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FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA
DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA
Pós-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL
ESTUDO DA OBTENÇÃO DE XILITOL EM HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA
COM CÉLULAS IMOBILIZADAS EM GEL DE ALGINATO DE CÁLCIO
Este exemplar corresponde à
versão final da Tese de Doutorado
aprovada pela banca examinadora
Dr. Silvio Silvério da Silva
Presidente da Banca Examinadora
Lorena - S.P. - Brasil
. 2004
A os- meccs- p~ Walt-er 8' Eligabeth{
A mú1Jia- noiY~ Lar~·
A o- mec« irmão; Luca4-:
AGRADECIMENTOS
Este trabalho é resultado de uma jornada que se iniciou em 1994, quando tive a
oportunidade de me envolver em atividades laboratoriais extraclasse no 1 º ano de graduação
em Farmácia. Ao longo destes anos, encontrei muitas pessoas que me ajudaram a chegar até
este ponto, pelo que agradeço a Deus. Em hipótese alguma, poderia deixar de citar os nomes
da Prof'. Miriam A P. Vilela (UFJF), do Prof Silvio S. Silva (Faenquil) e do Prof Ranil
Wickramasinghe (CSU), que confiaram em mim e me deram a oportunidade de trabalhar em
seus laboratórios. Igualmente, também não poderia deixar de citar os nomes do Prof Ismael
M. Mancilha (Faenquil), do Prof Michele Vitolo (USP), do Prof Attilio Converti (UNIGE),
do Prof Arnaldo M. R. Prata (Debiq), do Prof João B. A Silva (Faenquil), do Prof Marco A
M. Furtado (UFJF), da Prof'. Maria G. A Felipe (Faenquil), da Prof'. Inês C. Roberto
(Faenquil), do Dr. James D. McMillan (NREL) e do Dr. Binbing Han (CSU), que
participaram ativamente dos meus trabalhos de pesquisa, oferecendo sugestões e
complementando a formação adquirida com os professores em sala de aula. A estes, também
agradeço de coração.
À UFJF, à CAPES e à F APESP, agradeço pelas bolsas de iniciação científica,
mestrado e doutorado, respectivamente.
Aos amigos de curso e de laboratório, agradeço pela convivência, pelo estímulo e pela
ajuda nos inúmeros momentos dificeis. Em especial, gostaria de lembrar o nome de André
Luís de Almeida (in memoriam).
BIOGRAFIA
Walter de Carvalho, filho de Walter José de Carvalho e de Elizabeth Aparecida Lima
Carvalho, nasceu em Ribeirão Vermelho, Minas Gerais, no dia 23 de setembro de 1973.
Em fevereiro de 1994, ingressou no curso de Farmácia pela Faculdade de Farmácia e
Bioquímica da Universidade Federal de Juiz de Fora (Juiz de Fora, M.G.), onde obteve o
título de Farmacêutico em dezembro de 1997.
Em fevereiro de 1998, ingressou no curso de Mestrado em Biotecnologia Industrial
pela Faculdade de Engenharia Química de Lorena (Lorena, S.P.), onde obteve o título de
Mestre em Biotecnologia Industrial em abril de 2000.
Em dezembro de 2000, ingressou no curso de Doutorado em Biotecnologia Industrial
pela Faculdade de Engenharia Química de Lorena (Lorena, S.P.).
\
RESUMO
Estudo da obtenção de xilitol em hidrolisado de bagaço de cana com células imobilizadas em gel de alginato de cálcio. Walter de Carvalho. Tese de Doutorado. Programa de Pós- Graduação em Biotecnologia Industrial. Departamento de Biotecnologia. Faculdade de Engenharia Química de Lorena. Orientador: Dr. Silvio Silvério da Silva (FAENQUIL, C.P. 116, 12.600-970, Lorena, S.P., Brasil). Banca Examinadora: Dr. Alfredo Eduardo Maiorano, Dr. Ismael Maciel de Mancilha, Dr. José Geraldo da Cruz Pradella, Dr. Maria das Graças de Almeida Felipe. Dezembro de 2004.
