Universidade Federal do Rio de Janeiro

Departamento de Bioquímica

Prof Rodrigo Volcan Almeida

Lista de Exercícios – Bioquímica Escola de Química

Estrutura e Replicação

1. Quais são os grupos básicos formadores de uma molécula de nucleotídeo?

2. Baseado nos conhecimentos aprendidos sobre a estrutura do DNA e conhecendo uma das fitas (ATG AAT CGC), determine a sua fita complementar.

3. Quantas pontes de hidrogênio são formadas entre as bases A.T e G.C. De posse desta resposta explique o porquê de microrganismos hipertermofílicos possuírem em geral altos índices de G+C.

4. Qual a diferença básica entre a estrutura do DNA e do RNA?

5. O que Erwin Chargaff observou sobre a composição das bases no DNA?

6. Faça um resumo do artigo publicado por Watson e Crick, na Nature, em 1953, que se encontra disponível em http://www.nature.com/nature/dna50/watsoncrick.pdf .

7. Quais as principais diferenças entre os tipos de DNA descritos e em que condições podem ser encontrados nas células?

8. Faça um resumo de como ocorre o processo de replicação de DNA em procariotos, salientando: o mecanismo de reação e as diferenças entre a cópia das duas fitas de DNA.

9. Como foi visto na aula, a replicação do DNA exige um complexo mecanismo de reparo de nucleotídeos erroneamente pareados. Explique, em poucas palavras, o que poderia acontecer se a replicação não contasse com estes mecanismos.

10. Comente, passo a passo, a experiência de Meselson e Sthal a partir da animação disponível no sítio http://www.dnaftb.org/dnaftb/20/concept/index.htm l .

Transcrição e Tradução

1. De posse da seqüência do exercício 2 abaixo, faça os seus respectivos RNAs. Observando os RNAs formados, o que você diria das proteínas que serão formadas: serão iguais ou diferentes?

2. Indicar as regiões –10 e –35 e o nucleotídeo de iniciação na fita senso do promotor da tRNA Tyr de Escherichia coli, apresentado abaixo.

5’ CAACGTAACACTTTACAGCGGCGCGTCATTTGATATGATGCGCCCCGCTTCCCGATA 3’

3’ GTTGCATTGTGAAATGTCGCCGCGCAGTAAACTATACTACGCGGGGCGAAGGGCTAT 5’

3. Introns são “lixo genético”? Por que?

4. A figura apresentada abaixo é uma micrografia eletrônica e uma interpretação esquemática de um híbrido entre a fita anti-senso do gene da ovoalbumina de galinha e seu correspondente mRNA, resultante dos estudos do grupo de Pierre Chambon, que mostrou a existência de introns neste gene. A existência destas seqüências intervenientes foi demonstrada independemente por Phil Sharp e Rich Roberts, em 1977, apesar da idéia parecer inicialmente estranha! A partir disto, identifique os símbolos e números indicados na figura e explique por que processo eles são formados.

5. Especifique a proteína codificada na seqüência de DNA da fita anti-senso que está mostrada abaixo. Assuma que a tradução inicia no primeiro códon da seqüência.

5’ – TCTGACTATTGAGCTCTCTGGCACATAGCA – 3’ Se o DNA acima for uma seqüência da fita senso, a proteína codificada será diferente? Explique e determine a proteína, caso ela seja diferente.

6. Indique os sítios de controle da tradução e a seqüência de aminoácidos especificada no mRNA procariótico apresentado abaixo.

5’ – CUGAUAAGGAUUUAAAUUAUGUGUCAAUCACGAAUGCUAAUCGAGGCUCCAUAAUAACACUUCGAC – 3’

7. Como vimos, os mRNAs de bactérias são geralmente policistrônicos, isto é, cada mRNA codifica mais de uma proteína. Considere um mRNA que codifica duas proteínas e que contém uma seqüência interna não codificante. Sabendo como opera o processo de transcrição e tradução, explique por que o resultado final da tradução deste mRNA policistrônico seria duas proteínas separadas ao invés de uma única proteína mutante híbrida.

