Lista de Tabelas - attena.ufpe.br · Ciclos térmicos estabelecidos para as quatro reações de PCR-multiplex construídas..... Tabela 12. Freqüências e diversidades (h) alélicas

Universidade Federal de Pernambuco

Centro de Ciências Biológicas

Departamento de Genética

Programa de Pós-Graduação em Genética

Diversidade Haplotípica de Microssatélites do

Cromossomo Y Humano na População de

Pernambuco, Nordeste do Brasil

Jemima Eline Xavier da Silva Barros

Recife, PE

Fevereiro, 2006

Jemima Eline Xavier da Silva Barros

Diversidade Haplotípica de Microssatélites do

Cromossomo Y Humano na População de

Pernambuco, Nordeste do Brasil

Dissertação apresentada ao

programa de Pós-Graduação em

Genética da Universidade Federal

de Pernambuco, como parte dos

requisitos necessários para a

obtenção do grau de Mestre em

Genética.

Orientador: Prof. Dr. Luiz Maurício

da Silva, Depto. De Genética, Centro

de Ciências Biológicas, UFPE.

Recife, PE

Fevereiro, 2006

Barros, Jemima Eline Xavier da Silva

Diversidade Haplotípica de Microssatélites do Cromossomo Y Humano na População de Pernambuco, Nordeste do Brasil / Jemima Eline Xavier da Silva Barros. – Recife: O Autor, 2006.

146 folhas : il.,fig., tab., gráfs. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de

Pernambuco. CCB. Ciências Biológicas.Genética.

1. Genética – populações 2.Cromossomo Y – microsatélites - Pernambuco I. Título.

576.58 CDD (22.ed.) UFPE

575.17 CDU (2.ed.) CCB - 2006 -010

A todos aqueles que de

alguma forma contribuíram

estudo.

para a realização deste

O verdadeiro heroísmo consiste em resistir e persistir mais um

pouco quando tudo parece perdido.

Agradecimentos

O futuro pertence àqueles que acreditam na grandeza dos seus

sonhos. No entanto, a satisfação da conquista não se restringe apenas em

alcançá-la, mas sim em encontrar pessoas que nos incentivem e tornem

possível a realização de um sonho. Nesse sentido, muitas pessoas

colaboraram na construção dos alicerces desta conquista, dentre as quais

agradeço especialmente:

A Deus pela vida e por tudo que Ele me proporciona.

Aos meus pais por me ensinarem a fazer tudo o mais perfeito que

puder, e pelo exemplo de força e determinação. A vocês dedico minha

vida, minhas conquistas e minha admiração. Estejam onde estiverem,

jamais deixarei de sentir o apoio e força de um amor sem limites.

Aos meus irmãos e a toda a minha família pelo apoio, paciência e

compreensão, estando sempre dispostos a me ajudar e jamais me

deixarem desistir. Enfim, por serem minha fortaleza, meu refúgio e fonte

de renovação.

Aos amigos que encontrei ao longo da minha vida, agradeço a

fidelidade, a compreensão por minhas ausências, o carinho que encontro

sempre que procuro, por estarem sempre dispostos a me ouvir e por não

medir esforços para me ajudar. Em especial agradeço a Liciana Xavier

pela amizade incondicional; a Karina Zoby pela amizade, força e por

sempre acreditar em mim; a Manoel Celestino Jr e a Mayara Morais pelo

ombro amigo e pela valiosa ajuda; a Diogo Lins, que talvez nem saiba o

quanto foi importante, agradeço todo o carinho, atenção, compreensão,

paciência, força e incentivo. Agradeço também por me fazer acreditar em

certas coisas novamente e por me ensinar que quando desviamos a

atenção dos problemas, reduzimos sua dimensão. Descobrir isto nesta

etapa da minha vida foi essencial e maravilhoso!

Aos meus amigos de turma no mestrado: Pollyanna, Juliana,

Adriana, Dalmo, Helen, Kyria, Ebenézer, Catarina, Flávio, Iliano, Ana

Thereza, Rodolfo, Jaíra e Carolina por serem tão especiais a ponto de

estarem sempre dispostos a a s outros, seja no trabalho ou

com palavras de apoio. Agradeço a cumplicidade, união, amizade, carinho,

que aprendi.

Human

trabalh

e ajuda

“quebrar barreiras”; a Jeymesson pela alegria transmitida e ombro amigo;

a Erick por me “socorrer” muitas vezes; a Luzinete, Patrícia e Mônica pelo

A Jana

o; a Ma

da Glória (Glorinha) por todo carinho, apoio profissional e pessoal,

amizade, pela alegria do convív

“coreografias”; a Adriana pelo exemplo de profissionalismo e caráter, pela

amizad centivo e

por to . A tod

vocês, muito obrigada por se preocuparem com a minha nutrição, jamais

esquecerei!

Aos amigos do CPqAM que sempre torceram por mim, dando-

rtunidad

orientação e valiosos ensinamentos que, com certeza, tiveram grande

Aos demais Professores do Mestra iversida

A

oferecido.

ntribuíram

par

Obrigad

Jemima Eline Barros

judar uns ao

os sorrisos descontraídos para aliviar o estresse do dia-a-dia e por tudo

Aos meus amigos do Laboratório de Genética Molecular a:

Janaína, Simone e Daniella pela ajuda na realização deste o;

Cláudio Galvão pela força, incentivo e confiança; a Marília por m r a

carinho, força, confiança e ajuda em todos os momentos; ína

(Nêga) e Vanessa pelo carinho, amizade, força e companheirism ria

io e ensinamentos, inclusive as

e e importante ajuda sem “pré-conceitos”, pelo apoio e in

dos os ensinamentos acadêmicos-científicos e pessoais

os

me

grande força.

Aos Professores Doutores, Maurício e Rosilda, pela opo e,

importância no meu amadurecimento pessoal e profissional.

do em Genética da Un de

Federal de Pernambuco pelos conhecimentos transmitidos.

coordenação, especialmente a Lobo, por toda ajuda e suporte

Enfim, sou grata a todos que, direta ou indiretamente, co

a a realização deste.

Muito a!

Barros, JEXS (2006) Diversidade Haplotípica de Y-STRs em Pernambuco

Sumário

Lista de Figuras............................................................... 11

12

Lista de Abreviaturas....................................................... 14

Lista de Tabelas...............................................................

Resumo............................................................................ 16

1. Introdução................................................................... 17

2. Revisão da Literatura................................................... 20

2.1 Origem do Povo Brasileiro......................................... 20

Conseqüente Formação Populacional do País................

21

2.1.2 Colonização de Pernambuco e Forma

2.1.1 Ocupação Humana do Brasil Contemporâneo e

ção da

23

2.2 Estudo de Popula

População do Estado.................................................

ções e Marcadores Genéticos

26

2.3 Polimorfismo de Seqüências de DNA Repetidas............ 28

2.3.1 Seqüências Repetidas no Genoma....................... 28

2.3.1.1 Família de Seqüências de DNA repetidas em

Tandem..............................................................

29

2.

Polimórficos..................................................................

3.2 Polimorfismo e Mutação de Seqüências de DNA

Repetidas no Genoma...............................................

35

2.4 Microssatélites como Marcadores Moleculares do

38

2.4.1 Cromossomo Y................................................. 38

Cromossomo Y..............................................................

8


2.4.2 Uso de Microssatélites como Marcadores

Genéticos do Cromossomo Y......................................

40

2.5 Haplótipos...............................................................

Marcadores Genéticos do Cromossomo Y Usados neste

45

2.6

48

2.7

92

92

5.1.6 Análise Estatística............................................. 99

5.2 Resultados e Discussão............................................. 102

Estudo.........................................................................

Microssatélites do Cromossomo Y em Estudos de

Populações Brasileiras....................................................

53

3. Referências Bibliográficas............................................ 60

4. Manuscrito de Artigo Científico.................................... 76

Human Y-Chromosome STR Haplotype Diversity in

Pernambuco, Northeast Brazil..............................................

77

5. Informações Complementares..................................... 91

5.1 Materiais e Métodos..................................................

5.1.1 Obtenção das Amostras.....................................

92

5.1.2 Extração de DNA: Método de Mini Salting Out.......

5.1.2.1 Separação de Leucócitos............................ 92

5.1.2.2 Digestão e Eliminação de Proteínas.............. 93

5.1.2.3 Precipitação e Lavagem do DNA.................. 94

5.1.3 Quantificação do DNA....................................... 94

5.1.4 Obtenção dos Fragmentos de Microssatélites

através de Amplificação por PCR-Multiplex...................

94

5.1.4.1 Condições de Amplificação.......................... 95

5.1.5 Genotipagem dos Produtos da PCR...................... 97

9


5.2.1 Freqüências Alélicas dos Locos do Cromossomo Y

Analisados............. ..................

102

s Haplótipos Formados pelos Locos

105

.................................

5.2.2 Analise do

Estudados do Cromossomo Y......................................

5.2.3 Caracteriza

ção da População Pernambucana

quanto aos Microssatélites do Cromossomo Y................

111

6. Abstra 115

7. 1

8. 117

Haplótipos Encontrados na Popula

ct.......................................................................

Conclusões................................................................... 16

Apêndice......................................................................

ção de Pernambuco e suas

no Estado...................................... Respectivas Localizações

1

9. 125

18

Anexo 1 – Mapas de Pernambuco...............................

9.1 Mapa do Brasil destacando a localiza

ção do estado de

Pernambuco................................................................. 126

1

127

9.

