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Monografia apresentada para a disciplina de Biomoléculas em Superfície - USP - 2005
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Lipídios em superfícies Lipídios em superfícies
Monografia da Disciplina QBQ 5716 – Biomoléculas e Superfícies
Erika Temperly RabakTathyana Cristina M. C. Tumolo
Vinícius Curcino C. Vieira
2005
1
Resumo............................................................................................3Introdução..........................................................................................................4Técnicas para a formação de filmes lipídicos................................................7
Filmes de Langmuir-Blodgett (LB)...................................................................7Adsorção de filmes lipídicos em suportes sólidos a partir de vesículas........11“Black lipid membranes (BLM)”......................................................................17Filmes na interface ar-líquido (filmes de Langmuir).......................................19
Técnicas utilizadas na caracterização de filmes lipídicos e em suas interações com outras moléculas..................................................................21
Microscopia de Força Atômica (AFM)............................................................21Ressonância Plasmônica de Superfície (SPR)..............................................25Elipsometria...................................................................................................29QCM-D (Microbalança de Cristal de Quartzo com dissipação).....................31Microscopia de Fluorescência.......................................................................34Geração de segunda harmônica em superfície (SHG)..................................37
Conclusão........................................................................................................40Bibliografia.......................................................................................................41
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Resumo
O uso de filmes lipídicos formados em interfaces ar-líquido, líquido-
líquido e sólido-líquido tem sido utilizado com grande freqüência e com grandes
resultados em estudos de interação, como a associação entre proteínas e
membranas. Esses filmes são interessantes de serem estudados pois podem
mimetizar superfícies celulares. Além dos estudos envolvendo filmes lipídicos
adsorvidos em suportes sólidos ou nas interfaces ar-líquido (como os filmes de
Langmuir) e líquido-líquido (“black lipid membranes”), há na literatura também
estudos envolvendo lipossomas e vesículas gigantes em solução.
Após a formação do filme, o mesmo pode ser caracterizado por uma
série de técnicas, tais como microbalança de cristal de quartzo com dissipação
(QCM-D) e microscopia de força atômica (AFM). Pode-se obter informações
sobre a formação da camada lipídica (mono ou bicamada ou ainda se é um
filme vesicular), a cinética de adsorção em determinada superfície e a
espessura e a massa do filme adsorvido.
Uma vez obtido o filme pela técnica desejada e caracterizado por
determinados métodos, diversos estudos podem ser feitos. Entre eles a
interação proteína-membrana, devido à importância biológica dessas
interações e que podem ser mimetizados com um filme lipídico. Como
exemplo, os estudos de interação citocromo c com membranas constituídas de
fosfolipídios carregados negativamente, como a cardiolipina, feitos com o
auxílio de técnicas como a AFM e o SPR, podem conduzir às respostas sobre o
exato mecanismo de dissociação dessa proteína da membrana mitocondrial
interna, evento que está relacionado ao desencadeamento da apoptose (“morte
celular”).
3
Introdução
Os lipídios são compostos muito abundantes na natureza e encontrados
em todas as células. São geralmente insolúveis na água e solúveis em
solventes orgânicos polares como clorofórmio e metanol. Basicamente podem
ser classificados como ácidos graxos, triacilgliceróis, glicerofosfolipídios,
esfingolipídios, e esteróides. (1-2)
Glicerofosfolipídios (também chamados de fosfolipídios) são importantes
compostos de membranas biológicas. Possuem longas caudas hidrofóbicas e
grupos cabeça altamente hidrofílicos, portanto são moléculas anfifílicas. Os
grupos cabeça podem ser carregados positivamente ou negativamente, serem
zwiteriônicos ou ainda possuírem grupos poliidroxilados não-carregados (3). A
Figura 1 exemplifica a estrutura de um fosfolipídio e alguns grupos cabeça que
podem ocorrer.
Figura 1 – Estrutura de um Fosfolipídio e exemplos de grupos cabeça representados por –X que podem ocorrer nessa molécula. As caudas hidrofóbicas são representadas por R1 e R2.
A maioria dessas moléculas fosfolipídicas normalmente se associa em
bicamadas, devido à interações entre as cadeias e entre as cabeças polares. O
modelo de bicamada lipídica (muitos estudos utilizam modelos de
monocamadas lipídicas formadas em interfaces) tem sido muito utilizado para
mimetizar as membranas celulares. Os fosfolipídios mais utilizados em estudos
envolvendo miméticos de membrana são aqueles que apresentam o grupo
cabeça fosfatidilcolina, como DMPC, DPPC e DOPC (fosfolipídios com esse
grupo cabeça estão presentes em maior quantidade nas membranas celulares (4,5). As estruturas para os dois últimos são mostradas na Figura 2.
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CH
H2C
H2C O C
O
R1
O P
O
O X
OC
O
R2
O-
Fórmula de -X Nome do fosfolipídio
H2C CH2 NH3+
H2C CH2 N+
CH3
CH3CH3
H2C CH CH2 OH
OH
Fosfatidiletanolamina
Fosfatidilcolina (lecitina)
Fosfatidilglicerol
1,2-Dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) 1,2-Dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC)
Figura 2 – Estruturas de dois fosfolipídios com o mesmo grupo cabeça, mas com comprimentos da cauda hidrofóbica distintos, além da presença de insaturação na estrutura de DOPC. Esses fosfolipídios são muito utilizados em estudos de formação de filmes lipídicos.
A utilização de fosfolipídios como miméticos de membrana pode ser feita
com os seguintes sistemas: lipossomas, vesículas, vesículas unilamelares
grandes (LUV), “black lipid membrane”, monocamadas e bicamadas lipídicas (6).
O sistema de monocamadas ou bicamadas lipídicas formadas a partir do
contato entre as soluções de vesículas (ou lipossomas) e um suporte sólido
abriu caminho para o estudo da cinética de adsorção desses filmes, além dos
mecanismos envolvidos na associação entre a membrana e o suporte sólido.
Esse sistema mostrou-se eficiente como um modelo mimético de membranas
celulares devido à sua simplicidade e reprodutibilidade, além de possuir
aplicações em biotecnologia e no desenvolvimento de biosensores.
A formação de filmes lipídicos nas diferentes interfaces pode ser
caracterizada por técnicas como a microscopia de força atômica (AFM) (7,8),
microbalança de cristal de quartzo com dissipação (QCM-D) (8,9), geração de
segunda harmônica em superfície (SHG) (10), elipsometria (11), reflectância total
atenuada (ATR) e espectroscopia no infravermelho com transformada de
Fourier (FTIR) (12), microscopia de fluorescência (13,14,15) e ressonância
plasmônica de superfície (SPR) (16,17,18), além de medidas eletroquímicas como
condutância e capacitância (19).
Embora toda a complexidade de constituintes presentes em uma
membrana celular não seja possível de se reproduzir experimentalmente com
esses modelos miméticos, muitos eventos podem ser estudados: adesão
celular em estudos envolvendo interação entre gangliosídeos e fosfolipídeos
presentes em membranas celulares (20,21,22); ação do antimicótico anfotericina B
em miméticos contendo esteróis de membrana (23); associação membrana-
proteína (24,25); e membrana-quitosana (utilizada em pesquisas de entregas de
5
drogas e genes) (26,27), imunoensaios (28) dentre outras aplicações em pesquisas
biológicas.
