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LIVIA MARIA ZAMBROZI GARCIA PASSARI
CAMPINAS
2014
ESTUDOS QUIMIOMÉTRICOS DOS EFEITOS DO SOLVENTE E DA
SAZONALIDADE NOS METABÓLITOS SECUNDÁRIOS DA Mikania
laevigata
ii
iii
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE QUÍMICA
LIVIA MARIA ZAMBROZI GARCIA PASSARI
ESTUDOS QUIMIOMÉTRICOS DOS EFEITOS DO SOLVENTE E DA
SAZONALIDADE NOS METABÓLITOS SECUNDÁRIOS DA Mikania laevigata
TESE DE DOUTORADO APRESENTADA AO
INSTITUTO DE QUÍMICA DA UNICAMP PARA
OBTENÇÃO DO TÍTULO DE DOUTORA EM
CIÊNCIAS
ORIENTADOR: PROF. DR. ROY EDWARD BRUNS
COORIENTADORA: PROFA. DRA. IEDA SPACINO SCARMÍNIO
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA
POR LIVIA MARIA ZAMBROZI GARCIA PASSARI E ORIENTADA PELO PROF.
DR. ROY EDWARD BRUNS
___________________________
ASSINATURA DO ORIENTADOR
CAMPINAS
2014
iv
Ficha catalográfica Universidade Estadual de Campinas
Biblioteca do Instituto de Química Simone Lucas Gonçalves de Oliveira - CRB 8/8144
Informações para Biblioteca Digital Título em outro idioma: Chemometrics studies of solvent and seasonal effects in secondary metabolites of the Mikania laevigata. Palavras-chave em inglês: Chemometrics Experimental mixture design Mikania laevigata Extraction optimization Área de concentração: Química Analítica Titulação: Doutora em Ciências Banca examinadora: Roy Edward Bruns [Orientador] Fabíola Manhas Verbi Pereira Patrícia Kaori Soares Carla Beatriz Grespan Bottoli Anne Hélène Fostier Data de defesa: 21-08-2014 Programa de Pós-Graduação: Química
Passari, Livia Maria Zambrozi Garcia, 1985- P266e PasEstudos quimiométricos dos efeitos do solvente e da sazonalidade nos metabólitos secundários da Mikania laevigata. / Livia Maria Zambrozi Garcia Passari. – Campinas, SP : [s.n.], 2014. PasOrientador: Roy Edward Bruns. PasCoorientador: Ieda Spacino Scarminio. PasTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química. Pas1. Quimiometria. 2. Planejamento experimental de misturas. 3. Mikania laevigata. 4. Otimização da extração. I. Bruns, Roy Edward. II. Scarminio, Ieda Spacino. III. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Química. IV. Título.
vi
vii
Dedico este trabalho
Ao meu amor, Gustavo, por me incentivar e sempre acreditar nos meus sonhos e
objetivos.
viii
ix
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Bruns. Não tenho palavras para expressar meu respeito e gratidão por tudo
que pude aprender ao seu lado. Agradeço imensamente pela excelente orientação e
conhecimentos compartilhados, pela compreensão nos momentos difíceis e acima de tudo
pela confiança em meu trabalho.
À Profa. Dra. Ieda pelo exemplo de profissionalismo e pessoa. Por ter me recebido
prontamente em seu laboratório e ter me dado toda a orientação e incentivo para a
elaboração deste trabalho. Seu apoio foi fundamental para que eu chegasse até aqui.
À Universidade Estadual de Campinas, em especial ao instituto de Química e ao
programa de pós-graduação.
À Universidade Estadual de Londrina, por disponibilizar toda a infraestrutura para a
realização experimental deste trabalho.
À CNPq pelo financiamento deste trabalho.
À Rita de Cassia Zacardi de Souza pela disponibilização da infraestrutura do laboratório
de espectrometria de massas, explicações e atenção sempre presentes.
Aos meus pais e irmãos, Gui e Cy, pelo amor, paciência e incentivo não só nestes anos
de doutorado, mas em toda a minha vida.
À minha querida família, vózinha, tios, primos, primas, cunhados e cunhadas. Obrigada
pela compreensão nos momentos de ausência e pelo encorajamento para terminar esta
jornada.
Ao Gustavo, pelo amor, amizade e companheirismo. Obrigada por sempre estar ao meu
lado.
À Dany pela força e amizade ao longo desses anos...
Aos amigos do grupo, Arnaldo e Wagner que ao longo deste período se tornaram grande
amigos. Obrigada pelo apoio e os momentos divertidos.
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CURRICULUM VITAE
DADOS PESSOAIS Nome: Livia Maria Zambrozi Garcia Passari Naturalidade: Penápolis – SP/ Brasil Data de Nascimento: 28/05/1985 Estado Civil: Casada FORMAÇÃO ACADÊMICA 2007 – 2009: Mestrado em Química dos Recursos Naturais. Universidade Estadual de Londrina, UEL, Londrina, Paraná, Brasil. Título: Análise exploratória do efeito do solvente na análise de metabólitos secundários das folhas de Mikania laevigata Sch. Bip. por métodos quimiométricos, Orientador: Ieda Spacino Scarmínio. Bolsista da: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior. 2003 – 2006: Graduação em Química Bacharelado, com atribuições em Química Tecnológica e Licenciatura. Universidade Estadual de Londrina, UEL, Londrina, Paraná, Brasil. ATUAÇÃO PROFISSIONAL 08/2012 – Atual: Docente na escola de Engenharia da Universidade Anhembi Morumbi. Disciplinas ministradas: Química Aplicada à Engenharia, Química Ambiental, Propriedades dos materiais. ATIVIDADES ACADÊMICAS 10 semestre de 2012: Monitoria dentro do programa de estágio docente (PED) na disciplina de Química Analítica (QA 112). Professora Coordenadora: Isabel Cristina Sales Fontes Jardim. LISTA DE PUBLICAÇÕES 1. L. M. Z. G. Passari, I. S. Scarmínio, R. E. Bruns. Experimental designs characterizing seasonal variations and solvent effects on the quantities of coumarin and related metabolites from Mikania laevigata. Analytica Chimica Acta 821, 89–96, 2014. 2. L. M. Z. G. Passari, P. K. Soares, I. S. Scarmnínio, R. E. Bruns. Estatística aplicada à química: dez dúvidas comuns. Quim. Nova, Vol. 34, No. 5, 888-892, 2011. 3. L. M. Z. Garcia, T. F. de Oliveira, P. K. Soares, R. E. Bruns, I. S. Scarminio.
xii
Statistical mixture design — Principal component determination of synergic solvent interactions for natural product extractions. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems 103, 1-7, 2010. 4. L. M. Z. Garcia, E. D. Pauli, V. Cristiano, C. A. P. da Camara, I. S. Scarmínio, S. L. Nisxdorf Chemometric evaluation of adulteration profile in coffee due to corn and husk by determining carbohydrates ssing HPAEC-PAD. Journal of Chromatographic Science 47, 825-832, 2009. TRABALHOS EM EVENTOS INTERNACIONAIS Passari, L. M. Z. G., Bruns, R. E., Scarminio, I. S., SEASONAL, SOLVENT COMPOSITION AND THEIR INTERACTION EFECTS ON THE EXTRACTION OF SECONDARY METABOLITES FROM THE MIKANIA PLANT, 13th Conference on Chemometrics in Analytical Chemistry, Budapest – Hungria; 25-29 June 2012. Programme e Book of Abstracts: Chemometrics in “omics” technologies, p. 101.
Passari, L. M. Z. G., Soares, P. K., Bruns, R. E., Scarminio, I. S., BINARY SYNERGIC INTERACTION EFFECTS IN SOLVENT MIXTURES FOR FRACTIONATED AND TOTAL EXTRACTS OF MIKANIA LAEVIGATA SCH. BIP. LEAVES. 12th Conference on Chemometrics in Analytical Chemistry, Antuérpia – Bélgica; November 2010.
TRABALHOS EM EVENTOS NACIONAIS Passari, L. M. Z. G., Bruns, R. E., Scarminio, I. S., INFLUÊNCIA DA COMPOSIÇÃO E DA FORÇA DO SOLVENTE NA IMPRESSÃO DIGITAL CROMATOGRÁFICA DA Mikania laevigata, 16a Encontro Nacional de Química Analítica, 2011, Campos de Jordão, São Paulo, Brasil.
Passari, L. M. Z. G., Bruns, R. E., Scarminio, I. S., PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL PARA A OTIMIZAÇÃO DO RENDIMENTO DOS METABÓLITOS SECUNDÁRIOS DE MATERIAL VEGETAL, 34a Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, 2011, Florianópolis, Santa Catarina, Brasil.
Passari, L. M. Z. G., Soares, P. K., Bruns, R. E., Scarminio, I. S., EMPREGO DE PLANEJAMENTO ESTATÍSTICO DE MISTURAS NO PROCESSO DE EXTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS, 33a Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, 2010, Águas de Lindóia, São Paulo, Brasil.
Passari, L. M. Z. G., Pauli, E. D., Scarminio, I. S., Valderi, C., Diniz, A., Camera, C. A. P., Nixdorf, S. L. AVALIAÇÃO QUIMIOMÉTRICA DE PERFIS DE ADULTERAÇÕES EM CAFÉ POR MILHO E CASCA EMPREGANDO A DETREMINAÇÃO DE CARBOIDRATOS POR HPAE/HPLC-PAD In: Congresso Latino Americano de Cromatografia e Técnicas Relacionadas, 2008, Florianópolis, Santa Catarina, Livro de Resumos, p. 162.
xiii
RESUMO
Título: Estudos quimiométricos dos efeitos do solvente e da sazonalidade nos metabólitos
secundários da Mikania laevigata
Autora: Livia Maria Zambrozi Garcia Passari
Orientador: Prof. Dr. Roy Edward Bruns
Coorientadora: Profa. Dra. Ieda Spacino Scarmínio
Neste trabalho foi estudada a planta Mikania laevigata Sch. Bip, uma vez que é utilizada
na medicina alternativa para fazer xaropes e chás devido às suas propriedades
terapêuticas. Foram avaliados os efeitos sazonais e da composição do solvente extrator,
bem como as suas interações na qualidade e no rendimento dos extratos brutos e das
frações neutras, orgânicas, básicas, polares e fibras. O modelo estatístico de mistura do
tipo Centróide-Simplex com quatro componentes, etanol, acetona, clorofórmio e
diclorometano, foi empregado para a extração dos metabólitos secundários e os
resultados indicaram que os efeitos sazonais são evidentes para o rendimento dos
extratos brutos e todas as frações. Por outro lado, os efeitos dos solventes são
importantes e significativos para o extrato bruto e frações, exceto a fração polar. Métodos
estatísticos multivariados e univariados foram empregados aos dados gravimétricos e
aqueles obtidos por cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por arranjo de
diodos (CLAE-DAD) e cromatografia líquida de ultra-eficiência acoplada à espectrometria
de massas sequencial (CLUE-EM/EM). As análises das frações orgânicas permitiram
estudar as quantidades relativas da cumarina, a principal substância química de ação
farmacológica encontrada na Mikania, e também dos ácidos melilótico e o-cumárico,
sendo este último o precursor biossintético da cumarina. A existência e medição das
abundâncias relativas do ácido melilótico na planta Mikania laevigata não foi relatada
anteriormente. As concentrações dos ácidos melilótico e o-cumárico foram altamente
correlacionadas durante todo o ano. As maiores concentrações da cumarina foram obtidas
no verão, enquanto que para os ácidos o-cumárico e melilótico a maior abundância foi na
primavera. O efeito do solvente também se mostrou significativo. Para as amostras
xiv
coletadas verão, etanol extraiu a maior quantidade de cumarina na planta. As maiores
quantidades dos ácidos o-cumárico e melilótico foram extraídas por misturas contendo os
solventes etanol e acetona em suas composições nas estações primavera e inverno.
xv
ABSTRACT
Title: Chemometrics studies of solvent and seasonal effects in secondary metabolites of
the Mikania laevigata
Author: Livia Maria Zambrozi Garcia Passari
Advisor: Prof. Dr. Roy Edward Bruns
Co-advisor: Profa. Dra. Ieda Spacino Scarmínio
In this work the secondary metabolites of the Mikania laevigata Sch. Bip plant have been
studied since they are used in alternative medicine for making syrups and teas with
reputed therapeutic advantages. We have evaluated seasonal and solvent composition
effects as well as their interactions for crude extract and organic, neutral, basic, polar and
fiber fraction yields. The Simplex-Centroid mixture design for the ethanol,
dichloromethane, chloroform and acetone solvents has been applied to the extraction of
the secondary metabolites, and the results indicate that significant seasonal effects exist
for the crude extract and all the fraction yields. On the other hand, the solvent effects are
seen to be significant for the crude extract and all the fractions except the polar one. Both
univariate and multivariate statistical methods were applied to the gravimetric data and
those obtained by RP-HPLC-DAD and both positive and negative modes of UPLC-MS
analyses. Analyses the organic fraction of the M. laevigata plant allowed determining the
relative quantities of coumarin, the principal active pharmacological substance in Mikania,
o-coumaric acid, the coumarin biosynthesis precursor, and melilotic acid for each solvent
composition of samples harvested in the four different seasons. The existence and
measurement of the relative abundances of melilotic acid in Mikania laevigata have not
been reported previously. o-coumaric and melilotic acids concentrations were strongly
correlated during the year. Highest coumarin concentrations were encountered in the
summer whereas its o-coumaric acid precursor as well as melilotic acid were most
abundant in the spring. Also the solvent effects are seen to be significant. In summer,
ethanol extracted the highest amount of coumarin from the plant. Highest amounts of o-
coumaric and melilotic acids were extracted by mixtures containing both ethanol and
acetone in the winter and spring.
xvi
xvii
SUMÁRIO
Lista de Abreviaturas...........................................................................................
Lista de Tabelas...................................................................................................
Lista de Figuras....................................................................................................
1 Introdução e Objetivos ..................................................................................
xix
xxi
xxiii
1
2 Métodos Quimiométricos................................................................................. 7
2.1 Modelos Estatísticos.............................................................................. 9
2.2 Análise de Componentes Principais (ACP)........................................... 9
2.3 Análise Hierárquica de Agrupamentos (AHA)....................................... 10
3 Descrição Experimental.................................................................................... 13
3.1 Material Vegetal..................................................................................... 15
3.2 Extração e Fracionamento Químico...................................................... 16
3.3 Análises Cromatográficas...................................................................... 20
3.4 Reagentes e Programas Computacionais............................................. 21
4 Resultados......................................................................................................... 23
4.1 Resultados Gravimétricos..................................................................... 25
4.2 Efeitos das Interações dos Solventes nas Análises Metabolômicas..... 36
4.3 Estudo Fitoquímico e do Efeito Sazonal nos Perfis Espectrais dos
Compostos Detectados nos Extratos Brutos e Frações Orgânicas.......................
41
4.3.1 Análise dos Extratos Brutos............................................................... 42
4.3.2 Análise das Frações Orgânicas.......................................................... 49
4.4 Otimização do Processo da Extração da Cumarina e Outros
Metabólitos Secundários no Guaco.......................................................................
59
5 Conclusão…………………………………………………………………………….. 89
6 Referências Bibliográficas………………………………………………………… 93
7 Anexos…………..……………………………..…………………………………….. 101
7.1 Números de picos detectados nas análises cromatográficas das
amostras dos extratos brutos e frações orgânica e básica no verão, outono e
inverno.................................................................................................................... 103
xviii
xix
LISTA DE ABREVIATURAS
ANOVA Análise de Variância
a Acetona
ACP Análise de componentes principais
AHA Análise hierárquica de agrupamentos
Parâmetro de acidicidade
Parâmetro de basicidade
CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência
CLUE Cromatografia líquida de ultra eficiência
CP Componente principal
c Clorofórmio
ac Mistura acetona e clorofórmio
d Diclorometano
ad Mistura acetona e diclorometano
cd Mistura clorofórmio e diclorometano
DAD Detector por arranjo de diodos
E Matriz dos resíduos
EM Espectrometria de massas
e Etanol
ae Mistura acetona e etanol
ce Mistura clorofórmio e etanol
de Mistura diclorometano e etanol
ade Mistura acetona, diclorometano e etanol
ace Mistura acetona, clorofórmio e etanol
cde Mistura clorofórmio, diclorometano e etanol
acd Mistura acetona, clorofórmio e diclorometano
FR Fase Reversa
IES Ionização por electrospray
k Fator de retenção
min
m/z
Minutos
Razão massa/carga
n Objetos
N Número de pratos ou eficiência
xx
p Variáveis
P Matriz dos loadings
P’ Parâmetro de solventes de Snyder
q Número de componentes na mistura
q Número de componentes principais
r Replicatas
S Força do solvente
S Força cromatográfica
T Matriz dos escores
UV-Vis Espectroscopia de absorção molecular no ultravioleta-visível
X Matriz
i Fração de volume do solvente puro
y Resposta prevista pelo modelo
α Fator de separação
Parâmetro de dipolaridade
xxi
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1: Planejamento de misturas para a preparação dos extratos.................. 17
Tabela 2: Composição do solvente extrator em volume (mL), rendimentos (g),
média e desvio padrão dos extratos brutos, frações neutra; orgânica; básica e
polar, fibras e resíduos obtidos das folhas da Mikania na primavera, verão,
outono e inverno..................................................................................................... 26
Tabela 3: Análise de variância de dois fatores (ANOVA) para os rendimentos
do extrato bruto, fibras e frações neutra, orgânica, básica e polar........................ 29
Tabela 4: Composição da mistura extratora em mL, valores das absorvâncias
máximas, médias e desvios padrões obtidos nos perfis espectrais da cumarina
no verão, outono, inverno e primavera................................................................... 62
Tabela 5: Correlações entre os valores das absorvâncias máximas obtidas no
perfil espectral da cumarina nas quatro estações no nível de 95 % de confiança. 63
Tabela 6: Intensidades dos íons de maior abundância relativa no espectro de
massas dos ácidos o-cumárico e melilótico, obtidas em cada ponto do
planejamento de misturas por CLUE-EM/EM no verão, outono, inverno e
primavera................................................................................................................ 66
Tabela 7: Análise da variância para os modelos lineares ajustados às respostas
experimentais das absorvâncias máximas no perfil espectral da cumarina nos
extratos fracionados do guaco no verão e no inverno........................................... 71
Tabela 8: Análise da variância para os modelos quadráticos ajustados as
respostas experimentais das intensidades do íon de maior abundância relativa
no espectro de massas do ácido o-cumárico nos extratos fracionados do guaco
nas quatro estações............................................................................................... 76
Tabela 9: Análise da variância para os modelos ajustados aos dados da
intensidade do íon de maior abundância relativa no espectro de massas do
ácido melilótico nas frações orgânicas nas quatro estações................................. 81
xxii
xxiii
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1: Procedimento experimental empregado no trabalho.................................. 15
Figura 2: Foto da exsicata e da planta Mikania laevigata.......................................... 16
Figura 3: Planejamento experimental de misturas do tipo Centróide-Simplex com
4 componentes; utilizado para a preparação dos extratos......................................... 17
Figura 4: Procedimento experimental para o fracionamento químico dos extratos
brutos da Mikania laevigata resultando nas diferentes classes de metabólitos
secundários................................................................................................................. 18
Figura 5: Gráfico de barras de incertezas para comparar as médias dos
rendimentos do extrato bruto (a), frações neutra (b); orgânica (c); básica (d); polar
(e) e fibras (f) nas quatro estações............................................................................. 28
Figura 6: Gráfico dos perfis dos rendimentos dos extratos brutos (a) e das frações
neutras (b), orgânicas (c), básicas (d), polar (e) e fibras (f) em cada ponto do
planejamento estatístico de misturas nas quatro estações........................................ 31
Figura 7: (a) Gráfico dos escores e (b) loadings para a primeira e a segunda
componentes principais.............................................................................................. 34
Figura 8: Triângulo de seletividade baseado nos parâmetros , e para cada
ponto do planejamento estatístico de misturas.......................................................... 37
Figura 9: Cromatogramas dos extratos brutos do ponto central (replicatas),
obtidos na primavera com as fases móveis (a) s = 1,0; (b) s = 1,5 e (c) s = 2,0 em
240 nm........................................................................................................................ 38
Figura 10: Modelo Centróide-Simplex com os números dos picos detectados
utilizando a fase móvel s = 1,0 e em 240 nm para o extrato bruto (a) e as frações
orgânicas (b), básicas (c) e polares (d)...................................................................... 38
Figura 11: Gráfico biplot de escores e loadings para as duas componentes
principais para os dados dos picos detectados nas análises cromatográficas das
amostras do extrato bruto e frações básica, orgânica e polar.................................... 40
Figura 12: Cromatogramas dos extratos brutos da Mikania laevigata obtidos com
o solvente puro etanol nas quatro estações............................................................... 42
Figura 13: Dendrograma da análise de agrupamento hierárquica e perfis
xxiv
espectrais dos picos cromatográficos do extrato bruto da Mikania, obtido com o
solvente puro etanol nas quatro estações..................................................................