1

130

131

10. Anexo 2 - Instruções para Autores............................ 132

Genetics and Molecular Biology......................... 133

139

9.2 Mapa de Pernambuco – Regiões............................... 26

9.2.1 Região Metropolitana do Recife.........................

2.2 Zona da Mata................................................. 128

9.2.3 Agreste de Pernambuco................................... 29

9.2.4 Região do São Francisco..................................

9.2.5 Sertão de Pernambuco.....................................

10.1.1

10.1.2 Forensic Science International..........................

10


Lista de Figuras

Revisão da Literatura

Figura 1. Localização cromossômica das principais classes

de DNA repetitivo............................................................

33

Figura 2. Modelo do processo mutacional em

microssatélites...............................................................

Figura 3. Idio

37

grama do bandeamento G do cromossomo

Y..................................................................................

Figura 4. Localiza

39

ção no cromossomo Y dos microssatélites

analisados no presente estudo..........................................

Figura 5. Distribuição das freqüências alélicas do loco

50

55

DYS389II em diferentes populações..................................

Figura 6: Distribui

ção das freqüências alélicas do loco

DYS391 em diferentes populações..................................

Figura 7: Eletroforese dos marcadores DYS392/DYS393 e

56

DYS385/DYS390/DYS391 em gel de poliacrilamida

desnaturante..................................................................

98

Figura 8: Eletroforese dos marcadores DYS464/DYS447/

DYS458 em gel de poliacrilamida desnaturante...................

98

Figura 9: Eletroforese dos marcadores DYS19/DYS389I e II

em gel de poliacrilamida desnaturante...............................

99

Figura 10: Dendograma construído a partir das freqüências

alélicas da população pernambucana, européia, africana e

ameríndia......................................................................

114

Ma

nuscrito

Fig. 01. Map of Brazil showin

g the Northeast region and the

Pernambuco State from where the samples were

collected........................................................................ 88

11


Lista de Tabelas

Revisão da Literatura

Tabela 1. Principais classes de DNA humano repetitivo em

tandem...........................................................................

32

Tabela 2. Informações gerais sobre os locos de

microssatélites do cromossomo Y usados no presente estudo

para analisar a população de Pernambuco...........................

Tabela 3. Freqüências dos alelos encontrados através da

análise do marcador DYS19 em diferentes populações...........

49

54

análise do marcador DYS389II em diferentes populações....... 55

Freqüências dos alelos encontrados através da

56

57

58

58

97

“single-copy” do cromossomo Y na popula

54


análise do marcador DYS389I em diferentes populações........


Tabela 6.

análise do marcador DYS391 em diferentes populações.........





Tabela 9. Freqüências dos alelos encontrados pela análise do

marcador DYS393 em diferentes populações........................

Tabela 10. Seqüências do par de primers usados nas

reações de PCR-multiplex..................................................

96

Tabela 11. Ciclos térmicos estabelecidos para as quatro

reações de PCR-multiplex construídas.................................

Tabela 12. Freqüências e diversidades (h) alélicas para locos

ção de

Pernambuco....................................................................

102

12


Tabela 13. Freqüências e diversidades (h) haplotípica e de

marcadores “multi popula-copy” do cromossomo Y na ção

pernambucana........................... ....................................

103

Tabela 14.

..

Taxas de mutação de locos do cromossomo Y

revelados por observação direta em pares de pai/filho com

de comprovada...................

paternida ................................

105

bela moY

ectado ...

106

ela 1

diversidades obtidas para cada haplótipo construído em 250

mens d

10

popula

Ta 15. Lista dos 227 haplótipos do cromosso

det s em 250 homens de Pernambuco......................

Tab 6. Número de diferentes haplótipos e respectivas

ho e Pernambuco.................................................... 1

Tabela 17. Alelos mais freqüentes nos locos analisados na

ção de Pernambuco e em populações ancestrais

111

scrito

le 1.

previamente estudadas.....................................................

Manu

Tab Allele frequency and gene diversity values (h) at

Rs single copy loci in Pernambuco p

nine Y-ST opulation.......... 80

able 2. e distribution and diversity values (h) in

multi-copy Y-STRs............................................................

81

List of 227 Y-chromosome STR haplotypes detected

82

ble 4 n rates of Y-chromosomal STR loci as

vealed by direct observation in father/son pairs of

nfimate y.........................................................

86

le 5

diversities obtained for each type in 250

ambuco......................................

87

T Haplotyp

Table 3:

in 250 unrelated males from Pernambuco……………………………….

Ta . Mutatio

re

co d paternit

Tab . Number of different haplotypes and respective

contributed haplo

unrelated males from Pern

13


Lista de Abreviaturas

ACD Anticoagulante composto por ácido cítrico / citrato de sódio

rose

a Sérica Bovina

onucleic Acid - Ácido Desoxirribonuléico

omo Y, S – para um segmento único

TA minetetracetic Acid -

tribásico / dext

BSA Bovine Seric Albumin - Albumin

DNA Desoxirib

dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate - Desoxirrinucleotídeo

trifosfato

DYS D – DNA, Y - cromoss

ED Ethylenedia Ácido

sity - Diversidade Gênica

L Locos com alta diversidade

a Forense

M

otype – Haplótipo Mínimo

L

mM Milimolar

SY Male-specific Region of Y-chroromosome - Re

Etilenodiaminotetracético

EH Extended Haplotype – Haplótipo Estendido

h Gene Diver

HD High Diversity Loci –

ISFG International Society of Forensic Genetics - Sociedade

Internacional de Genétic

Kb Kilobase

Molar

Mb Megabase

MH Minimum Hapl

min Minutos

m Mililitros

M gião Específica

do Macho do Cromossomo Y

ng Nanograma

NRY Non-recombining Region of Y-chromosome - Região Não

Recombinante do Cromossomo Y

14


PAGE

Polyacrilamide Gel sis – Eletroforese em Gel de

Poliacrilamida

Pseudo Autosomic Region - Região Pseudo-Autossômica 1

Electrophore

PAR1

PAR2 Pseudo Autosomic Region - Região Pseudo-Autossômica 2

pb Pares de Base

pH Potencial de hidrogênio iônico

pmol Picomol

PCR Polymerase Chain Reaction - Reação em Cadeia da Polimerase

RCLB Red Cell Lysis Buffer – Tampão de Lise de Hemácias

rpm Rotações por minuto

s Segundos

SPK Solução para Digestão com Proteinase K

STR Short Tandem Repeats - Seqüências Curtas em Tandem

TE Tris-EDTA

U Unidades

VNTR Variable Number Tandem Repeats - Número Variável de

Repetições em Tandem

YHRD Y Chromosome Haplotype Reference Database – Banco de

Dados Referência de Haplótipos do Cromossomo Y oC Graus Celsius

% Porcentagem

µL Microlitro

Σ Somatório

15


Resumo

foi constituída

dos

Os microssatélites do cromossomo Y têm sido reconhecidos como

ferramentas valiosas na caracterização genética de populações humanas.

No entanto, poucos são os trabalhos com esse cromossomo no Nordeste

do Brasil. Por isso, estudamos 11 marcadores do cromossomo Y, visando

criar um banco de dados para caracterizar a população de Pernambuco

quanto ao grau de variabilidade genética, fornecendo informações para

investigações forenses e de paternidade. Assim, a amostra

por 250 homens pernambucanos não aparentados e um filho (sexo

masculino) de cada um deles. O DNA genômico foi obtido de sangue

periférico e extraído por mini salting out. Os sítios de interesse foram

amplificados por PCR e os produtos da PCR submetidos à eletroforese

vertical em PAGE, com revelação por impregnação com AgNO3. Os

resultados encontrados são consistentes com a história da população do

Nordeste do Brasil. Freqüências e diversidades alélicas/haplotípicas foram

determinadas. Os locos DYS385 e DYS464 foram os mais informativos

com diversidade genética (h) acima de 80%, e os locos DYS389I e

DYS393 os menos informativos, com h inferior a 50%. Foram observa

227 haplótipos distintos, dos quais os mais freqüentes foram encontrados

em quatro indivíduos e 211 haplótipos foram únicos, sendo o haplótipo

estendido bastante informativo. Outros haplótipos foram construídos e

analisados, mostrando uma contribuição maior que o haplótipo mínimo

também estudado. Estes resultados fornecem informações úteis para

investigações de paternidade e forense, bem como para análise histórica

da população pernambucana.

Palavras-Chave: Cromossomo Y, Microssatélites, Pernambuco

16


1. Introdução

élites são

ão molecular em que a utilização de

A descoberta dos segmentos repetidos de DNA deu uma nova

dimensão aos estudos de variabilidade ao nível molecular e, com o

advento da técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction, Reação em

Cadeia da Polimerase), quantidades muito pequenas de DNA puderam ser

utilizadas para genotipagem. Isto facilitou e melhorou as condições de

trabalho dos pesquisadores, que passaram a intensificar os estudos sobre

polimorfismos destas seqüências (Strachan e Read, 2002).

Um exemplo de segmentos repetidos de DNA em tandem são os

microssatélites, também comumente denominados STRs (Short Tandem

Repeats, Seqüências Curtas em Tandem). Os microssat

marcadores genéticos encontrados abundantemente em todo o genoma e

consistem de seqüências curtas, tipicamente 2 a 5 pares de base (pb),

agrupadas em arranjos de até 350 pb por loco (Amour et al., 2000;

Strachan e Read, 2002). Tais locos são predominantemente polimórficos

devido à mudanças no número de cópias da repetição principal. Estudos

indicam que esta variação é causada, principalmente, por elevadas taxas

de erros durante a replicação do DNA (Goldstein e Schlötterer, 1999).