Muitos estudos têm sido feitos também para serem avaliados os modos
de interação entre lipossomas de composição variada em diferentes
superfícies, como látex (29), aerogéis e xerogéis (13), sílica, mica, ouro oxidado ou
modificado com alcanotiol (30) e em sistemas poliméricos auto-montados em
superfície sólida (32,32), muitas vezes com os fosfolipídios modificados
quimicamente (33), levando ao desenvolvimento e aprimoramento de
biosensores para detecção de interações biomoleculares.
6
Técnicas para a formação de filmes lipídicos
Os estudos envolvendo a interação entre biomoléculas e membrana
podem ser feitos com modelos miméticos a partir de filmes lipídicos formados
em interfaces. Esses modelos podem ser formados na interface líquido-ar
(filmes de Langmuir), em interface líquido-líquido com um suporte sólido (“black
lipid films”), e também em superfícies sólidas, as quais podem estar
modificadas ou não. Os métodos utilizados na formação desses filmes são
mostrados a seguir.
Filmes de Langmuir-Blodgett (LB)
Para a formação de filmes pela técnica de Langmuir-Blodgett, deve-se
primeiramente considerar a formação de uma monocamada do composto
anfifílico em uma interface líquido-ar, a partir de uma solução do anfifílico
preparada em solvente orgânico. A monocamada é formada na interface com a
evaporação do solvente. Estudos cinéticos mostram duas etapas para a
formação dessa monocamada, esquematizadas simplificadamente na Figura 3.
Figura 3 – Reorganização interfacial das vesículas, durante a formação de uma monocamada na interface ar-água (34).
A essa monocamada é aplicada uma pressão levando a auto-
organização das moléculas, enquanto um substrato sólido é movimentado na
interface ar-monocamada, em sentido vertical ascendente, ou ainda
descendente. Isso permite a deposição da monocamada sobre o substrato, e
se a movimentação do substrato for feita várias vezes pode-se obter um filme
orientado com mais de uma camada e de espessura definida (35). Um esquema
para a deposição desses filmes é mostrado na Figura 4.
7
Com a realização de repetidos movimentos no substrato sólido (para
cima e para baixo) na interface líquido-ar, pode-se obter filmes como os
ilustrados na Figura 5.
Figura 4 – Aparato utilizado para a deposição de filmes LB em substrato sólido. São indicados: a) uma cuba, feita usualmente de Teflon; b) uma barra móvel, que permite o controle da pressão aplicada à monocamada; c) motor que movimenta a barra; d) dispositivo para controle da pressão exercida sobre o filme; e) dispositivo para medir a pressão na superfície; f) motor para movimentar o substrato sólido; g) substrato sólido(32)
Figura 5 – Formação de filmes com multicamadas pela técnica de Langmuir-Blodgett.
8
Primeira camada
Segunda camada
Terceira camada
Primeira camada
Segunda camada
Terceira camada
Na formação de filmes por essa técnica, algumas considerações devem
ser feitas. O ambiente deve estar livre de contaminantes, com vibração
minimizada e ter controle de temperatura, atmosfera e umidade. A fase líquida
é geralmente água, com pH e força iônica controlados, pois muitos anfifílicos
são susceptíveis a essas variações. Além disso, os anfifílicos utilizados devem
estar livres de contaminantes, pois qualquer impureza poderá ser incorporada
durante a formação do filme.
A natureza do substrato utilizado para deposição do filme será
modificada após a formação da primeira camada. Se o processo de deposição
for iniciado em um substrato hidrofílico, ele torna-se hidrofóbico após a primeira
transferência de monocamada. Considerando moléculas de fosfolipídios
adsorvidas em uma superfície hidrofílica, após a deposição da primeira camada
as caudas hidrofóbicas das moléculas estarão voltadas para a solução e na
próxima deposição as caudas hidrofóbicas dos fosfolipídios irão interagir, de
modo que as cabeças polares estarão voltadas para o líquido, e haverá uma
bicamada adsorvida no filme. Este tipo de deposição é também chamado de
tipo Y. Para muitos grupos cabeça polares este é o modo de deposição mais
estável, pois entre as monocamadas adjacentes as interações são hidrofóbica-
hidrofóbica ou hidrofílica-hidrofílica (36).
Outro tipo de deposição também já observado para multicamadas de
fosfolipídios é o do tipo Z, onde as interações entre as monocamadas
adjacentes são do tipo hidrofílica-hidrofóbica. A Figura 6 ilustra a diferença
entre os tipos Y e Z, encontrados em multicamadas de fosfolipídios.
Figura 6 – Tipos distintos de deposição para filmes lipídicos em multicamadas.
Embora a deposição de filmes lipídicos pelo tipo Y já fosse conhecida (37,38), a formação de filmes multicamadas pelo tipo Z foi mostrada
9
primeiramente em artigo de 1988 utilizando DPPC, onde os autores utilizaram a
técnica de ATR FTIR a fim de estudar a estrutura desses filmes (39). Foi
sugerido que os três grupos metila ligados ao nitrogênio no grupo cabeça
poderiam exercer um importante papel na redução do caráter hidrofílico do
grupo cabeça na monocamada formada na interface. Isso resultaria em uma
energia livre melhor para a interação com a superfície hidrofóbica, levando à
formação de filmes tipo Z estáveis.
A deposição de uma monocamada de fosfolipídios pela técnica de
Langmuir-Blodgett pode ser feita também em um substrato já modificado
quimicamente. Foi estudada recentemente a deposição de uma monocamada
de DPPC em uma superfície oxidada de sílica previamente modificada por
domínios de uma monocamada automontada de octadeciltriclorosilano (40),
devido ao grande potencial desses domínios para ancorar moléculas, inclusive
moléculas de fosfolipídios, levando ao aumento da estabilidade do filme lipídico
adsorvido. Para a formação da monocamada de DPPC, uma solução de DPPC
preparada em clorofórmio foi colocada gota a gota na água contida em uma
cuba de Langmuir, e após a evaporação do solvente, a monocamada de DPPC
formada na interface ar-água foi transferida para o substrato sólido aplicando-
se um pressão de 35 mN/m e com velocidade de movimentação vertical do
substrato 5 mm/min, no sentido ascendente.
Filmes LB lipídicos podem também ser formados por misturas de
fosfolipídios. A fim de serem utilizados como modelos de membrana celular,
filmes LB formados por DPPC / DOPC / gangliosídeo GM1 foram depositados
em superfície de mica, variando-se a porcentagem de cada um dos compostos
para a obtenção de filmes com a composição variada. A mistura de DPPC /
DMPC / gangliosídeo foi preparada em clorofórmio/metanol (9:1), colocada com
o auxílio de uma microseringa na solução aquosa da cuba e após a
evaporação do solvente, uma monocamada constituída pela mistura de lipídios
foi formada no substrato, com velocidade de compressão da monocamada
20mm/min, pressão na superfície 30 mN/m, e velocidade de deposição na mica
5 mm/min. As monocamadas obtidas com as diferentes composições foram
analisadas por AFM (22).
Adsorção de filmes lipídicos em suportes sólidos a partir de vesículas
10
Um método muito utilizado no estudo das propriedades de membranas e
suas interações com biomoléculas é a formação de monocamadas ou
bicamadas lipídicas sobre suportes sólidos, como sílica e mica. Este modelo é
muito utilizado como um mimético de superfície celular, e pode ser também
formado sobre suportes poliméricos finos. Avanços nessa área tem
possibilitado uma variedade de estudos envolvendo membranas, proteínas de
membrana, imunoensaios e aprimoramento de biosensores (41). A formação
dessas camadas lipídicas é comumente feita com o uso de vesículas ou
lipossomas adsorvidos em um suporte sólido, que pode ser modificado ou não.