43
Figura 14: Gráfico dos escores (a) e loadings (b) das componentes principais 1 e
3 dos dados espectrais dos picos cromatográficos do extrato bruto da Mikania
obtido com o solvente puro etanol nas quatro estações............................................
46
Figura 15: Cromatograma de íons totais e espectro de massa IES-EM no modo
positivo de ionização dos íons correspondentes aos picos em 0,9 e 1,2 min para o
extrato bruto preparado com o solvente puro etanol no verão................................... 47
Figura 16: Espectros de massas IES-EM no modo negativo de ionização dos íons
correspondentes ao ácido o-cumárico (a), ácido melilótico (b) e siringaldeído (c) no
extrato bruto preparado com o solvente puro etanol no outono................................. 48
Figura 17: Cromatogramas das frações orgânicas Mikania laevigata obtidos nas
quatro estações com mistura binária diclorometano-etanol (a) e com a mistura
ternária clorofórmio-diclorometano-etanol (b). ........................................................... 49
Figura 18: Dendrograma da análise de agrupamento hierárquica e perfis
espectrais dos picos cromatográficos das frações orgânicas da Mikania, preparada
com a mistura binária diclorometano-etanol nas quatro estações. 1 = verão; 2 =
outono; 3 = inverno e 4 = primavera........................................................................... 50
Figura 19: Gráfico dos escores (a) e loadings (b) das componentes principais 1 e
2 dos dados espectrais dos picos cromatográficos das frações orgânicas da
Mikania preparadas com a mistura binária diclorometano-etanol nas quatro
estações...................................................................................................................... 52
Figura 20: Dendrograma da análise de agrupamento hierárquica e perfis
espectrais dos picos cromatográficos das frações orgânicas da Mikania, preparada
com a mistura ternária clorofórmio-diclorometano-etanol nas quatro estações......... 54
Figura 21: Gráfico dos escores das componentes principais 1 e 2 dos dados
espectrais dos picos cromatográficos das frações orgânicas da Mikania
preparadas com a mistura ternária clorofórmio-diclorometano-etanol nas quatro
estações...................................................................................................................... 56
xxv
Figura 22: Gráfico dos loadings das componentes principais 1 e 2 dos dados
espectrais dos picos cromatográficos das frações orgânicas da Mikania
preparadas com a mistura ternária clorofórmio-diclorometano-etanol.......................
57
Figura 23: Cromatograma de íons totais e espectros de massas IES-EM no modo
negativo de ionização dos íons correspondentes aos picos em: 0,4 mim
(siringaldeído), 1,24 min (ácido melilótico) e 1,56 min (ácido o-cumárico), para as
frações orgânicas preparadas com a mistura ternária clorofórmio-diclorometano-
etanol no outono e na primavera................................................................................
58
Figura 24: Cromatogramas obtidos por FR-CLAE-DAD dos extratos fracionados
da planta Mikania laevigata Schultz Bip. no ponto central (replicatas) do
planejamento nas quatro estações............................................................................. 59
Figura 25: Cromatograma de íons totais e espectros de massas IES-EM no modo
negativo de ionização dos íons correspondentes aos picos em 1,24 e 1,56 min
para a fração orgânica obtido no ponto central do planejamento na primavera......... 61
Figura 26: Absorvâncias máximas obtidas no perfil espectral da cumarina para
cada solvente extrator utilizado no planejamento estatístico de misturas no verão
(a); outono (b); inverno (c) e primavera (d). As letras e, a, d, e c correspondem aos
solventes etanol, acetona, diclorometano e clorofórmio, respectivamente................ 64
Figura 27: Intensidades dos íons de maior abundância relativa obtidas em cada
ponto do planejamento estatístico de misturas no espectro de massas do ácido o-
cumárico no inverno (a) e na primavera (b), e do ácido melilótico no inverno (c) na
primavera (d). As letras e, a, d, e c correspondem aos solventes etanol, acetona,
diclorometano e clorofórmio, respectivamente........................................................... 68
Figura 28: Planejamento experimental Centróide-Simplex com as respostas
experimentais das absorvâncias máximas da cumarina (105) nos extratos
fracionados do guaco obtidos no outono.................................................................... 69
Figura 29: Planejamento experimental Centróide-Simplex com as respostas
experimentais das absorvâncias máximas da cumarina (105) nos extratos
fracionados do guaco obtidos na primavera............................................................... 70
Figura 30: Gráficos (a) e (c) correspondem aos resíduos deixados pelo ajuste dos
modelos lineares nas estações verão e inverno, respectivamente. Gráficos (b) e
(d) correspondem às respostas previstas pelas respostas observadas nas
xxvi
estações verão e inverno, respectivamente............................................................... 73
Figura 31: Superfícies de respostas (a) e (b) para os componentes; etanol,
acetona e clorofórmio aplicadas as absorvâncias máximas da cumarina nos
extratos fracionados do guaco nas estações verão e inverno, respectivamente....... 74
Figura 32: Gráficos (a) (c) (e) e (g) dos resíduos e dos (b), (d), (f) e (h) das
respostas previstas pelas respostas observadas nas quatro estações...................... 78
Figura 33: Superfícies de respostas (a), (b), (c) e (d) para os componentes;
etanol, diclorometano e acetona aplicadas às intensidades do íon de maior
abundância relativa no espectro de massas do ácido o-cumárico nos extratos
fracionados do guaco no verão, outono, inverno e primavera, respectivamente.......
79
Figura 34: Gráficos (a) (c) e (e) dos resíduos deixados pelo ajuste dos modelos
nas estações verão, outono, inverno e primavera, respectivamente. Gráficos (b),
(d), (f) e das respostas previstas pelas respostas observadas.................................. 84
Figura 35: Superfícies de respostas (a), (b), (d) para os componentes; etanol,
clorofórmio e diclorometano e (c) para os componentes etanol, clorofórmio e
acetona, aplicadas às intensidades do íon de maior abundância relativa no
espectro de massas do ácido melilótico nas frações orgânicas nas estações verão,
outono, inverno e primavera, respectivamente........................................................... 85
Figura 36: Sequências de reações enzimáticas para a conversão da cumarina em
ácido melilótico. (a) cumarina; (b) dihidrocumarina; (c) ácido melilótico.................... 86
1
1. Introdução e
Objetivos
2
3
As plantas produzem e acumulam uma variedade de compostos orgânicos que não
estão diretamente envolvidos nos seus processos metabólicos primários, como o
crescimento e o desenvolvimento1. Esses compostos, também chamados de metabólitos
secundários, desempenham um papel importante na interação das plantas com o meio
ambiente e são uma fonte rica e ainda inexplorada de matéria-prima (compostos com
princípios ativos) para a indústria farmacêutica2,3.
Neste trabalho foi analisada a planta Mikania laevigata Schultz Bip. ex Baker, que é
popularmente conhecida como guaco e amplamente empregada na medicina popular na
América do Sul para tratar uma variedade de doenças4,5. Estudos fitoquímicos e
farmacológicos têm atribuído às suas folhas propriedades broncodilatadoras6,7,
antimicrobianas8, antiulcerogênicas5 e anti-inflamatórias9-11. Recentemente verificou-se
que o extrato etanólico desta planta apresenta significativa ação contra os efeitos tóxicos
do veneno da cobra Philodryas olfersii12. A cumarina é a principal substância química de
ação farmacológica encontrada nesta planta e é utilizada como um marcador químico em
formulações farmacêuticas13,14. Além dela, outros metabólitos secundários derivados do
ácido cinâmico e de diterpenos caurânicos15-17 têm demonstrado sinergismo para produzir
os efeitos farmacológicos esperados do guaco.
No estudo de plantas medicinais é bem conhecido que a origem geográfica, idade,
aspectos agronômicos e ambientais, tal como a sazonalidade, e também a técnica de
extração e o solvente extrator utilizados, são fatores que influenciam no número e na
concentração de certos metabólitos e, portanto, devem ser considerados a fim de se obter
uma determinada substância desejada18,19.
Várias técnicas de extração têm sido investigadas para obter os compostos
bioativos dos materiais vegetais, e dentre elas, a extração com o uso do ultra-som tem
sido largamente empregada nos laboratórios de pesquisas por ser simples, rápida e
compatível com todos os solventes20-22. A princípio, as ondas de ultra-som facilitam a
hidratação e dilatação dos poros das paredes das células vegetais, capaz de levá-las a
ruptura e com isso, a liberação do seu conteúdo23.
Embora a escolha do método de extração tenha um efeito considerável na
qualidade dos extratos, a composição do solvente extrator utilizada é que determina o
rendimento24 e o número dos metabólitos que podem ser detectados nas análises
metabolômicas25,26. De fato, para obter uma extração completa e em maior concentração
4
de uma substância desejada, o solvente ideal deve apresentar o máximo de seletividade,
compatibilidade com as propriedades do material a ser extraído e a máxima capacidade
de extração em termos do coeficiente de saturação da substância no meio extrator27.
Na literatura, muitos solventes orgânicos puros ou ainda com uma pequena
proporção de água são utilizados no processo da extração. Entretanto, para o estudo
sistemático do efeito do solvente em produtos naturais, é importante considerar as
interações solvente-solvente em competição com a solvatação das moléculas do soluto. O
uso de planejamentos estatísticos de misturas28,29 são ferramentas úteis que podem ser
utilizadas neste estudo, pois, são ideais não somente para comparar os efeitos dos
solventes puros, mas também para determinar os efeitos sinérgicos e/ou antagônicos
entre os solventes que podem ser relevantes para a otimização do processo da extração.
Os experimentos são executados usando uma mistura de solventes previamente
escolhidos através de critérios estatísticos para minimizar o erro da modelagem, bem
como para determinar o número de experimentos que deverão ser executados30.
Tão importante quanto o processo da extração é o processo de identificação e
separação dos compostos químicos extraídos. Atualmente, a cromatografia líquida de alta
eficiência (CLAE) é a técnica analítica mais utilizada para essa finalidade, por ser
facilmente adaptada à quantificação individual dos componentes, com base em seus
metabólitos secundários, além de gerar a impressão digital cromatográfica para definir os
perfis químicos das amostras e determinar a sua composição qualitativamente31,32. Na
análise da impressão digital o perfil cromatográfico inteiro é utilizado33,34 e a otimização do
processo de separação vai depender do tipo da coluna e da composição da fase móvel
empregada.
Na cromatografia líquida de alta eficiência a fase móvel desempenha um papel
muito importante e sua composição quase sempre é fundamental no processo de
separação35,36, pois, além de arrastar os componentes da amostra através do sistema
cromatográfico também participa do processo de separação. Sua importância é
comprovada através da análise da equação geral de resolução, Rs, na qual dois dos três
parâmetros cromatográficos envolvidos, k e α, são fortemente influenciados pela fase
móvel35,
1
4 1S
N kR
k
(1)
5
onde, N corresponde ao número de pratos ou eficiência, k o fator de retenção e α o fator
de separação.
De um modo geral, três critérios devem ser considerados na seleção de solventes
para serem empregados como fase móvel: características físico-químicas, força
cromatográfica e seletividade, sendo que a força cromatográfica está relacionada à
retenção dos compostos e a seletividade está relacionada à separação entre eles.
A força cromatográfica ou polaridade mede a capacidade da fase móvel em
interagir com os componentes da amostra. Essa interação pode ser por meio de forças de
Van der Waals (dispersivas ou de London e as de dipolo-dipolo), além de ligações de
hidrogênio ou forças dielétricas. A polaridade do solvente pode ser determinada utilizando
o parâmetro de solventes de Snyder (P’), denominado fator força-peso do solvente (S)37, e
sendo a fase móvel uma mistura de um ou mais modificadores orgânicos e água, sua
polaridade é determinada pelo somatório dos fatores força-peso de cada um dos
solventes utilizados, ponderadas pelas suas respectivas proporções em volume:
S = Si i (2)
onde, S corresponde ao fator força-peso da fase móvel, Si representa o somatório do
produto do fator força-peso do solvente puro, e i a proporção em volume do solvente.
A retenção de um componente é controlada pela força cromatográfica do solvente.
Portanto, solventes fortes que possuem polaridade semelhante com a fase estacionária,
diminuem a retenção das substâncias analisadas, enquanto que com solventes fracos
ocorre o contrário. A força cromatográfica ideal (aquela que fornece 0,5< k <10) para uma
separação é geralmente selecionada empiricamente, iniciando a separação da amostra
com uma fase móvel de força elevada para que todos os compostos eluam com tempo de
retenção semelhante ao de um composto não retido. Em seguida, a força cromatográfica
é diminuída sucessivamente até conseguir uma boa separação35.
Dentro deste contexto, este trabalho teve como objetivo realizar um planejamento
experimental de misturas do tipo Centróide-Simplex com quatro componentes, para
estudar os efeitos sazonal e da composição do solvente extrator na análise dos
metabólitos secundários nas folhas da Mikania laevigata, bem como interpretar os dados
6
gravimétricos e cromatográficos obtidos com a aplicação de métodos quimiométricos de
análise de dados.
Os objetivos específicos são:
Realizar um planejamento estatístico de misturas do tipo Centróide-Simplex
com quatro componentes, para estudar os efeitos sazonal e do solvente no
rendimento e na composição química dos extratos e frações da planta
Mikania laevigata.
Avaliar os efeitos do comprimento de onda, bem como, da influência da força
da fase móvel na qualidade da impressão digital cromatográfica dos extratos
brutos e das frações orgânicas, básicas e polares.
Otimizar a composição do solvente extrator para a extração da cumarina e
outros metabólitos secundários no guaco.
Interpretar os resultados com a aplicação de métodos multivariados e
univariados de análise de dados.
7
2. Métodos Quimiométricos
8
9
2.1 Modelos Estatísticos
A metodologia de superfície de respostas é uma efetiva técnica estatística, que têm
sido empregada para modelar e otimizar processos envolvendo material vegetal38-41. Os
dados gravimétricos e cromatográficos obtidos nos experimentos com o planejamento
estatístico de misturas podem ser ajustados na equação polinomial:
ˆ i ii j i j jk i j k
i i j i j k
y b x bi x x b x x x
(3)
O primeiro termo desta equação representa a resposta esperada para o
componente puro i da mistura. O segundo e o terceiro termos descrevem as interações
binárias e ternárias entre os solventes, ou seja, as interações entre os componentes i-j e i-
j-k, respectivamente. Em outras palavras, esta equação contém um termo linear para cada
um dos quatro solventes puros empregados no planejamento de misturas. Se não existe
nenhuma interação solvente-solvente significativa, um modelo linear é adequado para
representar os dados e os coeficientes desses termos indicam a capacidade da extração
de cada solvente individual. Se um modelo quadrático é mais adequado, os coeficientes
de segunda ordem fornecem informações sobre as interações binárias solvente-solvente
mais significativas. O último termo desta equação é cúbico e os seus coeficientes
representam interações ternárias significativas entre os solventes.
2.2 Análise de Componentes Principais (ACP)
A ACP consiste essencialmente em transformar as coordenadas das amostras em
outro sistema de eixos mais conveniente para a análise de dados. Em outras palavras,
reduz o número de variáveis originais a poucas variáveis latentes, chamadas
componentes principais (CP), sem perder a informação dos dados originais. A primeira CP
é escolhida na direção de maior variância dos dados. A segunda CP é definida de tal
maneira que seja ortogonal a primeira e representa a variância máxima que não foi
explicada pela primeira CP, ou seja, as componentes principais são obtidas em ordem
decrescente de máxima variância42.
10
Matematicamente, cada CP pode ser descrita como uma combinação linear das
variáveis originais sendo que a importância de cada uma dessas variáveis é dada pelos
loadings. Esta combinação linear fornece ainda para cada objeto valores chamados de
escores.
A ACP pode ser definida tanto no espaço das amostras como das variáveis e a
decomposição é calculada através da diagonalização da matriz de associação (AAt) ou da
matriz de covariância (AtA), respectivamente43. A matriz A (n x p), formada por n objetos e
p variáveis é decomposta no produto de duas matrizes menores:
A (n x p) = T(n x q) x Pt (q x p) + E(n x p) (4)
onde P é a matriz dos loadings (pesos) das componentes principais, T é a matriz dos
escores das componentes principais, e E é a matriz dos resíduos. O sobrescrito t indica a
transposta da matriz e q é um escalar que indica o número de componentes principais que
descreve a maior parte da variância dos dados.
Após os cálculos, dois tipos de gráficos são obtidos, o gráfico dos escores, que
fornece informações sobre os objetos, neste caso as amostras do planejamento, e o
gráfico dos loadings que representa a importância e a correlação entre as variáveis.
2.3 Análise Hierárquica de Agrupamentos44 (AHA)
A AHA descreve a estrutura dos dados interligando as amostras por suas
associações, revelando os agrupamentos naturais existentes no conjunto de dados. A
classificação é feita com base nas informações das variáveis medidas, de forma que um
pequeno grupo, formado na separação do conjunto de dados, possa ser inteiramente
incluído num grupo maior, formado na separação consecutiva. Graficamente, a hierarquia
pode ser representada na forma de um gráfico bidimensional chamado de dendrograma,
onde as amostras semelhantes, segundo as variáveis escolhidas são agrupadas entre si.
Após o cálculo das distâncias entre todos os pares de amostras, as duas amostras
mais similares são agrupadas. Uma vez que um grupo é ligado ao outro grupo, eles
formarão um novo grupo. Após essa verificação, a distância deste novo grupo com
relação a todos os outros grupos é determinada e novamente, a menor distância entre os
11
grupos é analisada e outra ligação é formada. Esse processo continua até que todas as
amostras e grupos estejam ligados.
Neste trabalho, o método de Ward foi aplicado e a descrição dessas operações é
bem descrita na literatura e não serão tratados aqui45.
12
13
3. Descrição
Experimental
14
15
A Figura 1 mostra o procedimento experimental empregado neste trabalho.
Figura 1: Procedimento experimental empregado no trabalho.
3.1 Material Vegetal
Para este estudo foram utilizadas as folhas da Mikania laevigata Schultz Bip. ex
Baker. Uma exsicata desta planta está depositada no herbário da Universidade Estadual
de Londrina, PR, Brasil e registrada sob o número FUEL 44355, Figura 2.
16
Figura 2: Foto da exsicata e da planta Mikania laevigata.
As coletas das folhas foram realizadas no ano de 2010, sempre no período da
manhã, no jardim do Departamento de Química da Universidade Estadual de Londrina
(UEL), nos meses de janeiro, abril, julho e outubro, referentes às estações verão, outono,
inverno e primavera, respectivamente. A coleta procedeu de forma representativa do
aspecto geral da planta, selecionando as folhas de forma a evitar amostras com danos
causados por fungos, insetos ou danos mecânicos. A secagem foi realizada à sombra por
doze dias, à temperatura ambiente, protegida de umidade, ataque de fungos, insetos e
roedores. Em seguida, as folhas secas foram trituradas em um liquidificador com a
finalidade de reduzir o material vegetal a fragmentos de pequenas dimensões,
preparando-o assim para a próxima etapa, a extração.
3.2 Extração e Fracionamento Químico
Os extratos brutos foram preparados utilizando misturas de quatro solventes,
acetona, clorofórmio, diclorometano e etanol, cujas proporções foram variadas seguindo o
planejamento de misturas do tipo Centróide-Simplex apresentado na Figura 3.
Os quatro pontos nos vértices do tetraedro correspondem às extrações utilizando
apenas os solventes puros. Os seis pontos nas arestas correspondem às misturas
binárias na proporção 1:1 (v/v) entre estes solventes. As misturas ternárias também foram
investigadas e são representadas na figura pelos pontos nos centros dos triângulos que
17
formam o tetraedro. Por fim, o ponto central do tetraedro representa uma mistura entre os
quatro solventes em iguais proporções.
Figura 3: Planejamento experimental de misturas do tipo Centróide-Simplex com 4
componentes; utilizado para a preparação dos extratos.
Para cada estação do ano foram preparados 19 extratos brutos com quintuplicatas
no ponto central, para estimar o erro experimental. Ao todo, 15 extratos com composições
diferentes de misturas foram aleatoriamente preparados e as proporções de cada solvente
utilizado nas misturas extratoras estão especificadas na Tabela 1.
Tabela 1: Planejamento de misturas para a preparação dos extratos.