O alto nível de variabilidade e a ampla dispersão através do genoma

humano tornam os microssatélites uma fonte profícua de marcadores

genéticos. Atualmente, os locos autossômicos são os marcadores mais

usados para identificação humana, devendo-se principalmente ao fato de

serem sistemas genéticos que segregam mendelianamente. No entanto,

existem casos especiais de investigaç

marcadores sexuais pode ser mais informativa que a análise de

polimorfismos autossômicos.

A vantagem dos testes com cromossomos sexuais reside no fato de

que o homem transmite o seu cromossomo X para todas as suas filhas e o

cromossomo Y para todos os seus filhos sem recombinação gênica

17


(Jobling et al., 1997; Kayser et al., 1997). Este fato explica o motivo pelo

qual a genética forense está aumentando e concentrando o interesse, nos

últimos anos, por marcadores dos cromossomos sexuais.

A herança paterna da região não recombinante do cromossomo Y

resulta na conservação de locos polimórficos intimamente relacionados.

Quando tomados conjuntamente, estes locos fornecem haplótipos

bastante discriminatórios e particularmente úteis para a investigação

forense de casos de estupro, quando misturas de fluidos biológicos

masculinos e femininos devem ser analisadas, sendo também uma

ompletamente ausentes nesse período

arvalho-Silva et al., 2001). Estes dados apontam para um casamento

irecional entre homens europeus e mulheres africanas e ameríndias na

rmação da atual população brasileira (Pena et al., 2000; Callegari-

cques et al., 2003).

Para finalidades acima citadas, o haplótipo mínimo (DYS19, DYS385,

YS389I e II, DYS390, DYS391, DYS392 e DYS393) têm sido amplamente

studado (Biondo et al., 2004; Leat et al., 2004; Martín et al., 2004; Saul

t al., 2004; Berger et al., 2005; Dobashi et al., 2005; Goes et al., 2005;

ovrecic et al., 2005; Park et al., 2005; Pepinski et al., 2005; Rosa et al.,

poderosa ferramenta complementar em investigação de paternidade post

mortem, quando um descendente masculino está em questão (Roewer et

al., 1996; de Knijff et al., 1997; Jobling et al., 1997; Kayser et al., 1997),

bem como em estudos evolutivos e populacionais (Butler et al., 1995;

Takahashi et al., 1997; Drmic et al., 1998).

Diversas populações foram estudadas quanto ao polimorfismo de

microssatélites do cromossomo Y. A análise de polimorfismos da NRY

(Non-recombining Region of Y-chromosome - Região Não Recombinante

do Cromossomo Y) em brasileiros de várias regiões geográficas tem

demonstrado que a grande maioria dos Y é de origem européia,

principalmente ibérica, devido a significante imigração de homens

portugueses para o Brasil até o ano de 1808 (Ribeiro, 1995). Além disto, a

contribuição de haplótipos vindos da África subsaariana foi mínima e as

contribuições ameríndias foram c

(C

d

fo

Ja

D

e

e

L

18


2005) e vários dados de tipagem desses marcadores em populações de

do o mundo têm sido relatados (Nata et al., 1999). Mas, apesar de sua

tilidade, locos adicionais de microssatélites do cromossomo Y são

haplótipo de distinguir indivíduos

et al., 2005). Sendo assim, os marcadores DYS447, DYS458 e

DYS464, que são locos bastante informativos (Redd et al., 2002; Berger

relaciona

to

u

requeridos para elevar a capacidade do

(Park

et al., 2003; Butler e Schoske, 2004), podem ser combinados ao haplótipo

mínimo, formando um haplótipo estendido com bom poder de

discriminação.

O presente estudo tem como objetivo geral analisar 11 marcadores

de microssatélites do cromossomo Y (haplótipo mínimo e locos DYS447,

DYS458 e DYS464) a partir de DNA genômico de homens não

dos, bem como um de seus filhos do sexo masculino,

selecionados ao acaso na população do Estado de Pernambuco. E como

objetivos específicos determinar freqüências alélicas e taxas de mutação

para cada loco examinado; utilizar os dados obtidos para a construção de

haplótipos do cromossomo Y na população em questão; construir um

banco de dados de freqüências alélicas e haplotípicas, o que é

imprescindível para validar testes de investigação de paternidade e

identificação de indivíduos na população de Pernambuco; comparar os

resultados obtidos com dados de populações ancestrais para tentar

compreender a estrutura genética atual da população estudada, no que

diz respeito a linhagens paternas.

19


2. Revisão da Literatura

2.1 Origem do Povo Brasileiro

Em busca de uma maior compreensão do presente estudo, bem

mo de atender a um dos objetivos da pesquisa, tornou-se necessário

ificação morfológica, fruto da adaptação às

co

resgatar o conhecimento sobre as origens e formação do povo brasileiro,

mais especificamente da população pernambucana. Para isso, alguns fatos

históricos que influenciaram a estrutura genética atual de tais populações

foram abordados e analisados no decorrer deste capítulo.

Segundo Pena (2002), o homem moderno teve uma origem única e

relativamente recente (cerca de 100 mil anos atrás) na África. A partir daí

ele migrou e ocupou progressivamente a Ásia, a Europa, a Oceania, as

Américas, e todos os outros rincões da Terra. Essa “diáspora” foi

acompanhada de divers

condições climáticas e ambientais das diferentes regiões do mundo.

Milhares de anos após a dispersão do grupo africano inicial de

homens, povos oriundos da Ásia (ameríndios1), da Europa (portugueses) e

da África (escravos da África Ocidental e Central) reencontraram-se no

Brasil, durante o século XVI. A partir dessa confluência, iniciou-se um

processo de mistura gênica inusitado em toda a história da Humanidade,

gerando o brasileiro atual (Pena, 2002).

Sendo assim, os brasileiros compõem uma das mais heterogêneas

populações do mundo, sendo resultado de cinco séculos de cruzamento

interétnicos entre povos de três continentes: os colonizadores Europeus,

representados principalmente por portugueses; escravos africanos e

nativos americanos (indígenas) (Alves-Silva et al., 2000). Esse encontro

1 Foi comprovado cientificamente que a maioria dos indígenas das Américas descende de populações da área central da Sibéria, na Ásia (Pena et al., 2000). Há uma concordância geral de que a principal rota dos ancestrais de ameríndios no continente ocorreu através do Estreito de Bering. Isto não exclui, entretanto, a possibilidade de que outras migrações menores tenham ocorrido através do pacífico (Salzano, 1986)

20


produziu conflitos, acomodações e, sobretudo, uma forte miscigenação

biológica e cultural (Pena et al., 2000).

2.1.1 Ocupação Humana do Brasil e Conseqüente Formação

ão portuguesa, pouco

l, deixando para trás mulheres e filhos. Alguns desses

Populacional do País

Durante os primeiros 50 anos, a colonização do Brasil constituiu um

problema de difícil solução para Portugal. A populaç

superior a 1.000.000 de habitantes na época, não tinha condições de

atender as demandas das colônias portuguesas na África, Ásia e América.

Além disto, as notícias que chegavam do Brasil eram desanimadoras:

“Pode-se dizer que nela não encontramos nada de proveito”. Portugal

tinha, porém, a preocupação da posse da terra, visto que contrabandistas

de madeira e outros produtos passaram a visitar constantemente o nosso

litoral (Holanda, 1981).

Em 1500, ano da chegada de Pedro Álvares Cabral ao Brasil, esta

região era habitada por vários povos indígenas. Estima-se que, na época

do descobrimento, existiam no Brasil cerca de 2,5 milhões de índios

(Salzano e Freire Maia, 1970 apud Alves-Silva et al., 2000; Bethell, 1997).

A chegada dos portugueses ao Brasil não perturbou o equilíbrio da

vida tribal nos primeiros anos. Antes do açúcar se constituir fonte de

riqueza, seguida mais tarde pela mineração, era difícil atrair uma

imigração espontânea volumosa (Holanda, 1981). Em 1534, chegaram ao

Brasil muitos espanhóis, franceses, holandeses, principalmente

portugueses, entre outros degredados e aventureiros em busca de

enriquecimento fáci

foram aceitos e se acomodaram às tradições tribais, particularmente

através de matrimônio, que dava oportunidade do homem branco ter um

lugar na sociedade indígena, obtendo alimentos, bens e segurança diante

das tribos hostis (Holanda, 1981).

21


Em carta ao rei D. João, o padre Manoel da Nóbrega diz que para

colonizar a terra seria necessária a vinda de muitas mulheres brancas,

população indígena (Holanda, 1981).

Os negros, terceiro grupo étnico a fazer parte da nossa colonização,

antigo registro encontrado é a

existência de escravos a partir 1531, na Capitania de São Vicente, São

to, a miscigenação com os brancos

havia

ram trazidos africanos de Benin e Nigéria até o século

XVIII

leão, a família Real chega ao Brasil em 1808,

inician

da população brasileira”

que aqui se casariam e elevariam a moral cristã e os bons costumes. Mas

o pedido foi atendido apenas em parte e o número de mulheres enviadas

não resolveu o problema (Pena et al., 2000).

