos que são sensíveis ao oxigênio e aquecimento ou à luz
induzindo degradação. Os danos mecânicos sofridos pelos vegetais e tecidos de frutos, na
produção de sucos, pode promover o escurecimento enzimático. A fim de evitar tais efeitos,
frutos e vegetais podem ser tratados com ciclodextrina removendo a enzima polifenol oxidase
de sucos a partir da complexação, além de proteger componentes fenólicos de oxidações
enzimáticas (ASTRAY, 2009).
Uma aplicação interessante das ciclodextrinas na indústria de alimentos é como material
de embalagem, promovendo dois efeitos benéficos: redução residual de voláteis orgânicos
contaminantes e melhoria das propriedades de barreiras, otimizando as características
sensoriais enquanto mantêm a qualidade e segurança do alimento (ibidem).
3.3.2 Encapsulação de pigmentos
Nos últimos anos, novas tecnologias surgiram com a intenção de manter os pigmentos
naturais, presentes em alimentos, inalterados durante o seu processamento e armazenamento
evitando assim a sua oxidação. Entre as tecnologias existentes, destacam-se a encapsulação
que é capaz de aumentar a estabilidade, promover melhor solubilidade, evitar alterações de
cor e perda de aroma e, consequentemente, aumentar o tempo de vida de prateleira dos
produtos alimentícios (NUNES ; MERCADANTE, 2007).
As exigências do mercado consumidor e os estudos toxicológicos realizados com
corantes sintéticos têm incentivado a substituição por corantes naturais. No entanto, além de
mais caros que os sintéticos, os pigmentos naturais são muito instáveis quimicamente. Alguns
trabalhos foram realizados envolvendo a encapsulação destes pigmentos possibilitando a sua
dispersão em água e facilitando o emprego em alimentos (AZEREDO, 2005).
Um estudo envolvendo a microencapsulação de licopeno extraído da goiaba foi
realizado por Matioli e Rodriguez-Amaya (2003) utilizando as ciclodextrinas como
encapsulantes. O carotenoide foi extraído da goiaba, dissolvido e adicionado a α-, β- e γ-
48
ciclodextrinas. Inicialmente, foi investigado a complexação com as três ciclodextrinas em
razão molar licopeno: ciclodextrina de 1:50. A mudança de cor foi avaliada
espectrofotometricamente. Foi observado que com o uso da α- ciclodextrina a inclusão não
aconteceu, pois o licopeno ficou na superfície da solução. Com a β-ciclodextrina foi obtida
uma solução laranja clara com um precipitado no fundo do tubo. E, com a γ-ciclodextrina a
solução apresentou uma coloração laranja forte sem precipitado no fundo do tubo. Ambos
complexos mantiveram-se dispersíveis em água. O licopeno cmplexado com γ-ciclodextrina
após seis meses de testes manteve a cor original, já com a β-ciclodextrina foi reduzido em
torno de 80%. A inclusão foi máxima com o uso de γ-ciclodextrina quando a razão molar foi
de 1:200. A estabilidade à luz mostrou-se excelente, com 100% de retenção em quarenta dias
de monitoramento a temperatura ambiente.
Nunes e Mercadante (2007) complexaram cristais de licopeno em β-ciclodextrinas
utilizando as razões molares de 1:1 e 1:4 a partir da homogeneização das soluções de extrato
em diclorometano e ciclodextrina em água produzidas. Após overnight a -18° C adicionou-se
água e em seguida procedeu-se a filtração para reter o material não complexado e o filtrado,
contendo o complexo, foi liofilizado. Os resultados demonstraram que na razão de 1:4, 50 %
do licopeno adicionado permaneceram no filtro, enquanto que na razão molar 1:1 utilizada,
não houve formação do complexo, ficando todo o licopeno retido no filtro.
Provenzi et al. (2006) estudaram a influência da β- ciclodextrinas e γ- ciclodextrinas
sobre a estabilidade de antocianinas extraídas da casca de uvas Cabernet Sauvignon (Vitis
vinifera L.), sob presença e ausência de luz e nitrogênio, em temperatura de 15ºC e pH 3,5. As
amostras controle (sem ciclodextrina) apresentaram menores valores de absorbância e de
tempo de meia vida em relação às amostras testes, o que sugere uma proteção da cor pela
adição de ciclodextrinas. A atmosfera interferiu na meia vida de todas as amostras avaliadas,
sendo que a presença de nitrogênio conferiu valores superiores quando comparados com as
amostras na ausência de nitrogênio. A presença de luz interferiu de forma negativa na
estabilidade do pigmento. Os pesquisadores concluíram que a γ–ciclodextrina associada à
ausência de luz, e a presença de nitrogênio trazem perspectivas para uso das antocianinas de
uva Cabernet Sauvignon como corante em alimentos líquidos e pH inferior a 3,5.
A incorporação de carotenoides em alimentos que não contém quantidades elevadas
desses componentes podem oferecer efeitos benéficos a saúde relacionados à prevenção de
diversas doenças e promoção de novos produtos alimentícios no mercado. Sendo assim, o
desenvolvimento de estratégias que possam otimizar a estabilidade e melhorar a solubilidade
49
dos pigmentos carotenoides é extremamente essencial na aplicação desses ingredientes
bioativos em alimentos (BRITTON,1995; POLYAKOV; LESHINA, 2006).
50
4 METODOLOGIA
4.1 Material
Foram utilizados cerca de 20 kg de pimentão vermelho (Capsicum anumm L) no
estádio ótimo de maturação, adquiridos no comércio varejista do Estado do Rio de Janeiro,
para extração dos pigmentos carotenoides.
4.2 Processamento do pimentão e obtenção dos extratos contendo carotenoides
Os pimentões vermelhos foram submetidos às etapas de lavagem em água corrente,
remoção dos talos e das sementes e cortados em tiras com aproximadamente 1 cm de
espessura para otimizar a secagem. Os pimentões em tiras foram desidratados em estufas
ventiladas sob temperatura de 55 ºC, por cerca de 24 horas, e o material seco foi submetido a
moagem em liquidificador industrial.Os procedimentos foram realizados na Faculdade de
Farmácia e na Escola de Engenharia da UFF. A Figura 12 demonstra as etapas envolvidas no
processamento do pimentão vermelho.
Em relação à etapa de obtenção dos extratos, testes foram realizados com a mistura
dos solventes hexano:acetona (1:1) e etanol:água (90:10), cuja finalidade era avaliar o tempo
de extração e rendimento do extrato.
Figura 12- Fluxograma das etapas envolvidas no processamento dos pimentões
Os pimentões foram lavados em água corrente, os talos e sementes
removidos e cortados em tiras
uniformes
Secos em estufa ventilada a 55° C/
24 horas
Material seco Moagem Escolha do solvente para
extração dos pigmentos
51
No primeiro teste, 10 g do material seco em pó foram transferidos para um frasco tipo
erlenmeyer contendo 100 mL da mistura dos solventes hexano:acetona (1:1). Em seguida, a
amostra permaneceu macerando e a troca dos solventes foi realizada em dias alternados até a
completa exaustão na extração dos pigmentos. Após a etapa de extração, os solventes foram
eliminados em rotaevaporador (Fisatom ®), sob baixa pressão e temperatura de 35°C e o
extrato obtido foi pesado pra cálculo do rendimento. No segundo teste, usando a mistura de
solventes etanol:água (90:10), manteve-se a quantidade de material seco em pó utilizado e os
procedimentos de extração foram semelhantes àqueles realizados no primeiro teste. No
entanto, a solução obtida contendo a mistura de solventes e extrato foi submetida a partição
com hexano com a finalidade de separar a solução em duas fases distintas, apolar e polar,
sendo a fase apolar contendo os pigmentos carotenoides. O processo de partição consistiu da
transferência de 50 mL da solução citada anteriormente para um funil de separação onde
adicionou-se 50 mL de solvente hexano e 20 mL da solução de cloreto de sódio ( NaCl) a 10
%. Em seguida esse conteúdo foi agitado manualmente e mantido sob repouso por alguns
minutos para promover a separação das fases. A fração hexânica foi recuperada e o solvente
eliminado em rotaevaporador, a 35 °C, sob baixa pressão. O extrato livre de solvente foi
mensurado para cálculo do rendimento. Todos os procedimentos de extração foram efetuados
ao abrigo da luz.
A partir dos resultados obtidos dos testes realizados com os solventes foi possível
escolher aquele que apresentou menor tempo de extração e rendimento satisfatório. Sendo
assim, iniciou-se a extração dos pigmentos presentes no pimentão vermelho utilizando a
mistura de solventes escolhida. O material total em pó obtido (1,613 kg) foi transferido para
três frascos tipo erlenmeyer, sendo que em dois deles adicionou-se, em cada um, 637 g de
amostra em pó e 2.000 mL da mistura de solventes etanol:água e, no terceiro erlenmeyer,
adicionou-se 338 g do material em pó e 955 mL da mistura de solventes etanol: água (90:10).
As amostras permaneceram macerando, protegidas da luz, e o solvente foi trocado em dias
alternados até a exaustão da extração. A solução obtida contendo a mistura de solventes e
extrato foi submetida a partição com solvente hexano por diversas vezes até a coloração da
fase hexânica apresentar-se fraca, sugerindo saturação na transferência dos pigmentos da fase
polar para a apolar. O solvente hexano foi eliminado em rotaevaporador a 40 º C sob baixa
pressão e a fase etanol: água foi descartada. O extrato livre de solvente foi pesado para cálculo
do rendimento. A Figura 13 mostra as etapas envolvidas na obtenção do extrato.
52
4.3 Análises do extrato de pimentão vermelho
O extrato obtido foi analisado por cromatografia líquida de alta eficiência com
detector tipo “diode array detector” (CLAE-DAD) para separação e caracterização dos
carotenoides presentes. Primeiramente, o extrato foi saponificado com KOH metanólico a
10% durante 16 horas, no escuro em temperatura ambiente, para hidrólise dos ésteres de
carotenoides. Após saponificação, a amostra foi lavada e vestígios de água foram removidos
com adição de sulfato de sódio anidro. Para a etapa de separação e caracterização dos
carotenoides presentes no extrato, utilizou-se um cromatógrafo liquido de alta eficiência da
marca Waters ® com módulo de separação Alliance 2695, composto por bomba analítica,
injetor automático, desgaseificador, forno para colunas e detector de arranjo de diodos PDA
2996, com sistema controlado pelo software Empower ®. A coluna foi do tipo YMC ®, da
Waters ®, C30, 3 µm, 250x4,6 mm. Anteriormente a injeção, a amostra foi dissolvida em 200
µL de acetona e foram injetados 15 µL da solução do extrato. A fase móvel utilizada foi um
gradiente de eluição com os solventes metanol (fase A) e éter metil -terc-butilico (fase B)
(Tabela 3). O fluxo utilizado na coluna foi de 0,8 mL/min.
Figura 13 - Etapas de obtenção do extrato: partição com hexano (a e b) e
evaporação do solvente (c)
a b
c
53
Tempo (minutos) % Fase A % Fase B
0 80 20
0,50 75 25
15,00 15 85
15,05 10 90
16,50 10 90
16,55 80 20
28,00 80 20
A identificação dos carotenoides foi efetuada através da comparação entre os espectros
de absorção no UV-visível e tempo de retenção de cada pico do extrato com os de padrões de
carotenoides isolados previamente de pimentão vermelho. A proporção de cada carotenóide
presente no extrato foi calculada usando a área obtida sob cada pico.
