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Estudos sobre imunidade inata no mosquito Aedes aegypti.

Maria Clara Leal Nascimento Silva

Dissertação de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Química Biológica, do Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Química Biológica.

Orientador: Marcos Henrique Ferreira Sorgine Professor Adjunto do Instituto de Bioquímica Médica - IBqM - UFRJ Co-orientador: Pedro Lagerblad Oliveira Professor Titular do Instituto de Bioquímica Médica - IBqM - UFRJ

Rio de Janeiro

Junho de 2008

 

LOMBADA

 MARIA CLARA LEA

L NASCIMENTO SILV

A 

Ativação do sistem

a imune inato no 

mosquito A

edes aegypti. 

UFRJ 

2008 

II

 

III

 

Maria Clara Leal Nascimento Silva

Estudos sobre imunidade inata no mosquito Aedes aegypti.

Nascimento-Silva. Rio de Janeiro, 2008. Número de páginas fls. 210

Dissertação (Doutorado em Química Biológica)/UFRJ/Instituto de Bioquímica

Médica/Programa de Pós-Graduação em Química biológica, 2008.

Orientador: Marcos Henrique Ferreira Sorgine. Co-orientador: Pedro Lagerblad de Oliveira.

Referências bibliográficas: f. 210

1. Aedes aegypti. 2. Imunidade inata. 3. Vírus. 4. Hematofagia

I Sorgine, Marcos Henreique Ferreira. II. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Bioquímica Médica, Programa de Pós-Graduação em Química Biológica.

III. Título.

IV

 

FICHA DE APROVAÇÃO

Estudos sobre imunidade inata no mosquito Aedes aegypti

Maria Clara Leal Nascimento Silva

Dissertação de Doutorado submetida ao Programa de Pós-graduação em Química Biológica, do Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Química Biológica.

Aprovada por:

________________________________________________________________

Paulo Filemon Paolucci Pimenta Doutor em Ciências Biológicas (Biofísica) pela Universidade de Federal do Rio de Janeiro (1987) e

Pesquisador Titular da Fundação Oswaldo Cruz, Centro de Pesquisas René RachouMembro Externo

________________________________________________________________

Sirlei Daffre Doutora em Ciências Biológicas (Bioquímica) pela Universidade de São Paulo (1988) e Professora da

Universidade de São Paulo Membro Externo

________________________________________________________________

Yara Maria Traub-Cseko Doutora em Biologia Molecular pela Columbia University, CUNYC (1977) e Pesquisador Titular da

Fundação Oswaldo Cruz Membro Externo

________________________________________________________________

Eleonora Kurtenbach Doutora em Ciências Biológicas (Biofísica) pela Universidade Federal do Rio de Janeiro em 1988 e

Professora Associada do Instituto de Biofísica/UFRJ. Revisor e Suplente Interno

________________________________________________________________

Alexandre Afrânio Peixoto Doutor em Genética pela Universidade de Leicester, Reino Unido em 1993 e Pesquisador Titular do Instituto Oswaldo Cruz/Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular/FIOCRUZ/Laboratório

de Biologia Molecular de Insetos. Suplente Externo

________________________________________________________________

Marcos Henrique Ferreira Sorgine Doutor em Química Biológica pela Universidade Federal do Rio de Janeiro em 2001 e Professor

Adjunto do Instituto de Bioquímica Médica/UFRJ. Orientador

________________________________________________________________

Pedro Lagerblad Oliveira Doutor em Química Biológica pela Universidade Federal do Rio de Janeiro em 1990 e Professor Titular

do Instituto de Bioquímica Médica/UFRJ. Co-orientador

Rio de Janeiro,

V

 

O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Artrópodes Hematófagos do Instituto de Bioquímica Médica da Universidade Federal do Rio de Janeiro, sob a orientação do Professor Marcos Henrique Ferreira Sorgine e co-orientação do Professor Pedro Lagerblad de Oliveira, na vigência de auxílios concedidos pela FAPERJ (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro), pelo CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico), PADCT-CNPq (Programa de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico), PRONEX (Programa de Apoio a Núcleos de Excelência), John Simon Guggenheim Memorial Foundation e HHMI (Howard Hughes Medical Institute).

VI

 

"No esforço para compreender a realidade, somos como um homem tentando

entender o mecanismo de um relógio fechado. Ele vê o mostrador e os ponteiros,

ouve o seu tique-taque mas não tem meios para abrir a caixa. Se esse homem for

habilidoso, poderá imaginar um mecanismo responsável pelos fatos que observa,

mas nunca poderá ficar completamente seguro de que sua hipótese seja a única

possível." (Albert Einstein)

"Toda a nossa ciência, comparada com a realidade, é primitiva e infantil - e, no

entanto, é a coisa mais preciosa que temos." (Albert Einstein)

VII

 

Um galo sozinho não tece uma manhã: ele precisará sempre de outros galos.

De um que apanhe esse grito que ele e o lance a outro; de um outro galo que apanhe o grito de um galo antes e o lance a outro; e de outros galos que com muitos outros galos se cruzem os fios de sol de seus gritos de galo, para que a manhã, desde uma teia tênue, se vá tecendo, entre todos os galos.

À todos que me ajudaram e apoiaram nessa

jornada... Tenho certeza de que sem toda

essa ajuda não teria sido possível chegar

viva no final! Muito obrigada!

VIII

 

Agradecimentos 

Eu não tinha idéia do quanto seria difícil escrever esse agradecimento até

realmente tentar começar. Tanta coisa aconteceu, tanto tempo se passou, tantas

pessoas fundamentais... me sinto totalmente incapaz de retribuir em palavras todo o

apoio e a importância que essas pessoas tiveram nesse trabalho e na minha vida de

uma forma geral.

Mas, de algum modo, tenho certeza que cada uma delas sabe exatamente o

tamanho do meu amor e da minha gratidão.

Preciso começar agradecendo àquelas pessoas que são a base de todo esse

trabalho: meus orientadores!

Ao Marcos, assim como no mestrado, por TUDO. Não existe modo de resumir

em algumas linhas a importância que você tem na minha vida. Obrigada por

acreditar em mim, mesmo quando eu mesma não consegui. Pelo seu otimismo

exagerado e por não querer me matar por reclamar de tudo o tempo todo!! Por ser

muito mais que um bom orientador, mas um amigo de verdade.

Ao Pedro, pela maneira que ele enxerga a ciência e traduz ela pra gente. Por

todas as discussões, no laboratório ou no bloco A, fossem elas sobre o trabalho em si,

o sentido da vida científica ou o sexo dos anjos! Sua amizade, sua preocupação e sua

presença constante foram muito importantes pra mim! Obrigada por tornar o

laboratório a nossa segunda casa e por mostrar que mais importante ainda do que

fazer algo bem feito é fazer bem feito e com prazer!

E por falar em ter prazer para trabalhar, não posso deixar de agradecer

imediatamente as minhas alunas de IC, que além de me ajudarem incrivelmente nos

experimentos, me proporcionaram o maior prazer de todos, o de ensinar!

À Bia e à Luciana, por todos os experimentos que fizemos juntas e,

principalmente, por todos os que vocês fizeram sozinhas! Ver vocês aprendendo as

coisas e crescendo nesse mundo da ciência foi, sem dúvida, a melhor parte de tudo

isso!! Muito obrigada!!

IX

 

Aos outros alunos que eu orientei, mas não ficaram no laboratório, ou apenas

não continuaram trabalhando diretamente comigo, o mesmo agradecimento pela

experiência maravilhosa e pela companhia de vocês! Luiza, Aline e Renata, Bia 1 e

Ana Carolina, muito obrigada, meninas!!

Algumas pessoas estiveram tão presentes nesses quatro anos de trabalho que

parecem fazer parte do trabalho propriamente dito. Tenho certeza que a ajuda e o

incentivo delas foi muito mais que importante e elas merecem todo o agradecimento

do mundo!

À Gabi e ao Marcus, por todas as idéias e as discussões sobre o projeto. Por

estarem sempre dispostos a ajudar quando foi necessário e por serem um exemplo

tanto profissional quanto pessoal para mim!

Ao Aurélio, pelo seu incentivo incondicional... Obrigada por me ouvir

reclamar e sempre saber exatamente dizer o que eu precisava ouvir pra seguir

adiante! Por acreditar em mim acima de qualquer coisa sempre. Por me mostrar que

o mundo pode ser sempre muito maior do que o que conhecemos, e é nossa

obrigação explorá-lo cada vez mais!

À Liliane, minha maior companheira de desespero... Mais uma vez passamos

por esse período maluco de incertezas e preocupações juntas, amiga!! Tenho certeza

de que tudo dará certo como na ultima vez! Mesmo no período que você estava mais

longe, a sua amizade sempre foi muito importante. Dividimos preocupações,

correrias, prazos, angústias... mas compartilhamos muitos bons momentos também!

E, com certeza, tudo ficou bem mais fácil e mais alegre por ter você por perto!! Muito

obrigada por ser essa pessoa tão especial!!

À Kath, por fazer daquele laboratório o lugar mais divertido do mundo –

porque qualquer lugar com a Kath é o lugar mais divertido do mundo!! Amiga, a sua

alegria e o seu bom humor são o maior presente que eu poderia ter! Obrigada por ser

essa amiga maravilhosa em todas as horas, dentro e fora do laboratório, uma

companheira de verdade. E não se preocupe, amizades assim não acabam nunca,

viu??

À Lulu, minha amiga feliz, pela companhia constante na bancada! Por todos

os experimentos que fizemos juntas, por todas as placas que pipetamos em conjunto!

X

 

Nosso trabalho em equipe funcionava tão bem que uma nem precisava falar pra

outra o que tinha que fazer em seguida!! Você fez muita falta no último ano, Lu!!

Espero que agora possamos voltar a pipetar plaquinhas lado a lado!!

À Aninha, que apesar de não estar mais presente no laboratório, sempre vai

fazer parte dele pra mim. A gente começou esse caminho juntas, há muitos anos

atrás, e apesar de todas as dificuldades e todas as pedras que encontramos, vamos

terminar ele juntas também, amiga!! Muito obrigada por ser essa pessoa fantástica,

sempre disposta a fazer qualquer coisa pra tornar a minha vida menos complicada!

Você é muito especial pra mim, garota!!

À todos os outros amigos do laboratório, por tornar nosso ambiente de

trabalho um lugar mais agradável, apesar de ser no sub-sub-solo! Chris, Tiago,

Renatinha, Zé, Renata, Juliana, Elen, Joana, Donato, João Paulo, Ana Caroline,

Carolzinha, Milane, Raquelzinha, Vanessa, Hana, Fabi, Cecília e outros que eu devo

ter esquecido!

À todos do Laboratório de Biologia Molecular, nossos companheiros de

bancada, pela convivência agradável e pela infinitas discussões nos seminários de

terça feira!

À todos os amigos do Instituto, que de alguma forma participaram da minha

vida nos últimos anos, tanto profissionalmente, como nos momentos de

descontração!

À porfa Eleonora, pela atenção durante o acompanhamento e a revisão desta

tese.

Aos membros da banca, Profa Sirlei Daffre, Profa Yara Traub-Cseko, Prof Paulo

Pimenta e Prof. Alexandre Peixoto, que tão gentilmente aceitaram ler esse trabalho e

avaliá-lo.

As pessoas de fora do laboratório também tiveram uma valiosa participação

neste trabalho, afinal de contas, ninguém trabalha bem se não está feliz!

Ao pessoal da faculdade, Paulinha, Bruno, Si, Paulo, Chico, Marcelo, Maria,

Chirs, Lulu, Aninha, Lele... por tudo o que passamos juntos, durante e depois da

faculdade! E por tudo o que ainda vamos passar!!

XI

 

Aos meus amigos mais antigos, aquele que já viraram família, não precisa nem

dizer o quanto amo todos vocês!

Dani (minha marida) e Paulinha, não existem palavras para explicar nossa

amizade... ela supera qualquer exemplo que eu consiga pensar! Muito obrigada por

fazerem parte da minha vida sempre, de perto ou de longe! Estaremos sempre juntas,

amigas, não importa como! Bobba, Livoca, Tati, Nathinha, sem vocês o mundo seria

um lugar tão mais triste!! Amo todas vocês demais!

Aos meus irmãozinhos, Luiz e João, por simplesmente serem parte da pessoa

que eu me tornei. Muito difícil imaginar como seria minha vida sem vocês!

Ao quarteto fantástico, é claro! Eu nunca poderia deixar de agradecer à vocês

quatro por toda a diversão, toda a cachaça, todas as missas e as risadas! Pela musica

boa no domingo de noite, pela piscina aquecida e pela infinita quantidade de besteira

que vocês são capazes de falar por unidade de tempo! Se o quesito for abobrinhas,

vocês realmente valem por quatro!!!!

Ao Rafael, por ter aparecido na minha vida bem na hora certa. A sua presença

e a sua alegria nos últimos meses me fizeram ver o quanto o mundo pode ser um

lugar maravilhoso! Obrigada por me aturar nesse período estressante e corrido,

trabalhando quase tanto quanto você...!!! Obrigada por tudo de bom que você trouxe

pra minha vida, e olha que essa lista não é nada pequena! Como eu já te disse antes,

perto de você todo dia é um dia de sol, mesmo que esteja chovendo!

E, finalmente, agradeço à minha família. Meus primos, minha irmã, meus

sobrinhos, meus avós, à essas pessoas que sempre me apoiaram e incentivaram meus

sonhos malucos de ser cientista desde pequenininha!

E, especialmente, um muito obrigada gigante ao meu pai e à minha mãe. Por

serem pessoas incríveis e terem me dado todo o tipo de suporte e carinho que uma

pessoa pode sonhar na vida! Pela paciência nas crises, pela paciências nas festas, pela

atenção incondicional. Mas, acima de tudo, pela visão incrível do mundo que vocês

têm, e por dividir essa visão comigo. Amo vocês mais que tudo!!!

XII

 

LISTA DE ABREVIATURAS

AMPs: “antimicrobial peptides” ou peptídeos antimicrobianos

Arbovírus: “arthropod-born virus” ou vírus nascidos em artrópodes

BSA: Albumina bovina

cDNA: ácido desoxiribonucleico complementar

Ct: “Cycle Threshold”

DAI: Dias após a infecção

DCV: Vírus C de Drosophila

DENV: Vírus da dengue

Dif: “dorsal immune factor” ou fator imune homólogo àdorsal

DMSO: dimetilsulfóxido

DXV: Vírus X de Drosophila

H2O2: peróxido de hidrogênio

HO: heme oxigenase

IkB: Inibidor do NF-kB

IKK: Quinase do inibidor de NF-kB

IL-1R: Receptor e Interleucina-1

IMD: “Immune deficiency” ou deficiência imunológica

JAK: Janus quinase

JEV: Vírus da encifalite Japonesa

JNK: Jun N-terminal quinase

LPS: lipopolisacarídeos

LRRs: “Leucine rich repeats” ou repetições ricas em Leucina

mRNA: ácido ribonucleico mensageiro

NF-kB: “nuclear factor kappa B”

Nrf2: “nuclear factor erythroid-2 related factor 2” ou fator nuclear relacionado ao

fator eritróide-2

OH•: radical hidroxila

XIII

 

PAMPS: “ Pathogens associated molecular patterns” ou padrões moleculares

associados a patógenos

PCR: reação em cadeia da polimerase

PGRPs: “Peptidoglycan recognition proteins” ou proteina de reconhecimento de

peptideogicanos

PKC: “protein kinase C” ou proteína quinase C

PM: Matriz peritrófica

PRRs: “pattern recognition receptor” ou receptors de reconhecimento de padrões

R•: radical alquil

RE: Retículo endoplasmático

RIP: “receptor interaction protein”

RNA: ácido ribonucleico

RNAse: ribonuclease

RO•: radical alcoxil

ROO•: radical peroxil

ROOH: hidroperóxido orgânico

ROS: “reactive oxygen species” ou espécies reativas de oxigênio

RP 49: Proteína Ribossoma de A. aegypti

rtPCR: “retro transcribed polymerase chain reaction” ou reação em cadeia da

polimerase por transcrição reversa

SBTI: inibidor de tripsina de soja

SDS: dodecil sulfato de sódio

SINV: Vírus Sindbis

SnPP IX: Estanho portoporfirina IX

STAT: “Signal Transducers and Activators of Transcription” ou Transdutor de sinal e

ativados de transcriçao

TEP: “thioester-containing protein” ou proteína rica em thio-ester

TIR: “Toll/interleukin-1 receptor”

TLRs: “Toll like receptors” ou receptores do tipo Toll

TM: temperatura de desnaturação

TOR: “Target of Rapamycin” ou alvo de rapamicina

XIV

 

WNV: Vírus West Nile

YFV: Vírus da febre amarela

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – O ciclo de vida de Aedes aegypti

Figura 2 – O vírus da Dengue

Figura 3 – Ciclo replicativo dos Flavivirus

Figura 4 – Mapa da distribuição mundial da dengue

Figura 5 – Mapa da presença de dengue no Brasil

Figura 6 – Vírus Sindbis

Figura 7 – Esquema de replicação do genoma do vírus Sindbis

Figura 8 – Esquema das Barreiras de transmissão de patógenos

Figura 9– Aparelho digestivo de A aegypti.

Figura 10: Heme e geração de estresse oxidativo

Figura 11– Resumo esquemático simplificado mostrando as três principais vias de

ativação do sistema imune inato em Drosophila melanogaster

Figura 12 – Representação esquemática de proteínas da família NF-kB/REL e IkB

Figura 13 – Receptores Toll em D. melanogaster e em mamíferos

Figura 14 – Esquema comparando a ativação da via Toll em mamíferos e em D.

melanogaster.

Figura 15 – Esquema das via Toll e IMD em Drosophila melanogaster

Figura 16 – Evolução Gráfico mostrando ortólogos de genes entre Aedes aegypti,

Anopheles gambie e D melanogaster

Figura 17 – Genes e famílias gênicas envolvidas nas vias Toll e IMD

Figura 18 – Gráfico representativo de uma corrida de PCR em tempo real

Figura 19 – Expressão relativa de aaREL 1 nos diferentes estágios de vida do

mosquito Aedes aegypti e nos diferentes tecidos da fêmea adulta alimentada com

sangue.

Figura 20 – Expressão relativa de Cactus nos diferentes estágios de vida do mosquito

Aedes aegypti e nos diferentes tecidos da fêmea adulta alimentada com sangue

XV

 

Figura 21 – Expressão relativa de MYD 88 nos diferentes estágios de vida do

mosquito Aedes aegypti e nos diferentes tecidos da fêmea adulta alimentada com

sangue

Figura 22 – Expressão relativa de Serpina nos diferentes estágios de vida do

mosquito Aedes aegypti e nos diferentes tecidos da fêmea adulta alimentada com

sangue

Figura 23 – Expressão relativa de IMD nos diferentes estágios de vida do mosquito

Aedes aegypti e nos diferentes tecidos da fêmea adulta alimentada com sangue

Figura 24 – Expressão relativa de aaRel 2 nos diferentes estágios de vida do mosquito

Aedes aegypti e nos diferentes tecidos da fêmea adulta alimentada com sangue

Figura 25 – Expressão relativa de Defensina nos diferentes estágios de vida do

mosquito Aedes aegypti e nos diferentes tecidos da fêmea adulta alimentada com

sangue.

Figura 26 – Expressão relativa de STAT nos diferentes estágios de vida do mosquito

Aedes aegypti e nos diferentes tecidos da fêmea adulta alimentada com sangue

Figura 27 – Expressão relativa de TEP nos diferentes estágios de vida do mosquito

Aedes aegypti e nos diferentes tecidos da fêmea adulta alimentada com sangue.

Figura 28 – Infecção de células C6/36 com vírus Dengue.

Figura 29 – Infecção de células C6/36 com vírus Sindbis.

Figura 30 – Infecção mosquitos Aedes aegypti com vírus Sindbis

Figura 31 – Infecção mosquitos Aedes aegypti com vírus Sindbis – quarto dias após a

alimentação.

Figura 32 – Ativação das principais vias do sistema imune inato em fêmeas de Aedes

aegypti após a alimentação

Figura 33 – Captação de um análogo fluorescente de heme, a Sn-protoporfirina, por

células C6/36.

Figura 34 – Viabilidade de células C6/36 incubadas com heme e DMSO

Figura 35 – Ativação de aaREL 1 e aaREL 2 por heme em C6/36.

Figura 36 – Ativação das principais vias do sistema imune inato em fêmeas de Aedes

aegypti após a infecção com solução de esferas de látex.

XVI

 

Figura 37 – Ativação das principais vias do sistema imune inato em fêmeas de Aedes

aegypti após tratamento com antibióticos

Figura 38 – Quantificação viral em mosquitos Aedes aegypti alimentados com solução

de látex ou antibióticos.

Figura 39: Esquema da Conclusão

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Oligonucleotídeos utilizados para quantificação relativa por PCR em

tempo real

Tabela 2 – Eficiência dos oligonucleotídeos

XVII

 

Resumo 

Nascimento-Silva, Maria Clara Leal. Estudos sobre imunidade inata no mosquito Aedes

aegypti. Rio de Janeiro, 2008. Dissertação de Doutorado, Programa de Pós-graduação em

Química Biológica, Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro

– UFRJ, 2008.

Artrópodes são importantes vetores de parasitas e vírus responsáveis por

doenças de grande relevância para a saúde humana, como a malária, a Dengue e a febre amarela. No entanto, muito pouco é conhecido sobre como o sistema imune inato de insetos responde a infecções por vírus. No mosquito A. aegypti, infecções por fungos predominantemente ativam a via Toll, através do fator de transcrição aaREL 1, enquanto a via IMD é ativada por bactérias, pela regulação do fator de transcrição AaREL 2. A via JAK/STAT também parece estar relacionada com o controle de patógenos nesses organismos, regulando a expressão de proteínas semelhantes as do sistema complemento, como, por exemplo, TEP 1, em D. melanogaster.

Neste trabalho nos analisamos o perfil de expressão de nove genes ligados ao sistema imune, em diferentes estágios do ciclo de vida do mosquito, e diferentes tecidos da fêmea adulta, 24 horas após a alimentação com sangue.

Alem disso, observamos que os três fatores de transcrição das principais vias relacionadas ao sistema imune inato em invertebrados (aaREL 1,aaREL2 e STAT) estão super-expressos 24 horas após a alimentação com sangue, mas não após a alimentação com albumina bovina (BSA) ou esferas de látex. Após a infecção com o vírus Sindbis foi observado um aumento na expressão desses mesmos genes em células C6/36 e em mosquitos adultos. Utilizando um sistema in vitro, mostramos que células C6/36 são capazes de captar heme e a expressão de aaREL 1 e aaREL 2 se encontra aumentada após 24 horas de incubação com esta molécula.

Mosquitos tratados com antibióticos, por quatro dias antes da alimentação, apresentaram uma expressão reduzida de aaREL 2, mas não de aaREL 1 e STAT. Quando analisamos a carga viral nos mosquitos infectados após o tratamento com antibióticos ou utilizando a solução de látex como veiculo no lugar do sangue, encontramos uma quantidade muito elevada em comparação com mosquitos infectados com sangue sem nenhum tipo de tratamento.

Esses resultados sugerem que a alimentação com sangue, por si só, é capaz de ativar as vias do sistema imune inato e que a super-expressão de aaREL 2 parece ser devido ao aumento da microbiota intestinal do mosquito, afetando profundamente na carga viral após a infecção por Sindbis.

XVIII

 

Abstract

Nascimento-Silva, Maria Clara Leal. Estudos sobre imunidade inata no mosquito Aedes

aegypti. Rio de Janeiro, 2008. Dissertação de Doutorado, Programa de Pós-graduação em

Química Biológica, Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro

– UFRJ, 2008.

Diseases caused by arthropod-born virus are significant health problems, and novel control methods are required to block pathogen transmission. An important fact that preclude this goal is that little is known about Aedes aegypti responses to viral infection. Innate immune responses are mediated by signaling pathways, activated after specific cell-pathogens interactions. In the mosquito A. aegypti, infections by fungi are known activators of the toll pathway, through NF-Kb related transcription factor Rel 1, while bacteria mostly activate the IMD pathway, that operates through a different NF-Kb othologous protein, Rel 2. The JAK/STAT pathway is also related to pathogen clearance, a process that occurs by the regulation of complement-like humoral proteins, such as TEP1 in Drosophila.

In this work we analyzed the expression profile of nine immune-related genes in different stages of the mosquito life cycle and in different organs of the blood fed female.

Furthermore we observed that three major mosquito immune-related transcription factors (aaREL 1, aaREL 2 and STAT) are up regulated 24 hours after blood meal but not after albumin (BSA) or latex feeding. After sindbis virus infection an additional increase in these same genes could be observed by real time PCR .Using an in vitro system, we were able to show heme uptake by C6/36 Aedes albopictus cells and an upregulation of aaREL 1 and aaREL 2 after 24 hs incubations.

Mosquitoes treated four days with antibiotics before infection showed a reduced expression of REL 2, but not of REL 1 and STAT mRNA levels. Interestingly, sindbis infected mosquitoes pre-treated with antibiotics, as well as mosquitoes infected through an artificial latex meal, instead of blood, showed an increase in the viral load four days after infection when compared with mosquitoes infected with a normal blood meal.

These results suggest that the blood meal per se is able to activate innate immune pathways and the upregulation of REL 2 seems to be mediated by the gut microbiota, profoundly affecting viral loads in Aedes aegypti.

  

XIX

 

ÍNDICE

Lista de abreviações

Lista de Figuras

Lista de Tabelas

Resumo

Abstract

1 - INTRODUÇÃO

1.1 - Doenças transmitidas por vetores 21

1.2 - O mosquito Aedes aegypti 22

1.3 - O gênero flavivirus 25

1.4 – Dengue 28

1.5 – Sindbis 32

1.6 – Competência Vetorial 37

1.7 - O aparelho digestivo 38

1.8 - A digestão do sangue e o estresse oxidativo 40

1.9 - Bactérias endossimbiontes 43

2.0 - A microbiota e a imunidade inata 44

2.1 - O sistema imune inato em invertebrados 45

2.2 - Ativação de proteínas da família NF-kB/Rel 48

2.3 - Ativação da via Toll 51

2.4 - Ativação da via IMD 55

2.5 - Ativação da via JAK/STAT 57

2.6 - Evolução das vias do sistema imune inato em insetos 58

2.7 - Imunidade inata em Aedes aegypti 62

2.8 - Resposta à infecção viral em insetos 63

XX

 

2 - OBJETIVOS 65

3 - MATERIAL E MÉTODOS

3.1 – Mosquitos 67

3.2 - Alimentação artificial dos mosquitos 68

3.2.1 – Infecção 68

3.2.2 - Alimentação com SBTI e BSA 69

3.2.3 - Alimentação comsolução de esferas de látex 69

3.2.4 - Pré-tratamento com antibióticos 70

3.3 - Dissecção dos mosquitos 70

3.4 - Extração de RNA e tratamento com DNAse 71

3.5 - Síntese da fita de cDNA 72

3.6- Amplificação do cDNA por reação em cadeia da

polimerase (PCR) 72

3.7 -PCR quantitativo em tempo real

3.7.1 – A reação de PCR em tempo real 73

3.7.2 – Calculo da quantificação relativa 76

3.7.3 – Analise estatística dos dados 78

3.8 - Cultura de células e propagação de vírus 79

3.9 - Infecção de células C6/36 79

3.10 - Tratamentos com heme e análogos de heme em C6/36 80

3.11 - Microscopia de fluorescência 81

3.12 - Viabilidade celular por redução de MTT 81

RESULTADOS

4.1 – Caracterização de genes do sistema imune em Aedes aegypti 83

4.2 – Ativação das principais vias do sistema imune inato

por infecção viral em células C6/36 de Aedes albopictus. 95

XXI

 

4.3 – Ativação das principais vias do sistema imune inato

por infecção viral em Aedes aegypti 99

4.4 – Aumento da expressão dos genes do sistema imune

disparado pela alimentação sanguínea 103

4.5 – Células C6/36 são capazes de captar heme 106

4.6 – Heme induz expressão de aaREL 1 em C6/36 109

4.7 – Alimentação com esferas de látex induz a expressão de aaREL 2 110

4.8 - Microbiota e a ativação do sistema imune 113

4.9 – A alimentação controla a carga viral em Aedes aegypti 116

DISCUSSÃO

5.1 – Perfil de expressão dos genes do sistema imune inato

em Aedes aegypti 118

5.2 - As principais vias do sistema imune inato são ativadas

por infecções virais em mosquitos 121

5.3 – A influência da alimentação na ativação do sistema imune 124

5.4 - Papel da molécula de heme na ativação do sistema imune 126

5.5 – A microbiota e a ativação do sistema imune 128

5.5 – A alimentação e o controle da carga viral 131

CONCLUSÕES 134

BIBLIOGRAFIA 136

APÊNDICE A - Immune activation in Aedes aegypti by blood feeding and virus

infection. Nascimento-Silva, MCL, Olveira, JHM, Pereira, LOR, Olviera, PL &

Sorgine, MHF. Artigo submetido

APÊNDICE B - BYC, an atypical aspartic endopeptidase from Rhipicephalus

(Boophilus) microplus eggs. Nascimento-Silva MC, Leal AT, Daffre S, Juliano L, da

XXII

 

Silva Vaz I Jr, Paiva-Silva Gde O, Oliveira PL, Sorgine MH.Comp Biochem Physiol B

Biochem Mol Biol. 2008 Apr;149(4):599-607. Epub 2007 Dec 28.

APÊNDICE C- Purification and antigenicity of two recombinant forms of Boophilus

microplus yolk pro-cathepsin expressed in inclusion bodies. Leal AT, Pohl PC,

Ferreira CA, Nascimento-Silva MC, Sorgine MH, Logullo C,Oliveira PL, Farias SE, da

Silva Vaz I Jr, Masuda A. Protein Expr Purif. 2006 Jan;45(1):107-14. Epub 2005 Aug 8.

APÊNDICE D - Vaccine potential of a tick vitellin-degrading enzyme (VTDCE).

Seixas A, Leal AT, Nascimento-Silva MC, Masuda A, Termignoni C, da Silva Vaz I

Jr. Vet Immunol Immunopathol. 2008 Aug 15;124(3-4):332-40. Epub 2008 Apr 16.

XXIII

Introdução

1 – Introdução

1.1 - Doenças transmitidas por vetores

Artrópodes são vetores de parasitas e vírus responsáveis por doenças de

grande relevância para a saúde humana, como a malária, a doença do sono, a doença

de Chagas, a leishmaniose, a filariose, a dengue e a febre amarela. Entre as dez

doenças que mais afetam os países em desenvolvimento, oito são transmitidas por

vetores invertebrados. Estas doenças, somadas, atingem cerca de 54 milhões de

pessoas causando a morte de 1,2 milhão por ano, principalmente em regiões de clima

tropical ou subtropical, em países em desenvolvimento e em áreas pobres e rurais

(http://www.who.int/tdr).

Algumas características dos insetos claramente contribuíram para o sucesso

deste grupo em ocupar quase todos os tipos de habitat existente no planeta, fazendo

com que se tornassem veículos ideais para transmissão de patógenos sanguíneos

entre humanos. Incluídas nestas características, podemos destacar a capacidade de

voar, a presença de órgãos de sentido extremamente sofisticados e a hematofagia

(Ratcliffe et al., 1979).

Curiosamente, apesar do alto valor nutricional do sangue, apenas quatro

ordens de insetos possuem a hematofagia como uma importante fonte de

alimentação: Anoplura, Heteroptera, Díptera e Siphonaptera.

Como estes animais vivem em ambientes ricos em patógenos e parasitos,

contam com seu sistema imune para conter infecções e permanecer vivos. Deste

modo torna-se importante ressaltar que a maioria dos parasitos transmitidos por

21

Introdução

artrópodes não apenas é transportado pelo vetor, mas também interage intimamente

com ele, sofrendo e induzindo mudanças químicas e moleculares. Essas alterações

são essenciais para o ciclo de vida destes parasitos, uma vez que influenciam sua

maturação e multiplicação. Por outro lado, os parasitos são capazes de manipular o

organismo parasitado para aperfeiçoar sua transmissão para novos hospedeiros

(Hurd & Ardin, 2003). Assim, alterações no comportamento alimentar e reprodutivo,

bem como a diminuiçao da quantidade de ovos produzidos, foram algumas

características observadas em fêmeas de diferentes mosquitos infectados por

Plasmodium yoelii nigeriensis (Jahan et al., 1997; Hogg et al., 1995).

1.2 - O mosquito Aedes aegypti

Dentre os insetos vetores, os mosquitos são o grupo mais importante, sendo

seguidos pelos carrapatos (Parola & Raoult, 2001). O mosquito Aedes aegypti pertence

à família Culicidae, sub-ordem Nematocera, ordem Díptera, e é o principal vetor de

diversos arbovírus (arthropod-borne virus), como, por exemplo, os vírus da dengue e

da febre amarela. Este mosquito possui uma distribuição bastante ampla,

principalmente nas regiões tropicais, entre 30 °N e 20 °S (Christophers, 1960; Knight

and Stone, 1977) e apresenta preferência por regiões de ocupação humana, utilizando

sítios artificiais de oviposição, como por exemplo pneus, vasos de plantas e caixas

d’água (Tabachnick, 1991).

O Aedes aegypti, assim como todos os mosquitos, sofre metamorfose completa

(Figura 1). A eclosão dos ovos, quando em ambiente úmido, dá origem a larvas

aquáticas, capazes de se alimentar sozinhas. Quando as larvas se tornam maduras,

22

Introdução

cerca de uma semana após a eclosão, dão origem a pupas, que são também formas

aquáticas, porém incapazes de se alimentar. Alguns dias após a transformação em

pupa, emergem os mosquitos adultos em sua forma alada, capazes de se alimentar

de néctar e sucos vegetais. As fêmeas, por sua vez, são também capazes de se

alimentar de sangue, sendo este tipo de alimentação essencial para a ovogênese.

23

Introdução

Figura 1 – O ciclo de vida de Aedes aegypti (Modificado de www.ipnc.nc/article.php3

?id_article=80 – abril/2008). Após a ovoposição (1), os ovos eclodem (2) dando origem à larvas de

primeiro estágio (3), que se desenvolvem em larvas de segundo (4), terceiro (5) e quarto (6) estágios. A

larva de quarto estágio dá origem à pupa (7), da qual eclode um mosquito adulto (8), na sua forma

alada, aproximadamente 10 dias após a eclosão do ovo. Cerca de 3 dias após a eclosão, a fêmea adulta é

capaz de se alimentar de sangue e começa o processo de fertilização (9) e maturação dos ovos (10). 3

dias após a alimentação com sangue a fêmea está pronta para ovoposiçao e o ciclo se reinicia.