Mais tarde, o índio passou a ser considerado pelos portugueses

como impedimento à posse da terra e uma ameaça à segurança da

colonização, o que desencadeou diversos conflitos que explicam em parte

a redução da

vieram desde o principio em grande número e não se tem data exata da

chegada do primeiro navio. O mais

Paulo (Cavignac, 2003). Mas, de fa

começado na metrópole, muito antes de 1500, com negros escravos

levados à Europa para fazer todo tipo de trabalho braçal (Prado Jr, 1980).

A partir de 1550, se intensificou a vinda de africanos das colônias

portuguesas do Congo e Angola para trabalhar como escravos nas

lavouras de cana-de-açúcar. Com a ocupação Holandesa, o tráfico de

escravos foi parcialmente interrompido. Em 1700, o ciclo do açúcar entrou

em declínio, devido à concorrência entre colônias, e começou o ciclo do

ouro. Também fo

e de Senegal e Gâmbia a partir desse século. Com o bloqueio naval

Inglês em 1845, deixaram de vir escravos dessas regiões, passando a vir

principalmente de Moçambique. Em resumo, em 1855, já havia cerca de 4

milhões de negros no Brasil, constituindo mais de 50% da população

(Cavignac, 2003).

Fugindo de Napo

do um fluxo migratório de famílias européias. O Brasil recebeu

grandes contingentes de famílias de portugueses, italianos, espanhóis,

alemães, japoneses, sírios e libaneses, que participaram do processo de

mistura racial, provocando um “branqueamento

22


(Ribe

entais. Este fato gerou uma identidade nacional singular e

um po

acilmente atingível deste país

(Garc

A pirataria francesa travava relações

com o

Brasil em capitanias hereditárias (Mello, 1998).

iro, 1995). Entre 1872 e 1890, por exemplo a população de brancos

brasileiros aumentou 12,5 milhões (Pena et al., 2000).

São estes os principais fatos históricos responsáveis pela formação

atual do povo brasileiro. Tal povo resulta de um prolongado processo de

alta miscigenação biológica e cultural, devido a extrema variabilidade de

seus grupos étnicos originais e à sua distribuição por toda uma gama de

condições ambi

vo marcadamente mestiço, na aparência e na cultura (Pena, 2002).

2.1.2 Colonização de Pernambuco e Formação da População

do Estado

Quando os primeiros europeus chegaram ao território brasileiro no

início do século XVI, vários grupos indígenas, nômades e errantes

ocupavam a região nordeste, vagando pelo litoral e florestas da região. A

costa nordestina foi a primeira área do país a ser ocupada pelos

portugueses em 1500, uma vez que a costa oeste da África ficava

defronte as costas do nordeste brasileiro, o que a tornava a região de

maior proximidade geográfica, sendo f

ia, 1986).

Após 35 anos de desinteresse, a colonização Portuguesa se fazia

esperar, pois a riqueza e a abundância dos recursos naturais da colônia

atraíam piratas e aventureiros de outros países da Europa, tais como

franceses, holandeses e ingleses.

s índios, unindo-se contra os lusos que vinham comercializar o pau-

brasil (Garcia, 1986).

Os portugueses tinham interesses em “dar a mão à colônia” para

que não viesse a perder aquilo que lhes pertenciam por direito de

descoberta. A partir de então, a colonização mais prática foi dividir o

23


As terras do atual Estado de Pernambuco foram doadas como

capitania hereditária pelo rei de Portugal a Duarte Coelho em 1535.

Fidalg

o-de-obra escrava

nos e

iação de gado levou os

colon

egros a Pernambuco, visto que o

i houvera permitido que importasse 24 “peças” procedentes da Guiné,

tendendo a um pedido do donatário. Em 1559, a rainha regente

utorizou os senhores de engenho da colônia a importar até 120 escravos

negros do Congo (Patriota, 2000).

O desenvolvimento de Pernambuco atraía grande número de

uropeus para a região. Os franceses foram responsáveis por sucessivos

taques e, de fato, nos seus planos não estava apenas o comércio com os

ativos. Depois de saquear e destruir a Feitoria Régia, os franceses

nstruíram uma fortificação na Ilha de Itamaracá, mas pouco durou esse

o da casa real, Duarte Coelho vinha iniciar, praticamente, a

colonização portuguesa em Pernambuco, ergueu a sua capitania e esta foi

a que estabeleceu um maior desenvolvimento. Em 1537, foram fundadas

as vilas de Igarassu e Olinda, sendo esta a primeira capital do Estado

(Mello, 1998).

A prosperidade de Pernambuco teve inicio com o cultivo da cana de

açúcar e do algodão. Os índios eram utilizados como mã

ngenhos e nas lavouras, especialmente por parte daqueles que não

dispunham de capital suficiente para comprar escravos africanos

(Cavalcante, 2002).

Após um período de paz aparente, os índios reagiram a esse regime

de trabalho através de hostilidade, assaltos e devastações de engenhos e

propriedades. A guerra e a perseguição dos portugueses tornou-se

sistemática, fazendo com que os índios sobreviventes tivessem que

emigrar para longe da costa. No entanto, a cr

izadores a ocupar terras no interior do Estado, continuando assim a

haver conflitos. As missões religiosas dos jesuítas eram a única forma de

proteção com que os índios contavam, porém as explorações e injustiças

continuavam a acontecer (Souza, 1998).

Em 1539, chegaram os primeiros n

re

a

a

e

a

n

co

24


assentamento. A fortificação francesa foi atacada a mando do Rei de

Portugal e rendida após 18 dias de combate (Nogueira, 1988).

Em 1630, os holandeses invadiram Pernambuco e incendiaram

Olinda. Sendo assim, Recife passou a ser a sede do domínio holandês no

Brasil. Durante 24 anos, o conde Maurício de Nassau governou o Brasil

Holandês, cuja administração foi marcada por mudanças de natureza

econômica, social e cultural. A forte resistência de portugueses e

brasileiros (de origem lusitana, africana e índia, já cristianizados) acabou

resultando na expulsão dos holandeses (Maior, 1967).

Portanto, assim consolidou-se a estrutura genética da população

pernambucana, como o cruzamento entre índios nativos, negros africanos

e brancos europeus. Dentre os brancos que se estabeleceram na região

destacam-se os portugueses, os franceses e os holandeses, entretanto, os

franceses e holandeses, apesar de tentarem se estabelecer em território

pernambucano, deixaram uma contribuição étnica restrita. A presença de

espanhóis e ingleses foi ainda mais escassa (Ribeiro, 1995) devido ao

tempo de permanência em território do Estado.

A miscigenação ocorrida na formação da população de Pernambuco

e do Brasil acarretou em polimorfismo genético com características únicas.

Dessa forma, variações genéticas entre indivíduos em populações

passaram a ser amplamente utilizadas em estudos de genética

populacional, molecular e antropológica.

25


2. Estudo de Populações e Marcadores Genéticos

Polimórficos

2

2

A genética de populações é o ramo da genética que investiga as leis

e outros princípios que governam a estrutura das populações naturais,

elucidando os mecanismos que alteram a composição genética das

omo: fatores ecológicos e evolucionários, tamanho

opulacional, padrões de migração, acasalamentos, distribuição de

divíduos e seleção natural, para tentar compreender e predizer os

feitos de fenômenos como segregação, recombinação e mutação

Beiguelman, 1994).

Este conhecimento é fundamental para um correto entendimento da

volução, pois o processo evolutivo é essencialmente uma modificação

rogressiva da composição genética das populações, ou seja, alterações

as freqüências genotípicas através do tempo (Gillespie, 1998).

O estudo da composição genética das diferentes populações

umanas ocupa um lugar de destaque na ciência. Neste sentido, foram, e

inda são, utilizados diversos tipos de marcadores genéticos polimórficos,

omo os grupos sangüíneos (ABO e Rh), proteínas séricas e eritrocitárias,

unoglobulinas, sistemas de histocompatibilidade e polimorfismos de

NA3 (Cavalli-Sforza et al., 1996).

Diversos marcadores polimórficos de DNA se encontram distribuídos

or todo o genoma. Estes marcadores deram uma nova dimensão aos

studos de variabilidade genética ao nível molecular e vêm sendo

mplamente utilizados em inúmeros campos, incluindo identificação

dividual, mapeamento de genes e estudos populacionais.

mesmas, tais c

p

in

e

(

e

p

n

h

a

c

im

D

p

e

a

in

de indivíduos da mesma espécie, vivendo

m um determinado espaço e mantendo entre si uma relação de ancestralidade e escendência (Beiguelman, 1994).

ismos de DNA são seqüências de nucleotídeos que apresentam duas ou mais diferentes formas (alelos são definidos como formas alternativas de um gene). Um gene é denominado polimórfico quando o alelo mais comum em uma população tem uma freqüência inferior a 0,95 – alguns autores preferem um limite mais estringente de 0,99 (Hartl e Clark, 1997).

2 Uma população é definida como um conjuntoed3 Polimorf

26


O primeiro grande estudo populacional aplicando-se marcadores

et al.

s utilizando polimorfismos de DNA,

autossômicos e alossômicos, vêm sendo realizados com sucesso e, assim,

ntes contribuições para o estudo e caracterização

polimórficos de DNA foi feito com DNA mitocondrial por Cann

(1987). Desde então, diversos estudo

trazendo importa

genética de populações.

27


2.3 Polimorfismo de Seqüências Repetidas de DNA

s

ucarióticos (Doolittle e Sapienza, 1980; Orgel e Crick, 1980).