O extrato também foi analisado por espectrofotometria de absorção no Uv-Vis
(espectrofotômetro de varredura Perkin-Elmer Lambda 15) obtendo-se espectros em
comprimentos de onda entre 250 a 750 nm, utilizando-se os solventes hexano, etanol e
diclorometano. O objetivo deste teste foi verificar em que comprimento de onda seria obtida
a banda de absorção de maior intensidade. Posteriormente, estes solventes foram usados nos
testes de extração e quantificação dos pigmentos inseridos nos complexos de inclusão com
ciclodextrinas, a serem obtidos. As amostras analisadas no espectrofotômetro de varredura
foram soluções do extrato diluído em etanol, hexano e diclorometano, e a concentração de
cada solução foi 0,66 mg/mL.
Os resultados de máximos de absorção obtidos com os respectivos solventes foram
aplicados na construção de curvas de calibração para obtenção da relação concentração de
extrato versus absorbância nos comprimentos de onda especificados, usados posteriormente
na quantificação da eficiência da inclusão em ciclodextrinas.
As análises espectrofotométrica foram realizadas no Laboratório de Cromatografia, do
Departamento de Química Analítica, do Instituto de Química da UFF.
A atividade antioxidante do extrato de pimentão vermelho foi avaliada pelo método
fluorimétrico Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC), descrito por Dávalos, Gómez-
Cordovés; Bartolome (2004) com modificações. O método fundamenta-se no uso de 2,2’-
azobis-2-amidinopropano (AAPH), que gera radicais livres quando dissolvido em tampão em
solução tampão fosfato pH 7,4 (PBS) a 37 °C. Os radicais gerados irão atacar a fluoresceína
Tabela 3: Composição do gradiente da fase móvel usada nas análises
54
(usada como sonda fluorescente) que, em consequência, irá apresentar inibição da emissão de
fluorescência. A presença de substâncias antioxidantes e sequestrantes de radicais irá
preservar a estrutura da fluoresceína, que então irá preservar a capacidade de emissão de
fluorescência. A intensidade da emissão de fluorescência é proporcional à presença de
antioxidantes no meio reacional.
Para execução do método, inicialmente, o antioxidante padrão ácido 2-carboxílico-6-
hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano (trolox) foi dissolvido em metanol e o volume final
completado a 50 mL com PBS. Em seguida, 5 mL dessa solução foi avolumada a 50 mL com
PBS. Soluções de trolox em PBS, nas concentrações de 2,5, 5,0, 7,5, 10, 12,5, 15,0, 17,5 e
20,0 µg/mL foram preparadas e usadas para a construção da curva de calibração de
concentração de trolox versus área sob a curva de fluorescência da fluoresceína, usada como
sonda fluorescente para o método. Para a construção da curva de calibração, foi utilizada
microplaca preta de 96 poços. 20 µL de cada solução de trolox foram colocados em seu
respectivo poço, e em seguida foram adicionados 120 µL de solução de fluoresceína 0,439
µg/mL. A placa foi incubada por 10 minutos a 37 °C e, em seguida, foram adicionados a
cada poço 60 µL de solução recentemente preparada de AAPH 10,85 mg/mL. Imediatamente
após a adição do AAPH, a microplaca foi inserida em leitor de fluorescência e absorbância
em microplacas (Fluostar Optima, da BMG) e as curvas de fluorescências de cada poço foram
medidas (simultaneamente). O comprimento de onda de excitação foi 485 nm e de emissão foi
de 520 nm. Um branco apropriado foi preparado usando o tampão PBS no lugar da solução
padrão de trolox. E o valor de fluorescência usado para a construção da curva de calibração
foi calculado considerando-se o valor da área sob a curva de fluorescência de cada solução
padrão menos o valor obtido para o branco.
Soluções da amostra de extrato de pimentão vermelho em PBS, com adição de dimetil
sulfóxido, foram preparadas, na faixa de concentração similar à do padrão trolox. Os mesmos
procedimentos adotados para o padrão foram aplicados também à amostra, para a qual foi
construída a curva de concentração versus área sob a curva de fluorescência. O valor ORAC
para a amostra foi calculado dividindo-se o coeficiente angular da curva de fluorescência da
amostra pelo coeficiente angular da curva de fluorescência do padrão, e foi expresso como
miliequivalentes de trolox/100 mg de amostra. Padrão e amostras foram analisados em
triplicata.
A avaliação da cor instrumental do extrato de pimentão vermelho é de suma
importância visto que os pigmentos podem apresentar comportamento de cor diferenciado
quando solubilizado em diferentes solventes. Tais análises foram realizadas por reflectância
55
no aparelho Colorview 9000 da Byk - Gardner, no Sistema CIElab, instalado no Laboratório
de Biotecnologia de Alimentos da Faculdade de Farmácia da UFF, sendo capaz de detectar a
cor emitida pelos pigmentos presentes no extrato de pimentão vermelho, simulando a
percepção de cor pelo olho humano. Os parâmetros de cor medidos foram: L* = luminosidade
(0=preto e 100=branco), a* (-80 até zero=verde, do zero ao +100=vermelho), b* (-100 até
zero=azul, do zero ao +70=amarelo). Os índices de cor foram avaliados no extrato
solubilizado em diferentes solventes (etanol, hexano, diclorometano e mistura de solvente
etanol:água na proporção de 90:10). Sendo assim, utilizou-se 20 mg de extrato de pimentão
vermelho e 30 mL de cada solvente citado anteriormente. As análises foram realizadas em
triplicata.
4.4 Inclusão dos pigmentos do extrato do pimentão em ciclodextrinas
Foram testadas três diferentes ciclodextrinas (α-, β- e metil-β ciclodextrina) visando
identificar aquela capaz de formar complexos de inclusão com melhor rendimento e melhor
eficiência de inclusão. Os testes foram realizados primeiramente com a β-ciclodextrina
utilizando os dois procedimentos de inclusão (agitação magnética e sonda de ultra-som). A
partir dos resultados obtidos com a β-ciclodextrina, realizou-se testes de inclusão com a α- e
metil-β ciclodextrinas utilizando apenas a sonda de ultra-som.
A metodologia de inclusão molecular utilizada no presente estudo foi por co-
precipitação, baseado no proposto por Chen et al. (2007), com modificações. Primeiramente,
solubilizou-se o extrato (0,5 g) no solvente etanol (0,5 mL). Em seguida, a β- ciclodextrina (2 g)
foi dissolvida em etanol:água destilada (45 mL) (1:2 v/v) sob agitação magnética com
aquecimento a 35 °C. A razão de massa utilizada foi de 1:4. O procedimento usando agitação
magnética (Fisatom ®) (Figura 14) consistiu na mistura das soluções de extrato e da
ciclodextrina até atingir a temperatura ambiente. O procedimento com sonda de ultra-som
(Omni Sonic Ruptor 250) foi conduzido através da mistura das soluções de extrato e
ciclodextrina em ambiente ultra-sônico durante 5 min aplicando uma potência de 100 Watts,
seguido pela agitação magnética até atingir temperatura ambiente. As misturas foram
armazenadas overnight a 4 ° C e filtradas sob vácuo. O precipitado foi lavado três vezes com
etanol e água destilada (45 mL, 1:2 v/v), congelado e liofilizado em liofilizador da marca
Labconco, que operou a 10-3 mbar de pressão e - 40° C de temperatura. O pó obtido foi
pesado para cálculo do rendimento e armazenado no freezer. O processo de inclusão foi
56
realizado em quadriplicata.
A partir dos resultados obtidos com os testes realizados anteriormente, foi possível dar
continuidade aos experimentos com o procedimento de inclusão que apresentou rendimento e
eficiência de inclusão satisfatórios e com a ciclodextrina que mostrou capacidade em formar
complexo de inclusão com o extrato de pimentão vermelho.
A mistura física foi preparada sob agitação manual em um gral adicionando-se o extrato
de pimentão vermelho sobre a ciclodextrina em pó A razão de massa de extrato e
ciclodextrina utilizada foi mantida como descrito anteriormente no processo de inclusão
molecular e a mistura foi armazenada sob refrigeração ao abrigo da luz.
a b
Figura 14- Etapas envolvidas no procedimento de inclusão utilizando dois
procedimentos: (a) solubilização da ciclodextrina em solução de etanol:água, (b)
inclusão molecular utilizando agitação magnética, (c) inclusão molecular utilizando
sonda de ultra-som, (d) filtração a vácuo em membranas de celulose, (e) obtenção do
depósito e (f) liofilização.
d c
e f
57
4.5 Determinação da eficiência de inclusão e caracterização do complexo obtido
O conteúdo total de pigmentos complexados foi determinado pelo método de extração
em solvente proposto por Falcão et al. (2010) com modificações. Diversos procedimentos
foram realizados na extração utilizando diferentes solventes (etanol, diclorometano e metanol)
e equipamentos (vórtex e banho de ultrassom) com a finalidade de escolher aqueles mais
eficientes na extração dos pigmentos do interior da ciclodextrina. Primeiramente testou-se a
extração com etanol/banho de ultra-som e vórtex a fim de comparar a eficiência de cada
equipamento utilizado. Em seguida, testou-se o diclorometano/banho de ultra-som e vórtex. A
partir dos resultados obtidos nos ensaios preliminares, optou-se por testar os solventes etanol
e metanol utilizando apenas o banho de ultra-som.
O complexo liofilizado (5 mg) foi transferido para três vials tipo eppendorf contendo
1mL do solvente e, em seguida, homogeneizados paralelamente em banho de ultrassom
(ultrasonic cleaner Unique ®) e vórtex (Fisatom®) durante 10 min. Após a homogeneização,
a suspensão foi centrifugada ( Microcentrífuga Ministar ®) por 15 min a 6200 rpm. O
sobrenadante foi recuperado com pipeta pasteur e transferido para um balão volumétrico de
25 mL e o volume foi completado com o mesmo solvente. Sucessivas extrações foram
realizadas até o complexo perder a sua coloração. O sobrenadante obtido foi analisado em
espectrofotômetro (Bausch e Lomb, CT 211) em comprimento de onda obtidos
correspondente a cada solvente. As extrações foram realizadas em triplicata. O conteúdo de
carotenoides foi calculado a partir de uma curva de calibração construída utilizando o extrato
de partida. A curva de calibração foi feita em triplicata. Os procedimentos descritos foram
realizados utilizando etanol e diclorometano PA como solventes. Por último, os testes de
extração foram repetidos com o objetivo de comparar a eficiência de extração empregando
como solventes metanol e etanol PA utilizando apenas o banho de ultra-som.
A eficiência de inclusão (EI) (%) foi calculada segundo a equação a seguir:
Os resultados obtidos nos testes de extração foram de suma importância na
continuidade do estudo visto que, após a etapa de inclusão, foi necessário quantificar os
pigmentos incluídos no interior das ciclodextrinas aplicando o procedimento de extração que
mostrou-se mais eficiente.
Os complexos formados entre extrato/β- ciclodextrinas utilizando etanol/sonda ultra-
sônico, etanol/agitação magnética, extrato de pimentão vermelho e a mistura física foram
EI (%) = 100 x (conteúdo medido de carotenoides / conteúdo total teórico de carotenoides)
58
caracterizados por métodos físicos (espectrofotometria no infravermelho, ressonância
magnética nuclear de hidrogênio (RMN1H) e análise térmica diferencial (DSC). O tamanho, a
distribuição e o potencial Zeta das partículas foram avaliados utilizando um analisador de
potencial Zeta (Zeta Plus).
Os espectros de infravermelho das amostras foram obtidos na faixa de 500 a 4.500cm-1
usando um espectrofotômetro Nicolet Nexus 670 FT-IR (Nicolet). A resolução foi 1.0 cm-1 e o
espectro foi o resultado da média de 32 scans. As amostras foram diluídas na razão de 1:100
em sal transparente, brometo de potássio (KBr).
As análises de DSC foram realizadas usando um 822 Mettler-Toledo (Mettler Toledo).