24

Introdução

1.3 – O gênero flavivirus

O vírus da Dengue pertence à família Flaviviridae que é constituída por três

gêneros: Flavivirus, Pestivirus e Hepacivirus. O gênero Flavivirus é o maior dentro da

família, incluindo mais de 70 diferentes vírus. Além do vírus Dengue, podemos

também destacar neste grupo o vírus da encefalite japonesa (JEV), o vírus da febre do

Nilo (WNV) e o vírus da febre amarela (YFV). O nome flavivirus é derivado da palavra

flavus, em Latim, que significa amarelo, devido à coloração característica de

indivíduos acometidos pelo vírus da febre amarela (Mukhopadhyay et al., 2005)

De um modo geral, os flavivirus são transmitidos por artrópodes e seus

sintomas variam bastante, abrangendo desde febre baixa e sensação de mal estar até

casos de encefalite fatal e febre hemorrágica.

Os vírus desse gênero possuem aproximadamente 500 Å de diâmetro e

possuem seu material genômico na forma de RNA fita simples de polaridade

positiva, empacotado por um nucleocapsídeo protéico e uma bicamada lipídica

derivada da célula hospedeira, contendo duas glicoproteínas virais (Figura 2 A)

(Lindenbach & Rice, 2003).

O genoma dos flavivirus possui aproximadamente 10,8 kb e apenas uma fase

aberta de leitura, codificando um único polipeptídio. A parte 5’ do genoma codifica

as três proteínas estruturais do vírus (capsídeo, membrana – M (ou prM quando se

refere à proteína precursora de M) e envelope – E). O restante do genoma codifica

sete proteínas não estruturais, essenciais no processo de replicação do vírus (Figura 2

B e C) (Lindenbach & Rice, 2003).

25

Introdução

A B

C

Figura 2 – O vírus da Dengue. A – Corte longitudinal central feito através de crio-elétron

microscopia (Zhang et al., 2003). B – Esquema mostrando a partícula viral intracelular (do

lado esquerdo) e extracelular (do lado direito), destacando o nucleocapsídeo, as proteínas E e

prM na membrana de partículas virais intracelulares e dímeros da proteína E, a proteína M

madura e sua precursora na membrana de partículas virais já externalizadas. C - Esquema da

organização do genoma dos Flavivirus, com as proteínas estruturais localizadas na porção 5’ e

as proteínas não estruturais que participam da replicação do material genético na região 3’.

26

Introdução

A proteína do capsídeo, de aproximadamente 120 aminoácidos, se liga ao

material genético do vírus em formação e ajuda na montagem do nucleocapsídeo. Já

as proteínas prM (aproximadamente 165 aminoácidos) e E (aproximadamente 495

aminoácidos) são glicoproteínas que contém duas hélices transmembrana cada.

Durante a formação da partícula, ainda na fase intracelular do ciclo, a proteína prM

parece funcionar como uma chaperona, ajudando a montagem da proteína E (Lorenz

et al., 2002). A proteína E, por sua vez, contém sítios de ligação a receptores e é

responsável pela fusão de membranas que ocorre durante a invasão da célula a ser

infectada (Stadler et al., 1997; Allison et al., 2001).

A entrada na célula hospedeira se dá através de endocitose mediada por

receptor. Logo após a formação do endossoma, a acidificação do meio neste

compartimento inicia um processo irreversível de trimerização da proteína E, que

resulta na fusão da membrana viral com a membrana da vesícula em questão. Deste

modo, o nucleocapsídeo é liberado no citoplasma, onde as proteínas e o RNA se

dissociam e a replicação do genoma se inicia (Allison et al., 1995). As partículas

imaturas se formam no interior do retículo endoplasmático (RE) e ainda não são

infecciosas, pois a proteína precursora de M ainda não foi clivada (Guirakhoo et al.,

1991). A clivagem de prM ocorre no complexo de Golgi, tornando essas partículas

infecciosas prontas para serem liberadas por exocitose (Figura 3) (Stadler et al., 1997;

Elshuber et al., 2003).

27

Introdução

Figura.3 – Ciclo replicativo dos Flavivirus (Adaptado de Mukhopadhyay et al., 2005). A

figura mostra o vírus entrando na célula através de fusão de mebranas e iniciando sua

replicação no citoplasma. A montagem se dá no RE e a partícula viral se torna madura no

endossoma pouco antes de ser exocitada.

1.4 – Dengue

Entre os diferentes flavivirus, o vírus Dengue é o responsável pelas mais altas

taxas de casos e de mortes em todo o mundo. O crescimento de sua importância para

a saúde pública global determinou que ela fosse incluída no portfólio da UNICEF,

UNDP, Banco Mundial, WHO Special Programme for Research e Training in Tropical

Diseases (TDR) desde 1999. A dengue é uma doença infecciosa re-emergente que

28

Introdução

ocorre em mais de 100 países, na África, Américas, Mediterrâneo Leste, Sudeste

Asiático e Pacífico Oeste (CDC, 2008) (Figura 4), colocando mais de 2,5 bilhões de

pessoas em risco. Estima-se uma incidência de 50 milhões de casos e,

aproximadamente, 24.000 mortes por ano. Entre as doenças transmitidas por vetores,

estes números assombrosos são ultrapassados somente pela malária (WHO, 2002).

Figura 4 – Mapa da distribuição mundial da dengue. A figura mostra, em bege, as áreas de

prevalência do mosquito da dengue, o Aedes aegypti, e em vermelho regiões onde se encontra

tanto o mosquito quanto a doença. (CDC – www.cdc.org – 2005).

Já foram descritos quatro subtipos do vírus Dengue (DENV1, DENV2, DENV3

E DENV4), que apresentam cerca de 60-80% de homologia entre eles.

No Estado do Rio de Janeiro, a introdução dos vírus DENV1, em 1986, e

DENV2, em 1990, deram origem a diversas epidemias da doença em diferentes

regiões (Nogueira et al., 1988; 1993; 1999). A introdução de DENV3 causou uma

29

Introdução

extensa epidemia no verão de 2002 no Estado do Rio de Janeiro, com 249.247 casos

notificados da doença e 91 óbitos (Figura 5) (Secretaria de Saúde do Estado do Rio de

Janeiro).

Segundo dados da Secretaria do Estado de Saúde e Defesa Civil, até 26 de

março de 2008 foram registrados 43.523 casos de dengue no Estado do Rio de Janeiro,

sendo que a maioria aconteceu na cidade do Rio de Janeiro (28.233). O Estado do Rio

de Janeiro registrou 8.486 casos nas primeiras cinco semanas de 2008, um aumento de

117,42% em relação ao mesmo período analisado no ano anterior

(http://portal.saude.gov.br/portal/aplicacoes/noticias/noticias_detalhe.cfm?co_seq

_noticia=42918 - 2008).

30

Introdução

Figura 5 – Mapa da presença de dengue no Brasil. O mapa 1 mostra os sorotipos circulantes

do vírus Dengue no Brasil nos anos de 2001 e 2002. O mapa 2 mostra a presença do mosquito

Aedes aegypti nos diferentes municípios brasileiros nos anos de 1997 e 2001, deixando nítido

um aumento significativo de municípios infestados por esse mosquito ao longo dos anos

(Instituto Virtual de Dengue – 2008).

Apesar do quadro de dengue no país, vários aspectos da doença são pouco

compreendidos. Dentre eles, a interação do vírus com o seu vetor apresenta diversas

questões fundamentais ainda sem resposta. Ao mesmo tempo em que o vírus Dengue

31

Introdução

é capaz de infectar eficientemente o mosquito Aedes aegypti, outros Flavivirus são

eliminados do trato digestivo deste inseto (Wolff et al., 2001). As variações de

suscetibilidade/refratoriedade do mosquito à infecção viral, em populações naturais,

têm sido relacionadas à existência de barreiras envolvendo a infecção das células do

intestino, a saída do vírus do intestino e a etapa de propagação para a glândula

salivar (Black et al., 2002; Gorrochotegui-Escalante, 2005). Essas barreiras de infecção

são específicas, dependem da população do inseto e, possivelmente, são um dos

determinantes da dinâmica epidemiológica da doença (Salazar et al., 2007). No

entanto, pouco se sabe a respeito dos mecanismos celulares e moleculares

responsáveis pela capacidade de uma dada população de mosquitos ser ou não

infectiva a um determinado vírus.

1.5 – O vírus Sindbis

O vírus Sindbis foi primeiramente isolado no Cairo, Egito, em 1952, de

mosquitos C. pipens e C. univittatus (Hurlbut, 1953; Taylor et al., 1955). Como outros

Alphavirus, o Sindbis é transmitido por mosquitos à hospedeiros vertebrados, como

aves e mamíferos.

As manifestações clínicas do vírus Sindbis são febre, vermelhidão e artralgia.

A doença é comum na parte sul e leste da África, no Egito, em Israel, nas Filipinas e

em algumas partes da Austrália.

O vírus Sindbis faz parte do gênero Alphavirus, da família Togaviridae. Esse

gênero possui 27 vírus, classificados de acordo com suas propriedades antigênicas.

São vírus esféricos, de 60 a 70 nm de diâmetro e possuem material genético na forma

32

Introdução

de RNA fita simples de polaridade positiva, com aproximadamente 11,7 Kb (Strauss

et al., 1984). O capsídeo icosaédrico contém uma proteína de aproximadamente 260

aminoácidos e RNA. O envelope lipídico possui três glicoproteínas (E1, E2 e E3)

responsáveis pela ligação, endocitose e fusão do vírus na membrana do endossoma

da célula hospedeira (Figura 6) (Strauss et al., 1994). Assim como nos flavivirus, a

acidificação do endossoma promove mudanças conformacionais nas proteínas do

envelope, acarretando na fusão de membranas e liberando o nucleocapsídeo no

citoplasma da célula hospedeira.

Figura 6 – Virus Sindbis: A – Crio–eletrón microscopia de partículas de vírus. B – Estrutura

do vírus Sindbis com resolução de 20 Å determinada através de crio-eletroón microscopia e

técnicas de reconstrução 3D de imagens. C – Corte de uma partícula de vírus Sindbis com

resolução de 11 Å, mostrando as glicoproteínas E1 e E2, a bicamada lipídica e a proteína do

capsídeo (NCP) (Zhang et al., 2002).

O genoma do Sindbis possui um CAP na extremidade 5` e poliadenilação na

terminação 3`. O RNA genômico funciona como RNAm e codifica quatro proteínas

33

Introdução

não estruturais, nsP1, nsP2, nsP3 e nsP4, na forma de duas poliproteínas, P123 e

P1234. A primeira contém apenas as três primeiras proteínas citadas acima, devido a

um códon de terminação entre nsP3 e nsP4. A segunda poliproteína é encontrada em

menor abundância e contém as quatro proteínas não estruturais (Lopez et al., 1985).

As poliproteínas são processadas, gerando intermediários com diferentes papéis no

processo de replicação e transcrição no vírus(Figura 7) (Hardy & Strauss, 1988; Lemm

& Rice, 1993, Shirako & Strauss, 1990). A replicação ocorre inteiramente no

citoplasma e de forma bastante rápida (aproximadamente 4 horas, enquanto os

Flavivirus levam entre 20 e 30 horas). As proteínas não estruturais já traduzidas,

junto com fatores celulares, usam o RNA genômico positivo (RNA(+)) como molde

para a síntese de fitas de RNA de polaridade negativa (RNA(-)). Estas, por sua vez,

servirão de molde para a produção de RNA(+) completas que serão encapsuladas.

Um promotor interno no RNA(-) é usado para a transcrição de um RNA(+) sub-

genômico de 26S. A tradução deste RNA dá origem a uma poliproteína estrutural,

que é clivada para produzir as proteínas do capsídeo (C), e as proteínas do envelope

(E1 e E2). As proteínas do capsídeo se ligam a fitas de RNA(+) completas para formar

novos nucleocapsídeos. Os nucleocapsídeos interagem com as proteínas de envelope

que já estão inseridas na membrana plasmática da célula, levando ao brotamento da

partícula viral (Strauss & Strauss, 1994).

34

Introdução

Figura 7 – Esquema de replicação do genoma do vírus Sindbis. A fita de RNA(+) dá origem

a poliproteínas não estruturais que, após o processamento, são responsáveis pela replicação

da fita de RNA. Um promotor interno na fita de RNA(-) gera um RNA (+) sub-genômico que

codifica as proteínas estruturais (Adaptado de Straus & Strauss, 1994).

O vírus Sindbis infecta tanto células de invertebrados, no caso de seus insetos

vetores, quanto células de vertebrados (aves, pequenos mamíferos e humanos)

(Calisher, 1994). Estudo utilizando culturas de células de mosquitos e de vertebrados

observaram marcantes diferenças entre a replicação e patogênese do vírus nessas

células. A principal diferença é que as células de mosquito, após a fase aguda,

desenvolvem uma infecção persistente (Karpf et al., 1997a,b). Por outro lado, as

35

Introdução

células de vertebrados não sobrevivem à fase aguda da infecção, aparentemente

devido a eventos apoptóticos (Levine et al., 1993).

O tropismo do vírus Sindbis pelo mosquito Aedes albopicutus foi determinado

por Bowers e colaboradores, em 1995. Após 18 dias de infecção, foi observado que os

ovaríolos e os túbulos de Malphigi eram refratários ao Sindis. Por outro lado, o corpo

gorduroso apresenta uma infecção permanente. Tecidos como o aparelho digestivo

médio anterior e posterior e os músculos toráxicos apresentaram uma infecção

transiente, diminuindo os títulos virais depois do sétimo dia (Bowers et al., 1995).

O curso temporal da infecção por Sindbis em mosquitos Aedes aegypti foi

determinado utilizando um vírus modificado, que codifica, além de seu genoma, a

proteína fluorescente verde (GFP). A expressão de GFP um dia após a infecção (DAI)

mostrou que neste período a infecção ainda não estava disseminada, possuindo

apenas alguns focos no aparelho digestivo médio. No quarto DAI o vírus já estava

disseminado pelo mosquito e os focos presentes no aparelho digestivo eram bem

maiores e em maior quantidade (Foy et al., 2004).

Ao longo dos anos, devido às semelhanças observadas com a infecção de

outros vírus, principalmente Flavivirus, o estudo da infecção por Sindbis em células

de mosquito tem se tornado uma importante ferramenta no combate à transmissão

não apenas deste vírus em particular, mas também dos arbovírus de uma forma

geral, funcionando como um sistema modelo para entender mais sobre a interação

entre os vírus e seus vetores invertebrados.

36

Introdução

1.6 – Competência Vetorial em artrópodes

A competência vetorial de um artrópode é determinada de acordo com

o grau de permissividade deste a uma determinada infecção. Já se sabe que diversas

linhagens de Aedes aegypti apresentam grandes diferenças com relação à competência

vetorial para Flavivirus, principalmente para o vírus da Dengue (Bennett et al., 2005,

Vazeille-Falcoz et al., 1999; Black et al., 2002), inclusive no Brasil (Lourenço-de-

Oliveira et al., 2004).

Após ser ingerido pelo mosquito durante a alimentação sanguínea, o vírus

precisa atravessar diversas barreiras de modo a realizar uma infecção bem sucedida.

No caso dos arbovírus, a principal barreira para o estabelecimento da infecção é a

entrada do vírus nas células do epitélio do aparelho digestivo (conhecida como

Midgut Infection Barrier, MIB). Uma vez colonizado este órgão, a segunda barreira

de infecção que se apresenta é a saída das partículas virais em direção à hemolinfa,

levando à infecção de outros tecidos (Midgut Escape Barrier, MEB) (Black et al.,

2002). Ainda considera-se uma terceira barreira, que seria a entrada do vírus no

lúmem da glândula salivar, de onde ele, finalmente, será transmitido ao próximo

hospedeiro (Transmission Barrier - TB). Uma vez suplantadas estas barreiras,

acredita-se que a infecção viral será bem sucedida (Figura 8) (Black et al., 2002).

37

Introdução

Figura 8 – Esquema das Barreiras de transmissão de patógenos em mosquitos (adaptado de

Black et al., 2002). A figura destaca as principais barreiras de transmissão de patógenos em

mosquitos e as principais partes do trato digestivo deste organismo.

1.7 - O aparelho digestivo dos mosquitos

O aparelho digestivo forma uma barreira física que protege os demais tecidos

das enzimas digestivas e dos agentes infecciosos que podem ser ingeridos durante a

alimentação sanguínea, sendo, portanto, o primeiro local de contato entre estes

patógenos e o organismo do vetor.

O aparelho digestivo do mosquito é composto por uma mono-camada de

células epiteliais e pode ser dividido em aparelho digestivo anterior, médio e

posterior (Figura 9). O aparelho digestivo anterior está envolvido principalmente

com a ingestão, condução e armazenamento do alimento (Romoser, 1996). Próximo à

38

Introdução

parte posterior do esôfago existem três divertículos, envoltos em cutícula

impermeável, que ficam normalmente repletos de bolhas de ar e são utilizados como

reservatórios de alimento (Consoli & Lourenço-de-Oliveira, 1994). Quando o

mosquito se alimenta de açúcar, na forma de néctar, por exemplo, essa solução é

estocada no divertículo e liberada gradativamente para o aparelho digestivo médio,

onde será digerida.

O aparelho digestivo médio é o ponto de maior vulnerabilidade do vetor, visto

que é o local onde o sangue fica estocado durante o processo digestivo (Romoser,

1996), propiciando ao parasita maior chance de penetrar através do epitélio. Além

disso, esta região do sistema digestivo é de origem endodérmica e, portanto, não é

recoberta por cutícula de quitina como todas as demais. Na maior parte dos insetos o

aparelho digestivo médio é recoberto por uma barreira não celular que envolve o

bolo alimentar. Nos mosquitos, essa camada é denominada matriz peritrófica (PM)

(Petters, 1992), constituindo mais uma barreira de proteção para danos causados pela

digestão do sangue (Richards & Richards, 1977; Peters, 1992; Abedi & Brown, 1962).

Embora essa barreira seja importante no processo de entrada de diversos parasitos

em seus vetores (Berner et al., 1983; Billingsley & Rudin, 1992), este não parece ser o

caso para os vírus, visto que estes parecem ser capazes de invadir as células do

epitélio do aparelho digestivo antes da formação desta estrutura (Figura 9)

(Comunicação pessoal, Stephen Higgs, 2007).

39

Introdução

Figura 9– Aparelho digestivo de A aegypti. A figura mostra a divisão entre aparelho

digestivo anterior, médio e posterior. A matriz peritrófica está assinalada como PM.

(Adaptado do livro Biology of disease vectors, capítulo 19, página 321).

Vários fatores parecem influenciar a entrada dos patógenos no aparelho

digestivo do vetor, entre eles a fonte sanguínea, o pH, a situação nutricional e

hormonal do hospedeiro (Nguu et al., 1996; Billingsley & Sinden, 2001; Feder et al.,

1997), a ação das enzimas digestivas (Kaplan et al., 2001), receptores de

glicoproteínas na superfície do epitélio do aparelho digestivo (Wilkins & Billingsley,

2001), presença de bactérias simbiontes (Dale & Welburn, 2001) e a ativação de genes

do sistema imune e peptídeos antimicrobianos (Lehane et al., 2003; Dimopoulos et al.,

1998).

1.8 – A digestão do sangue e o estresse oxidativo

Os insetos hematófagos precisam digerir uma quantidade muito grande de

sangue a cada alimentação sanguínea, visto que são capazes de ingerir várias vezes o

40

Introdução

valor do próprio peso em sangue durante um mesmo evento alimentar. A digestão

da hemoglobina presente neste sangue resulta em uma grande liberação de heme no

aparelho digestivo médio, o que é extremamente citotóxico, visto que o heme é uma

molécula anfipática, sendo capaz de desestabilizar membranas biológicas e causar

danos celulares. Além disso, o heme livre é um potente estimulador da formação de

radicais livres (Figura 10). Desta forma, a alimentação hematófaga pode ser

considerada um desafio oxidativo, tendo um impacto relevante sobre o equilíbrio

redox das células digestivas destes vetores.

Figura 10: Heme e geração de estresse oxidativo. Através da reação de Fenton o ferro pode

gerar radicais hidroxil (OH•). Estes radicais são capazes de iniciar uma cadeia de reações de

peroxidação lipídica removendo elétrons de outras moléculas como ácidos graxos

insaturados (RH), gerando radicais alquil (R•). Além disso, o heme induz a conversão de

hidroperóxidos orgânicos de baixa reatividade (ROOH) em radicais alcoxil (RO•) e peroxil

(ROO•) extremamente reativos (figura adaptada de Graça-Souza e cols., 2006).

41

Introdução

Em A. aegypti, experimentos utilizando técnicas de microarranjo mostraram

que a expressão gênica após a alimentação com sangue apresenta uma importante

ativação de genes de resposta ao estresse oxidativo (Sanders, 2003). Este fato já era

esperado, visto que a resposta celular ao estresse é um mecanismo bastante

conservado em organismos eucarióticos, envolvendo uma extensa reprogramação

gênica através da ativação de fatores de transcrição como NF-kB, nrf2 e AP-1.

O estresse oxidativo também parece estar envolvido diretamente na regulação

da resposta celular frente a diversos patógenos, tanto em mamíferos como em

invertebrados. Em células hepáticas humanas, por exemplo, já foi demonstrado que o

vírus da Dengue é responsável pela ativação de genes de resposta a estresse

oxidativo (Lin et al., 2000). Em mosquitos, foi mostrado que linhagens de Anopheles

gambiae refratárias à P. falcuparum experimentavam situações de estresse oxidativo

crônico e que a resistência à infecção pode ser atribuída à incapacidade do plasmódio

de sobreviver a este tipo de estresse. Além disso, a penetração do plasmódio no tubo

digestivo do mosquito parece ativar a produção de espécies reativas, por uma via

que envolve a ativação de STAT (Signal Transducers and Activator of Transcription).

Esse processo resultaria no aumento da expressão da enzima óxido nítrico sintase e

de uma peroxidase envolvida na nitração de proteínas, o que pode ser entendido

como um mecanismo de imunidade inata voltado para a neutralização do patógeno

por induzir a morte da célula infectada por apoptose (Kumar and Barillas-Mury,

2005).

42

Introdução

1.9 - Bactérias endossimbiontes

O epitélio do aparelho digestivo está em íntimo contato com um enorme

número de bactérias simbiontes. Sabe-se que as bactérias influenciam muitos

aspectos da fisiologia do organismo hospedeiro, dentre os quais podemos destacar

imunidade inata, desenvolvimento e homeostasia (Hooper et al., 2001). Apesar disso,

a relação entre a microbiota bacteriana e o aparelho digestivo do hospedeiro ainda é

extremamente pouco conhecida.

Organismos que apresentam uma dieta pobre tendem a possuir bactérias

endossimbiontes em maior quantidade no intuito de suprir deficiências especificas

(Douglas, 1989). O sangue, embora seja um alimento muito rico do ponto de vista

nutricional, possui uma grande deficiência em vitamina B e alguns aminoácidos.

Desta forma, vários artrópodes hematófagos, como carrapatos, pulgas, moscas e

outros, parecem suprir esta deficiência através de microorganismos simbiotes

(Buchner, 1965).

As vias de sinalização ativadas em Drosophila melanogaster pela presença de

patógenos como fungos e bactérias já foram extensivamente descritas, abrangendo

desde interações iniciais, que levam à produção de espécies reativas de oxigênio

(ROS), até a produção de moléculas efetoras, como peptídeos antimicrobianos

(AMPs). No entanto, estudos que levem em consideração a microbiota simbionte e

sua interação molecular com o organismo hospedeiro são muito raros.

Muito pouco é conhecido sobre a microbiota dos mosquitos. Os métodos

convencionais de cultura de bactérias impossibilitam o isolamento e a identificação

de todos os componentes desta microbiota, visto que estes não são capazes de

43

Introdução

reproduzir artificialmente as condições de crescimento destes organismos (Olson et

al., 1994).

Apesar dessa dificuldade, estudos realizados ao longo dos anos foram capazes

de identificar alguns microrganismos constituintes destas microbiotas em diferentes

mosquitos (DeMaio et al., 1996), inclusive em A. aegypti (Gusmão et al., 2007).

2.0 – A microbiota e a imunidade inata

A coexistencia de bactérias e outros patógenos no aparelho digestivo do vetor

podem resultar numa alteração da eficiência da infecção, como já foi mostrado para

mosquitos do gênero Anopheles co-infectados por bactérias e Plasmodium sp.(Seitz,

1987; Pumpuni et al., 1993, 1996; Gonzalez-ceron et al., 2003). Por exemplo, em um

estudo feito com Plasmodium falciparum e Anophles stephensi, a adição de bactérias

gram-negativas e parasitos, concomitantemente, foi capaz de inibir completa ou

parcialmente a formação de oocistos. No entanto, bactérias gram-positivas, LPS

(purificados de E. coli J5) ou bactérias pré-tratadas com formalina (E. coli H243) não

tiveram nenhum efeito na infecção por este parasito (Pumpuni et al., 1993). Além

disso, ainda não se sabe qual o efeito real da ativação dos peptídeos antimicrobianos

do mosquito após a alimentação com sangue no desenvolvimento deste e de outros

parasitas sanguíneos (Dimopoulos et al., 1997).

Em outro modelo, Azambuja e colaboradores, ao estudarem a interação entre

Rhodnius prolixus e o Tripanossoma cruzi, observaram que bactérias residentes no

estômago do inseto vetor produziam substâncias que causavam a lise do parasita,

corroborando a importância de estudar a microbiota do aparelho digestivo como

44

Introdução

parte do processo de interação parasita-hospedeiro em insetos vetores (Garcia et al,

1994, 1995).

2.1 – O sistema imune inato em invertebrados

Assim como os organismos superiores, os invertebrados dependem de um

conjunto de múltiplas reações do sistema imune inato para combater infecções. Esse

conjunto de reações inclui o uso de barreiras físicas (como a matriz peritrófica, por

exemplo), respostas locais (celulares) e sistêmicas (humoral). De um modo geral, o

patógeno entra em contato com o inseto pela alimentação. Neste caso, o epitélio do

aparelho digestivo age tanto como um barreira física, quanto produzindo AMPs e

ROS (Ryu et al., 2006). Já na hemolinfa, os hemócitos, células circulantes dos insetos,

participam deste processo de defesa através de fagocitose ou encapsulamento de

organismos estranhos. O corpo gorduroso, equivalente funcional do fígado em

mamíferos, participa destas defesa produzindo moléculas de resposta humoral, como

por exemplo AMPs.

O sistema imune inato depende, a princípio, de um sistema de receptores de

reconhecimento de patógenos (PRRs), responsáveis pela detecção de substâncias

derivadas destes agentes invasores (Janeway, 1989). A ativação do sistema imune

inato, através desses receptores, leva à síntese de diversas moléculas antimicrobianas

efetoras que irão atacar os patógenos em diferentes estágios da infecção.

Até o momento, Drosophila melanogaster é o inseto que possui o sistema imune

inato mais bem caracterizado. Diversos estudos mostram similaridades marcantes

entre as vias de ativação e sinalização do sistema imune inato de mamíferos e de

45

Introdução

Drosophila (Martinelli & Reichhart, 2005). Em ambos os casos, infecções com

diferentes patógenos levam à ativação de receptores Toll/TLR, iniciando uma cascata

intracelular que resulta na ativação de fatores de transcrição da familia NF-kB/Rel

(Martinelli & Reichhart, 2005).

Duas vias independentes de ativação de NF-kB já foram descritas em

Drosophila. Uma delas responde a fungos e a bactérias gram-positivas (via Toll),

enquanto a outra responde a bactérias gram-negativas ou tratamento com LPS (via

IMD) (Figura 11).

A indução da via Toll em Drosophila leva à ativação de dois homólogos de NF-

kB/Rel, chamados Dorsal e Dif (Dorsal immune factor). Dorsal parece ser muito

importante durante o desenvolvimento dorso-ventral do embrião (Belvin &

Anderson, 1996), enquanto Dif se mostrou essencial para o funcionamento do

sistema imune, levando à produção de peptídeos antifúngicos e antimicrobianos,

como a Drosomicina (Lemaitre et al., 1996, Rutschmann et al., 2002).

Paralelamente, foi identificado um mutante de D. melanosgaster que não era

capaz de resistir a infecções por bactérias gram-negativas, porém não era tão sensível

a bactérias gram-positivas e fungos como o mutante para o gene Toll. Ele foi

chamado “mutante com deficiência imunológica” (immune deficiency – IMD). A via

alterada nesse mutante foi então denominada via IMD e leva à ativação de um

terceiro homólogo de NF-kB/Rel, a proteína Relish. Relish é sintetizado como um

precursor citoplasmático inativo, clivado em resposta a uma infecção com bactérias

gram-negativas (ativação da via de IMD) estando pronto para entrar no núcleo e se

46

Introdução

ligar a seqüências especificas no DNA, promovendo a expressão de um conjunto de

genes, entre eles peptídeos antimicrobianos, como a Diptericina (Stoven et al., 2000).

Nunca foi descrita nenhuma função para a via IMD que não estivesse ligada

ao sistema imune inato, e os mutantes desta via que não adquirem nenhum tipo de

infecção são completamente viáveis e normais.

Além disso, em Drosophila, infecções também podem levar à ativação das vias

JNK (Sluss et al., 1996) e JAK/STAT (Lagueux et al., 2000). A função da via JNK na

infecção ainda não foi estabelecida, porém a via JAK/STAT é necessária à indução de

inúmeras proteínas similares às do sistema complemento, que recentemente foram

descritas como possuindo um importante papel na opsonização de bactérias gram-

negativas, promovendo fagocitose (Levashina et al., 2001) (Figura 11).

47

Introdução

Figura 11 – Resumo esquemático simplificado mostrando as três principais vias de

ativação do sistema imune inato em Drosophila melanogaster: Via Toll, via IMD e via

JAK/STAT e seus ativadores. Adaptado de Hoffmann e Lemaitre, 2007.

2.2 - Ativação de proteínas da família NF-kB/Rel

Em relação ao sistema imune inato, a principal semelhança encontrada ao

longo de todo o reino animal tem sido o papel central da familia NF-kB/Rel como

importantes fatores de transcrição.

Em células não estimuladas, proteínas da família NF-kB/Rel existem como

homo/heterodímeros no citoplasma celular devido a uma associação com inibidores

membros da família IkB. Diferentes sinais extracelulares podem gerar cascatas

48

Introdução

intracelulares que levam à destruição de proteínas tipo IkB e à conseqüente ativação

de proteínas da família NF-kB/Rel. Essas cascatas passam pela ativação de kinases

de IkB (IKK) e, conseqüentemente por fosforilações de resíduos de serina na região

N-terminal de IkB que sinalizam para a destruição desta proteína através da

ubiquitinação e degradação via proteossomas. A destruição de IkB libera a proteína

NF-kB/Rel, permitindo que ela entre no núcleo celular e se ligue a promotores ou

acentuadores, regulando a expressão de determinados genes específicos.

O homólogo à proteína IkB em D. melanogaster é uma proteína denominada

cactus, que, por ter uma grande homologia a IkB alfa, parece também ter sua

destruição regulada por fosforilação de resíduos de serina. Embora a kinase

responsável por essa fosforilação ainda não tenha sido identificada, já foi mostrado

que a destruição de cactus é dependente de proteossomas (Spencer et al., 1999).

Um outro mecanismo de ativação de proteínas NF-kB/Rel é a existência de

precursores longos incapazes de serem translocados para dentro do núcleo celular.

Esse exemplo se aplica à proteína Relish de D. melanogaster e a seus homólogos

humanos p100 e p105. O N-terminal destas proteínas contém domínios de ligação ao

DNA e domínios de dimerização (domínios de homologia Rel), enquanto o C-

terminal possui uma série de seqüências repetidas denominadas ankirinas,

semelhantes às de proteínas da família IkB. Assim, por possuírem seqüências

inibitórias do tipo IkB, essas proteínas ficam presas ao citoplasma celular até que seu

C-terminal seja clivado por proteólise, permitindo então sua entrada no núcleo e a

ativação de genes específicos (Figura 12).

49

Introdução

Em humanos essa clivagem se dá via proteossomo e o C-terminal da proteína

é completamente degradado. Nos insetos, no entanto, a clivagem de Relish parece ser

endoproteolítica, em resposta a uma infecção, gerando um C-terminal com domínios

de ankirina estável que permanece no citoplasma mesmo após a translocação do N-

terminal para o núcleo (Shin et al., 2002). O papel deste C-terminal ainda não foi

esclarecido.

Figura 12 – Representação esquemática de proteínas da família NF-kB/REL e IkB de

mamíferos. Em verde observa-se o domínio de homologia REL (RHD) e em azul, repetições

do domínio ankirina. P100 e p105 sofrem proteólise nos resíduos marcados com setas para

ativação, sendo homólogos a proteína Relish de D. melanogaster e aaREL 2 em Aedes aegypti

As proteínas kinases que fosforilam IkB são muito importantes na via de

ativação de NF-kB (Karin and Ben-Neriah, 2000). O complexo IKK alfa/beta/gama

50

Introdução

pode ser ativado por uma grande diversidade de estímulos, entre eles o tratamento

com LPS e infecção por vírus (O’Connel et al, 1998; Chu et al., 1999; Hawiger et al.,

1999). A ativação deste complexo envolve a fosforilação de dois resíduos de serina

localizados na alça de ativação do domínio kinase da IKK alfa ou beta. Em 2000,

Karin e Ben-Neriah demonstraram que algumas MAP3 kinases são capazes de

fosforilar esses domínios in vitro, ativando NF-kB (Karin & Ben-Neriah, 2000).

Em D. melanogaster, dois homólogos de IKK são conhecidos. O primeiro,

chamado de Dm IKKε, não teve sua função elucidada até o momento. O segundo,

DmIKKbeta ou DLAK é essencial para a via de sinalização imune contra bactérias.

DmIKKbeta faz parte do complexo DMIKK, que é ativado por LPS e fosforila

diretamente a proteína Relish, o que é essencial para sua clivagem e ativação

(Silverman et al., 2000).

A fosforilação induzida de proteínas da família NF-kB/Rel parece ter

diferentes funções, incluindo mudanças conformacionais no domínio de ativação,

que levam a um aumento de afinidade pelo DNA e promovem a ligação com

coativadores de transcrição (Schmitz et al., 2001).

2.3 – Ativação da via Toll

Receptores Toll e receptores do tipo Toll (TLRs) são caracterizados por

possuírem um domínio extracelular rico em repetições de leucina (LRRs), um único

domínio transmembrana e um domínio intracelular de sinalização, conhecido como

TIR (Figura 13) (Wilson et al., 1997).

51

Introdução

Dez diferentes receptores Toll já foram descritos em D. melanogaster, porém

apenas um foi associado diretamente à vias de sinalização do sistema imune inato

deste inseto.

Uma diferença marcante entre os TLRs de mamíferos e os de D. melanogaster é

que os primeiros reconhecem diretamente padrões moleculares associados a

patógenos (PAMP), enquanto nenhum receptor Toll de D. melanogaster é capaz de

apresentar esse tipo de reconhecimento. Em contrapartida, os receptores tipo Toll de

D. melanogaster possuem uma proteína ligante (Spatzle), podendo então responder a

estímulos vindos de diferentes patógenos, como fungos, bactéria e vírus (De

Gregório et al., 2001).

O receptor responsável pelo reconhecimento de LPS em humanos é o TLR4.