O presente trabalho buscou definir condições adequadas para a obtenção de xilitol em
hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana utilizando a levedura Candida guilliermondii
FTI 20037 imobilizada em alginato de cálcio. Inicialmente, a produção de xilitol foi avaliada
em três sistemas fermentativos diferentes: frascos Erlenmeyer - 125 mL (EF), reator de
mistura - 2.4 L (STR) e reator de mistura tipo cesta - 2.4 L (BSTR). Enquanto os sistemas EF
e STR resultaram em produções equivalentes de xilitol, a fermentação no sistema BSTR foi
prejudicada por limitações na transferência de massa. Em etapa seguinte, as metodologias de
planejamento de experimentos e de superficie de resposta foram utilizadas para determinar
condições adequadas de fermentação no sistema STR. Modelos empíricos foram ajustados aos
dados experimentais, considerando a produtividade e o rendimento em xilitol como variáveis
dependentes. A partir destes modelos, condições adequadas para a produção de xilitol no
sistema STR foram definidas, a saber: fator de concentração do hidrolisado (5.0), vazão de ar
(1.30 L/min), agitação (300 rpm), concentração inicial de células (1.4 g/L), pH inicial do meio
de fermentação (6.0). Utilizando estas condições, obteve-se uma produção de xilitol igual a
4 7. 5 g/L após 120 h de fermentação, resultando em produtividade e rendimento iguais a
0.40 g/L h e 0.81 g/g, respectivamente. As células imobilizadas puderam ser reutilizadas
durante cinco bateladas repetidas de fermentação sem prejuízos na produção de xilitol. Em
valores médios ( coeficientes de variação inferiores a 1 O % ), foram obtidos 51.6 g/L de xilitol
em cada uma das bateladas repetidas de fermentação, com produtividade e rendimento iguais
a 0.43 g/L h e 0.71 g/g, respectivamente. Por outro lado, foi observada uma redução de
31.6 % no volume médio das esferas de alginato de cálcio ao final do 5º ciclo de fermentação.
A suplementação do hidrolisado de bagaço de cana com sulfato de amônio e extrato de farelo
de arroz maximizou a produção de xilitol pela levedura. Esta suplementação se mostrou
benéfica ao longo de todas as bateladas repetidas.
ABSTRACT
Study of xylitol obtainment from sugarcane bagasse hydrolysate by Ca-alginate entrapped cells. Walter de Carvalho. Doctorate Thesis. Post-Graduation Program in Industrial Biotechnology. Department of Biotechnology. Chemical Engineering College of Lorena. Supervisor: Dr. Sílvio Silvério da Silva (FAENQUIL, C.P. 116, 12.600-970, Lorena, S.P., Brazil). Examining Board: Dr. Alfredo Eduardo Maiorano, Dr. Ismael Maciel de Mancilha, Dr. José Geraldo da Cruz Pradella, Dr. Maria das Graças de Almeida Felipe. December, 2004.