Para calibração utilizou-se o indium e o zinco como materiais de referência. Durante o estudo
as amostras foram aquecidas de 25 a 400 °C a um taxa de aquecimento de 10 °C/min, sob
atmosfera de nitrogênio. As amostras foram analisadas e comparadas para possíveis
interações. As análises foram conduzidas no Laboratório de Processamento e Caracterização
de Materiais Poliméricos, no Instituto Nacional de Tecnologia (INT).
Os espectros de RMN 1H foram obtidos no equipamento Varian VNMRS com
freqüência de 500 MHz. Os solventes deuterados (D2O) utilizados para obtenção dos
espectros de RMN foram obtidos da Sigma-Aldrich. Os deslocamentos químicos (δ) foram
expressos em partes por milhão (ppm). A edição dos espectros foi realizada utilizando-se o
programa SpinWorks 3.1.5.0. As análises foram realizadas no Laboratório de Ressonância
Magnética Nuclear, situado na UFF.
O tamanho e a distribuição das partículas foram medidas pelo analisador de potencial
Zeta usando ZetaPlus (Brookhaven Inst. Corp.). Cada amostra foi ressuspendida em água ultra
pura, em banho de ultra-som, por 15 min. Foram realizadas cinco corridas. O tamanho de
partícula foi expresso como média do diâmetro em µm.
O potencial Zeta (ζ) das partículas foi determinado a partir da imersão do eletrodo na
cubeta de acrílico contendo a dispersão diluída em água ultra-pura. As análises foram
realizadas no aparelho ZetaPlus (Brookhaven Inst. Corp.)
As análises de espectrofotometria no infravermelho, tamanho, distribuição e potencial
Zeta das partículas foram realizadas no Laboratório de Biomateriais do Centro Brasileiro de
Pesquisas Físicas (CBPF).
Os complexos foram ainda avaliados quanto à atividade antioxidante através do
método ORAC (DÁVALOS; GÓMEZ-CORDOVÉS; BARTOLOME, 2004) e os parâmetros de
cor L*, a* e b* por espectrofotometria de reflectância, segundo os métodos já descritos
anteriormente.
59
4.6 Avaliação da estabilidade dos complexos de inclusão em sistemas modelos, frente a
fatores importantes para o processamento de alimentos
Para os testes desta etapa em diante, foi necessário produzir complexos de inclusão em
maior escala utilizando a β-ciclodextrina e o procedimento de inclusão que proporcionou
melhores características de rendimento e eficiência de inclusão (sonda de ultra-som) nos
testes realizados anteriormente. Sendo assim, utilizou-se 1,5 g de extrato de pimentão
vermelho e 6 g de β-ciclodextrinas (razão de massa 1:4) para preparo do complexo de
inclusão. O pó obtido foi pesado para cálculo do rendimento e armazenado no congelador em
um frasco hermético. A estabilidade do complexo escolhido foi avaliada pela medida dos
parâmetros de cor L *, a* e b*, nas diferentes condições do experimento descrito a seguir.
O aquecimento para a pasteurização acompanha o processamento para a produção de
alimentos de diferentes valores de pH. O experimento foi efetuado para estabelecer o efeito
do aquecimento em diferentes valores de pH sobre a estabilidade do extrato de pimentão
vermelho e do complexo carotenoides de pimentão/ciclodextrina escolhido. Os parâmetros de
cor L *, a* e b* foram medidos antes e após o tratamento térmico. Verificou-se o efeito
combinado de três variáveis (pH, temperatura e tempo de aquecimento), em três níveis de
valores significativos para o processamento de alimentos líquidos por pasteurização, através
da adoção de um planejamento experimental fatorial fracionado 32, gerado pelo programa
STATISTICA v. 7.0, constituído de 9 combinações das variáveis e foram efetuadas três
repetições autênticas do experimento. A análise estatística para determinação das condições
de maior estabilidade foi feita com o auxílio do programa STATISTICA v. 10.0, para
determinar as variáveis com efeito mais significativo sobre os parâmetros de cor. A Tabela 4
indica as variáveis e níveis que foram utilizados no experimento e a Tabela 5 indica as
combinações adotadas.
Tabela 4: Variáveis e níveis utilizados no experimento
Variáveis Níveis
-1 0 +1
pH 3 5 7
Temperatura ( C) 60 70 80
Tempo (min.) 1 5 10
60
Tabela 5 - Combinações de variáveis e níveis usadas no experimento
Corrida
pH
Temperatura
(C)
Tempo (min.)
1
7
60
1
2 7 80 1
3 3 60 1
4 3 80 1
5 5 70 5
6 7 60 10
7 7 80 10
8 3 60 10
9 3 80 10
4.7 Avaliação da estabilidade de cor de iogurte adicionado do complexo carotenoides de
pimentão/ciclodextrina
O iogurte foi preparado por fermentação láctica a partir da utilização de 7 L de leite
esterilizado, 700 g de leite em pó desnatado e iogurte natural, mantidos aquecidos a 45 °C, até
atingir o pH de 4.1. A cultura inicial foi inoculada a partir de uma amostra de iogurte
comercial contendo Streptococcus thermophilus e Lactobacillus bulgaricus.
Após a fermentação e coagulação, o gel sofreu agitação para quebra do coágulo e
conferência de cremosidade ao iogurte. Em seguida, o produto sofreu resfriamento para inibir
o crescimento de bactérias lácticas e, assim, não ocorrer uma acidificação excessiva.
Posteriormente foram feitas adições do conservante sorbato de potássio (100 mg/kg), açúcar a
10 % e dos respectivos corantes utilizados no experimento: extrato de pimentão vermelho (0,
05%), complexo liofilizado (0,15%) e corante artificial amarelo crepúsculo (FD&C n. 6)
(0,0046 %). Os corantes foram adicionados ao iogurte fresco até atingir um padrão de cor
semelhante a do iogurte comercial sabor mamão (L = 77.91; a = 22.99; b = 29, 63).
Os iogurtes foram divididos em quatro grupos: (ISC) iogurte sem corante, (ICE)
iogurte adicionado de extrato de pimentão vermelho, (ICC) iogurte adicionado de complexo
61
liofilizado e (ICA) iogurte fresco adicionado de corante artificial amarelo crepúsculo. Em
seguida, foram armazenados em tubos de ensaio durante um período de 60 dias a 4°C. As
medidas de cor foram realizadas a cada 10 dias a partir do inicio do experimento.
As análises instrumentais foram realizadas por reflectância usando espectrofotômetro
(Colorview 9000 Byk-Gardner, Columbia, MD, USA) com software QC Manager instalado
no Laboratório de Biotecnologia de Alimentos da Faculdade de Farmácia da UFF. A cor
medida foi expressa pelos índices L*,a*,b* (CIELAB). Para cada amostra, os valores dos
parâmetros de cor determinados em cada tempo foram analisados por ANOVA, usando o
valor de p < 0,05 para determinação de diferença significativa entre os tempos de
armazenamento para cada grupo. Havendo diferença significativa para os valores das médias
de cada amostra avaliada, estas foram comparadas ao tempo zero, através do teste de Dunnet.
Os experimentos e as medições foram realizados em triplicata.
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Obtenção do extrato de pimentão vermelho (Capsicum anumm L)
Os testes realizados previamente com a mistura de solventes etanol:água e
hexano:acetona para escolha do solvente utilizado na extração dos pigmentos do pimentão
vermelho em pó, indicaram que a extração com hexano:acetona apresentou um tempo de
extração até esgotamento de três meses, com rendimento de 4,8 % (p/p), enquanto que, com
os solventes etanol:água com posterior partição em hexano, o tempo de extração foi de dois
meses, com rendimento de 4,4 % (p/p). Apesar do extrato obtido com os solventes hexano:
acetona ter apresentado um rendimento ligeiramente maior comparado ao extrato obtido com
os solventes etanol:água, a extração com a mistura etanol:água, seguida da partição em
hexano, foi considerada mais adequada para dar continuidade aos experimentos em virtude
do menor tempo necessário para o esgotamento da extração. Vale ressaltar que a mistura
etanol: água proporcionou a obtenção do extrato com coloração vermelha intensa, enquanto
que a mistura hexano:acetona apresentou uma coloração vermelho-alaranjada (Figura 15).
Entretanto, as diferenças nas colorações apresentadas podem ser decorrentes do efeito dos
solventes sobre os pigmentos e não necessariamente representam diferentes concentrações dos
mesmos.
63
Figura 15: Extrato de pimentão vermelho obtido com a mistura
hexano: acetona (a) e etanol: água (b)
O fenômeno denominado de solvatocromismo descrito por Hantzsch em 1922 é
observado a partir das mudanças causadas pelos solventes, com consequentes alterações na
posição, intensidade e forma da banda de absorção de certos compostos na região do
ultravioleta e visível (UV/Vis) (REICHARDT, 1988; SUPPAN; GHONEIM, 1997). A
molécula de soluto, quando isolada, apresenta transições bem definidas pelos seus níveis
eletrônicos, porém ao ser embebida em solvente, os níveis eletrônicos irão interagir
diferentemente com o meio, promovendo deslocamento das bandas em direção o azul ou ao
vermelho (GEORG, 2006). Desta forma, as diferentes colorações observadas para os extratos
de pimentão vermelho obtidos com hexano:acetona (alaranjada) e etanol:água (vermelha
intensa) podem ser decorrentes do solvatocromismo causado pelos diferentes solventes nos
pigmentos. No item 5.2.2 é descrito o resultado do efeito de diferentes solventes sobre o
extrato obtido com etanol:água, seguido da partição com hexano, comprovando então o efeito
solvatocrômico.
A partir dos resultados obtidos com os testes do solvente, iniciou-se a extração dos
pigmentos do extrato total com a mistura de solventes etanol:água, seguida da partição com
hexano e evaporação do solvente, e este extrato foi utilizado em todos os experimentos
seguintes.
5.2 Análises do extrato de pimentão vermelho
5.2.1 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
A análise por CLAE/DAD do extrato do pimentão vermelho foi realizada antes e
a b
64
depois da saponificação da amostra é mostrado na Figura 16. Anteriormente ao procedimento
de saponificação foi feita uma injeção cujo objetivo foi avaliar o perfil cromatográfico da
amostra. O cromatograma obtido permite visualizar que não ocorreu separação dos analitos
adequadamente, portanto, verificou-se a necessidade de realização do procedimento de
saponificação com a finalidade de melhorar a resolução cromatográfica e remover lipídios
e/ou clorofilas, que possam interferir na análise cromatográfica. Durante a saponificação,
ocorre a hidrólise dos ésteres de carotenoides liberando os carotenoides que anteriormente
estavam ligados (PACHECO, 2009) e uma consequência disto é a obtenção de um
cromatograma com melhor resolução e linhas de base mais retas.
Os tempos de retenção, quando comparados aos de padrões de carotenoides,
associados aos espectros de absorção no UV-visível dos picos obtidos no cromatograma da
Figura 16, permitiram a identificação de alguns dos principais carotenoides do extrato de
pimentão vermelho.
Figura 16: Perfil cromatográfico do extrato de pimentão vermelho, antes (a)
e após (b) a saponificação.
AU
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
Minutes
2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00
a
AU
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
Minutes
5,00 10,00 15,00 20,00 25,00
caps
antin
a
caps
orub
ina
Bet
a-cr
ipto
xant
ina
13-c
is-b
eta-
caro
teno
Bet
a-ca
rote
no9-
cis-
beta
-car
oten
o
b Capsantina: 24,54% Capsorubina: 4,57% β-criptoxantina: 4,27% 13-cis- β caroteno: 1,39 %
β-caroteno: 8,15 % 9-cis- β-caroteno: 2,26 %
65
O cromatograma da amostra do extrato do pimentão vermelho, após saponificação,
demonstrou a predominância da capsantina, com a presença também dos carotenoides
capsorubina, β-criptoxantina e β-caroteno e os isômeros 13- e 9-cis-β-caroteno, sendo que os
isômeros trans, provavelmente, foram originados de reações de isomerização durante a
extração ou saponificação. Os espectros de absorção entre 280 e 600 nm dos picos
identificados estão representados na Figura 17.