O preparo de lipossomas é iniciado pela dissolução dos fosfolipídios de
interesse em um solvente orgânico, como clorofórmio, seguindo com a
evaporação desse solvente para que um fino filme lipídico seja formado no tubo
onde a solução estava contida. Com uma solução tampão esse filme pode ser
resuspendido, levando a formação de lipossomas com muitas bicamadas.
Entre essas bicamadas há um espaço aquoso que pode ser utilizado em
estudos de transporte e permeabilidade de membranas. Por ser um sistema
com propriedades reprodutíveis, pode ser utilizado também em vários estudos
biofísicos. Entretanto, possui entre as desvantagens a heterogeneidade em
tamanho de número de bicamadas e a inabilidade de se acessar os dois lados
da bicamada quando utilizadas em estudos eletroquímicos.
Os problemas na heterogeneidade no tamanho e no número de
camadas em soluções de lipossomas podem ser resolvidos com a utilização de
vesículas, formadas por métodos que permitam a homogeneidade dos
agregados presentes na solução (os métodos mais utilizados são extrusão e
sonicação). Agregados conhecidos como vesículas pequenas unilamelares
(SUV) são formadas por esses métodos, e pode-se diferenciar esses
agregados das lipossomas através de medidas por espalhamento de luz (SUV
possuem diâmetro menor que as lipossomas, sendo formados por apenas uma
bicamada lipídica). Entretanto, o pequeno tamanho desses agregados resulta
em um pequeno raio de curvatura comparado ao de muitas membranas
celulares. Desse modo, o empacotamento observado na bicamada não
mimetiza o empacotamento de membranas biológicas, além do pequeno
espaço aquoso disponível internamente, fazendo com que essas vesículas não
sejam úteis em estudos de transporte. A formação de vesículas unilamelares
11
com diâmetro de cerca de 1 m (LUV, large unilamellar vesicles) pode ser feita
utilizando o método de extrusão, e tais agregados podem ser utilizados em
estudos de transportes de drogas, por exemplo, por apresentarem um espaço
aquoso maior do que aquele observado para as lipossomas e as vesículas
unilamelares pequenas (3,6).
A formação de uma bicamada lipídica em sílica já foi estudada pela
adição de SUV – formadas por PC, DPPC, DODAB (brometo de
dioctadecildimetilamônio) e DHP (dihexadecilfosfato) – às partículas hidrofílicas
de sílica (Aerosil OX-50) colocadas em eppendorf e levadas ao vórtex. Após o
período de sedimentação das partículas no eppendorf e centrifugação, a
porção sobrenadante foi utilizada para determinar as concentrações dos
compostos utilizados. A construção das curvas de isotermas de adsorção
forneceu as informações sobre as diferentes afinidades desses compostos
pelas partículas de sílica hidrofílica (42). Dando continuidade a essa pesquisa
(excluindo o composto DHP), os autores publicaram um estudo em que dados
experimentais adicionais foram obtidos utilizando o corante merocianina 540
incorporado nas vesículas para detectar a ocorrência de defeitos hidrofóbicos
na bicamada formada na superfície de sílica, conforme esquematizado na
figura 7 (43).
Figura 7 – Esquema da incorporação da molécula de corante na porção externa da vesícula (a porção hidrofóbica da molécula do corante situa-se na porção hidrofóbica da vesícula), e posterior adsorção na superfície de sílica. Informações sobre a bicamada lipídica foram obtidos por dados de absorbância (43).
Em análises por QCM-D (microbalança de cristal de quartzo com
dissipação), camadas de sílica e mica são evaporadas na superfície do cristal,
seguindo os procedimentos descritos na literatura (9,30,44). Se uma solução de
vesículas for colocada em contato com essas camadas, já na cela do
equipamento, o processo de adsorção com formação da camada lipídica é
12
iniciado e pode ser monitorado em função do tempo pela técnica de QCM-D (8,9,30,44,45).
Superfícies de ouro do sensor utilizados em equipamentos de
Ressonância Plasmônica de Superfície (SPR) são modificados com uma
monocamada auto-montada de alcanotiol (SAM), deixando a superfície
hidrofóbica e permitindo que o processo de formação de uma monocamada
lipídica ocorra sobre essa superfície quando uma solução contendo vesículas a
cela de fluxo do equipamento, onde está localizado o sensor. Esses filmes são
denominados de membranas de bicamada híbrida (HBM), por serem formados
por uma monocamada de alcanotiol e por uma monocamada lipídica (46,48,49). A
formação de bicamadas lipídicas sobre uma monocamada auto-montada de tiol
também já foi descrito na literatura, com a utilização de uma molécula de
colesterol modificada com um grupo –SH inserida entre moléculas de tiol com
terminação hidroxila (49,50). A Figura 8 ilustra a bicamada lipídica formada sobre
esse suporte.
Figura 8 – Modelo de uma bicamada lipídica formada por um único fosfolipídio adsorvida sobre uma camada mista auto-montada de tiol (49).
Bicamadas lipídicas podem ser formadas também sobre suportes
poliméricos, inclusive polieletrólitos. Para estudar a formação de bicamada
contendo os fosfolipídios 1-estearoil-2-oleoil-fosfatidilserina (SOPS) e 1-
palmitoil-2-oleoil-fosfatidilcolina (POPC) em um suporte polimérico, uma
camada do polieletrólito cloreto de polidialildimetilamônio (PDDA) foi montada
sobre uma superfície de ouro modificada com ácido 11-mercaptoundecanóico
(MUA) (51). Tal sistema foi utilizado para impedir o contato entre a bicamada
13
lipídica e o substrato. Após a adsorção da camada de MUA (carregada
negativamente), uma solução contendo PDDA foi deixada em contato com
essa superfície modificada, a fim de que uma camada do polieletrólito fosse
formada, via interações eletrostáticas. Soluções de vesículas formadas apenas
por SOPS ou pela mistura SOPS / POPC foram colocada em contato com esse
sistema, e a adsorção monitorada por SPR e também por voltametria cíclica. A
inserção do peptídio protegrina-1 – que forma canal iônico em membranas,
possui atividade antimicrobiana e tem preferência por membranas de células
de bactérias carregadas negativamente – foi monitorado, concluindo-se que o
sistema utilizado como suporte para a bicamada poderia ser utilizado em
estudos envolvendo proteínas de membrana.