This study aimed to define adequate conditions for xylitol obtainment frorn sugarcane bagasse
hemicellulosic hydrolysate using the yeast Candida guilliermondii FTI 20037 entrapped in
Ca-alginate beads. Initially, the xylitol production was evaluated in three different
fermentation systems: 125-mL Erlenmeyer flasks (EF), 2.4-L stirred tank reactor (STR) and
2.4-L basket-type stirred tank reactor (BSTR). While the EF and the STR systems resulted in
similar xylitol productions, the fermentation in the BSTR system was affected by rnass-
transfer limitations. ln a further step, the experimental design and the response surface
methodologies were used in arder to determine adequate conditions for cultivating the
entrapped cells in the STR system. Empírica! models were fitted to the experimental data,
considering the xylitol productivity and yield as dependent variables. From these models,
adequate conditions for xylitol production in the STR system were defined: hydrolysate
concentration factor (5.0), air flowrate (1.30 L/min), agitation speed (300 rpm), initial cell
concentration (1.4 g/L), initial pH ofthe fermentation medium (6.0). Using these conditions, a
xylitol production of 47.5 g/L was obtained after 120 h of fermentation, resulting in
productivity and yield of 0.40 g/L h and 0.81 g/g, respectively. The immobilized cells were
reused during tive successive batch fermentations, without lasses in the xylitol production. ln
average ( variation coefficients lower than 1 O % ), a xylitol production of 51. 6 g/L was
obtained in each one of the successive batch fermentations, with productivity and yield of
0.43 g/L h and 0.71 g/g, respectively. On the other hand, a reduction of 31.6 % in the average
volume of the Ca-alginate beads was observed at the end of the fifth fermentation cycle. The
supplementation of the hydrolysate with amrnonium sulfate and rice bran extract maximized
the xylitol production by the yeast. This supplementation was shown to be beneficial along all
the successive batch fermentations.
- ,-
I
ÍNDICE
1 INTRODUÇÃO --------------------------------------------------------------------------1
2 O BJ ETIV OS ----------------------------------------------------------------------------- 3
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA --------------------------------------------------------4
3.1 Biomassa Lignocelulósica ------------------------------------------- 4
3. 1. 1 Bagaço de Cana-de-Açúcar-------------------------------------------------------- 6
3.2 Xilitol, Propriedades e Aplicações----------------------------- 7
3 .2.1 Produção de Xilitol em Escala Industrial ---------------------------------------- 9
3.3 Produção de Xilitol por Via Biotecnológica --------------------------10
3.3.1 Principais Fatores que Interferem na Bioconversão de Xilose em Xilitol---14
3 .3 .1.1 Concentração Inicial de Xilose----------------------------------------------14
3 .3 .1.2 Taxa de Transferência de Oxigênio-----------------------------------------15
3. 3. 1. 3 Inibidores do Metabolismo Celular-----------------------------------------17
3. 3. 1. 4 Modo de Condução da Fermentação ---------------------------------------22
3.4 Imobilização de Células em Gel de Alginato de Cálcio------------------24
3.5 Cultivo de Células Imobilizadas---------------------------------------29
4 MATERIAIS E MÉTODOS -------------------------------------------------------- 34
4.1 Obtenção, concentração e tratamento do hidrolisado hemicelulósico do
bagaço de cana de açúcar------------------------------------------------------34
4.2 Microrganismo e obtenção das células ------------------------------------------34
_,./
"'"\
II
4.3 1 mo bil izaçã o d as célula s------------------------------------------------------------35
4.4 Meio e condições de fermentação----------------------------------------36
4.4.1 Avaliação da Performance das Células Imobilizadas na Produção de Xilitol
em Diferentes Sistemas Fermentativos -----------------------------------------------------------3 7
4.4.2 Identificação dos Principais Fatores que Influenciam a Produção de Xilitol