Com o progresso do Projeto Genoma Humano, mais conhecimentos

sendo

sclarecida a função e a estrutura das seqüências não codificadoras.

ul

2.3.1 Seqüências Repetidas no Genoma

O genoma humano, assim como outros genomas de mamíferos,

possui uma proporção muito elevada de seqüências repetidas de DNA4, as

quais estão presentes em regiões não codificantes dispersas por todo o

genoma. Por serem, de forma predominante, inativas no que se refere à

transcrição, tais seqüências foram consideradas não funcionais por muito

tempo 5(Strachan e Read, 2002).

Masatoshi Nei foi o primeiro a enfatizar a importância dessas

seqüências e, no ano de 1969, as denominou “DNA sem sentido” (Nei,

1969). Poucos anos depois, Suzumu Ohno criou o termo “DNA lixo” para

descrever esse fenômeno (Ohno, 1972). A abundância de seqüências

repetitivas não tinha explicação racional imediata, pois existiam muitos

organismos com genomas compactos e bem sucedidos, como os

procariotos. Portanto, muitos pesquisadores viam esses elementos como

depósitos desnecessários sobrecarregando o genoma e os compararam

com parasitas (Hickey, 1982), um “DNA egoísta” explorando genoma

e

sobre o genoma foram acrescentados, de modo que vem

e

Sim taneamente, mais e mais biólogos vêm considerando os elementos

4 Até 50% do genoma de mamíferos é ocupado por elementos repetitivos (Makalowski, 2000).

vantagem adaptativa e, portanto, não sofrem seleção esquisa, 2001).

5 Pensava-se que seqüências de DNA repetidas no genoma não eram funcionais, pois não são propriamente genes e, portanto, não sintetizam produtos e nem exercem efeitos sobre características físicas de uma pessoa. Como conseqüência, tais seqüências não estão associadas a nenhuma natural (Conselho Nacional de P

28


repetitivos como um tesouro genômico, pois, ao contrário do que se

acreditava, algumas dessas seqüências repetitivas parecem estar

envolvidas em diferentes processos genômicos (Brosius, 1991; Nowak,

1994; Brosius, 1999; Makalowski, 2000).

Um certo número de evidências vem mostrando que seqüências

repetitivas funcionam como elementos regulatórios com habilidade de

ligar proteínas e servir como acentuadores da expressão em genomas de

eucariotos (Goldstein e Schlötterer, 1999). Embora as seqüências

acientes com tais doenças (Paulson e Fischbeck,

19

2.3.1

micro

famíli

em ta

das u

(Strachan e Read, 2002).

repetitivas tenham sido identificadas no DNA intergênico ou dentro de

introns de genes, uns poucos exemplos foram relatados dentro de

seqüências codificadoras de genes associados com doenças degenerativas

neuronal e/ou muscular humana (Gondo et al., 1998). Tais doenças foram

causadas por variação quantitativa na função da proteína e na atividade

gênica (Goldstein e Schlötterer, 1999), como conseqüência de drásticas

expansões de unidades repetitivas, afetando a fisiologia e o

desenvolvimento de p

96 apud Goldstein e Schlötterer, 1999; Richards et al., 1993 apud

Goldstein e Schlötterer, 1999). Outros trabalhos têm mostrado que

seqüências repetitivas também agem como sítios de poliadenilação e

representam pontos quentes de recombinação e de mutação, entre outras

funções (Makalowski, 2000). Assim sendo, as funções biológicas das

seqüências repetitivas de DNA ainda não são muito bem compreendidas.

.1 Família de Seqüências de DNA Repetidas em Tandem

As seqüências de DNA-satélite, megassatélites, minissatélites e

ssatélites, relatadas resumidamente na Tabela 1, formam uma

a definida por blocos (ou arranjos) de seqüências de DNA repetidas

ndem. Tal família é assim classificada com base no tamanho médio

nidades repetitivas ou dos arranjos formados por essas unidades

29


DNA

mega

uma s

contri

acred

centrô apresentado na figura 1 (Browater e Wells, 2000;

Strach

O D

riando entre 6

64 pb (Strachan e Read, 2002). O DNA minissatélite pode ser

ipervariável ou telomérico:

a. As seqüências de DNA minissatélite hipervariável são altamente

polimórficas e estão organizadas em arranjos de repetições em

tandem (Jeffreys, 1987). As unidades de repetição, nos diferentes

arranjos hipervariáveis, variam consideravelmente em tamanho,

mas têm uma seqüência central comum, GGGCAGGAXG (onde X =

qualquer nucleotídeo) (Strachan e Read, 2002). Esse tipo de DNA

minissatélite localiza-se preferencialmente nas regiões

subteloméricas (figura 1). Este fato limita seu uso em estudos do

genoma;

O DNA-satélite humano é composto por arranjos muito longos de

repetido em tandem – blocos geralmente de 100 Kb até vários

bases (Mb) de comprimento – com a unidade de repetição sendo

eqüência simples ou moderadamente complexa. Esse tipo de DNA

bui com a maior parte das regiões heterocromáticas do genoma e

ita-se que esteja envolvido na estrutura e na função dos

meros, como

an e Read, 2002).

O DNA megassatélite ou macrossatélite é caracterizado por arranjos

de comprimentos relativamente modestos em comparação com alguns

arranjos de DNA-satélite. No entanto, o prefixo “mega” tem sido utilizado

para enfatizar o grande tamanho da unidade repetitiva, que pode ter

vários quilobases de extensão. Essa classe é exemplificada pelo

megassatélite RS447, que consiste de cerca de 60 cópias em tandem

resultando em um fragmento de 4,7 Kb em 4p15, altamente polimórfica

(Gondo et al., 1998).

NA minissatélite, também conhecido como VNTRs (Variable Number

Tandem Repeats - Número Variável de Repetições em Tandem),

compreende uma coleção de arranjos de seqüências de DNA repetidas

moderadamente – blocos variando geralmente de 0,1 a 20 Kb de extensão

– e organizadas em tandem, com unidades de repetição va

e

h

30


b. O DNA minissatélite telomérico (figura 1) é constituído por unidades

de repetição em tandem de 10 a 15 Kb de um hexanucleotídeo,

especialmente TTAGGG, que é adicionado por uma enzima

especializada, a telomerase. Essas re ples são

etamente respo ção dos t eger as

ossômicas da degradação e de perdas (Strachan e

cido como repetições de imples ou

rtas repetições em tandem DNA m rossatélite consiste de

s curtas, variando tipicamente de 1 a 5 pb (St

2002), organizadas em arranjos de múltiplas cópias em tandem. Os

microssatélites estão dispersos nos cromossomos por todo o genoma

a figura 1. Tais marcadores são encontrados, em

nucleotí e resul ente

télites distribuídos por todo genoma (Edwards et al.,

93 apud Pena, 1993).

s sobre os élites, o odem

lificados por PCR mesmo quando o DNA está em

ou degradad (Ruitberg e lo fato

los serem discretos, po em ser def idos sem ambigüidade

repetições ( an e Rea

petições sim

elômeros de protdir nsáveis pela fun

terminações crom

Read, 2002).

Também conhe seqüências s

cu (STR), o ic

seqüência rachan e Read,

humano, como expõe

média, a cada 10.000

300 mil microssa

1991; Tautz, 19

deos, o qu ta em aproximadam

Como vantagen

ser facilmente amp

pequenas quantidades

de seus ale

minissat s microssatélites p

t al., 2001) e, peo

d in

pelo número exato de Strach d, 2002).

31


Tabela 1: Principais classes de DNA humano repetido em tandem.

Classe Tamanho da Unidade de Repetição

Localização Cromossômica Principal

DNA megassatélite

(blocos de centenas de

Kb em alguns casos) RS447

Vários Kb

Várias localizações em

cromossomos

selecionados.

~ 50-70 cópias em

4p15 e muitas cópias

em 8p distal.

DNA-satélite (blocos

geralmente de 100 Kb

até vários Mb de

comprimento)

5-171 pb Especialmente nos

centrômeros.

DNA minissatélite

blocos geralmente

dentro da variação de

Família Hipervariável

6-64 pb

9-64 pb

Nos telômeros ou

próximos a eles, todos

os cromossomos.

Todos os

cromossomos,

(

0,1-20 Kb)

Família Telomérica

6 pb

Todos os telômeros.

freqüentemente

próximo aos

telômeros.

DNA microssatélites

(blocos geralmente

com menos de 150 pb)

1-5 pb Dispersos por todos os

cromossomos.

(Strachan e Read, 2002)

32


Os microssatélites têm sido detectados no genoma de todos os

organismos analisados, ocorrendo tanto em procariontes quanto em

eucariontes (Goldstein e Schlötterer, 1999). Contudo, espécies diferentes

contêm seqüências de microssatélites distintas e certas repetições

ocorrem com mais freqüência que outras (Stallings, 1992). Por exemplo,

(A)n e (CA)n são mais comuns em humanos, (AT)n em plantas e (CT)n

em algumas espécies de insetos (Primmer et al., 1997). No entanto, a

origem dessas diferenças ainda não está clara.