Entretanto, proteínas transmembrana maiores que a protegrina-1, se
estudadas nesse sistema, poderiam entrar em contato com a superfície
metálica, prejudicando sua mobilidade na membrana (41). Tal observação levou
ao desenvolvimento de um sistema multicamada formado pelos polieletrólitos
cloreto de polidialildimetilamônio (PDDA) e poliestirenosulfonato (PSS),
montados sobre a camada de MUA (31), o qual devido a sua espessura ser
maior do que para o sistema MUA / PDDA poderia ser utilizado em estudos de
proteínas transmembranas grandes. No estudo, após a adsorção da camada
de MUA, soluções de PDDA (positivo), PSS (negativo) e novamente PDDA
foram colocadas consecutivamente, de modo que o sistema é formado camada
por camada, via interações eletrostáticas entre os polieletrólitos. Soluções de
vesículas formadas apenas por SOPS ou pela mistura SOPS / POPC foram
colocada em contato com esse sistema, e a adsorção monitorada por SPR e
fluorescência. Novamente, a inserção de protegrina-1 foi monitorada, obtendo
resultados satisfatórios nessa associação membrana-peptídio observados
também por AFM. Assim, demonstrou-se a aplicabilidade desse sistema para
estudos que envolvem proteínas transmembranas, o qual previne que as
proteínas adsorvidas na bicamada entrem em contato com a superfície
metálica além de permitir a mobilidade lateral dos componentes de membrana
estudados, reproduzindo as características de uma célula. São apresentados
na Figura 9 dois esquemas que ilustram os sistemas utilizados nesses estudos.
14
Figura 9 – Ilustração dos sistemas de polieletrólitos utilizados na formação de bicamada lipídica para o estudo da interação membrana-peptídio (31,51).
Ainda focalizando o estudo de proteínas de membrana, um novo método
para a formação de bicamada lipídica em suporte sólido foi proposto visando a
formação de bicamadas lipídicas livres de defeitos em sua estrutura.
Inicialmente uma superfície de óxido de alumínio é silanizada com solução de
aminopropildimetiletoxisilano (ADMS), criando grupos amino nessa superfície.
Uma solução de NHS-LC-biotina é deixada sobre essa superfície por um
determinado tempo e, após um fluxo de tampão, uma solução de estreptavidina
é colocada em contato as moléculas de NHS-biotina adsorvidas na superfície.
Vesículas preparadas com DPPE biotinilado (além de egg-PC e DOPE, estes
em maior porcentagem e também NBD-DPPE) entram em contato com a
camada de estreptavidina. Dessa maneira as interações são estabelecidas
especificamente (estreptavidina associa-se de modo específico com moléculas
de biotina, tanto na superfíce quanto com as moléculas de lipídio biotinilado).
As vesículas não adsorvidas especificamente são removidas com sucessivas
trocas de tampão. A formação de bicamada lipídica é finalizada com a troca da
solução tampão por uma solução 30% de PEG (polietilenoglicol). Nesse
sistema o polímero PEG torna-se um agente de fusão das vesículas,
disparando rapidamente o processo de formação da bicamada lipídica.
Experimentos como esse foram também realizados em uma superfície de vidro,
e os resultados obtidos mostram que a formação e as propriedades das
bicamadas ancoradas são idênticas qualquer que seja o substrato, abrindo
possibilidades para novos estudos. Entretanto a presença de PE nas vesículas
15
mostrou-se essencial na etapa de fusão promovida por PEG. A Figura 10
ilustra as etapas necessárias até a formação de bicamada lipídica induzida por
PEG.
Figura 10 – Esquema da formação de bicamada lipídica em suporte de estreptavidina em duas etapas. No primeira passo as vesículas são acumuladas na superfície modificada por estreptavidina, com especificidade de ligação com os lipídios biotinilados. O segundo passo induz a formação da bicamada com a introdução de PEG no sistema, o qual induz a fusão entre as vesículas imobilizadas (33).
16
“Black lipid membranes (BLM)”
Embora não pertença à categoria de filmes lipídicos formados em
suportes sólidos, o modelo de membranas BLM tem tido uma grande
participação em estudos envolvendo miméticos de membranas biológicas, e
por esse motivo será descrito nesse trabalho. Tendo sido apresentado há mais
de 40 anos, esse modelo é especialmente útil devido à sua sensibilidade à
modificação de propriedades elétricas da membrana, como condutância e
constante dielétrica. É o único sistema a permitir que medidas de condutividade
elétrica sejam feitas, colocando-se eletrodos em ambos lados da bicamada
fosfolipídica (6,52).
O comportamento óptico observado durante a formação dessas
bicamadas resultou na denominação “black lipid membranes”, ou bicamada
lipídica escura. Dois métodos para a formação dessas membranas são
descritos. O primeiro utiliza os lipídios dissolvidos em solvente orgânico, como
decano e hexano, colocados através de uma abertura localizada na parede de
um recipiente de Teflon imerso em solução aquosa. O filme atravessa essa
abertura até a formação de uma bicamada simples. Uma desvantagem é a
permanência do solvente no meio em que se forma a bicamada. O segundo
método faz uso do espalhamento dos lipídios sobre a superfície de um tampão
com o auxílio de um solvente (forma-se desse modo uma monocamada lipídica
na superfície do tampão). Abaixando-se o nível do tampão até a abertura
localizada no substrato sólido, a primeira monocamada é formada. Elevando-se
novamente o nível do meio aquoso há a formação da segunda monocamada,
gerando dessa maneira a bicamada lipídica. Neste caso, a presença de
solvente no meio é menor do que no primeiro método apresentado. Entretanto,
em ambos observa-se que na formação da bicamada a membrana torna-se
opaca devido à interferência destrutiva da luz refletida dos dois lados da
bicamada (sendo percebidos pontos cinza-escuros espalhando-se pelo filme) (6,52). A formação de BLMs é ilustrada na Figura 11.
17
Figura 11 – Esquema da formação de “black lipid membranes”.
Medidas eletroquímicas são então possíveis porque podem ser
colocados eletrodos nas duas faces da membrana, sendo possível também
modificação do tampão em qualquer dos lados em que a membrana está
exposta (6,52,53).
Esse modelo mimético de membrana pode ser aplicado em estudos de
interação membrana-membrana, fusão de membrana, transporte molecular
transmembrana e lateral, transporte de prótons, incorporação de porinas
mitocondriais, entre outras aplicações (52,19,53,54,55). Colocando-se duas BLMs
separadas por distâncias muito curtas pode-se investigar a interação entre as
bicamadas, com aplicação no estudo de fusão de membranas. Utilizando-se
essa fusão, pode-se estudar a assimetria gerada na membrana pela diferença
de composição lipídica entre as bicamadas utilizadas (53).
Em um interessante estudo mostrado na literatura, a interação de
compostos odorantes com uma BLM foi utilizada como base no
desenvolvimento de um sensor potenciométrico para moléculas neutras (56).
Bicamadas de lecitina modificadas com a introdução de -caroteno foram
formadas em um oríficio de uma divisória de Teflon, separando dois meios
contendo NaCl. Mudanças de potencial foram observadas na adição de
soluções etanólicas de alguns compostos odorantes, como citral, mentol e
geraniol, à um dos compartimentos. Foi possível observar o grau de
despolarização da membrana modificada com o -caroteno causado pelos
odorantes, em comparação à uma membrana composta apenas de fosfolipídio,
além do aumento da sensibilidade para detecção de moléculas neutras por
potenciometria.
18
Filmes na interface ar-líquido (filmes de Langmuir)
Filmes lipídicos de Langmuir, formados na interface ar-água, também
não constituem exemplos de camadas lipídicas em suportes sólidos. Mas
devido à sua relevância e a grande quantidade de artigos científicos que
utilizam essa técnica em estudos de formação de filmes lipídicos, um breve
comentário sobre a técnica e algumas aplicações desses filmes são mostrados
a seguir.