β-Criptoxantina
AU
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
nm
300,00 350,00 400,00 450,00 500,00 550,00 600,00
286,4
472,1
AU
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
nm
300,00 350,00 400,00 450,00 500,00 550,00 600,00
286,4356,7
466,1
AU
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
nm
300,00 350,00 400,00 450,00 500,00 550,00 600,00
347,1
450,3
478,2
AU
0,000
0,010
0,020
0,030
nm
300,00 350,00 400,00 450,00 500,00 550,00 600,00
338,7
444,3
AU
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
nm
300,00 350,00 400,00 450,00 500,00 550,00 600,00
451,5
478,2
AU
0,00
0,02
0,04
0,06
nm
300,00 350,00 400,00 450,00 500,00 550,00 600,00
344,7
446,7
473,3
Capsantina Capsorubina
β-Criptoxantina 13-cis- β-Criptoxantina
β-caroteno 9-cis-β-caroteno
Figura 17: Espectros de absorção dos carotenoides presentes no extrato de pimentão
vermelho
66
Entretanto, foi possível observar que o cromatograma da amostra não saponificada,
embora nem todos os carotenoides tenham sido identificados, apresentou um maior número de
picos, com áreas distintas daquelas observadas na amostra saponificada. Portanto, apesar da
saponificação ter auxiliado na obtenção de cromatograma com melhor resolução, facilitando a
análise, este procedimento causou perdas dos carotenoides presentes, logo, a amostra
saponificada não representa totalmente a amostra antes da saponificação.
Azevedo-Meleiro e Rodriguez-Amaya (2009) identificaram capsantina, luteína, β-
caroteno, violaxantina, capsorubina, anteraxantina e zeaxantina como os carotenoides
presentes em extrato de frutos frescos de pimentão vermelho. Sim, Park e Hwang (2004) ,
identificaram cinco picos, capsantina, capsorubina, zeaxantina, β-criptoxantina e β-caroteno
como os principais pigmentos presentes no pimentão vermelho durante o amadurecimento.
No presente trabalho, foram identificados os principais carotenoides responsáveis pela
coloração do pimentão vermelho, descritos como capsantina e capsorubina o que concorda
com os resultados citados pelos outros autores, entretanto, alguns picos apresentando menores
áreas não puderam ser identificados, pela não disponibilidade de padrões adequados.
Além disso, foi verificada a presença dos isômeros 13-e 9-cis-β-caroteno, em virtude,
provavelmente, da isomerização trans-cis durante a extração ou até mesmo da saponificação e
análise, visto que é relatada a ocorrência de isômeros trans de carotenoides em alimentos e
outros produtos naturais (MERCADANTE; EGELAND, 2004).
Diferenças nas composições dos pigmentos relatadas por diferentes autores podem
estar relacionadas ao estágio de amadurecimento e ao próprio local de cultivo da hortaliça. No
estágio de imaturidade, luteína e neoxantina foram detectadas no pimentão vermelho, mas
seus conteúdos podem reduzir durante o amadurecimento (MINGUEZ-MOSQUERA;
JARÉN-GALÁN; GARRIDO-FERNANDEZ, 1993). No estágio de maturação a coloração
vermelha é mais intensa e, consequentemente, os conteúdos de capsantina e capsorubina
aumentam (HORNERO-MENDEZ; GOMEZ-LADRON ; MINGUEZ-MOSQUERA, 2000).
5.2.2 Espectrofotometria de absorção na região do UV- visível
O extrato de pimentão vermelho dissolvido em diferentes solventes (hexano, etanol e
diclorometano) foi analisado por espectrofotometria de absorção em comprimentos de onda
entre 250 e 750 nm. O objetivo desta análise, no que se refere ao uso dos solventes, foi
verificar em que comprimento de onda pode-se obter a banda de absorção de maior
intensidade, pois, posteriormente, os solventes foram usados em testes de extração para
67
quantificação dos pigmentos inseridos nos complexos de inclusão com ciclodextrinas. Os
espectros obtidos (Figura 18) indicaram que o extrato com solvente diclorometano (curva
verde) apresentou absorbância mais intensa que o extrato nos demais solventes. Além disso,
os espectros de absorção demonstraram que, para o mesmo extrato na mesma concentração, o
uso do etanol como solvente proporcionou a obtenção de espectro com máximos de absorção
em menores comprimentos de onda do que os obtidos com os solventes diclorometano e
hexano, confirmando o efeito de cada solvente sobre os cromóforos (efeito solvatocrômico),
já explicado anteriormente. Apesar disso, o solvente etanol foi escolhido para realizar as
extrações para análise dos complexos de inclusão por razões a serem descritas posteriormente.
Os resultados de máximos de absorção obtidos na análise anterior foram aplicados na
construção das curvas de calibração para cada solvente (etanol, diclorometano e hexano) que
foram usadas para quantificar a eficiência da inclusão em ciclodextrinas. As curvas obtidas
(Figura 19) mostraram que o coeficiente de determinação de regressão apresentou valores
próximos a 1,0 (R2=0,99) indicando que existe relação entre a absorbância referente a cada
solvente (máximos em 451, 477 e 479 nm, respectivamente, para etanol, hexano e
diclorometano) e a concentração de extrato utilizada.
Figura 18: Espectros de absorção no visível do extrato de pimentão vermelho diluído nos
solventes: etanol (curva azul), hexano (curva vermelha) e diclorometano (curva verde).
68
Figura 19: Curvas de calibração com extrato solubilizado em etanol (a);
hexano (b) e diclorometano (c).
5.2.3 Espectrofotometria de reflectância
Os resultados referentes às análises estatísticas dos índices de cor L**, a* e b* para o
extrato solubilizado em diferentes solventes indicaram que houve diferença significativa (p <
0,05) para todos os parâmetros de cor avaliados. Observa-se na Tabela 6 que o valor do índice
L* do extrato dissolvido em diclorometano foi maior quando comparado aos demais
solventes, indicando que ocorreu aumento na luminosidade da solução do extrato em
diclorometano. Em contrapartida, o valor do índice a* do extrato solubilizado em etanol:água
foi maior e, para os demais solventes, os valores mantiveram-se constante entre os solventes
etanol, hexano e diclorometano, indicando que o extrato solubilizado em etanol:água
69
apresentou uma maior emissão da cor vermelha comparado aos demais. Deve ser ressaltado
que foram utilizadas massas iguais da mesma amostra de extrato, dissolvidas em nos
diferentes solventes. As características observadas em relação à mudança de cor da amostra
quando solubilizada nos solventes diferentes reforça a ocorrência do efeito solvatocrômico.
Em relação ao índice b*, observa-se que o extrato solubilizado em hexano apresentou o maior
valor para este índice comparado aos demais solventes, confirmando, portanto, uma maior
emissão da coloração amarela quando o extrato encontra-se solubilizado em hexano.
Tabela 6: Resultados das análises de colorimetria do extrato solubilizado em diferentes
solventes
Amostra
L*
(*média ± desvio-
padrão)
a*
(*média ± desvio-
padrão)
b*
(*média ± desvio-
padrão)
Extrato
em etanol 1,91 ± 0,025 a 5,55 ± 0,02 a 2,94 ± 0,007 a
Extrato em
etanol:água 2,55 ± 0,020 b 6,45 ± 0,046 b 3,37 ± 0,051 b
Extrato em hexano 3,01 ± 0,098 c 5,33 ± 0,045 c 4,52 ± 0,144 c
Extrato em
diclorometano 3,32 ± 0,042 d 5,48 ± 0,071 d 2,93 ± 0,025 d
*Média de três repetições
a-d Diferença significativa (p < 0,05) é expressada por letras diferentes na mesma coluna.
Os parâmetros de cor L*, a* e b* também foram avaliados para o extrato e complexo
antes do tratamento térmico alterando apenas a variável pH (3, 5 e 7) das soluções analisadas.
O gráfico representado na Figura 20 (a) demonstrou que para o extrato, houve um aumento da
luminosidade quando o pH variou de 3 para 5, logo em seguida ocorreu uma queda da
luminosidade quando o pH variou de 5 para 7. O contrário foi observado para o complexo,
que apresentou uma estabilidade do índice L* entre o pH 3 e 5, apresentando redução deste
índice apenas quando submetido ao pH 7. Em relação ao índice a* (Figura 20 b), observa-se
que o complexo apresentou comportamento oposto ao do extrato quando submetido em
diferentes faixas de pH. Entre o pH 3 e 5, o extrato apresentou aumento da coloração
vermelha, enquanto que o complexo apresentou redução deste índice. Entre o pH 5 e 7, houve
uma redução deste índice para o extrato e aumento para o complexo. Para o índice b*,
observaram-se comportamentos semelhantes ao índice a*, porém nesse caso, o extrato
apresentou maiores alterações comparado ao complexo entre o pH 3, 5 e 7 (Figura 20 c).
70
Portanto, a partir desses resultados, pode-se afirmar que as alterações do pH para o extrato
foram capazes de promover maiores variações dos parâmetros de cor avaliados quando
comparado ao complexo, indicando que este proporcionou maior estabilidade destes
parâmetros.
0 2 4 6 816
17
18
19
20
21
22Extrato
Complexo
pH
Valo
rL
*
Figura 20: Parâmetros de cor L* (a), a* (b) e b* (c) avaliados para o extrato e complexo antes
do tratamento térmico em pH 3, 5 e 7.
5.2.4 ORAC
Espécies reativas de oxigênio podem danificar moléculas biológicas tais como
proteínas, lipídios e DNA. Tais espécies são geradas como subprodutos da respiração aeróbica
das células normais que é essencial para a vida. O corpo humano tem desenvolvido um
sistema muito delicado, embora não 100% efetivo, para eliminar radicais livres do corpo
(YOUNG ; WOODSIDE, 2001; DAVIES, 2000). Portanto, dietas ricas em frutas e vegetais
vêm sendo consideradas excelentes fontes de antioxidantes (BLOCK; PATTERSON ;
SUBER, 1992; NESS; POWLES, 1997) devido a presença de vitamina C e E, carotenoides e
polifenóis.
O método ORAC tem sido amplamente aplicado para avaliar a capacidade de eliminar
radicais livres do plasma humano, proteínas, DNA e extratos antioxidante de plantas e
0 2 4 6 80
5
10
15
20Extrato
Complexo
pHV
alo
ra*
0 2 4 6 815
20
25
30
35Extrato
Complexo
pH
Valo
rb
*a b
c
71
alimentos. O ensaio mede a degradação oxidativa da fluoresceína após ser misturado com
AAPH, gerador de radicais peroxila, prejudicando a molécula fluorescente e resultando na
perda da fluorescência. A função dos antioxidantes é proteger a molécula fluorescente da
degeneração oxidativa ocasionada após a adição do AAPH. Conforme ocorre a degeneração
oxidativa, a intensidade fluorescente diminui e consequentemente é registrada. A
decomposição da fluoresceína é medida em função da presença do antioxidante, que retarda o
decaimento da fluorescência, e o seu efeito protetor é avaliado a partir do cálculo da área sob
a curva de decaimento da fluoresceína da amostra, em comparação ao branco que não contém
nenhum antioxidante. O grau de proteção antioxidante é quantificado usando o antioxidante
Trolox como padrão e os resultados são expressos em equivalentes de trolox.