Figura 1: Localização cromossômica das principais classes de DNA repetitivo. Note as

localizações restritas de certos tipos de DNA repetido em tandem, como o DNA-satélite,

que é encontrado na heterocromatina (notável nos centrômeros) e os DNA-

minissatélites, que são freqüentemente encontrados nos telômeros ou próximo a eles


Microssatélites (amplamente dispersos pelos cromossomos)

Telômero (repetições em tandem do minissatélite TTAGGG). Comprimento = vários Kb

Centrômero (vários componentes do DNA-satélite). Comprimento = vários Mb

DNA- minissatélite hipervariável (preferencialmente em regiões próximas aos telômeros)

33


Os microssatélites podem ser constituídos por repetições mono, di,

tri, tetra ou pentanucleotídicas. As unidades de repetição

pentanucleotídicas são muito raras no genoma humano em relação aos

demais microssatélites. Entre as repetições de mononucleotídeos, as

séries A e T são muito comuns e, juntas, correspondem a cerca de 10 Mb

ou 0,3% do genoma nuclear humano; as séries G e C são menos

(0,5% do genoma), seguida das repetições

CT/GA (0,2% do genoma), mas repetições CG/GC são muito raras.

Repet

t al., 1997; Lee et al., 1997; Ricciardone et

al., 1997), bem como para inferir sobre a história evol

ente no genoma humano,

exibin

freqüentes. No caso das repetições dinucleotídicas, arranjos de repetições

CA/GT são muito comuns

ições em tandem tri e tetranucleotídicas são relativamente raras,

altamente polimórficas e têm sido cada vez mais investigadas (Strachan e

Read, 2002).

O alto nível de variabilidade (ver tópico 2.3.2), facilidade de

amplificação por PCR e ubiqüidade no genoma eucarioto (Bowoock et al.,

1994; Deka et al., 1995; Mountain e Cavalli-Sforza, 1997) são

características que tornam os microssatélites marcadores genéticos

particularmente úteis para identificação de indivíduos em ciência forense

(Micka et al., 1996; Busque e

utiva e

antropológica de uma população (Pérez-Lezaun et al., 1997; Pinheiro et

al., 1997; Pawlowski et al., 1999), para o mapeamento do genoma

humano (Nelleman et al., 1994; Ricciardone et al., 1997), no apoio ao

diagnóstico de doenças e na investigação de paternidade (Nelleman et al.,

1994; Micka et al., 1996), para avaliação de sucesso de transplante de

medula óssea (Lins et al., 1996), etc.

Atualmente, os microssatélites autossômicos são os marcadores

moleculares mais usados, devendo-se principalmente ao fato de serem

sistemas genéticos que segregam mendelianam

do herança com dois alelos provenientes de ambos os progenitores,

os quais estão sujeitos a eventos de recombinação meiótica. Tal evento é

responsável pela mistura de genes entre os autossomos, produzindo

inúmeras combinações distintas, o que praticamente impede que duas

34


pessoas tenham o mesmo genoma, fazendo dos microssatélites

autossômicos ótimos marcadores de individualidade (Pena et al., 2000).

No entanto, há casos especiais de identificação molecular em que a

investigação de marcadores nos cromossomos sexuais é indispensável.

s

hered

al., 1999;

Golds

repetições em tandem também podem ocorrer no caso de unidades de

repetição intermediárias ou grandes, e mecanismos genéticos distintos

são responsáveis por esse polimorfismo, dependendo da extensão da

unidade de repetição (Strachan e Read, 2002).

As grandes unidades repetidas de DNA estão sujeitas mais

comumente à inserção/deleção, como resultado de crossing-over desigual

ou trocas desiguais entre cromátides irmãs. Em seqüências curtas em

tandem, o mecanismo mais provável para explicar a variação em sua

2.3.2 Polimorfismo e Mutação de Seqüências de DNA

Repetidas no Genoma

Como em outros genomas, o DNA humano não é uma entidade

estática. Ao contrário, ele é passível de diferentes tipos de mudança

itárias (Strachan e Read, 2002). Os níveis de diversidade observados

nos locos de microssatélite podem ser explicados por elevadas taxas de

mutação que se acumulam ao longo de sucessivas gerações, estimando-se

uma taxa mutacional loco-específica entre 0 e 8,58 x 10-3 e uma taxa

mutacional média de 2,80 x 10-3 por geração (Carvalho-Silva et

tein e Schlötterer, 1999; Kayser et al., 2000; Kayser e Sajantila,

2001; Gusmao et al., 2005).

Em geral, o modelo mutacional step wise (“passo a passo”) define a

dinâmica populacional dos microssatélites (Carvalho-Silva et al., 1999), os

quais estão sujeitos, principalmente se forem seqüências longas e

interruptas, ao polimorfismo de deleção/inserção, pelo qual alelos

diferentes variam no número de cópias integrais da unidade principal da

repetição em tandem. Tais polimorfismos de número variável de

35


36

extensão é mostrado na figura 2 e se

deslize das fitas de DNA durante a repl

de informação de seqüência (Goldste

Read, 2002).

muitos e

microssat

erros no processo de replicação e as correç

reparo. Vale ressal

uma vez

processo de mutaç

têm dado suporte à hipótese que seqüências repe

important

alterações evolucionárias (Goldstein

torna-se f

também é

crucial para uma correta interpretaçã

(Carvalho-Silva

2004; Gusmao

mais de uma gera

as taxas de mutação para cada loco estudado atr

direta do perfil de DNA de pais e filh

inicia pelo pareamento incorreto por

icação, o que leva a uma mudança

in e Schlötterer, 1999; Strachan e

Alguns desses erros são corrigidos por sistemas de reparo, mas

scapam e tornam-se mutações. Assim, a instabilidade dos

élites pode ser considerada como um balanço entre a geração de

ões através de sistemas de

tar que os microssatélites não são igualmente instáveis,

que nem todos estão propensos, da mesma maneira, ao

ão (Eisen, 2000 apud Goldstein e Schlötterer, 1999).

As altas taxas de mutação espontânea no número de repetições,

titivas são uma

e origem de variação genética quantitativa e substrato para

e Schlötterer, 1999). Tal hipótese

undamental para estudos evolutivos e populacionais.

O conhecimento sobre as taxas de mutação dos microssatélites

importante em testes de paternidade e análises forenses, pois é

o dos perfis genéticos encontrados

et al., 1999; Kayser e Sajantila, 2001; Kurihara et al.,

et al., 2005). Para tanto, torna-se necessário o estudo de

ção da população analisada, o que permite determinar

avés de observação

os para cada microssatélite analisado.

Figura 2: Modelo do i l c ssa i A fi é prese tada e as repetições do loco de microssatélite por retâ u n o e l a a sup -sint mostra como o paream incorreto por deslize d c i ão d N O deslize da fita envolve uma região de não-pareame contendo é s t esliz t da ara frente), causa respectivamente, u n ç u e n fita i izada e Schlötterer, 19

entonto,ndo,99).

processo mutac ona em mi ro tél tes.ng los; a fita i feri r é par nta e fit

das fitas po e o orrer durante a repl caçuma ou mais repetições da fita rec m- inte izada (d

ma i ser ão o del ção a

ta de DNA reerior é a recém

o D A. e para rás) ou recém-s ntet

n por linhasetizada. A figura

fita parental (deslize p (Goldstein

REPLICAÇÃO REPLICAÇÃO REPLICAÇÃO REPLIC

E AÇ

SEM MUTAÇ

PLICNORM

ÃO AL

ÃO

R

AÇÃO

ME ANISMO ARO

CDE REP

D SLIZ DA F TA E E I REALINHAMENTO

PERDA ODO ALINHAMENT

EXTENSÃO EXTENSÃO

DESLIZE PARA TRÁS CAUSA INSE ÇÃO(+1 REPETI ÃO)

R Ç

D Z R E

ESLI E PA A FRENTECAUSA D LEÇÃO (-1 REPETIÇÃO)

Barros, JEXS (2006) Diversidade Haplotípica de Y-STRs em Pernambuco 2. Microssatélites como Marcadores Moleculares do

Cromossomo Y

2.4.1 Cromossomo Y

O cromossomo Y humano é um cromossomo sexual de morfologia

acrocêntrica que pertence ao grupo G, sendo o terceiro menor

cromossomo humano com aproximadamente 60 milhões de pares de

bases, o que representa apenas 2% do ge

4

noma total (Ali e Hasnain, 2002;

raig et al., 2004).

No cromossomo Y são encontrados poucos genes funcionais, os

uais desempenham importante função biológica com conseqüências

retas na determinação do sexo e na fertilidade masculina, estando

nvolvidos no desenvolvimento e manutenção das células germinativas do

omem (Quintana-Murci et al., 2001).

Para manter as diferenças sexuais, os cromossomos X e Y são

strutural e funcionalmente distintos. No entanto, existem regiões de

omologia6 entre estes cromossomos. Essas regiões são denominadas

seudoautossômicas (PAR 1 e PAR 2) e estão localizadas nas porções

istais do braço longo e do braço curto dos cromossomos X e Y, como

ostra a figura 3. PAR 1 (2,60 Mb) e PAR 2 (0,32 Mb) desempenham

apel importante durante a meiose masculina pois são responsáveis pelo

areamento, recombinação e segregação corretas do par de cromossomos

Graves, 2002; Craig et al., 2004; Ross et al., 2005). Deleções

C

q

di

e

h

e

h

p

d

m

p

p

sexuais (

nestas regiões podem levar à esterilidade masculina, provavelmente por

falha na divisão meiótica (Quintana-Murci et al., 2001).

íram a partir de um cromossomo ancestral comum e sofreram, subseqüentemente, grande divergência ao longo dos anos (Graves, 2002; trachan e Read, 2002; Ross et al., 2005).