A formação de um filme de Langmuir constituído por fosfolipídios segue
basicamente o mesmo estágio inicial de formação dos filmes LB: uma
determinada quantidade de uma solução de fosfolipídio ou uma mistura de
lipídios preparada em um solvente orgânico (geralmente clorofórmio) é
colocada na interface ar-água, de modo que uma monocamada contendo os
anfifílicos seja formada após a evaporação do solvente. Controlando-se a
pressão aplicada à essa monocamada, controla-se também o grau de
organização das moléculas na interface. Entretanto, os estudos com filmes
lipídicos de Langmuir utilizam a monocamada formada na própria interface,
sem a formação de filmes em suportes sólidos, como os filmes LB.
Utilizando filmes na interface ar-água, a interação entre DPPC e
etilpalmitato (EP) foi estudada, obtendo-se isotermas de adsorção que
fornecem informações relevantes sobre o empacotamento dessa monocamada
devido às interações entre os lipídios (57). Os dados experimentais desse
trabalho mostraram que a interação entre DPPC e EP leva à redução da área
superficial por molécula, o que pode ser relevante para sistemas biológicos, já
que a redução na área de membranas pode estar relacionado à diminuição do
tamanho de células e com o aumento de sua esfericidade, com importância na
etapa de diferenciação celular.
Filmes de Langmuir constituídos de dipalmitoilfosfatidiletanolamina
(DPPE) foram utilizados no estudo da interação dessa monocamada com uma
proteína que desempenha papel fundamental na divisão celular de bactérias
(denominada FtsZ). A monocamada formada apenas com DPPE foi escolhida
pelo fato desse fosfolipídio ser o componente principal da membrana interna da
bactéria E. coli (58).
19
A interação entre o antimicótico anfotericina B e monocamadas de
DOPC contendo esteróis de membranas celulares foi estudada a partir da
formação de filmes constituídos de DOPC-ergosterol e DOPC colesterol na
interface ar-água. Informações sobre o modo de associação entre o
antimicótico e as membranas puderam ser obtidas, levantando hipóteses sobre
o mecanismo de ação desse composto que leva à morte da célula microbiana (23).
20
Técnicas utilizadas na caracterização de filmes lipídicos e em suas interações com outras moléculas
A formação de um filme lipídico sobre uma superfície pode ser
caracterizada mediante a utilização de diversos métodos, os quais podem
fornecer informações sobre a cinética de formação do filme, sua topografia,
espessura, massa do material adsorvido, mudança conformacional das
vesículas na superfície, além da homogeneidade e fluidez da camada lipídica.
Os métodos mais utilizados e descritos na literatura para a obtenção
dessas informações são mostrados a seguir, juntamente com uma breve
explicação dos princípios operacionais do método,
Microscopia de Força Atômica (AFM)
A técnica de AFM foi desenvolvida por Bining et al. por volta de 1986 e
desde então tem se destacado por permitir a aquisição de imagens da
topografia de superfícies tanto condutoras como não-condutoras, e em
algumas situações essas imagens possuem resolução atômica (36,59). Os
principais componentes de um microscópio de força atômica são: uma ponta de
prova montada em uma alavanca (cantilever), um sensor de deflexão da
alavanca, um microposicionador piezoelétrico e um mecanismo elétrico para
esse microposicionador.
Um sistema óptico e um fotodiodo quadrante sensível à deflexão da
alavanca são utilizados para a detecção nesses equipamentos. Desajustes da
alavanca podem ser corrigidos com esse sistema. Um esquema ilustrando os
componentes básicos utilizados nessa técnica é mostrado na Figura 12.
21
Figura 12 – Ilustração dos componentes básicos da técnica de AFM e modo de detecção da topologia da superfície da amostra.
As imagens topográficas são obtidas através do movimento da ponta de
prova do microscópio na superfície da amostra causando a deflexão da
alavanca, a qual é proporcional a força de interação que ocorre entre a ponto
da prova e as moléculas na superfície (essa força está na faixa de 10 -9 – 10-10
N) (60). Os modos de imagem podem ser divididos em contato e não contato. A
operação do microscópio na região atrativa define o modo não contato, e nesse
caso a alavanca é puxada por forças atrativas, como van der Waals, e
encontra-se curvada em direção à amostra. Imagens obtidas por contato
formam-se com operações na região repulsiva, e a alavanca está distanciada
da amostra devido às forças repulsivas. Características da ponta de prova
como a sua forma e sua geometria são pontos críticos na obtenção das
imagens. Quanto à alavanca, são importantes a constante de elasticidade (pois
determina a força entre a ponta de prova e a amostra) e a oscilação na
freqüência de ressonância quando a alavanca é movida da sua posição de
equilíbrio (é determinada por propriedades mecânicas da alavanca) (59).
Utilizando-se essa técnica, muitos estudos envolvendo camadas
lipídicas têm sido feitos, como propriedades de membrana e aspectos da fusão
de vesículas, em diferentes substratos, com diferentes composições de
fosfolipídios e também variação na força iônica. Foi demonstrado, por exemplo,
que a presença de cálcio induz a fusão das vesículas em uma superfície de
mica, enquanto que na sua ausência as vesículas adsorviam, mas não ocorria
22
fusão (8,61). Além disso, a técnica de AFM pode ser empregada também nos
estudos de interação membrana com proteínas.
A formação de bicamada lipídica em suporte de estreptavidina foi
monitorada etapa por etapa pela técnica de AFM. As seqüências de tratamento
da superfície até a formação do filme lipídico são mostrados na Figura 13 (33).
Figura 13 – As imagens da seqüência I mostram as etapas de formação da camada de estreptoavidina: a) superfície de óxido de alumínio sem funcionalização; b) após silanização e tratamento com NHS-biotina; c) após 45 minutos com solução de estreptoavidina e lavagem com tampão. A seqüência II mostra as etapas de formação da bicamada lipídica: a) subcamada de streptoavidina, com uniformização da superfície, b) vesículas imobilizadas na subcamada de estreptoavidina; c) após tratamento com PEG; d) controle, a camada lipídica foi removida com detergente (octadecil glicopiranosideo – OG).
Pode ser facilmente observado na imagem c da seqüência II que após o
tratamento uma bicamada lipídica contínua sobre a subcamada de
estreptoavidina é formada.
As imagens por AFM podem ser também obtidas com uma escala de
cores que indica a espessura dos filmes formados. Desse modo,
monocamadas compostas de gangliosideo GM1 / DPPC / DOPC foram
23
investigadas em uma superfície de mica, juntamente com os efeitos da
variação da composição desses lipídios na monocamada. A Figura 14 mostra
diferentes imagens obtidas com a variação na composição dessas camadas (22).
Figura 14 – Imagens por AFM para monocamadas formadas por GM1 / DPPC / DOPC, nas respectivas proporções indicadas.
Nota-se que a topologia da superfície é altamente modificada com a
variação da composição da camada. Estes resultados levaram à sugestão de
que os diferentes “estados” da monocamada dependentes da composição
podem estar relacionados à um papel específico (como transdução de sinal ou
específico reconhecimento celular) desempenhado pelo gangliosídeo GM1 em
cada órgão, pois as concentrações de GM1, DPPC e fosfolipídios insaturados
nas membranas celulares dos órgãos são diferentes.
24
Ressonância Plasmônica de Superfície (SPR)
Informações cinéticas de interações biomoleculares podem ser obtidas
em tempo real através da técnica de SPR, um método muito utilizado na
determinação das constantes de associação e dissociação de moléculas que
ocorrem em uma interface sólido-líquido.