CD14 e MD2 são proteínas de membrana que também participam do reconhecimento

de LPS, junto com TLR4 (Moore et al., 2000; Shimazu et al., 1999). CD14 e TLR4

também estão envolvidos no reconhecimento de proteínas virais (Kurt-Jones et al.,

2000).

Em D. melanogaster, os receptores do tipo Toll foram descritos inicialmente na

via de desenvolvimento do eixo dorso-ventral durante a embriogênese. Porém,

posteriormente, observou-se que a cascata de sinalização via receptores Toll também

é responsável pela defesa da mosca e outros insetos contra fungos e algumas

bactérias gram-positivas (Lemaitre et al., 1996).

52

Introdução

Drosophila Mamíferos

Figura 13 – Receptores Toll em D. melanogaster e em mamíferos. A porção extracelular

destes receptores é composta por domínios LRRs, flaqueados por resíduos ricos em cisteínas.

A porção intracelular possui um domínio TIR, similar ao dos receptores de interleucina de

mamíferos, como, por exemplo, o IL-1R. Esquema adaptado de Bilak et al., 2003.

Essa cascata começa pela ligação de PAMPs de bactérias ou fungos a

receptores de peptideoglicanas (PGRPs) ou a proteínas ligadoras de bactérias gram-

positivas. Essa ligação dispara uma cascata de serino proteases que cliva Spatzle, o

ligante do receptor Toll. Quando essa forma clivada de Spatzle se liga ao receptor

Toll, inicia-se uma cascata de sinalização que resulta na degradação da proteína

homóloga a IkB, Cactus. A degradação de cactus permite que os homólogos ao NF-

53

Introdução

kB (Dorsal ou Dif) migrem para o núcleo da célula, ativando seletivamente a

expressão de genes que possuem o motivo de ligação kB, como, por exemplo,

peptídeos antimicrobianos (Figura 14).

Figura 14 – Esquema comparando a ativação da via Toll em mamíferos e em D.

melanogaster. Deve-se ressaltar as principais diferenças entre as vias, como o fato da

proteína TLR 4 ser ativada diretamente pelo LPS do patógeno, enquanto a proteína Toll sofre

uma ativação indireta, através da proteina Spatzle

(genomebiology.com/2000/1/1/REVIEWS/106/figure/F1 - 2008) (Adaptado de Medzhitov

& Janeway Jr, 2000).

Os componentes canônicos dessa via são: a citocina extracelular chamada

Spatzle (que possui similaridades estuturais com NGF – nerve growth factor), o

receptor transmembrana Toll, os adaptadores Tube e MyD88, a quinase Pelle, Cactus

54

Introdução

(homólogo ao inibidor de NF-kB – IkB) e os fatores de transcrição homólogos ao NF-

kB, Dorsal e Dif.

Dif e Dorsal parecem ter papéis redundantes em larvas, no que diz respeito à

produção de AMPs. Apesar disso, Dif é suficiente para a resposta imune em moscas

adultas (Meng et al., 1999, Manfruelli et al., 1999, Rutschmann et al., 2000)

É importante ressaltar que a ativação da via Toll, num processo auto-

regulatório, leva à indução de vários genes da própria via (Spaetzle, Toll, Pelle,

Cactus e Dif,), não apenas de AMPS (Figura 15) (De Gregório et al., 2002).

2.4 - Ativação da via IMD

A via IMD é ativada de modo semelhante à via Toll. Acredita-se que exista a

participação de peptideoglicanos e de receptores como o PGRP-LC. Os receptores

ativados são capazes de recrutar a proteína IMD, que possui um domínio death (DD)

(homóloga ao gene Receptor Interaction Protein – RIP em mamíferos) e se liga a

dFadd. Este interage com Dreed, proteína homóloga à caspase 8 humana que, por

sua vez, se associa e cliva a proteína Relish fosforilada. Relish é fosforilada pelo

complexo kinase de ikB de D. melanogaster (DmIKK complex), que é ativado por uma

MAPKKK chamada dTAK1, de um modo dependente de IMD. A forma clivada de

Relish pode migrar para o núcleo celular, ativando a expressão de diversos genes

ligados à resposta imune. A via IMD guarda diversas semelhanças com a via TNF-R

de mamíferos, porém sua organização molecular ainda é pouco conhecida (Figura

15).

55

Introdução

Figura 15 – Esquema das via Toll e IMD em Drosophila melanogaster (Adaptado de

Hoffmann & Lemaitre, 2007). A via Toll é preferencialmente ativada por Fungos, leveduras e

bactérias Gram-positivas, enquanto a via IMD é ativada por bactérias Gram-negativas.

Ambas as vias de sinalização culminam na ativação de fatores de transcrição da família NF-

kB/REL. Esses fatores de trancrição, uma vez dentro do núcleo, participam da ativação da

transcrição de diversos genes de defesa, entre eles peptídeos antimicrobianos.

56

Introdução

2.5 - Ativação da via JAK/STAT

Originalmente descrita por seu papel na segmentação embrionária, a via

JAK/STAT em D. melanogaster possui três principais componentes: o receptor

domeless, a janus quinase (JAK) Hopschotch e o ativador de transcrição STAT

(Agaisse & Perrimon, 2004). Os primeiros indícios da participação desta via no

sistema imune de insetos vieram de trabalhos realizados com Anopheless gambiae

infectados com bactéria, nos quais se observou um acúmulo de STAT no núcleo após

a infecção (Barillas-Mury et al., 1999).

Atualmente já se conhece alguns dos genes controlados por essa via em D.

melanogaster, como a proteína TEP2, de função homóloga a proteínas do sistema

complemento de mamíferos, importante na opsonização de patógenos, e os genes de

estresse do tipo Turandot, de função ainda desconhecida (Boutros et al., 2002,

Lagueux et al., 2000, Agaisse et al., 2003).

Moscas mutantes para essa via possuem o mesmo grau de resistência a fungos

e bactérias do que moscas selvagens, além de não apresentarem nenhuma alteração

no perfil de expressão de AMPs. Apesar disso, esses mutantes se mostraram mais

sensíveis a infecções pelo vírus C de Drosophila (Dostert, 2005), sugerindo a

participação desta via na defesa antiviral na mosca. No entanto, até o momento,

nenhum gene efetor foi encontrado ativado após infecções virais.

O papel desta via no contexto geral da defesa imune inata, tanto em D.

melanogaster quanto em outros insetos, ainda é pouco claro e precisa ser mais bem

estudado.

57

Introdução

2.6 – Evolução das vias do sistema imune inato em insetos

Após o sequenciamento do genoma de A. aegypti (Nenê et al., 2007) foi

possível ter uma melhor visão evolutiva do quadro da imunidade inata em insetos,

comparando famílias de genes relacionadas ao sistema imune entre diferentes

espécies. A. aegypti (Aa) e A. gambiae (Ag) são espécies de mosquitos afastadas

evolutivamente, tendo divergido há cerca de 150 milhões de anos. Quando

comparado com os genes de D. melanogaster (Dm), que divergiu destes mosquitos há

aproximadamente 250 milhões de anos, este quadro se torna ainda mais rico e

completo, permitindo a estimativa de distâncias genéticas mais confiáveis do que

pela simples comparação entre A. gambiae e D melanogaster (Waterhouse et al., 2007,

Christophides et al., 2002).

Waterhouse e colaboradores, utilizando métodos de bioinformática em larga

escala, anotações manuais e análise filogenética, identificaram 285 genes em Dm, 338

em Ag e 353 em Aa, de 31 famílias gênicas e/ou grupos funcionais ligados a

imunidade ou defesa. Neste trabalho foram identificados 4951 ortólogos nas três

espécies e 886 ortólogos específicos de mosquitos (não existiam em D. melanogaster ou

em Apis melífera).

Comparando ortólogos relacionados ao sistema imune com ortólogos totais no

genoma desses três organismos, podemos perceber que o repertório imune possuiu

maior divergência em grupos funcionais do que todos os outros (Figura 16).

58

Introdução

Figura 16 – Gráfico mostrando ortólogos de genes entre Aedes aegypti (Aa), Anopheles

gambiae (Ag) e D. melanogaster (Dm). Em azul, trios de ortólogos no genoma. Em vermelho,

apenas genes relacionados ao sistema imune. (Adaptado de Waterhouse et al., 2007)

Quando analisamos a presença ou ausência de ortólogos nas famílias gênicas

individualmente, levando em consideração a fase em que elas participam da resposta

imune, observamos que algumas possuem grande variação entre as espécies,

enquanto outras são bastante conservadas.

O repertório de receptores de reconhecimento de patógenos (PRRs), existente

nas três espécies, parece ter sido montado através de expansão gênica e rearranjo de

domínios, de acordo com os patógenos encontrados por cada organismo. Assim,

domínios antigos de reconhecimento, como o LRRs, parecem ter evoluído, formando

novos modelos de receptores com diferentes funções.

59

Introdução

A modulação imune é a etapa que regula a ativação das vias após o

reconhecimento do patógeno. Alguns exemplos seriam a modulação da ativação da

via Toll pela ativação de Spaetzle e a ativação da cascata de melanização. Ambos os

eventos envolvem a ativação de uma cascata de serino proteases e seus inibidores

(serpinas) e são espécie específicos, sugerindo que co-evoluíram junto com os

patógenos de cada organismo.

As vias de transdução de sinal intracelulares, como a via Toll, IMD e

JAK/STAT são altamente conservadas, e seus genes parecem evoluir sempre em

conjunto com outros genes da mesma via, para que esta não deixe de funcionar

(Figura 17).

Por último, os genes efetores seguem padrões evolutivos de acordo com seu

modo de ação: alguns são altamente específicos, como os AMPs e outros altamente

conservados, como os mecanismos de defesa oxidativa (enzimas antioxidantes)

(Waterhouse et al., 2007).

60

Introdução

Figura 17 – Genes e famílias gênicas envolvidas nas vias Toll e IMD (verde e roxo,

respectivamente). As fases caracterizadas, desde o reconhecimento até a produção de

efetores, estão marcadas. Os genes de D. melanogaster estão em azul, os de Anopheles gambiae

em vermelho e os de Aedes aegpyti em amarelo. Adaptado de Waterhouse et al., 2007.

61

Introdução

2.7 - Imunidade inata em Aedes aegypti

No genoma do mosquito A. aegypti foram encontrados 12 seqüências

homólogas ao receptor Toll de D. melanogaster. No entanto, até o momento apenas

três foram caracterizados, e esta via parece estar predominantemente envolvida no

controle de infecções causadas por fungos (Luna et al., 2003). Embora um gene

homólogo à Dif nunca tenha sido encontrado em nenhuma espécie de mosquito, o

homólogo de Dorsal (AaREL 1) parece ser ativado por estímulos imunológicos e

induzir a transcrição de peptídeos antimicrobianos in vitro. AaREL 1 possui dois

transcritos, codificando as isoformas A e B (Shin et al., 2005).

A via IMD, em mosquitos, começou a ser descrita com a clonagem e

caracterização do homólogo da proteína Relish (AaREL 2). Assim como em D.

melanogaster, este fator de transcrição possui ambos os domínios NF-kB e IkB na

mesma cadeia peptídica e é ativado por infecção com bactérias (Shin et al., 2002). Em

A. aegypti existem três isoformas de Relish, frutos de splicing diferencial de um

mesmo gene. A primeira delas possui o domínio Rel e o domínio inibidor de NF-kB

(IkB), assim como a proteína homóloga em D. melanogaster (Relish) e em mamíferos

(p100 e p105). Os dois outros transcritos que foram identificados possuem apenas a

região de homologia ao domínio REL ou apenas o domínio similar ao IkB (Shin et al.,

2002).

Em 2004, Lin et al., caracterizaram os análogos de STAT em Aedes albopictus e

demonstraram que, em cultura de células isoladas desse mosquito (C6/36), a

infecção por Japonese Encephalitis Vírus (JEV) leva à diminuição da fosforilação de

62

Introdução

STAT e, conseqüentemente, à diminuição de sua capacidade de se ligar ao DNA

celular e regular a expressão de genes efetores.

2.8 – Resposta à infecção viral em insetos

Muito pouco é conhecido sobre como o sistema imune inato de insetos

responde a infecções por vírus. Já foi demonstrado que ambas as vias Toll e IMD

podem ser ativadas em D. melanogaster pela infecção por Vírus X de Drosophila

(DXV), visto que a produção de peptídeos antimicrobianos (AMPs) se encontra

elevada, chegando a níveis comparáveis aos vistos em infecções com bactérias.

Porém, a análise com moscas mutantes para genes destas vias demonstrou que

apenas a via Toll parece ser essencial na defesa do organismo contra a infecção viral,

já que mutantes Relish possuem a mesma capacidade de lidar com a infecção do que

moscas selvagens. Ao mesmo tempo, a análise de mutantes que super-expressam

AMPs não mostra nenhuma diminuição na infecção pelo vírus. Sendo assim, se estas

moléculas possuem algum papel no combate à infecção, este papel parece ser

indireto, talvez auxiliando na ativação dos hemócitos e, conseqüentemente, na

resposta celular à presença do vírus (Zambon et al., 2005). Essa teoria é sustentada

pelo fato de que, em Lepidopteras, por exemplo, hemócitos são capazes de

reconhecer e melanizar células infectadas por vírus (Trudeau et al., 2001).

Estudos que investigaram a resposta de D. melanogaster ao vírus C de

Drosophila (DCV) identificaram diversos genes ativados após a infecção, sendo que

muitos deles possuíam uma seqüência de ligação para STAT em sua região

promotora. Além disso, este mesmo trabalho mostrou a ativação de STAT após

63

Introdução

infecção pelo DCV, assim como um aumento em sua atividade de ligação ao DNA,

sugerindo que a via JAK/STAT é ativada em moscas após infecção viral (Dostert et

al., 2005).

Recentemente, Sanders et al. (2005), utilizando técnicas de microarranjo de

DNA, demonstraram que a infecção de A. aegypti por vírus Sindbis leva à ativação de

genes ligados ao citoesqueleto e vias de transporte intracelular. Além disso, também

foi observado um aumento de duas vezes na expressão de aaRel 1 no primeiro dia

após a infecção, mostrando que a via Toll parece estar sendo ativada pela entrada do

vírus.

Assim como no trabalho citado acima, podem ser encontradas outras

referências de situações nas quais um fator de transcrição específico de uma via

possui sua expressão aumentada quando esta parece estar ativada por um desafio

imunológico. Em Frankliniella occidentalis, inseto vetor do TSWV (Tomato spotted wilt

virus), um experimento utilizando subtração de bibliotecas de cDNA de animais

infectados ou não pelo vírus mostraram um aumento da proteína homóloga ao fator

de transcrição aaRel 2 de A aegypti, além de vários outros genes das vias Toll e IMD,

inclusive peptídeos antimicrobianos (Medeiros et al, 2004). Em mamíferos já foi

mostrado que STAT 1 e STAT 3 são capazes de ativar a expressão deles mesmo,

promovendo uma alça positiva de ativação para essa via (Yang & Stark, 2008). Esses

dados sugerem que o nível de expressão de um determinado fator de transcrição

pode ser usado como um valioso indicativo da atividade daquela mesma via.

64

Objetivos

2 – Objetivos

Este trabalho tem como objetivo geral caracterizar a ativação das principais vias

do sistema imune inato de Aedes aegypti após a alimentação hematófaga, na

presença ou não de vírus, através da análise da expressão de genes ligados a

essas vias.

Objetivos específicos:

- Caracterizar a expressão de genes ligados às vias do sistema imune de Aedes

aegypti em diferentes estágios do desenvolvimento deste mosquito e em

diferentes órgãos da fêmea adulta alimentada com sangue.

- Observar a ativação das principais vias do sistema imune inato in vitro através

da infecção de células de Aedes albopictus em cultura (C6/36) com vírus Sindbis

e Dengue em diferentes tempos após a infecção.

- Analisar a ativação destas em mosquitos Aedes aegypti infectados por vírus

Sindbis.

- Analisar a ativação destas vias após o repasto sanguíneo, correlacionando a

ativação observada com a distensão do aparelho digestivo do mosquito e com a

digestão da hemoglobina.

65

Objetivos

- Caracterizar a captação de heme pela célula C6/36, os possíveis danos

oxidativos e a ativação de genes do sistema imune inato decorrentes desse

processo.

- Avaliar a influência da presença de heme na ativação destas vias e na carga

viral utilizando suspensão de esferas de látex como veículo para a infecção do

mosquito.

- Avaliar o papel da microbiota residente do aparelho digestivo médio do

mosquito na infecção por vírus Sindbis.

66

Material e Métodos

3 – Materiais e Métodos

3.1 – Mosquitos

Os mosquitos utilizados nesse trabalho eram adultos da espécie Aedes

aegypti, cepa Red-eye, mantidos no Laboratório de Biologia e Bioquímica de

Insetos do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, CCS, UFRJ.

Ovos, larvas, pupas e adultos foram submetidos a um fotoperíodo de 12 h

de claro e 12h de escuro, com umidade relativa do ar entre 75 e 80%, e

temperatura ambiente de 28 ± 1 °C.

Para eclosão, os ovos foram submetidos ao vácuo por 20 minutos em água.

As larvas recém eclodidas foram transferidas para bandejas com água e

alimentadas com ração de cachorro triturada, sendo re-divididas pelo menos

duas vezes nos dias seguintes para garantir condições de crescimento

homogêneas para toda a população. As pupas recém-eclodidas foram

transferidas para gaiolas, onde os adultos eram mantidos e alimentados com

sacarose 5% “ad libitum”. Toda a água utilizada foi filtrada e descansada por

pelo menos 12 h para reduzir os níveis de cloro.

Todos os experimentos envolvendo alimentação artificial foram realizados

com fêmeas de Aedes aegypti, entre 3 e 7 dias após a eclosão dos adultos, que

jamais haviam sido alimentadas com sangue anteriormente.

67

Material e Métodos

3.2 – Alimentação artificial dos mosquitos

Fêmeas adultas entre 3 e 7 dias após a eclosão foram deixadas 24 horas

sem a solução de sacarose 5% antes de qualquer alimentação artificial. As

diferentes soluções de alimentação (detalhadas nos itens 3.2.1, 3.2.2, 3.2.3 e

3.2.4) foram oferecidas aos mosquitos utilizando um alimentador artificial de

vidro jaquetado, aquecido por água a 37 °C, durante aproximadamente 1 hora,

utilizando uma membrana de Parafilme (adaptado de Garcia et al., 1975). ATP

(1mM) foi acrescentado em todas as soluções com função fagoestimulante.

Após a alimentação, os mosquitos foram anestesiados a -20 °C, por 2 minutos, e

as fêmeas alimentadas foram separadas numa nova gaiola. Os mosquitos

alimentados foram mantidos nas mesmas condições da colônia citada no item

3.1, até o momento da extração de RNA total.

3.2.1 – Infecção de mosquitos com vírus sindbis

As infecções com o vírus Sindbis foram feitas adaptando o protocolo

descrito por Lourenço-de-Oliveira et al., 2004 para infecção de mosquitos em

laboratório com o vírus Dengue. Resumidamente: sangue de coelho retirado na

presença de heparina foi lavado três vezes com PBS, centrifugando por 10

minutos a 3000 rpm. Esse lavado de hemácias (350 μL) foi misturado com

solução de vírus clarificado (150 μL) (como descrito no item XX) ou com

68

Material e Métodos

sobrenadante de cultura de células não infectadas. Essa solução (500 μL) foi

oferecida às fêmeas como descrito no item 3.2.

3.2.2 - Alimentação com Inibidor de tripsina (SBTI) e albumina bovina

(BSA)

Soluções de SBTI (1mM) e BSA (100mg/mL) foram preparadas na hora

em tampão fosfato 0,1 M pH 7.4. A solução de SBTI foi adicionada ao sangue

numa concentração final de 100 μM. A solução de BSA foi oferecida aos

mosquitos pura, sem adição de sangue. Neste experimento, a alimentação com

sangue foi acrescida do mesmo volume de tampão fosfato de sódio 0,1M pH 7.4

dos pontos experimentais e todas as soluções foram oferecidas aos mosquitos

como descrito no item 3.3.

3.2.3 – Alimentação com solução de esferas de látex (poliestireno)

A suspensão de esferas de látex foi preparada na hora da alimentação e

continha 10 mg de glicose, 10 μL de tampão bicarbonato de sódio 500mM,

pH7.4, 0,5 mg de agarose de baixo ponto de fusão e 50 μL de esferas de látex

(Sigma – LB-5). O volume final foi acertado para 350 μL utilizando NaCl 150

mM. Na hora da alimentação foi adicionado 150 μL de solução de vírus

69

Material e Métodos

clarificado ou sobrenadante de cultura de células não infectadas. Essa solução

(500 μL) foi oferecida às fêmeas como descrito no item 3.3.

3.2.4 – Pré-tratamento com antibióticos

Soluções de penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (0,1 mg/mL) foram

misturadas com a solução de sacarose 5 % e oferecidas diariamente aos

mosquitos, por quatro dias antes da alimentação artificial, exceto nas ultimas 24

horas, quando os mosquitos foram mantidos em jejum. A infecção dos

mosquitos foi realizada como descrito no item 3.3.1. Após a separação das

fêmeas alimentadas, os mosquitos dos grupos pré-tratados continuavam

recebendo soluções de açúcar com antibióticos por mais quatro dias, até o

momento da extração do RNA.

3.3 - Dissecção dos mosquitos

Os mosquitos foram imobilizados à -20 °C por 2 minutos, e transferidos

para uma placa de petri no gelo. A dissecção dos órgãos (cabeça, corpo

gorduroso, aparelho digestivo, ovários e tórax) foi feita sobre lâminas, em

etanol 50%, com o auxílio de pinças n° 5.

70

Material e Métodos

3.4 - Extração de RNA total e tratamento com DNAse

A extração de RNA total foi realizada utilizando o reagente TRIzol -

Invitrogen (Chomczynski, 1987). No caso de mosquitos inteiros, utilizamos

grupos de cinco mosquitos para cada extração. Em experimentos com

mosquitos dissecados, foram utilizados 10 orgãos por extração. O procedimento

consiste em uma homogeneização da amostra desejada em 1 mL do reagente,

uma solução monofásica de fenol e isotiocianato de guanidina, que garante a

integridade do RNA durante o processo de lise celular. A seguir, a adição de

clorofórmio e uma rápida centrifugação dividem o material em duas fases: uma

fase orgânica e uma fase aquosa, na qual se encontra o RNA. Após a passagem

da fase aquosa, contendo o RNA desejado, para um novo tubo, este pode ser

recuperado através de uma precipitação com isopropanol. Neste experimento,

após a precipitação, o RNA foi lavado com etanol 70% e ressuspenso em 10 μL

de água para a dosagem no espectrofotômetro.

O RNA total purificado foi dosado e sua qualidade monitorada por

medida da absorção de luz à 260, 280 e 320 nm . Aproximadamente 1 μg de

RNA foi tratado com 1 U de DNase I (Invitrogen) de acordo com o protocolo do

fabricante. Após 30 minutos, foi acrescentado 1 μl EDTA 25 mM e as amostras

foram incubadas a 65 °C, por 10 minutos, para inativação da enzima.

71

Material e Métodos

3.5 – Síntese da fita de cDNA

A síntese da primeira fita de DNA complementar (cDNA) foi realizada

por transcrição reversa do RNA obtido, utilizando o kit " High Capacity cDNA

Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems)”, conforme o protocolo do

fabricante. Todo o volume obtido no tratamento com DNAse foi utilizado para

a reação de síntese de cDNA. A reação ocorre com a adição de dNTPs, random

primers, tampão e a enzima transcriptase reversa do KIT ao RNA já tratado.

Após 2 horas a 37 ºC, a reação é interrompida através da desnaturação da

enzima à 75 ºC, por 10 minutos. Os cDNA foram estocados à –20 ºC até serem

utilizados.

3.6 - Amplificação do cDNA por reação em cadeia da polimerase (PCR)

Para conferir a amplificação do segmento desejado do cDNA, todos os

pares de iniciadores foram testados através de PCRs convencionais antes do

teste na máquina de PCR em tempo real. As reações continham tampão da

enzima Taq (10 X), dNTPs (0,2 mM), os oligonucleotídios (0.6 μM), 1 μl de

cDNA, água e a enzima Taq DNA polimerase (1 U) numa reação de 15 μl.

Todos os genes foram amplificados numa reação de 40 ciclos (94 °C – 30 seg

– desnaturação; 60 °C – 30 seg – anelamento; 72 °C – 30 seg – extensão) num

termociclador Gene Amp PCR System 2400 (Applied Biosystems) e analisados em

gel de agarose 2%.

72

Material e Métodos

3.7 – PCR quantitativo em tempo real

3.7.1 – A reação de PCR em tempo real

A análise da expressão relativa dos genes do sistema imune em Aedes

aegypti foi realizada utilizando a técnica de PCR em tempo real.

As reações de PCR em tempo real foram conduzidas em um

equipamento Applied Biosystms 7500 Real Time PCR System (Applied

Biosystems). Como sistema de detecção foi utilizado o SYBR Green (Power

SYBR® Green PCR Master Mix – Applied Biosystems), um reagente que emite

fluorescência ao se ligar inespecificamente a qualquer dupla fita de DNA.

Por causa dessa característica não especifica do SYBR Green, todas as

amostras utilizadas nos ensaios de PCR em tempo real foram previamente

tratadas com DNAse, com o intuito de eliminar qualquer tipo de contaminação

com DNA genômico que atrapalhasse a quantificação. As amostras de RNA

tratadas com DNAse foram testadas para garantir que não havia contaminação

genômica através de PCR convencional.

Todos os experimentos de quantificação foram realizados no mínimo

duas vezes, sendo que cada experimento era composto de uma duplicata

biológica. Alguns foram realizados em maior número de replicatas, o que será

descrito na legenda das respectivas figuras.

Para cada gene estudado foi utilizado um par de oligonucleotídeos

específico (Tabela 1). Antes de realizar a quantificação, cada oligonucleotídeo

73

Material e Métodos

foi testado por PCR convencional para estabelecer as condições ótimas da

reação. Posteriormente, os oligonucleotídeos eram submetidos a uma curva de

eficiência. Neste teste, um par de oligonucleotídeos (0,3 μM final) era utilizado

em reações com diferentes diluições de um mesmo cDNA (1, 1:10, 1:100 e

1:1000). A curva gerada neste procedimento indica a eficiência de reação

daquele determinado oligonucleotídeo naquela amostra, nos permitindo

garantir que a quantificação será valida dentro do método escolhido para o

processamento dos resultados (Método do ΔΔCt - User boletin #2, Applied

Biosystems, 2001) (Tabela 3.2).

Como o SYBR Green marca qualquer dupla fita de DNA, a análise do

branco de reação (reação que não contém cDNA) nos permite determinar a

temperatura de desnaturação (TM) do dímero de oligonucleotídeo formado na

ausência de amplificação. A temperatura de desnaturação (TM) do fragmento

amplificado foi determinada a partir da curva de eficiência. Essas temperaturas

nos permitem avaliar, após cada experimento, se a reação produziu o resultado

esperado para aquele determinado par de oligonucleotídeos.

A tabela 3.1 apresenta a listagem de todos os oligonucleotídeos utilizados

nesse trabalho, mostrando a seqüência de nucleotídeos de cada um deles.

74

Material e Métodos

Gene Seqüência dos olignucleotídeos iniciadores

F GACTCGTCGGAGCTGAAATC aaREL R CGGTTTGTTCAGGTTGTTGA

F TCTGTCGGCAGATGAAGTGA aaREL R GCACTGGAATGGAGAATCAAA F TCTTGCGTTGAAGTGAGTGG Cactus R GACCCTCTGAAAGGGAAAGG D1 TCAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG Dengue TS2 CGCCACAAGGGCCATGAACAG F GATTCGGCGTTGGTGATAGT Defensina R TTATTCAATTCCGGCAGACG F TCGTCAAACTCGGTTTTCCT IMD R TGGCGGAGTTGAAGGTAAAG F CGATGCGTTCATTTTGTTTG MyD88 R CACCGCTCAGAAATCAGCTT F GCTATGACAAGCTTGCCCCCARP49 R TCATCAGCACCTCCAGCTF ACGTGATGGATTGGATGGAG Serpina R GTGCCTGCACTTGTTTCTGA F TGACTAACCGGGGTAGGT SINDBIS R TTGGCTTCGGTGGGCATC F CGTTCACCTTCTGGGAGTGG STAT alb R AATGGCTGGATGTGCAGGAT F CACACAAAAAGGACGAAGCA STAT R TCCAGTTCCCCTAAAGCTCA F ATTTTTGACGGCTTTTGTGG TEP R TGGATTACTTGCCCCACTTC

Tabela 1 – Oligonucleotídeos utilizados para quantificação relativa por PCR em

tempo real dos genes listados.

O gene RP49 (Gentile et al., 2005), que codifica uma proteína ribossomal,

foi utilizado como controle endógeno para a normalização em todos os

experimentos, tanto em células C6/36 quanto em mosquitos.

75

Material e Métodos

As reações eram realizadas utilizando 7,5 μL do kit Power SYBR® Green

PCR Master Mix (Applied Biosystems), 0,5 μL do par de oligonucleotídeos

específico a ser analisado (10 μM), 6,5 μL de água Milli-Q autoclavada e 5 μL do

cDNA (previamente diluído de acordo com o experimento em questão), num

volume final de 15 μL de reação.

As reações foram realizadas nas seguintes condições: 95 °C por 10

minutos, 40 ciclos de duas temperaturas: 95 °C por 15 segundos e 60 °C por 1

minuto, seguido de uma curva de desnaturação.

3.7.2 – Cálculo da quantificação relativa

O programa ABI Prism 7500 Sequence Detection software versão 1.2.3

(Applied Biosystems) acompanha a reação de PCR em tempo real, gerando um

gráfico correspondente ao logaritmo do valor da fluorescência medida em cada

poço pelo número do ciclo correspondente (Figura 3.2). Uma linha de corte

(denominada Threshold) é delimitada em um ponto onde todas as curvas (de

todos os poços do experimento) estejam em sua fase exponencial (Figura 2.1).

O ciclo do PCR no qual a curva de amplificação de um determinado gene

cruza a linha de corte é denominado Ct (Ciclo de acordo com o Threshold). De

acordo com a quantidade inicial de DNA presente em cada amostra analisada,

esta amostra irá levar um número maior ou menor de ciclos para que sua curva

de amplificação alcance a linha de corte (threshold). Deste modo, amostras com

pouco DNA apresentarão um Ct elevado, enquanto amostras com mais DNA

apresentarão um Ct mais baixo.

76

Material e Métodos

Figura 18 – Gráfico representativo de uma corrida de PCR em tempo real. O gráfico

representa o Log da fluorescência medida pelo aparelho versus o número do ciclo de

leitura da fluorescência. As setas pretas indicam a fase exponencial do processo de

amplificação do DNA e a linha de corte ou Threshold determinada pelo aparelho em

um ponto no qual todas as curvas do experimento estão na fase exponencial. Adaptado

de Real Time PCR vs. Tradicional PCR, Applied Biosystems,

(http://www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/rtpcr_vs_tradpcr.pdf,

2008).

O método que utilizamos para realizar a quantificação relativa dos genes

do sistema imune neste trabalho foi o Comparative Ct Method, também chamado

de Método do ΔΔCt (Livak & Schmittgen, 2001; Pfaffl, 2001), utilizando o gene

RP 49 como normalizador endógeno. O detalhamento dos cálculos utilizados

para a análise dos dados encontra-se explicado nos manuais da Applied

Biosystems (Método do ΔΔCt - User boletin #2, Applied Biosystems, 2001).

A expressão relativa final de cada gene foi estabelecida pela média entre

as expressões relativas dos diferentes experimentos.

77

Material e Métodos

A validação do Método do ΔΔCt foi efetuada de acordo com o manual da

Applied Biosystems (User boletin #2, Applied Biosystems, 2001), através da

comparação entre as curvas de eficiência de cada par de oligonucleotídeo

utilizado com a curva de eficiência do normalizador endógeno, o RP49 (Tabela

3.2).

Gene TM (°C) R2

Curva de eficiência Eficiência

aaREL 1 81,1 0,9989 1,1516 aaREL 2 79,7 0,9999 1,1144 Cactus 79,2 0,993 1,034 Dengue 81,0 0,9984 1,0988 Defensina 81,9 0,9992 0,9955 IMD 78,9 0,9925 1,1068 MyD88 76,8 0,9889 1,03 RP49 83,7 0,9879 1,2002 Serpina 79,2 0,9995 1,0149 SINV 83,3 0,9955 1,1034 STAT 75,7 1 1,1797 TEP 78,9 0,9992 1,0604

Tabela 2 – Eficiência dos oligonucleotídeos. Nome do gene, temperatura de

desnaturação (TM), o R2 da curva de eficiência e a eficiência de amplificação de cada

um dos oligonucleotídeos utilizados nesse trabalho. A eficiência foi calculada

utilizando a formula E=10(-1/slope)-1.

3.7.3 – Análise estatística dos dados

As análises estatísticas dos dados foram feitas utilizando análises de

variância (ANOVA) e o teste t de Student. Nas análises de variância e correlação

78

Material e Métodos

dos resultados de quantificação relativa foram utilizados os valores de ΔCt de

cada experimento.

3.8 – Cultura de células e propagação de vírus

A linhagem celular C6/36, derivada da linhagem original isolada por

Singh (Singh, 1967) foi mantida em meio L-15 suplementado com 10% de soro

fetal bovino, 0,2g/L de L-glutamina, 1% de aminoácidos essenciais, 1% de

antibióticos, 0,1% de fungizona e 10 % de Triptose fosfato.

O vírus Sindbis, cepa AR339, foi propagado e titulado como descrito em

Gaspar et al., 2001. Resumidamente Células BHK-21 (Baby hamster kidney)

foram mantidas em meio DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s médium –

Sigma Chemical Co.) suplementado com 10% de soro fetal bovino e 3% de

triptose fosfato a 37 °C em um estufa com 5% de CO2. As células foram

infectados com uma MOI (multiplicity of infection) de 1 e mantidas por 48

horas a 37 °C. O sobrenadante foi coletado e clarificado de restos celulares por

centrifugação e congelado a -70 °C até o momento das infecções.

O vírus Sindbis foi titulado utilizando ensaio de placa em células BHK-

21, utilizando meio 199 sem soro e CMC 1% por 48 horas a 37 °C. Após 48 horas

as placas foram fixadas com formaldeído 20% por duas horas, lavadas e coradas

com cristal violeta (1 g % em etanol 20%).

79

Material e Métodos

3.9 – Infecção das células C6/36

Células C6/36 crescidas em garrafas de cultura de tecidos de 25 cm2 por

24 horas foram infectadas com vírus Sindbis ou Dengue.

O vírus Sindbis ou Dengue (numa MOI de 10 e 1, respectivamente) foi

ressuspenso em 1 mL de L-15 sem soro fetal bovino e incubado com as células

por 1 hora a 28 °C. Após a incubação, as células foram lavadas três vezes com

PBS estéril e 5 mL de meio L-15 com 10% de soro fetal bovino foi adicionado. As

células controle foram manipuladas da mesma maneira, porém o meio sem soro

não foi acrescido de nenhum tipo de vírus. As células foram mantidas a 28 °C

por diferentes períodos de tempo.