Os resultados do presente estudo demonstraram que o extrato de pimentão vermelho
apresentou uma capacidade antioxidante de 36,37 miliequivalentes de Trolox/100 mg extrato.
Não foram encontrados na literatura consultada trabalhos com a descrição da atividade
antioxidante de extrato de pimentão vermelho, para comparação com os resultados aqui
obtidos.
5.3 Inclusão dos pigmentos de extrato de pimentão vermelho em ciclodextrinas e
determinação das eficiências de inclusão
Com base nos resultados anteriormente propostos por Szente et al., (1998), foram
testadas três diferentes ciclodextrinas (α-,β- e metil- β) a fim de avaliar a inclusão dos
carotenoides de pimentão vermelho seguindo a metodologia descrita por Chen et al. (2007),
com modificações, utilizando-se sonda de ultra-som para homogeneização. Após a realização
da inclusão, a mistura foi mantida overnight sob refrigeração e, no dia seguinte, observou-se a
presença de precipitado para o teste com a β-ciclodextrina, indicando a ocorrência de
formação de complexo, porém o mesmo comportamento não foi observado para a α- e metil-
β-ciclodextrina, ou seja, após overnight, não houve formação de precipitado. Sequencialmente
a etapa de overnight, a mistura foi filtrada em membrana de acetato de celulose de tamanho de
poro de 0,22 µm e, em seguida, congeladas e liofilizadas até obtenção de um pó. Vale
ressaltar que, após a liofilização, observou-se que o material retido na membrana ficou
completamente aderido na mesma, não havendo nenhum sinal de formação de pó conforme
observado com a β-ciclodextrina.
A partir dos testes preliminares realizados anteriormente, os resultados obtidos não
72
foram satisfatórios para a α- e metil-β-ciclodextrina, portanto, optou-se em dar
prosseguimento ao estudo utilizando apenas a β-ciclodextrina.
Alguns fatores podem contribuir para a não formação do complexo com a α- e metil-β-
ciclodextrina, como por exemplo, o diâmetro menor da cavidade interna da α-ciclodextrina
(4,7-5,3 Å) comparado a β-ciclodextrina (6,0-6,5 Å), assim como o tamanho e a forma dos
carotenoides (MATIOLI; RODRIGUEZ-AMAYA, 2003). Em relação à metil-β-ciclodextrina,
é possível que o grupamento metila contribua para que a sua superfície seja mais apolar,
assemelhando-se à cavidade interna, podendo dificultar a inclusão de moléculas grandes como
os carotenoides por um efeito estérico.
Sequencialmente ao processo de escolha da ciclodextrina para inclusão molecular, foi
necessário avaliar o conteúdo de pigmentos encapsulados para determinação da eficiência de
inclusão referente a cada procedimento a ser aplicado posteriormente (sonda de ultra-som e
agitação magnética). Para isso, testes de extração utilizando diferentes solventes (etanol,
diclorometano e metanol) e equipamentos (vórtex e banho de ultra-som) foram realizados
com a finalidade de escolher aqueles que apresentariam maior eficiência de extração e,
consequentemente, indicar a eficiência de retenção de carotenoides no complexo.
O primeiro teste de extração utilizando o solvente etanol foi realizado com o objetivo
de comparar a eficiência de extração de cada equipamento (vórtex e banho de ultra-som). Os
resultados revelaram que o vórtex apresentou uma eficiência de extração dos pigmentos do
interior da ciclodextrina maior em comparação ao banho de ultra-som, 28,47 % e 26,76 %,
respectivamente, e o número de extrações (cinco) foram semelhantes para os dois
procedimentos (Tabela 7). Embora os resultados tenham mostrado para o vórtex tendência de
elevação da eficiência de extração, as análises estatísticas demonstraram não haver diferença
entre os dois equipamentos, além disso, o uso deste equipamento pode promover a perda de
material presente no interior do frasco recipiente, por conta da agitação. Sendo assim, optou-
se em dar continuidade aos testes de extração utilizando o banho de ultra-som.
Após a realização dos testes anteriores, optou-se em realizar um último teste com a
finalidade de comparar apenas a eficiência de extração entre os solventes etanol e metanol
utilizando o banho de ultra-som. Os resultados demonstraram que o etanol apresentou uma
eficiência de extração maior comparado ao metanol, 32,18% e 28,07%, respectivamente.
Embora as análises estatísticas tenham demonstrando que não houve diferença significativa
entre os dois solventes, optou-se pelo etanol e banho de ultra-som para extração dos
pigmentos do interior das ciclodextrinas.
73
Tabela 7: Comparação entre a eficiência de extração e o número de extrações para os
diferentes procedimentos realizados.
Procedimento Eficiência de Extração (%)
(média* ± desvio padrão)
Número de
extrações
Etanol /Banho de ultra-som 26,76 ± 1,05 a 5
Etanol /Vórtex 28,47 ± 2,17 a 5
Diclorometano/ Banho de ultra-som 26,73 ± 1,39 b 5
Diclorometano/Vórtex 28,56 ± 3,57 b 5
Etanol/Banho de ultra-som 32,18 ± 1,95 c 7
Metanol/Banho de ultra-som 28,07 ± 1,84 c 6
*Média das três repetições
a-c Valores seguidos de letras iguais na mesma coluna não diferem significativamente (p > 0,05)
Após os testes de extração realizados anteriormente para escolha do solvente e
equipamento mais eficientes, foi necessário avaliar a eficiência de inclusão referente a cada
procedimento aplicado na produção dos complexos e, consequentemente, escolher aquele
mais adequado para ser empregado na produção de complexos de inclusão a serem avaliados
quanto à estabilidade frente a fatores importantes para o processamento de alimentos, visando
estabelecer a viabilidade de seu uso como substituto de corantes artificiais em alimentos
industrializados.
Os resultados obtidos referentes ao rendimento e à eficiência de inclusão com os dois
procedimentos de inclusão (Tabela 8) indicaram diferença significativa (p < 0,05) apenas
entre os rendimentos obtidos através dos dois procedimentos. Em relação à eficiência de
inclusão, as análises estatísticas indicaram que não houve diferença significativa (p > 0,05)
entre o procedimento de inclusão com agitação magnética e sonda de ultra-som, devido ao
elevado desvio-padrão observado nos dois procedimentos. Entretanto, o procedimento de
inclusão com ultra-som apresentou maior rendimento comparado ao de agitação magnética
(54,48% e 40,49 %) e maior eficiência de inclusão (62,43% e 52,95%). A Figura 21
demonstra o aspecto da mistura de soluções obtidas após a homogeneização do extrato em β-
ciclodextrina utilizando agitação magnética (a) e sonda de ultra-som (b). No procedimento
com agitação magnética (Figura 21 a), observa-se que não ocorreu uma distribuição uniforme
do extrato na solução, evidenciando a presença de substâncias dispersas. Entretanto, no
74
procedimento de inclusão com sonda de ultra-som (Figura 21 b), observa-se uma completa
homogeneização do extrato na solução, proporcionando a obtenção de uma mistura com
aspecto uniforme.
Figura 21: Soluções obtidas após a etapa de homogeneização do extrato em
β-ciclodextrina, com agitação magnética (a) e sonda de ultra-som (b).
Procedimento Rendimento (%)
(média* ± desvio-padrão)
Eficiência de Inclusão (%)
(média* ± desvio-padrão)
Etanol /Agitação Magnética 40,49 ± 2,76 a 52,95 ± 9,39 c
Etanol /Sonda de Ultra-som 54,48 ± 3,60 b 62,43 ± 12,89 c
* Média de 4 repetições do experimento a-b
Diferença significativa (p < 0,05) c
Não diferem significativamente (p > 0,05)
Estudos realizados com inclusão molecular de carotenoides em β-ciclodextrinas
utilizando apenas o procedimento de agitação magnética apresentaram eficiência de inclusão
menores, 48,96% (CHEN et al., 2007) e 50% (NUNES; MERCADANTE, 2007) comparado
ao presente estudo, 52,95% ( agitação magnética) e 62,43 % (sonda de ultra-som).
A mistura das soluções de extrato e β-ciclodextrina através do contato entre a sonda e
a superfície do líquido permite que ondas sonoras atravessem esse líquido proporcionando
adequada miscibilidade das misturas (BARBOZA; SERRA, 1992). Portanto, pode-se sugerir
que a sonda de ultra-som apresente maior capacidade de incluir os pigmentos no interior de
ciclodextrinas, aumentando a eficiência de inclusão e reduzindo as perdas que podem ocorrer
durante o procedimento, elevando assim o rendimento. Em relação à agitação magnética,
observou-se na Figura 21 (a), que não ocorreu uma completa dispersão do extrato na solução
Tabela 8: Comparação entre o rendimento e eficiência de inclusão com sonda de ultra-som e
agitação magnética.
a b
75
indicando que a aplicação de agitação não foi eficiente na homogeneização promovendo uma
baixa eficiência de inclusão e maiores perdas de extrato com consequente redução do
rendimento.
5.4 Caracterização dos complexos obtidos
Os complexos obtidos por diferentes metodologias de inclusão, a mistura física, o
extrato e a β- ciclodextrinas foram caracterizados por métodos físicos, que incluíram
espectrofotometria no infravermelho, ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN1H),
análise térmica diferencial (DSC), tamanho e distribuição de partículas e por um método
físico-químico, potencial Zeta das partículas.
As técnicas descritas acima são capazes de caracterizar a formação de complexos de
inclusão a partir das mudanças nas propriedades físicas e físico-químicas que podem ser
observadas quando a molécula hóspede é incorporada no interior da cavidade da ciclodextrina
(SINGH et al., 2010).
5.4.1 Espectrofotometria no Infravermelho (IV-TF)
As alterações que ocorrem na estrutura da ciclodextrina pela formação do complexo
podem ser observadas através da espectrofotometria no infravermelho. Desta forma, é
possível detectar as modificações significantes na forma e na posição das bandas de
absorbância através do espectro vibracional dos diferentes grupos funcionais do complexo ou
das moléculas livres (SPRICIGO et al., 2008).
A partir dos resultados obtidos nas análises de espectrofotometria no infravermelho
(Figura 22), observa-se, na região entre 3000-3500 cm-1, a ocorrência de um estiramento da
banda mais pronunciado no espectro do complexo de inclusão com ultra-som (d) comparado
ao espectro da mistura física (c) podendo indicar que as hidroxilas presentes no exterior da
molécula de β- ciclodextrina permanecem livres no processo de inclusão, ou seja, as ligações
entre as hidroxilas e os grupamentos químicos do extrato de pimentão vermelho podem não
estar ocorrendo, talvez pela possibilidade do extrato estar complexado no interior da β-
ciclodextrina . No espectro do complexo de inclusão com agitação magnética (e) e na mistura
física (c) observa-se um estiramento da banda menos pronunciado quando comparado ao
espectro do complexo com ultra-som (d) sugerindo que as hidroxilas da β- ciclodextrina não
76
estejam na forma livre corroborando com o processo de inclusão molecular diferenciado nos
processos (FALCÃO et al., 2011).
Na região de 2.926 cm-1 dos espectros referentes às amostras (a), (b), (c), (d) e (e)
ocorreu vibração de deformação axial da banda correspondente ao C-H alifático presente
tanto na estrutura da β- ciclodextrina quanto nas substâncias que compõem o extrato de
pimentão vermelho. Portanto, ao comparar as bandas desta região da mistura física (c) com o
complexo de inclusão com ultra-som (d) e com agitação magnética (e), observa-se que, em
(d), esta apresenta um perfil diferenciado em relação às demais amostras sugerindo
comportamento diferente referente a este tipo de ligação quando ocorre a formação do
complexo de inclusão. Portanto em relação ao espectro do complexo de inclusão com agitação
magnética (e), observa-se certa semelhança quando comparado ao da mistura física (c)
sugerindo analogia de comportamentos referentes a este tipo de ligação em ambas amostras
(NORASIHA; SAKINAH ; ROHAIDA, 2009).