em Reator de Mistura ---------------- ---------------------------------------------------------------3 9
4.4.3 Elaboração de Modelos Empíricos para Predição da Produção de Xilitol em
Reator de Mistura -----------------------------------------------------------------------------------41
4.4.4 Avaliação da Estabilidade Operacional do Sistema de Produção de Xilitol
em Reator de Mistura -------------------------------------------------------------------------------4 2
4.4.4.1 Avaliação das Necessidades Nutricionais da Levedura para a Produção
de Xilitol na Modalidade de Bateladas Repetidas de Fermentação-------------------------43
4.5 Métodos Analíticos -------------------------------------------------------------44
4. 5. 1 Determinação das Concentrações Celulares ----------------:-------------------44
4.5.2 Determinação da Estabilidade das Esferas de Alginato de Cálcio -----------45
4.5.3 Determinação do Teor de Açúcares, Xilitol, Ácido Acético, Furfural e
Hidróxi-m eti l-furfural-------------------------------------------------------------------------------46
4.5.4 Determinação do teor de produtos de decomposição da lignina--------------47
4. 5. 5 Determinação dos Parâmetros Fermentativos ---------------------------------4 7
5 RESUL TACOS E DISCUSSÃO--------------------------------------------------- 50
5.1 Caracterização Parcial dos Hidrolisados Obtidos ·------------------50
5.2 Avaliação da Performance das Células Imobilizadas na Produção de
Xilitol em Diferentes Sistemas Fermentativos --------------------------------------54
III
5.2.1 Comparação dos Resultados com Dados da Literatura------------------------59
5.3 Identificação dos Principais Fatores que Influenciam a Produção de
Xilitol em Reator de Mistura -------------------------------------------------------------------60
5.3.1 Comparação dos Resultados com Dados da Literatura------------------------70
5.4 Elaboração de Modelos Empíricos para Predição da Produção de Xilitol
em Reator de Mistura------------------------- ------------ 73
5 .4. 1 Definição das Condições de Cultivo para a Produção de Xilitol em Reator de
Iviistura ---------------------------------------------------------------------------------------80
5.5 Avaliação da Estabilidade Operacional do Sistema de Produção de Xilitol
em Reator de Mistura-------------- -----------84
5.5.1 Comparação dos Resultados com Dados da Literatura------------------------87
5.5.2 Avaliação das Necessidades Nutricionais da Levedura para a Produção de
Xilitol no Sistema de Bateladas Repetidas de Fermentação------------------------------------88
6 CONCLUSÕES ----------------------------------------------------------------------- 93
7 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS------------------------------ 95
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS--------------------------------------------- 96
IV
LISTA DE TABELAS
TABELA 1: Valores reais das variáveis independentes utilizados nos ensaios, de acordo com
um planejamento fatorial fracionado do tipo 2/-1 .......................•......................•......... 40
TABELA 2: Matriz experimental do planejamento fatorial fracionado do tipo 2/·1 utilizado
para a identificação dos principais efeitos / interações que influenciam a produção de
xilitol 40
TABELA 3: Matriz experimental utilizada para compor o planejamento fatorial fracionado
do tipo 2/-1 em face centrada 42
TABELA 4: Planejamento experimental utilizado para a avaliação das necessidades
nutricionais da levedura para a produção de xilitol no sistema de bateladas repetidas de
fermentação 43
TABELA 5: Caracterização parcial do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana obtido
após hidrólise ácida 50
TABELA 6: Caracterização parcial dos hidrolisados hemicelulósicos de bagaço de cana
submetidos à concentração por fatores iguais a três (H3), quatro (Ri) e cinco (Hs) 51
TABELA 7: Caracterização parcial dos hidrolisados hemicelulósicos de bagaço de cana
submetidos à concentração por fatores iguais a três (H3), quatro (Ha) e cinco (H«),
detoxificação e autoclavagem 52
TABELA 8: Caracterização parcial dos hidrolisados hemicelulósicos de bagaço de cana
submetidos a concentração por fatores iguais a três (H3), quatro (Ri) e cinco (Hc) 53