3.10 - Tratamentos com heme e análogos de heme em C6/36

Células C6/36 crescidas em garrafas de cultura de tecidos de 25 cm2 ou

placas de 6 poços com lamínulas estéreis de vidro no fundo para microscopia

por 24 horas foram com heme ou Sn-Protoporfirina.

As soluções estoque de heme e Sn-Protoporfirina foram sempre feitas na

hora, em DMSO, para uma concentração de 30 mM. A solução estoque foi

diluída em 1 mL de L15 já suplementado com soro fetal bovino para uma

concentração de 25 μM e adicionada às células. Os pontos controle sempre

receberam a mesma quantidade de DMSO dos experimentais (sempre menos de

80

Material e Métodos

0,1% de DMSO, concentração não nociva para célula, como mostrado na figura

34).

As células foram mantidas com o estímulo à 28 °C durante o tempo de

cada experimento.

3.11 - Microscopia de fluorescência das células incubadas com Sn-

protoporfirina

As lamínulas com células foram mantidas em formaldeído 4% preparado

na hora em PBS a 4 °C e posteriormente colocadas em uma lâmina e observadas

por contraste de interferência diferencial, utilizando-se um microscópio

Axioplan 2 (Zeiss). As imagens de fluorescência foram obtidas usando uma

lâmpada de mercúrio de 100 W como a fonte de excitação e um filtro Zeiss-15

(BP 546 nm-12/FT 580 nm/LP 590 nm).

3.12 - Viabilidade celular por redução de MTT

Os experimentos de MTT foram realizados com amostras tratadas como

descrito no item 3.11. Após a incubação das células com os estímulos por 24

horas, o meio era retirado e as células foram lavadas com PBS pH 7,4. Após a

lavagem foi adicionado 300 μL de solução de MTT 0,5 mg/mL em PBS. A placa

foi mantida por 15 minutos no escuro a 37 °C, quando então a solução contendo

MTT foi retirada e adicionou-se 200 μL de DMSO. Após 15 minutos sob

81

Material e Métodos

agitação cada amostra foi lida à 540 nm em um espectrofotômetro. A amostra

com valor mais alto foi considerada 100% para cálculo da percentagem de

viabilidade celular.

82

Resultados

83

4- Resultados

4.1 – Caracterização de genes do sistema imune em Aedes aegypti

A ativação das principais vias do sistema imune inato em resposta a infecções

por fungos e bactérias em insetos vem sendo alvo constante de diversos estudos.

Inicialmente em D. melanogaster e mais recentemente nos mosquitos A. gambiae e A

aegypti, o seqüenciamento do genoma nos permitiu identificar genes ortólogos

ligados à resposta imune, permitindo-nos fazer um mapa bastante amplo das

principais vias existentes em cada organismo bem como de seus genes efetores.

Deste modo, utilizamos os dados provenientes do seqüenciamento do genoma

de A aegypti para selecionar nove genes ligados às três principais vias do sistema

imune inato deste mosquito para este estudo. A partir de sua seqüência de cDNA,

desenhamos um par de oligonucleotídeos iniciadores para cada um destes genes, no

intuito de quantificar sua expressão nos diferentes tecidos, estágios e gêneros do

mosquito através de PCR em tempo real, como descrito em Material e Métodos.

Os genes escolhidos para essa análise inicial foram: aaREL 1, Cactus, MYD88 e

Serpina 27A (pertencentes a via Toll); IMD, aaREL 2 e Defensina (pertencentes a via

IMD); STAT e TEP (pertencentes a via JAK/STAT) (Figura 15, Tabela 1). Os níveis de

expressão destes nove genes foram medidos em RNA total extraído de diferentes

estágios do ciclo de vida do mosquito: larvas de primeiro, segundo/terceiro e quarto

estágios, pupas, machos e fêmeas recém eclodidos (Figuras de 19 A a 27 A).

Resultados

84

O primeiro estágio larvar (L1) apresentou o nível mais baixo da expressão de

todos os genes estudados quando comparado com os outros estágios do ciclo de vida

utilizados nesse trabalho.

Surpreendentemente, o macho apresentou expressão mais elevada de quase

todos os genes citados em relação aos outros estágios estudados e às fêmeas não

alimentadas com sangue. Os genes aaREL 1 (Fig 19 A), Cactus (Fig 20 A) e IMD (Fig

23A) foram os únicos que apresentaram expressão no macho inferior a 2 vezes a

expressão da fêmea.

Observando os demais estágios do ciclo de vida do mosquito, a expressão dos

nove genes não apresentou nenhuma outra característica marcante, apenas uma alta

expressão de IMD em larvas de quarto estágio (L4) (Figura 23 A).

Paralelamente, fêmeas adultas alimentadas com sangue foram dissecadas e os

diferentes tecidos foram submetidos a uma extração de RNA total como descrito em

materiais e métodos e analisados pela mesma metodologia. Os tecidos estudados

foram: Cabeça (C), Corpo gorduroso (CG), Aparelho digestivo médio (MG), Ovários

(OV) e Tórax (T) (Figuras 19 B a 27 B).

Podemos observar uma alta expressão de aaREL 1 e Cactus no ovário (Figuras

19 B e 20 B) enquanto aaREL 2 é claramente muito expresso no aparelho digestivo

(Figura 24 B). O peptídeo antimicrobiano estudado, a Defensina, tem sua expressão

bastante alta no corpo gorduroso (Figura 25B), órgão previamente caracterizado

como responsável pela produção de AMPs em insetos. Os demais genes, MYD88,

Serpina 27A, IMD, STAT e TEP, apresentaram uma expressão mais alta na cabeça do

que nos demais tecidos (Figura 21 B, 22 B, 23 B, 26 B e 27 B, respectivamente).

Resultados

85

É possível também observar que, genes que dão origem a proteínas secretadas,

como a Serpina 27A, a Defensina e TEP, apresentaram altos níveis de expressão no

corpo gorduroso, enquanto genes que codificam fatores de transcrição, como

aaREL1, aaREL 2 e STAT, apresentaram-se pouco expressos neste órgão de síntese.

Resultados

86

Figura 19 – Expressão relativa de aaREL 1 nos diferentes estágios de vida do mosquito

Aedes aegypti e nos diferentes tecidos da fêmea adulta alimentada com sangue.

Resultado de dois experimentos independentes de quantificação relativa por PCR em tempo

real. O gráfico A representa a expressão relativa em diferentes estágios de vida do mosquito:

larva estágio 1 (L1), larva estágios 2 e 3 (L2/3), larva estágio 4 (L4), pupa (P), fêmea (F) e

macho (M) recém eclodidos. O gráfico B representa a expressão relativa deste mesmo gene

nos diferentes tecidos da fêmea adulta, 24 horas após a alimentação com sangue: Cabeça (C),

Corpo gorduroso (CG), Aparelho digestivo (MG), ovário (OV) e Tórax (T).

Resultados

87

Figura 20 – Expressão relativa de Cactus nos diferentes estágios de vida do mosquito Aedes

aegypti e nos diferentes tecidos da fêmea adulta alimentada com sangue.

Resultado de dois experimentos independentes de quantificação relativa por PCR em tempo

real. O gráfico A representa a expressão relativa em diferentes estágios de vida do mosquito:

larva estágio 1 (L1), larva estágios 2 e 3 (L2/3), larva estágio 4 (L4), pupa (P), fêmea (F) e

macho (M) recém eclodidos. O gráfico B representa a expressão relativa deste mesmo gene

nos diferentes tecidos da fêmea adulta, 24 horas após a alimentação com sangue: Cabeça (C),

Corpo gorduroso (CG), Aparelho digestivo (MG), ovário (OV) e Tórax (T).

Resultados

88

Figura 21 – Expressão relativa de MYD 88 nos diferentes estágios de vida do mosquito

Aedes aegypti e nos diferentes tecidos da fêmea adulta alimentada com sangue.

Resultado de dois experimentos independentes de quantificação relativa por PCR em tempo

real. O gráfico A representa a expressão relativa em diferentes estágios de vida do mosquito:

larva estágio 1 (L1), larva estágios 2 e 3 (L2/3), larva estágio 4 (L4), pupa (P), fêmea (F) e

macho (M) recém eclodidos. O gráfico B representa a expressão relativa deste mesmo gene

nos diferentes tecidos da fêmea adulta, 24 horas após a alimentação com sangue: Cabeça (C),

Corpo gorduroso (CG), Aparelho digestivo (MG), ovário (OV) e Tórax (T).

Resultados

89

Figura 22 – Expressão relativa de Serpina nos diferentes estágios de vida do mosquito

Aedes aegypti e nos diferentes tecidos da fêmea adulta alimentada com sangue.

Resultado de dois experimentos independentes de quantificação relativa por PCR em tempo

real. O gráfico A representa a expressão relativa em diferentes estágios de vida do mosquito:

larva estágio 1 (L1), larva estágios 2 e 3 (L2/3), larva estágio 4 (L4), pupa (P), fêmea (F) e

macho (M) recém eclodidos. O gráfico B representa a expressão relativa deste mesmo gene

nos diferentes tecidos da fêmea adulta, 24 horas após a alimentação com sangue: Cabeça (C),

Corpo gorduroso (CG), Aparelho digestivo (MG), ovário (OV) e Tórax (T).

Resultados

90

Figura 23 – Expressão relativa de IMD nos diferentes estágios de vida do mosquito Aedes

aegypti e nos diferentes tecidos da fêmea adulta alimentada com sangue.

Resultado de dois experimentos independentes de quantificação relativa por PCR em tempo

real. O gráfico A representa a expressão relativa em diferentes estágios de vida do mosquito:

larva estágio 1 (L1), larva estágios 2 e 3 (L2/3), larva estágio 4 (L4), pupa (P), fêmea (F) e

macho (M) recém eclodidos. O gráfico B representa a expressão relativa deste mesmo gene

nos diferentes tecidos da fêmea adulta, 24 horas após a alimentação com sangue: Cabeça (C),

Corpo gorduroso (CG), Aparelho digestivo (MG), ovário (OV) e Tórax (T).

Resultados

91

Figura 24 – Expressão relativa de aaRel 2 nos diferentes estágios de vida do mosquito

Aedes aegypti e nos diferentes tecidos da fêmea adulta alimentada com sangue.

Resultado de dois experimentos independentes de quantificação relativa por PCR em tempo

real. O gráfico A representa a expressão relativa em diferentes estágios de vida do mosquito:

larva estágio 1 (L1), larva estágios 2 e 3 (L2/3), larva estágio 4 (L4), pupa (P), fêmea (F) e

macho (M) recém eclodidos. O gráfico B representa a expressão relativa deste mesmo gene

nos diferentes tecidos da fêmea adulta, 24 horas após a alimentação com sangue: Cabeça (C),

Corpo gorduroso (CG), Aparelho digestivo (MG), ovário (OV) e Tórax (T).

Resultados

92

Figura 25 – Expressão relativa de Defensina nos diferentes estágios de vida do mosquito

Aedes aegypti e nos diferentes tecidos da fêmea adulta alimentada com sangue.

Resultado de dois experimentos independentes de quantificação relativa por PCR em tempo

real. O gráfico A representa a expressão relativa em diferentes estágios de vida do mosquito:

larva estágio 1 (L1), larva estágios 2 e 3 (L2/3), larva estágio 4 (L4), pupa (P), fêmea (F) e

macho (M) recém eclodidos. O gráfico B representa a expressão relativa deste mesmo gene

nos diferentes tecidos da fêmea adulta, 24 horas após a alimentação com sangue: Cabeça (C),

Corpo gorduroso (CG), Aparelho digestivo (MG), ovário (OV) e Tórax (T).

Resultados

93

Figura 26 – Expressão relativa de STAT nos diferentes estágios de vida do mosquito Aedes

aegypti e nos diferentes tecidos da fêmea adulta alimentada com sangue.

Resultado de dois experimentos independentes de quantificação relativa por PCR em tempo

real. O gráfico A representa a expressão relativa em diferentes estágios de vida do mosquito:

larva estágio 1 (L1), larva estágios 2 e 3 (L2/3), larva estágio 4 (L4), pupa (P), fêmea (F) e

macho (M) recém eclodidos. O gráfico B representa a expressão relativa deste mesmo gene

nos diferentes tecidos da fêmea adulta, 24 horas após a alimentação com sangue: Cabeça (C),

Corpo gorduroso (CG), Aparelho digestivo (MG), ovário (OV) e Tórax (T).

Resultados

94

Figura 27 – Expressão relativa de TEP nos diferentes estágios de vida do mosquito Aedes

aegypti e nos diferentes tecidos da fêmea adulta alimentada com sangue.

Resultado de dois experimentos independentes de quantificação relativa por PCR em tempo

real. O gráfico A representa a expressão relativa em diferentes estágios de vida do mosquito:

larva estágio 1 (L1), larva estágios 2 e 3 (L2/3), larva estágio 4 (L4), pupa (P), fêmea (F) e

macho (M) recém eclodidos. O gráfico B representa a expressão relativa deste mesmo gene

nos diferentes tecidos da fêmea adulta, 24 horas após a alimentação com sangue: Cabeça (C),

Corpo gorduroso (CG), Aparelho digestivo (MG), ovário (OV) e Tórax (T).

Resultados

95

4.2 – Ativação das principais vias do sistema imune inato por infecção viral em

células C6/36 de Aedes albopictus.

Apesar da resposta a fungos e bactérias estar bastante bem caracterizada em

insetos, muito pouco é conhecido sobre a ativação dessas vias em resposta à infecção

viral. No entanto, alguns indícios apontam para a participação das vias Toll e

JAK/STAT em D. melanogaster (Zambon et al., 2005, Dostert et al., 2005), como

discutido anteriormente. A via Toll também se mostrou ativada em Aedes aegypti

infectado por vírus Sindbis, um dia após a infecção (Sanders et al., 2005).

Baseado nesses estudos decidimos caracterizar a participação das vias Toll,

IMD e JAK/STAT em uma linhagem embrionária de células em cultura de Aedes

albopicuts (C6/36) infectadas com vírus Dengue e Sindbis. Para isso, usamos a

expressão dos fatores de transcrição das respectivas vias como marcadores da

ativação das mesmas (Sanders et al., 2005, Yang & Stark, 2008, Medeiros et al, 2004).

Em células C6/36, a infecção por Dengue foi bem sucedida, como mostra a

Figura 28A, que representa a quantidade de RNA viral contida no interior das células

normalizada pela expressão de um gene constitutivo (RP49) do mosquito. Podemos

observar um aumento de cerca de 2 vezes no primeiro dia e cerca de 80 vezes no

sétimo dia em relação ao momento imediatamente após a infecção (0 hora).

Quando investigamos a expressão relativa dos fatores de transcrição aaREL 1,

aaREL 2 e STAT (Figura 28 B, C e D, respectivamente), observamos um aumento

destes genes nas células infectadas quando comparadas às células não infectadas que

passaram pela mesma manipulação. Estes resultados sugerem uma ativação das três

principais vias do sistema imune inato em insetos após a infecção pelo vírus da

Resultados

96

dengue. Apesar de todos os genes estarem aumentados no início da infecção, STAT

parece sofrer uma queda após o primeiro dia de infecção, o que pode significar uma

ativação desta via apenas em eventos agudos da infecção.

No intuito de observar se essa ativação era específica da infecção por vírus

Dengue ou comum a infecções por outros arbovírus de famílias diferentes,

infectamos células C6/36 com um alphavirus, o vírus Sindbis.

Neste caso a infecção também foi bem sucedida, como pode ser observado

através da quantificação do RNA do vírus Sindbis (Figura 29 A). As células

infectadas com Sindbis também apresentaram um aumento no nível de expressão

dos três fatores de transcrição analisados, aaREL 1, aaREL 2 e STAT. Este aumento,

no entanto, só foi significativo em tempos mais prolongados (7 dias), não sendo

observado no primeiro dia após a infecção (Figura 29 B, C e D).

Resultados

97

Figura 28 – Infecção de células C6/36 com vírus Dengue.

Resultado de três experimentos independentes de quantificação relativa por PCR em tempo

real. O gráfico A representa a expressão relativa do RNA viral normalizado pelo gene

ribossomal do mosquito RP49. O tempo 0 é usado como calibrador e, portanto, fixado em 1.

A escala da expressão relativa está representada como [Log10] para facilitar a visualização.

Os gráficos B, C e D mostram, respectivamente, a expressão relativa de aaREL 1, aa REL 2 e

STAT nos tempos 0, 1 e 7 dias após a infecção. O gene RP49 foi usado como normalizador em

todos os casos e células não infectadas, mas que passaram por manipulações idênticas num

mesmo intervalo de tempo, foram usadas como calibradores para o cálculo da expressão

relativa. A análise da variância (ANOVA) indicou diferenças significativas entre alguns

pontos, sinalizados com * em cada gráfico.

Resultados

98

Figura 29 – Infecção de células C6/36 com vírus Sindbis.

Resultado de dois experimentos independentes de quantificação relativa por PCR em tempo

real. O gráfico A representa a expressão relativa do RNA viral normalizado pelo gene

ribossomal do mosquito RP49. O tempo 0 é usado como calibrador e, portanto, fixado em 1.

A escala da expressão relativa está representada como [Log10] para facilitar a visualização.

Os gráficos B, C e D mostram, respectivamente, a expressão relativa de aaREL 1, aa REL 2 e

STAT nos tempos 0, 1 e 7 dias após a infecção. O gene RP49 foi usado como normalizador em

todos os casos e células não infectadas, mas que passaram por manipulações idênticas num

mesmo intervalo de tempo, foram usadas como calibradores para o cálculo da expressão

relativa. A análise da variância (ANOVA) indicou diferenças significativas entre alguns

pontos, sinalizados com * em cada gráfico.

Resultados

99

4.3 – Ativação das principais vias do sistema imune inato por infecção viral em

Aedes aegypti

Com o objetivo de caracterizar a ativação destas vias no mosquito adulto,

partimos para a infecção de Aedes aegypti em sistema de alimentação artificial. Apesar

de diversas tentativas não fomos capazes de infectar nossa linhagem de mosquitos

com o vírus Dengue, mesmo utilizando o protocolo já descrito na literatura (Lanciotii

et al, 1992). Contudo, a infecção artificial com o vírus Sindbis se mostrou muito

eficiente (Figura 30 A) e permitiu que avaliássemos alguns dos parâmetros desejados.

As expressões de aaREL 1, aaREL 2 e STAT mostraram uma tendência de

aumento em diferentes tempos após a infecção, como pode ser visto nas Figuras 30 B,

C e D. Os fatores de transcrição aaREL 1 e STAT se comportaram de modo

semelhante ao visto em C6/36, apresentando um aumento mais expressivo em

momentos mais avançados da infecção. No entanto, aaREL 2 mostrou maior ativação

um dia após a infecção.

Como obtivemos uma variação experimental muito grande, decorrente de

uma grande variação biológica dos parâmetros observados, escolhemos realizar os

ensaios com apenas um tempo após a infecção, porém com mais réplicas por

experimento. Escolhemos o tempo de quatro dias após a infecção para dar

continuidade aos experimentos, visto que este é um momento no qual não existe

mais sangue no aparelho digestivo médio do mosquito, de modo que todo vírus

detectado está necessariamente contido nas células do hospedeiro. Além disso, de

acordo com Foy e colaboradores, em 2004, o quarto dia já apresenta sinais de infecção

disseminada e ainda possui muitos focos de infecção no aparelho digestivo.

Resultados

100

Esta análise mais cuidadosa do quarto dia após a infecção, nos permitiu

observar uma tendência ao aumento da expressão de aaREL 1 e aaREL 2 neste

momento, e nenhum aumento na expressão de STAT em relação aos mosquitos não

infectados (Figura 31). Nestes experimentos foi extraído RNA total de mosquitos

inteiros, o que pode ter influenciado negativamente o resultado, visto que

observamos expressão diferenciada destes fatores de transcrição nos diferentes

órgãos do mosquito 24 horas após a alimentação (aaREL 1 mais alto nos ovários,

aaREL2 no aparelho digestivo e STAT na cabeça). Dados preliminares mostraram

que, quando o RNA total é extraído apenas de aparelho digestivo médio, o aumento

desses fatores de transcrição parece mais pronunciado.

Resultados

101

Figura 30 – Infecção mosquitos Aedes aegypti com vírus Sindbis.

Resultado de dois experimentos independentes de quantificação relativa por PCR em tempo

real. O gráfico A representa a expressão relativa do RNA viral normalizado pelo gene

ribossomal do mosquito RP49. O tempo 1 é usado como calibrador e, portanto, fixado em 1.

A escala da expressão relativa está representada como [Log10] para facilitar a visualização.

Os gráficos B, C e D mostram, respectivamente, a expressão relativa de aaREL 1, aa REL 2 e

STAT nos tempos 1, 4 e 7 dias após a infecção. O gene RP49 foi usado como normalizador em

todos os casos, e mosquitos não infectados, alimentados artificialmente com sangue em

intervalos idênticos aos infectados, foram usadas como calibradores para o cálculo da

expressão relativa. A análise da variância (ANOVA) não indicou nenhuma diferença

significativa neste experimento.

Resultados

102

Figura 31 – Infecção de mosquitos Aedes aegypti com vírus Sindbis – quarto dias após a

alimentação.

Resultado de três experimentos independentes, cada um com uma duplicata biológica

interna, de quantificação relativa por PCR em tempo real. O gráfico representa a expressão

relativa de aaREL 1, aa REL 2 e STAT 4 dias após a infecção com vírus Sindbis. O gene RP49

foi usado como normalizador em todos os casos, e mosquitos não infectados, alimentados

artificialmente com sangue em intervalos idênticos aos infectados, foram usados como

calibradores para o cálculo da expressão relativa, sendo fixados em 1 (linha pontilhada). A

análise da variância (ANOVA) não indicou nenhuma diferença significativa neste

experimento.

Resultados

103

4.4 – Aumento da expressão dos genes do sistema imune disparado pela

alimentação sanguínea

Considerando que o vírus, assim como a maioria dos patógenos transmitidos

por vetores, invade o aparelho digestivo médio do mosquito durante o repasto

sanguíneo, resolvemos avaliar o quanto cada um dos diferentes componentes deste

processo participa da regulação da ativação destas vias do sistema imune.

Para isso, alimentamos mosquitos artificialmente utilizando sacarose 5%,

sangue, sangue suplementado com SBTI (no intuito de inibir a principal enzima

digestiva do mosquito, uma tripsina) e BSA, este último em uma concentração

protéica semelhante à presente no sangue (Figura 32 A, B e C). Convém ressaltar que

os mosquitos alimentados apenas com açúcar apresentam conteúdo alimentar

reduzido no aparelho digestivo médio, visto que a solução de sacarose se acumula no

divertículo, sendo liberada para o intestino em pequenas porções.

Assim, após diferentes tipos de alimentação, os mosquitos foram mantidos na

colônia por 24 horas e então dissecados. Apenas o aparelho digestivo médio foi

utilizado para a extração do RNA total e quantificação dos genes de interesse, visto

que queríamos observar o efeito local da ingestão do alimento oferecido.

Quando comparados com mosquitos alimentados com sacarose, os mosquitos

alimentados com sangue apresentaram um aumento de duas ou mais vezes de

aaREL 1 e STAT e de 1,7 vezes de aaREL 2. Já os mosquitos alimentados com BSA

não apresentaram nenhum aumento significativo de aaREL 1 e 2 e um pequeno

aumento em STAT. Esse resultado indica que apenas a distensão do aparelho

digestivo médio ou a presença de aminoácidos e/ou proteínas não parece ser capaz

Resultados

104

de ativar a via Toll e a via IMD do mesmo modo que o sangue, mas possui algum

efeito na via JAK/STAT, sugerindo que a qualidade do alimento ingerido é

importante para a ativação ou não das vias estudadas.

Com a intenção de saber se o próprio sangue era o indutor desse aumento, ou

algum produto proveniente de sua degradação, observamos os mosquitos

alimentados com sangue acrescido de SBTI. Estes mosquitos apresentavam o

aparelho digestivo médio ainda cheio de sangue 24 horas após a alimentação,

indicando que a digestão estava realmente comprometida. Os mosquitos níveis

equivalente de aaREL 2 e STAT aos níveis observados nos animais alimentados

somente com sangue (Figura 32 B e C), porém os níveis de aaREL 1 (Figura 32 A)

eram próximos aos do controle dos mosquitos alimentados apenas com açúcar.

Resultados

105

Figura 32 – Ativação das principais vias do sistema imune inato em fêmeas de Aedes

aegypti após a alimentação.

Resultado de três experimentos independentes de quantificação relativa por PCR em tempo

real. Os gráficos A, B e C representam a expressão relativa de aaREL 1, aa REL 2 e STAT,

respectivamente, em mosquitos alimentados com açúcar, sangue, sangue suplementado de

SBTI e BSA. O gene RP49 foi usado como normalizador em todos os casos, e os mosquitos

alimentados com açucar foram usados como calibradores para o cálculo da expressão

relativa, tendo sua expressão fixada em 1. A análise da variância (ANOVA) indicou

diferenças significativas entre alguns pontos, sinalizados com * em cada gráfico.

Resultados

106

4.5 – Células C6/36 são capazes de captar heme

Como a expressão de aaREL 1 parece ser dependente da digestão do sangue,

decidimos investigar se o heme, grupamento prostético da hemoglobina, é capaz de

induzir alguma modificação na expressão dos genes selecionados. Para isso

utilizamos, inicialmente, sistema in vitro de cultura de células C6/36.

As células C6/36 foram incubadas com uma porfirina fluorescente, utilizada

como análogo da molécula de heme, a Sn protoporfirina IX. Este análogo possui o

anel porfirínico semelhante ao do heme, com uma substituição do átomo de ferro

central por um átomo de estanho. Ao contrario do heme, esta molécula tem a

propriedade de ser fluorescente, tornando possível a observação de sua localização

dentro da célula por microscopia. Este procedimento já foi utilizado com outras

porfirinas fluorescente, como a Pd-proptorfirina IX , com a mesma finalidade (Lara et

al., 2005).

Após diferentes tempos de incubação com 25 µM de Sn-protoporfirina, as

células foram fixadas com fomaldeído e as lâminas observadas no microscópio de

fluorescência. É possível notar um aumento da fluorescência no interior das células

incubadas com a Sn-protoporfirina, sugerindo que esta linhagem celular é capaz de

captar heme do meio de cultura (Figura 33).

Com o objetivo de identificar se a molécula de heme captado pela C6/36

causava algum dano celular, realizamos um ensaio de viabilidade em células em

C6/36 incubadas por 24 horas com 25 µM de heme (Figura 34), no qual pode-se notar

que a viabilidade das células com heme é semelhante a das células controle. O

DMSO, utilizado como veículo tanto para o heme como para a Sn-protoporfirina,

Resultados

107

quando na concentração final de 0,01%, também não altera a viabilidade celular. No

entanto, concentrações mais altas de DMSO (1%) são letais às células C6/36 (Figura

34).

Figura 33 – Captação de um análogo fluorescente de heme, a Sn-protoporfirina, por células

C6/36.

Na coluna da esquerda (A-G) são mostradas as imagens de contraste por interferência

diferencial (DIC) e na coluna da direita (B-H) as imagens de fluorescência. Células C6/36

crescidas sobre lamínulas de vidro foram incubadas em meio L15 sem soro com 25 µM de

Sn-protoporfirina por 0 (C e D), 2 (E e F) e 4 horas (G e H). Após o período de incubação, as

células foram lavadas com PBS e fixadas com formaldeído para posterior observação no

Resultados

108

microscópio. Nos painéis A e B estão representadas células não incubadas com o análogo de

heme.

Figura 34 – Viabilidade de células C6/36 incubadas com heme e DMSO.

Células C6/36 foram incubadas com meio L15 contendo 25 μM de heme diluído em DMSO

por 24 horas. Como controle utilizamos células incubadas apenas com meio L15

suplementado com soro, células incubadas com L15 suplementado com soro e 0.01% de

DMSO e células incubadas com L15 suplementado com soro e 1% de DMSO.

Resultados

109

4.6 – Heme induz expressão de aaREL 1 em C6/36

Tendo visto que as células C6/36 eram capazes de captar heme, decidimos

investigar se este heme, uma vez internalizado, induziria alguma modificação na

expressão dos fatores de transcrição estudados neste trabalho. Células C6/36 em

cultura foram incubadas com 25µM de heme, por 24 horas. Em seguida tiveram seu

RNA total extraído e foi feita uma quantificação relativa da expressão de aaREL 1, aa

REL 2 e STAT por PCR em tempo real, utilizando o gene RP49 como controle

endógeno. Neste sistema in vitro o heme se mostrou capaz de induzir um aumento de

cerca de 2 vezes na expressão de aaREL 1 e 1,5 vezes na expressão de aaREL 2. a

expressão de STAT não se mostrou aumentada nas células incubadas com heme

quando comparado a células não tratadas (Figura 35).

Resultados

110

Figura 35 – Ativação de aaREL 1 e aaREL 2 por heme em C6/36.

Resultado de três experimentos independentes de quantificação relativa por PCR em tempo

real. O gráfico representa a expressão relativa de aaREL 1, aa REL 2 e STAT em células C6/36

de Aedes albopicutus após 24 horas de incubação com 25 µM de heme em DMSO. O gene RP49

foi usado como normalizador, em todos os casos, e células tratadas apenas com DMSO foram

usadas como calibradores para o cálculo da expressão relativa. sendo fixadas em 1 (linha

pontilhada). A análise da variância (ANOVA) não indicou nenhuma diferença significativa

neste experimento.

4.7 – Alimentação com esferas de látex induz a expressão de aaREL 2

Para verificar se o heme é o produto da digestão do sangue responsável pelo

aumento observado em aaREL 1 (Figura 32 A), mosquitos foram alimentados com

uma solução artificial que se acumula no aparelho digestivo médio do mosquito, não

ficando apenas no divertículo como a sacarose pura, mas, no entanto, não contém

hemoglobina ou heme. Esta solução consiste em uma suspensão de esferas de látex

Resultados

111

diluídas em um tampão com pH controlado, sacarose, NaCl e agarose de baixo ponto

de fusão. Este sistema foi escolhido uma vez que, de acordo com a literatura, a

alimentação artificial com solução de esferas de látex simula diversas das alterações

fisiológicas que ocorrem no aparelho digestivo do mosquito após a alimentação com

sangue, como, por exemplo, a secreção da matriz peritrófica.

Dados prévios do nosso laboratório mostraram que mosquitos alimentados

com esta solução de esferas de látex possuem grande quantidade de radicais livres de

oxigênio no lúmem de seu aparelho digestivo. No entanto, a quantidade de bactérias

da microbiota intestinal desses mosquitos é semelhante à de mosquitos alimentados

com sangue.

Alimentamos mosquitos com solução de esferas de látex, contendo ou não

vírus Sindbis, e observamos a expressão relativa dos fatores de transcrição quatro

dias após a infecção. Como era de se esperar, aaREL 2 teve sua expressão ativada no

mesmo nível em mosquitos que comeram sangue e vírus Sindbis ou látex e Sindbis.

Já aaREL 1 e STAT apresentaram expressão reduzida nos mosquitos que comeram

látex e vírus Sindbis quando comparados aos mosquitos que foram infectados com

sangue. (Figura 36 A, B e C).

Resultados

112

Figura 36 – Ativação das principais vias do sistema imune inato em fêmeas de Aedes

aegypti após a infecção com solução de esferas de látex.

Resultado de três experimentos independentes com duplicatas biológicas internas de

quantificação relativa por PCR em tempo real. Os gráficos A, B e C representam a expressão

relativa de aaREL 1, aa REL 2 e STAT, respectivamente, em mosquitos infectados usando

como veículo solução de esferas de látex ou sangue. O gene RP49 foi usado como

normalizador em todos os casos e os mosquitos alimentados com solução de látex e vírus

foram usados como calibradores para o cálculo da expressão relativa, sendo fixados em 1. A

análise da variância (ANOVA) indicou diferenças significativas entre alguns pontos,

sinalizados com * em cada gráfico.

Resultados

113

4.8 - Microbiota e a ativação do sistema imune

Considerando que aaREL 2 não têm sua expressão regulada por nenhum fator

proveniente do sangue, decidimos observar o papel da microbiota do aparelho

digestivo médio na expressão destes genes.

Sabe-se que as populações de bactérias comensais aumentam em grande

quantidade no aparelho digestivo médio de fêmeas após a alimentação com sangue

(Luckhart et al., 1998), principalmente devido ao grande aporte de nutrientes

decorrente deste processo. Também já se sabe que em diversos sistemas esta

microbiota é responsável por ativação do sistema imune (Hooper et al., 2001). Assim,

decidimos avaliar se a microbiota de Aedes aegypti possui algum papel na ativação

das vias do sistema imune observada após a ingestão de sangue.

Para isso, tratamos mosquitos por quatro dias antes da alimentação com uma

solução de sacarose 5% suplementada com penicilina e estreptomicina. Neste

momento, mosquitos foram dissecados e seus aparelhos digestivos foram

homegenizados e plaqueados em uma placa de LB Agar. A observação destas placas,

após 24 horas de incubação a 37 °C, nos permitiu observar que o tratamento com

antibiótico estava sendo eficaz, visto que os mosquitos tratados apresentavam muito

pouca ou nenhuma bactéria (dado não mostrado). Em seguida os mosquitos foram

alimentados artificialmente com sangue, contendo ou não vírus Sindbis. Os

mosquitos foram então mantidos por quatro dias, sendo submetidos durante este

período ao mesmo tratamento com antibióticos. No quarto dia os mosquitos foram

homogenizados e o RNA total foi extraído para a quantificação.

Resultados

114

Mosquitos tratados com antibióticos mostraram uma diminuição significativa

na expressão de aaREL 2 (Figura 37B), entretanto não houve alteração significativa na

expressão de aaREL 1 e STAT (Figuras 37 A e C). Em todos os casos, a infecção por

Sindbis não fez nenhuma diferença na expressão destes genes quando comparava-se

os mosquitos tratados com antibióticos com os não tratados (Figuras 37 A, B e C).

Resultados

115

Figura 37 – Ativação das principais vias do sistema imune inato em fêmeas de Aedes

aegypti após tratamento com antibióticos.

Resultado de dois experimentos independentes de quantificação relativa por PCR em tempo

real. Os gráficos A, B e C representam a expressão relativa de aaREL 1, aa REL 2 e STAT,

respectivamente, em mosquitos infectados ou não, pré-tratados com antibióticos para

eliminar a microbiota do aparelho digestivo. O gene RP49 foi usado como normalizador em

todos os casos, e os mosquitos alimentados apenas com sangue e não tratados com

antibióticos foram usados como calibradores para o cálculo da expressão relativa, sendo

fixados em 1. A análise da variância (ANOVA) indicou diferenças significativas entre alguns

pontos, sinalizados com * em cada gráfico.