8. Células da bactéria Escherichia coli foram cultivadas em meios com diferentes fontes de carbono (glicose e lactose), com concentrações iniciais conhecidas dos açúcares no meio de cultivo. Após crescimento da bactéria até sua fase exponencial, duas alíquotas de células de cada um dos meios foram coletadas, centrifugadas, lavadas e ressuspensas em diferentes frascos contendo apenas tampão fosfato e com a presença de glicose na primeira alíquota e lactose na segunda, para as células cultivadas nas duas fontes de carbono. Note que as células inicialmente cultivadas em glicose são submetidas a diferentes meios, ou com glicose ou com lactose, em condições que não permitem a repressão catabólica nem a indução de síntese protéica, e o mesmo é feito com as células inicialmente cultivadas em lactose. Que resultados são esperados em termos de consumo de açúcar contido no tampão nas quatro diferentes condições experimentais? Explique as bases para a sua proposta. Lembre-se que as enzimas da via glicolítica, para degradação de glicose a piruvato, são constitutivas.

9. Um organismo selvagem foi exposto à radiação ionizante e seu DNA foi seqüenciado, sendo observadas mutações em um gene responsável pela codificação de uma enzima da rota de síntese de um aminoácido essencial, que originaram cepas com genes mutantes diferentes, que são mostrados abaixo.

5’ – ATGATTGCGGTGTTACGCGGATGGTGCTTATTATGA – 3’ (cepa selvagem)

5’ – ATGATTGCGGTGTTGCGCGGATGGTGCTTATTATGA – 3’ (cepa mutante 1)

5’ – ATGATTGCGGTGTTCCGCGGATGGTGCTTATTATGA – 3’ (cepa mutante 2)

Quando estes mutantes foram colocados em um meio de cultivo sem a presença deste aminoácido essencial, observou-se que somente uma delas cresceu e a outra não. Determine a estrutura primária das proteínas das três cepas e explique o resultado obtido. Observe que as seqüências apresentadas são da fita senso. Considere que a tradução começa no primeiro códon.

Tecnologia do DNA recombinante

1. Vários são os plasmídeos comerciais disponíveis para clonagem em bactérias, leveduras, células animais ou insetos, entre outros. Eles empregam desde o método clássico, por enzimas de restrição, até a utilização de técnicas modernas (recombinação sítio-específica, ligação com a enzima topoisomerase), com ou sem tags de purificação (como cauda 6xHis ou GST), e a otimização de promotores, replicação para geração de multi-cópias na célula clonada, etc. Abaixo listamos alguns endereços de páginas na Internet de empresas de biologia molecular, com exemplos de plasmídeos bastante utilizados para expressão em Escherichia coli, Pichia pastoris, Saccharomyces cereviseae e células animais:

Amersham Pharmacia, http://www.apbiotech.com: plasmídeos de expressão do tipo pUC18 e pGEX.Invitrogen - Life Technologies, http://www.invitrogen.com: GatewayTM Cloning Technology-Instruction Manual; pENTR Directional TOPO Cloning Kits; plasmídeos para expressão em células de leveduras (tipo pPIC9, pPICZ e pYES), mamíferos (tipo pCR e pcDNA) e insetos.

New England BioLabs, http://www.neb.com: plasmídeos de expressão do tipo pMAL.

Novagen, http://www.novagen.com: plasmídeos de expressão do tipo pET.

Promega, http://www.promega.com: plasmídeos para seqüenciamento e para ligação de produtos de PCR do tipo pGEM-T e para células de mamíferos do tipo pCI.

Qiagen, http://www.qiagen.com: plasmídeos de expressão do tipo pQE.

Selecione duas estratégias diferentes de clonagem do gene abaixo a partir de plasmídeos comerciais (Dica: alguns plasmídeos são mais fáceis de inserir produtos de PCR, como Topo e pGEM-T e eles podem ser usados como uma primeira etapa de ligação com posterior transferência do gene para o plasmídeo de expressão). Dentro da estratégia:

a)Procure identificar nos plasmídeos escolhidos suas estruturas importantes;

b) Desenhe os primers para amplificação do gene em estudo;

c) Calcule a Tm dos primers e proponha um programa de PCR para amplificar o gene em estudo;

d) Justifique as escolhas dos plasmídeos e da célula hospedeira utilizada.

2. No exercício 1 foram indicados vários plasmídeos de clonagem, todos comerciais e patenteados. Sob o ponto de vista da engenharia, é viável desenvolver/implementar um processo que empregue vetores comerciais? Discuta (livremente) esta questão.

3. Você pretende clonar o gene do Fator VIII humano. Enumere a estratégia de clonagem desde o método de isolamento do gene, passando pelo vetor de expressão, purificação e hospedeiro.

4. Como você faria para estudar a localização de uma proteína utilizando as ferramentas de biologia molecular?