TABELA 9: Caracterização parcial do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana
submetido à concentração por fator igual a cinco 54
TABELA 10: Performance dos sistemas fermentativos empregados na bioconversão de xilose
em xilitol 57
TABELA 11: Dados reportados na literatura sobre o uso de células imobilizadas em esferas
V
de alginato de cálcio para a produção de xilitol em meios sintéticos e hidrolisados
hemicelulósicos · 59
TABELA 12: Parâmetros fermentativos determinados após 72 h de fermentação 61
TABELA 13: Análise de variância dos efeitos principais e de interações entre 2 fatores sobre
a produtividade (Qp) 62
TABELA 14: Análise de variância dos efeitos principais e de interações entre 2 fatores sobre
o rendimento (Yp;s) 63
TABEL.\ 15: Parâmetros fermentativos determinados nos tempos de 72 e 120 h de
fermentação. Condições de cultivo: fator de concentração do hidrolisado (5.0), vazão de
ar (1.30 L/min), agitação (300 rpm), concentração inicial de células (1.4 g/L), pH inicial
do meio (6.0) 71
TABELA 16: Dados reportados na literatura sobre a produção de xilitol em hidrolisados
hemicelulósicos de bagaço de cana com a levedura Candida guiltiermondii FTI 20037 72
TABELA 17: Parâmetros fermentativos determinados após 72 h de fermentação 73
TABELA 18: Valores dos coeficientes de regressão mantidos no modelo proposto para a
predição da produtividade em xilitol 75
TABELA 19: Análise de variância do modelo quadrático e da falta de ajuste dos dados
experimentais a este modelo 76
TABELA 20: Valores dos coeficientes de regressão mantidos no modelo proposto para a
predição do rendimento em xilitol 78
TABELA 21: Análise de variância do modelo quadrático e da falta de ajuste dos dados
experimentais a este modelo 79
TABELA 22: Parâmetros fermentativos determinados nos tempos de 72 e 120 h de
fermentação. Condições de cultivo: fator de concentração do hidrolisado (5.0), vazão de
ar (1.30 L/min), agitação (300 rpm), concentração inicial de células (1.4 g/L), pH inicial
VI
do meio (6.0) 82
TABELA 23: Parâmetros fermentativos determinados ao final de cada uma das 5 bateladas
repetidas de fermentação 85
TABELA 24: Dados reportados na literatura sobre o uso da levedura Candida guilliermondii
FTI 2003 7 para a produção de xilitol em hidrolisado de bagaço de cana na modalidade de
bateladas repetidas de fermentação 88
TABELA 25: Parâmetros fermentativos determinados nas bateladas repetidas de fermentação
···································································································································· 89
VII
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1: Exemplos de produtos que contêm xilitol. -------------------------------------------- 8
FIGURA 2: Principais vias metabólicas usadas na fermentação de xilose por leveduras
(HAHN-HAGERDAL et al.. 1994). -----------------------------------------------------------12
FIGURA 3: Produtos formados durante a hidrólise ácida de materiais lignocelulósicos
(PALMQVTST e HAHN-HAGERDAL 2000b ). ----------------------------------------------18
FIGURA 4: Métodos de imobilização de enzimas e células (BÁLES, 1994). -----------------25
FIGURA 5: Modelo para a formação da malha de alginato de cálcio envolvendo: a)
dimerização inicial, e b) subseqüente agregação dos dímeros pré-formados induzida por
íons cálcio (GEMEINER et al., 1994 ). --------------------------------------------------------29
FIGURA 6: Ilustração do equipamento utilizado para a imobilização das células de Candida
guilliermondii em esferas de gel de alginato de cálcio. --------------------------------------36
FIGURA 7: Representação esquemática do reator de mistura utilizado para a bioconversão de
xi lose em xi I ito 1. -------------- --------------------------------------------------------------------3 8
FIGURA 8: Representação esquemática do reator tipo cesta utilizado para a bioconversão de
xi lose em xi l ito l. ----------------------------------------------------------------------------------3 8
FIGURA 9: Bioconversão de xilose em xilitol em frascos Erlenmeyer. Concentração de