Resultados

116

4.9 – A alimentação controla a carga viral em Aedes aegypti

Considerando que os mosquitos tratados com antibióticos ou alimentados com

solução de esferas de látex possuem níveis mais baixos de alguns fatores de

transcrição (aaREL 2 e aaREL 1/STAT, respectivamente) (Figuras 36 e 37), decidimos

analisar a carga viral desses mosquitos quatro dias após a infecção.

A carga viral foi determinada, de modo análogo ao usado em C6/36 (Figura

29 A), através de quantificação relativa por PCR em tempo real do vírus Sindbis,

utilizando o gene RP49 do mosquito como controle para normalização.

Quando comparados com mosquitos infectados através de alimentações com

sangue, ambas as situações levaram a uma carga viral maior após quatro dias de

infecção. Em fêmeas tratadas com antibióticos, a carga viral encontrava-se em torno

de 10 vezes mais alta do que as de fêmeas não tratadas (Figura 38 A), enquanto

fêmeas alimentadas com solução de látex possuíam até 100 vezes mais vírus do que

aquelas infectadas com sangue (Figura 38 B).

Estes resultados indicam que a alimentação sanguínea controla a ativação das

vias do sistema imune do mosquito Aedes aegypti e que, a inibição da ativação de

qualquer uma destas vias leva a uma maior proliferação do vírus no mosquito.

Resultados

117

Figura 38 – Quantificação viral em mosquitos Aedes aegypti alimentados com solução de

látex ou antibióticos.

Resultado de três experimentos independentes de quantificação relativa por PCR em tempo

real para cada condição. O gráfico A representa a expressão relativa do RNA viral

normalizado pelo gene ribossomal do mosquito RP49 em mosquitos infectados utilizando

sangue ou solução de esferas de látex como veículo para o vírus. O gráfico B mostra a

expressão relativa do RNA viral normalizado pelo gene ribossomal do mosquito RP49 em

mosquitos infectados pré-tratados ou não com antibióticos. Mosquitos infectados com

sangue sem nenhum tipo de tratamento, foram usados como calibrador e, portanto, fixado

em 1. A escala da expressão relativa está representada como [Log10] para facilitar a

visualização. A análise da variância (ANOVA) indicou diferenças significativas entre alguns

pontos, sinalizados com * em cada gráfico.

Discussão

5 – Discussão

5.1 – Perfil de expressão dos genes do sistema imune inato em Aedes aegypti

Com a publicação do genoma de Aedes aegypti (Nene et al., 2007) e a

comparação entre os genes anotados neste mosquito com aqueles já conhecidos em

A. gambiae (Holt et al., 2002) e D. melanogaster (Adams et al., 2000), diversos genes

relacionados ao sistema imune deste mosquito foram identificados (Waterhouse et

al., 2007). Apesar disso, existem poucos dados na literatura sobre o perfil de

expressão destes genes nos diferentes estágios de desenvolvimento do mosquito e

nos diferentes tecidos.

Como já discutido no item 2.6 da introdução, uma comparação feita entre

diferentes famílias gênicas destes três insetos mostrou que genes relacionados com

imunidade, principalmente aqueles ligados ao reconhecimento de patógenos,

possuem menor quantidade de ortólogos quando comparados com outras famílias

gênicas. De um modo geral, o repertório imune é considerado um dos grupos

funcionais mais divergentes pela classificação do “Gene Ontology”

(http://www.geneontology.org/ - 2008) (Waterhouse et al., 2007).

Quando observamos o perfil de expressão de genes relacionados com o

sistema imune em A. aegypti, nos diferentes estágios de vida do mosquito, notamos

uma acentuada expressão de quase todos os genes estudados em machos recém

eclodidos, seja quando comparados aos outros estágios, ou a fêmeas recém eclodidas

(Figuras 19 A a 27A). Essa diferença pode ser determinada geneticamente ou pode

ser decorrência do modo de alimentação distinto de machos e fêmeas, visto que as

118

Discussão

fêmeas apresentam um aumento significativo na expressão de alguns desses genes

(aaREL, aaREL 2 e STAT) após a alimentação com sangue (Figura 32 A, B e C).

Estudos estão sendo realizados em nosso laboratório a fim de entender melhor a

natureza dessa diferença.

Quando analisamos o perfil de expressão dos genes nos diferentes tecidos da

fêmea adulta, 24 horas após a alimentação com sangue (Figuras 19 B a 27 B), notamos

que o perfil de expressão de aaREL 1 e seu inibidor Cactus é semelhante, sendo mais

alto no ovário, o que é compatível com o conhecido papel destes genes no

desenvolvimento embrionário, ao menos em Drosophila (Figuras 19 B e 20 B) (Drier

et al., 1997).

Observando a via IMD podemos destacar uma alta expressão de aaREL 2 no

aparelho digestivo, quando comprarado aos demais tecidos estudados (Figura 24B).

Este resultado mostra-se particularmente relevante frente ao fato desta via ter sido

implicada na resposta a infecções bacterianas, tanto por outros autores (Shin et al.,

2002) quanto por este trabalho (Figura 37). Sabe-se que, após a alimentação, ocorre

um grande aumento da população de bactérias no trato digestivo do mosquito

(Luckhart et al., 1998). O aumento observado na atividade expressão de aaREL 2 no

aparelho digestivo parece ser decorrente deste fato e, conseqüentemente, importante

para o controle da população desta microbiota pelo inseto (Figuras 37). A via Toll,

por outro lado, ao contrário de Drosophila, modelo na qual está relacionada ao

combate de infecções por fungos e bactérias gram-positivas, tem sido implicada no

controle de infecções apenas por fungos neste mosquito (Shin et al., 2005), fato

corroborado por nossos resultados.

119

Discussão

No entanto, a expressão de Defensina, um peptídeo antimicrobiano

sabidamente regulado pela via IMD em mosquitos, se mostrou elevada no corpo

gorduroso, e não no aparelho digestivo (Figura 25B). Esse resultado, embora pareça

contrariar o anterior, está de acordo com o fato de o corpo gorduroso ser o principal

órgão de síntese e secreção de proteínas nos insetos, inclusive de AMPs.

Todos os demais genes estudados apresentaram expressão mais elevada na

cabeça do que nos demais órgãos dissecados. É possível que isso se deva ao fato da

de que a cabeça possui estruturas sensoriais bastantes expostas ao meio ambiente, o

que poderia levar a um aumento local de exposição a patógenos e, conseqüentemente

a uma ativação de genes relacionados ao sistema imune.

Curiosamente, como descrito em Resultados, todos os genes estudados que

dão origem a proteínas secretadas possuem maior expressão no corpo gorduroso do

que nos outros órgãos (Figuras 22B, 25B e 27B). Este resultado é condizente com o

papel secretor desse órgão no mosquito. Por outro lado, os genes que codificam os

fatores de transcrição aaREL1, aaREL2 e STAT, possuem sua expressão baixa no

corpo gorduroso e elevada em outros órgãos, indicando um possível papel destes

genes na ativação de outros genes efetores não estudados aqui e talvez ainda

desconhecidos (Figuras 19B, 24B e 26B).

120

Discussão

5.2 - As principais vias do sistema imune inato são ativadas por infecções virais em

mosquitos

Neste trabalho analisamos a ativação das três principais vias relacionadas ao

sistema imune inato em Aedes aegypti através do perfil de expressão de seus fatores

de transcrição, aaREL 1, aaREL 2 e STAT, após diferentes desafios, tais como a

alimentação com sangue e a infecção com o vírus Sindbis.

O principal modo de ativação conhecido para estas vias, como descrito na

introdução, é a ativação dos fatores de transcrição da família NF-kB, através da

degradação de seu inibidor, o que permite que estes possam entrar no núcleo e

promover a transcrição de genes efetores. No entanto já foi descrito em diferentes

modelos, para as três vias escolhidas para este estudo, que a ativação da via leva a

um aumento na transcrição dos próprios fatores de transcrição, formando uma alça

de ativação positiva, o que permite que aumentos na expressão dos mesmos seja

utilizada como indicador da ativação de sua respectiva via (Sanders et al., 2005, Yang

& Stark, 2008, Medeiros et al, 2004).

Deste modo, a escolha de trabalhar com a expressão destes fatores de

transcrição baseou-se nestas informações e no fato de não termos acesso a anticorpos

de qualidade para as proteínas do mosquito com a mesma facilidade do que para as

de mamíferos, o que dificulta a caracterização da atividade da via através da

observação de mudanças relacionadas à ativação protéica. Por outro lado, é

importante lembrar que um pequeno aumento na expressão de fatores de transcrição

pode resultar em um aumento bem maior na expressão dos genes efetores

controlados por eles.

121

Discussão

O sistema imune de insetos possui diversos componentes, incluindo barreiras

físicas (como, por exemplo, a matriz peritrófica em mosquitos), respostas celulares

como a fagocitose e a encapsulação (Lavine & Strand, 2002; Levashina, et al., 2001) e

resposta humoral, como a produção de espécies reativas de oxigênio (Nappi et al.,

2000) e de peptídeos antimicrobianos (AMPs) (Hetru et al., 2003).

Como já descrito na introdução, a via Toll foi identificada como parte da

resposta de Drosophila melanogaster ao vírus X de Drsosphila (DXV) (Zambon et al.,

2005). Por outro lado, a super-expressão de AMPs regulados por essa via não

diminuiu a infecção viral na mosca, sugerindo um mecanismo efetor de defesa

diferente do observado para fungos e bactérias (Zambon et al., 2005).

Um outro trabalho interessante sobre infecção viral em D. melanogaster utilizou

o vírus C de Drosophila (DCV) para investigar os genes ativados após a infecção,

através de ensaios de micro-arranjo de DNA. Neste caso foi observada uma ativação

da via JAK/STAT. Além disso, o DCV induziu ativação de STAT in vitro bem como

aumentou sua atividade de ligação ao DNA (Dostert et al. 2005).

Nossos resultados mostram um aumento na expressão dos três fatores de

transcrição das principais vias do sistema imune inato em invertebrados Toll, IMD e

JAK/STAT, após a infecção com vírus Dengue (Figura 28 A-D) e Sindbis (Figura 29

A-D, em cultura de células de Aedes albopictus C6/36, o que sugere que estas vias

estão ativadas nesta condição.

As células infectadas com vírus Dengue mostraram um aumento na expressão

dos três fatores de transcrição desde o primeiro dia após a infecção (DAI) (Figura 28

B-D), enquanto as células infectadas com Sindbis apresentaram um aumento tardio

122

Discussão

na regulação da expressão destes genes, sendo observada alteração apenas no sétimo

DAI (Figura 29 B-D).

Para analisar essa alteração in vivo, infectamos mosquitos Aedes aegypti com

vírus Sindbis e observamos a expressão dos genes em diferentes dias após a infecção

(1, 4 e 7) (Figura 30 A-D). Neste experimento concluímos que as variações na

expressão dos genes estudados era pequena e a diferença entre as replicatas

biológicas, muito grande.

Para reduzir este problema o experimento foi realizado seis vezes de modo

independente, com pelo menos uma duplicata biológica interna, apenas no quarto

DAI. As amostras com valores muito diferentes das demais foram retiradas e os

ΔΔCts foram utilizados para a análise estatística utilizando o teste t de Student.

Esta análise mais detalhada mostrou uma tendência ao aumento na expressão

de aaREL 1, aaREL 2 e STAT no quarto dia após a infecção com vírus Sindbis em

mosquitos, porem esse aumento não é significativo estatisticamente neste período

(Figura 31).

Embora os aumentos absolutos observados neste trabalho possam ser

considerados pequenos, é importante que alguns pontos sejam levados em

consideração:

1 - Conforme já discutido, os genes utilizados para este estudo são fatores de

transcrição, de modo que um pequeno aumento em sua expressão pode representar

uma variação muito mais expressiva na síntese de eventuais proteínas efetoras.

2 - Os níveis de aumento de expressão observados neste trabalho, após infecções

virais, são compatíveis com os aumentos observados na expressão dos genes da

123

Discussão

mesma família em outros modelos de inseto, mesmo após desafios com infecções

bacterianas (Schlüns et al., 2007).

3 – Os experimentos apresentados nesta tese foram feitos utilizando mosquitos

inteiros, o que pode mascarar alguns resultados, uma vez que uma ativação restrita a

um determinado órgão pode não ser significativa por ser “diluída” quando colocada

junto aos demais. Experimentos preliminares, feitos apenas com o aparelho

digestivo, mostram uma ativação bem mais significativa na expressão relativa de

aaREL 1.

5.3 – A influência da alimentação na ativação do sistema imune

A infecção viral, para ser bem sucedida, precisa suplantar diversas barreiras

no mosquito (Black et al., 2002). Considerando que a primeira, e notadamente a mais

importante delas, é a entrada do vírus nas células do epitélio do aparelho digestivo

médio do mosquito, resolvemos analisar a influência da alimentação sanguínea e de

seus diferentes componentes no processo de infecção viral.

Nossos resultados mostram que a alimentação com sangue é capaz de

aumentar a expressão dos três fatores de transcrição estudados entre 1,5 e 3 vezes

(Figura 32 A-C). No entanto, quando o sangue é ingerido junto com um inibidor da

atividade das principais enzimas digestivas do mosquito (tripsinas), o SBTI, apenas

aaREL 2 e STAT mostram um nível de ativação igual ao dos animais alimentados

sem o inibidor (Figura 32 B e C). Esse resultado indica que a ativação de aaREL 1

após a alimentação sanguínea depende, em algum nível, da digestão do sangue

124

Discussão

(Figura 32 A), não podendo portanto ser atribuído exclusivamente à dilatação do

trato gastro-intestinal ou ao aumento da microbiota observado após a alimentação.

Já que a ativação de aaREL2 e STAT não depende da digestão do sangue,

alimentamos mosquitos com albumina bovina (BSA) para saber se uma outra fonte

de aminoácidos ou proteínas seria capaz de induzir um aumento na expressão destes

genes ou se este efeito era de algum elemento (exceto a albumina) específico do

sangue. Neste caso, aaREL 1 e aaREL 2 não mostraram aumento de expressão

significativo, indicando que sua ativação não parece ser decorrente de uma

alimentação apenas protéica (Figura 32 A e B). Por outro lado, STAT mostrou uma

pequena ativação em mosquitos alimentados com BSA, sugerindo um mecanismo de

ativação diferente dos fatores de transcrição da via Toll e IMD (Figura 32C). Esta

ativação, embora significativa, representa apenas cerca de 50% da ativação vista

anteriormente com sangue, o que sugere que a disponibilidade protéica é apenas

parte do estímulo responsável pela ativação desta via em mosquitos.

Em diferentes organismos, a via TOR (Target of Rapamycin) constitui uma das

mais importantes vias reguladas por nutrientes, sendo de extrema importância na

regulação do crescimento e proliferação desde leveduras e insetos até mamíferos

(Jacinto & Hall, 2003). Em mosquitos, a ativaçao da via TOR após a alimentação com

sangue leva a síntese do fator de transcrição GATA, que possui seqüências de ligação

no promotor de genes regulados pela alimentação sangüínea como a Vitelogenina,

para dar inicio a ovogenese (Park et al., 2006). Alem disso, em D. melanogaster já foi

mostrado que GATA possui sítios de ligação ao promotor de alguns AMPs, sendo

responsável, junto com os homólogos de NF-kB da mosca pela ativação destes

125

Discussão

(Senger et al., 2006). Diante dessas informações, é possível imaginar que a via TOR,

ativada pelos aminoácidos presentes na alimentação, através da ativação do fator de

transcrição GATA, esteja de alguma forma regulando os efeitos observados neste

trabalho, principalmente no caso de STAT, que parece depender da ingestão de

nutrientes para sua ativação.

5.4 - Papel da molécula de heme na ativação do sistema imune

Por muito tempo se acreditou que o principal objetivo do sistema imune era

reconhecer moléculas que não pertencessem ao organismo para combatê-las. Nos

últimos anos, no entanto, novos conceitos vêm abordando a idéia de que o sistema

imune não apenas combate patógenos, mas protege o organismo contra sinais de

perigo de um modo geral, causando inflamações estéreis e remodelamento tecidual

após dano celular (Matizenger, 1992; Figueiredo et al., 2007). Assim, em processos

inflamatórios na ausência patógeno, moléculas liberadas pelas células danificadas,

por exemplo, podem ser responsáveis por ativar e/ou amplificar a resposta imune

(Beutler, 2004).

Considerando que observamos a indução dos três fatores de transcrição

estudados após a alimentação com sangue, mas apenas aaREL 2 parece ter sua

expressão regulada pelo aumento da microbiota do aparelho digestivo, resolvemos

investigar qual(is) poderia(m) ser o(s) outro(s) fator(es) decorrente(s) da ingestão do

sangue responsável(is) por esta indução.

A molécula de heme, grupo prostético da hemoglobina, é um conhecido

agente pró-inflamatório em mamíferos, sendo capaz de ativar células do sistema

126

Discussão

imune inato através da sua ligação ao TLR-4 (Figueiredo et al, 2007). Já foi

demonstrado também que a hemozoína, o pigmento do parasito Plasmodium

falciparum, um cristal de dímeros de heme, é capaz de se ligar ao TLR-9 ativando a

resposta imune inata in vivo e in vitro, através da produção de citocinas e quimiocinas

(Coban et al., 2005). Deste modo, tendo em vista que o sangue, quando digerido, gera

quantidades muito elevadas de heme livre no aparelho digestivo médio do mosquito,

decidimos investigar o papel da molécula de heme na indução do sistema imune

inato em Aedes aegypti.

Primeiramente mostramos, utilizando um análogo fluorescente desta

molécula, que a linhagem celular C6/36 é capaz de captar heme do meio de cultura

(Figura 33). Além disso, observamos também que esse heme não causa morte celular

nas quantidades utilizadas nesse estudo (Figura 34).

Feitos estes controles, utilizamos a quantificação por PCR em tempo real para

avaliar os níveis de expressão dos fatores de transcrição estudados em células

tratadas ou não com heme. Como esperávamos, os níveis de aaREL 1 se encontravam

elevados em relação às células não tratadas, sugerindo que o heme deve ser um dos

fatores responsáveis pela ativação desta via após a alimentação com sangue. No

entanto o mesmo não é verdade para STAT, o que significa que, pelo menos in vitro,

apenas a molécula de heme não é suficiente para ativar a transcrição deste gene

(Figura 35). A expressão de aaREL 2 se mostrou levemente aumentada após o

tratamento com heme, no entanto esse aumento não foi estatisticamente significativo.

Para avaliar essa ativação in vivo, alimentamos mosquitos com uma solução

sem hemoglobina. Inicialmente tentamos alimentações artificiais com plasma, porém

127

Discussão

esbarramos em problemas experimentais com a quantificação da expressão gênica

nestes mosquitos, visto que a expressão dos genes de controle endógeno também era

radicalmente diminuída após este tipo de alimentação, o que comprometia a

normalização dos dados e, portanto, a interpretação dos resultados do PCR em

tempo real. Numa tentativa de contornar este problema, utilizamos uma solução de

esferas de látex, em tampão com pH fisiológico e sacarose, como veículo para estudar

a infecção em um sistema sem heme ou hemoglobina (Figura 36).

Os mosquitos infectados com solução de látex apresentaram níveis muito mais

baixos de expressão de aaREL 1 e STAT quando comparados aos infectados na

presença de sangue, o que se mostra condizente com os experimentos anteriores que

indicavam que o sangue era essencial para a ativação dessas vias (Figura 36 A e C).

Dados anteriores do nosso laboratório mostraram que mosquitos alimentados

com esferas de látex possuem uma microbiota intestinal bastante semelhante em

número àqueles alimentados com sangue. Assim, mosquitos infectados com látex e

com sangue mostraram níveis semelhantes de expressão de aaREL 2, o que também

corrobora nossos experimentos nos quais vimos uma indução desta via pelo aumento

da microbiota e não pela natureza do conteúdo alimentar em si (Figura 37 B).

5.5 – A microbiota e a ativação do sistema imune

Conforme discutido anteriormente, um evento muito importante induzido

pela alimentação sanguínea é o enorme aumento observado na população de

bactérias do aparelho digestivo do mosquito (Luckhart et al., 1998). Após a

alimentação, devido principalmente ao grande aporte de nutrientes, a quantidade de

128

Discussão

bactérias da microbiota comensal destes organismos é incrivelmente aumentada, fato

que parece ser muito importante para a sobrevivência e capacidade de infecção dos

parasitos destes organismos (Azambuja et al., 2005).

Resultados recentes de estudos sobre a importância da microbiota na ativação

do sistema imune e na resposta a patógenos vêm mostrando que muito pouco ainda

é entendido deste delicado e essencial equilíbrio.

Este ano, Ryu e colaboradores mostraram, em D. melanogaster, que bactérias

patogênicas e bactérias da microbiota modulam os níveis de secreção de AMPS,

através do balanço entre dois fatores de transcrição no epitélio intestinal, relish e

caudal (Ryu et al., 2008). Este conceito já havia sido descrito previamente em

vertebrados, como no caso da bactéria Bacteroides thetaiotaomicron, membro da

microbiota de camundongos que induz a expressão de proteínas antimicrobianas

capazes de combater bactérias patogênicas a este animal, mas não afeta a

sobrevivência da própria Bacteroides thetaiotaomicron (Cash et al., 2006). Se bactérias

diferentes são capazes de produzir diferentes respostas no organismo infectado,

induzindo AMPs com diferentes especificidades, isso leva a crer que a microbiota

pode possuir um papel ativo em modular a resposta imune do hospedeiro

(Muyskens et al., 2008). Ryu e colaboradores também responderam esta pergunta

mostrando que o espectro de AMPs expresso no aparelho digestivo, por sua vez,

define a comunidade microbiana e, consequentemente, a saúde do hospedeiro (Ryu

et al., 2008).

No entanto, muitas perguntas ainda permanecem sem resposta sobre como

ocorre o equilíbrio destes fatores de transcrição e principalmente sobre quais os

129

Discussão

mecanismos utilizados pelo vetor para “perceber” a diferença entre bactérias

comensais e patogênicas que muitas vezes apresentam padrões moleculares (PAMPs

– “pathogen associated molecular patterns”) muito parecidos.

Os mosquitos axênicos, obtidos através de tratamentos com penicilina e

estreptomicina neste trabalho, apresentaram níveis de aaREL 1 e STAT iguais aos dos

mosquitos não tratados, sugerindo que a microbiota não possui nenhum efeito na

expressão destes genes (Figura 37 A e C). Este dado é, mais uma vez, condizente com

a idéia de que, em mosquitos, a via Toll parece ser pouco ou não responsiva a

infecções bacterianas, conforme sugerido por Shin et al;, 2002. Entretanto, o aumento

observado na expressão de aaREL 2 após a alimentação com sangue e/ou sangue

infectado com vírus Sindbis não é observada nos mosquitos tratados com

antibióticos, indicando que a ativação desta via observada, após a alimentação com

sangue, é causada majoritariamente pelo aumento das bactérias da microbiota

(Figura 37 B). Mais uma vez este resultado corrobora os dados observados por Shin e

colaboradores, em 2002, sugerindo a ativação da via IMD após infecção por bactérias

em Aedes aegypti. No entanto é importante ressaltar que neste os autores apenas

observam um aumento na expressão da via IMD após infecção dos mosquitos por

bactérias (Enterobacter cloacae) injetadas e, portanto, não pertencentes à microbiota do

inseto. Nossos dados, por outro lado, demonstram que esta via é importante, não

apenas para o combate de infecções causadas por bactérias “estranhas” ao mosquito,

mas também é ativada pelo aumento da população da própria microbiota residente.

130

Discussão

5.5 – A alimentação e o controle da carga viral

Levando em consideração que tanto nossos dados quanto evidências da

literatura indicavam que a alimentação possui um importante papel na ativação das

principais vias do sistema imune inato do mosquito, decidimos medir a carga viral

após a infecção realizada através das diferentes alimentações utilizadas nesse estudo.

É importante lembrar que, tanto em alimentações com esferas de látex, quanto

nas alimentações feitas após tratamentos com antibióticos tínhamos observado

menor expressão de algum fator de transcrição (aaREL1/STAT e aaREL 2,

respectivamente). Por causa disso, imaginamos que a administração de vírus ao

mosquito, em uma ou outra condição, poderia ser um interessante instrumento para

nos revelar a importância da ativação dessas vias na infecção do mosquito por

infecção viral durante a alimentação.

Analisamos a carga viral nesses dois tipos de infecção quatro dias após a

alimentação contendo o vírus e, em ambos os casos, a carga viral encontrava-se mais

alta nos mosquitos que foram submetidos a tratamentos que preveniam a ativação de

alguma das vias do que nos controles (não tratados com antibióticos e alimentados

com sangue) (Figura 38 A e B). Este resultado sugere que a ativação das principais

vias de imunidade do mosquito, após a alimentação sanguínea, é extremamente

importante para que o mesmo possa proteger-se da infecção por patógenos presentes

no alimento e que, ao menos para Sindbis, a supressão da ativação de qualquer uma

destas vias leva a um pronunciado aumento da susceptibilidade do mosquito à

infecção. Este fato evidencia que, tanto a via de IMD quando a de Toll/Jak-STAT, são

importantes para o combate da infecção por Sindbis pelo mosquito.

131

Discussão

Acreditamos que, caso este evento mostre-se verdadeiro para infecção por

outros vírus, mais do que revelar que o mosquito emprega diferentes vias de

imunidade para o combate da infecção viral, esses dados revelam um fascinante

aspecto da adaptação dos mosquitos à hematofagia. Considerando que este é o

momento no qual o mosquito encontra-se mais susceptível à infecção, um aumento

da defesa contra patógenos, seja induzido pela digestão do sangue, seja induzido

pela própria microbiota do aparelho digestivo, é um importante mecanismo

adaptativo desses animais para um melhor controle de organismos invasores (Figura

39).

132

Conclusões

6 – Conclusões

Com base nos resultados obtidos neste trabalho e utilizando como

fundamento as informações disponíveis na literatura aqui discutidas, foi possível

chegar as seguintes conclusões:

• As três vias estudadas neste trabalho, Toll, IMD e JAK/STAT,

cooperam na resposta à infecção viral após uma alimentação sangüínea.

• Embora os três fatores de transcrição estudados estejam aumentados

após a ingestão de sangue, eles parecem responder a diferentes

estímulos: aaREL 2 é regulado pelo aumento da microbiota no aparelho

digestivo médio do mosquito; aaREL 1 responde à algum fator

decorrente da digestão do sangue ingerido, possivelmente a molécula

de heme; e STAT parece ter sua expressão aumentada após a ingestão

de nutrientes, o que sugere um participação da via TOR.

• Esse efeito imunomodulatório decorrente da ingestão de sangue se

mostrou de grande importância no controle da infecção viral pelo

mosquito A. aegypti como resumido na figura 39.

134

Conclusões

Figura 39 – Esquema proposto para a modulação das vias estudadas nesse

trabalho (Toll, IMD e JAK/STAT) pela alimentação sangüínea e sua importância no

controle da carga viral pelo mosquito Aedes aegypti .

135

136

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Apêndice A

Immune Response Activation in Aedes Aegypti by Blood Feeding and

Virus Infection$

Running title: Aedes immune activation by virus

Maria Clara L. Nascimento-Silva 1, Jose Henrique Maia de Oliveira1 , Luiza

Pereira Ramos de Oliveira1, Pedro L. Oliveira 1 and Marcos Henrique F.

Sorgine 1*

1Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio

de Janeiro, Brazil

*Corresponding author:

Marcos Henrique F. Sorgine, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Centro

de Ciências da Saúde, Instituto de Bioquímica Médica, Bloco D – Sala SS05 –

Ilha do Fundão, RJ – CEP: 21.941-590 Brazil, Tel 552125626751.

E-mail: sorgine@bioqmed.ufrj.br

$ This work is dedicated to Prof. Leopoldo de Meis for his inspiring example and for his 70th

birthday.

Abstract

In the mosquito A. aegypti, infections by fungi are known activators of the

toll pathway, through NF-Kb related transcription factor Rel 1, while bacteria

mostly activate the IMD pathway, which operates through Rel 2, another NF-Kb

ortholog. The JAK/STAT pathway is also related to pathogen clearance, a

process that occurs by the regulation of complement-like humoral proteins, such

as TEP1 in Drosophila. In contrast, little is known about Aedes aegypti

responses to viral infection. In this work we observed that three major mosquito

immune-related transcription factors (aaREL 1, aaREL 2 and STAT) are up

regulated 24 h after a blood meal but not after feeding insects with albumin

(BSA). When sindbis virus was given with the blood meal, an additional

increase in expression of these genes was observed. In contrast, when

mosquitoes were treated four days with antibiotics before oral infection, a

reduced expression of REL 2 mRNA was observed, but not of REL 1 and STAT.

Interestingly, sindbis infected mosquitoes pre-treated with antibiotics showed an

increase in the viral load when compared with mosquitoes infected with a

normal blood meal. These results suggest that a blood meal per se is able to

activate innate immune pathways and that the upregulation of REL 2 seems to

be mediated by the presence of gut microbiota, profoundly affecting viral loads

in Aedes aegypti.

1-Introduction

A wide array of information has been learned using Drosophila

melanogaster to study insect immune system, allowing the development of

general picture concerning the mechanisms by which other insect’s immune

system operates. In this insect, multiple cellular and humoral responses [1] are

activated to combat infection, such as proteolytic cascades leading to

coagulation and/or melanization, microorganism phagocytosis by hemocytes

and the production of effector molecules, including antimicrobial peptides

(AMPs) [2]. Usually produced by fat body cells or hemocytes, AMPs are

hemolymphatic peptides capable of direct killing of pathogens, [3]. Two main

pathways regulate the expression of AMP genes, Toll and IMD, which activate

transcription factors of the REL/NF-kB family [4,5]. In adult flies the Toll pathway

controls fungal and gram-positive bacterial infections through the activation of

the transcription factor Dif (dorsal immune factor) [6], an NFkB homologue. On

the other hand, gram-negative bacteria stimulate the IMD pathway, leading to

the activation of another NFkB homologue, Relish [7,8]. Together with the

recognition of other conserved transduction pathways also involved in immune

response, such as JNK [9], MAPK [10] and JAK/STAT pathways [11], the great

similarity between Toll and IMD pathways and the vertebrate TLR (toll-like

receptor) and TNF (tumor necrosis factor) pathways revealed a remarkable

level of conservation of innate immune response throughout animal evolution

[12].

The mosquito Aedes aegypti is the main vector of important arthropod-

borne viruses (arboviruses), such as dengue and yellow fever virus. Despite the

great importance of these diseases, very little is known about mosquito

responses to virus infection. The availability of the complete genome sequence

of Aedes aegypti [13] created new possibilities to study mosquito immune

response. In A. aegypti, where 3 Toll homologues were characterized, this

pathway seems to be involved only in antifungal response [14]. Despite the fact

that a transcription factor Dif homologue has never been found in mosquitoes,

the Dorsal homologue (AaREL 1) is activated by immunological stimuli and

regulates AMP expression in adult mosquitoes in vitro [15]. The IMD pathway in

A aegypti is modulated by bacteria and activates Relish’s homologue (AaREL 2)

[16]. Recently, the involvement of Toll and JNK pathways in the mosquito

response against viral infection was recognized by Sanders [17], who used a

DNA microarray to study gene expression during SINV infection.

Although commensal microbiota are known to influence host physiology

[18] including innate immunity [19] and consequently vectorial capacity [20], the

knowledge on this subject is still limited. Ryu et al. showed, in D melanogaster,

that the intestinal homeobox gene Caudal regulates gut microbiota by

repressing Relish-dependent AMP expression. When Caudal is suppressed,

commensal microbiota is disrupted and gut epithelial cell apoptosis and host

mortality is observed due to the dominance of a pathogenic bacteria [21]. These

results indicate the interrelationship between host immunity and the gut

microbiota as an important factor in gut homeostasis and pathogen control.

In this work we investigated the activation of the three main pathways of

A. aegypti immune system through the expression profile of their transcription

factors (aaRel1, aaRel2 and STAT) after SINV infection. We also addressed

possible roles of the blood meal and gut bacteria in immune activation. Our

results reveal that activation of A. aegypti main immune pathways after blood

meal is in part dependent on gut microbiota (aaRel2) and in part on blood

digestion and/or other factors of cellular stress (aaRel1 and STAT).

2- Methods

2.1 – Mosquitoes and artificial meals

Aedes aegypti Red-eye strain mosquitoes were reared at 28 °C, 70-80%

humidity in a 12:12 light:dark photoperiod. Mosquitoes were fed with sucrose

5%. For artificial meal, 4-8 days old females were starved for 24 hours.

Mosquitoes were allowed to feed until repletion (1 hour) in an artificial feeder

and then were anaesthetized by cold. Fully engorged females were separated

on ice and put into a new cage. Females were maintained in the same

conditions as before for different periods of time until RNA extraction. All

experiments were repeated at least three times.

SBTI (1mM) was added directly to rabbit blood before feeding, in a final

concentration of 100 µM. BSA (100mg/mL) were offered in water-jacketed

artificial feeders maintained at 37 °C and parafilm was used as a membrane to

be pierced by the mosquitoes. ATP (1mM) was added as phagostimulant.

2.2 – SINV infection

SINV infections were adapted from Lanciotti protocols for Dengue virus infection

[22]. Briefly, 350 µl of rabbit blood were mixed with 150 µl of 108 pfu/mL virus

stock or 150 µl of virus-free cell culture medium and were offered in an artificial

feeder as described above. Mosquitoes were maintained under the same

conditions as before.

2.3 – Antibiotics treatments

To obtain insects free of bacteria, penicillin (100 U/mL) and streptomycin (0,1

mg/mL) were added to the 5 % sucrose solution used to feed insects, which

was changed daily for four days before and four days after blood meal. After the

first four days of treatment, mosquitoes were dissected and midguts were

homogenized and platted onto a LB-agar medium. Bacteria colonies were

estimated 24 h after plating to control for efficacy of antibiotics (Figure 4).

2.4 - Cell culture and virus

C6/36 cell line [23], was maintained in L-15 medium supplemented with 10%

fetal calf serum, 0,2g/L L-glutamine, 10 % triptose phosphate broth, 1% non

essential amino acids and 1% penicillin/ streptomycin at 28 0C.

SINV virus, MR16 strain, was propagated and titrated as described before [24].

2.5 – Cell infection and heme treatment

Aedes albopicutus cells treatments were performed in 25 cm2 tissue culture

flasks 24 h after plating.

SINV (MOI of approximately 10 PFU per cell) was suspended in 1 mL of L-15

medium without fetal calf serum and incubated with the cells for 1 h at 28 0C.

Cells were washed 3 X with sterile PBS and fresh medium with fetal calf serum

(10 %) was added to the flasks. Control cells were handled in an identical

manner. At different time points, cells were washed again with PBS and

ressuspended in TRIzol for RNA extraction.

Heme (30 mM freshly made in DMSO) was diluted in 1 mL of L-15 medium with

fetal calf serum to a final concentration of 25 µm and added to cell flasks.

Control cells were handled in an identical manner, receiving only DMSO instead

of heme. Cells were maintained at 28 0C for 24 h and then washed in PBS and

ressuspended in TRIzol.