Na região de 1.738 cm-1 dos espectros referentes às amostras de extrato (b), mistura
física (c), complexo de inclusão com ultra-som (d) e complexo de inclusão com agitação
magnética (e), observa-se uma banda vibracional de deformação axial correspondente a
carbonila de grupos cetona (C=O) característicos de alguns pigmentos presentes no extrato de
pimentão vermelho (CHEN et al., 2007).
As bandas vibracionais correspondentes a região entre 942-946 cm-1 dos espectros de
β- ciclodextrinas (a), mistura física (c), complexo de inclusão com ultra-som (d) e complexo
de inclusão com agitação magnética (e) estão relacionadas a vibração das ligações
glicosídicas α-1,4 da molécula de β- ciclodextrina. Observa-se que a banda vibracional do
complexo (d) apresenta intensidade semelhante à banda relacionada a β- ciclodextrina. Na
mistura física (c) e no complexo com agitação magnética (e), essa banda está presente com
intensidade muito inferior podendo indicar uma alteração na ligação glicosídica da β-
ciclodextrina em função da interação com outros grupamentos funcionais das moléculas
presentes no extrato, evidenciando um comportamento diferente entre os processos de
inclusão molecular e mistura física (NORASIHA; SAKINAH ; ROHAIDA, 2009).
Nos espectros de (a), (c), (d) e (e) observa-se um acoplamento das bandas na região
entre 1.033 e 1.162 cm -1 referente a deformação axial de C-O com a deformação axial do C-C
adjacente característico de função álcool. O perfil das bandas do complexo de inclusão (d)
manteve-se semelhante ao da β- ciclodextrina (a), porém manteve-se diferente do perfil das
bandas do complexo de inclusão com agitação magnética (e) apresentando uma intensidade
discretamente inferior enquanto que na mistura física (c) tais bandas apresentaram menor
77
intensidade, sugerindo participação diferente deste tipo de ligação na mistura física e nos
complexos (SILVERSTEIN; WEBSTER; KIEMLE, 2006).
O conjunto de informações obtidas com as análises por infravermelho evidencia a
diferença existente entre as amostras obtidas com os diferentes procedimentos, corroborando
assim com a obtenção de um complexo de inclusão molecular conseguido através da
metodologia empregada (ultra-som) que em muito se difere da mistura física e da metodologia
com agitação magnética.
Figura 22: Espectros de infravermelho: β- ciclodextrina (a), extrato de pimentão vermelho
(b), mistura física (c), complexo de inclusão com ultra-som (d) e complexo de inclusão com
agitação magnética (e).
78
5.4.2 Análise Térmica Diferencial (DSC)
Os métodos térmicos são amplamente utilizados na caracterização das ciclodextrinas e
dos seus complexos, pela rapidez das análises. A calorimetria exploratória diferencial (DSC)
permite a detecção quantitativa de todos os processos que requerem energia. A formação do
complexo de inclusão pode ser identificada nos perfis de DSC, pelo desaparecimento de picos
endotérmicos ou exotérmicos e variações relevantes na entalpia do extrato puro ou
complexado (FIGUEIRAS et al., 2007; RIBEIRO et al., 2008). Picos exotérmicos ou
endotérmicos caracterizam transições ou reações que tenham ocorrido durante a análise, como
transição vítrea, gelatinização, fusão, oxidação e decomposição, dentre outras (SALES;
SCHLEMMER, 2010).
As análises de calorimetria térmica da β- ciclodextrina, extrato de pimentão vermelho,
mistura física, complexo de inclusão com ultra-som e complexo de inclusão com agitação
magnética estão representados na Figura 23.
Figura 23: Análise Térmica Diferencial (DSC): β- ciclodextrina (verde), extrato de pimentão
vermelho (vermelho), mistura física (azul), complexo de inclusão com etanol/ultra-som (lilás)
e complexo de inclusão com etanol/agitação magnética (preto).
79
O termograma da β-ciclodextrina exibiu um pico térmico amplo entre 115 e 160 °C
devido à eliminação da água. A presença de uma origem térmica próxima a 300 °C
geralmente está atribuída ao início da degradação térmica da β- ciclodextrina (Falcão et al.,
2011). Em relação ao extrato de pimentão vermelho, o pico observado na região entre 115 e
160 °C pode estar relacionado ao processo de degradação, não estando presente no
termograma referentes à mistura física, complexo de inclusão com sonda de ultra-som e no
complexo de inclusão com agitação magnética, sugerindo que os pigmentos presentes na
cavidade da β-ciclodextrina estejam protegidos da degradação (KARATHANOS et al., 2007).
Para o complexo de inclusão preparado através da utilização do método por co-
precipitação com sonda de ultra-som, o termograma representado na Figura 23 demonstrou
que a entalpia de evaporação da água, representado pelo pico endotérmico, foi menor quando
comparado ao método de inclusão por co-precipitação com agitação magnética e à mistura
física , indicando que ocorreu uma melhor interação entre a β- ciclodextrina e o extrato no
processo de inclusão com ultra-som em relação aos demais processos.
Resultados semelhantes foram evidenciados em um estudo realizado por Marcolino et
al.(2011), cujo objetivo foi comparar três métodos de inclusão (kneading, co-precipitação com
agitação magnética e mistura física) para a formação de complexos de bixina e curcumina
com β-ciclodextrina por DSC. Os pesquisadores concluíram que o método por co-precipitação
com agitação magnética demonstrou uma melhor interação entre a molécula hóspede e a
hospedeira comparado aos demais métodos. No presente estudo, a sonda de ultra-som
apresentou melhores resultados comparado ao agitador magnético.
5.4.3 Tamanho e distribuição de partículas e potencial Zeta
O espalhamento de luz dinâmico é uma técnica bastante usual para determinar o
tamanho e a distribuição das partículas dos nanomateriais em solução, sendo utilizada como
um método para avaliar estabilidade das diferentes amostras em suspensão e medir o tamanho
das partículas em suspensão (SIMAKOV; TSUR, 2007); (WILLIAMS; EHRMAN;
HOLOMAN, 2006). A determinação do potencial Zeta bem como o diâmetro médio das
amostras permite caracterizar os complexos obtidos por diferentes procedimentos.
Os resultados obtidos demonstraram que todas as amostras apresentaram partículas em
suspensão com tamanho variando desde 562 a 644 nm. As análises indicaram que o tamanho
das partículas referente ao complexo de inclusão com ultra-som (c) apresentou diâmetro
80
médio menor (562 ± 36,7 nm) quando comparado à mistura física (603± 43,7 nm) e a inclusão
com agitação magnética (596 ± 132 nm), sugerindo que o tamanho reduzido das partículas do
complexo com sonda de ultra-som (c) pode ser decorrente da interação entre o extrato apolar e
a cavidade hidrofóbica da ciclodextrina (FALCÃO et al., 2011). A β-ciclodextrina apresentou
um diâmetro médio de 644 ± 44,1 nm. Outro aspecto de grande relevância que pode ser
observado na Figura 24 é a diferença entre o perfil de distribuição das partículas da amostra
(c) e as demais (a), (b) e (d), indicando a ocorrência de um perfil bimodal nas análises de (a) e
(b) e multimodal na análise de (d), exceto para (c) que apresentou um perfil unimodal, ou seja,
uma população mais homogênea, possivelmente em função da ação das ondas de ultra-som,
corroborando com a formação do complexo entre o extrato e a ciclodextrina.
Figura 24: Distribuição do tamanho de partícula: β- ciclodextrina (a), mistura física (b),
complexo de inclusão com ultra-som (c) e complexo de inclusão com agitação magnética (d).
O índice de polidispersão é indicativo da distribuição de tamanho e ele mostrou que as
amostras preparadas por métodos diferentes estavam homogêneas (IP < 0,5). As amostras (a),
(b), (c) e (d) apresentaram os seguintes índices de polidispersão, respectivamente, 0,345;
81
0,079; 0,005 e 0,383. Porém vale ressaltar que o valor observado para a amostra (c) foi menor
comparado as demais, sugerindo uma maior uniformidade na distribuição dos tamanhos das
partículas do complexo de inclusão com ultra-som (c) contribuindo para uma melhor
estabilidade e demonstrando que o ultra-som mostrou-se mais eficiente na homogeneização
do complexo de inclusão.
O potencial Zeta é uma medida da carga superficial da partícula que representa a
magnitude da repulsão eletrostática ou de atração entre as mesmas, sendo um dos parâmetros
conhecidos que podem afetar a estabilidade (FLORENCE; ATTWOOD, 2003). Os valores
obtidos em relação ao potencial Zeta para a β-ciclodextrina, inclusão com ultra-som, inclusão
com agitação magnética e mistura física foram - 24 ± 3,03 mv, - 34,12 ±2,64 mv, - 42,33 ±
3,11 e -36,11 ± 5,98, respectivamente. Os resultados referentes às amostras analisadas
apresentaram variações consideráveis comparado ao valor do potencial Zeta para a β-
ciclodextrina sugerindo a presença de substâncias adsorvidas na superfície da ciclodextrina,
capazes de alterar sua carga, embora as demais análises de caracterização tenham
demonstrado a presença de substâncias incluídas na cavidade da ciclodextrina.
5.4.4 Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN1H)
O RMN de hidrogênio (RMN1H) tornou-se o método mais avançado e importante na
caracterização de complexos por ser direto e permitir distinguir interações superficiais ou
inclusão da molécula hóspede no interior da ciclodextrina, caracterizando então um complexo
de inclusão. Além disso, é possível monitorar os deslocamentos químicos inferindo a
formação do complexo de inclusão devido a variações na composição das moléculas. Essas
alterações podem ser observadas nos hidrogênios localizados no interior das moléculas de
ciclodextrina (H3, H6 e H5). Em contrapartida, os hidrogênios localizados na região externa
(H2 e H4) sofrem desvios mínimos ou nenhum desvio, por não fazerem parte da complexação
(DJEDAINI et al., 1990; SCHNEIDER et al, 1998; SZEJTLI,1988; POLYAKOV et al.,
2004).
A Figura 26 (a) do presente estudo apresenta os hidrogênios de interesse nas análises
de RMN para possível identificação da formação do complexo. O espectro de RMN obtido
referente à inclusão molecular com ultra-som (Figura 26 b) demonstrou que os hidrogênios
internos (H3, H6 e H5) e externos ((H2 e H4) não apresentaram mudanças no comportamento
comparado ao espectro de RMN da β-ciclodextrina (Figura 26 a). Além disso, as variações
82
entre o deslocamento químico da β-ciclodextrina e o complexo de inclusão com ultra-som
(Tabela 9), nessas regiões, foram menores que 0,01 ppm.
Tabela 9: Diferenças de deslocamento químico do pico H (em ppm) entre a β-ciclodextrina
e o complexo de inclusão com ultra-som.
δ(ppm)
β- ciclodextrina Inclusão com ultra-som Δ δ (ppm)
4,1358 4,1292 0,0066
4,0466 4,0444 0,0022
4,0271 4,0207 0,0064
3,8280 3,8252 0,0028
3,7582 3,7583 0,0001
O espectro de RMN referente ao processo de inclusão com agitação magnética, representado
pela Figura 26 (c), demonstrou mudanças de comportamento nas regiões referentes às
cavidades interna (H3, H6 e H5) e externa (H2 e H4) da ciclodextrina, sugerindo interação do
extrato com ambas regiões. As variações entre o deslocamento químico da β-ciclodextrina e o
complexo de inclusão com agitação magnética (Tabela 10), nessas regiões, foram inferiores a
0,12 ppm.