células imobilizadas nas esferas de alginato de cálcio, X1 <•), e no reator, Xn, (O);
concentração de células livres no meio de fermentação, XM <•), e no reator, XRM (O);
concentração celular total no reator, XR (.6.). ------------------------------------------------55
FIGURA 1 O: Bioconversão de xilose em xilitol em reator de mistura. Concentração de
células imobilizadas nas esferas de alginato de cálcio, X1 <•), e no reator, XR! (O);
concentração de células livres no meio de fermentação, XM (e), e no reator, J(m.1 (O);
concentração celular total no reator, XR ( .6. ). -------------------------------------------------56
FIGURA 11: Bioconversão de xilose em xilitol em reator tipo cesta. Concentração de células
VIII
imobilizadas nas esferas de alginato de cálcio, X,(•), e no reator, XRJ (O); concentração
de células livres no meio de fermentação, .X:11 (e), e no reator, XRA-1 (O); concentração
celular total no reator, XR ( .6. ). ------------------------------------------------------------------58
FIGURA 12: Valores preditos para a produtividade (a) e rendimento (b), em função do fator
de concentração do hidrolisado e da concentração inicial de células. ----------------------65
FIGURA 13: Valores preditos para a produtividade (a) e rendimento (b), em função do fator
de concentração do hidrolisado e do pH inicial do meio de fermentação. -----------------66
FIGURA 14: Valores preditos para a produtividade (a) e rendimento (b), em função do pH
inicial do meio de fermentação e da velocidade de agitação. -------------------------------68
FIGURA 15: Valores preditos para rendimento, em função da vazão de ar e da velocidade de
agitação. -------------------------------------------------------------------------------------------69
FIGURA 16: Plote dos resíduos em função dos valores preditos pelo modelo quadrático
proposto para a predição da produtividade. --------------------------------------------------- 76 : -. -
FIGURA 17: Superfície de resposta descrita pela equação 25, que relaciona a produtividade
com o fator de concentração do hidrolisado e com o pH inicial do meio de fermentação.
------------------------------------------------------------------------------------------------------77
FIGURA 18: Plote dos resíduos em função dos valores preditos pelo modelo quadrático
proposto para a predição do rendimento. ------------------------------------------------------ 79
FIGURA 19: Superficie de resposta descrita pela equação 27, que relaciona o rendimento
com o fator de concentração do hidrolisado e com o pH inicial do meio de fermentação.
------------------------------------------------------------------------------------------------------80 FIGURA 20: Superposição das curvas de nível que relacionam a produtividade e o
rendimento em xilitol com o fator de concentração do hidrolisado e com o pH inicial do
meio de fermentação. ----------------------------------------------------------------------------81
FIGURA 21: Perfis do consumo de glicose (v'), xilose (•), arabinose (e) e ácido acético
IX
(0), da produção de xilitol (Ã), e do crescimento de células livres no reator, X1t11 (0).83
FIGURA 22: Valores de concentração final (Pr-) obtidos durante a produção de xilitol, em
frascos Erlenmeyer, no sistema de bateladas repetidas de fermentação: Ensaio A C•);
Ensaio B (e); Ensaio C (A); Ensaio D (D); Ensaio E (O); Ensaio F (.6).---------------90
FIGURA 23: Valores de produtividade (Qp) obtidos durante a produção de xilitol, em frascos
Erlenmeyer, no sistema de bateladas repetidas de fermentação: Ensaio A C•); Ensaio B
(e); Ensaio C (A); Ensaio D (D); Ensaio E (O); Ensaio F (.6). --------------------------91
FIGURA 24: Valores de rendimento (YP/S) obtidos durante a produção de xilitol, em frascos
Erlenmeyer, no sistema de bateladas repetidas de fermentação: Ensaio A (•): Ensaio B
(e); Ensaio C (A); Ensaio D (D); Ensaio E (O); Ensaio F (.6). --------------------------92
LISTA DE SÍMBOLOS
A: Fator de concentração do hidrolisado
B: Vazão de ar
BSTR: Reator de mistura tipo cesta
C: Agitação
D: Concentração inicial de células
E: pH inicial do meio de fermentação
E%: Eficiência da conversão de xilose em xilitol