2.6 - RNA extraction and cDNA synthesis

Total RNA was isolated from pools of five females each, using TRIzol reagent

(Invitrogen) according to the manufacturer’s instructions. Total RNA was

quantified in a spectrophotometer and 1 µg were treated with 1 U of DNAse

RNAse free (Invitrogen) for 30 min at 37 0C. Reactions were stopped by adding

1 µl of 20 mM EDTA and heating for 10 min at 65 0C. cDNA synthesis was

performed from the DNAse treated RNA according to High Capacity cDNA

Reverse Transcription Kit from Applied Biosystems.

2.7 - Primers and PCR

All primers were made using Primer 3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/

input.htm) and Oligo analyzer software (http://www.idtdna.com/analyzer/

Applications/OligoAnalyzer/Default.aspx/oligocalc.asp). Primers were:

Gene Seqüência

aaREL 1F GACTCGTCGGAGCTGAAATC

aaREL 1R CGGTTTGTTCAGGTTGTTGA

aaREL 2F TCTGTCGGCAGATGAAGTGA

aaREL 2R GCACTGGAATGGAGAATCAAA

RP49 F GCTATGACAAGCTTGCCCCCA

RP49R TCATCAGCACCTCCAGCT

SINVF TGACTAACCGGGGTAGGT

SINVR TTGGCTTCGGTGGGCATC

STAT albF CGTTCACCTTCTGGGAGTGG

STAT albR AATGGCTGGATGTGCAGGAT

STAT F CACACAAAAAGGACGAAGCA

STAT R TCCAGTTCCCCTAAAGCTCA

Before Real Time PCR reactions all primers pairs were tested by conventional

PCR using a 40 cycles reaction (94 0C – 30 s – denaturation; 60 0C – 30 s –

annealing; 72 0C – 30 s – Taq extension) in a thermocycler and analysed in 2%

agarose gel.

2.8 - Real Time PCR

Real Time PCR was performed in an ABIXX (Aplied Byosystems) using power

SYBR-GREEN PCR master MIX. The Comparative Ct Method [25,26] was used

to compare changes in gene expression levels. RP-49 was used as

endogenous control [27].

2.9 – Statistical analysis

Statistical analysis were made using ANOVA and Student´s t-test of ∆Ct values.

3 – Results

3.1 – SINV infection induces the expression of immuno-related

transcription factors in C6/36 Aedes albopicuts cells and in adult female

A. aegypti mosquitoes.

Real Time PCR was used to measure mRNA expression of three

major immune-related transcription factor, aaRel 1, aaRel 2 and STAT in

infected cells and mosquitoes. C6/36 cells infected with SINV were analyzed on

0, 1, 3 and 7 days post-infection (DPI). Viral load increased in a time-

dependent manner, as expected (Fig 1A), but an increase in all three

transcription factors was observed only in late infection (Fig 1B, C and D). Adult

females fed with SINV presented an increase in viral particles 4 DPI (Fig 2A).

Although differences in individual experiments were not statistically significative,

a tendency to upregulation of Rel-1 and Rel-2 (but not of STAT) at 4 DPI was

consistently observed in all experiments (Fig 2B).

3.2 – Blood feeding induces immune activation in A. aegypti females.

To understand a possible role of blood feeding on innate immune

activation and pathogen transmission, we analyzed aaRel 1, aaRel 2 and STAT

mRNA expression after blood intake. All three genes were up regulated in the

midgut 24 h after meal (Fig 3A, B and C). Induction of STAT and aaRel 2 was

not affected when insects were fed with blood containing SBTI, an inhibitor of

trypsin, the major mosquito digestive protease (Fig B and C). In contrast, aaRel

1 expression seems to depend on blood digestion for its upregulation, since its

induction was prevented by SBTI (Fig 3A). Furthermore, BSA fed mosquitoes

presented a small upregulation of the studied genes, suggesting that this

regulation is not just a physical response to distention of the gut or to the

formation of a free aminoacid pool generated by digestion of a protein meal but

also dependent on the quality of the meal.

3.3 – Antibiotics treatment decreases aaREL2 expression after a blood

meal.

Gut commensal microbiota is an important factor on innate immune

activation [28] and it is known to increase after blood feeding [29], mainly

because the great intake of nutrients. In order to evaluate how gut microbiota

contributes to the immune activation observed after blood feeding, mosquitoes

were treated with antibiotics during four days before receiving a blood meal.

After this treatment, midguts were dissected, homogenized and plated onto LB

agar plates to control for absence of bacterial growth (Fig 4). Female

mosquitoes were then fed with blood and kept for four days on antibiotics until

RNA extraction. aaRel 2 showed a down regulation in antibiotics treated

mosquitoes (Fig 4B), but not aaRel 1 and STAT (Fig 4A and C). It is also

interesting to notice that, in treated mosquitoes, the increase in expression of

the transcriptional factors observed in Fig 2 is no longer observed, suggesting a

cross-talk between bacterial and viral immune response.

3.4 – Blood meal controls viral load in A. aegypti

Considering that antibiotic-treated mosquitoes down-regulated aaRel 2, we

decided to analyze infection levels under these conditions. When compared to

control mosquitoes, antibiotics treated ones presented about 6 times more viral

RNA, measured by Real Time PCR (Fig 7). This result suggests that blood

meal-induced activation of innate immune pathways, especially of Rel2 by the

increase in gut microbiota that follows a blood meal, is required to control of

pathogen entry and infection.

4 – Discussion

Despite all the knowledge that exists about immune response to fungi

and bacteria, much less is known about innate response to viral infection. The

Toll pathway was identified as an important part of D. melanogaster response

against Drosophila X virus (DXV). AMP genes were regulated by viral infection

reaching levels similar to those found in bacterial infection, but overexpression

of these genes did not diminish viral titers in flies, suggesting a that other

effector molecules than AMPs that are also under control of the Toll pathway

are involved in resistance against virus [30]. Investigating D. melanogaster

response to Drosophila C virus (DCV), [31] showed that JAK/STAT pathway is

activated in D. melanogaster after viral infection and that several viral-induced

genes contained the consensus binding site for STAT, a transcription factor of

JAK/STAT pathway [32]. In this study we analyzed the activation of the three

major immune-related pathways in A. aegypti mosquitoes by making an mRNA

expression profile of its transcription factors in different situations after blood

meal and SINV infection. Ours results showed an up regulation of aaRel 1 and

aaRel 2, two NF-kB homologs and STAT in Aedes albopictus cells persistently

infected with SINV (Fig 1). However, only a mild up regulation was observed in

vivo, in orally infected mosquitoes at 4 DPI (Fig 2), a time point when we have

already found production of viral transcripts and when other authors have

reported that there is intense viral replication in the midgut and that infection is

already disseminated throughout the insect body [33].

To get infected by a virus, females must ingest blood from an infected

host and the virus must be capable of enter and replicate in midgut cells

(outcoming the so-called midgut infecting barrier). After that, the virus must

leave the midgut towards the hemocoel and other organs (overcoming the

midgut escape barriers). Studies of refractoriness to viral infection of

arboviruses in natural populations have shown that frequently midgut barriers

are the major component of the vectorial competence [34], leading to the

conclusion that a better comprehension of the cell biology of the midgut

epithelium will be essential to understand host-pathogen interaction. The data

presented here showed that all three transcription factors of immune pathways

studied here were up regulated after blood meal, but not after a BSA meal, what

means that this activation was not a reaction to midgut distention (Fig 3).

Furthermore, mosquitoes fed with blood and SBTI were not capable of inducing

aaRel 1, what suggests this regulation is somehow dependent on blood

digestion (Fig 3A).

One important factor triggered by blood meal is the enormous increase of

commensal microbiota in the gut [35]. Proliferation of gut microbial population

could explain the increase of immune related transcription factors observed

here for aaRel 2, which was down regulated after antibiotic treatment (Fig 4B).

Expression of aaRel 1 and STAT in blood fed mosquitoes, on the other hand,

(Fig 4A and C) was equally increased both in normal and in antibiotics treated

insects, suggesting that the increase in expression observed after a blood meal

was not related to the presence of the microbiota, being triggered by the

presence of one or more digestion products.

SINV transcript levels in antibiotics treated mosquitoes 4 DPI were

significantly higher than in non-treated mosquitoes. We believe that the

decrease observed in aaRel 2 after elimination of microbiota might accomplish

for this increased viral susceptibility observed in antibiotics treated mosquitoes

(Fig 7B). In this way, we suggest that the increase of the population of gut

microbiota that follows a blood meal leads to the activation of IMD pathway,

which by an unknown mechanism might play an important role in virus control.

This conclusion is in line with some reports that indicated that midgut microbiota

in insect vectors could be very important for parasites survival and infection,

being important for the midgut infection barrier or constituting one [36]. Taken

together our results indicate that the upregulation of all three major midgut

immune pathways after a blood meal is important for the control of viral titers in

A. aegypti. In this way, disrupting that response by decreasing aaRel 2

expression leads to higher viral infection, indicating the importance of the insect

immune balance in controlling pathogen invasion after blood meal.

Besides, as far as we know, this is the first work to emphasize the

upregulation of midgut immune pathways caused by a non infected blood meal.

We believe that, in addition to being effective in control of SINV infection, this

might be an important adaptative mechanism developed by the mosquito to turn

on midgut immune pathways in the moment it is exposed to different pathogens.

In this way, this “anticipatory” immune trigger might constitute a key mechanism

to the establishment of the so called midgut infection barrier (MIB), which has

been shown to be the most important barrier to the establishment of all the

mosquito infections studied so far [37].

Recently, Xi et al.,[38] reported the role of Aedes aegypti Toll pathway in

controlling Dengue Virus infection. In this article it is shown that activation of

transcription of Toll controlled genes is observed in infected mosquitoes and

that a constitutive activation of Toll pathway by “knock down” of cactus by RNAi

leads to increased levels of viral particles in the mosquito. The same is not

observed for the IMD pathway, which is suggested to play a minor role in the

control of Dengue infection. It is also suggested that the mosquito’s natural

microbiota might modulate Dengue virus infection, through stimulation of the

mosquito’s immune system. Our results working with sindbis virus are in

agreement with these data and reinforce the idea that activation of basal

immunity by the gut microbiota might be important to an effective antiviral

response in the mosquito. It is also noteworthy that both in our work and in the

report from Xi et al., activation of Toll, IMD and Jak/STAT pathways are

observed after an infected blood meal, what might represent a general pattern

for mosquito response to a viral infection.

On the other hand, data showed here clearly points to an important role

for IMD pathway in controlling Sindbis infection, as can be observed by the

increased viral levels in antibiotics treated mosquitoes, which do not activate

aaRel 2 after a blood meal. Additional studies are still required to demonstrate if

this activation is required specifically for the control of Sindbis virus or if it can

also be involved in the control of other virus, such as Dengue.

Acknowledgements

We are grateful to Katia Anastácio Laia and S. R. Cassia for technical

assistance. This work was supported by grants from HHMI, PRONEX and

CNPq.

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Capture do figures

Fig 1 – C6/36 SINV infected cells

C6/36 cells were infected with sindbis virus (MOI=10) and incubated at 28 °C.

RNA extraction were performed at 0, 1, and 7 DPI. Viral titer was estimated by

Real Time PCR with primers for SINV genomic RNA, using 0 DPI as reference

(A). aaRel 1 (B), aaRel 2 (C) and STAT (D) mRNA expression were also

measured by Real Time PCR using RP49 as endogenous control and mock

infected cell as reference..

Fig 2 – SINV infected mosquitoes

Female mosquitoes were infected with sindbis virus (approximately 108) and

maintained for 4 DPI. RNA extraction were performed at 1, 4 and 7 DPI. Viral

titer was estimated also by Real Time PCR with primers for SINV genomic

RNA, using 1 DPI as reference (A). aaRel 1, aaRel 2 and STAT (B) mRNA

expression was measured by Real Time PCR using RP49 as endogenous

control and non-infected mosquitoes as reference.

Fig 3 – Blood feeding induces immune activation in mosquitoes

Female mosquitoes were artificially fed on sugar, rabbit’s blood, blood with

SBTI or BSA. Midguts were dissected 24 hours after feeding. aaRel 1 (A),

aaRel 2 (B) and STAT (C) mRNA expression were measured by Real Time

PCR using RP49 as endogenous control and sugar fed mosquitoes as

reference.

Fig 4 – Antibiotics treated mosquitoes

Mosquitoes were treated with antibiotics (penicillin/streptomycin) during four

days, dissected and midguts were homogenized and platted onto a LB-agar

medium. Bacteria colonies were estimated 24 h after plating.

Fig 5 – Antibiotics treatment decreases aaRel-2 expression

Mosquitoes treated with antibiotics (penicillin/streptomycin) during four days

were infected by artificial blood feeding. aaRel 1 (A), aaRel 2 (B) and STAT (C)

mRNA expression was measured by Real Time PCR using RP49 as

endogenous control and non-treated mosquitoes as reference.

Fig 6 – Viral load in antibiotics treated mosquitoes

Viral titers were estimated by Real Time PCR with primers for SINV genomic

RNA, using RP49 as endogenous control and non-treated mosquitoes as

reference.

Figure 1

Figure 2

Figure 3

Figure 4

Figure 5

Figure 6

Apêndice B

BYC, an atypical aspartic endopeptidase from Rhipicephalus(Boophilus) microplus eggs

Maria Clara L. Nascimento-Silva a, Alexandre T. Leal b, Sirlei Daffre c, Luiz Juliano d,Itabajara da Silva Vaz Jr. b, Gabriela de O. Paiva-Silva a,

Pedro L. Oliveira a, Marcos Henrique F. Sorgine a,⁎

a Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazilb Centro de Biotecnologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Brazil

c Departamento de Parasitologia, Instituto de Ciencias Biomedicas, Universidade de Sao Paulo, Sao Paulo, Brazild Departamento de Biofisica, Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, Brazil

Received 24 August 2007; received in revised form 13 December 2007; accepted 14 December 2007Available online 28 December 2007

Abstract

An aspartic endopeptidase was purified in our laboratory from Rhipicephalus (Boophilus) microplus eggs [Logullo, C., Vaz, I.S., Sorgine, M.H.,Paiva-Silva, G.O., Faria, F.S., Zingali, R.B., De Lima, M.F., Abreu, L., Oliveira, E.F., Alves, E.W., Masuda, H., Gonzales, J.C., Masuda, A., andOliveira, P.L., 1998. Isolation of an aspartic proteinase precursor from the egg of a hard tick, Rhipicephalus (Boophilus)microplus. Parasitology 116,525–532]. Boophilus yolk cathepsin (BYC) was tested as component of a protective vaccine against the tick, inducing a significant immune responsein cattle [da Silva, V.I., Jr., Logullo, C., Sorgine, M., Velloso, F.F., Rosa de Lima, M.F., Gonzales, J.C., Masuda, H., Oliveira, P.L., and Masuda, A.,1998. Immunization of bovines with an aspartic proteinase precursor isolated from Rhipicephalus (Boophilus) microplus eggs. Vet. Immunol.Immunopathol. 66, 331–341]. In this work, BYCwas cloned and its primary sequence showed high similarity with other aspartic endopeptidases. Inspite of this similarity, BYC sequence shows many important differences in relation to other aspartic peptidases, the most important being the lack ofthe second catalytic Asp residue, considered to be essential for the catalysis of this class of endopeptidases. When we determined BYC cleavagespecificity by LC-MS, we found out that it presents a preference for hydrophobic residues in P1 and P1' in accordance to most asparticendopeptidases. Also, when analyzed by circular dicroism, BYC presented high β sheet content, also a characteristic of aspartic endopeptidases. Onthe other hand, although both native and recombinant BYC are catalytically active, they present a very low specific activity, what seems to indicatethat this peptidase will digest its natural substrate, vitellin, very slowly. We speculate that such a slow Vn degradative process might constitute animportant strategy to preserve egg protein content to the hatching larvae.© 2007 Elsevier Inc. All rights reserved.

Keywords: Rhipicephalus microplus; Aspartic endopeptidases; Catalytic mechanism; Vitellin degradation

1. Introduction

The hard tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Acari:Ixodidae) is a bovine ectoparasite responsible for great econom-

ical losses in tropical and subtropical areas of the globe, such asCentral and South America and Australia. Besides the damagecaused by blood feeding,R. microplus is also the vector of severallethal cattle diseases, such as babesiosis and anaplasmosis(Jongejan and Uilenberg, 2004).

Endopeptidases form a large protein functional group andaccount for almost 2% of all sequenced genes in eukaryoticgenomes (Barrett et al., 1998). The knowledge about asparticendopeptidases catalytic mechanism is very limited when com-pared to other endopeptidases. The exactmechanism bywhich the

Available online at www.sciencedirect.com

Comparative Biochemistry and Physiology, Part B 149 (2008) 599–607www.elsevier.com/locate/cbpb

⁎ Corresponding author. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Centro deCiências da Saúde, Instituto de Bioquímica Médica, Bloco D-Sala SS05-Ilha doFundão, RJ-CEP: 21.941-590 Brazil. Tel.: +55 21 25626751.

E-mail address: sorgine@bioqmed.ufrj.br (M.H.F. Sorgine).

1096-4959/$ - see front matter © 2007 Elsevier Inc. All rights reserved.doi:10.1016/j.cbpb.2007.12.007

hydrolysis reaction takes place is not completely understood, butit is known that, in the catalytic pocket of aspartic endopeptidases,two aspartic acid residues are responsible for binding watermolecules, essential for the cleavage of the peptide-bond.

Structural characterization of retropepsins, the aspartic endo-peptidases of retroviruses, provided support to the concept thatthe two aspartic acid residues are essential for peptide-bondhydrolysis by aspartic endopeptidases. Since retropepsins haveonly one Asp residue in each polypeptide chain, this enzymeonly works as a homodimer (Lapatto et al., 1989).

In this work, the cDNA coding for BYC was cloned by RT-PCR and the analysis of its deduced amino acid sequenceconfirmed great similarity with other aspartic endopeptidases.However, BYC sequence showed a unique feature, which wasthe lack of the highly conserved second Asp residue found inthe active site of this class of endopeptidases. We have tried todefine molecular aspects of the protein catalysis for this uniqueenzyme and speculate about the consequence of the lack of oneAsp catalytic residue to the enzyme role in yolk degradation andtick development.

2. Materials and methods

2.1. Animals

R. (B.) microplus of Porto Alegre strain, were reared oncalves obtained from a tick-free area and maintained at theFaculdade de Veterinaria of the Universidade Federal do RioGrande do Sul, Brazil. Engorged adult females were kept in Petridishes at 28 C and 85% relative humidity. Eggs were collected atthe first day after oviposition and were frozen at−70 C until use.

2.2. Egg homogenates

Eggs were homogenized in a Potter-Elvehjem tissue grinder in20 mM Tris–HCl buffer, pH 7.4, with soybean trypsin inhibitor(20 μM), leupeptin (10 μM), and benzamidine (20 μM). Egghomogenates were centrifuged at 45,000 g for 60min at 4 °C. Thefloating lipids and the pellet were discarded, and the crude eggextract supernatant was used for protein isolation.

2.3. Electrophoresis

Polyacrylamide gels (10%) were run in the presence of SDS ata constant current of 20 mA. Gels were stained with CoomassieBlue G according to the method of Neuhoff et al., 1988. anddestained with deionized water.

2.4. Native BYC purification

BYC was purified as previously described (Logullo et al.,1998). Briefly, first-day egg homogenate was applied to an anionexchange DEAE-Toyopearl (20×3 cm) column equilibratedwith 10 mM Tris–HCl, pH 8.4 and eluted with a NaCl gradient(0 to 0.3MNaCl) at a 1 mL/min flow. Fractions containing BYC(identified by SDS-PAGE) were concentrated in a Speed-Vacsystem (Savant) and applied to a Sephacryl S-200 column

(120×2.4 cm) equilibrated with 0.15 MNaCl, 10 mM Tris–HClbuffer, pH 7.2. Protein purity was monitored by SDS-PAGE.

2.5. cDNA cloning and analysis

Total RNA from fat bodies of engorged female ticks waspurified using TRIzol reagent (Invitrogen Inc.). Five microgramsof total RNAwere reverse transcribed using the ‘Superscript pre-amplification system’ (Invitrogen Inc). A degenerated primer(CGNAARGAYCGNATHATHATG) based on BYC amino-terminal sequence (Logullo et al., 1998) was used together witha NotI-(dT)18 primer (Amersham Pharmacia Biotech) to amplifyBYC cDNA in a 35 cycles PCR reaction (94 °C for denaturation,55 °C for annealing and 70 °C for extension) using Pfx DNApolymerase. The PCR product was analyzed in 1% agarose geland extracted using “Concert Rapid Gel Extraction System” (LifeTechnologies Inc.). This product was cloned into a pT7Blue-3vector using the Perfectly Blunt TM cloning kit (Novagen Inc.),according to the manufacturer's instructions. DNA sequencingwas performed using the dideoxy method at the MolecularGenetics Instrumentation Facility of the University of Georgia.Several clones produced in different PCR and cloning reactionswere sequenced.

The obtained sequences were subjected to similaritysearches in non-redundant sequence databases such as NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Multiple alignments weremade using ClustalW (www.expasy.org) (Thompson et al.,1994) and T-coffee, version 1.4(http://www.ch.embnet.org/software/TCoffee.htmL) (Notredame et al., 2000). Physico-chemical and structural features were analyzed using the fol-lowing programs: Prot-Param (www.expasy.org), for generalparameters (Guruprasad et al., 1990); SignalP 3.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) for signal peptide cleavage siteidentification; PROSITE search (www.expasy.org) for second-ary structure prediction (Bairoch et al., 1997); SwissModelFirst Approach Mode (http://www.expasy.org/spdbv/) forsecondary structure comparison and alignment and SwissMo-del First Approach Mode (http://www.expasy.org/spdbv/) fortertiary structure modeling (Peitsch and Tschopp, 1995; Guexand Peitsch, 1997; Schwede et al., 2003).

2.6. Recombinant BYC

The amino acid sequence of the BYC clone obtained in thiswork was incomplete when compared to the sequence de-termined by Logullo et al., 1998, since the six N-terminal aminoacids were absent. In order to express recombinant BYC, the fullcoding sequence was restored by PCR and sub-cloned into apET32b (Novagen) vector, producing a recombinant proteinfused with histidine tagged thioredoxin protein (rBYC-trx) (Lealet al., 2006).

Recombinant BYC (rBYC-trx) was expressed in inclusionbodies. The inclusion bodies were purified as described byMarks et al., 2001. Briefly, the induction was made using1 mM IPTG in 250 mL of LB medium for 6 h at 37 °C. Cultureswere centrifuged at 3000 ×g for 10 min at 4 °C, the cell pelletwas incubated in KTE (50 mM Tris pH 8, 100 mM KCl, 1 mM

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EDTA) with 5 μg/mL DNAase for 10 min and sonicated on ice.After that, the preparation was centrifuged at 15,000 ×g for15 min at 4 °C and washed with KTE. This procedure wasrepeated four times. The obtained inclusion bodies werewashed twice in 20 mM Tris pH 8.5, 2.5 mM EDTA, 5 mMimidazole, 1% Triton X-100, centrifuged at 27,000 ×g for10 min at 4 °C and solubilized in 15 mL 0.3% N-laurosylsarcosine with 50 mM CAPS, pH 11, and 1 mM DTT for30 min at room temperature. After that, the preparation wascentrifuged at 11,000 ×g for 15 min at 4 °C and the supernatantwas collected and dialyzed at 4 °C against 0.15 M NaCl,20 mM Tris–HCl, pH 8.0, using three refolding steps, 4 h perstep: 1) 0.1 mM DTT 2) buffer only 3) with 0.2 mM oxidizedglutathione and 1 mM reduced glutathione. Protein purity wasmonitored by SDS-PAGE.

2.7. Proteolytic activity

To determine peptidase activity, both native and recombinantBYC were incubated in 0.1 M sodium acetate buffer, pH 3.5, at37 °C with its substrates. Abz-peptidyl-EDDnp fluorogenicsubstrates (6 μM) were incubated with 0.5 μM of the enzymeand the reactions were monitored after 12 h by measuring thefluorescence (excitation at 320 nm wavelength, emission at420 nm) with a Cary Eclipse spectrofluorometer.

2.8. Hemoglobin hydrolysis and BYCs cleavage specificityanalysis by LC-MS

To follow hydrolysis of hemoglobin, 20 μg of native BYCand 20 μg of bovine hemoglobin were incubated in 0.1 Msodium acetate buffer pH 3.5, at 37 °C for different times.Reactions were stopped by the addition of 3 μl of SDS samplebuffer to the 15 μl of the reaction mixture and the samples wereimmediately boiled for 3 min. Hemoglobin hydrolysis wasobserved by SDS-PAGE.

For analysis of cleavage specificity, 50 μg of native BYC and65 μg of bovine hemoglobin were incubated in 0.1 M sodiumacetate buffer pH 3.5, at 37 °C for 12 h in a 50 μl reaction. Thisreaction was diluted 10 times in 0.05% TFA and fractioned in aC18 capillaryHPLCcolumn equilibrated in 5% acetonitrile, 0.05%TFA and eluted by a 5–80% acetonitrile gradient. This columnwascoupled to a Finnigan LCQDuo ion Trap mass spectrometer. Datawas obtained with 3 s intervals in a 150–2000 m/z range. Thesequenced fragments were analyzed by Turbo Sequest (ThermoFinnigan) software, using bovine proteins database.

2.9. Circular dichroism

CD spectra were made at room temperature in a Jasco J-715spectropolarimeter, between 190–260 nm, using a 1 mm cuvette

Fig. 1. BYC cloning. BYC complete nucleotide and amino acid sequence. The box marks the region corresponding to the primer used for PCR. The shaded regioncorresponds to the pre-pro-region. The asterisk corresponds to the cleavage site of the pre-pro-BYC, predicted using SignalP, which matches the amino terminaldetermined by Edmann degradation (Logullo et al., 1998).

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and 0.05 mg/mL of BYC, in 0.10 M sodium acetate buffer, pH3.5.

2.10. Fluorogenic synthetic peptides

All fluorogenic peptides used in this work were synthesizedas previously described (Hirata et al., 1991).

3. Results

3.1. BYC cloning

The amino-terminal sequence, obtained by Edman degrada-tion of native BYC (Logullo et al., 1998), was used to construct adegenerated primer (CGNAARGAYCGNATHATHATG) that,together with a NotI-(dT) 18 primer, was used to clone BYCfrom tick fat body RNA (GenBank accession no. AY966003).The obtained cDNAwas Blasted against B. microplus sequencesavailable at The Institute for Genomic Research (TIGR) GeneIndex Project (http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/cgi-bin/tgi/gimain.pl?gudb=b_microplus) and a sequence namedBEACL02 was identified as identical to BYC, containing notonly its coding sequence but also its 5'UTR. When translated,the obtained sequences encodes a protein of 375 amino acids(41,844.6 Da) with a pI of 5.38 (Fig. 1). When this cDNAsequence was used to perform a search in NCBI Blastp database,some of the closest obtained identities were with aspartic

endopeptidases from Schistossoma mansoni (GenBank acces-sion no. SMU60995) and Aedes aegypti (GenBank accessionno. H477377) (34% and 35%, respectively), which were alignedwith BYC in Fig. 2.

3.2. BYC sequence analysis

When BYC sequence was compared with other asparticendopeptidases, we noticed some important differences in theamino-acids of its active site (Fig. 2). The substrate binding S2sub-site, in the carboxy-end of BYC amino acid sequence wasnot preserved, as well as the nearby conserved cysteine pair.But the most important change was the absence of the secondaspartic acid residue, highly conserved in this enzyme class. Aspreviously described, aspartic endopeptidases have twoaspartic residues, responsible for binding the water moleculesin its active site, leading to substrate hydrolysis (Barrett et al.,1998).

3.3. Secondary and tertiary structure prediction

BYC amino acid sequence was analyzed using Predictpro-tein (Columbia University) and SWISS-MODEL software forsecondary structure prediction. The higher identity matches inSWISS-MODEL template database were with rennin, fromMus musculus (code 1smrA, 32% identity) and Homo sapiens(code 1hrnA, 33% identity). The predicted secondary structure

Fig. 2. Alignment of BYC amino acid sequence with Aedes aegypti (GenBank accession no. H477377) and Schistossoma mansoni (GenBank accession no.SMU60995) aspartic endopeptidases. The structural and functional domains are assigned: Conserved loops are shaded, catalytic aspartic residues are in grayboxes marked with an arrow; S2 substrate subsite is assigned with a dark star; S3 substrate subsite is assigned with a white star and Cys residues witharrowheads.

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showed a predominance of β-sheet, which was in accordancewith the circular dichroism spectra of native BYC, whichdisplayed a typical β-sheet profile, with a negative peak at216 nm (Fig. 3).

Using the alignments with M. musculus and H. sapiensrennins we obtained a tertiary structure model for BYC, usingthe “first approach” mode of Swiss-Model. Besides, anotheralignment was done, using T-Coffee software, having humanrecombinant renin (PDB- 2Ren) as template. From this secondalignment, another BYCmodel was made, using the “AlignmentInterface”mode of Swiss-Model. Both models were analyzed onRasTop and SPDBV software and the main residues werelocated in nearly identical positions. The comparison of BYCmodel with renin structure showed a serine residue in BYCsequence that would be in the same position occupied by one ofthe rennin catalytic asp residues, suggesting a role for this aminoacid in BYC catalytic mechanism (Fig. 4).

3.4. Determination of cleavage specificity by LC-MS

Native BYC activity was tested against hemoglobin, a classicsubstrate for aspartic endopeptidases (Fig. 5). When incubatedin acidic medium for 12 h, purified native BYC was able tohydrolyze hemoglobin. However, when incubated in neutralmedium or in presence of pepstatin A, an aspartic endopeptidaseinhibitor, proteolysis was totally abolished.

Considering that BYC is an active aspartic endopeptidasethat lacks an important residue in its catalytic site, we wanted todetermine its cleavage specificity. BYC (20 μg) was incubated

Fig. 3. Circular Dichroism of BYC. BYC presented a β-sheet typical profile,with a negative peak at 216 nm.

Fig. 4. BYC Structure prediction. (A) The prediction was made using first approach mode, SWISS-MODEL. Human recombinant renin PDB — 2ren_ two catalyticAsp-residues are shown in (B) and BYC residues that align in the active region are shown in (C).

Fig. 5. Bovine hemoglobin hydrolysis by BYC. SDS PAGE (20%) of BYCincubated with hemoglobin for 12 h. 1-BYC and hemoglobin without incu-bation, 2-acidic medium pH 3.5, 3-acidic medium in the presence of pepstatinA and 4-neutral medium.

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with hemoglobin (20 μg) for 15 h. The reaction mixture wasanalyzed in a HPLC capillary C18 column coupled to a massspectrometer (LC-MS). The proteolysis products were partiallysequenced and analyzed using a bovine protein database. Itwas possible to identify 17 different BYC cleavage sites inhemoglobin sequence (Fig. 6A).

3.5. Fluorogenic synthetic peptides

Based on the cleavage profile obtained by the LC-MS an-alysis, 14 synthetic peptides with 8 amino acids were made(from P4 to P4'). In these peptides, P1 and P1' were theprobable cleavage site determined by bovine hemoglobinproteolysis (Fig. 6A). One more peptide was synthesized,using a consensus hydrolysis sequence for aspartic endopepti-dases (peptide A, AIAFFSRQ). All the synthetic peptides wereincubated with native BYC for 48 h and the reaction mediumfluorescence was registered at different times. When the fluo-rescence values obtained were analyzed, three peptides weremore efficiently cleaved than the others, reaching the maximumof fluorescence after 20 h of incubation (HSLLVTLA, VVV-

LARNF and AIAFFSRQ); eight peptides presented a lowercleavage rate (LERMFLSP, AEALERMF, SHSLLVTL, LV-TLASHL, TAFWGKV, LGRLLVVY, TQRFFESF and GR-LLVVYP) and the other four were not susceptible at all toproteolysis by BYC (LDKFLANV, STVLTSKY, FLANVSTVand LQADFQKV) (Fig. 6B).

3.6. Recombinant BYC activity

Bacteria containing pET-32b/BYC (Leal et al., 2006) weregrown in LB medium with IPTG. The recombinant BYC, fusedwith histidine tagged thioredoxin (Trx) was expressed ininclusion bodies, which were purified to obtain rBYC-Trx.After refolding, the extraction product presented the expectedmolecular mass for rBYC-Trx (50 kDa ) when observed by SDSPAGE (Fig. 7A).

Recombinant BYC activity was measured using the syn-thetic peptide A, consensus for aspartic endopeptidases, in thesame conditions as the native protein. Recombinant BYC wasable to hydrolyze peptide A and its activity was abolished inthe presence of pepstatin A, a specific aspartic endopeptidase

Fig. 6. Clevage specificity analysis. (A) Cleavage sites identificed by “⁎” in α and β chains of bovine hemoglobin by overnight 15 h incubations with BYC weredetermined by mass spectrometry LC-MS (B) Cleavage profile of the fluorogenic peptides by BYC after a 20 h incubation, pH 3,5 and 37 °C. Results are indicated asmeans±S.E.M. of three independent experiments.

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inhibitor (Fig. 7B). Bacterial extracts containing only PET32bplasmid showed no activity under these conditions (data notshown).

4. Discussion

4.1. An atypical aspartic endopeptidase

BYC amino terminal sequence (Logullo et al., 1998) was usedto design a degenerated primer to clone its cDNA by RT-PCR(Fig. 1). The first amino-acids and the 5'UTR of the gene werefurther obtained by blasting the obtained sequence against theBoophilus microplus EST database at the TIGR Gene IndexProject. BYC cDNA sequence (Fig. 1) was compared to otheraspartic endopeptidases. BLASTp analysis showed greatsequence identities (about 35%) with arthropods endopeptidases,and with those of Schistossoma mansoni (34%). Despite overallsequence similarity, BYC showed important differences towardsthese typical aspartic endopeptidases (Fig. 2). Themost importantis the absence of the second Asp residue from the catalytic site.Since present knowledge about the reaction mechanism ofaspartic endopeptidases establishes that two conserved Aspresiduesmust bind the water molecules responsible for hydrolysisof substrate peptide bond, we wonder how BYC could preserveproteolytic activity even in the lack of this residue of aspartic acid.

A few reports on aspartic endopeptidases that also lack im-portant residues in their active sites can be found in the literatureand include mammal PSPs, cockroach proteins and an asparticpeptidase from Plasmodium falciparum.

The Pregnancy Specific Proteins (PSPs) are found in placentaof ungulate mammals and are described as inactive members ofthe aspartic endopeptidase family (Xie et al., 1991). PSPspresent several modifications in its catalytic site, among whichthe most relevant is the absence of the second Asp residue, afeature that is also observed in BYC sequence. These proteins

are proposed to have no catalytic activity, in spite of beingcapable of binding peptides (up to 7 amino acids) to its active site(Butler et al., 1982).