O fenômeno ressonante ocorre como resultado da reflexão interna total
de um feixe de luz em uma interface sólido (metal) – líquido. Essa reflexão é
observada em situações onde a luz se propaga em um meio de alto índice de
refração (como vidro) e após atingir uma interface em um meio com índice de
refração menor, com um ângulo de incidência acima do ângulo crítico, a luz é
refletida totalmente na interface propagando-se novamente no meio de alto
índice de refração. Embora a luz seja totalmente refletida, um componente do
momento de luz incidente, denominado onda evanescente, penetra a uma certa
distância no meio de índice de refração menor. Se a luz incidente é
monocromática e plano polarizada e um filme fino de metal, como o ouro, é
formado na interface entre os meios, a onda evanescente irá interagir com
elétrons livres oscilantes na superfície do filme de metal, gerando plasmons de
superfície. Desse modo, quando ocorre o fenômeno de ressonância
plasmônica de superfície, a energia da luz incidente é perdida no filme de
metal, resultando em um decréscimo na intensidade da luz refletida, para um
determinado comprimento de onda. Esse fenômeno ocorre em um determinado
ângulo da luz incidente, o qual é dependente do índice de refração do meio
próximo à superfície de metal, e também do metal (o vetor da onda plasmônica
depende do índice de refração do metal e da amostra sobre a superfície desse
metal), sendo percebida até uma distância de cerca de 300 nm da superfície de
metal. A troca de uma solução tampão presente na superfície do metal por uma
solução contendo biomoléculas, por exemplo, altera o índice de refração do
meio onde ocorre a penetração da onda evanescente. Com isso, altera-se
também a ângulo de incidência necessário para criar o fenômeno de SPR
(ângulo de SPR), o qual é detectado pelo instrumento. Essa mudança é
igualmente observada durante um processo de adsorção no filme de metal, e
com o monitoramento contínuo das variações no índice de refração, detectadas
como uma variação no ângulo de ressonância, os valores obtidos podem ser
25
colocados em função do tempo, obtendo-se um “sensorgrama”. Amostras de
aspecto opaco também podem ser analisadas por SPR, pois é a onda
evanescente que penetra no meio e não a luz incidente. O tratamento dos
dados fornece valores de espessura do filme formado sobre o metal e
quantidade do composto adsorvido, além da obtenção dos parâmetros
cinéticos. Para determinação desses valores em experimentos de adsorção a
quantidade de material ligado na superfície é obtida pela diferença de valores
obtidos nas leituras da solução tampão e da solução de interesse (62). A figura
15 esquematiza como uma associação entre moléculas pode ser medida em
um equipamento de SPR.
Figura 15 – Ilustração dos componentes de um sensor de Ressonância Plasmônica de Superfície, onde o analito é levado até a superfície do sensor através de uma cela de fluxo. No detector, 1 indica o ângulo de SPR medido com a presença do ligante na superfície do sensor, e 2 é o ângulo observado na ligação entre o analito e o ligante.
A cinética de formação de uma monocamada fosfolipídica a partir de
vesículas em solução em uma monocamada de alcanotiol hidrofóbica foi
descrita por um modelo que considera a concentração de lipídios, difusão e
reorganização das moléculas na superfície (46). Os dados cinéticos que
possibilitaram o tratamento foram obtidos pela técnica de SPR. A Figura 16
mostra o gráfico obtido utilizando-se vesículas com diferentes concentrações
de DMPC adsorvidas em uma monocamada de dodecanotiol auto-montada
sobre ouro.
26
Figura 16 – Cinética de formação de camada lipídica obtida por SPR. As vesículas foram colocadas na cela de fluxo no tempo t=0. Os pontos representam dados experimentais, ajustados com equação apropriada (linha sólida). As concentrações das vesículas em solução são indicadas.
Os dados obtidos neste estudo mostraram que a cinética de formação
do filme lipídico sobre monocamada de alcanotiol ocorre pelo rearranjo das
vesículas na superfície hidrofóbica e é dependente da concentração de lipídio.
Em altas concentrações há dependência da constante de difusão das vesículas (46).
Estudos cinéticos de formação de filme lipídico em monocamadas auto-
montadas de tiol foram também realizadas variando-se a composição do filme
de tiol – com terminação hidrofílica e hidrofóbica, também monitorados por
SPR (49,50,63). Desses estudos, foram propostos possíveis mecanismos para a
adsorção de vesículas nessas superfícies, mostrados na Figura 17.
27
Figura 17 – Possíveis mecanismos para ruptura e fusão de vesículas em superfície de tiol hidrofóbico (a) e hidrofílico (b).
A velocidade inicial de formação de camada lipídica em SAM de tiol com
terminação hidrofílica ou mista é mais rápida do que aquela observada para
SAM de tiol hidrofóbico. Isso deve-se provavelmente à necessidade das
vesículas romperem sua camada externa para permitirem que as caudas
hidrofóbicas entrem em contato com as cadeias alquílicas dos tióis
hidrofóbicos. Posteriormente deve ocorrer a abertura da vesícula e difusão na
camada de tiol. Esses processos são termodinamicamente mais desfavoráveis
do que aqueles necessários para a formação de uma bicamada sobre SAM de
tiol hidrofílico.
A técnica de SPR, além de possibilitar a caracterização cinética da
formação de filmes lipídicos em diferentes superfícies, é também muito
utilizada nos estudos de cinética de associação proteínas e membranas (9,
27,31,51, 64,65).
Elipsometria
A adsorção de filmes em um substrato pode ser monitorada pela técnica
de elipsometria, que fornece também valores de espessura para o filme
adsorvido.
Em um aparelho de elipsometria, uma luz monocromática plano
polarizada (p = ângulo de polarização) atinge uma superfície. Um compensador
muda o feixe de luz refletido que é elipticamente polarizado para plano
28
polarizada (a = ângulo de polarização). Um analisador determina então o
ângulo a, pelo qual o compensador polarizou o feixe. A figura 18 ilustra os
componentes de um elipsômetro típico.
Figura 18 – Descrição esquematizada dos componentes de um elipsômetro.
Esses dois ângulos (a e p) fornecem a diferença de fase entre os
componentes paralelo e perpendicular (), e a mudança na proporção das
amplitudes dos dois componentes (tg ), onde = 2p + /2 e = a. Para uma
superfície limpa, e estão diretamente relacionados ao índice de refração
complexo da superfície e são denominados ângulos elipsométricos. Se um
filme com índice de refração nf adsorver na superfície, esses ângulos estarão
relacionados aos índices de refração complexos tanto do filme quanto do
substrato, e também à espessura do filme. Desse modo, a técnica permite
monitorar fenômenos de adsorção (36,44).
Muitos estudos focam o uso da elipsometria na determinação de
espessura de camadas lipídicas formadas em suporte sólidos, em relação ao
tempo de exposição dos fosfolipídios ao suporte (66,67). Desse modo, variando-
se a composição e a porcentagem dos fosfolipídios estudados, além do
substrato utilizado, pode-se obter a espessura e cinética de formação dos
filmes, além de caracterizar dentre os filmes estudados o que possui melhor
estabilidade para aplicação em estudos com proteínas ou como biosensores.
Os gráficos mostrados na Figura 19 foram obtidos em um estudo de
formação de filme lipídico em wafers de silício variando-se a porcentagem dos
lipídios utilizados.