EF: Frascos Erlenmeyer
1%: Percentual de células imobilizadas no reator
PF: Concentração final de xilitol
Qp: Produtividade em xilitol
qp: Produtividade específica em xilitol
Qs: Taxa do consumo de xilose
qs: Taxa específica do consumo de xilose
R%: Percentual de redução no volume médio das esferas de alginato de cálcio
S0: Concentração inicial de xilose
S%: Percentual do consumo de xilose
STR: Reator de mistura
V: Volume médio das esferas de alginato de cálcio
X1: Concentração de células imobilizadas nas esferas de alginato de cálcio
XM: Concentração de células livres no meio de fermentação
XR: Concentração celular total no reator
XRo: Concentração inicial de células no reator
Xru: Concentração de células imobilizadas no reator
X
XI
XRJ\1: Concentração de células livres no reator
Y p1s: Fator de rendimento da conversão de xilose em xilitol
YX!c: Fator de rendimento da conversão de glicose e xilose em células
l INTRODUÇÃO
O xilitol é um álcool pentahidroxilado que apresenta poder adoçante equivalente ao da
sacarose. Além de prevenir a formação de cáries, exerce também um efeito sobre as lesões já
existentes ocasionando remineralização do esmalte dos dentes e regeneração das cáries já
formadas. Além disso, pode ser utilizado por diabéticos, por pessoas obesas e por pacientes
que apresentam desordens no metabolismo de gorduras.
Este poliol é produzido em escala industrial por meio da redução de xilose obtida de
materiais lignocelulósicos. Após extensivas etapas de purificação, a xilose é reduzida a xilitol
na presença de um catalisador inorgânico sob condições elevadas de temperatura e pressão.
Este processo confere ao produto final um preço elevado.
Desde a descoberta da habilidade de certas leveduras em produzir xilitol, a
possibilidade de produção deste composto por via biotecnológica tem despertado interesse
para aplicação em escala comercial. Idealmente, a redução da xilose seria realizada - ---·-
diretamente no hidrolisado (sem purificação prévia da xilose) sob condições amenas de
temperatura e pressão, reduzindo-se os custos de produção.
O principal obstáculo na utilização de hidrolisados hemicelulósicos para a produção
biotecnológica de xilitol refere-se à presença de substâncias tóxicas aos microrganismos,
originadas durante a etapa de hidrólise. Os valores de concentração final, rendimento e
produtividade em xilitol obtidos em meios constituídos por hidrolisados são inferiores aos
valores obtidos em meios sintéticos, elaborados com xilose comercial. A condução da
fermentação na modalidade de bateladas repetidas é um procedimento que contribui para
superar estes efeitos tóxicos, uma vez que promove adaptação das células.
Em um estudo prévio (CARVALHO, 2000), desenvolvido nos laboratórios do Grupo
de Microbiologia Aplicada e Bioprocessos (GMBio) do Departamento de Biotecnologia
(Debiq) da Faculdade de Engenharia Química de Lorena (Faenquil), foram determinadas
2
condições adequadas para a imobilização da levedura Candida guilliermondii FTI 2003 7 em
gel de alginato de cálcio. Naquele estudo, foi constatado o efeito benéfico da condução da
fermentação na modalidade de bateladas repetidas para a produção de xilitol em hidrolisado
hemicelulósico de bagaço de cana. O presente trabalho visou dar continuidade ao estudo
inicial com células imobilizadas em gel de alginato de cálcio, procurando definir condições
adequadas de cultivo para maximizar a produção de xilitol. Após a definição destas
condições, a estabilidade operacional do sistema foi avaliada durante uma seqüência de
bateladas repetidas de fermentação.
3
2 OBJETIVOS
./ Avaliar a performance das células imobilizadas na produção de xilitol em frascos
Erlenmeyer, reator de mistura e reator tipo cesta;
,/ Identificar os principais fatores que influenciam a produção de xilitol, em reator de
mistura, utilizando a metodologia de planejamento experimental;
./ Elaborar modelos empíricos para a predição da produção de xilitol, em reator de mistura,
utilizando a metodologia de superficie de resposta;
,/ Avaliar a estabilidade operacional da produção de xilitol, em reator de mistura, na
modalidade de bateladas repetidas de fermentação.