Extrato Solventes
Etanol Acetona Diclorometano Clorofórmio
e 1 0 0 0 a 0 1 0 0 d 0 0 1 0 c 0 0 0 1 ae 1/2 1/2 0 0 de 1/2 0 1/2 0 ce 1/2 0 0 1/2 ad 0 1/2 1/2 0 ac 0 1/2 0 1/2 cd 0 0 1/2 1/2
ade 1/3 1/3 1/3 0 cde 1/3 0 1/3 1/3 ace 1/3 1/3 0 1/3 acd 0 1/3 1/3 1/3 r1 1/4 1/4 1/4 1/4 r2 1/4 1/4 1/4 1/4 r3 1/4 1/4 1/4 1/4 r4 1/4 1/4 1/4 1/4 r5 1/4 1/4 1/4 1/4
e = etanol; a = acetona; d = diclorometano; c = clorofórmio
18
Cada extrato bruto foi preparado adicionando-se 60 mL do solvente extrator em 12
g de folhas secas e moídas da planta. Estas misturas ficaram por 30 minutos em banho
ultra-som, sendo que a troca da água do banho se deu a cada 10 minutos para manter a
temperatura constante. Em seguida, os extratos foram filtrados em papel de filtro comum
e as folhas submetidas à remaceração por mais oito vezes consecutivas.
Os extratos brutos obtidos foram concentrados em um evaporador rotativo a uma
temperatura de 60 ºC (± 3 ºC) e mantidos sob ventilação forçada durante 15 dias para a
evaporação dos solventes. Após atingir peso constante, os extratos foram fracionados por
extração líquido-líquido conforme o esquema46 apresentado na Figura 4.
Figura 4: Procedimento experimental para o fracionamento químico dos extratos brutos
da Mikania laevigata resultando nas diferentes classes de metabólitos secundários.
19
O fracionamento químico foi realizado re-dissolvendo os extratos brutos em
aproximadamente 10 mL dos respectivos solventes extratores (Tabela 1). A mistura
resultante foi homogeneizada por 10 min com 24 mL de metanol e 6 mL de água (4:1 v/v)
em banho ultra-som, e a solução resultante foi filtrada em papel de filtro comum
previamente pesado. O resíduo foi lavado com 15 mL (em triplicatas) de acetato de etila e
a solução obtida resultou na fração neutra, composta por gorduras e graxas.
O filtrado foi transferido para um funil de separação e acidificado com algumas
gotas de ácido sulfúrico concentrado. Após, foram adicionados 15 mL (em triplicatas) de
clorofórmio, resultando no aparecimento de duas fases, uma mais densa (fase orgânica) e
outra menos densa (fase aquosa/metanólica). A fase orgânica foi transferida para um
balão de fundo redondo e submetida à concentração em um evaporador rotativo a uma
temperatura de 50 ºC 3 ºC, resultando em uma fração de polaridade intermediária que
apresenta maiores quantidades de terpenóides e compostos fenólicos. A fase aquosa foi
basificada com hidróxido de amônio até atingir pH 10 e submetida a extração com 15 mL
(em duplicatas) de uma mistura de clorofórmio e metanol na proporção 3:1 (v/v). Isso
novamente resultou no aparecimento de duas fases imiscíveis. A fase orgânica foi
separada da fase menos densa, a aquosa, e novamente a fase orgânica foi submetida a
mais uma extração com 15 mL de clorofórmio. Em seguida, em um balão de fundo
redondo reuniu-se a fase orgânica e esta foi submetida à concentração em um
evaporador rotativo a uma temperatura de 50 ºC 3 ºC, resultando em uma fração básica
rica em alcalóides. A fase aquosa que permaneceu no funil de separação também foi
concentrada em um evaporador rotativo mantendo-se as mesmas condições. Esta fase
resultou em uma fração polar cujos principais compostos presentes são alcalóides
quaternários e n-óxidos.
O fracionamento químico resultou em fibras e mais quatro diferentes frações;
fração neutra (gorduras e graxas), fração orgânica (terpenóides e compostos fenólicos),
fração básica (alcalóides) e fração polar (alcalóides quaternários e n-óxidos).
Após atingir peso constante foram obtidos os resultados gravimétricos destas
frações.
20
3.3 Análises Cromatográficas
Os extratos brutos e as quatro frações obtidas nas quatro estações foram
submetidas às análises por cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por
arranjo de diodos (CLAE-DAD) e cromatografia líquida de ultra-eficiência acoplada à
espectrometria de massas sequencial (CLUE-EM/EM).
Para as análises cromatográficas, 10 mg de cada extrato foi redissolvido em 200
µL de metanol e 20 µL desta solução foi diluída com 980 µL (1:50 v/v) da fase móvel
empregada nas análises. As amostras diluídas foram filtradas em filtro Millipore Millex com
0,22 m de tamanho de poro e colocadas em frascos do tipo eppendorf. As análises
foram conduzidas em um cromatógrafo líquido de alta eficiência Thermo Model LC Pump
Plus, acoplado a um detector por arranjo de diodos, Finnigan Surveyor PDA Plus. As
condições cromatográficas estabelecidas foram: fase móvel constituída por
metanol:acetonitrila:água (17,5:17,5:65 v/v/v), coluna Gemini C18 ODS PN0380
Phenomenex (250 mm x 4,6 mm), com tamanho de partícula de 5 m, temperatura de 23
ºC, volume de injeção de 20 L, eluição isocrática a 1 mL min-1 e monitorada por 25
minutos em três comprimentos de onda; 210, 240 e 272 nm.
Para confirmar e identificar os metabólitos secundários previamente detectados por
CLAE-DAD foi utilizado um cromatógrafo líquido de ultra eficiência, modelo Waters
ACQUITY UPLCTM (Waters, Milford, MA, USA), acoplado a um espectrômetro de massas
do tipo triplo-quadrupolo (Milford, MA, EUA), equipado com um sistema de bombas
binárias. As condições cromatográficas estabelecidas foram: coluna BEH Acquity UPLC
(C18) (50 mm x 2,1 mm), com tamanho de partícula de 1,7 m, temperatura de 25 ºC,
volume de injeção de 5 L e eluição isocrática a 3 L min-1 com metanol:água (7:3 v/v)
como fase móvel durante 4 min. As análises de EM foram adquiridas nos modos positivo e
negativo de ionização devido à natureza ácida e básica dos metabólitos secundários
presentes na planta Mikania. Os dados foram obtidos no modo SCAN usando uma faixa
de m/z de 120 à 220. As condições de ionização da fonte foram: voltagem no capilar: 3
kV; temperatura da fonte: 150 °C, fluxo de gás no cone: (80 L h-1), fluxo de gás de
dessolvatação: (800 L h-1); temperatura de dessolvatação: 350 °C. Gás Nitrogênio (pureza
> 99 %) foi utilizado como gás de nebulização.
21
3.4 Reagentes e Programas Computacionais
Todos os reagentes utilizados na preparação dos extratos foram de grau analítico e
comprados da VETEC. Metanol e acetonitrila, ambos de grau cromatográfico, foram
comprados da VETEC Tedia e J.T. Baker, respectivamente. Para a preparação da fase
móvel foi utilizado um sistema de purificação Millipore Milli-Q Gradiente.
Os dados obtidos nas análises por espectrometria de massas foram processados
no software MassLynx v4.1.
Para o tratamento dos dados foram utilizados os programas computacionais
STATISTICA® 6.047 e Matlab® 6.548.
22
23
4. Resultados
24
25
4.1 Resultados Gravimétricos
Na primeira etapa deste trabalho, métodos univariados e multivariados foram
empregados para estudar os efeitos sazonal e da composição do solvente extrator, bem
como as suas interações nos rendimentos dos extratos brutos, fibras e frações neutra,
orgânica, básica e polar. A composição do solvente extrator em cada ponto do
planejamento estatístico de misturas, mais os resultados gravimétricos em gramas, a
média e o desvio padrão em cada estação são apresentados na Tabela 2. Os valores dos
resíduos foram obtidos através do cálculo da diferença da massa do extrato bruto com a
soma de todas as massas das outras frações. No outono, os dados para a fração polar
não são apresentados, porque, devido a um problema na câmara fria da universidade, as
amostras que continham água em sua composição fungaram e foram descartadas.
26
Tabela 2: Composição do solvente extrator em volume (mL), rendimentos (g), média e desvio padrão dos extratos brutos,
frações neutra; orgânica; básica e polar, fibras e resíduos obtidos das folhas da Mikania na primavera, verão, outono e
inverno. e = etanol; a = acetona; d = diclorometano; c = clorofórmio
Extrato
Solventes
Rendimentos (g)
Bruto Neutra Orgânica Básica
e a d c Prim. Verão Outono Inverno Prim. Verão Outono Inverno Prim. Verão Outono Inverno Prim. Verão Outono Inverno
e 60 0 0 0 0,9728 1,8933 1,4541 1,4384 0,5750 0,1847 0,9597 0,7556 0,1797 0,6978 0,2141 0,2845 0,0178 0,0272 0,0142 0,0287
a 0 60 0 0 0,7846 0,8393 0,6547 0,5557 0,4763 0,2233 0,1154 0,2490 0,1796 0,3423 0,3605 0,0704 0,0037 0,0142 0,0045 0,0063
d 0 0 60 0 0,8619 1,0092 0,8127 0,8353 0,5944 0,2420 0,3769 0,4801 0,2339 0,3454 0,3797 0,2357 0,0069 0,0137 0,0020 0,0020
c 0 0 0 60 0,8991 1,0175 0,8842 0,8300 0,4450 0,2812 0,2467 0,2786 0,3334 0,315 0,5690 0,3617 0,0116 0,0123 0,0040 0,0256
ae 30 30 0 0 0,9254 1,4769 0,8503 1,3813 0,6059 0,2246 0,4203 0,7013 0,1590 0,7888 0,1919 0,1139 0,0106 0,0206 0,0123 0,0170
de 30 0 30 0 1,1012 1,4794 1,0556 1,3211 0,6520 0,3086 0,7066 0,6063 0,2312 0,9415 0,1303 0,4505 0,0102 0,0233 0,0080 0,0243
ce 30 0 0 30 1,1556 1,8499 1,0055 1,2352 0,7601 0,2796 0,4786 0,5627 0,2350 0,7241 0,2878 0,4592 0,0345 0,0183 0,0134 0,0292
ad 0 30 30 0 0,8851 1,0450 0,9065 1,0686 0,5820 0,3785 0,1099 0,5960 0,2545 0,2843 0,5846 0,2597 0,0031 0,0076 0,0071 0,0132
ac 0 30 0 30 0,9462 1,0118 0,9086 0,8746 0,6575 0,4475 0,4006 0,4653 0,1662 0,1921 0,4422 0,2574 0,0061 0,0201 0,0091 0,0093
cd 0 0 30 30 0,9253 1,0304 0,9083 0,8376 0,5369 0,2759 0,8013 0,5948 0,3329 0,2691 0,1527 0,1651 0,0025 0,0045 0,0053 0,0023
ade 20 20 20 0 1,0042 1,4154 1,1578 1,4215 0,6473 0,2953 0,4130 0,5657 0,2096 0,3602 0,5371 0,3824 0,0176 0,0197 0,0150 0,0215
cde 20 0 20 20 1,1825 1,6944 1,0602 1,5063 0,6115 0,3605 0,5836 0,6189 0,3859 0,632 0,3092 0,3612 0,0149 0,0089 0,0078 0,0241
ace 20 20 0 20 1,1000 1,2088 0,6602 1,2314 0,7705 0,3454 0,3417 0,6124 0,1847 0,3864 0,2450 0,2922 0,0096 0,0145 0,0080 0,0169
acd 0 20 20 20 0,9222 1,0344 0,8517 0,8595 0,3874 0,3627 0,4995 0,4958 0,2588 0,2754 0,2160 0,1722 0,0029 0,0075 0,0036 0,0043
r1 15 15 15 15 1,0382 1,4374 0,9241 1,1360 0,6844 0,3380 0,6844 0,6907 0,2560 0,4918 0,2910 0,2269 0,0088 0,0147 0,0061 0,0144
r2 15 15 15 15 1,0717 1,4999 0,9614 1,2293 0,6344 0,3611 0,6017 0,7344 0,2404 0,5674 0,2283 0,2552 0,0096 0,0190 0,0082 0,0181
r3 15 15 15 15 1,1313 1,4408 0,8975 1,1985 0,6872 0,3306 0,5896 0,7229 0,2328 0,6049 0,3246 0,2656 0,0076 0,0252 0,0056 0,0241
r4 15 15 15 15 1,2578 1,2435 0,9933 1,0041 0,6030 0,3665 0,6093 0,7626 0,2967 0,4187 0,2183 0,2323 0,0082 0,0137 0,0033 0,0131
r5 15 15 15 15 1,0743 1,4999 0,9820 1,1791 0,6070 0,3772 0,3576 0,5861 0,3001 0,6204 0,3175 0,3630 0,0051 0,0254 0,0077 0,0175
Média 1,0126 1,3225 0,9436 1,1128 0,6062 0,3149 0,4893 0,5831 0,2458 0,4872 0,3158 0,2742 0,0101 0,0163 0,0076 0,0164
Desvio padrão 0,1248 0,3051 0,1746 0,2587 0,0966 0,0665 0,2189 0,1434 0,0619 0,2081 0,1349 0,1045 0,0074 0,0066 0,0038 0,0086
Desvio padrão das replicatas 0.0867 0.1055 0.0401 0.0880 0.0407 0.0197 0.1236 0.0683 0.0315 0.0844 0.0498 0.0551 0.0017 0.0056 0.0019 0.0043
27
Continuação da Tabela 2
Prim. = Primavera;
A última linha da tabela mostra os desvios padrão dos experimentos realizados em
quintuplicatas (r1-r5) e fornece as estimativas das incertezas experimentais nos resultados.
Comparação entre as médias indica que o efeito sazonal é evidente para o extrato bruto
porque decresceu de 1,32 ± 0,31 g no verão para 0,94 ± 0,17 g no outono. Para a fração
orgânica, o rendimento no verão foi aproximadamente duas vezes maior que na
primavera, 0,49 ± 0,21 g e 0,25 ± 0,06 g, respectivamente. Entretanto, os rendimentos da
fração neutra na primavera, 0,61 ± 0,10 g, e no inverno, 0,58 ± 0,14 g, foram
aproximadamente duas vezes maiores do que o obtido no verão, 0,31 ± 0,07 g. Isto pode
ser visto mais claramente examinando a Figura 5, onde as médias dos rendimentos
Extrato
Solventes
Rendimentos (g)
Polar Fibras Residuos
e a d c Prim. Verão Outono Inverno Prim. Verão Outono Inverno Prim. Verão Outono Inverno
e 60 0 0 0 0,1982 0,5389 - 0,4006 0,0291 0,0585 0,0214 0,0346 -0,0270 0,3862 0,2447 -0,0656
a 0 60 0 0 0,1174 0,1750 - 0,1855 0,0268 0,0232 0,0181 0,0192 -0,0192 0,0613 0,1562 0,0253
d 0 0 60 0 0,0853 0,1643 - 0,0875 0,0477 0,0447 0,0272 0,0201 -0,1063 0,1991 0,0269 0,0099
c 0 0 0 60 0,0509 0,1404 - 0,0745 0,0733 0,0547 0,0596 0,0272 -0,0151 0,2139 0,0049 0,0624
ae 30 30 0 0 0,0819 0,3388 - 0,2863 0,0345 0,0822 0,0251 0,0354 0,0335 0,0219 0,2007 0,2274
de 30 0 30 0 0,1545 0,4312 - 0,2058 0,0567 0,0607 0,0448 0,0146 -0,0034 -0,2859 0,1659 0,0196
ce 30 0 0 30 0,1088 0,3907 - 0,3183 0,0655 0,0864 0,0354 0,0662 -0,0483 0,3508 0,1903 -0,2004
ad 0 30 30 0 0,1636 0,2049 - 0,1174 0,0428 0,0551 0,0358 0,0466 -0,1609 0,1146 0,1691 0,0357
ac 0 30 0 30 0,1116 0,2413 - 0,1047 0,0623 0,0317 0,0336 0,0464 -0,0575 0,0791 0,0231 -0,0085
cd 0 0 30 30 0,1024 0,1973 - 0,4366 0,0506 0,0585 0,0581 0,0666 -0,1000 0,2251 -0,1091 -0,4278
ade 20 20 20 0 0,1570 0,3068 - 0,2774 0,0480 0,0489 0,0594 0,0537 -0,0753 0,3845 0,1333 0,1208
cde 20 0 20 20 0,0944 0,2342 - 0,2004 0,0577 0,0735 0,0455 0,0336 0,0181 0,3853 0,1141 0,2681
ace 20 20 0 20 0,1298 0,2316 - 0,2218 0,0779 0,0469 0,0198 0,0513 -0,0725 0,1840 0,0457 0,0368
acd 0 20 20 20 0,0817 0,2003 - 0,1651 0,0333 0,0560 0,0242 0,0379 0,1581 0,1325 0,1084 -0,0158
r1 15 15 15 15 0,1232 0,2460 - 0,1697 0,0689 0,0455 0,0429 0,0466 -0,1031 0,3014 -0,1003 -0,0123
r2 15 15 15 15 0,1319 0,3763 - 0,1910 0,0622 0,0562 0,0311 0,0451 -0,0068 0,1199 0,05 -0,0145
r3 15 15 15 15 0,1440 0,2310 - 0,1905 0,0516 0,0520 0,0397 0,0462 0,0081 0,1971 -0,062 -0,0508
r4 15 15 15 15 0,1268 0,2535 - 0,1118 0,0608 0,0489 0,0335 0,0504 0,1623 0,1422 0,1289 -0,1661
r5 15 15 15 15 0,1308 0,3337 - 0,1781 0,0618 0,0517 0,0387 0,0487 -0,0305 0,0915 0,2605 -0,0143
Média 0,1207 0,2756 - 0,2065 0,0532 0,0545 0,0365 0,0416 -0,0235 0,1739 0,0922 -0,0089
Desvio padrão 0,0346 0,1030 - 0,0996 0,0148 0,0149 0,0129 0,0145 0,0813 0,1597 0,1091 0,1496
Desvio padrão das replicatas 0.0079 0.0634 - 0.0328 0.0062 0.0040 0.0048 0.0021 0.0973 0.0828 0.1462 0.0660
28
obtidas em cada estação são apresentadas no gráfico de barras de incertezas para o
nível de 95 % de confiança.
0.8
0.9
1.0
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
Ren
dim
en
to (
g/1
2g
)
Bruto
Primavera
Verão
Outono
Inverno
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
Ren
dim
en
to (
g/1
2g
)
Primavera
Verão
Inverno
Outono
Neutra
(a) (b)
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
Ren
dim
en
to (
g/1
2g
)
Orgânica
Primavera InvernoOutono
Verão
0.004
0.008
0.012
0.016
0.020R
en
dim
en
to (
g/1
2g
)Básica
Primavera
VerãoInverno
Outono
(c) (d)
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
Ren
dim
en
to (
g/1
2g
)
Primavera
Inverno
Verão
Polar
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
Ren
dim
en
to (
g/1
2g
)
Fibras
Primavera
Inverno
Outono
Verão
(e) (f) Figura 5: Gráfico de barras de incertezas nas médias para comparar as médias dos
rendimentos do extrato bruto (a), frações neutra (b); orgânica (c); básica (d); polar (e) e
fibras (f) nas quatro estações.
29
De maneira geral, observa-se que no verão as quantidades extraídas do extrato
bruto e frações foram significativamente maiores do que nas demais estações, exceto
para a fração neutra, que foi menor. Os maiores rendimentos para as frações básica e
polar, Figuras 5d e 5e, respectivamente, foram obtidos no verão e no inverno e para as
fibras (Figura 5f), nas estações verão e primavera.
A análise de variância de dois fatores (ANOVA), apresentada na Tabela 3,
comprova estes resultados e mostra que os rendimentos do extrato bruto e de todas as
frações dependem da época de colheita da planta, porque os valores das razões média
quadrática da estação/média quadrática do erro são maiores do que os valores críticos da
distribuição F com os mesmos números de graus de liberdade no nível de 95 % de
confiança.
Tabela 3: Análise de variância de dois fatores (ANOVA) para os rendimentos do extrato
bruto, fibras e frações neutra, orgânica, básica e polar.
Fonte de variação Soma
quadrática Graus de liberdade
Média
quadrática F calculado
a
Bruto
Estação 1,18895 3 0,39632 56,59
Solvente 2,55570 14 0,18255 26,06
Estação - Solvente 1,04065 42 0,02478 3,54
Erro 0,11206 16 0,00700
Total 4,89736 75
Neutra
Estação 0,78823 3 0,26274 47,776
Solvente 0,61352 14 0,04382 7,969
Estação - Solvente 0,77890 42 0,01855 3,372
Erro 0,08799 16 0,00550
Total 2,2686 75
Orgânica
Estação 0,497497 3 0,165832 48,692
Solvente 0,291678 14 0,020834 6,117
Estação - Solvente 1,026454 42 0,024439 7,176
Erro 0,054492 16 0,003406
Total 1,8701 75
30
Básica
Estação 0,000719 3 0,000240 17,1461
Solvente 0,002055 14 0,000147 10,4925
Estação - Solvente 0,001092 42 0,000026 1,8591
Erro 0,000224 16 0,000014
Total 0,00409 75
Polar
Estação 0,198598 2 0,099299 7,6333
Solvente 0,242849 14 0,017346 1,3334
Estação - Solvente 0,143371 28 0,005120 0,3936
Erro 0,156104 12 0,013009
Total 0,740922 56
Fibras
Estação 0,003871 3 0,001290 63,345
Solvente 0,006176 14 0,000441 21,658
Estação - Solvente 0,008231 42 0,000196 9,622
Erro 0,000326 16 0,000020
Total 0,018604 75
a Valores críticos de F correspondentes no nível de 95 % de confiança para a razão
média quadrática da estação/média quadrática do erro são: F3,16 = 3,24; F2,12 = 3,89.