Tabela 10: Diferenças de deslocamento químico do pico H (em ppm) entre a β-ciclodextrina
e o complexo de inclusão com agitador magnético.
Em relação à mistura física, a Figura 26 (d) demonstra a ocorrência de modificações apenas
nas regiões referentes aos hidrogênios externos (H2 e H4) da ciclodextrina indicando uma forte
interação entre o extrato e a região externa. Outro aspecto importante observado foi a
alteração no comportamento referente ao carbono anomérico ligado ao hidrogênio da posição
δ(ppm)
β- ciclodextrina Inclusão com agitação Δ δ (ppm)
4,1358 4,2357 0,0999
4,0466 4,1588 0,1122
4,0271 4,1182 0,0911
3,8280 3,9365 0,1085
3,7582 3,8660 0,1078
83
1 da glicose (Figura 25) corroborando assim com o observado no espectro desta amostra. As
variações entre o deslocamento químico da β-ciclodextrina e a mistura física (Tabela 11),
nessas regiões, foram inferiores a 0,13 ppm.
Tabela 11: Diferenças de deslocamento químico do pico H (em ppm) entre a β-ciclodextrina
e a mistura física.
Figura 25: Espectro de RMN1H referente à região do carbono
anomérico da (a) β- ciclodextrina e (b) mistura física
δ(ppm)
β- ciclodextrina Mistura Física Δ δ (ppm)
3,828 3,7001 0,1279
3,7582 3,6353 0,1229
5,2489 5,1218 0,1271
a b
84
Figura 26: Espectro de RMN1H para (a) β- ciclodextrina, (b) complexo de inclusão com ultra-som, (c) complexo de inclusão com agitação
magnética e (d) mistura física.
A
4.0
444
4.0
207
3.8
252
2
3.7
583
2
4.1
292
b
H3
H6
H5 H2 H4
4.1
358
4.0
466
4.0
271
3.8
280
3.7
582
a
d
3.7
001
3.6
353
1
4.2
357
4.1
588
4.1
182
3.9
365
3.8
660
c
85
Embora os resultados não tenham apresentado evidências de inclusão entre o extrato e
a β- ciclodextrina utilizando o ultra-som, vale ressaltar que, em relação à mistura física,
modificações foram observadas na região referente aos hidrogênios da cavidade externa da
ciclodextrina, H2 e H4, e, na região referente ao carbono anomérico do H1 , demonstrando o
perfil obtido neste caso onde não há a complexação. Portanto, o conjunto de informações
obtidas relacionadas às análises de caracterização realizadas neste trabalho evidenciou a
formação do complexo com ambos os procedimentos de inclusão empregados (agitador
magnético e sonda de ultra-som). Sendo assim, a partir das informações obtidas com a
caracterização e com os resultados relacionados ao rendimento e a eficiência de inclusão,
optou-se em prosseguir os experimentos utilizando o procedimento com ultra-som.
As etapas anteriores foram de suma importância na escolha do complexo mais
adequado para prosseguimento dos experimentos subsequentes, como a avaliação da
estabilidade em sistemas modelos, frente a fatores importantes para o processamento e
aplicação do complexo em iogurte com a finalidade de avaliar a estabilidade de cor durante a
vida de prateleira e possível utilização como corante natural em alimentos.
5.4.5 ORAC
A atividade antioxidante também foi determinada com o objetivo de avaliar a função
antioxidante do extrato enquanto complexado pela metodologia escolhida para prosseguir
com os experimentos. No método ORAC, função dos antioxidantes é proteger a molécula
fluorescente da degeneração oxidativa ocasionada após a adição do AAPH.
Os resultados obtidos, representados na Figura 27, demonstraram que o complexo de
inclusão apresentou uma atividade antioxidante maior quando comparado ao do extrato bruto,
36,37 miliequivalentes trolox/100 mg de extrato e 47,41 miliequivalentes trolox/100 mg
extrato, respectivamente, indicando que o procedimento de inclusão elevou a atividade
antioxidante do extrato.
O sistema de duplas ligações conjugadas presentes na estrutura dos carotenoides
constitui o grupo cromóforo responsável pelo poder corante dessas substâncias, no entanto,
diante de fatores externos como oxigênio, luz e temperatura, ocorre a degradação oxidativa
causando perda da coloração e das funções bioativas, dentre elas a função antioxidante
(RODRIGUEZ-AMAYA, 2001). Por conta desse fato, técnicas foram desenvolvidas com o
intuito de resolver essas questões, como por exemplo, a inclusão molecular, que possui a
86
capacidade de proteger a molécula hóspede desses fatores adversos em sua cavidade
hidrofóbica e consequentemente evitar a ocorrência de degradações oxidativas. Portanto,
sugere-se que o complexo formado tenha promovido uma proteção das duplas ligações
conjugadas presentes nos carotenoides do extrato de pimentão vermelho, aumentando a sua
atividade oxidante.
Figura 27: Atividade antioxidante do complexo de inclusão e do extrato de pimentão.
As barras de erro indicam o desvio padrão (p < 0,025).
As diferenças estatisticamente significativas foram marcadas com o símbolo *** (p< 0,0001).
5.5 Avaliação da estabilidade do complexo de inclusão em sistema modelo, frente a
fatores importantes para o processamento de alimentos
O presente experimento foi elaborado na tentativa de determinar a estabilidade de cor
do extrato de pimentão vermelho, assim como do complexo entre β-ciclodextrina e extrato,
em função de condições ambientais importantes durante o processamento de alimentos. Estas
condições poderiam estar presentes, em processos térmicos para estabilização microbiológica
de alimentos formulados, como por exemplo, bebidas adicionadas de corante. Sendo assim,
decidiu-se elaborar soluções modelos contendo 0,66 mg/mL de extrato de pimentão vermelho
ou de complexo, que foram submetidas a diferentes valores de pH (entre 3 e 7) e temperatura
(entre 60 e 80 °C), durante diferentes intervalos de tempo (de 1 a 10 minutos). Para execução
deste experimento, utilizou-se um planejamento de um experimento fatorial fracionado 3 2,
87
determinado pelo programa Statistica 7.0, de acordo com o que foi descrito na seção de
materiais e métodos. Na análise deste experimento, é possível avaliar a influência dos 3
parâmetros estudados, bem como das interações entre estes fatores, concorrendo para
determinar a estabilidade de cor em situações que modelam o que ocorre num processo real.
Uma versão mais recente deste programa (Statistica 10.0) foi utilizada na avaliação estatística
dos resultados, que avaliou o efeito de cada variável sobre as respostas (parâmetros de cor) e
usou um modelo quadrático para simular a variação dos índices de cor em função do pH,
temperatura e tempo de aquecimento.
Cabe ressaltar que foi necessária a adição de dimetilsulfóxido (DMSO) ao extrato para
que este pudesse apresentar-se na forma de solução em água, enquanto que isto não foi
necessário para preparar a solução do complexo.
A influência do pH, temperatura e tempo de aquecimento, assim como da interação
entre estes fatores sobre os parâmetros de cor L* (grau de claro e escuro), a* (grau de
vermelho) e b* (grau de amarelo), pode ser visualizada pelos gráficos de Paretto, mostrados
nas Figuras 28, 29 e 30. Nos gráficos apresentados, as barras que ultrapassam a região a
direita da vertical onde está indicado p=0,05 denotam os parâmetros que apresentam efeito
significativo sobre o parâmetro avaliado.
Assim sendo, para o índice L* (grau de claro e escuro), no caso do extrato, pode-se
observar que diversos fatores influenciaram com significância estatística, os valores medidos,
sendo que, em ordem decrescente, os fatores importantes foram: tempo de aquecimento,
interação entre temperatura e tempo, interação entre pH e tempo, interação entre pH e
temperatura, temperatura e pH (efeito quadrático). Por outro lado, para o caso do complexo, o
único fator que apresentou efeito significativo foi a interação entre tempo e temperatura,
indicando que somente a interação entre estes dois parâmetros foi significativa para alterar o
valor L*. Estes resultados podem ser apontados como indicadores de que a inclusão do extrato
na β-ciclodextrina aumenta a estabilidade do valor L* de amostras em solução.
Para o valor a* (índice de vermelho) do extrato, a Figura 29 indica que todos os
parâmetros avaliados, assim como todas as interações entre eles, apresentaram efeitos
significativos, indicando que a* varia conforme ocorre a variação destes parâmetros e com a
interação entre eles. Já para o complexo, houve efeito significativo sobre o índice a* da
interação entre pH e tempo, temperatura, tempo e pH, indicando que a estabilidade do índice
a* é influenciada por um número menor de parâmetros, denotando menor influência dos
parâmetros ambientais avaliados sobre o grau de vermelho do complexo em relação ao
extrato.
88
Já para o índice b* (grau de amarelo) do extrato, todos os parâmetros avaliados, bem
como as interações entre eles, apresentaram efeito significativo, indicando que o índice b* do
extrato em solução é influenciado por todos os fatores estudados. Para o complexo, os
parâmetros com efeito significativo foram interação entre pH e tempo, pH e temperatura,
denotando, mais uma vez, que o complexo é menos sujeito ao efeito dos fatores ambientais
durante o aquecimento que o extrato, o que indica maior estabilidade de cor amarela do
complexo frente aos parâmetros avaliados.
Estes resultados, avaliados em conjunto, demonstram que, no caso do uso do
complexo para a formulação de alimentos sujeitos a tratamentos térmicos, em diferentes
valores de pH, temperatura e tempo de aquecimento, pode-se esperar maior retenção dos
parâmetros de cor com o uso do complexo do que com o uso do extrato.
Figura 28: Gráficos de Paretto indicando os efeitos do pH, temperatura e tempo de
aquecimento sobre o índice L* das soluções do extrato de pimentão vermelho e do complexo
β-ciclodextrina/extrato
89
Figura 29: Gráficos de Paretto indicando os efeitos do pH, temperatura e tempo de
aquecimento sobre o índice a* das soluções do extrato de pimentão vermelho e do complexo
β-ciclodextrina/extrato
Figura 30: Gráficos de Paretto indicando os efeitos do pH, temperatura e tempo de
aquecimento sobre o índice b* das soluções do extrato de pimentão vermelho e do complexo
β-ciclodextrina/extrato
90
As Figuras 31, 32 e 33 mostram superfícies de resposta, indicando as variações,
respectivamente, de L*, a* e b* em função de parâmetros com efeitos significativos sobre
estes índices de cor, denotando maior estabilidade para o complexo que para o extrato. Pode-
se notar que as superfícies que representam as variações dos índices de cor do complexo, em
geral, mostram-se mais planas, com poucas curvas de nível. Estas curvas de nível
representam as combinações de fatores que causam mudança na resposta avaliada. Notar
também, nas legendas, que as faixas de variação, em geral, são menores para o complexo.
91
Figura 31: Superfícies de resposta mostrando as variações do índice L* para extrato e
complexo em função do tempo e pH (temperatura fixa de 70 °C), temperatura e pH
(tempo fixo de 5 minutos) e tempo e temperatura (pH fixo no valor de 5).
92
Figura 32: Superfícies de resposta mostrando as variações do índice a* para extrato e
complexo em função do tempo e pH (temperatura fixa de 70 °C), temperatura e pH
(tempo fixo de 5 minutos) e tempo e temperatura (pH fixo no valor de 5).
93
Figura 33: Superfícies de resposta mostrando as variações do índice b* para extrato e
complexo em função do tempo e pH (temperatura fixa de 70 °C), temperatura e pH
(tempo fixo de 5 minutos) e tempo e temperatura (pH fixo no valor de 5).