6 A existência de regiões homólogas nos cromossomos X e Y sugere que os dois cromossomos sexuais evolu

S

38

Barros, JEXS (2006) Diversidade Haplotípica de Y-STRs em Pernambuco A maior parte do cromossomo Y, cerca de 95%, compreende

Esta região não sofre recombinação com nenhum outro

omossomo, uma vez que o Y encontra-se em estado haplóide, por isso,

e

PAR2, com seus respectivos tamanhos, localizam-se nas extremidades dos braços longo

regiões, assim como as regiões de heterocromatina e eucromatina, estão indicadas na

figura (Jobling et al., 1997).

seqüências de DNA exclusivas deste cromossomo e, portanto, encontradas

apenas no macho.

cr

é denominada NRY (Non-recombining Region of Y-chromosome - Região

Não Recombinante do Cromossomo Y) ou ainda MSY (Male-specific Region

of Y-chroromosome, Região Macho-Específica do Cromossomo Y). A NRY,

como exibe a figura 3, é constituída por aproximadamente 24 Mb de

eucromatina e 30 Mb de heterocromatina constitutiva inerte, composta

por diferentes tipos de DNA não codificador altamente repetitivo (Ali

Hasnain, 2002; Strachan e Read, 2002).

Figura 3: Idiograma do bandeamento G do cromossomo Y humano. As regiões PAR1 e

e curto do cromossomo e recombinam-se com regiões homólogas do cromossomo X. A

NRY não sofre recombinação e é passada “em bloco” (haplótipo) de pai para filho. Tais

Heterocromatina ~ 30Mb

PAR2 = 0,32Mb

PAR1 = 2,60Mb

Eucromatina ~ 24Mb

Região não recombinante

(NRY)

39


2.4.2 Uso dos Microssatélites como Marcadores Genéticos do

to, o uso de marcadores do cromossomo Y

et al., 1999) e novos microssatélites

do cromossomo Y têm sido estudados

Cromossomo Y

A década de 90 foi marcada pelo desenvolvimento e rápido

estabelecimento da técnica de PCR para amplificar microssatélites. Tal

técnica tornou-se o método de escolha, o qual vem sendo empregado com

sucesso em casos forenses, permitindo que a amplificação dos

microssatélites seja realizada com precisão, sensibilidade e velocidade,

até mesmo quando o DNA está degradado (Ruitberg et al., 2001).

Através desta técnica, um grande número de microssatélites

autossômicos foram rapidamente avaliados e sucessivamente usados na

rotina forense. Enquanto is

permanecia estagnado devido à existência de um limitado número de

locos polimórficos estudados (Kayser et al., 1997; Butler et al., 2002).

Apenas três microssatélites do cromossomo Y diméricos (YCAI, YCAII e

YCAIII) (Mathias et al., 1994), um tetramérico (27H39 ou DYS19)7

(Roewer et al., 1992) e um pentamérico (Chen et al., 1994) tinham sido

descritos com mais detalhes até a metade da década de 90 (Kayser et al.,

1997).

Após o primeiro Workshop sobre marcadores do cromossomo Y em

Berlim (1996) vários dados de tipagem de locos do Y em populações de

todo o mundo foram relatados (Nata

e caracterizados a cada ano (Bosch

et al., 2002; Butler et al., 2002; Gusmao et al., 2002; Redd et al., 2002;

Beleza et al., 2003; Quintans et al., 2003; Uchihi et al., 2003; Zarrabeitia

et al., 2003; Schoske et al., 2004; Berger et al., 2005). Isso reflete em

mais de 100 locos do cromossomo Y disponíveis para investigações

forenses atualmente (Kayser et al., 2004; Berger et al., 2005), o que os

7 Y27H39 ou DYS19, como é designada atualmente, foi o primeiro microssatélite do cromossomo Y descrito (Roewer et al., 1992).

40

Barros, JEXS (2006) Diversidade Haplotípica de Y-STRs em Pernambuco torna uma ferramenta mundialmente aceita para identificação humana

(Berger et al., 2005).

Este fato se deve a alguns méritos do cromossomo Y, como a

especificidade masculina de sua maior parte e a ausência de

recombinação, que estabelece uma linhagem paterna e uma distribuição

sexo masculino, foi comprovado e

m sempre é

alélica específica na população (Roewer, 2003). Tais características

tornam os microssatélites do Y, em alguns casos, uma ferramenta mais

útil que os marcadores autossômicos, sendo particularmente importantes

na identificação de indivíduos em casos forenses, quando há misturas de

fluidos biológicos masculinos e femininos, em casos de paternidade

especiais e em estudos evolutivos e antropológicos (Kayser et al., 1997;

Schultes et al., 1999; Butler et al., 2003; Jobling e Tyler-Smith, 2003;

Goes et al., 2005).

O potencial do cromossomo Y, tanto para identificar quanto para

discriminar o DNA de um indivíduo do

tem sido extensivamente utilizado na prática forense. Tal ferramenta tem

seu valor acentuado pois a grande maioria dos crimes é cometida por

indivíduos do sexo masculino (99% dos crimes de violência contra uma

pessoa e 93% dos crimes sexuais na Inglaterra e Grã-Betanha – Home

Office, 1995 apud Jobling et al., 1997) e, em evidências de crime sexual,

o DNA do agressor encontra-se freqüentemente misturado ao DNA da

vítima (Roewer et al., 1996; de Knijff et al., 1997; Jobling et al., 1997;

Kayser et al., 1997).

Técnicas convencionais podem separar espermatozóides de

componentes femininos, entretanto, a completa separação ne

alcançada. Adicionalmente, o agressor pode ser azoospérmico ou

vasectomisado, o que impediria o funcionamento das técnicas utilizadas

para separação de células. Além disto, amostras misturadas que são

analisadas através de PCR com marcadores autossômicos podem sofrer

alguma interferência ou competição entre relativamente pouca quantidade

de DNA masculino e grande quantidade de DNA feminino. Nestas

circunstâncias, pode-se fazer a identificação do indivíduo através de PCR

41

Barros, JEXS (2006) Diversidade Haplotípica de Y-STRs em Pernambuco com marcadores do cromossomo Y localizados na NRY, não requerendo a

separação de células femininas e espermatozóides, o que aumenta a

probabilidade de se obter o perfil de DNA específico do macho em

amostras misturadas (Busque et al., 1997; Sibille et al., 2002; Goes et

al., 2005).

A análise de microssatélites do cromossomo Y também pode ser

ancestralidade da linhagem paterna em populações humanas.

ação adequada entre instituições

distin

muito útil em testes de paternidade, principalmente em casos que o

suposto pai é falecido ou ainda quando o pai alegado não pode ser

estudado. Nesses casos, indivíduos da mesma patrilinhagem podem ser

analisados através da utilização de marcadores do Y, permitindo assim,

chegar a informação desejada, uma vez que o homem transmite o mesmo

cromossomo Y, sem sofrer recombinação, para todos os seus filhos do

sexo masculino. Desta forma, tanto o pai alegado quanto o filho

compartilham o mesmo cromossomo Y (Jobling et al., 1997; Quintana-

Murci et al., 2001; Goes et al., 2005).

Devido a esta propriedade genética particular do cromossomo Y –

herdado como uma unidade intacta através da patrilinhagem – este

cromossomo sexual também tem se mostrado extremamente útil para

traçar a

Dessa forma, informações importantes são fornecidas para estudos

evolutivos e populacionais, como padrão específico das migrações

ocorridas no passado e predição de parentesco evolutivo através da

análise da diversidade genética das diferentes populações do mundo

(Pinheiro et al., 1997; Perez-Leuzaun et al., 1997; Frégeau et al., 1998;

Santos et al., 1999; Pena et al., 2000; Pacheco et al., 2005).

Como o uso de locos do cromossomo Y tem se tornado bastante

popular e numerosos novos locos vêm sendo introduzidos a cada ano, o

uso de uma nomeclatura comum é crucial nas áreas forenses e estudos

populacionais para permitir uma comunic

tas e a comparação entre dados obtidos (Gusmao et al., 2005). A

nomeclatura dos microssatélites do cromossomo Y segue as normas da

ISFG (International Society of Forensic Genetics - Sociedade Internacional

42

Barros, JEXS (2006) Diversidade Haplotípica de Y-STRs em Pernambuco de Genética Forense) que publica guias e recomendações regularmente.

De acordo com a ISFG, as seqüências repetidas podem ser designadas

como D#S##, sendo D – DNA, # - cromossomo estudado, S – para um

segmento único, ## - número de série. Dessa forma, os marcadores do

cromossomo Y são conhecidos como DYS (Gill et al., 2001; Gusmao et al.,

2005).

A designação dos alelos também é estabelecida pela ISFG, a qual

comenda que sejam nomeados de acordo com o número total de

nidades repetidas do loco (Kayser et al., 1997; Gill et al., 2001; Gusmao

t al., 2005). Ocasionalmente, alelos intermediários podem aparecer

evido à inserção ou deleção de uma base, portanto, se uma repetição

arcial for encontrada, o alelo é designado de acordo com o número de

epetições, separado por ponto e seguido pelo número de bases da

epetição incompleta. No caso de sistemas duplicados, onde a distinção

ntre diferentes produtos amplificados não for possível, os alelos

ncontrados devem ser nomeados separando-os por hífen, sendo tratados

omo genótipos de locos ligados e considerados como um único “alelo” ou

haplótipo” (Schneider et al., 1998; Gill et al., 2001; Gusmao et al.,

005).