Para as razões media quadrática do solvente/média quadrática do erro são: F14,16 =
2,35; F14,12 = 2,62 e interação (estação – solvente)/média quadrática do erro são: F42,16
= 2,15; F28,12 = 2,47. Valores em vermelho são significativos.
Os modelos indicaram que a composição do solvente extrator é estatisticamente
significativo para o extrato bruto e todas as frações, exceto a fração polar. Isto indica que
a escolha do solvente é importante e que os rendimentos do extrato bruto, fibras e frações
neutra, orgânica e básica podem ser maximizados ou minimizados de acordo com a
composição do solvente extrator empregado.
A Figura 6 mostra os perfis dos rendimentos dos extratos brutos, fibras e frações
obtidos em cada estação e em cada ponto do planejamento estatístico de misturas. Os
maiores rendimentos do extrato bruto são obtidos no verão para os extratos preparados
com o solvente puro etanol, a mistura binária clorofórmio-etanol e a mistura ternária
clorofórmio-diclorometano-etanol. Nas quatro estações, os menores rendimentos ocorrem
31
com o solvente puro acetona na seguinte ordem: verão 0,8396 g > primavera 0,7846 g >
outono 0,6547 g > inverno 0,5557 g.
e a d c
ae
de
ce
ad
ac
cd
ade
cd
e
ace
acd r
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
Rendim
ento
Bru
to (
g/1
2g)
e a d c
ae
de
ce
ad
ac
cd
ade
cd
e
ace
acd r0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Rendim
ento
Neutr
a (
g/1
2g)
(a) (b)
e a d c
ae
de
ce
ad
ac
cd
ade
cd
e
ace
acd r0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Rendim
ento
Org
ânic
a (
g/1
2g)
e a d c
ae
de
ce
ad
ac
cd
ade
cd
e
ace
acd r0.00
0.01
0.02
0.03
0.04R
endim
ento
Básic
a (
g/1
2g)
(c) (d)
e a d c
ae
de
ce
ad
ac
cd
ade
cde
ace
acd r0.00
0.15
0.30
0.45
0.60
Rendim
ento
Pola
r (g
/12g)
e a d c
ae
de
ce
ad
ac
cd
ade
cde
ace
acd r
0.015
0.030
0.045
0.060
0.075
0.090
Rendim
ento
Fib
ras (
g/1
2g)
(e) (f)
Figura 6: Gráfico dos perfis dos rendimentos dos extratos brutos (a) e das frações neutras
(b), orgânicas (c), básicas (d), polar (e) e fibras (f) em cada ponto do planejamento
estatístico de misturas nas quatro estações, onde: ■ Primavera; ♦ Verão; ▲ Outono; ●
Inverno. e = etanol; a = acetona; d = diclorometano; c = clorofórmio
32
Para a fração neutra o maior rendimento foi obtido com o solvente puro etanol nas
estações outono e inverno, enquanto no verão, este mesmo solvente apresentou a menor
eficiência. De fato, no verão quase todos os solventes extraem as menores quantidades
das frações neutras quando comparados às demais estações.
Para a fração orgânica os maiores rendimentos foram obtidos no verão utilizando
as misturas binárias entre o solvente etanol com diclorometano (0,9415 g), acetona
(0,7888 g) e clorofórmio (0,7241 g). Etanol puro extraiu somente 0,6978 g, evidenciando
que as interações solvente–solvente envolvendo o etanol na composição das misturas
extratoras são importantes para maximizar os rendimentos das frações orgânicas.
A ANOVA mostra também que o efeito da interação sazonal-composição do
solvente extrator é altamente significativo para as frações orgânicas e fibras, indicando
que o solvente ou mistura de solventes que é mais eficiente para a maximização do
rendimento em uma estação não será necessariamente o mais eficiente em outra. De
fato, diferentes misturas de solventes resultam na máxima eficiência da extração da
fração orgânica em cada estação (Figura 6c), sendo a mistura ternária clorofórmio-
diclorometano-etanol na primavera, diclorometano-etanol no verão, acetona-
diclorometano no outono e clorofórmio-etanol no inverno. Isto indica que a composição ou
concentração das substâncias químicas presentes nas folhas da Mikania se altera com o
decorrer das estações do ano, resultando em diferentes interações entre a composição do
solvente extrator e o material da planta.
Nas estações primavera e inverno a mistura binária clorofórmio-etanol extraiu a
maior quantidade da fração básica, 0,0345 g e 0,0292 g respectivamente. Analisando a
Figura 6d observa-se que esta mistura também foi eficiente nas demais estações do ano.
A Tabela da ANOVA mostra para esta fração que a interação sazonal-composição do
solvente não é significativa no nível de 95 % de confiança, e justifica o resultado de em
todas as estações obter boa eficiência na extração, empregando a mesma composição
extratora.
Para a fração polar apenas o efeito sazonal é significativo no nível de 95 % de
confiança. Analisando o gráfico da Figura 6e, verifica-se que os perfis dos rendimentos
são semelhantes para as frações preparadas com o solvente puro etanol e as misturas
envolvendo o etanol em sua composição. Além disso, a maior quantidade é extraída no
verão com redução no inverno e posteriormente na primavera, exceto para a fração
33
preparada com a mistura binária clorofórmio-diclorometano que extraiu 0,4366 g no
inverno e apenas 0,1973 g no verão.
Com relação aos resultados gravimétricos obtidos para as fibras, a Tabela da
ANOVA mostra que os efeitos sazonal e da composição extratora, bem como a sua
interação são significativos no nível de 95 % de confiança. O efeito altamente significativo
da interação justifica o fato de diferentes misturas de solventes resultarem na máxima
eficiência da extração em cada estação (Figura 6f), sendo a mistura binária clorofórmio-
etanol no verão, acetona-clorofórmio-etanol na primavera, clorofórmio-diclorometano no
inverno e o solvente puro clorofórmio no outono.
Os dados gravimétricos dos extratos brutos e das frações neutra, orgânica, básica,
polar, fibras e resíduos também foram submetidos à análise de componentes principais
para investigar as correlações entre os rendimentos obtidos em cada estação e as
similaridades existentes entre os diferentes solventes extratores. Os valores dos
rendimentos foram transformados em uma matriz de dimensão 19x27 e os cálculos foram
feitos sem nenhum tipo de pré-processamento. Cada linha representa os resultados para
uma das 15 composições diferentes das misturas mais as quintuplicatas da mistura
quaternária. Cada coluna corresponde a uma das estações para o extrato bruto, fibras,
resíduos e todas as frações.
A Figura 7 mostra o gráfico dos escores (a) e dos loadings (b) para as duas
primeiras componentes principais que juntas explicam 47,44 % da variância total contida
nos dados.
A primeira componente principal contém 33,6 % da variância e permite discriminar
as amostras extraídas com misturas contendo o solvente etanol em sua composição,
localizadas no lado direito da figura e com valores de escores mais positivos, das
amostras que foram extraídas sem o etanol, que apresentam valores de escores
negativos. A dispersão das replicatas próximo ao zero fornece uma medida da variação
nos dados devido ao erro experimental. O gráfico dos loadings mostra a formação de dois
grupos, cujo o localizado no lado direito corresponde aos rendimentos do extrato bruto e
das frações polar e básica nas quatro estações. Estes sofrem maior influência das
misturas extratoras contendo o solvente etanol em sua composição. De fato, quanto mais
próximos os pontos do extrato bruto ou de uma fração específica estiverem um do outro,
mais semelhantes parecem ser os seus perfis de rendimentos obtidos empregando o
34
planejamento estatístico de misturas. Isto pode ser verificado analisando, por exemplo, a
fração básica cujo todos os pontos estão localizados no lado direito no gráfico dos
loadings e apresentam em todas as estações perfis de rendimentos similares, sendo as
maiores quantidades extraídas com as misturas que contém o solvente etanol em sua
composição, Figura 6d. Além disso, a tabela da ANOVA mostra para a fração básica que
o efeito da interação sazonal-composição do solvente não é significativa no nível de 95 %
de confiança, e justifica o resultado de em todas as estações obter boa eficiência na
extração, empregando a mesma composição extratora.
Figura 7: (a) Gráfico dos escores para as duas primeiras componentes principais. (b)
Gráfico dos loadings para a primeira e a segunda componentes principais. (C = Bruto; N =
Neutra; O = Orgânica; B= Básica; P = Polar; F = Fibras; R = Resíduos; e = etanol; a =
acetona; d = diclorometano; c = clorofórmio).
Todos os pontos da fração polar estão localizados no lado direito da Figura e
embora o efeito sazonal seja significativo para a quantidade extraída, sendo o verão a
estação mais eficiente e a primavera a menos, os perfis dos rendimentos são similares,
principalmente no verão e no inverno, Figura 6e. Isto é condizente com a insignificância
do efeito da interação sazonal-composição do solvente extrator na ANOVA, mostrado na
Tabela 3.
O extrato bruto também têm todos os pontos localizados na direita do gráfico dos
loadings, e apresentam os perfis dos rendimentos muito similares no verão e inverno, bem
35
como na primavera e outono, com exceção apenas para o ponto correspondente ao
solvente puro etanol no planejamento, Figura 6a. Por outro lado, as frações neutra,
orgânica e fibras estão localizadas em ambos os grupos e o espalhamento entre seus
pontos são bem maiores do que das replicatas no ponto central.
No verão e no inverno os pontos das frações orgânicas estão localizados no lado
direito da figura e apresentam, respectivamente, um rendimento médio de 0,6028 ± 0,175
g e 0,3072 ± 0,1000 g para as frações obtidas com misturas contendo o solvente etanol
em sua composição e apenas 0,2891 ± 0,0527 g e 0,2175 ± 0,0921 g para aquelas
obtidas com misturas sem o etanol. Entretanto, no outono a fração orgânica está
localizada no lado esquerdo e uma maior eficiência da extração é obtida empregando
misturas sem o solvente etanol, 0,3864 ± 0,1633 g, do que com o etanol, 0,2745 ± 0,1011
g. Na primavera, empregando misturas com ou sem o etanol, o rendimento médio foi
semelhante, 0,2426 ± 0,0622 g e 0,2513 ± 0,0660 g, respectivamente. Nas estações
verão e outono, os perfis dos rendimentos da fração orgânica são muito diferentes
justificando o efeito altamente significativo da interação sazonal-composição do solvente
extrator mostrado na ANOVA. Etanol puro e as misturas binárias de etanol com acetona,
diclorometano e clorofórmio apresentaram a máxima eficiência no verão, enquanto que no
outono estas misturas resultaram nos menores valores obtidos.
No gráfico dos loadings os pontos das frações neutras no outono, inverno e
primavera estão localizados no lado direito e indicam que os maiores rendimentos são
obtidos com os extratores contendo o solvente etanol em sua composição. De fato,
quantidades médias variando entre 0,5622 g - 0,6600 g são extraídas com o etanol e suas
misturas, enquanto que apenas 0,3643 g – 0,5256 g são obtidas com os solventes puros
acetona, diclorometano, clorofórmio e as suas misturas. No verão, empregando misturas
com ou sem o etanol, o rendimento médio foi semelhante, 0,3143 ± 0,0597 g e 0,3159 ±
0,0819 g, respectivamente. Como resultado, o ponto da fração neutra no verão está
localizado no lado esquerdo do gráfico dos loadings.
Para as fibras, os pontos das estações outono, inverno e primavera estão
localizados no lado esquerdo e apenas o ponto do verão está dentro do grupo que contém
o solvente etanol. Como já visto anteriormente, o efeito altamente significativo da
interação sazonal-composição do solvente justifica o fato de diferentes misturas de
solventes resultarem na máxima eficiência da extração em cada estação (Figura 6f).
36
4.2 Efeitos das Interações dos Solventes nas Análises Metabolômicas
Na segunda etapa do trabalho foram analisadas por FR-CLAE-UV/Vis as amostras
dos extratos brutos e frações orgânicas, básicas e polares obtidas nas quatro estações.
Para o desenvolvimento do método verificou-se os efeitos do comprimento de onda
utilizado nas análises cromatográficas, bem como, da influência da força da fase móvel na
qualidade da impressão digital dos metabólitos secundários no guaco. Os efeitos de
diferentes solventes extratores e suas misturas na composição química dos extratos e
frações também foram analisados.
A seleção de cada solvente orgânico do planejamento estatístico de misturas, com
quatro componentes, foi feita através do triângulo de seletividade dos solventes proposto
por Snyder49, sendo que solventes de grupos distintos apresentam diferentes parâmetros
de seletividade e são classificados de acordo com a sua habilidade de interagir com as
moléculas do soluto como doador de próton (basicidade, ), aceptor de próton
(acidicidade, ) ou momento dipolar (dipolaridade, ). A propriedade aceptora ou doadora
de prótons de uma molécula é uma medida da sua capacidade de formar ligações de
hidrogênio com outras moléculas. Entretanto, o momento dipolar é uma medida da
separação da carga permanente em uma molécula e, portanto, do campo elétrico ao redor
dela. Uma molécula que apresenta momento dipolar elevado interage fortemente com
outra molécula carregada ou espécie dipolar, atuando como uma substância mais polar50.
A Figura 8 mostra o triângulo de seletividade onde os parâmetros de , e
localizam-se nos vértices do triângulo e cada ponto corresponde aos valores destes
parâmetros para os componentes puros mais as misturas apresentadas na Tabela 1.
Estes pontos definem uma região trapezoidal invertida com os solventes puros etanol e
acetona ocupando os vértices da base maior e clorofórmio e diclorometano a menor.
Solventes localizados longe um do outro neste triângulo possuem diferentes parâmetros
de seletividade, e consequentemente na extração, diferentes interações soluto-solvente
são encontradas, resultantes das misturas entre eles.
37
e a
dc
ae
dece adac
cd
ade
cde
ace
acd
r
Figura 8: Triângulo de seletividade baseado nos parâmetros , e para cada ponto do
planejamento estatístico de misturas. e = etanol; a = acetona; d = diclorometano; c =
clorofórmio.
Para obter um perfil cromatográfico bem informativo, com o maior número de picos,
foram testadas três fases móveis compostas por água:metanol:acetonitrila nas proporções
(65:17,5:17,5; v/v/v; 47:27:26, v/v/v/ e 30:35:35, v/v/v) com forças s = 1,0; 1,5 e 2,0,
respectivamente. Três comprimentos de onda 210, 240 e 272 nm foram testados nas
análises metabolômicas. O número de picos detectados foi utilizado como parâmetro para
avaliar a eficiência da extração, sendo que a melhor condição ocorreu em 240 nm com a
fase móvel (65:17,5:17,5; v/v/v) água:metanol:acetonitrila, de força cromatográfica s = 1,0,
e esta foi a utilizada no trabalho. Um exemplo disto pode ser visto na Figura 9 que mostra
os cromatogramas dos extratos brutos obtidos no ponto central (amostras r1 –r5) e as
médias dos números dos picos detectados em 240 nm com as três fases móveis na
primavera. Neste trabalho serão discutidos os dados cromatográficos obtidos na
primavera. Em anexo são apresentados os números dos picos detectados nas análises
cromatográficas das amostras dos extratos brutos e frações orgânica e básica nas demais
estações.
38
(a) (b) (c)
Figura 9: Cromatogramas dos extratos brutos do ponto central (replicatas), obtidos na
primavera com as fases móveis (a) s = 1,0; (b) s = 1,5 e (c) s = 2,0 em 240 nm.
A Figura 10 mostra os números de picos obtidos nas análises cromatográficas das
amostras dos extratos brutos e frações orgânicas, básicas e polares, em cada ponto do
planejamento estatístico de misturas na condição otimizada.
Figura 10: Modelo Centróide-Simplex com os números dos picos detectados utilizando a
fase móvel s = 1,0 e em 240 nm para o extrato bruto (a) e as frações orgânicas (b),
básicas (c) e polares (d).
39
Analisando a Figura 10a verifica-se que os maiores números de picos são obtidos
para os extratos preparados com os solventes puros clorofórmio (17) e diclorometano (15)
e a mistura binária entre eles (17). Clorofórmio e diclorometano são solventes
relativamente polares e possuem os parâmetros de seletividade , e semelhantes,
sendo baixo o valor de basicidade e intermediários os valores de acidicidade e
dipolaridade.
Para a fração orgânica, os maiores números de picos foram obtidos com o solvente
puro acetona (17), seguido das misturas binárias de acetona com diclorometano (15) e
etanol (15) e a mistura ternária acetona-clorofórmio-etanol (15). É interessante notar que
ao contrário do observado para o extrato bruto, os solventes que compõem estas
interações estão localizados em diferentes extremidades no triângulo, e
consequentemente, apresentam diferentes parâmetros de seletividade. De fato, a
interação binária acetona-etanol envolve os solventes etanol, que apresenta fortes
propriedades de , e fraca dipolaridade, e a acetona, com valores relativamente altos de
basicidade e dipolaridade e baixa acidicidade. A interação acetona-diclorometano envolve
o solvente diclorometano que é um forte doador de prótons e um fraco receptor, além de
apresentar um caráter altamente dipolar. Por fim, os solventes puros que compõem a
interação ternária acetona-clorofórmio-etanol localizam-se nos vértices de um triângulo
invertido e apresentam as maiores diferenças nas propriedades de , e .
Os números de picos detectados nas análises das frações básicas preparadas com
os solventes puros acetona e clorofórmio foram duas vezes maiores do que os obtidos
com os solventes diclorometano e etanol. Entretanto, a interação clorofórmio-etanol
apresentou uma boa eficiência na extração (12 picos), assim como as misturas ternárias
acetona-clorofórmio-diclorometano (13) e acetona-diclorometano-etanol (13). Novamente
estas interações envolvem solventes que apresentam diferentes parâmetros de
seletividades. De fato, apenas o par resultante da interação entre os solventes
diclorometano e clorofórmio apresenta os parâmetros de seletividade semelhantes,
enquanto que os outros têm propriedades de seletividades diferentes, como por exemplo,
as misturas envolvendo o etanol com qualquer um dos outros três solventes.
Para a fração polar (Figura 10d), verifica-se que a média do número dos picos
obtidos com os solventes puros foi menor do que a obtida com as misturas, 2,8 ± 0,5 e 3,9
40
± 0,83 respectivamente. A maior eficiência foi alcançada para as frações preparadas com
as misturas binária diclorometano-etanol e ternária acetona-clorofórmio-etanol. Essas
misturas contém o etanol em suas composições que possui valores de acidicidade e
basicidade semelhantes e baixo valor de .
Os resultados dos números de picos detectados nas análises cromatográficas dos
extratos brutos e frações foram submetidos à análise de componentes principais, porque a
posição relativa de cada ponto do planejamento estatístico de misturas no gráfico biplot de
escores e loadings, Figura 11, também pode ser interpretada em termos dos parâmetros
de seletividade , e . Os dados foram organizados em uma matriz de dimensão 19x4 e
submetidos ao pré-processamento por autoescalonamento. Cada linha representa os
resultados para uma das 15 composições diferentes das misturas mais as quintuplicatas
no ponto central. As quatro colunas correspondem aos valores dos números dos picos do
extrato bruto e das frações básica, orgânica e polar.
Figura 11: Gráfico biplot de escores e loadings para as duas componentes principais para
os dados dos picos detectados nas análises cromatográficas das amostras do extrato
bruto e frações básica, orgânica e polar. e = etanol; a = acetona; d = diclorometano; c =
clorofórmio.
As duas primeiras componentes principais explicam 64,9 % da variância total
contida dos dados. O gráfico dos loadings da CP1 descreve 34,35% da variância e
apresenta valor positivo para o extrato bruto, localizado na direita do gráfico, e negativo
41
para as frações básica, orgânica e polar, na esquerda. A CP2 com apenas 32,6 % de
variância é caracterizada pelo valor de loading positivo para as frações básica e polar e
negativo para a fração orgânica.
O gráfico dos escores mostra que as amostras preparadas com as misturas
contendo o solvente acetona em sua composição estão concentradas no lado esquerdo
do gráfico, enquanto que o lado direito contém os pontos correspondentes as misturas
que contém os solventes clorofórmio, diclorometano e etanol em suas composições.