Lma-p54 is a surface protein present in adult Leucophaeamaderae and proposed to be closely related to aspartic endo-peptidases. However, some amino-acid substitutions at the activesite seem to result in the absence of enzymatic activity. Proteolysisassays performed in conditions close to those observed in thenatural secretions suggested that Lma-p54 is not active on theinsect body surface (Cornette et al., 1991). The most similarprotein to Lma-p54 is the cockroach allergen Bla g 2, of B.germanica (Arruda et al., 1995) (48.5% amino acid Identity). Thestructure of Bla g 2, obtained using recombinant enzymeexpressed in Pichia pastoris revealed that this protein has abilobal fold with a large cleft located between the two domains, asexpected for aspartic endopeptidases. However, four criticalamino-acid substitutions in the active site and in the flap regioncause important modifications in the orientation of the aspartateresidues important to its catalytic mechanism (Gustchina et al.,2005). No enzymatic activity was measured using milk-clottingand hemoglobin assays but a residual proteolytic activity wasfound at high protein concentrations (approximately 4 mM),suggesting that proteolysis may not be the primary function of thisallergen. (Wünschmann et al., 2005).

Despite a very low activity, both Bla g 2 and PSPs arecapable of biding ligands to its active site (Butler et al., 1982,Wünschmann et al., 2005) and their role as a ligand-binding orcarrier molecules are under investigation.

Another aspartic endopeptidase presenting a modification inits catalytic site has been characterized. HAP (Histo-asparticendopeptidase) is an aspartic endopeptidase located in thedigestive vacuole of Plasmodium falciparum that presents a Hisresidue in the place of the first Asp catalytic residue (Berry et al.,1999). This substitution allows the enzyme to be active,although it results in a change of the enzyme optimum pHtowards more neutral instead of acidic ones. This data shows thatother amino-acids can also bind the water molecule, performingrole of at least one of the aspartic acid residues in hydrolysis ofsubstrate peptide bonds. Nevertheless, it is important to noticethat, in the case of BYC, a change in the enzyme optimumactivity pH is not observed, being its activity maximum at acidicpHs, similar to all the other “classical” aspartic endopeptidases(Fig. 5).

An alternative explanation would be that BYC, as well asHIV retropepidase, works as a dimmer, using only one asparticacid residue from each subunit to break the peptide bond.Nevertheless, all molecular weight determinations, by nativePAGE or gel exclusion chromatography, showed no evidence ofsuch fact and, indeed, indicate that BYC works as a monomer(Logullo et al., 1998).

Comparison of BYC amino acid sequence with other asparticendopeptidases shows that the region around the first Aspresidue is highly conserved, including the Gln residue of the S3sub-site, important in substrate binding. In contrast, the regionnear the position of the missing Asp residue of BYC is alsodifferent from other aspartic endopeptidases since a sequencesimilar to the whole S2 sub-site is not found in the tick peptidase.

Fig. 7. Recombinant BYC is proteolytic active (A) SDS PAGE (10%) ofrecombinant BYC 1-Molecular mass marker and 2-purified inclusion bodies.The arrow indicates BYC. (B) Synthetic peptide A fluorescence when incubatedwith recombinant BYC in the absence (1) or presence (2) of pepstatin A. Resultsare representative of three independent experiments.

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Several studies with vertebrate and fungi aspartic endopepti-dases suggested that S2 and S3 sub-sites are both essential forpeptidase-substrate interaction (Dunn et al., 1986; Dunn et al.,1987 and Wong et al., 1997).

Vertebrate cathepsins D present eight conserved loops, someof them involved in maturation and processing of precursorpolypeptides. Loop 3 is responsible for a cleavage that leads todimer formation, stabilizing the tertiary structure of the enzyme(Yonezawa et al., 1988). Some enzymes do not have this loopbut, instead, present other cleavage site or never form a dimer.BYC and the peptidases that alignment better with it did notpresent loop 3 (Fig. 2).

Secondary structure prediction using BYC amino acidsequence indicates a high β sheet content, a known characteristicof aspartic endopeptidases (Davies, 1990). This prediction was inagreement with circular dichroism spectra of native BYC (Fig. 3).When BYC was compared to other aspartic endopeptidases thatalready have its tertiary structure determined (SWISS-PROTdatabase), it presented higher similarity with rennins. Based on thestructure of human rennin, a model for BYC tertiary structure wascreated, making it possible to compare the different amino acidpositions in the active site region (Fig. 4). The residue that betterfits the second Asp position, in this model, was a serine. The lackof a cysteine pair in this region could lead to a modified con-formation in comparison to other aspartic endopeptidases, sug-gesting that only a complete resolution of BYC structure, togetherwith a site-directedmutagenesis study, could answer this question.

4.2. BYC activity, cleavage specificity and importance to thetick larvae

Brindley et al., 1997, studied carefully the cleavagespecificity of the cathepsin D — like aspartyl endopeptidasesof S. mansoni and S. japonicum. Using human hemoglobin assubstrate they found 15 and 13 cleavages sites, respectively.Both enzymes showed preference for hydrophobic residues inP1 and P1', specially leucine and phenylalanine. BYC cleavagespecificity analysis by LC-MS identified seventeen cleavagesites in bovine hemoglobin (Fig. 6A). Ten of these sites were inhemoglobin α chain and seven in β chain. Among them, thirteenhad leucine or phenylalanine in P1 and six in P1'. This profile isvery similar to the one exhibited by S. mansoni cathepsin Dwhen assayed against human hemoglobin (Brindley et al., 1997).Furthermore, BYC shares six of the thirteen human cathepsin Dcleavage sites in bovine hemoglobin (Fruitier et al., 1998).

The cleavage profile of synthetic peptides by BYC confirmedthe enzyme preference for hydrophobic and aromatic residues inP1 and P1' (Fig. 6B). These results showed that BYC displays atypical cathepsin D-like cleavage primary specificity, althoughlacking an important residue in its active site.

To exclude the possibility that BYC previously demonstratedactivity (Logullo et al., 1998) was due to a minor contaminationof the preparation by another egg aspartic endopeptidase, suchas THAP (Sorgine et al., 2000), we expressed the protein in E.coli system (Leal et al., 2006). After purification, activity wastested using synthetic peptide A, showing that the recombinantenzyme is proteolytically active (Fig. 7) and shows the same

cleavage specificity of the native enzyme. For these reasons, webelieve that BYC, as described here, might constitute a novelaspartic endopeptidase with a unique catalytic mechanism.Further studies, particularly using single point mutations, arestill necessary to better elucidate its action mechanism.

Vitellins (Vns) are the major storage proteins of arthropodeggs and are degraded during embryogenesis to provide rawmaterials/substrates for embryo development (Postlethwait andGiorgi, 1985). BYC is associated with yolk degradation in R.microplus (Abreu et al., 2004). Logullo et al., 2002, showed thatonly one third of total Vn is degraded during the embryogenesisof R. microplus – which takes about three weeks fromoviposition to hatching – suggesting that this is a very slowand controlled process. Besides BYC, two other yolkendopeptidases from R. (B.) microplus eggs have already beendescribed: a cysteine endopeptidase VTDCE (vitellin degradingcysteine endopeptidase) (Seixas et al., 2003) and anotheraspartic endopeptidases, THAP (Tick Heme-binding Asparticendopeptidase) (Sorgine et al., 2000). If the activity of thesepeptidases were not tightly controlled, Vn would probably bedegraded much faster than it actually occurs in vivo. Therefore,the mechanisms by which each one of these enzymes isregulated are not only extremely important for a betterunderstanding of embryogenesis in the tick, but also representsa very interesting model to increase our understanding onsubstrate-enzyme interaction and cleavage specificity.

One important issue about BYC activity is that significantlevels of activity can only be detected after long incubations inhigh enzyme/substrate molar ratios, sometimes close to 1:1,indicating that the enzyme possesses a very low specificactivity. It seems much likely that this low specific activity bedue to the lack of the second Asp catalytic residue. BYC is themost abundant endopeptidase in R. microplus eggs. Whendetermined by densitometry of SDS gels, this proteinrepresents approximately 6% of egg total protein content(data not shown). Considering that Vn may constitute up to90% of the egg protein content (Logullo et al., 2002), one mayconclude that the physiological molar ratio of BYC to Vn inthe egg is of approximately 0.6 to 1, which is probably one ofthe highest enzyme to substrate ratios ever described. In thisway, if BYC had a high specific activity, Vn would bedegraded too soon, a fact that cannot happen since by the timeof hatching only 40% of the original Vn content has beenconsumed and the rest of this protein is necessary to sustain thelarvae before it finds a new host (a process that can take a fewmonths) (Logullo et al., 2002). In this way, we believe that thepresence of an endopeptidase with high specificity and lowactivity might constitute an important strategy developed bythe tick to spare egg energetic resources for the first periods oflarvae existence.

Acknowledgements

We are grateful to Dr. Misao Onuma for cooperation incloning experiments and S R Cassia for technical assistance.This work was supported by grants from HHMI, PRONEXand CNPq.

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Apêndice C

Protein Expression and PuriWcation 45 (2006) 107–114

www.elsevier.com/locate/yprep

1046-5928/$ - see front matter 2005 Elsevier Inc. All rights reserved.doi:10.1016/j.pep.2005.07.009

PuriWcation and antigenicity of two recombinant forms of Boophilus microplus yolk pro-cathepsin expressed in inclusion bodies

Alexandre T. Leal a, Paula C. Pohl a, Carlos A.S. Ferreira b, Maria C.L. Nascimento-Silva c,Marcos H.F. Sorgine c, Carlos Logullo d, Pedro L. Oliveira c, Sandra E. Farias a,

Itabajara da Silva Vaz Jr. a,e, Aoi Masuda a,¤

a Centro de Biotecnologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Avenida Bento Gonçalves, 9500, Porto Alegre-RS 91501-970, Brazilb Laboratório de Imunologia, Faculdade de Biociências, Pontifícia Universidade Católica, Porto Alegre-RS, Brazil

c Departamento de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro-RJ, Brazild Laboratório de Química e Função de Proteínas e Peptídeos, Universidade Estadual do Norte Fluminense, Campos de Goytacazes-RJ, Brazil

e Faculdade de Veterinária, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre-RS, Brazil

Received 11 April 2005, and in revised form 8 July 2005Available online 8 August 2005

Abstract

The tick Boophilus microplus is a bovine ectoparasite present in tropical and subtropical areas of the world and the use of vaccinesis a promising method for tick control. BYC is an aspartic proteinase found in eggs that is involved in the embryogenesis of B. micro-plus and was proposed as an important antigen in the development of an anti-tick vaccine. The cDNA of BYC was ampliWed by PCRand cloned for expression in two forms with and without thioredoxin fusion protein (Trx), coding recombinant proteins namedrBYC-Trx and rBYC, respectively. Expression, solubility, and yields of the two forms were analyzed. The recombinant proteins wereexpressed in inclusion bodies (IBs) and three denaturant agents (N-lauroyl sarcosine, guanidine hydrochloride, and urea) were testedfor IBs solubilization. The N-lauroyl sarcosine solubilized 90.4 and 92.4% of rBYC-Trx and rBYC IBs, respectively, and was themost eYcient denaturant. Two recombinant forms were aYnity-puriWed by Ni2+-Sepharose under denaturing conditions. After dial-ysis, the yield of soluble protein was 84.1% for r-BYC-Trx and 5.9% for rBYC. These proteins were immune-reactive against serafrom rabbit, mouse, and bovine previously immunized with native BYC, which conWrms the antigenicity of the recombinant BYCsexpressed in the Escherichia coli system. 2005 Elsevier Inc. All rights reserved.

Keywords: Boophilus microplus; BYC; Thioredoxin; Inclusion bodies; N-Lauroyl sarcosine; Vaccine

The tick Boophilus microplus is an important cattleectoparasite in South and Central Americas, Asia,Africa, and Oceania [1]. This ixodidae tick causes consid-erable economical losses to cattle breeding, eitherdirectly, due to the blood-sucking deleterious eVectswhich cause losses in animal production, or indirectly byincreasing pest control costs. Besides, B. microplus is avector of diseases such as anaplasmosis and babesiosis.

Conventional tick control methods are based mainly onthe use of acaricides, in spite of the high costs and therapid appearance of resistance in the tick population [2].The presence of chemical residues in meat and milkemphasizes the need for novel control methods [3].Therefore, eVorts are being made to develop new meth-odologies to monitor the appearance of acaricide resis-tance [4] as well as to promote alternative approaches totick control such as vaccines [5–9] and biological control[10–12]. An anti-tick vaccine is considered one of themost promising methods; however, its development still

* Corresponding author. Fax: +55 51 3316 7309.E-mail address: aoi@cbiot.ufrgs.br (A. Masuda).

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depends on the identiWcation and characterization ofone or more protective tick antigens [13,14]. The successof this strategy depends on the identiWcation and cloningof key tick molecules and the characterization of theirroles in arthropod physiology [14,15].

The Boophilus yolk pro-cathepsin (BYC)1 is an aspar-tic proteinase present in B. microplus eggs [16]. The54 kDa BYC is activated in vitro by auto-proteolysiswhen incubated in acidic pH, and converted to a 47-kDapolypeptide that can be detected in vivo, during embryo-genesis. Recently, the role of BYC was demonstrated inthe degradation of vitellin (VT), the major yolk protein,conWrming its importance in embryogenesis [17]. Cattleimmunized with puriWed BYC showed an immuneresponse partially protective against tick infestation thatwas mostly due to an increase in the number of sterileeggs [7]. These data support BYC as an antigen candi-date to design an anti-tick vaccine. Aspartic proteinasesproduced in Escherichia coli are usually expressed ininclusion bodies (IBs), and fusion proteins as thiore-doxin (Trx) [18,19] or maltose-binding protein (MBP)have been used in order to improve solubility of recom-binant proteins [20]. In the present study, the BYCcDNA was cloned in a vector with thioredoxin and His-tag as fusion protein and in other vector only with His-tag at the carboxy-terminus of the protein. Therefore, wereport the expression of the two recombinant forms ofBYC (rBYC) in E. coli as inclusion bodies, and the anal-ysis of various denaturants to solubilize the IBs in orderto purify rBYC by aYnity Ni2+-Sepharose chromatogra-phy. We also report the eYciency of solubility and therecognition of rBYC not fused and fused with Trx byhyperimmune sera raised in animals immunized with thenative BYC protein.

Materials and methods

Cloning of BYC

The cDNA encoding BYC was previously cloned byRT-PCR from fat body of engorged tick females (MariaNascimento-Silva, personal communication). Accordingto the amino acid sequencing of BYC [16] the cDNAwas incomplete, without the coding sequence for the sixN-terminal amino acids (GenBank Accession No.AY966003). The full coding sequence was restored byPCR and the complete cDNA was cloned into twoexpression vectors, pET-32b (Novagen), which producesa recombinant protein fused with histidine tagged thio-

redoxin protein (Trx), and pET-19b (Novagen), whichproduces a recombinant protein fused with a histidinetag. For cloning into pET-32b vector via NcoI and XhoIsites, the following primers were used: sense, tatca-attccatggcaaaaatt cgcattccgcttcgcaaggatcgtattattatgtc;antisense, atcagggc tcgagttagtacacgattgggcgg (NcoI andXhoI restriction sites are in italics, the bases coding themissing amino acids are in bold). PCR ampliWcationwith Elongase polymerase (Invitrogen) was performedusing 10 ng of template plasmid (pT7-Blue/BYC). Reac-tion conditions were: an initial 5-min denaturation at94 °C, 30 cycles of 30 s at 94 °C, 30 s at 54 °C, 60 s at68 °C, and a 5-min Wnal extension at 68 °C. The ampliWedDNA (1106 bp) sequence encoding the exon of BYC wasdigested with NcoI and XhoI, and cloned into plasmidpET-32b at NcoI/XhoI restriction sites downstream tothe gene of thioredoxin (Trx) and histidine tag to givethe pET-32b/BYC plasmid. For ligation, digested insertand vector were puriWed in a MicroSpin S-400 HR col-umn (Amersham Biosciences) and ligated with T4 DNAligase (Invitrogen). After the cloning into pET-32b, theBYC cDNA was subcloned into pET-19b using the fol-lowing primers: sense, tatcaattccatggcaaaaattcgcattc;antisense,atcagggctcgagttagtggtggtggtggtggtggtacacgattgggcgggtg (NcoI and XhoI restriction sites are in italics,the encoding histidine tag included into antisense primerare in bold). Reaction conditions were: an initial 5-mindenaturation at 94 °C, 30 cycles of 30 s at 94 °C, 30 s at55.9 °C, 60 s at 68 °C, and a 5-min Wnal extension at68 °C. The 1123 bp PCR product and plasmid weredigested with NcoI and XhoI, puriWed in MicroSpin S-400 column (Amersham Biosciences), and ligated withT4 DNA ligase (Invitrogen) to give pET-19b/BYC plas-mid. The resulting plasmids pET-32b/BYC and pET-19b/BYC, coding the rBYC-Trx and rBYC proteins,respectively, were transformed by electroporation intoXL1 Blue E. coli cells (Novagen) and selected in Luria–Bertani (LB) medium containing ampicillin(100 �g ml¡1). The BYC cDNA integrity was conWrmedby sequencing the plasmid DNA.

Expression and preparation of inclusion bodies

The recombinant plasmids pET-32b/BYC and pET-19b/BYC were transformed into E. coli strain AD494DES LysS (Novagen) and plated onto LB agar platescontaining ampicillin. Single colonies were inoculatedinto 2.5 ml SOB medium [21] containing ampicillin(100 �g ml¡1) and grown overnight at 37 °C with shakingat 180 rpm. The overnight cultures were harvested bycentrifugation, resuspended in fresh medium, and usedto inoculate 500 ml of SOB medium in 2-L Xasks. TheseXasks were incubated at 37 °C with shaking at 180 rpmuntil an OD600 of 0.5 was reached. For induction, isopro-pylthio-�-D-galactoside (IPTG, Invitrogen) was added toa Wnal concentration of 0.4 mM and the culture was

1 Abbreviations used: BYC, Boophilus yolk pro-cathepsin; VT, vitel-lin; IBs, inclusion bodies; Trx, thioredoxin; MBP, maltose-binding pro-tein; LB, Luria–Bertani; IPTG, isopropylthio-�-D-galactoside; GuHCl,guanidine hydrochloride; ORFs, open reading frames; CMC, criticalmicelle concentration.

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grown at 30 °C for 17 h. The cell culture was centrifugedat 10,000g for 10 min at 4 °C and the cell pellet was resus-pended in phosphate buVer (10 mM sodium phosphate,150 mM NaCl, pH 7.4). For cell lysis, the suspension wasfrozen, thawed out and sonicated on ice. The proteaseinhibitor PMSF (1 mM) was added prior to sonication.The soluble and insoluble fractions were separated bycentrifugation at 10,000g for 10 min at 4 °C. The pelletcontaining the IBs was resuspended with washing buVer(50 mM Tris–HCl, 100 mM NaCl, 1 M urea, and 1% Tri-ton X-100, pH 8.0) and centrifuged at 8000g for 10 minat 4 °C. This step was repeated three times.

Solubilization of recombinant proteins

The IBs were treated with three denaturant agents(0.3% N-lauroyl sarcosine, guanidine hydrochloride, andurea), as described below. After each denaturant treat-ment, solubilization yields were analyzed by sodiumdodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis 12%(SDS–PAGE) [22] and protein quantiWcation was deter-mined by the Bradford method [23] with bovine serumalbumin as standard.

Solubilization with 0.3% N-lauroyl sarcosine

The washed IBs were denatured and solubilized inlysis buVer A (0.3% N-lauroyl sarcosine, 50 mM CAPSbuVer, and 0.3 M NaCl, pH 11.0) for 1 h and centrifugedat 10,000g for 15 min at 4 °C. The rBYC-Trx and rBYCproteins, which contain His-tag, were aYnity-puriWed byNi2+-Sepharose. In brief, the supernatant was applied toa His Trap HP column (Amersham Biosciences) and thecolumn was then washed with washing buVer A (30 mMimidazole, 0.3% N-lauroyl sarcosine, 50 mM CAPSbuVer, and 150 mM NaCl, pH 11.0). The proteins wereeluted with a serial concentration increase of imidazole(50, 100, 200, and 500 mM) in elution buVer A (0.3% N-lauroyl sarcosine, 50 mM CAPS buVer, and 150 mMNaCl, pH 11.0). Eluted fractions were analyzed by 12%SDS–PAGE. The denatured puriWed proteins in theeluted fractions were dialyzed in 20 mM Tris–HCl,150 mM NaCl buVer with gradual pH reduction (pH 10,pH 9, and pH 8). Each dialysis step was performed at4 °C during 12 h against at least 20£ sample volume.Samples at pH 9.0 were collected for SDS–PAGEanalysis.

Solubilization with 6 M guanidine hydrochlorideand 8 M urea

The washed IBs were denatured and solubilized withlysis buVer B (20 mM sodium phosphate, 500 mM NaCl,6 M guanidine hydrochloride (GuHCl), and 1 mM �-mercaptoethanol, pH 7.4) for 1 h and centrifuged at10,000g for 15 min at 4 °C. The solubilized proteins

(rBYC-Trx and rBYC) were puriWed in Ni2+-Sepharosecolumn following the manufacturer’s instructions(Amersham Biosciences). PuriWcations were performedunder denaturing conditions. Samples were loaded andthe columns washed with the same lysis buVer B contain-ing 30 mM imidazole. Proteins of interest were elutedwith 100 mM imidazole in elution buVer B (20 mMsodium phosphate, 500 mM NaCl, and 6 M GuHCl, pH7.4). The puriWed proteins were dialyzed against 20 mMTris–HCl, 300 mM NaCl (pH 7.4). Eluted fractions wereanalyzed by 12% SDS–PAGE. Urea (8 M) was alsotested for solubilization of recombinant proteins.Washed IBs were solubilized with lysis buVer C (20 mMsodium phosphate, 500 mM NaCl, and 8 M urea, pH 7.4)for 1 h at room temperature. The samples were centri-fuged at 10,000g for 15 min at 4 °C and the soluble frac-tions were analyzed by 12% SDS–PAGE.

Western blotting with anti-BYC antibody

To verify antigenicity, Western blot assays usingserum against native BYC of diVerent species were car-ried out. The recombinant proteins (rBYC-Trx andrBYC) were separated by 12% SDS–PAGE and trans-ferred onto a nitrocellulose membrane and probed withbovine, rabbit or mouse sera (1:500) previously immu-nized with native BYC. Anti-IgG species-speciWc alka-line phosphatase conjugates were used as secondaryantibodies and NBT/BCIP (Sigma) were used as sub-strate.

Results

Cloning of BYC cDNA

The DNA sequence analysis conWrmed the deducedsequences of the cloned cDNAs, which possess openreading frames (ORFs) of 1560 bp in pET-32b/BYC, andof 1101 bp in pET-19b/BYC. These ORFs encode topolypeptides with predicted molecular masses of57,563 Da (rBYC-Trx) and 41,257 Da (rBYC), respec-tively.

Expression of recombinant proteins

rBYC-Trx and rBYC were detected by 12% SDS–PAGE and immunoblotting against rabbit anti-BYCserum. The apparent molecular masses of rBYC-Trxand rBYC were of approximately 56 and 40 kDa,respectively (Fig. 1). Both supernatant and pellet of celllysates were tested for the presence of recombinantproteins. As shown in Fig. 1, the majority of theexpressed recombinant proteins was present in inclu-sion bodies. The predicted molecular mass of the BYCamino acid sequence is 40.4 kDa, but the native BYC is

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a glycoprotein with apparent molecular mass of 54 kDa[16]. The major bands visualized in SDS–PAGE wereconWrmed as rBYC and rBYC-Trx proteins by Westernblotting with rabbit anti-BYC serum and showedapparent molecular masses of 40 and 56 kDa, respec-tively (Fig. 2).

Solubilization of inclusion bodies

The IBs were partially puriWed after washing withbuVer containing 1 M urea and 1% Triton X-100 (Fig. 1).Three denaturant agents were tested for solubilization ofrecombinant proteins. The alkalinized lysis buVer con-taining 0.3% N-lauroyl sarcosine was the most eYcientfor rBYC and rBYC-Trx IBs solubilization, as shown inFig. 3 and Table 1. The highest yield of solubilization

was achieved with N-lauroyl sarcosine, which was over90% for both rBYC-Trx and rBYC (Table 1). Guanidinehydrochloride was also eYcient and solubilized approxi-mately 78% for rBYC-Trx and 65% for rBYC (Table 1).The IBs were only partially solubilized in 8 M urea withmore than 80% of rBYC and rBYC-Trx proteins stillresiding in the precipitate after lysate centrifugation.As the recombinant protein-containing IBs were barelysolubilized in 8 M urea, further puriWcation was notcarried out.

PuriWcation of recombinant proteins

rBYC and rBYC-Trx solubilized with the N-lauroylsarcosine treatment were puriWed under denaturing con-ditions using Ni2+-Sepharose. This one-step puriWcationyielded highly puriWed rBYC and rBYC-Trx proteins(Fig. 4). The recombinant proteins were eluted with both50 and 100 mM imidazole, although they showed ahigher degree of purity with 100 mM (Figs. 4A and B).The Xowthrough was loaded a second time onto Ni2+-Sepharose to increase the yield of recombinant proteinrecovery. PuriWcation yields with N-lauroyl sarcosine aresummarized in Table 2. The IBs solubilized with 6 MGuHCl were also aYnity-puriWed by Ni2+-Sepharose.However, rBYC and rBYC-Trx re-aggregated and pre-cipitated during dialysis for GuHCl removal (data notshown).

Solubility of puriWed recombinant proteins

The puriWed protein was dialyzed for removal of theN-lauroyl sarcosine and gradual pH reduction. Aftereach dialysis step (pH 10, pH 9, and pH 8), an aliquotwas taken and centrifuged to separate soluble and insol-uble fractions. Analysis by SDS–PAGE indicated that

Fig. 1. SDS–PAGE (12% gel performed under reducing conditions) ofrecombinant BYC proteins in soluble and insoluble fractions of crudeextracts stained with Coomassie blue G-250. Samples were lysed withSDS loading buVer and boiled for 5 min. Lane 1, native BYC; lane 2,supernatant of pET-19b/BYC bacterial extract; lane 3, pellet of pET-19b/BYC bacterial extract; lane 4, pET-19b/BYC inclusion bodiesafter washing; lane 5, supernatant of pET-32b/BYC bacterial extract;lane 6, pellet of pET-32b/BYC bacterial extract; and lane 7, pET-32b/BYC inclusion bodies after washing step. MW marker £ 103.

Fig. 2. Western blot of recombinant BYC proteins in soluble andinsoluble fractions of crude extracts probed with rabbit BYC antise-rum (1:500). Lane 1, native BYC; lane 2, supernatant of pET-19b/BYCbacterial extract; lane 3, pellet of pET-19b/BYC bacterial extract; lane4, pET-19b/BYC inclusion bodies after washing; lane 5, supernatant ofpET-32b/BYC bacterial extract; lane 6, pellet of pET-32b/BYC bacte-rial extract; and lane 7, pET-32b/BYC inclusion bodies after washing.Alkaline phosphatase-conjugated anti-rabbit IgG (1:5000) and NBT/BCIP were used. MW marker £ 103.

Fig. 3. Solubilization of IBs with three denaturant agents. Sampleswere analyzed by SDS–PAGE and stained with Coomassie blue G-250. Samples were resuspended directly in SDS loading buVer andboiled for 5 min. Lane 1, rBYC 6 M GuHCl treated; lane 2, rBYC N-lauroyl sarcosine treated; lane 3, rBYC 8 M urea treated; lane 4,rBYC-Trx 6 M GuHCl treated; lane 5, rBYC-Trx N-lauroyl sarcosinetreated; and lane 6, rBYC-Trx 8 M urea treated. MW marker £ 103.

A.T. Leal et al. / Protein Expression and PuriWcation 45 (2006) 107–114 111

pH reduction was critical for solubility of recombinantproteins, especially rBYC. As shown in Fig. 5, rBYC wasalmost totally precipitated at pH 8.0 and partially pre-cipitated at pH 9.0. On the other hand, recombinant thi-oredoxin-fusion protein (rBYC-Trx) remained insolution after N-lauroyl sarcosine removal at the pH val-ues tested (Fig. 5). The solubility rates of both recombi-nant proteins are shown in Table 2.

Western blotting with anti-BYC antibodies

A Western blot with rabbit anti-BYC serum con-Wrmed the expression of the recombinant proteins andindicated its immune-reactivity (Fig. 2). Another indica-tion of antigenicity was the recognition by bovine and

mouse anti-native BYC sera. Sera of bovines immunizedwith four doses of native BYC [7] also recognized therBYC and rBYC-Trx, with a somewhat weaker intensitywhen compared to native BYC, as summarized in Fig. 6.Anti-native BYC mouse serum also recognized therecombinant proteins (Fig. 7). These results demonstratethat the immunogenicity potential was maintained in therBYC and rBYC-Trx.

Discussion

Our group has characterized three proteinases fromB. microplus eggs. Two aspartic proteinases named BYC[16] and THAP [24], and one cysteine proteinase [25].

Fig. 4. SDS–PAGE of N-lauroyl sarcosine solubilized protein fractions after aYnity puriWcation in Ni2+-Sepharose. Samples were resuspendeddirectly in SDS loading buVer and boiled for 5 min. (A) rBYC; (B) rBYC-Trx. Lanes 1, solubilized IBs before puriWcation; lanes 2, proteins in theXowthrough fraction; lanes 3, washing fractions with 30 mM imidazole; lanes 4, elution fraction with 50 mM imidazole; lanes 5, elution fraction with100 mM imidazole; lanes 6, elution fraction with 200 mM imidazole; and lanes 7, elution fraction with 500 mM imidazole. Gel stained with Coo-massie blue G-250.

Table 2PuriWcation and solubility rate of recombinant BYC proteins treated with N-lauroyl sarcosine

a From 1 L of induced culture.

Recombinant protein

Total protein in solubilized IBs (mg)a

PuriWed protein with His Trap column (mg)

Soluble protein (mg) Solubility rate pH 8.0 (%)

pH 9.0 pH 8.0 From IBs From puriWcation

rBYC 90.5 78.6 68.7 4.6 5.1 5.9rBYC-Trx 120.2 64.9 63.0 54.5 45.4 84.1

Table 1EYciency of solubilization of inclusion bodies containing the recombinant BYC proteins with three denaturant agents

a From 1 L of induced culture.

Recombinant protein Denaturant Total protein in washed IBs (mg)a

Total protein in solubilized IBsa

(mg) (%)

rBYC GuHCl 98 64.3 65.7N-Lauroyl sarcosine 98 90.5 92.4Urea 98 16.9 17.3

rBYC-Trx GuHCl 133 104.4 78.5N-Lauroyl sarcosine 133 120.2 90.4Urea 133 21.0 15.8

112 A.T. Leal et al. / Protein Expression and PuriWcation 45 (2006) 107–114

The most abundant protein (BYC) is the precursor of anaspartic proteinase that is synthesized in the fat bodyand gut of the tick, secreted to the hemolymph, and

stored in the oocyte [16]. This protease is activated byautoproteolysis under acidic conditions, a process thathas been described in other invertebrates where the par-ticipation of diVerent classes of acid proteases is alsoobserved in digestion of egg yolk [26–28]. Recently, itwas demonstrated (in vitro) that BYC is highly speciWcfor vitellin [17], reinforcing the hypothesis that it plays akey role in the degradation of yolk proteins, an essentialprocess for embryogenesis [16,17]. In previous reports,we demonstrated that cattle vaccination with nativeBYC induces an humoral response and functional anti-BYC antibodies were observed in the hemolymph ofticks feeding on vaccinated cattle [29], resulting in anoverall protection between 14 and 36% of bovines chal-lenged with B. microplus larvae. Consistent with thein vitro data, egg fertility and egg laying capacities werethe principal parameters aVected by immunization [7].Other authors have provided evidence that anti-tickimmunity induced by a cocktail vaccine is more eVectiveas compared to a single antigen vaccine [5,30]. Based onthese data we can suggest that BYC is an antigen withpotential to become part of a cocktail vaccine against B.microplus.

The production of recombinant proteins in heterolo-gous systems is a key process to vaccine development.High expression of foreign proteins in bacteria oftenresults in aggregation and accumulation [31]. This maybe due to a protein translation rate that may exceed thecell capacity to fold the newly synthesized proteins [32].Aspartic proteinases produced in E. coli are generallyexpressed in IBs [20]. Thioredoxin is a small monomerwhich facilitates the soluble expression and refolding ofrecombinant proteins [18,19]. To compare the expressionof rBYC and the role of a fusion protein in its solubility,BYC cDNA was cloned into two vectors, pET-32b andpET-19b, with and without Trx, respectively. Bothexpression vectors induced high levels of recombinantBYC expression in the E. coli system. However, rBYCaccumulated in inclusion bodies independently of vec-tors and expression conditions tested. One way to over-come the formation of inclusion bodies consists inreducing the protein translation rate by inducing expres-sion at a lower temperature [33]. We tested inductions at23 and 18 °C, but the lower temperatures had no eVecton the expression of soluble rBYC and rBYC-Trx (datanot shown).

Guanidine hydrochloride and urea are denaturingagents commonly used for solubilization of proteinsexpressed in IBs. However, rBYC and rBYC-Trxobtained in IBs were not eYciently solubilized with 8 Murea. GuHCl, a strong denaturant, was eYcient in rBYCand rBYC-Trx solubilization with yields of 65 and 78%,respectively. GuHCl-solubilized proteins were puriWedunder denaturant conditions in Ni2+-Sepharose chroma-tography (not shown). Both puriWed proteins wereunable to refold eYciently due to aggregation and

Fig. 5. Solubility of the puriWed proteins after dialysis. Samples weresubmitted to SDS–PAGE 12% and were stained with Coomassie blueG-250. Samples were resuspended directly in SDS loading buVer andboiled for 5 min. Lane 1, rBYC supernatant pH 8; lane 2, rBYC pelletpH 8; lane 3, rBYC-Trx supernatant pH 8;.lane 4, rBYC-Trx pellet pH8; lane 5, rBYC supernatant pH 9; lane 6, rBYC pellet pH 9; lane 7,rBYC-Trx supernatant pH 9; and lane 8, rBYC-Trx pellet pH 9.

Fig. 6. Western blot of puriWed BYC and rBYC probed with bovineserum anti-native BYC. Lane 1, rBYC-Trx; lane 2, rBYC; and lane 3,native BYC. Alkaline phosphatase-conjugated anti-bovine IgG(1:5000). MW marker £ 103.

Fig. 7. Western blot of puriWed BYC and rBYC probed with mouseserum anti-native BYC. Lane 1, rBYC-Trx; lane 2, rBYC; and lane 3,native BYC. Alkaline phosphatase-conjugated anti-mouse IgG(1:5000). MW marker £ 103.

A.T. Leal et al. / Protein Expression and PuriWcation 45 (2006) 107–114 113

precipitation of the proteins once the denaturant wasgradually removed by dialysis. Gradual concentrationreduction of denaturant agent and co-solvents asglycerol, reduced glutathione, oxidized glutathione, andL-arginine have been used to improve the refolding ofrecombinant proteins solubilized with GuHCl, but theresults are diVerent for each protein [31,34,35,37]. Wehave not tested these co-solvents in the refolding ofrBYC, since N-lauroyl sarcosine proved to be a betterdenaturing agent for rBYC and rBYC-Trx.