29
Figura 19 – Formação de filmes constituídos de 50 mol% DPPC, 20 mol% DPPG and 30 mol% DPPE+Colesterol, nas proporções DPPE/Col 0,3; 2 e 14 respectivamente nos gráficos 1,2 e 3. O monitoramento foi feito por elipsometria. O seta em a indica adição de lipossomas, b indica adição de cloreto de cálcio e c indica tampão.
Além dessa superfície, o estudo também mostrou dados cinéticos
obtidos por elipsometria em uma superfície de platina. A adição de cálcio foi
feita para determinar sua influencia na formação do filme lipídico e na sua
estabilidade. O mesmo trabalho mostrou também como a presença de
proteínas (extraídas de cérebro bovino) na preparação de lipossomas pode
influenciar a formação dos filmes (66).
QCM-D (Microbalança de Cristal de Quartzo com dissipação)
Esta é uma técnica custo-efetiva simples e que permite a análise de
massa de amostra adsorvida em determinada superfície baseada no efeito
piezoelétrico. Também analisa a amostra termodinâmicamente, parâmetros
cinéticos e viscoelasticidade do sistema (68).
30
O princípio está na proporcionalidade entre a variação da freqüência de
ressonância do cristal de quartzo e a massa depositada sobre o mesmo. A
freqüência de vibração diminui com pequena quantidade de material
depositado sobre a superfície do cristal piezoelétrico. A relação é dada pela
equação que diz que a variação da freqüência f (Hz) resulta da mudança da
massa M (g) (sendo proporcionais) e é inversamente proporcional à área
piezoelétrica do cristal (em cm2) (69). A Figura 20 esquematiza a técnica.
Figura 20 – Ilustração esquemática de equipamento de QCM utilizado em análises com células.
A técnica se popularizou quando permitiu a análise de mudança de
massas em sistemas líquidos-sólidos e sobre eletrodos de metal. Dentre as
principais vantagens da QCM estão a permissão de captação de sinais mesmo
em mudanças abruptas no sistema; eliminação da necessidade de marcação
da amostra para transdução de sinal e a análise de propriedade de biofilmes
durante sua formação e depois com perturbações na sua natureza.
Um instrumento de QCM-D, utilizado em muitos estudos, monitora
simultaneamente um segundo parâmetro importante, denominado fator de
dissipação do oscilador (D). As medidas de dissipação fornecem informações
qualitativas e também quantitativas sobre as propriedades viscoelásticas do
filme adsorvido e permite o modelamento teórico para a resposta obtida por
QCM-D. A dissipação é geralmente elevada se o filme adsorvido tem um
componente viscoso também elevado. Tal filme deforma com maior facilidade e
dissipa a energia guardada no oscilador devido à fricção interna durante a
31
deformação cíclica na escala atômica. É importante frisar também que a
técnica de QCM-D é sensível tanto à massa do filme adsorvido quanto à massa
de água presente no sistema, como o tampão no interior de vesículas intactas
na superfície e água ao redor de proteínas adsorvidas em determinada
superfície. Além disso, a técnica é também sensível à mudanças de
viscosidade no líquido em contato com o cristal (9,45).
Em um estudo de adsorção em sílica (8), três preparações de vesículas
constituídas por DOPC / DOPS (1:1), DOPC / DOPS (4:1) e DOTAP foram
utilizadas, de modo a investigar as mudanças conformacionais que ocorriam
com as vesículas quando em contato com o suporte de sílica. O monitoramento
foi feito por QCM-D, e os dados obtidos são mostrados na Figura 21.
Figura 21 – Respostas obtidas por QCM-D para a deposição de misturas diferentes de fosfolipídios em sílica. Em (A) DOTAP, (B) DOPC / DOPS (1:1), (C) DOPC / DOPS (4:1). As ilustrações indicam as camadas lipídicas formadas em cada situação (47).
Para vesículas de DOPC / DOPS na proporção 1:1 observa-se que a
frequancia diminui monotonicamente até o equilíbrio em torno de –54 Hz, e a
dissipação aumenta, havendo equilíbrio por volta de 2,9 x 10-6. Esses valores
indicam a formação de uma camada flexível de vesículas (supported vesicular
layer - SVL), adsorvida de maneira estável após a lavagem com tampão. Para
vesículas de DOPC / DOPS com proporção 4:1, observa-se inicialmente o
mesmo caso descrito acima (diminuição na freqüência, aumento na
dissipação), entretanto um segundo estágio é observado, com aumento na
32
freqüência e diminuição na dissipação. Isso indica a adsorção inicial de uma
camada vesicular, seguido pela formação de uma bicamada lipídica contínua
após a ruptura das vesículas. Para os dados obtidos com as vesículas de
DOTAP, há formação de uma bicamada lipídica, com possível rompimento
espontâneo das vesículas.
A adsorção em superfícies diferentes também pode ser verificada com
QCM-D. Vesículas de egg-PC foram estudadas em superfície de ouro
modificada por alcanotiol, sílica e ouro oxidado. A Figura 22 mostra os gráficos
obtidos nesse estudo (30).
Figura 22 – Variações nas freqüências de ressonância e dissipação, para as três superfícies estudadas. As ilustrações indicam as prováveis camadas que são formadas em cada um dos casos.
A freqüência de –13 Hz obtida no experimento com alcanotiol é a
metade do valor observado para a superfície de sílica (-26 Hz), o que indica a
formação de uma monocamada lipídica sobre a camada de alcanotiol. A
formação de bicamada em sílica é novamente precedida da adsorção de
vesículas intactas na superfície (freqüência diminui, dissipação aumenta),
ocorrendo após determinado tempo a ruptura dessas vesículas e formação de
bicamada. Em ouro oxidado há formação de uma camada vesicular, com
saturação alcançada rapidamente. A elevada dissipação indica que a estrutura
do filme adsorvido é diferente de uma monocamada ou bicamada.
33
Microscopia de Fluorescência
Pode-se dizer que nos estudos feitos com microscopia de fluorescência, a
amostra é a própria fonte luminosa. Esta técnica baseia-se no fenômeno de
que certos materiais emitem uma energia detectável como luz visível quando
irradiados com uma fonte luminosa de comprimento de onda específico. A
amostra pode ser tanto fluorescente em seu estado natural (como clorofila e
alguns minerais), como devido à um tratamento com compostos químicos
fluorescentes.
Uma fonte de luz com determinado comprimento de onda, após passar por
um filtro que a “seleciona” para o material a ser analisado, alcança os átomos
da amostra fazendo com que os elétrons sejam excitados para um nível de
energia mais alto. Quando o elétron no orbital de maior energia possui spin
com orientação oposta ao do segundo elétron no orbital inferior a multiplicidade
de spin é a mesma. Isso ocorre no estado excitado singlete. Ao retornar ao
estado fundamental, o elétron não precisa mudar sua orientação de spin.
Nesse retorno ocorre a emissão de luz, e o material fluoresce, o que pode ser
detectado com um microscópio. Para tornar-se visível, a luz emitida é separada
da luz de excitação mais brilhante com um segundo filtro. A luz emitida é de
menor energia e tem comprimento de onda maior. Os esquemas da Figura 23
mostram o modo de detecção simplificado em um microscópio de fluorescência
e o princípio dessa técnica.