Os pontos correspondentes às amostras preparadas com acetona, acetona-
diclorometano, acetona-etanol e acetona-clorofórmio-etanol localizam-se próximo ao
loading da fração orgânica. Essas misturas ocupam a região superior no lado direito do
triângulo de seletividade e contém em sua composição a acetona, que apresenta o menor
valor de acidicidade quando comparada aos outros solventes. De fato, a Figura 10b
mostra que as melhores eficiências ocorrem com estas composições extratoras e que o
rendimento médio do número de picos obtido com as misturas contendo a acetona em
sua composição é maior do que sem a acetona, 14 e 12, respectivamente.
Os pontos dos escores correspondentes às amostras extraídas com o solvente
puro clorofórmio e as misturas binárias de clorofórmio com diclorometano e etanol
localizam-se próximo ao loading do extrato bruto. Analisando a Figura 8 verifica-se que
clorofórmio e diclorometano apresentam os parâmetros de seletividade , e similares
e o ponto correspondente a sua mistura binária localiza-se próximo aos pontos dos seus
respectivos solventes puros. Por outro lado, a interação clorofórmio-etanol, envolve
solventes que estão localizados em diferentes extremidades no triângulo, e
consequentemente, o ponto da mistura resultante entre eles está posicionado longe dos
pontos dos seus solventes puros.
4.3 Estudos Fitoquímico e do Efeito Sazonal nos Perfis Espectrais dos Compostos
Detectados nos Extratos Brutos e Frações Orgânicas.
A maioria dos estudos fitoquímicos realizados com as folhas da Mikania laevigata
revelaram a presença da cumarina e de outros metabólitos secundários derivados do
ácido cinâmico e de diterpenos caurânicos4-6,51, que estão associados com os efeitos
terapêuticos encontrados do guaco. Desta forma, nesta etapa do trabalho analisaram-se
42
os extratos brutos e as frações orgânicas, sendo esta específica para a extração e
concentração destes metabólitos.
A fim de verificar o efeito sazonal nos perfis espectrais dos compostos detectados
nas análises cromatográficas e identificar similaridades entre os espectros das diferentes
classes das substâncias, as análises de agrupamento hierárquica e de componentes
principais foram aplicadas aos espectros UV/DAD dos extratos brutos e das frações
orgânicas, preparados com o solvente ou mistura de solventes que apresentaram os
maiores rendimentos na estação mais e também menos significativa. Por exemplo, para a
fração orgânica, no verão obteve-se o maior rendimento médio (0,4872 g) e a maior
eficiência na extração foi obtida com a mistura binária diclorometano-etanol, entretanto, na
primavera obteve-se o menor rendimento médio (0,2458 g) e o solvente mais eficiente foi
a mistura ternária clorofórmio-diclorometano-etanol. Desta forma, as frações orgânicas
obtidas nas quatro estações com estas misturas foram analisadas.
4.3.1 Análise dos Extratos Brutos
Para o extrato bruto, nas estações verão e outono obteve-se a maior e a menor
eficiência na extração, respectivamente, e para ambas as estações o solvente que
apresentou o maior rendimento foi o etanol. A Figura 12 mostra os cromatogramas dos
extratos brutos obtidos nas quatro estações com o solvente puro etanol na condição
otimizada. Nesta, observa-se o efeito sazonal no perfil cromatográfico bem como na
concentração dos metabólitos, principalmente no tempo de retenção em 15,7 min.
0 5 10 15 20 25
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
Tempo (min)
Verao
Outono
Inverno
Primavera
15.7
Figura 12: Cromatogramas dos extratos brutos da Mikania laevigata obtidos com o
solvente puro etanol nas quatro estações.
15,7
43
Nas análises cromatográficas detectou-se 14 picos no verão e inverno e 13 picos
no outono e primavera. Ao todo 54 espectros correspondentes aos picos cromatográficos
foram obtidos e organizados em uma matriz de dimensão 54x261. Cada linha representa
um espectro UV/DAD e as colunas correspondem aos valores de absorvância no intervalo
de 190 á 450 nm. Essa matriz foi submetida às análises de agrupamento hierárquico e de
componentes principais, sendo os cálculos feitos sem nenhum tipo de pré-processamento.
A Figura 13 mostra o dendrograma obtido na análise de agrupamento hierárquica
bem como os espectros de absorção UV-VIS correspondentes aos picos cromatográficos
obtidos por CLAE-DAD.
Figura 13: Dendrograma da análise de agrupamento hierárquica e perfis espectrais dos
picos cromatográficos do extrato bruto da Mikania, obtido com o solvente puro etanol nas
quatro estações. 2 = verão; 3 = outono; 4 = inverno e 1 = primavera.
Dis
tân
cia
44
No dendrograma, observa-se a existência de dois grandes grupos, denominados A
e B, e no valor de distância Euclidiana entre 16 e 24 a existência de pelo menos sete sub-
grupos e de dois conjuntos dentro do subgrupo II.
O sub-grupo I exibe um único perfil espectral e no tempo de retenção em 15,7 min
foi detectado em todas as estações. O efeito da sazonalidade é evidente na concentração
da substância, sendo a do verão quase três vezes maior que a da primavera. Os
espectros mostram absorções máximas em 200, 275 e em 315 nm que são características
da cumarina, utilizada como marcador químico e considerada uma das principais
substâncias químicas que apresenta ação farmacológica na planta Mikania laevigata51.
No sub-grupo II é possível visualizar o agrupamento de diferentes perfis espectrais,
ausentes apenas no verão. Para simplificar a interpretação dos espectros, este sub-grupo
foi dividido em dois conjuntos. No conjunto I, embora os perfis espectrais sejam
diferentes, apresentam a absorção máxima nos comprimentos de ondas similares, 198 e
220 nm. Isto pode indicar que estes espectros são de substâncias que pertencem à
mesma ou similar classe química de compostos. O conjunto II exibe no outono um perfil
espectral distinto dos demais espectros com uma banda de absorção máxima entre 205 a
230 nm e outra em 309 nm, podendo indicar a presença do composto fenólico
siringaldeído, formado a partir da degradação da lignina52. Este metabólito tem
apresentado considerável atividade antioxidante e contribui para as propriedades anti-
inflamatórias da Mikania53,54.
O sub-grupo III exibe perfis espectrais detectados na primavera e no inverno com
absorções máximas em 212, 270 e 320 nm. Essas absorções são similares ao do ácido o-
cumárico, o precursor biossintético da cumarina17, sendo na literatura descrito como um
dos responsáveis pela atividade terapêutica do guaco55-56.
O sub-grupo IV contém um único perfil espectral e foi detectado apenas no verão.
O espectro exibe uma forte banda de absorção com o máximo entre 260 e 270 nm e uma
mais fraca em 200 nm, que são indicativas da presença de polifenóis, tal como os
derivados do ácido gálico57.
O sub-grupo V exibe espectros que foram detectados em todas as estações, sendo
com uma maior frequência no verão. De fato, dos 14 picos cromatográficos detectados no
verão, 8 apresentaram este perfil espectral que tem uma forte absorção em 197 nm.
Esses espectros são característicos de compostos que possuem poucos grupos
45
cromóforos, tal como o ácido caurenóico, um diterpeno caurânico58. Alguns estudos
relatam que esta substância possui atividades antibacteriana59, antifúngica e anti-
inflamatória60.
Os espectros do sub-grupo VI, detectados na primavera e no inverno, mostram
absorções máximas nos comprimentos de ondas semelhantes daqueles apresentados no
sub-grupo IV, 205 e 260 nm. De acordo com os dados na literatura, este perfil espectral é
consistente com as estruturas eletrônicas de anel benzênico substituído e também de
polifenóis, que podem incluir moléculas simples como os ácidos fenólicos e/ou compostos
altamente polarizáveis como os taninos61. O ácido gálico é um precursor comum dos
taninos hidrolisáveis62 e isso pode justificar a semelhança das absorções máximas nos
perfis espectrais apresentados nos grupo IV e VI.
O sub-grupo VII exibe perfis espectrais que apresentam uma forte absorção em
197 nm e uma pequena banda em 267 nm, e foram detectados em todas as estações do
ano. Estes espectros são característicos de derivados de cumarinas, como por exemplo, a
dihidrocumarina63. Este metabólito possui atividades antioxidantes e antiinflamatórias e é
considerado como um dos principais compostos presentes no extrato hidroalcoólico do
guaco64,65.
A fim de confirmar os resultados da análise de agrupamento hierárquica e
investigar as correlações entre o efeito sazonal nos perfis espectrais dos compostos
detectados e similaridades entre os espectros, a análise de componentes principais foi
também aplicada aos dados.
A Figura 14 mostra o gráfico de escores (a) e loadings (b) para as CP1 e CP3 que
juntas descrevem 77,10 % da variância total dos dados.
Uma inspeção no gráfico dos escores confirma a formação dos dois maiores
grupos denominados A e B na análise de agrupamento hierárquica, bem como dos
subgrupos de I à IV e VI. Os subgrupos V e VII não foram discriminados, provavelmente
devido à semelhança entre os espectros que compõem estes grupos.
A CP1 descreve 63,4 % da variância e discrimina o grupo A, localizado na região
negativa, do grupo B. A CP3 descreve 13,7 % da variância e discrimina os subgrupos I e
IV do subgrupo II. Os loadings da CP1 mostram que os espectros pertencentes ao grupo
A, que possuem valores de escores negativos (Figura 14a), sofrem maior influência da
variável que apresenta valor de loading negativo, ou seja, são caracterizados pela banda
46
de absorção próxima à 200 nm, similares aos espectros do ácido caurenôico e seus
derivados. Já os espectros pertencentes ao subgrupo III, que possuem valores de escores
mais positivos, são caracterizados pelas absorções em 275 e 320 nm, característicos do
ácido o-cumárico. Os loadings da CP3 mostram que o único espectro que compõe o
grupo IV, que possui valor de escore mais negativo, é caracterizado pela banda de
absorção máxima entre 260 e 270 nm, característico dos polifenóis.
-1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
CP1 (63,43%)
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
2
3
CP
3 (
12
,05
%)
IV
I
II
VIIII
Verão
Outono
Inverno
Primavera
A B
(a)
(b)
Figura 14: Gráfico dos escores (a) e loadings (b) das componentes principais 1 e 3 dos
dados espectrais dos picos cromatográficos do extrato bruto da Mikania obtido com o
solvente puro etanol nas quatro estações.
47
Para confirmar a presença das substâncias previamente detectadas nas análises
cromatográficas por CLAE-DAD, as amostras dos extratos brutos preparadas com o
solvente puro etanol foram submetidas às analises por CLUE-EM em modo positivo e
negativo de ionização.
Nas análises no modo positivo, em todas as estações foram detectados dois picos
com tempos de retenções em aproximadamente 0,9 e 1,2 min. Ao analisar o espectro de
massa do pico em 0,9 min observou-se a presença de um íon de maior abundância
relativa, revelando uma espécie iônica principal (1) com m/z 149 ([M+H]+), característico
da dihidrocumarina protonada.
Para o pico em 1,2 mim observou-se a presença de um íon predominante,
revelando uma espécie iônica principal (2) com m/z 147 ([M+H]+), característico da
cumarina protonada. Isto pode ser verificado na Figura 15, que mostra os cromatograma
de íons totais bem como os espectros de massas dos íons correspondentes aos picos em
0,9 e 1,2 min, obtidos na análise do extrato bruto preparado com o solvente puro etanol no
verão.
Figura 15: Cromatograma de íons totais e espectro de massa IES-EM no modo positivo
de ionização dos íons correspondentes aos picos em 0,9 e 1,2 min para o extrato bruto
preparado com o solvente puro etanol no verão.
Alt
ura
do
pic
o (
u.a
)
48
Nas análises do modo negativo, os perfis cromatográficos dos íons totais
apresentaram uma baixa resolução e diferenças no tempo de eluição das substâncias
entre as estações e, portanto, não são apresentados neste trabalho. Entretanto, nas
análises dos espectros de massas verificou-se em todas as estações a presença de íons
característicos dos ácidos desprotonados o-cumárico (3), com m/z 163 ([M-H]-), e
melilótico (4), com m/z 165 ([M-H]-), Figura 16a e 16b, respectivamente.
No estudo dos espectros dos picos cromatográficos obtidos nas análises por
CLAE-DAD, o sub-grupo III exibiu perfis espectrais detectados apenas na primavera e no
inverno com absorções máximas em 212, 270 e 320 nm, sugerindo a presença do ácido
o-cumárico, por ser o precursor da cumarina e ser uma das substâncias majoritárias entre
os metabólitos secundários nos extratos do guaco. Por outro lado, o ácido melilótico
apresenta um perfil espectral semelhante ao ácido o-cumárico63 e ambos podem estar
presentes no sub-grupo III. Embora na literatura nenhum trabalho tenha citado
diretamente a presença deste ácido em extratos da Mikania laevigata, a conversão da
cumarina em ácido melilótico foi discutida para as espécies de Melilotus officinalis L.
(trevo amarelo) e Memilotus alba L. (trevo branco)66,67.
(a) (b) (c)
Figura 16: Espectros de massas IES-EM no modo negativo de ionização dos íons
correspondentes ao ácido o-cumárico (a), ácido melilótico (b) e siringaldeído (c) no extrato
bruto preparado com o solvente puro etanol no outono.
No outono, nas análises dos espectros de massas, também foi observada a
presença de um íon predominante, revelando uma espécie iônica principal com m/z 181
49
([M-H]-), característico do siringaldeído desprotonado (5), Figura 16c. Este resultado está
de acordo com o encontrado no estudo espectral e indica que o efeito sazonal pode ser
significativo e determinante para a produção e identificação deste metabólito.
4.3.2 Análise das Frações Orgânicas
A Figura 17a mostra os cromatogramas das frações orgânicas obtidas nas quatro
estações com a mistura binária diclorometano-etanol, bem como, com a mistura ternária
clorofórmio-diclorometano-etanol, Figura 17b. Nestas, observa-se os efeitos do solvente e
sazonal nos perfis cromatográficos e na concentração dos metabólitos.
(a) (b)
Figura 17: Cromatogramas das frações orgânicas da Mikania laevigata obtidos nas quatro
estações com mistura binária diclorometano-etanol (a) e com a mistura ternária
clorofórmio-diclorometano-etanol (b).
Nas análises cromatográficas das frações orgânicas preparadas com a mistura
binária diclorometano-etanol detectou-se 8 picos no verão, 12 no inverno e 11 na
primavera e outono. Ao todo 42 espectros correspondentes aos picos cromatográficos
foram obtidos e organizados em uma matriz de dimensão 42x261. Cada linha representa
um espectro cromatográfico e as colunas correspondem aos valores de absorvância no
intervalo de 190 á 450 nm. Essa matriz foi submetida às análises de agrupamento
hierárquico e de componentes principais, sendo os cálculos feitos com pré-processamento
por autoescalonamento.
50
A Figura 18 mostra o dendrograma obtido na análise de agrupamento hierárquica
bem como os espectros de absorção no UV-VIS correspondentes aos picos
cromatográficos obtidos por CLAE-DAD. No valor de distância Euclidiana entre 20 e 30
pode-se observar a existência de 6 grupos e de dois subgrupos dentro do grupo VI,
denominados a e b.
Figura 18: Dendrograma da análise de agrupamento hierárquica e perfis espectrais dos
picos cromatográficos das frações orgânicas da Mikania, preparada com a mistura binária
diclorometano-etanol nas quatro estações. 1 = verão; 2 = outono; 3 = inverno e 4 =
primavera.
51
O grupo I contém um perfil espectral e foi detectado apenas no verão nos tempos
de retenções 2,4; 2,7 3,3 e 11,3 min. Os espectros mostram uma banda de absorção com
o máximo entre 230 e 260 nm e uma mais fraca em 290 nm, que são indicativas da
presença de anel aromático benzênico substituído, sugerindo tratar-se de um derivado
caurânico, como por exemplo, o ácido benzoilgrandiflórico68.
Os espectros do grupo II, detectados apenas na primavera nos tempos de
retenções 7,0; 9,1 e 11,3 min mostram absorções máximas em 270 e 320 nm, sugerindo
tratar-se de um derivado do ácido cinâmico.
O grupo III exibe espectros que foram detectados em todas as estações, sendo
com uma maior frequência no outono e na primavera. Os picos detectados apresentaram
variações nos tempos de retenções nas diferentes estações do ano, como por exemplo,
16,4 min no verão, 18,3 min no outono, 19,5 min no inverno e 19,3 na primavera. Os perfis
espectrais exibem absorções máximas em 212, 270 e 320 nm, indicando a presença do
ácido o-cumárico. No entanto, não é descartada a possibilidade de ser o ácido melilótico,
pois este apresenta espectro no UV semelhante. Estes ácidos são derivados do ácido
cinâmico e isso pode justificar a equivalência das absorções em 270 e 320 nm presentes
nos grupos II e III.
No grupo IV os perfis espectrais apresentam uma forte absorção em 309 nm e
foram detectados nas estações outono e inverno no tempo de retenção de 8,2 min. Este
espectro é característico do siringaldeído, considerado um dos compostos majoritários no
guaco56. No estudo dos espectros do extrato bruto preparado com o solvente puro etanol
este metabólito havia sido detectado apenas no outono.
O grupo V exibe o perfil espectral da cumarina, com absorções máximas em 200,
272 e em 315 nm, e foi detectado em todas as estações no tempo de retenção de 15,3
min. Analisando a Figura 17 verifica-se o efeito do solvente na extração desta substância,
sendo a mistura binária diclorometano-etanol mais eficiente no outono e a ternária
clorofórmio-diclorometano-etanol mais eficiente no verão.
Para simplificar a interpretação dos espectros, o grupo VI foi dividido em dois sub-
grupos, denominados a e b. No sub-grupo a, embora os perfis espectrais sejam
diferentes, apresentam uma absorção máxima em 198 nm. Os espectros do sub-grupo b
exibem uma forte absorção em 198 nm e duas bandas mais fracas com absorções em
267 nm e 350 nm, e foram detectados nas estações verão, inverno e primavera, com uma
52
maior frequência no inverno. Estes espectros podem indicar a presença de derivados do
ácido caurenóico58,59.
A fim de confirmar os resultados da análise de agrupamento hierárquica e
investigar as correlações entre o efeito sazonal nos perfis espectrais dos compostos
detectados e similaridades entre os espectros, a análise de componentes principais foi
também aplicada aos dados. A Figura 19 mostra o gráfico de escores e loadings para as
CP1 e CP2 que juntas descrevem 78,4 % da variância total dos dados.
-3.0 -2.0 -1.0 0.0 1.0 2.0 3.0
CP1 (48,5%)
-3.0
-2.0
-1.0
0.0
1.0
2.0
3.0
CP
2 (
29,9
%)
Verão Outono Inverno Primavera
I III
VI
II
I
200 250 300 350 400 450
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
CP1
CP2
Figura 19: Gráfico dos escores e loadings das componentes principais 1 e 2 dos dados
espectrais dos picos cromatográficos das frações orgânicas da Mikania preparadas com a
mistura binária diclorometano-etanol nas quatro estações.
Load
ings
Comprimento de onda, nm
53
Analisando o gráfico dos escores verifica-se a formação dos grupos I, II, III e VI,
formados na análise hierárquica. A CP1 descreve 48,5 % da variância e discrimina o
grupo III, localizado na região positiva, dos grupos I e VI na região negativa, enquanto que
o grupo II encontra-se na parte intermediária. A CP2 consegue discriminar com 29,9 % de
variância os grupos I e II do grupo VI. O gráfico dos loadings da CP1 mostra que os
espectros pertencentes ao grupo III, que possuem valores de escores positivos na Figura
19, sofrem maior influência das variáveis que apresentam valores de loadings positivo, ou
seja, são caracterizados pelas bandas com absorções máximas em 275 e em 320 nm,
característicos dos ácidos o-cumárico e melilótico. Já os espectros pertencentes ao grupo
I, que possuem valores de escores mais negativos, são caracterizados pela banda de
absorção com o máximo em 240 nm, similar aos espectros do ácido benzoilgrandiflórico e
detectado apenas no verão. Os loadings da CP2 mostram que os espectros que
compõem o grupo VI, que possuem valores de escores mais positivos, são caracterizados
pela absorção máxima em 198 nm. Esta forte absorção é comum em muitos espectros e
isso pode justificar o agrupamento de diferentes perfis espectrais no grupo VI, que não
foram discriminados no gráfico dos escores.
Nas análises cromatográficas das frações orgânicas preparadas com a mistura
ternária clorofórmio-diclorometano-etanol detectou-se 15 picos no verão e 17 picos nas
demais estações. Comparando os números de picos obtidos verifica-se que a mistura
ternária clorofórmio-diclorometano-etanol extraiu uma maior quantidade de compostos do
que a mistura binária diclorometano-etanol. Ao todo 66 espectros correspondentes aos
picos cromatográficos foram obtidos e organizados em uma matriz de dimensão 66x261.
Cada linha representa um espectro cromatográfico e as colunas correspondem aos
valores de absorvância no intervalo de 190 á 450 nm. Essa matriz foi submetida às
análises de agrupamento hierárquico e de componentes principais, sendo os cálculos
feitos com pré-processamento por autoescalonamento.