94
5.6 Avaliação da estabilidade de cor de iogurte adicionado do complexo carotenoides de
pimentão/ciclodextrina
O iogurte é um alimento com elevada qualidade nutricional devido à diversidade e
quantidade de nutrientes presentes em sua composição, sendo consumido por indivíduos de
todas as faixas etárias. Portanto, a adição de corantes artificiais tem como finalidade melhorar
as características sensoriais tornando o produto mais atrativo para o consumidor. Todavia, de
acordo com a literatura, o consumo destes aditivos está associado a riscos toxicológicos. Para
a obtenção das colorações que sugerem a presença de mamão, morango e frutas vermelhas em
iogurtes, algumas indústrias lançam mão dos seguintes corantes artificiais: amarelo
crepúsculo (INS 110), ponceau 4R (INS:124) e bourdeaux (INS 123) ou da combinação de um
desses dois com o corante natural carmim de cochonilha para obtenção do iogurte de morango , e
a combinação do azul brilhante e ponceau 4R ou bourdeaux para obtenção do iogurte frutas
vermelhas.
O extrato de pimentão vermelho quando adicionado ao iogurte, consegue simular a
coloração do iogurte comercial sabor mamão, porém devido à questão de estabilidade e baixa
solubilidade, promove uma dificuldade de dispersão do extrato no produto, a utilização deste
extrato em produtos industrializados pode tornar-se um fator crítico. Sendo assim, na tentativa
de melhorar a estabilidade e solubilidade dos carotenoides do pimentão vermelho, realizou-se
a técnica de inclusão molecular em β-ciclodextrina com posterior aplicação no iogurte e desta
forma obter um produto de coloração estável ao longo de sua vida de prateleira, o qual possa
ser indicado como substituto dos iogurtes industrializados coloridos artificialmente. Foi
possível observar que a homogeneização do extrato no iogurte foi mais difícil do que a
homogeneização do complexo em β-ciclodextrina, já que, utilizando-se o extrato, a completa
solubilização foi mais lenta. Além disso, durante os 60 dias de armazenamento, observaram-
se pontos alaranjados não homogêneos no iogurte adicionado do extrato, o que não foi
observado no iogurte adicionado do complexo com β-ciclodextrina/extrato, o que pode ser
observado através da Figura 34.
95
Figura 34: Iogurte adicionado do extrato de pimentão vermelho (a)
e iogurte adicionado do complexo (b).
A estabilidade de cor do iogurte adicionado de extrato de pimentão vermelho
encapsulado em β-ciclodextrina foi avaliada pelos parâmetros de cor (L*, a* e b*) por
espectrofotometria de reflectância durante sessenta dias, período escolhido com base na vida
útil média de iogurtes encontrados no mercado nacional.
A Figura 35 apresenta a variação do índice L* (luminosidade) para todos os grupos de
iogurte. Para todos os grupos de iogurte, a saber: iogurte sem adição de corante (ISC); iogurte
com adição do complexo (ICC); iogurte com adição de extrato bruto (ICE) e iogurte com
adição de corante sintético amarelo crepúsculo (ICA), as análises estatísticas realizadas por
ANOVA demonstraram diferenças significativas (p < 0,05) entre os valores medidos nos
tempo zero e sessenta dias de armazenamento. Para o grupo ISC, a diferença entre o tempo
zero e sessenta dias foi maior que para os outros grupos. No entanto, para os outros grupos, as
diferenças em relação ao grau de claro e escuro das amostras, embora significativas como
detectadas pela análise estatística, foram pequenas demais, e talvez nem sejam detectadas
visualmente.
a b
96
Figura 35: Variação do índice L* (grau de claro/escuro) de iogurtes sem adição
de corante (ISC), extrato bruto (ICE), complexo (ICC) e corante sintético
amarelo crepúsculo (ICA) avaliados durante 60 dias (média ± desvio padrão).
O índice a* representa o grau de vermelho sendo influenciado pelos carotenoides
presentes no extrato do pimentão vermelho. A Figura 36 apresenta a variação do índice a* nas
amostras de iogurte estudadas. As análises estatística de variância (ANOVA) indicaram que
houve diferença significativa (p < 0,05) para os valores medidos entre o tempo zero e os
sessenta dias de armazenamento para todos os grupos, inclusive para o grupo onde foi
utilizado o corante artificial.
Os resultados demonstraram que entre o tempo zero e o tempo sessenta de
armazenamento, houve uma variação do índice a* em 0,72 % para o grupo iogurte com
aditivo artifical (ICA), 11% para o grupo iogurte com extrato (ICE), 13 % para o grupo
iogurte com complexo (ICC) e 24 % para o grupo iogurte sem corante (ISC). Embora a
variação percentual do índice a* entre os tempos zero e sessenta para o grupo ICC tenha sido
2% mais alta do que o grupo ICE, os dados plotados demonstraram que entre o tempo zero e o
tempo dez, ocorreu uma variação do índice a* de 12,63% para o grupo ICE enquanto que para
o grupo ICC, a variação foi de 6,56%. Além disso, a variação do índice a* no ICC foi mais
lenta que no grupo ICE, indicando proteção da cor vermelha maior do que no iogurte que
recebeu o extrato não complexado, visto que, nesta amostra, uma diferença maior na cor
vermelha já pode ser observada aos 10 dias de armazenamento.
0 10 20 30 40 50 600
20
40
60
80
100ISC
ICE
ICC
ICA
Tempo (dias)
Valo
rL
*
97
Figura 36: Variação do índice a* (grau de verde/vermelho) de iogurtes sem adição
de corante (ISC), extrato bruto (ICE), complexo (ICC) e corante sintético
amarelo crepúsculo (ICA) avaliados durante 60 dias (média ± desvio-padrão).
A Figura 37 apresenta a variação para o índice b* (amarelo) para todos os grupos de
iogurte. As análises estatísticas demonstraram diferença significativa (p < 0,05) entre os
valores medidos no tempo zero e aos 60 dias de armazenamento de armazenamento para aos
grupos ICA e ICE. Apesar das análises estatísticas apresentarem diferença significativa para o
grupo ICA, o aumento de 0,67% do índice b* entre o tempo zero e o sessenta foi tão pequeno
que não representaria diferença real no grau de cor amarela do iogurte. Em relação ao grupo
ICE, os dados plotados no gráfico demonstraram que houve uma redução de 8,30% para o
índice b* entre o tempo zero e o tempo dez, indicando uma perda da cor amarela durante esse
período de armazenamento, e, entre o tempo zero e o sessenta, observa-se uma variação
percentual de 5,0% demonstrando uma redução da coloração amarela durante todo o
experimento. Para o grupo ISC, não houve diferença significativa apenas entre o tempo dez e
o tempo zero, mas para os demais tempos observou-se diferença significativa, muito embora o
gráfico demonstre que, visualmente, o índice b* não variou ao longo do experimento. Em
relação ao grupo ICC, houve diferença significativa entre o tempo zero e os tempos dez, vinte,
trinta, cinquenta e sessenta, exceto entre o tempo quarenta e zero. As variações percentuais
observadas entre o tempo zero e os tempos dez,vinte, trinta, cinquenta e sessenta foram 1,8%,
0,4%, 2,26%, 2,14% e 2,34 %, respectivamente, indicando pequena perda da coloração
amarela. Porém, vale ressaltar que a variação do índice b* entre o tempo zero e o dez para o
grupo ICC foi menor (1,8%) em comparação ao grupo ICE (8,30%), assim como entre o
10 20 30 40 50 60
-10
0
10
20
30ISC
ICE
ICC
ICA
Tempo (dias)
Valo
ra*
98
tempo zero e o sessenta, 2, 34% (ICC) e 5,0% (ICE), indicando que o complexo proporcionou
uma maior estabilidade da cor amarela no iogurte comparado ao grupo com extrato que
apresentou uma redução da coloração amarela mais acentuada durante todo o experimento.
Figura 37: Variação do índice b* (grau de azul/amarelo) de iogurtes sem adição
de corante (ISC), extrato bruto (ICE), complexo (ICC) e corante sintético
amarelo crepúsculo (ICA) avaliados durante 60 dias (média ± desvio-padrão).
Na literatura consultada, não foram encontrados estudos de estabilidade similares para
comparação com os encontrados no presente trabalho.
É relevante ressaltar que, apesar do complexo entre ciclodextrina e extrato demonstrar
maior estabilidade de cor durante o armazenamento, embora as diferenças em relação ao
extrato tenham sido pequenas, o material complexado demonstrou maior facilidade para
dissolução e o iogurte com complexo apresentou-se homogêneo durante todo o
armazenamento, o que não ocorreu com o extrato não complexado. Além disso, o ensaio de
atividade antioxidante mostrou que o complexo possui valor ORAC mais elevado que o
extrato, indicando que a adição do complexo ao iogurte pode contribuir para a obtenção de
alimento de maior apelo como produto funcional.
0 10 20 30 40 50 600
10
20
30ISC
ICE
ICC
ICA
Tempo (dias)
Valo
rb
*
6 CONCLUSÕES
O presente trabalho demonstrou que a mistura de solventes etanol:água, seguida da
partição em hexano, foi mais adequada para extração dos pigmentos de pimentão vermelho
seco do que a mistura hexano:acetona.
As análises de CLAE permitiram a identificação dos principais carotenoides presentes
no extrato saponificado, que foram capsantina, capsorubina, β-criptoxantina e β-caroteno.
A espectrofotometria de absorção confirmou o efeito solvatocrômico do hexano,
etanol e diclorometano sobre os cromóforos presentes nos pigmentos do extrato de pimentão
vermelho e a espectrofotometria de refletância reforçou a ocorrência deste efeito a partir das
mudanças dos índices de cor L*, a* e b* quando o extrato foi solubilizado em hexano, etanol,
etanol:água e diclorometano. Além disso, o valor do índice a* do extrato solubilizado em
etanol:água foi maior comparado aos demais solventes proporcionando maior emissão da cor
vermelha.
A espectrofotometria de reflectância confirmou que a variação de pH exerce uma
maior influência na alteração dos parâmetros de cor L*, a* e b* do extrato comparado ao
complexo.
Os testes de inclusão revelaram que, para o presente estudo, a β-ciclodextrina
apresentou melhores resultados comparado a α- e metil β-ciclodextrina. O procedimento de
inclusão com sonda de ultra-som proporcionou maiores rendimentos e eficiência de inclusão
comparado a agitação magnética.
As análises de caracterização revelaram a ocorrência de inclusão para ambos
procedimentos, sonda de ultra-som e agitação magnética, entretanto o infravermelho e a
análise térmica diferencial confirmaram uma melhor interação entre o extrato e a
ciclodextrina quando utiliza-se a sonda de ultra-som. O tamanho e a distribuição de partículas
demonstraram menores diâmetros e populações mais homogêneas para este procedimento.
O método ORAC indicou que o procedimento de inclusão elevou a atividade
100
antioxidante comparado ao extrato bruto.
O experimento de avaliação da estabilidade da cor demonstrou que o complexo
apresentou maior retenção dos parâmetros avaliados comparado ao extrato quando submetido
a condições que simulam o processamento de alimentos a partir da variação de pH, tempo e
temperatura. O experimento de avaliação da estabilidade de cor do iogurte revelou que o
índice L* variou para todos os grupos de iogurte estudados durante os sessenta dias de
armazenamento. O complexo promoveu maior proteção da cor vermelha comparado ao
iogurte que recebeu extrato não complexado. Em relação ao índice b*, houve uma menor
variação entre o tempo zero e o dez para o grupo ICC em comparação ao grupo ICE, assim
como entre o tempo zero e o sessenta, indicando que o complexo proporcionou uma maior
estabilidade da cor amarela no iogurte comparado ao grupo com extrato que apresentou uma
redução da coloração amarela mais acentuada durante todo o experimento.
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