Embora os polimorfismos do cromossomo Y tenham adquirido

rande importância na literatura forense, algumas limitações são

ncontradas na utilização dos locos de microssatélites deste cromossomo

omo marcadores moleculares para identificação de indivíduos da mesma

nhagem. Tais locos possuem uma menor capacidade de distinguir

divíduos que os marcadores autossômicos (Gusmao et al., 2005) devido

natureza haplóide do cromossomo Y. Neste caso, cada indivíduo possui

penas um alelo por marcador, o que é menos informativo que um

arcador autossômico com a mesma diversidade alélica porém,

presentando dois alelos por indivíduo.

Uma outra limitação encontrada é conseqüência da ausência de

recombinação do cromossomo Y. Esse fato implica na transmissão direta

do haplótipo do Y de pai para filho sem alterações. Logo, os homens de

re

u

e

d

p

r

r

e

e

c

“

2

g

e

c

li

in

à

a

m

a

43

Barros, JEXS (2006) Diversidade Haplotípica de Y-STRs em Pernambuco uma mesma linhagem paterna compartilham o mesmo haplótipo, exceto

utação. Sendo assim, algumas estratégias devem ser

mpregadas para aumentar o poder de discriminação do haplótipo, como

analisar o maior número de marcadores possível ou ainda, o que é mais

viável, utilizar uma combinação dos marcadores mais polimórficos (Bosch

et al., 2002; Redd et al., 2002; Schoske et al., 2004).

se ocorrer alguma m

e

44


2.5 Haplótipos

Algumas partes do genoma humano são herdadas em grupos,

geração após geração. Esses grupos de genes se dispõem em locos

ligados, estando situados muito próximos no mesmo cromossomo e, por

isso, raramente recombinam ou sofrem rearranjos gênicos. Assim,

conjuntos de alelos situados no mesmo segmento cromossômico tendem a

serem transmitidos em blocos. Estes blocos de alelos são conhecidos

como haplótipos (Kayser et al., 1997; Quintana-Murci et al., 2001;

Strachan e Read, 2002).

Os haplótipos marcam segmentos cromossômicos reconhecíveis, que

podem ser seguidos através de genealogia e de populações. Enquanto não

desfeitos por recombinação, os haplótipos podem ser tratados, para fins

de mapeamento, genética forense, investigação de paternidade, entre

outras áreas, como se fossem um só loco altamente polimórfico.

Dependendo do grau de polimorfismo dos diferentes locos, os haplótipos

podem ter freqüências tão baixas que tornam cada indivíduo quase único


Os microssatélites do cromossomo Y são herdados como haplótipos,

os quais são transmitidos de pai para filho, estabelecendo uma linhagem

paterna (Kayser et al., 1997). A herança patrilínea da porção não-

recombinante do Y resulta na conservação completa de polimorfismos de

locos ligados. Quando tomados conjuntamente, estes polimorfismos

fornecem haplótipos altamente discriminatórios e, portanto, ferramentas

de grande utilidade para genética forense e estudos populacionais.

Várias populações do mundo vêm sendo estudadas e bancos de

dados de haplótipos de microssatélites do cromossomo Y têm sido

estabelecidos na Europa, América e Ásia (Roewer et al., 2001; Kayser et

al., 2002; Lessig et al., 2003).

45

Barros, JEXS (2006) Diversidade Haplotípica de Y-STRs em Pernambuco Um haplótipo constituído pelos locos DYS19, DYS385, DYS389I e II,

DYS390, DYS391, DYS392 e DYS393 tem sido o mais comum8 conjunto de

; Park

t al., 2005).

No entanto, necessidades forenses específicas algumas vezes

equerem mais informações (Sanchez-Diz et al., 2003) e, portanto, locos

e microssatélites do cromossomo Y adicionais são requeridos para

umentar o potencial do haplótipo para distinguir diferentes linhagens

aternas (Berger et al., 2005; Park et al., 2005). Por esta razão, a adição

o marcador YCAII ao haplótipo mínimo determinou o haplótipo estendido

de Knijff et al.,1997; Kayser et al., 1997; Roewer et al., 2001),

umentando consideravelmente o poder de discriminação do haplótipo.

ontudo, o marcador YCAII não é ideal para o estudo de misturas de

mostras masculinas, pois é um marcador polimórfico dinucleotídico que

ode levar ao deslizamento da DNA polimerase durante a PCR (Redd et

l., 2002; Chi e Lam, 2005). Diante disto, foi definido um haplótipo

omposto pelos locos do haplótipo mínimo e os microssatélites DYS438 e

YS439, o qual não apresentou nenhuma perda apreciável na capacidade

iscriminatória em relação ao haplótipo inicialmente estabelecido, com a

antagem da eliminação do problema produzido pelo marcador YCAII

marcadores do Y analisado em diversas populações (Biondo et al., 2004;

Leat et al., 2004; Martín et al., 2004; Saul et al., 2004; Berger et al.,

2005; Dobashi et al., 2005; Goes et al., 2005; Lovrecic et al., 2005; Park

et al., 2005; Pepinski et al., 2005; Rosa et al., 2005) e é definido como

haplótipo mínimo (Redd et al., 2002). O haplótipo mínimo foi estabelecido

na Europa e possui um bom poder discriminatório, podendo distinguir

aproximadamente 76,1% a 95,5% dos indivíduos do sexo masculino em

várias populações (Kayser et al., 1997; Roewer et al., 2001; Kayser et al.,

2002; Lessig et al., 2003; Nasidge et al., 2003; Schoske et al., 2004

e

r

d

a

p

d

(

a

C

a

p

a

c

D

d

v

o YHRD (Y Chromosome Haplotype Reference Database - Banco de Dados

eferência de Haplótipos do Cromossomo Y) continha mais de 26.000 registros do estudo e haplótipo mínimo em populações mundiais (Roewer et al., 2001; Berger et al., 2005).

8 Até 2004, Rd

46

Barros, JEXS (2006) Diversidade Haplotípica de Y-STRs em Pernambuco (Redd et al., 2002; Berger et al., 2003; Butler e Schoske, 2004; Berger et

adores polimórficos vêm sendo estudados e poderiam

r combinados ao haplótipo mínimo para obtenção de um haplótipo com

al., 2005; Krenke et al., 2005).

Outros marc

se

maior capacidade de diferenciar indivíduos. Um bom exemplo são os

marcadores DYS447, DYS458 e DYS464, os quais apresentam-se mais

polimórficos que os locos DYS438 e DYS439 e, portanto, são bastante

informativos (Redd et al., 2002; Berger et al., 2003; Butler e Schoske,

2004), tornando-se ótimos candidatos à composição de um haplótipo

estendido com considerável poder de discriminação. Tal haplótipo faz-se

bastante útil para o presente estudo na população de Pernambuco.

47

Barros, JEXS (2006) Diversidade Haplotípica de Y-STRs em Pernambuco 2.6 Marcadores Genéticos do Cromossomo Y Usados

neste Estudo

Atualmente, um dos mais importantes objetivos dos geneticistas

tratificação étnica e

ge d de os ssom al.,

2005). Mais de 100 locos do cromossomo Y humano foram identificados

(Roewer 1992; Chen et al.,

al. Kayse 1997; t a yu a

et 1; 200 et ;

K a yud al. e

Segundo a ISFG, cerca de 220 diferentes marcadores do Y são

po en en

de pacid criminat dad an s

ainda são escassos e torna-se, portanto, prematura a reco

alguns destes marcadores para tais propósitos (Gusmao et al., 2005).

Al , muit possue s b m s

e, út dis di

Diante disso, 11 marcadores de microssatélites do cromossomo Y

fo cionad base gr im

através da análise de populações mundiais, com o objetivo de aumentar o

poder do haplótipo formado de discriminar indivíduos. Os marcadores do Y

analisados no presente trabalho foram: DYS19, DYS385, DYS389I,

DYS389II, DYS390, DYS391, DYS392 e DYS393, que constituem o

h

a Saul et al., 2004; Berger

; Dobashi et al., 2005; Goes et al., 2005; Lovrecic et al.,

2005;

forenses e antropológicos é o desenvolvimento de bancos de dados de

populações, que é crucial para estabelecer uma es

ográfica as freqüências haplótip do cromo o Y (Khil et

et al., 1994; Mathias et al., 1994; Jobling et

, 1996; r et al., White e l., 1999; A b et al., 2000; Iid

al., 200 Bosh et al., 2; Iida al., 2002 Redd et al., 2002;

ayser et l., 2004; Moh din et , 2004; B rger et al., 2005).

tencialm te úteis para g ética forense. No entanto, para a maioria

les, a ca ade dis ória e os import tes das seqüência

mendação de

ém disso os deles m alelo astante co uns nas populaçõe

por isso, tornam-se pouco eis para criminar in víduos.

ram sele os com no alto au de pol orfismo encontrado

aplótipo mínimo, o qual foi estudado em diversas populações (Biondo et

l., 2004; Leat et al., 2004; Martín et al., 2004;

et al., 2005

Park et al., 2005; Pepinski et al., 2005; Rosa et al., 2005).

Adicionalmente, foram analisados os locos DYS447, DYS458 e DYS464

que, embora ainda pouco estudados em populações mundiais (Berger et

48

Barros, JEXS (2006)

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Lista de Tabelas - attena.ufpe.br · Ciclos térmicos estabelecidos para as quatro reações de PCR-multiplex construídas..... Tabela 12. Freqüências e diversidades (h) alélicas