A Figura 20 mostra o dendrograma obtido na análise de agrupamento hierárquica
bem como os espectros de absorção no UV-VIS correspondentes aos picos
cromatográficos obtidos por CLAE-DAD. Observa-se a existência de dois grandes grupos,
denominados A e B, e no valor de distância Euclidiana 21 a existência de seis subgrupos
e de dois conjuntos dentro dos subgrupos V e VI, denominados a-b e c-d,
respectivamente.
54
Figura 20: Dendrograma da análise de agrupamento hierárquica e perfis espectrais dos
picos cromatográficos das frações orgânicas da Mikania, preparada com a mistura
ternária clorofórmio-diclorometano-etanol nas quatro estações. 1 = verão; 2 = outono; 3 =
inverno e 4 = primavera.
55
Os subgrupos I e II exibem os mesmos perfis espectrais já detectados nas análises
das frações orgânicas preparadas com a mistura binária diclorometano-etanol (Figura 18).
Como já descrito anteriormente, os espectros que formam os subgrupos I e II são
semelhantes ao do ácido benzoilgrandiflórico e de um derivado do ácido cinâmico,
respectivamente. Este resultado sugere que de fato existe variação na composição dos
metabólitos secundários em função das estações do ano, porque, os espectros
característicos do ácido benzoilgrandiflórico (subgrupo I) foram detectados apenas no
verão, enquanto que os que compõem o subgrupo II foram detectados apenas na
primavera.
O subgrupo III exibe um perfil espectral que foi detectado apenas no verão nos
tempos de retenções 2,8; 3,3; 3,8 e 4,1 min. Os espectros mostram uma banda de
absorção com o máximo em 260 nm, indicativas da presença de polifenóis. Este perfil
espectral não foi detectado nas análises das frações orgânicas preparadas com a mistura
binária diclorometano-etanol e pode mostrar a existência do efeito do solvente na extração
da substância.
No subgrupo IV é possível visualizar o agrupamento dos espectros característicos
da cumarina, que apresenta absorções máximas em 212, 270 e em 315 nm, e dos ácidos
o-cumárico e/ou melilótico, que apresentam espectro no UV com absorções semelhantes
em 212, 270 e 320 nm. Estas substâncias foram detectadas em todas as estações do
ano, sendo a cumarina no tempo de retenção de 15,5 min, enquanto que os ácidos
apresentaram variações nos tempos de retenções nas diferentes estações do ano.
O subgrupo V é composto por espectros que têm diferentes perfis espectrais, mas
que apresentam uma forte banda de absorção entre 195 e 215 nm, justificando o
agrupamento destes espectros em um único grupo. Para simplificar a interpretação dos
espectros, este subgrupo foi dividido em três conjuntos. O conjunto a exibe perfis
espectrais que tem uma forte absorção em 198 nm e outra mais fraca em 320 nm, e foram
detectados apenas no inverno. Os espectros do conjunto b exibem uma forte absorção em
198 nm e duas bandas mais fracas em 267 e 350 nm, e foram detectados nas estações
inverno e primavera, sendo com uma maior frequência no inverno. No conjunto c, embora
os perfis espectrais sejam diferentes, apresentam uma absorção máxima em 210 nm e
foram detectados nas estações verão, inverno e primavera. Espectros semelhantes aos
conjuntos a e b já haviam sido detectados nas análises das frações orgânicas preparadas
56
com a mistura binária diclorometano-etanol, indicando a presença de derivados do ácido
caurenóico.
O subgrupo VI foi dividido em dois conjuntos e um deles é composto por espectros
que apresentam uma forte absorção em 309 nm, característicos da substância
siringaldeído, e foi detectada no tempo de retenção de 8,2 min nas estações outono,
inverno e verão. Conforme descrito anteriormente, nas análises das amostras preparadas
com a mistura binária diclorometano-etanol, esta substância foi detectada neste mesmo
tempo de retenção no outono e no inverno.
Para confirmar os resultados da análise de agrupamento hierárquica a análise de
componentes principais também foi aplicada aos dados. A Figura 21 mostra o gráfico de
escores para as CP1 e CP2 que juntas descrevem 76,6 % da variância total contida nos
dados.
-4.0 -3.0 -2.0 -1.0 0.0 1.0 2.0 3.0
PC1 (48,3%)
-2.0
-1.0
0.0
1.0
2.0
3.0
PC
2 (
28,3
%)
Verão Outono Inverno Primavera
A B
I
II
III
IV
V, VI
Figura 21: Gráfico dos escores das componentes principais 1 e 2 dos dados espectrais
dos picos cromatográficos das frações orgânicas da Mikania preparadas com a mistura
ternária clorofórmio-diclorometano-etanol nas quatro estações.
57
Uma inspeção no gráfico dos escores confirma a formação dos dois maiores
grupos denominados A e B na análise de agrupamento hierárquica, bem como dos
subgrupos de I à IV. Os subgrupos V e VI não foram discriminados.
A CP1 descreve 48,3 % da variância dos dados e discrimina o grupo A contendo os
subgrupos de I, II e III, localizados na região negativa, do grupo B na região positiva. A
CP2 descreve 28,3 % da variância e discrimina os subgrupos V e VI, localizados na região
positiva, do subgrupo II na região negativa, enquanto que os subgrupos I, III e IV
encontram-se na região intermediária.
O gráfico dos loadings, Figura 22, apresenta um perfil semelhante ao observado na
Figura 19b e mostra que os espectros pertencentes ao subgrupo I, que possuem valores
de escores mais negativos (Figura 21), sofrem maior influência da variável que apresenta
valor de loading negativo, ou seja, são caracterizados pela banda de absorção próxima à
240 nm, similares ao do ácido benzoilgrandiflórico. Já os espectros pertencentes ao
subgrupo IV, que possuem valores de escores mais positivos, são caracterizados pelas
bandas de absorções entre 260-280 e 310-330 nm, que contém as absorções
características do ácido o-cumárico, melilótico e da cumarina. Os loadings da CP2
mostram que os espectros contidos no subgrupo II, que possuem valores de escores mais
negativos, são caracterizados pela absorção em 275 e 320 nm, semelhantes aos
espectros derivados do ácido cinâmico.
200 250 300 350 400 450
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
CP1
CP2
Figura 22: Gráfico dos loadings das componentes principais 1 e 2 dos dados espectrais
dos picos cromatográficos das frações orgânicas da Mikania preparadas com a mistura
ternária clorofórmio-diclorometano-etanol nas quatro estações.
Comprimento de onda, nm
Load
ings
58
Para confirmar a presença das substâncias previamente detectadas nas análises
cromatográficas por CLAE-DAD, as amostras das frações preparadas com a mistura
binária diclorometano-etanol e com a mistura ternária clorofórmio-diclorometano-etanol
nas quatro estações foram submetidas às analises por CLUE-EM em modo positivo e
negativo de ionização.
As análises realizadas no modo positivo confirmaram a presença da cumarina em
todas as amostras nas quatro estações. No modo negativo, em todas as estações
detectou-se no tempo de retenção de 1,24 min a presença do ácido melilótico e no de
1,56 min a do ácido o-cumárico. No entanto, o composto siringaldeído foi detectado
apenas nas estações outono e inverno, confirmando os resultados descritos no estudo
espectral. Isto pode ser verificado na Figura 23, que mostra os cromatogramas das
amostras preparadas com a mistura ternária clorofórmio-diclorometano-etanol no outono e
na primavera. Nesta observa-se que o pico com tempo de retenção de 0,4 min foi
detectado apenas no outono. A análise do espectro de massa deste pico confirma a
presença de um íon predominante, revelando uma espécie iônica principal com m/z 181
([M-H]-), compatível com o siringaldeído desprotonado.
Figura 23: Cromatograma de íons totais e espectros de massas IES-EM no modo
negativo de ionização dos íons correspondentes aos picos em: 0,4 mim (siringaldeído),
1,24 min (ácido melilótico) e 1,56 min (ácido o-cumárico), para as frações orgânicas
preparadas com a mistura ternária clorofórmio-diclorometano-etanol no outono e na
primavera.
59
4.4 Otimização do Processo da Extração da Cumarina e Outros Metabólitos
Secundários no Guaco
Após o estudo fitoquímico qualitativo para avaliar a presença de alguns metabólitos
secundários nos extratos brutos e fracionados, foram estudados os efeitos sazonal e da
composição do solvente extrator na extração dos metabólitos secundários majoritários nas
folhas da planta Mikania laevigata. Nesta etapa, um enfoque especial será dado para a
cumarina, por ser a principal substância química de ação farmacológica encontrada nesta
planta e estar presente nos extratos em maior quantidade, bem como, para o ácido o-
cumárico, o precursor biossíntético da cumarina, e o ácido melilótico.
A fração orgânica pode ser vista como uma extração específica para os compostos
fenólicos e terpenóides e foi utilizada nesta etapa do trabalho porque contém quantidades
significativas da cumarina.
A Figura 24 mostra os cromatogramas obtidos por FR-CLAE-DAD dos extratos
fracionados no ponto central do planejamento (replicatas), preparados com a mistura
quaternária acetona-clorofórmio-diclorometano-etanol (1:1:1:1 v/v/v/v) nas quatro
estações. Nela é possível observar a presença de dois picos majoritários independente da
estação.
Figura 24: Cromatogramas obtidos por FR-CLAE-DAD dos extratos fracionados da planta
Mikania laevigata Schultz Bip. no ponto central (replicatas) do planejamento nas quatro
estações.
60
O pico de maior intensidade com tempo de retenção por volta de 13,2 min foi
detectado em todos os extratos analisados e apresentou um perfil espectral com
absorções máximas em 202, 274 e em 312 nm, que são consistentes com a estrutura da
cumarina. Para confirmar a presença da cumarina estes extratos foram submetidos às
analises por CLUE-EM em modo positivo de ionização. Na análise de todos os extratos foi
detectado um pico com tempo de retenção em torno de 1,12 min, e no espectro de
massaS observou-se a presença de um íon de maior abundância relativa, revelando uma
espécie iônica principal com m/z 147 ([M+H]+), compatível com a cumarina protonada e
anteriormente já identificada nas análises dos extratos brutos, Figura 15, e das frações
orgânicas preparadas com as misturas diclorometano-etanol e clorofórmio- diclorometano-
etanol.
O segundo pico, de menor intensidade na Figura 24, apresentou variação no tempo
de retenção nas diferentes estações do ano, por exemplo, no inverno o tempo de retenção
foi de 6 min, na primavera de 24 min e no verão e outono de 21 min. Apesar da
discrepância no tempo de eluição, os perfis espectrais apresentaram uma grande
semelhança na região entre 240 à 370 nm, com absorções máximas em torno de 272 e
323 nm. Esses espectros são compatíveis com a estrutura de alguns ácidos fenólicos
derivados do ácido cinâmico, como por exemplo, o ácido o-cumárico, precursor
biossintético da cumarina. Para confirmar a presença do ácido o-cumárico nos extratos
fracionados, as amostras foram analisadas por CLUE-EM em modo negativo de
ionização. Em todos os cromatogramas de íons totais das amostras analisadas foram
observados a presença de dois picos com tempo de retenção em aproximadamente 1,24
e 1,56 min, Figura 25.
No espectro de massa do pico com tempo de retenção em 1,24 min, observou-se a
presença de dois íons predominantes, revelando uma espécie iônica principal com m/z
165 ([M-H]-) e outra com m/z 121 ([M-H]-) de menor intensidade, provavelmente resultante
da perda de CO2, característico nos ácidos fenólicos. Nesta análise foi possível inferir a
presença do ácido melilótico (4) nos extratos. A análise do espectro de massa do pico em
1,56 min mostrou a presença de um íon predominante, revelando uma espécie iônica
principal com m/z 163 ([M-H]-), compatível com o ácido o-cumárico desprotonado (3).
61
Figura 25: Cromatograma de íons totais e espectros de massas IES-EM no modo
negativo de ionização dos íons correspondentes aos picos em 1,24 e 1,56 min para a
fração orgânica obtido no ponto central do planejamento na primavera.
Para cada extrato analisado por FR-CLAE-DAD obteve-se no ápice do pico da
cumarina o perfil espectral no intervalo entre 220-400 nm, que mostrou uma absorção
máxima em 274 nm. A Tabela 4 mostra os valores das intensidades das absorvâncias
máximas nos espectros, a média e o desvio padrão em cada estação. A última linha da
tabela contém os desvios padrões dos experimentos realizados em quintuplicatas (r1-r5) e
fornecem as estimativas das incertezas experimentais nos resultados.
Comparando as médias das absorvâncias da cumarina, observa-se a evidência do
efeito sazonal na extração da substância. Em outras palavras, a época de colheita da
planta influenciou significativamente na quantidade extraída, porque a média da
absorvância máxima decresceu de 1,2x105 ua no verão para 0,82x105 ua na primavera. As
estações outono e inverno não apresentaram diferenças significativas na eficiência da
extração, sendo semelhantes os valores das intensidades médias obtidos, 1,04x105 ua e
1,03x105 ua, respectivamente. No entanto, nas determinações dos valores das
62
absorvâncias na Tabela 4, um erro no valor de 0,34 ua é obtido a partir de uma estimativa
agredada dos desvios padrões das replicatas, com 16 graus de liberdade. Da mesma
forma, um erro no valor de 0,08 ua é estimado para os valores dos desvios padrões
médios. Sendo o valor da estimativa conjunta dos desvios das replicadas comparável com
as diferenças entre os valores médios, realizou-se o teste-t emparelhado para determinar
se os efeitos sazonais são realmente significativos.
Tabela 4: Composição da mistura extratora em mL, valores das absorvâncias máximas,
médias e desvios padrões obtidos nos perfis espectrais da cumarina no verão, outono,
inverno e primavera.
Fração Intensidade da Absorvância da Cumarina /274 nm (10
5)
Verão Outono Inverno Primavera
e 2,45 1,40 1,65 1,32
a 0,77 1,18 1,04 0,96
d 0,36 1,01 0,48 0,52
c 0.55 0,87 0,93 0,34
ae 2,08 1,72 1,96 0,87
de 0,39 1,04 0,62 0,72
ce 1,96 1,53 2,02 0,75
ad 0,87 0,46 0,71 0,69
ac 0,72 0,81 0,77 0,83
cd 1,46 1,16 0,36 0,99
ade 1,65 1,23 0,48 0,85
cde 1,27 0,17 0,56 0,47
ace 1,21 1,07 1,01 0,95
acd 0,57 0,82 0,40 0,37
r1 1,16 1,39 1,04 1,16
r2 1,75 1,26 1,55 0,95
r3 1,59 0,99 2,04 1,00
r4 0,79 0,75 1,11 0,82
r5 1,12 0,94 0,81 0,91
Média 1,20 1,04 1,03 0,82
Desvio Padrão 0,60 0,36 0,56 0,25
Desvio Padrão das Replicatas 0,39 0,25 0,48 0,12
e = etanol; a = acetona; d = diclorometano; c = clorofórmio
63
Na primavera o valor médio da absorvância máxima obtido é estatisticamente
diferente de todos os valores médios das outras estações no nível de 90 % de confiança.
De fato, a diferença entre as médias obtidas no verão e na primavera é significativa no
nível de 99 % de confiança, enquanto que nas estações outono e inverno é significativa
apenas no nível de 80 % de confiança. Estes resultados confirmam a existência do efeito
sazonal na extração da cumarina e que no verão se têm a maior concentração desta
substância. Nesta estação, a planta Mikania encontra-se em pleno desenvolvimento
vegetativo, caracterizado por sua biomassa elevada, especialmente nas folhas jovens. A
maior eficiência da extração observada nesta época do ano pode estar diretamente
relacionada à proporção de folhas jovens empregadas na preparação dos extratos. Este
resultado está de acordo com o observado em estudos anteriores realizados por Biavatti
et al51 e Bertolucci et al69.
As correlações entre as absorvâncias máximas nas quatro estações foram
calculadas e os resultados são mostrados na Tabela 5, onde os valores em negrito
indicam significância no nível de 95 % de confiança.
Tabela 5: Correlações entre os valores das absorvâncias máximas obtidas no perfil
espectral da cumarina nas quatro estações no nível de 95 % de confiança.
Verão Outono Inverno Primavera
Verão 1,00 0,56 0,67 0,61
Outono 0,56 1,00 0,56 0,55
Inverno 0,67 0,56 1,00 0,44
Primavera 0,61 0,55 0,44 1,00
Correlações significativas com valores de 0,67 e 0,61 foram observadas entre as
absorvâncias do verão e das estações inverno e primavera, respectivamente. Isto significa
que a dispersão dos resultados no verão é semelhante da obtida no inverno e na
primavera, e que um aumento da quantidade da cumarina no verão, obtida com uma
composição de solvente adequado, causará também um aumento na quantidade desta
substância no inverno e na primavera, ou vice e versa. Correlações moderadas com
valores de 0,56 e 0,55 foram observadas entre as absorvâncias do outono e das estações
inverno e primavera, respectivamente.
64
A Figura 26 mostra os efeitos da composição do solvente extrator na intensidade
da absorvância máxima, obtida no perfil espectral da cumarina nos extratos fracionados
do guaco, para cada ponto do planejamento estatístico de misturas nas quatro estações.
Figura 26: Absorvâncias máximas obtidas no perfil espectral da cumarina para cada
solvente extrator utilizado no planejamento estatístico de misturas no verão (a); outono
(b); inverno (c) e primavera (d). As letras e, a, d, e c correspondem aos solventes etanol,
acetona, diclorometano e clorofórmio, respectivamente.
Na Figura 26a observa-se que as intensidades das absorvâncias máximas
dependem do solvente extrator utilizado. Comparando as absorvâncias obtidas com os
solventes puros, verifica-se que as menores intensidades foram obtidas com o clorofórmio
65
e diclorometano, enquanto que o etanol foi o mais eficiente na extração (2,45x105),
seguido pelas misturas binárias acetona-etanol (2,08x105), clorofórmio-etanol (1,96x105),
e a mistura ternária acetona-diclorometano-etanol (1,65x105). Isto indica que o etanol puro
e algumas interações solvente-solvente envolvendo o etanol em suas composições são
importantes para maximizar a quantidade da cumarina no extrato fracionado do guaco no
verão. O etanol é um solvente anfiprótico com característica predominante de formar
ligações por ponte de hidrogênio.
No outono, Figura 26b, verifica-se que os efeitos das interações entre os solventes
foram mais significativos na extração da cumarina quando comparados aos solventes
puros. Os maiores valores de absorvâncias foram obtidos com as misturas binárias entre
etanol com acetona (1,72x105) e clorofórmio (1,53x105), e a mistura ternária acetona-
diclorometano-etanol (1,23x105). Entre os solventes puros o etanol foi o mais eficiente na
extração (1,40x105).
No inverno, Figura 26c, verifica-se que os extratos preparados com as misturas
binárias clorofórmio-etanol e acetona-etanol apresentaram as maiores intensidades das
absorvâncias máximas no perfil espectral da cumarina, 2,02x105 e 1,96x105,
respectivamente. Elevadas absorvâncias também foram obtidas com as misturas
quaternárias entre os solventes acetona-clorofórmio-diclorometano-etanol, média de
1,31x105. De fato, em todas as estações as misturas quaternárias apresentaram uma boa
eficiência na extração. Comparando os efeitos dos solventes puros, verifica-se que o
etanol apresentou o maior valor (1,65x105), seguido da acetona (1,04x105), diclorometano
(0,48x105) e clorofórmio (0,93x105). Para confirmar estas diferenças nos valores das
intensidades deve-se levar em conta o erro experimental indicado pelas replicatas no
ponto central e calcular os intervalos de confiança.
Na primavera, Figura 26d, a maior intensidade da absorvância máxima foi obtida
com o solvente puro etanol (1,32x105). Entretanto, utilizando este mesmo solvente
extrator no verão, a absorvância obtida foi quase duas vezes maior (2,45x105). Entre as
misturas, boa eficiência na extração da cumarina foi alcançada com as misturas
clorofórmio-diclorometano (0,99x105), seguida das misturas quaternárias (média de
0,97x105), acetona-clorofórmio-etanol (0,95x105) e acetona-etanol (0,87x105).
Para os ácidos fenólicos identificados nas análises por CLUE-EM no modo
negativo de ionização, também foram estudados os efeitos sazonal bem como da
66
composição do solvente extrator na extração desses metabólicos. A Tabela 6 mostra o
valor da intensidade do íon de maior abundância relativa no espectro de massas dos
ácidos o-cumárico e melilótico para cada ponto do planejamento. A média e o desvio
padrão em cada estação são apresentados. A última linha da tabela contém os desvios
padrões dos experimentos realizados em quintuplicatas (r1-r5) e fornecem as estimativas
das incertezas experimentais nos resultados.