N-Lauroyl sarcosine, an anionic denaturant, reduceshydrophobicity due to its capacity to interact withhydrophobic residues, and can be removed by dialysiswhen its concentration lies below critical micelle concen-tration (CMC) [35,36]. N-Lauroyl sarcosine was highlyeYcient for rBYC and rBYC-Trx solubilization withyields higher than 90%, the best result among the dena-turants tested. The puriWcation with His Trap column(Amersham Biosciences) was performed under denatur-ant conditions, indicating that the N-lauroyl sarcosinedid not abolish adsorption of proteins to Ni2+ chargedresin. The elution proWle was not aVected by Trx andmost of the contents of both recombinant proteins wereeluted with 100 mM imidazole and SDS–PAGE analysesshowed few contaminating bands (Fig. 4) after a singlepuriWcation step. The puriWed proteins were dialyzed fordenaturant removal with gradual pH reduction. The Trxfusion partner increased the yield of soluble proteins(rBYC-Trx) after dialysis, which was also inXuenced bypH. In pH 9.0 solutions, the majority of the recombinantproteins was soluble. However, in pH 8.0 solutionsrBYC was almost totally precipitated and rBYC-Trxremained soluble. Therefore, Trx facilitated the recoveryof soluble protein after dialysis. The role of Trx andMBP in the increase of solubility during refolding ofother recombinant aspartic proteases was previouslydescribed [20]. The predicted pIs of rBYC (5.77) andrBYC-Trx (5.36) are similar. Thus, the higher solubilityof the rBYC-Trx compared to rBYC is remotely due todiVerences in the pIs of the two proteins. Sachdev andChirgwin [20] suggested that during refolding fusionproteins block side-reactions, hence avoiding the aggre-gation of the recombinant proteins.

The BYC amino acid sequence indicates a molecularmass of 40.4 kDa, whereas the native glycoprotein has amolecular mass of 54 kDa—a diVerence due to glycosyla-tion and phosphorylation [16]. Therefore, the possibleinvolvement of glycosylation in the antigenicity of rBYCneeds to be evaluated. In Western blot, the rBYC andrBYC-Trx were recognized by rabbit anti-BYC serum(Fig. 2). This, associated with Western blot assays withbovine and mouse anti-BYC sera, conWrmed the presenceof antigenicity for both recombinant forms (rBYC andrBYC-Trx). The recognition of rBYC by hyperimmunesera conWrms that the recombinant protein displays epi-topes that were immunogenic in the vaccination with

native BYC. This characteristic is of paramount impor-tance for a potential vaccine based on rBYC. However,investigation into the capacity of rBYC to induce protec-tive humoral response in vaccinated bovines is required toauthenticate its use as vaccine antigen. In this report, wedescribed a method for expression, solubilization, anddialysis of the aspartic proteinase, a potential candidate todesign a B. microplus vaccine. The presence of Trx asfusion protein in rBYC increased the solubility after dialy-sis of the recombinant protein. In addition, the aggrega-tion dependence on pH values of dialysis solutions wasdemonstrated. This method might be applicable to otherrecombinant proteins. In this work, we veriWed that ourrecombinant proteins showed similar immunologicalproperties as compared to native protein. Therefore, het-erologous expression of recombinant protein could pro-vide a valuable resource of BYC, which is a potentialcandidate as an antigen for multi-component vaccinesagainst B. microplus.

Acknowledgments

This work was supported by grants from CNPq,PRONEX, and FAPERGS.

Appendix A. Supplementary data

Supplementary data associated with this article canbe found, in the online version, at doi:10.1016/j.pep.2005.07.009.

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Apêndice D

Vaccine potential of a tick vitellin-degrading enzyme (VTDCE)

Adriana Seixas a,1, Alexandre T. Leal a,1, Maria Clara L. Nascimento-Silva b,Aoi Masuda a,c, Carlos Termignoni a,d, Itabajara da Silva Vaz Jr.a,e,*

a Centro de Biotecnologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Avenida Bento Goncalves,

9500 Predio 43421, Porto Alegre, RS 91501-970, Brazilb Instituto de Bioquımica Medica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ, Brazil

c Departamento de Biologia Molecular e Biotecnologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brazild Departamento de Bioquımica, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brazil

e Faculdade de Veterinaria, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brazil

Received 21 December 2007; received in revised form 7 April 2008; accepted 9 April 2008

Abstract

VTDCE (Vitelin-Degrading Cysteine Endopeptidase) is a peptidase with an active role in Rhipicephalus (Boophilus) microplus

embryogenesis. VTDCE is found in the tick’s eggs and was shown to be the most active protein in vitellin (VT) hydrolysis of the

three peptidases already characterized in R. microplus eggs (Boophilus Yolk pro-cathepsin (BYC), Tick Heme Binding Aspartic

Proteinase (THAP) and VTDCE). VTDCE activity was assessed in vitro using the natural substrate and a synthetic substrate (N-

Cbz-Phe-Arg-MCA). The activity was inhibited by anti-VTDCE antibodies. In the present study, it was shown that VTDCE acts

differently from BYC and THAP in VT hydrolysis and that the vaccination of bovines with VTDCE induces a partial protective

immune response against R. microplus infestation. Immunized bovines challenged with R. microplus larvae presented an overall

protection of 21%, and a reduction in the weight of fertile eggs of 17.6% was observed. The data obtained indicate that VTDCE

seems to be important for tick physiology, and that it induces partial protective immune response when inoculated in bovines. This

suggests that VTDCE can be useful to improve the protective capacity observed for other antigens.

# 2008 Elsevier B.V. All rights reserved.

Keywords: Rhipicephalus (Boophilus) microplus; Tick vaccine; VTDCE; Cysteine endopeptidase; Vitellin

1. Introduction

Recently, all Boophilus species including B. micro-

plus were reclassified under the genus Rhipicephalus

(Murrell and Barker, 2003). Consensus says that this

genus includes the major tick pests of cattle in tropical

and subtropical regions of the world (Peter et al., 2005).

Infestations with Rhipicephalus microplus cause eco-

nomical impact to cattle production by impairing

weight gain, reducing milk production, and by

transmitting pathogens that cause babesiosis (Babesia

bovis and Babesia bigemia) and anaplasmosis (Ana-

plasma marginale) (Willadsen, 2006a).

Current tick control methods are based on the use of

acaricides (Graef et al., 2004). However, the use of

acaricides is often accompanied by serious drawbacks,

including environmental, milk, and meat contamina-

tion, apart from the worrisome selection of acaricide-

resistant ticks (Willadsen, 2004; de la Fuente et al.,

www.elsevier.com/locate/vetimm

Available online at www.sciencedirect.com

Veterinary Immunology and Immunopathology 124 (2008) 332–340

* Corresponding author at: Centro de Biotecnologia, Universidade

Federal do Rio Grande do Sul, Avenida Bento Goncalves, 9500 Predio

43421, Porto Alegre, RS 91501-970, Brazil. Tel.: +55 51 3308 6078;

fax: +55 51 3308 7309.

E-mail address: ita@cbiot.ufrgs.br (I. da Silva Vaz Jr.).1 These authors contributed equally to this work.

0165-2427/$ – see front matter # 2008 Elsevier B.V. All rights reserved.

doi:10.1016/j.vetimm.2008.04.001

2007b). These drawbacks point to an urgent call for new

tick control methods in order to reduce or replace the

use of acaricides, especially in regions where extensive

tick resistance has occurred (Martins and Furlong,

2001; de la Fuente and Kocan, 2006). Among the new

approaches proposed to improve tick control are the use

of pheromone-impregnated decoys for attracting and

killing ticks, of biological control agents, and of

vaccines (Samish et al., 2004; Sonenshine et al., 2006;

Willadsen, 2006b). In this context, the development of

vaccines against tick infestations offers a cost-effective

and environmentally sound control strategy. In addition,

multiantigenic vaccines could be used to target a broad

range of species and prevent or reduce the transmission

of pathogens (Nuttall et al., 2006; Labuda et al., 2006;

de la Fuente et al., 2007a).

The feasibility of vaccination as a control method for

ectoparasites was established over a decade ago with the

commercialization of tick vaccine for cattle, based on

the R. microplus gut Bm86 antigen (Willadsen et al.,

1995; reviewed by de la Fuente et al., 2007b). Since

then, research has continued in search of new antigens,

which could increase the efficacy of tick vaccines. In

recent years, a broad range of molecules of physiolo-

gical importance, including peptidases and their

inhibitors, are becoming gradually available, and such

molecules are now considered putative targets for an

anti-tick vaccine (reviewed by Willadsen, 2006a). Some

of these molecules confer partial protection against tick

infestations, showing that anti-tick vaccine antigens are

not restricted to midgut or salivary glands proteins (da

Silva Vaz et al., 1998; Tellam et al., 2002; Andreotti

et al., 2002; Imamura et al., 2005).

In this context, we have been studying several

physiologic processes in the cattle tick R. microplus in

order to find molecules to be used as targets for an anti-

tick vaccine. One of these processes is tick embryogen-

esis. Three enzymes involved in vitellin digestion in R.

microplus eggs were characterized. Two aspartic-

endopeptidases, the Boophilus Yolk pro-cathepsin

(BYC) and the Tick Heme Binding Aspartic Proteinase

(THAP) (Logullo et al., 1998; Sorgine et al., 2000), and

a Vitelin-Degrading Cysteine Endopeptidase (VTDCE;

Seixas et al., 2003) have been tested as antigen to

immunize bovines, conferring partial protection against

R. microplus (da Silva Vaz et al., 1998; Leal et al.,

2006).

VTDCE is a cysteine endopeptidase naturally

associated to its putative physiological substrate VT.

This enzyme was previously purified from R. microplus

eggs (Seixas et al., 2003) and it is also present in

maternal tissues, including ovary and gut (Seixas et al.,

submitted for publication). In the present study, we

compare the in vitro activity of VTDCE, BYC and

THAP upon the VT different-length peptides (Canal

et al., 1995) and evaluate the use of VTDCE as antigen

for bovine immunization against the cattle tick R.

microplus.

2. Materials and methods

2.1. Antigen preparation

VTDCE was purified from R. microplus eggs

according to the protocol established by Seixas et al.

(2003) with modifications. Eggs from the 1st to the 10th

day after oviposition were homogenized in a Potter-

Elvehjem tissue grinder with 10 mM phosphate buffer,

pH 7.2 (1 g of eggs/ml). The homogenate was

centrifuged (16,000 � g for 5 min) and the supernatant

was filtered through a sequence of filters (AP glass fiber

filter, 0.45 mm and 0.22 mm). The sample was then

applied onto a 5 � 5 ml Hitrap Q HP (GE Healthcare,

Uppsala, Sweden) column previously equilibrated with

10 mM sodium phosphate buffer, pH 7.2 and eluted

with a 0–0.8 M NaCl gradient in the same buffer system

at room temperature with a flow rate of 0.5 ml/min.

Activity containing fractions (6–7 ml) were pooled and

submitted to autolysis. In this step, the pooled fractions

were acidified to pH 4.0 with 1.0 M citric acid and

incubated at 37 8C for approximately 3 h, after which

the sample was centrifuged at 3000 � g for 15 min.

The supernatant was concentrated in a Centricon-10

and applied onto a 1.0 cm � 30 cm Superdex 75 HR

(GE Healthcare, Uppsala, Sweden) column equilibrated

with 10 mM acetate buffer, pH 4.0, using a Fast-

Purification-Liquid Chromatography system (FPLC) at

room temperature with a flow rate of 0.5 ml/min. The

pool of active fractions was then applied onto a Mono Q

HR 5/5 column (0.5 cm � 5.0 cm), previously equili-

brated with acetate buffer 10 mM, pH 4.0. The enzyme

was eluted with a 0–0.8 M NaCl gradient in the same

buffer.

2.2. Polyclonal antibodies against VTDCE

A rabbit was inoculated subcutaneously with 100 mg

of purified VTDCE emulsified in Freund’s complete

adjuvant followed by three boosters of VTDCE

(100 mg) in Freund’s incomplete adjuvant at 15-day

intervals. The VTDCE used to produce antibodies was

previously tested with a monoclonal anti-VT antibody

to check any VT contamination in the protein

preparation (anti-VT was kindly supplied by Sandra

A. Seixas et al. / Veterinary Immunology and Immunopathology 124 (2008) 332–340 333

E. Farias, Centro de Biotecnologia do Estado do Rio

Grande do Sul, Brazil).

2.3. Enzyme activity and vitellin hydrolysis

Enzyme activity present in chromatographic fractions

was monitored with N-carboxibenzoyl-Phe-Arg-7-

amido-4-methylcoumarin, 14 mM (N-Cbz-Phe-Arg-

MCA (Sigma–Aldrich, St. Louis, USA) as substrate in

50 mM sodium citrate/sodium phosphate buffer, 10 mM

ditiotreitol (DTT; Sigma–Aldrich, St. Louis, USA) in a

microplate fluorimeter (M2e, Molecular Devices Cor-

poration, Sunnyvale, USA) as described by Seixas et al.

(2003). Anti-serum effect was tested using the same

assay described above, except for the fact that the enzyme

was pre-incubated with polyclonal anti-VTDCE or pre-

immune serum (diluted 1:10) for 10 min before

the addition of the substrate. The inhibition values

were calculated by the initial velocity of the enzyme

reaction, deducting the effect caused by pre-immune

serum. The same reaction without serum was developed

as a control.

Vitellin hydrolysis was tested incubating vitellin

purified from 1-day-old egg (60 mg) and the R.

microplus enzymes VTDCE (1 mg), BYC (10 mg)

and THAP (10 mg) in acetate buffer pH 3.5, 1 h at

37 8C. DTT (10 mM) was added to the VTDCE pool

reaction, since this enzyme is a cysteine endopeptidase

and requires reducing conditions for activity. BYC and

THAP are aspartic-endopeptidases, so their enzymatic

activity does not depend on reducing conditions. The

hydrolysis products were analyzed by SDS-PAGE 10%

stained with comassie brilliant blue G. VT and THAP

were purified according to Sorgine et al. (2000) and

BYC according to Logullo et al. (1998).

2.4. SDS-PAGE and Western blot

Samples were electrophoresed on sodium dodecyl

sulfate-polyacrylamide gels (SDS-PAGE) under non-

denaturing conditions (Laemmli, 1970). Electrophor-

esis was performed using a Bio-Rad Mini-Protean Cell

II unit. Resolving and stacking gels were 10 or 14 and

5% polyacrylamide, respectively. In Western blot,

samples were separated by 14% SDS-PAGE (Laemmli,

1970) and transferred to a nitrocellulose membrane

(0.45 mm, Schleicher & Schuell, Germany) at 0.8 mA/

cm2 for 1 h in a semi-dry system (GE-Healthcare,

Uppsala, Sweden) using 25 mM Tris, 192 mM ami-

noacetic acid, 30% methanol, pH 8.4. Nitrocellulose

sheets were blocked with blotto (5% non-fat cow dry

milk in PBS [sodium phosphate (10 mM), NaCl

(150 mM), pH 7.2] and probed with rabbit polyclonal

antibodies against VTDCE, vaccinated and control

bovine sera diluted in blotto. After 3 washes, anti-rabbit

or anti-bovine IgG alkaline phosphatase conjugates

were used as secondary antibody. Development was

performed with nitro blue tetrazolium/5-bromo-4-

chloro-3-indolyl-phosphate p-toluidine salt (NBT/

BCIP; USB Corporation, OH, USA) as previously

described (Rosa de Lima et al., 2002).

2.5. Bovine immunization and challenge infestation

Hereford breed females (14-month-old) purchased

from a tick-free area were used. The bovines were

individually housed in tick-proof pens on slatted floors

and fed twice a day with hay and concentrate, with

water available ad libitum. The animals were divided

into two groups: control group (bovines 1, 2, 3, 4) and

treatment group (bovines 5, 6, 7, 8). The animals

received 5 subcutaneous inoculations in the neck at

10-day intervals. After the challenge experiment,

animals in the vaccinated group received five boosters

with the orginal vaccine. Treatment group animals

received an emulsion of 1 ml VTDCE (100 mg) plus

1 ml adjuvant (Marcol 52 and Montanide 888). The

control group received emulsion composed of 1 ml

PBS plus 1 ml of adjuvant per dose. Ten days after the

last inoculation, bovines were challenged with 20,000

10-day-old Porto Alegre strain larvae of R. microplus,

Babesia spp. and Anaplasma spp. free. R. microplus

eggs (1 g) were packed into 20 ml-syringes closed

with a cotton plug and kept at colony conditions

(27 8C, 80% humidity) upon larvae hatching. At the

challenge day the syringes were fixed, one per bovine,

on the animal dorsum and the plug was removed to

allow larvae to disperse.

2.6. Serological analysis

Sera samples were collected before the first

inoculation, and 10 days after each subsequent

inoculation before and after the infestation period.

The humoral response was verified by ELISA and

Western blot using purified VTDCE as antigen. For

Western blot, blood samples were collected 10 days

after the fifth immunization. For ELISA analysis,

microtitration plates were coated with 0.1 mg of

VTDCE in 20 mM carbonate buffer (pH 9.6) by

incubation at 4 8C overnight, washed three times and

incubated for 1 h at 37 8C with blotto. The sera diluted

1:100 were considered positive when the reaction of

post-inoculation samples showed a difference in optical

A. Seixas et al. / Veterinary Immunology and Immunopathology 124 (2008) 332–340334

density (O.D.) that was at least twice as high the O.D.

value obtained with pre-inoculation serum (control).

Then rabbit anti-IgG–peroxidase conjugate in 5% blotto

was incubated for 1 h at 37 8C. O-phenylenediamine

(OPD; Sigma–Aldrich, St. Louis, USA) was used as

chromogen and O.D. was determined at 492 nm

(Harlow and Lane, 1988).

2.7. Ticks analysis

Ticks that detached spontaneously from the host

were collected once a day, from the 17th post-challenge

day until the end of the infestation period. Collected

females were classified as fully or partially engorged,

counted and weighed. Up to 5 g of fully engorged

females were incubated at 27 8C, 80% humidity, for egg

laying. Eggs were analyzed, weighed and incubated

again for other 20 days until larvae hatched. Lastly,

larvae were separated and weighed. Overall protection

was calculated based on the number of fully engorged

ticks, egg laying capacity and egg fertility using the

formula (Willadsen et al., 1996; Canales et al., 1997; da

Silva Vaz et al., 1998; Leal et al., 2006):

Overall protection ratio

¼ 100� ½1� ðNFE�WE �WLÞ�

where NFE—number of fully engorged ticks from

VTDCE vaccinated bovines divided by number of fully

engorged ticks from control bovines, WE—egg laying

capacity of ticks from VTDCE vaccinated bovines

divided by egg laying capacity of ticks from control

bovines, WL—egg fertility of ticks from VTDCE vac-

cinated bovines divided by egg fertility of ticks from

control bovines.

The statistical significance of the results shown in

Table 1 was tested using t-test and ANOVA, as

previously described (da Silva Vaz et al., 1998).

3. Results

3.1. VT hydrolysis by the R. microplus egg

peptidases

SDS-PAGE analysis showed that after 1-h incubation

at 37 8C in acidic pH, VTDCE was able to completely

hydrolyze all VT-related polypeptides. No molecular

weight fragments in the range of 30–130 kDa were

observed (Fig. 1, line 3). The aspartic-endopeptidase

THAP also exerted high activity upon VT at these

conditions. However, the VT hydrolysis by THAP was

only partial, not as complete as the hydrolysis by

VTDCE (Fig. 1, line 5). After incubation, under the

same conditions with BYC, another egg aspartic-

A. Seixas et al. / Veterinary Immunology and Immunopathology 124 (2008) 332–340 335

Table 1

Biological parameters of detached R. microplus from cattle immunized with VTDCE and control group

Group Fully engnorgedb Index

Bovine Number Weight (g) Fertile eggs (g) Egg laying capacityc Egg fertilityd

Control 1 2415 700 6.81 0.415 0.330

2 1915 494 5.64 0.399 0.320

3 1198 309 4.36 0.433 0.286

4 3245 916 6.89 0.402 0.309

Total 8773 2419 23.70 1.650 1.245

Mean 2193 605 5.92 0.412 0.311

S.D. 861 262 1.19 0.015 0.019

VTDCE 5 2019 557 0.40 0.400 0.294

6 1584 414 4.98 0.407 0.357

7 1303 326 4.43 0.404 0.276

8 2586 654 4.61 0.388 0.258

Total 7492 1952 19.53 1.599 1.186

Mean 1873 488 4.88 0.400 0.296

S.D. 559 146 0.47 0.008 0.043

Difference (%)a 14.60 19.32 17.60 3.09 4.74

a Difference (%) = 100 � [1 � (total value of vaccinated group/control group)].b Collected during 14 days in the course of the infestation period.c The weight of eggs laid by samples of fully engorged ticks, collected daily during 14 days in the course of the infestation period, was used to

calculate the proportion of the weight of ticks that was converted into eggs.d Proportion between weight of fertile eggs and weight of eggs laid.

endopeptidase, VT polypeptides were still intact (Fig. 1,

line 4). Moreover, it is important to note that, comparing

with the other two peptidases, VTDCE activity is even

higher than the visual observation suggests (Fig. 1),

because the molar concentration of VTDCE used was

approximately four times lower than that of BYC and

THAP, in this experiment.

3.2. Anti-VTDCE antibodies interfere in enzyme

activity

Immunization of the rabbit with VTDCE induced

specific antibody with an ELISA titer of 16,000. This

immune serum was used for the enzyme inactivation

experiment. The enzyme was pre-incubated with

polyclonal serum anti-VTDCE (diluted 1:10) for

10 min before the addition of the substrate (N-cbz-

Phe-Arg-MCA). Enzyme kinetics was monitored for

30 min and a dose-dependent inactivation was observed

when compared to the control with no serum (Fig. 2,

closed cross). In comparison to the pre-immune serum,

the specific reduction in the enzyme activity was

25 � 3.8% with 1 ml of serum, 61 � 5.0% with 3 ml and

71 � 1.6% with 4 ml of serum. Some unspecific

inactivation was observed when pre-immune serum

was used as a control, though this effect was not as

evident as when anti-VTDCE was used (Fig. 2). This

result shows that antibodies against VTDCE were able

to block the enzyme catalytic activity.

3.3. Homogeneity of VTDCE preparation and

reaction with rabbit polyclonal serum

The VTDCE preparation used for cattle immuniza-

tion was analyzed by SDS-PAGE (14%), and shown to

be homogeneous (Fig. 3). This preparation showed a 17-

kDa protein in SDS-PAGE that corresponds to the lower

molecular weight protein previously characterized by

Seixas et al. (2003) , which can be the result of a distinct

processing during autolysis. However, enzyme prepara-

tion has the same catalytic properties previously

characterized (data not shown). VTDCE was found to

be immunogenic when inoculated in a rabbit, and only

one protein was observed in Western blot (Fig. 3).

3.4. Serological analyses by ELISA and Western

blot

The kinetics of the host humoral response during

immunization and after the challenge with R. microplus

larvae was monitored by ELISA (Fig. 4). Serum

antibody reactivity to VTDCE increased gradually

A. Seixas et al. / Veterinary Immunology and Immunopathology 124 (2008) 332–340336

Fig. 1. Vitellin hydrolysis by the three known R. microplus egg

enzymes with VT digestion activity VTDCE, BYC and THAP. VT

(60 mg) was incubated with VTDCE (1 mg), BYC (10 mg), THAP

(10 mg) in acetate buffer pH 4.0, 1 h at 37 8C (see Section 2). The

hydrolysis products were analyzed by SDS-PAGE 10% stained with

Coomassie brilliant blue G. Molecular weight markers were run at

lane 1 (kDa); lane 2 shows VT (60 mg) used as a control.

Fig. 2. Effect of anti-VTDCE on the VTDCE activity. Rabbit poly-

clonal serum anti-VTDCE (opened) or rabbit pre-immune serum

(closed) diluted 1:10 were incubated with VTDCE (10 min) in

100 ml sodium citrate/sodium phosphate buffer 50 mM, 10 mM

DTT, before adding the substrate N-cbz-Phe-Arg-MCA (1.4 mM).

Enzyme kinetics was monitored per 30 min, and a dose-dependent

inactivation was observed by comparison to the control without serum

(closed cross). Doses of serum are identified by symbols: squares

(1 ml), triangles (3 ml) and circles (4 ml). Enzymatic activity is shown

in relative fluorescence units (R.F.U.).

during immunizations (Fig. 4). A small drop in anti-

VTDCE antibody concentration was observed 50 days

after challenge, and after additional boosters the

immune response increased, suggesting the develop-

ment of immunological memory (Fig. 4). Western blot

analyses confirmed that specific VTDCE IgG was

elicited in vaccinated bovines and no response was

detected in control bovines (data not shown).

The antibody titer of the vaccinated bovine serum on

the challenge day was determined as the dilution that

achieved an O.D. value that was twice that of the pre-

immune serum at the same dilution. Serum samples

were diluted (1:200–1:3200) and tested by ELISA. IgG

titers were 1:200 (bovine 7), 1:400 (bovine 5), 1:800

(bovine 8) and 1:1600 (bovine 6), showing individual

variation among the animals. Bovine 7 had the lowest

titer, since the pre-immune serum of this bovine

presented high unspecific absorbance in ELISA.

3.5. Challenge and changes in tick biological

parameters

Ticks that naturally detached in the period between

the 17th and 30th day post-infestation were collected

daily and some biological parameters were analyzed.

The means of the results for each parameter and the

differences between groups are presented in Table 1.

The fully engorged females showing no macroscopic

lesions were counted and weighed, and a sample of up

to 5 g per day was incubated for egg laying and fertility

analysis. The VTDCE vaccinated bovines presented a

reduction of 14.6% and 19.32% in number and weight

of engorged ticks respectively. These differences were

not statistically significant due to variations in the

responses of different animals. Tick egg laying capacity

and egg fertility were respectively reduced by 3.09%

and 4.74% in vaccinated animals. Also, the difference in

weight of fertile eggs was not statistically significant

( p < 0.07; Table 1). Despite this, the biological

performance of ticks from bovines vaccinated with

VTDCE tended to be lower than that of ticks from

control animals. The overall efficacy of vaccine

formulations against R. microplus considering the

effect on tick infestations and oviposition was 21%.

4. Discussion

Different proteinases that are able to digest VT have

been identified in R. microplus eggs. Our research group

characterized two aspartic-endopeptidases, named

BYC (Logullo et al., 1998) and THAP (Sorgine

et al., 2000), and one cysteine endopeptidase (VTDCE)

(Seixas et al., 2003) involved in VT hydrolysis during

tick embryogenesis. More recently, another cysteine

endopeptidase, RmLCE, was partially isolated and

characterized from R. microplus larvae (Estrela et al.,

2007). Also, the larvae cysteine endopeptidase seems to

play an active role in VT digestion, by providing amino

acids and energy for larval survival until a host is

encountered and feeding starts (Estrela et al., 2007).

Among R. microplus egg protein-digesting enzymes,

VTDCE seems to be the most active enzyme upon VT

(Fig. 1), reinforcing the hypothesis that VTDCE plays a

key role in yolk protein degradation, an essential

process for embryogenesis. In addition, different from

the aspartic-endopeptidases, VTDCE is associated to its

putative physiological substrate (VT). Dissociation was

A. Seixas et al. / Veterinary Immunology and Immunopathology 124 (2008) 332–340 337

Fig. 3. SDS-PAGE (14%) of the purified VTDCE (30 mg) used for

bovine immunization and Western blot using rabbit polyclonal serum

anti-VTDCE (1:300). Molecular weight markers are in kDa.

Fig. 4. Dynamics of the humoral immune response of bovines

immunized with R. microplus VTDCE determined by ELISA (sera

diluted 1:100). Arrows indicate the day of immunization, and the

triangle shows the day of infestation.

only achieved by an autolysis reaction in acidic pH,

which was included in the purification protocol.

Autolysis occurs in pH 4.0, and after that the enzyme

must be maintained in acidic pH, otherwise it

inactivates. Also, after this step VTDCE is susceptible

to additional autolysis, which may cause variation in the

protein size in the final preparation. It is well known

that, for cathepsin L-like enzymes, autolysis is

frequently observed in the final steps of purification

(Cristofoletti et al., 2005). This may explain why the

VTDCE preparation used here shows a different mass in

comparison to values previously found (Seixas et al.,

2003).

VTDCE activity was inhibited in a dose-dependent

manner by a polyclonal anti-VTDCE serum, in vitro.

This is of major importance, if one considers that bovine

functional antibodies (anti-tick proteins) were detected

in the hemolymph of ticks fed in animals immunized

with a R. microplus egg protein (BYC) (da Silva Vaz

et al., 1996). Moreover, this inhibition was observed in

pH 4.0, showing that the antibodies are viable even

under acidic conditions. Unspecific inhibition was

observed in control assays using pre-immune serum

(Fig. 2). Nevertheless, albumin is a major protein in the

serum, and it is known that this protein, as well as

others, like hemoglobin and gelatin, is a substrate for

VTDCE (Seixas et al., 2003). In this experiment, where

the enzyme activity was measured using synthetic

substrate, it is possible that albumin caused a substrate-

competitive inhibition that resulted in enzymatic

activity reduction. Obviously, this is observed even in

assays with pre-immune serum. As both sera came from

the same animal, it does not impair experiment results

since the specific VTDCE inhibition by anti-VTDCE

antibodies was analyzed in the light of the difference

between the inhibition caused by the immune and pre-

immune serum. A control to check the enzyme

preparation was done without serum.

In turn, BYC is very abundant in eggs and expresses

preference for VT over other proteic substrates (Abreu

et al., 2004). However, greater amounts of enzyme

(milligrams) and long periods of incubation are

necessary to detect in vitro VT hydrolysis by BYC

(Abreu et al., 2004). Recently, the native and

recombinant BYC activity upon synthetic and natural

substrates was evaluated, and data clearly show that

BYC digestion rate is in fact slow (Nascimento-Silva

et al., 2008). As it is known that enzyme activity is

strongly decreased as a consequence of modifications in

the active site, the same authors show that BYC action

mechanism is affected by an important mutation, in

comparison with typical aspartic-endopeptidases.

These new data could explain our results that show

that VTDCE is more active than BYC in VT hydrolysis

(Fig. 1).

THAP, the other R. microplus egg aspartic-endo-

peptidase, has its activity upon VT regulated in a

specific manner. THAP uses heme bound to VT as a

docking site to increase specificity and regulate VT

degradation according to heme availability (Sorgine

et al., 2000). These differences among VTDCE, BYC

and THAP may be related to the control of VT

degradation during R. microplus embryogenesis.

As these enzymes are involved in a such very

important physiological process as reproduction, the

study of their potential as targets in an anti-tick vaccine

is impelling. With this objective, BYC was tested in

native (da Silva Vaz et al., 1998) and recombinant (Leal

et al., 2006) forms as immunogen for bovine vaccina-

tion. Cattle immunized with BYC showed a partially

protective immune response (between 14% and 36% for

native and 25% for recombinant protein) against R.

microplus infestations. This protection was mostly due

to an increase in the number of sterile eggs (da Silva Vaz

et al., 1998; Leal et al., 2006). These data support BYC

as a candidate to a multiantigenic anti-tick vaccine.

The use of VTDCE as an antigen for bovine

immunization was supported by the analysis of this

enzyme’s putative role in tick physiology (Seixas et al.,

2003). Initially, its ability to induce a specific antibody

was checked in rabbits. So, in this study, the

characterization of bovine antibody responses provided

by VTDCE immunization and the determination of the

protection against experimental tick infestation was

investigated. ELISA and Western blot analysis reveal

that VTDCE elicited specific antibodies in vaccinated

bovines, while sera from control animals remained

negative during the experimental period. All experi-

mental bovines responded to immunization with

VTDCE and presented titers between 200 (bovine 7)

and 1600 (bovine 6). Individual variation in antibody

titers observed is usual in vaccination of outbred

animals. Immunization of 98 bovines with Bm86

produced variable antibody titers and 6% of the animals

failed to respond to the vaccination, presenting very low

antibody titers (Rodriguez et al., 1995).

Titers obtained for VTDCE were lower than those for

bovines vaccinated with BYC, which presented titers

between 1000 and 6400 (da Silva Vaz et al., 1998; Leal

et al., 2006). The lowest titer was obtained for bovine 7

(200). Different from the others, this bovine showed an

unspecific reactivity, which was already detected in the

pre-immune serum. Moreover, a localized nonspecific

granulomatous reaction was observed at the sites of

A. Seixas et al. / Veterinary Immunology and Immunopathology 124 (2008) 332–340338

inoculation. We do not know whether these findings are

actually able to interfere with the development of

specific immune responses against VTDCE.

In this study, ticks fed on cattle immunized with

VTDCE display changes in biological parameters,

resulting in an overall protection of 21% as compared

with the control group. Considering individual biolo-

gical parameters, vaccinated bovines presented a

reduction of 14.6% and 19.32% in number and weight

of engorged ticks, respectively, and a reduction in the

weight of fertile eggs of 17.6% (Table 1). Also, egg

laying capacity and egg fertility were reduced (3.09%

and 4.74%, respectively). Biological parameters like

these are quite difficult to analyze, because outbred

animals show a strong degree of individual variation.

Apart from this, it is not feasible to perform experiments

with a large number of bovines per group, as observed in

other vaccination and tick challenge experiments

(Riding et al., 1994; Andreotti, 2007; Biesenkamp-

Uhe et al., 2007; Piercy et al., 2007).

Physiological and biochemical studies showed that

VTDCE may play a role in tick survival by offering

nutrients during embryogenesis (Seixas et al., 2003). It

is likely that anti-VTDCE immune response can be

modulated to improve its protective action by altering

the adjuvant or inoculation protocols as dose and

inoculum site. Patarroyo et al. (2002) achieved a

protection of 81% by vaccinating cattle with synthetic

peptides derived from the R. microplus gut protein

Bm86 using twenty times more immunogen (2.0 mg). A

large quantity of VTDCE will be required to carry out

experimental immunizations with higher numbers of

animals; therefore, the production of the recombinant

protein is impelling. Recombinant protein production is

an important step, since the purification protocol of

VTDCE and of other proteins used in tick vaccination

experiments is complex and unpractical for the high-

scale production of an antigen to be used in a

commercial vaccine (Rand et al., 1989; Riding et al.,

1994; Andreotti et al., 2002). Accordingly, we already

cloned and determined the nucleotide sequence of the

VTDCE gene and have initiated the overexpression of

VTDCE in heterologous expression system.

The overall protection afforded by VTDCE is not

enough to allow its use as a sole vaccinal antigen.

Indeed, all studies conducted so far have shown that

there is not one single protein that achieves the

protection level necessary for an efficient and practical

vaccine (de la Fuente and Kocan, 2006). Therefore, a

useful vaccine must be multiantigenic and the VTDCE

protection level could be complementary to the

protective action of other antigens.

Acknowledgments

This work was supported by grants from CNPq,

FINEP, PRONEX, CAPES and FAPERGS.

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