34
Figura 23 – À esquerda ilustra-se a detecção da fluorescência de uma amostra. No esquema à direita, é mostrado de que maneira a espécie fluoresce: a energia é absorvida pelo átomo (1), excitando o elétron a um nível mais alto de energia (2). Ao retornar para o estado fundamental, há emissão de fótons, sendo observada a fluorescência (3).
Essa técnica revela a presença de material fluorescente com grande
sensibilidade – cerca de 50 moléculas fluorescentes por mL são suficientes
para serem detectadas. Aliado a isso pode-se estudar também os processos
dinâmicos de macromoléculas, como difusão, constantes de ligação, além de
monitorar importantes funções celulares, como endo e exocitose, transdução
de sinal e geração de potencial transmembrana (70,71).
Sistemas sintéticos, como vesículas poliméricas, podem também ser
estudados com a microscopia de fluorescência (60). Nesses casos, um corante
fluorescente solúvel em água é encapsulado durante a formação das vesículas,
seguido pela exclusão de moléculas de corantes do espaço extra-vesicular (por
cromatografia de exclusão de tamanho, diálise, ultrafiltração ou centrifugação).
A formação de bicamada contínua sobre um suporte de estreptavidina
auxiliado por PEG foi monitorado por fluorescência, entre outras técnicas (33).
As vesículas continham em sua composição o fosfolipídio fluoróforo 1,2-
dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfo-etanolamina-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-il),
NBD-DPPE, em concentração 1 – 2 % em mol. A fluorescência foi utilizada
principalmente para obter dados quanto à eficiência do polímero PEG no
processo de fusão das vesículas, avaliando-se as propriedades de dinâmica
lateral dos lipídios antes e após o tratamento com PEG. As imagens obtidas
são mostradas na Figura 24.
35
Figura 24 – As imagens da seqüência A foram obtidas antes do tratamento com PEG. A seqüência B mostra imagens obtidas após o tratamento com PEG. Como superfície para a camada de streptavidina foi utilizado óxido de alumínio.
Na seqüência A observou-se que as vesículas estão corretamente
imobilizadas no suporte de streptavidina e que a taxa de fusão pode ser
desprezada (coeficiente de difusão 10-11 cm2 s-1). Após o tratamento com PEG
(seqüência B), observa-se um comportamento completamente diferente. O
coeficiente de difusão dos lipídios NBD-DPPE foi estimado em 2 x 10-8 cm2 s-1.
Verificou-se dessa maneira que a presença de PEG provoca a formação de
uma bicamada lipídica contínua no suporte de streptavidina.
Geração de segunda harmônica em superfície (SHG)
A geração de segunda harmônica em superfície é um processo que
surge da radiação de dipolos oscilantes em 2 em um meio induzido não-
36
linearmente por um laser na freqüência , e é permitido apenas em sistemas
sem inversão de simetria sob a aproximação do dipolo elétrico. Este é
geralmente o caso para modos de superfície devido à falta de simetria na
interface de sistemas água-ar, sólido-ar, etc. Portanto o método de SHG
mostra-se versátil para o estudo da orientação molecular em superfícies e pode
ser sensível o bastante para detectar até mesmo a cobertura de uma
submonocamada (36). Os componentes básicos em uma determinação por SHG
são ilustrados na Figura 25.
Figura 25 – Esquema do aparato utilizado na técnica de geração de segunda harmônica de superfície.
Um dos pontos principais da técnica é requerer a falta de simetria em
uma interface a ser estudada, permitindo com isso a visualização de certas
regiões de uma bicamada suspendida. Uma bicamada altamente simétrica
pode não gerar um sinal significante de SHG, a menos que exista alguns
domínios na estrutura que apresentem assimetria através da bicamada. A
figura 26 mostra uma imagem obtida por SHG de uma bicamada suspendida
através de um poro em um substrato de silício.
37
Figura 26 – Imagem por SHG de uma “black lipid membrane”. A imagem foi obtida utilizando microscopia SHG resolvida por polarização. Uma ilustração da bicamada é mostrada à direita da imagem
A imagem da Figura 26 revela duas regiões, uma área central (em
vermelho) que não produz sinal de SHG e uma área que aparentemente
apresenta alguma estrutura. O aspecto dessa bicamada, ilustrado à direita da
imagem, mostra que a região central representa uma bicamada simétrica e de
espessura fina, na qual as caudas hidrofóbicas dos fosfolipídios estão longe de
qualquer solvente orgânico. A região em forma de anel, detectável por SHG,
não possui a simetria da região central e pode produzir sinal (10).
Essa técnica permite também que a dinâmica de formação de bicamada
possa ser acompanhada em relação ao tempo em diferentes substratos, sem a
necessidade de se utilizar um corante no monitoramento. Imagens obtidas da
formação de bicamada de 1-estearoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina
(SOPE) em dois substratos distintos, delrin® (uma resina de acetal) e sílicio,
são mostradas na Figura 27.
38
Figura 27 – Imagens da formação de bicamada de SOPE em Delrin® e silício, mapeadas em intervalos de 22 minutos.
A primeira imagem obtida no substrato de Delrin (seqüência a) é uma
bicamada recém obtida, e as imagens em seqüência mostram sua evolução. A
bicamada sofre um afinamento inicial, seguido por um período de espessura
constante, até que ocorre novamente um afinamento e a bicamada se rompe.
Esse afinamento pode estar relacionado à expulsão do solvente do interior da
bicamada para a região anular. Estas etapas de evolução de bicamada são
geralmente observadas quando se aplica voltagem, mudando o potencial
químico da região anular, forçando a bicamada a ajustar a quantidade de
solvente incorporado para manter o mínimo de energia livre. Se esse ajuste
não ocorre a bicamada rompe. Para a bicamada formada no substrato de silício
(b), as imagens revelam um aumento na porção vermelha (central),
característica de afinamento da bicamada, com expansão radial dessa região.
As regiões azuis e verdes são mais espessas. O afinamento da porção central
começa a ser observado entre a segunda e a terceira imagem. Na última
imagem, a região em vermelho ocupa cerca de 35 % da porção da bicamada.
Tais medidas por SHG com imagem mostram que a técnica é extremamente
sensível à pequenas variações na espessura da bicamada, a qual é um
parâmetro dinâmico.
39
Conclusão
A utilização de filmes lipídicos, seja em superfícies sólidas, em interface
ar-água ou como black lipid membranes, leva à mimetização de membranas
biológicas, tornando possível o estudo de interação de proteínas,
imunoensaios, interação membrana-mebrana, desenvolvimento de
biosensores, entre outros.
O suporte utilizado na formação das camadas lipídicas, desde
alcanotióis sobre uma superfície de ouro até a utilização de estreptoavadina e
multicamadas poliméricas, pode gerar também diferentes linhas de pesquisa,
na busca pela superfície mais estável para a formação das camadas lipídicas.
Esses estudos incluem também a utilização de superfícies diferentes para a
formação desses suportes.
Devido à grande quantidade de fosfolípidos sintéticos e de origem
biológica disponíveis para estudo, pode-se aliar os estudos de superfície com a
formação de camadas lipídicas com diferentes composições de fosfolipídios,
nas mais diferentes proporções. Além de proporcionar os estudos das
propriedades físicas da membrana formada em um suporte sólido.
Pela variedade de pesquisa nas quais os fosfolipídios podem ser
estudados em interfaces, as respostas para os diferentes questionamentos de
mecanismos celulares poderão ser elucidados com a utilização de camadas
lipídicas como sistemas miméticos de membrana.
]
40
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