Tabela 6: Intensidades dos íons de maior abundância relativa no espectro de massas dos
ácidos o-cumárico e melilótico, obtidas em cada ponto do planejamento de misturas por
CLUE-EM no verão, outono, inverno e primavera.
Fração
Intensidade do Ácido o-cumárico (105)
m/z 163 ([M-H]-)
Intensidade do Ácido Melilótico (105)
m/z 165 ([M-H]-)
Verão Outono Inverno Prim. Verão Outono Inverno Prim.
e 2,67 4,76 8,41 14,59 5,04 8,11 22,73 30,08
a 3,67 5,43 15,64 16,37 0,85 6,36 24,26 25,59
d 0,29 1,04 1,34 1,15 1,41 6,19 7,302 5,05
c 0,51 0,55 0,66 0,95 2,38 3,80 4,980 5,73
ae 4,69 14,22 21,64 21,20 5,38 10,04 33,41 33,74
de 2,69 6,59 13,38 14,43 4,92 27,40 21,09 24,29
ce 2,87 8,96 10,35 19,04 11,58 13,38 15,98 35,20
ad 3,50 1,79 6,85 12,39 5,27 4,19 18,62 22,87
ac 2,95 3,64 7,39 14,71 6,02 6,53 12,45 27,53
cd 0,82 1,47 1,55 0,80 4,51 9,48 10,42 4,14
ade 4,91 3,32 8,98 16,79 12,38 5,16 13,84 32,76
cde 3,79 6,92 8,38 12,27 10,57 12,42 19,09 19,20
ace 5,94 9,32 19,80 19,56 13,97 7,89 35,97 29,79
acd 1,61 3,93 4,22 4,68 3,29 7,54 14,23 9,27
r1 3,90 7,71 11,57 19,67 11,34 6,72 32,27 36,28
r2 5,16 4,02 16,17 23,05 11,66 1,61 25,56 42,36
r3 5,20 7,16 14,09 15,05 12,68 4,18 21,06 26,32
r4 5,21 5,43 20,17 15,32 9,26 4,99 25,94 27,89
r5 5,09 3,25 15,91 25,34 12,78 5,36 29,69 33,19
Média 3,44 5,23 10,87 14,19 7,91 7,97 21,52 23,23
Desvio Padrão 1,71 3,37 6,44 7,44 4,79 5,54 10,75 12,10
Desvio Padrão das
Replicatas 0,57 1,93 3,16 4,58 3,14 1,89 10,52 6,50
67
Para os ácidos identificados, os resultados mostraram que independente da
estação de colheita da planta, as médias das intensidades do íon de maior abundância
relativa referente ao ácido melilótico foram superiores ao do ácido o-cumárico. Além disso,
é evidente o efeito sazonal na extração de ambos os metabólitos. No verão e no outono
os valores das intensidades foram semelhantes, sendo 3,44 (± 1,71)x105 e 5,23 (±
3,37)x105 para o ácido o-cumárico e 7,91(± 4,79)x105 e 7,97 (± 5,54)x105 para o ácido
melilótico, respectivamente. Entretanto, no inverno e na primavera estas intensidades
foram quase três vezes maiores do que as observadas nas demais estações, 10,87 (±
6,44)x105 e 14,19 (± 7,44)x105 para o ácido o-cumárico e 21,52 (± 10,75)x105 e 23,23 (±
12,10)x105 para o ácido melilótico, respectivamente. Para o ácido o-cumárico o efeito
sazonal parece ser significativo o ano todo porque todas as médias de suas intensidades
são significativamente diferentes uma das outras no nível de 99 % de confiança. É
interessante notar que este resultado é o contrário do observado para a cumarina, uma
vez que nas estações verão e outono os extratos apresentaram a máxima quantidade
para esta substância. Sendo o ácido o-cumárico o precursor biossintético da cumarina, é
possível que em uma determinada estação uma alta concentração de um acarrete em
uma diminuição no outro e vice-versa.
Altas correlações significativas com valores de 0,88 e 0,96 foram obtidas entre as
intensidades dos íons de maior abundância relativa para os ácidos o-cumárico e melilótico
no inverno e na primavera, respectivamente.
A Figura 27 mostra os efeitos da composição do solvente extrator nos valores das
intensidades dos íons dos ácidos o-cumárico e melilótico em cada ponto do planejamento
de misturas, nestas estações. Analisando esta Figura verifica-se que os perfis de todos os
quatro gráficos são semelhantes e que as maiores eficiências na extração desses ácidos
são obtidas com as misturas contendo os solventes etanol e a acetona em suas
composições, enquanto que as menores, com os solventes puros clorofórmio e
diclorometano e a mistura binária entre eles. Estes resultados sugerem a existência do
efeito sinérgico entre os solventes e indicam a importância das interações solvente-
solvente para otimizar o processo da extração destes ácidos.
Para confirmar a existência dos efeitos significativos entre os solventes e otimizar a
composição do solvente extrator para a extração da cumarina e dos ácidos melilótico e o-
cumárico em cada estação, a metodologia de superfície de respostas foi aplicada às
68
absorvâncias máximas obtidas no perfil espectral da cumarina, bem como nas
intensidades do íon de maior abundância relativa no espectro de massas referentes aos
ácidos melilótico e o-cumárico. Em todos os casos, os modelos linear, quadrático e cúbico
especial foram testados e a falta de ajuste destas superfícies foram avaliadas com a
ANOVA no nível de 95 % de confiança.
Figura 27: Intensidades dos íons de maior abundância relativa obtidas em cada ponto do
planejamento estatístico de misturas no espectro de massas do ácido o-cumárico no
inverno (a) e na primavera (b), e do ácido melilótico no inverno (c) na primavera (d). As
letras e, a, d, e c correspondem aos solventes etanol, acetona, diclorometano e
clorofórmio, respectivamente.
69
Para os resultados das absorvâncias máximas da cumarina obtidos no verão,
apenas os modelos linear e quadrático foram significativos e não apresentaram falta de
ajuste no nível de 95 % de confiança. O modelo linear foi o escolhido e ajustado aos
dados, porque no modelo quadrático não houve nenhuma interação binária significativa. A
equação para este modelo, está apresentada na equação 5:
510 2.41 0.99 0.92 50.32 0.32 0.32
Cumarina Verão e a c
onde, a = acetona, c = clorofórmio, d = diclorometano e = etanol, e os valores entre
parênteses representam os erros padrões dos parâmetros. No restante deste trabalho
todas as outras equações apresentadas seguem essa mesma notação para os
coeficientes. Os termos que não apresentaram significância no nível de 95 % de confiança
foram omitidos.
No outono, os modelos linear, quadrático e cúbico especial aplicados aos dados
das absorvâncias máximas não apresentaram significância no nível de 95 % de confiança.
Neste caso, para avaliar os resultados foram colocadas às respostas experimentais em
cada ponto do planejamento, Figura 28.
Figura 28: Planejamento experimental Centróide-Simplex com as respostas
experimentais das absorvâncias máximas da cumarina (105) nos extratos fracionados do
guaco obtidos no outono.
70
Nesta Figura observa-se que entre os quatros solventes puros o etanol foi o que
extraiu a maior quantidade da cumarina (1,4x105), seguido da acetona (1,18x105),
diclorometano (1,04x105) e clorofórmio (0,87x105). As maiores eficiências na extração
foram obtidas utilizando-se as misturas binárias acetona-etanol (1,72x105) e clorofórmio-
etanol (1,53x105).
No inverno, apenas o modelo linear foi significativo e não apresentou falta de ajuste
no nível de 95 % de confiança. A equação para este modelo está apresentada na
equação 6:
510 1.89 1.12 0.98 60.33 0.33 0.33
Cumarina Inverno e a c
Na primavera, todos os modelos aplicados às absorvâncias máximas obtidas no
perfil espectral da cumarina não apresentaram significância no nível de 95 % de
confiança. Para avaliar os resultados, em cada ponto do planejamento foram colocadas às
respostas experimentais, Figura 29.
Figura 29: Planejamento experimental Centróide-Simplex com as respostas
experimentais das absorvâncias máximas da cumarina (105) nos extratos fracionados do
guaco obtidos na primavera.
71
Analisando esta figura observa-se que entre os quatros solventes puros o etanol foi
o extrator que extraiu a maior quantidade da cumarina (1,32x105), seguido da acetona
(0,96x105), diclorometano (0,52x105) e clorofórmio (0,34x105). As maiores eficiências na
extração foram alcançadas utilizando-se as misturas clorofórmio-diclorometano
(0,99x105), acetona-clorofórmio-etanol (0,95x105), acetona-etanol (0,87x105) e as misturas
quaternárias (média de 0,97x105).
A Tabela 7 mostra a ANOVA para os modelos lineares ajustados às respostas
experimentais das absorvâncias máximas no perfil espectral da cumarina nos extratos
fracionados do guaco no verão e no inverno. A soma quadrática, graus de liberdade,
média quadrática e valores do teste F calculados são apresentados.
Tabela 7: Análise da variância para os modelos lineares ajustados as respostas
experimentais das absorvâncias máximas no perfil espectral da cumarina nos extratos
fracionados do guaco no verão e no inverno.
Para os modelos lineares ajustados, os valores das razões das MQfaj/MQep são
menores do que o valor da distribuição F3,15 no nível de 95 % de confiança, indicando que
não há falta de ajuste para os modelos. Além disso, os valores das razões MQR/MQr são
maiores se comparadas ao valor da distribuição F com os mesmos números de graus de
Extrato
Fracionado Fonte de variação
Soma
quadrática
(1010
)
Graus de
liberdade
Média quadrática
(1010
) F-calculado F-tabelado
Verão
(linear)
Modelo (R) 3,47 3 1,16 5,70 F3,15,0.05= 3,29
Resíduos (r) 3,04 15 0,20
Falta de ajuste (faj) 2,45 11 0,22 1,50 F11,4;0,05= 5,91
Erro puro (ep) 0,59 4 0,15
Total 6,51 18 0,36
Inverno
(linear)
Modelo (R) 2,49 3 0,83 4,02 F3,15;0,05= 3,29
Resíduos (r) 3,01 15 0,21
Falta de ajuste (faj) 2,14 11 0,19 0,81 F11,4;0,05= 5,91
Erro puro (ep) 9,57 4 0,24
Total 5,59 18 0,31
72
liberdade no nível de 95 % de confiança, indicando que os modelos ajustados são
significativos. Desta forma, os modelos foram validados pela análise de variância
(ANOVA) e permitiu determinar o solvente que extraiu a maior quantidade da cumarina no
processo da extração.
Analisando os coeficientes do modelo obtido no verão, verifica-se que apenas o
diclorometano não foi significativo no nível de 95 % de confiança. Etanol apresentou o
maior valor, prevendo uma absorvância máxima no perfil espectral da cumarina de
2,41x105, que está em boa concordância com o obtido experimentalmente, 2,45x105.
Acetona e clorofórmio apresentaram efeitos similares na extração.
A equação ajustada no inverno mostra novamente que entre os coeficientes
lineares, apenas o diclorometano não apresentou significância no nível de 95 %
confiança, enquanto que o etanol apresentou o maior efeito seguido por acetona e
clorofórmio.
A Figura 30 mostra os resíduos deixados pelos ajustes versus as respostas
previstas pelos modelos, juntamente com os gráficos das respostas previstas pelas
observadas. A distribuição dos resíduos (Figuras 30a, 30c) obtidos no verão e inverno não
revela um comportamento sistemático.
73
Figura 30: Gráficos (a) e (c) correspondem aos resíduos deixados pelo ajuste dos
modelos lineares nas estações verão e inverno, respectivamente. Gráficos (b) e (d)
correspondem às respostas previstas pelas respostas observadas nas estações verão e
inverno, respectivamente.
As curvas de níveis para os modelos ajustados às absorvâncias máximas no perfil
espectral da cumarina nos extratos fracionados nas estações verão e inverno são
mostradas nas Figuras 31a e 31b, respectivamente. O componente diclorometano foi
igualado à zero para representar a superfície de respostas em apenas duas dimensões.
74
Figura 31: Superfícies de respostas (a) e (b) para os componentes; etanol, acetona e
clorofórmio aplicadas as absorvâncias máximas da cumarina nos extratos fracionados do
guaco nas estações verão e inverno, respectivamente.
Pela inspeção visual das superfícies de respostas, observa-se que em ambas as
estações as maiores absorvâncias são obtidas nos vértices dos triângulos utilizando como
extrator o solvente puro etanol. Comparando as absorvâncias previstas, verifica-se que as
maiores intensidades ocorrem no verão, confirmando assim uma maior concentração da
cumarina nesta estação.
De maneira geral, os resultados mostraram que os coeficientes lineares referentes
aos solventes etanol e acetona foram significativos para modelos lineares ajustados no
inverno e no verão. Os coeficientes referentes ao solvente etanol apresentaram um valor
aproximadamente duas vezes maiores do que o da acetona, indicando que ele deve ser o
solvente de escolha para a extração da cumarina na planta Mikania. As Figuras 26a e 26b
mostram que nas estações verão e outono, o solvente etanol foi o mais eficiente na
extração da cumarina quando comparado a qualquer outro solvente puro. Embora as
quantidades extraídas pelas misturas binárias entre os solventes acetona-etanol e
clorofórmio-etanol sejam comparáveis à quantidade extraída pelo etanol, as interações
binárias entre estes solventes não apresentaram significância devido o modelo ajustado
ter sido o linear.
Os dados experimentais das intensidades do íon do ácido o-cumárico foram bem
reproduzidos pelo modelo quadrático, por ser significativo e não apresentar falta de ajuste
no nível de 95 % de confiança. As equações de predição para a quantidade desta
75
substância no verão, outono, inverno e primavera estão apresentadas nas equações 7, 8,
9, e 10 respectivamente:
510 2.24 3.44 11.23 11.02 74.020.95 0.95 4.02
Ácido o cumárico verão e a ae ce
510 5.42 5.97 25.26 21.84 8
2.13 2.13 9.01 9.01
Ácido o cumárico outono e a ae ce
510 914.98 44.323.86 3.86
Ácido o cumárico inverno a ae
510 1013.81 15.95 51.584.14 4.14 17.49
Ácido o cumárico primavera e a ce
A Tabela 8 mostra a ANOVA para os modelos quadráticos ajustados as respostas
experimentais do ácido o-cumárico nas quatro estações. A soma quadrática, graus de
liberdade, média quadrática e valores do teste F calculados são apresentados.
Para todos os modelos quadráticos ajustados, os valores das razões das
MQfaj/MQep são menores do que o valor da distribuição F5,4 no nível de 95 % de confiança,
e não há indicação de falta de ajuste para os modelos. Além disso, os valores das razões
MQR/MQr são maiores se comparados ao valor da distribuição F com os mesmos
números de graus de liberdade no nível de 95 % de confiança, indicando que os modelos
são significativos. Dessa forma, os modelos foram validados pela a análise de variância
(ANOVA) e permitiu determinar o solvente que extraiu a maior quantidade do ácido o-
cumárico no processo da extração.
Para todos os quatro modelos quadráticos ajustados, Eqs. 7–10, observa-se que os
termos lineares referentes aos solventes etanol e acetona são significativamente
diferentes de zero, exceto no inverno, cujo o etanol não apresentou significância no nível
de 95 % de confiança. Entre os solventes puros, a acetona é o extrator mais eficiente na
extração do ácido o-cumárico, porque em todos os modelos ajustados o coeficiente ba foi
76
maior do que o be. De fato, as Figura 27a e 27b mostram que no inverno e na primavera,
respectivamente, a acetona pura extrai uma maior quantidade deste ácido do que o
solvente etanol. A acetona por apresentar um caráter básico e dipolar, é receptora de
prótons, e portanto, interage preferencialmente com os compostos que possuem um
caráter ácido, ou seja, doadores de prótons como, por exemplo, os compostos fenólicos.
Tabela 8: Análise da variância para os modelos quadráticos ajustados as respostas
experimentais das intensidades do íon de maior abundância relativa no espectro de
massas do ácido o-cumárico nos extratos fracionados do guaco nas quatro estações.
Fração
orgânica Fonte de variação
Soma quadrática
(1010
)
Graus de
liberdade
Média quadrática
(1010
) F calculado F tabelado
Verão
(quadrático)
Modelo (R) 44,32 9 4,92 5,28 F9,9,0,05= 3,18
Resíduos (r) 8,40 9 0,93
Falta de ajuste (faj) 7,11 5 1,42 4,41 F5,4,0,05= 6,26
Erro puro (ep) 1,29 4 0,32
Total 52,72 18 2,93
Outono
(quadrático)
Modelo (R) 162,79 9 18,08 3,85 F9,9,0,05= 3,18
Resíduos (r) 42,23 9 4,69
Falta de ajuste (faj) 27,34 5 5,46 1,47 F5,4,0,05= 6,26
Erro puro (ep) 14,90 4 3,72
Total 205,02 18 11,39
Inverno
(quadrático)
Modelo (R) 608,01 9 67,56 4,40 F9,9;0,05= 3,18
Resíduos (r) 138,13 9 15,35
Falta de ajuste (faj) 98,31 5 19,66 1,97 F5,4;0,05= 6,26
Erro puro (ep) 39,83 4 9,97
Total 746,15 18 41,45
Primavera
(quadrático)
Modelo (R) 811,03 9 90,11 5,10 F9,9;0,05= 3,18
Resíduos (r) 159,07 9 17,67
Falta de ajuste (faj) 75,23 5 15,05 0,71 F5,4;0,05= 6,26
Erro puro (ep) 83,84 4 20,96
Total 970,10 18 53,89
77
Nas Equações 7-9 observa-se que a mistura binária acetona-etanol é a mais
eficiente para produzir a maior intensidade do íon do ácido o-cumárico, do que seria
obtida baseado apenas nas propriedades aditivas dos seus componentes puros. No
entanto, o modelo ajustado na primavera não contém a interação sinérgica significativa
entre estes dois solventes. Analisando o gráfico de barras do inverno, Figura 27a, verifica-
se que a quantidade extraída por esta mistura é muito maior do que a quantidade média
extraída pelos solventes puros etanol e acetona.
Na primavera, apenas a mistura binária clorofórmio-etanol apresenta uma forte
sinergia para a eficiência da extração e o modelo prevê uma intensidade de 20,07x105.
Este valor está em boa concordância com obtido experimentalmente que é de 19,04x105.
No verão e no outono esta mistura também foi significativa. Analisando a Figura 27b
verifica-se que o valor da intensidade obtida com esta mistura (19,04x105) é muito maior
do que a média das intensidades obtidas com os solventes puros etanol e clorofórmio
(7,8x105). De fato, a intensidade do íon do ácido o-cumárico obtida empregando o
solvente puro clorofórmio foi somente 0,95x105.
A Figura 32 mostra os resíduos deixados pelos ajustes versus as respostas
previstas pelos modelos, juntamente com os gráficos das respostas previstas pelas
observadas. A Figura mostra também que a distribuição dos resíduos (Figuras 32b, 32d,
32f e 32h ) obtidos em cada estação não revela um comportamento sistemático.
78
Figura 32: Gráficos (a) (c) (e) e (g) dos resíduos e dos (b), (d), (f) e (h) das respostas
previstas pelas respostas observadas nas quatro estações.
79
As curvas de níveis para os modelos ajustados às intensidades do íon de maior
abundância relativa no espectro de massas do ácido o-cumárico nos extratos fracionados
no verão, outono, inverno e primavera são mostradas nas Figuras 33a, 33b, 33c e 33d,
respectivamente. O componente diclorometano ou clorofórmio foi igualado à zero para
representar a superfície em apenas duas dimensões.
Figura 33: Superfícies de respostas (a), (b), (c) e (d) para os componentes; etanol,
diclorometano e acetona aplicadas às intensidades do íon de maior abundância relativa
no espectro de massas do ácido o-cumárico nos extratos fracionados do guaco no verão,
outono, inverno e primavera, respectivamente.
Pela inspeção visual das superfícies de respostas observa-se que os gráficos de
contorno são similares e as maiores intensidades dos íons são obtidas nas arestas dos
triângulos utilizando-se a mistura binária acetona-etanol na proporção 1:1 (v/v). Na
primavera, a superfície de resposta entre os solventes acetona-clorofórmio-etanol, não
80
apresentada neste trabalho, mostra que uma mesma eficiência na extração da substância
é alcançada utilizando a mistura binária clorofórmio-etanol na proporção 1:1 (v/v). De fato,
na Equação 10 observa-se que apenas esta mistura apresentou significância no nível de
95 % de confiança.
Para os resultados das intensidades do íon de maior abundância relativa no
espectro de massas do ácido melilótico obtidos no verão, os modelos quadrático e cúbico
especial foram significativos e não apresentaram falta de ajuste no nível de 95 % de
confiança. O modelo cúbico especial foi o escolhido por apresentar dois termos cúbicos
significativos. A equação para este modelo é apresentada na equação 11.
6.47 6.47 6.47 40.58 40.581.33
5.03 31.96 17.04 18.10 155.61 112.53 11Ácido melilótico Verão e ce ad ac ade ace
No outono, apenas o modelo cúbico especial foi significativo e não apresentou falta
de ajuste no nível de 95% de confiança. A equação para este modelo é apresentada na
equação 12:
8.45 8.45 53.02 53.021.74 1.74 1.74
8.09 6.35 6.18 81.48 30.18 311.94 227.157 12Ácido melilótico Outono e a d ed ec ade ace
No inverno, os modelos linear e cúbico especial foram significativos e não
apresentaram falta de ajuste no nível de 95 % de confiança. O modelo cúbico especial foi
o escolhido por apresentar um termo cúbico significativo. A equação para este modelo é
apresentada na equação 13:
134.754.41 4.41
22.81 24.34 463.11 (13)Ácido melilótico Inverno e a ace
Na primavera, os modelos linear e quadrático foram significativos e não
apresentaram falta de ajuste no nível de 95 % de confiança. O modelo quadrático foi o
escolhido e ajustado aos dados por apresentar um termo quadrático significativo. A
equação para este modelo é apresentada na equação 14:
81
6.78 6.78 28.66
Pr 28.88 24.89 70.55 (14)Ácido melilótico imavera e a ce
A Tabela 9 mostra a ANOVA para os modelos ajustados às respostas
experimentais do ácido melilótico nas frações orgânicas nas quatro estações. A soma
quadrática, graus de liberdade, média quadrática e valores do teste F calculados são
apresentados.
Tabela 9: Análise da variância para os modelos ajustados aos dados da intensidade do
íon de maior abundância relativa no espectro de massas do ácido melilótico nas frações
orgânicas nas quatro estações.
Fração orgânica
Fonte de variação Soma
quadrática (10
10)
Graus de liberdade
Média quadrática (10
10)
F-calculado F-tabelado
Verão
(cúbico
especial)
Modelo (R) 330,93 13 25,46 14,42 F13,5;0,05= 4,65
Resíduos (r) 8,83 5 1,77
Falta de ajuste (faj) 0,74 1 0,74 0,36 F1,4;0,05= 7,71
Erro puro (ep) 8,09 4 2,02
Total 339,75 18 18,89
Outono
(cúbico
especial)
Modelo (R) 537,78 13 41,37 13,73 F13,5;0,05= 4,65
Resíduos (r) 15,07 5 3,01
Falta de ajuste (faj) 0,73 1 0,73 0,20 F1,4;0,05= 7,71
Erro puro (ep) 14,34 4 3,58
Total 552,85 18 30,71
Inverno
(cúbico
especial)
Modelo (R) 1297,74 13 99,83 5,13 F13,5;0,05= 4,65
Resíduos (r) 97,33 5 19,47
Falta de ajuste (faj) 23,88 1 23,89 1,30 F1,4;0,05= 7,71
Erro puro (ep) 73,44 4 18,36
Total 13395,07 18 77,50
Primavera
(quadrático)
Modelo (R) 1864,38 9 207,15 4,36 F9,9;0,05= 3,18
Resíduos (r) 427,40 9 47,49
Falta de ajuste (faj) 258,48 5 51,70 1,22 F5,4;0.05= 6.26
Erro puro (ep) 168,92 4 42,23
Total 2291,78 18 127,32
82
Para todos os modelos cúbico especial e quadrático ajustados, os valores das
razões das MQfaj/MQep são menores do que os valores das distribuições F1,4 e F5,4 no
nível de 95 %, respectivamente. Sendo assim, não há indicação de falta de ajuste para os
modelos. Além disso, os valores das razões MQR/MQr são maiores se comparados aos
valores das distribuições F com os mesmos números de graus de liberdade no nível de 95
% de confiança, indicando que os modelos ajustados são significativos.
Após os modelos apresentados serem validados através da análise de variância
(ANOVA), foi possível interpretar as equações para determinar o solvente ou a mistura de
solventes que permitiu obter uma maior eficiência na extração do ácido melilótico.
Analisando o modelo obtido no verão, verifica-se que entre os coeficientes lineares
apenas o etanol foi significativamente diferente de zero. Isto pode indicar que a extração
do ácido melilótico é favorecida por efeitos de interações sinérgicas entre os solventes. De
fato, três termos de interações binárias e dois de interações ternárias, todos de efeitos
sinérgicos, foram significativos no nível de 95 % de confiança. Dentre os coeficientes de
interações binárias, clorofórmio-etanol é significativamente o que apresenta o maior valor,
enquanto que acetona-diclorometano e acetona-clorofórmio apresentam valores similares,
e consequentemente, equivalência na eficiência da extração. A equação para o modelo
cúbico especial ajustado aos dados prevê uma intensidade de 11,69x105 para o ácido
melilótico extraído com a mistura clorofórmio-etanol na proporção 1:1 (v/v). Este valor está
em ótima concordância com o obtido experimentalmente, de 11,58x105. A equação
mostra também que as misturas ternárias entre os solventes acetona-diclorometano-
etanol e acetona-clorofórmio-etanol apresentam efeitos altamente sinérgicos na extração.
Estas misturas correspondem aos maiores valores das intensidades encontrados para o
ácido melilótico no verão, conforme pode ser visto na Tabela 6.
Na equação ajustada no outono, apenas o termo linear referente ao solvente
clorofórmio não é significativo no nível de 95 % de confiança. Entre os termos lineares,
etanol apresenta o maior efeito, enquanto que os solventes acetona e diclorometano
apresentam efeitos similares. O modelo cúbico especial mostra dois termos de interações
binárias de efeitos sinérgicos entre os solventes diclorometano-etanol e clorofórmio-
etanol. A equação ajustada aos dados prevê uma intensidade de 27,50x105 e 13,49x105
para o ácido melilótico extraído com estas misturas, respectivamente. Estes valores estão
em ótima concordância com o obtido experimentalmente que é de 27,40x105 e 13,38
83
x105, e correspondem aos maiores valores encontrados para o ácido melilótico no outono,
Tabela 6. A equação mostra também que as misturas ternárias entre os solventes
acetona-diclorometano-etanol e acetona-clorofórmio-etanol apresentam efeitos altamente
antagônicos na extração.
Na equação ajustada no inverno, apenas os termos lineares referentes aos
solventes etanol e acetona são significativos e ambos apresentam efeitos similares na
eficiência da extração. A equação mostra também um único termo significativo de
interação ternária entre os solventes acetona-clorofórmio-etanol.
Na primavera, apenas os solventes puros etanol e acetona são significativos e
apresentam eficiências equivalentes na extração do ácido melilótico. O modelo quadrático
ajustado aos dados também apresenta uma interação binária de efeito sinérgico entre os
solventes clorofórmio-etanol. O modelo ajustado aos dados prevê uma intensidade de
35,54x105, que está em boa concordância com o obtido experimentalmente que é de 35,2
x105.
A Figura 34 mostra os resíduos deixados pelos ajustes versus as respostas
previstas pelos modelos, juntamente com os gráficos das respostas previstas pelas
observadas. Conforme a Tabela 9, os modelos de misturas ajustados aos dados preveem
a eficiência da extração do ácido melilótico com a raiz do erro médio quadrático de 1,33
105 no verão, 1,73x105 no outono, 4,41x105 no inverno e 6,89x105 na primavera. O erro
experimental estimado a partir das replicatas são ± 3,14x105 no verão, ± 1,89x105 no
outono, ± 10,52x105 no inverno e 6,50x105 na primavera. A Figura mostra também que a
distribuição dos resíduos (Figuras 34b, 34d, 34f e 34g) obtidos em cada estação não
revela um comportamento sistemático.
84
Figura 34: Gráficos (a) (c) e (e) dos resíduos deixados pelo ajuste dos modelos nas
estações verão, outono, inverno e primavera, respectivamente. Gráficos (b), (d), (f) e das
respostas previstas pelas respostas observadas.
85
As curvas de níveis para os modelos ajustados às intensidades do íon de maior
abundância relativa no espectro de massas do ácido melilótico nas frações orgânicas no
verão, outono, inverno e primavera podem ser vistas na Figura 35a, 35b, 35c e 35d
respectivamente. No inverno, o componente diclorometano foi igualado à zero para
representar a superfície em apenas duas dimensões. Nas demais estações o componente
acetona foi igualado à zero.
Figura 35: Superfícies de respostas (a), (b), (d) para os componentes; etanol, clorofórmio
e diclorometano e (c) para os componentes etanol, clorofórmio e acetona, aplicadas às
intensidades do íon de maior abundância relativa no espectro de massas do ácido
melilótico nas frações orgânicas nas estações verão, outono, inverno e primavera,
respectivamente.
Pela inspeção visual das superfícies de respostas observa-se que no verão, Figura
35a, a maior intensidade do íon referente ao ácido melilótico é obtida na aresta do
triângulo, utilizando a mistura binária entre os solventes etanol-clorofórmio na proporção
86
1:1 (v/v). Uma boa eficiência também é alcançada com a mistura ternária entre os
solventes clorofórmio-diclorometano-etanol, sendo o diclorometano em menor proporção
nesta mistura. Na superfície de resposta entre os solventes acetona-clorofórmio-etanol,
não apresentada neste trabalho, é possível observar que a máxima eficiência é obtida na
região intermediária do triângulo com a mistura ternária entre os três componentes. A
Figura 35b mostra que o melhor solvente extrator no outono é obtido utilizando as
misturas binárias entre os solventes diclorometano-etanol na proporção 1:1 (v/v). A
superfície de resposta obtida no inverno, Figura 35c, mostra que a máxima eficiência na
extração é alcançada com a mistura ternária entre os solventes acetona-clorofórmio-
etanol, sendo o clorofórmio em menor proporção nesta mistura. Uma boa eficiência
também é observada na aresta inferior do triângulo com a mistura binária entre os
solventes acetona-etanol. Por fim, a superfície de resposta obtida na primavera, Figura
35d, mostra que a maior eficiência é alcançada na aresta do triângulo com a mistura
binária entre os solventes clorofórmio-etanol, sendo o etanol em maior proporção nesta
mistura.
De maneira geral pode-se observar que as interações solvente-solvente
envolvendo etanol em sua composição são importantes para maximizar a quantidade do
ácido melilótico nas frações orgânicas em todas as estações.
Como já descrito anteriormente, na literatura nenhum trabalho reportou a presença
do ácido melilótico na Mikania laevigata. O estudo da sequência das transformações
químicas ocorridas na rota biossintética da cumarina66,67 sugere que a formação do ácido
melilótico ocorre em duas etapas por um processo de hidrogenação na molécula da
cumarina e não do ácido o-cumárico, Figura 36.
(a) (b) (c)
Figura 36: Sequências de reações enzimáticas para a conversão da cumarina em ácido
melilótico. (a) cumarina; (b) dihidrocumarina; (c) ácido melilótico.
87
A primeira etapa envolve a hidrogenação da cumarina (a) que forma a
dihidrocumarina (b). Essa reação é muito lenta e parece ser a etapa que limita a
velocidade da via biossintética. Em seguida, pela ação da enzima dihidrocumarina
hidrolase, rapidamente a dihidrocumarina é convertida em ácido melilótico (c), e desta
forma a dihididrocumarina não se acumula nas plantas. Esta enzima está limitada às
espécies que sintetizam ativamente a cumarina70. Isto pode explicar a presença da
dihidrocumarina apenas nos extratos brutos, e após o fracionamento químico nas frações
orgânicas esta foi convertida no ácido melilótico. Há necessidade que estudos de
atividade biológica sejam realizados com esta substância, a fim de verificar os seus
efeitos farmacológicos.
88
89
5. Conclusão
90
91
Os resultados apresentados neste trabalho mostraram a importância do
planejamento de misturas do tipo Centróide-Simplex, aplicado para o estudo e a extração
dos metabólitos secundários em produtos naturais. Embora somente a planta Mikania
tenha sido estudada, com certeza o planejamento de misturas pode ser aplicado em
outros trabalhos a fim de estudar e otimizar as suas condições experimentais.
A partir deste estudo foi possível verificar que quando associada à métodos
quimiométricos, a análise gravimétrica dos extratos brutos e material fracionado do guaco,
extraídos através do planejamento estatístico de misturas, pode fornecer informações
importantes sobre a variação do conteúdo dos metabólitos secundários durante as quatro
estações do ano, que é útil para as aplicações farmacológicas da planta.
Verificou-se que os efeitos sazonais foram significativos para os rendimentos do
extrato bruto e das frações orgânica, básica, polar e fibras. Além disso, os efeitos do
solvente também apresentaram significância para o extrato bruto e as frações, exceto a
fração polar. No estudo dos efeitos das interações sazonal-composição do solvente
extrator, verificou-se pela ANOVA, comparações dos perfis de rendimentos em cada
ponto do planejamento estatístico de misturas, e análise de componentes principais, que
são altamente significativos para as frações orgânicas e fibras. De fato, quatro diferentes
misturas resultaram nos maiores rendimentos das frações orgânicas e fibras em cada
uma das quatro estações.
Na otimização das condições experimentais os resultados indicaram que o perfil
cromatográfico e o número de picos detectados foram consideravelmente afetados pela
força da fase móvel e do comprimento de onda empregado nas análises cromatográficas.
A melhor condição ocorreu em 240 nm com a fase móvel (65:17,5:17,5; v/v/v)
água:metanol:acetonitrila, de força cromatográfica s = 1,0. De modo geral, verificou-se
que as interações moleculares existentes nas misturas que mais eficientemente
resultaram nos maiores números de picos nas análises das frações, são aquelas que
possuem diferentes parâmetros de acidicidade, basicidade e dipolaridade. Assim, o
triângulo de seletividade aplicado em estudos cromatográficos poderá ser útil no
planejamento mais eficiente da extração com solventes para outras amostras.
No estudo comparativo dos perfis espectrais dos picos detectados por CLAE-DAD,
realizado para os extratos brutos e frações orgânicas, verificou-se que a época de colheita
da planta influência na concentração e também na detecção das diferentes classes de
92
substâncias. A cumarina, substância utilizada como marcador químico em formulações
farmacêuticas, foi detectada em todas as amostras analisadas e de modo geral, foi
possível verificar que embora o efeito sazonal não tenha alterado de forma significativa o
perfil cromatográfico qualitativo, o perfil cromatográfico quantitativo foi altamente
influenciado por esta variável.
Nas análises das frações orgânicas, os resultados indicaram que o efeito sazonal é
significativo para a extração da cumarina e os ácidos o-cumárico e melilótico. A maior
eficiência na extração da cumarina foi obtida no verão utilizando o solvente puro etanol,
enquanto que para os ácidos o-cumárico e melilótico, foram na primavera e inverno
empregando as misturas binárias ou ternárias contendo em sua composição os solventes
etanol, acetona e clorofórmio. Isto demonstra a importância do planejamento estatístico de
misturas aplicado para à obtenção de metabólitos secundários no guaco.
De modo geral, pode-se inferir que de fato existe variação na composição e
concentração dos metabólitos secundários do guaco em função das estações do ano, que
provavelmente são causadas pelo estado fenológico da planta e de outros eventos físicos
e ecológicos relacionados. Portanto, estas diferenças sazonais justificam os resultados
gravimétricos, sendo que os maiores rendimentos do extrato bruto e frações foram obtidos
com diferentes solventes extratores. No entanto, no estudo dos metabólitos secundários
majoritários, como por exemplo, a cumarina que é o princípio ativo do guaco, verificou-se
que apesar da variação dos seus teores em função da época de colheita da planta, o
solvente extrator mais eficiente na extração permanece o mesmo para todas as estações.
Desta forma, este trabalho apresenta significativa contribuição para a padronização dos
extratos e frações do guaco, bem como, para às suas fito-preparações.
93
6. Referências
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63. C. dos Santos, C.L. Krueger, A.A. Steil, M.R. Krueger, M.W. Biavatti, J.A. Wisniewski, LC characterisation of guaco medicinal extracts, Mikania laevigata and Mikania glomerata, and their effects on allergic pneumonitis, Planta Med. 72 (2006) 679-684. 64. J.R.S. Hoult, M. Paya, Pharmacological and biochemical actions of simple coumarins: Natural products with therapeutic potential, Gen. Pharmacol. 27 (1996) 713-722. 65. Y.H. Gu, K. Xue, Direct oxidative cyclization of 3-arylpropionic acids using PIFA or oxone: synthesis of 3, 4-dihydrocoumarins, Tetrahedron Lett. 51 (2010) 192-196. 66. A. Bye, H.K. King, The Biosynthesis of 4-Hydroxycoumarin and Dicoumarol by Aspergillus fumigatus Fresenius, Biochem. J. 117 (1970) 237-245. 498 67. J.R. Stoker, D.M. Bellis, The Biosynthesis of Coumarin in Melilotus Alba, J. Biol. Chem. 237 (1962) 2303-2305. 68. S.K.V. Bertolucci, A.B.D. Pereira, J.E.B.P Pinto, J.A.A Ribeiro, A.B de Oliveira, F.C. Brada, Development and validation of an RP-HPLC method for quantification of cinnamic acid derivatives and kaurane-type diterpenes in Mikania laevigata and Mikania glomerata, Planta Med. 75 (2009) 280-285. 69. S.K.V. Bertolucci, A.B.D. Pereira, J.E.B.P. Pinto, A.B. Oliveira, F.C. Braga, Seasonal variation on the contents of coumarin and kaurane-type diterpenes in Mikania laevigata and M. glomerata leaves under different shade levels, Chem. Biodivers. 10 (2013) 288-295
70. W.R. Akeson, H.J. Gorz, F.A. Haskins, Effect of genotype and growth stage on distribution of Melilotic acid, o Coumaric acid, and Coumarinic acid in Melilotus alba Desr, Crop Science 3 (1963) 167-171.
101
7. Anexos
102
103
ANEXO 1
7.1 Números de picos detectados nas análises cromatográficas das amostras dos extratos brutos e frações orgânica e básica no verão, outono e
inverno.
Extratos
Extrato Bruto Fração Orgânica Fração Básica
Verão Outono Inverno Verão Outono Inverno Verão Outono Inverno
210 240
(nm)
272
210 240
(nm)
272 210 240
(nm)
272 210 240
(nm)
272 210 240
(nm)
272 210 240
(nm)
272 210 240
(nm)
272 210 240
(nm)
272 210 240
(nm)
272
e 7 11 4 6 8 8 4 9 5 7 11 1 7 15 4 3 6 6 4 7 5 4 5 5 4 3 7
a 6 9 4 9 12 8 4 10 3 11 15 1 7 12 5 6 9 6 12 11 11 5 6 4 3 4 3
d 7 12 2 9 11 6 5 8 3 7 12 2 8 16 6 5 4 4 3 8 5 4 7 6 4 4 5
c 6 14 8 10 11 12 9 12 5 12 11 5 9 14 4 8 9 6 10 14 10 6 9 6 7 4 7
ae 7 9 4 11 15 8 4 8 6 8 9 2 8 14 5 7 8 5 10 8 8 7 7 5 6 7 5
de 10 9 4 8 10 10 6 11 6 8 16 3 7 14 7 4 12 5 9 13 7 3 5 3 5 5 5
ce 7 10 6 7 9 10 7 9 7 11 14 2 8 12 5 8 9 6 7 10 5 3 6 3 4 13 4
ad 6 10 3 7 9 4 4 7 8 10 17 2 7 15 4 4 12 4 9 8 7 4 8 7 5 5 5
ac 7 7 2 7 11 4 4 10 4 7 17 3 7 15 4 4 9 2 11 11 10 7 11 9 5 8 7
cd 5 14 2 5 7 7 5 7 4 9 15 2 7 12 4 6 7 4 7 10 10 5 8 8 9 11 10
ade 7 14 5 7 12 7 6 12 7 12 15 4 9 15 4 7 9 6 11 12 11 4 10 6 3 6 3
cde 7 15 5 9 11 8 7 11 5 9 13 6 9 12 9 5 6 5 7 7 3 2 7 5 5 3 3
ace 6 14 4 8 11 6 6 11 6 10 15 3 8 15 4 4 10 4 7 13 9 4 8 4 4 9 3
acd 7 5 4 7 11 7 7 10 4 13 16 8 6 12 7 6 7 3 13 18 9 5 8 7 6 6 5
r1 9 10 3 9 13 7 6 12 4 11 12 2 6 11 3 4 8 4 7 16 8 5 10 7 6 6 8
r2 7 11 3 9 15 7 5 13 7 6 15 2 5 10 4 4 5 3 13 14 9 5 5 4 5 8 4
r3 7 11 3 8 14 8 7 12 5 9 13 1 8 11 6 5 6 3 10 13 9 6 7 7 6 5 7
r4 10 14 4 7 16 5 8 10 8 9 13 3 9 12 3 5 7 4 11 15 6 6 9 5 4 3 3
r5 7 9 5 5 14 6 6 9 6 9 12 2 8 10 4 7 6 4 8 11 7 4 4 2 6 3 6