4
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 BIOMASSA LIGNOCELULÓSICA
A biomassa vegetal constitui uma fonte potencial de carbono e energia que pode ser
empregada em bioprocessos para a produção de diversos produtos de valor agregado, uma vez
que é abundante, renovável e de baixo custo (TSAO, 1986). O mercado para os produtos
derivados da biomassa vegetal inclui combustíveis e insumos químicos em geral. Dentre
estes, encontram-se alimentos, fármacos e enzimas (LOUWRIER, 1998; WINKELHAUSEN
e KUZMANOV A, 1998).
Os materiais lignocelulósicos representam a fração mais expressiva da biomassa
vegetal (LUTZEN et al., 1983). Estes materiais são compostos principalmente por uma
mistura de carbohidratos polimerizados ( celulose e hemicelulose) e lignina. A composição
exata não é bem definida, e varia de espécie para espécie com relação aos constituintes e às
proporções entre eles (KUHAD e SINGH, 1993).
A celulose, principal componente da parede celular da fibra vegetal, é um
homopolissacarídeo linear formado por unidades de D-glicose unidas entre si através de
ligações glicosídicas do tipo f3 (1-+4), com grau de polimerização de até 25.000 unidades. As
fibrilas de celulose envolvem as células vegetais em arranjos paralelos regulares e são
geralmente mantidas juntas por uma matriz de outro material polimérico, a hemicelulose
(FENGEL e WEGENER, 1989).
A hemicelulose, fração que chega a representar até 40 % do material da parede celular
da fibra vegetal e age como substância de reserva e sustentação, é um heteropolímero formado
por pentoses (xilose e arabinose) e por hexoses (glicose, manose e galactose} e seus
correspondentes ácidos urônicos. Esta fração é geralmente acetilada e sua composição varia
amplamente, dependendo da espécie considerada. O grau de polimerização deste
heteropolímero é geralmente inferior a 200 unidades (FENGEL e WEGENER, 1989).
5
A lignina, fração responsável pela rigidez e baixa reatividade destes materiais, é
encontrada na parede celular de todas as plantas vasculares. Esta macromolécula de elevado
peso molecular possui estrutura polifenólica complexa, sendo formada através da
polimerização desidrogenativa de três precursores primários: trans-p-cumaril, trans-coniferil e
trans-sinapil. Junto com hemicelulose e pectina, a lignina preenche os espaços entre as fibrilas
de celulose, atuando assim como um material de ligação entre componentes da parede celular
(FENGEL e WEGENER, 1989).
Os constituintes dos materiais lignocelulósicos encontrados em menores proporções
incluem extrativos e não-extrativos. Os extrativos consistem de graxas, gomas, amidos,
alcalóides, resinas, óleos essenciais e outros constituintes citoplasmáticos. Os não-extrativos
incluem compostos como sílica, carbonatos e oxalatos, sendo freqüentemente responsáveis
por características como cor, sabor, resistência ao apodrecimento e propriedades abrasivas
(KUHAD e SINGH, 1993).
A utilização dos diferentes componentes, passíveis de serem obtidos a partir dos
materiais lignocelulósicos, requer a separação seletiva de cada uma das frações. Isto implica
na ruptura do complexo lignina - hemicelulose - celulose e na remoção de cada fração por
técnicas de pré-tratamento, hidrólise e deslignificação (FENGEL e WEGENER, 1989). A
separação simultânea de cada um dos principais constituintes (lignina, celulose· e
hemicelulose) em sua forma polimérica, usando procedimentos de separação convencionais
como cristalização, precipitação ou extração, não é factível. No mínimo um dos polímeros
acima citados deve ser degradado tendo em vista as diferenças entre suas propriedades
químicas (PARAJÓ et ai., 1998c).
Dentre os diferentes métodos empregados para a recuperação dos açúcares presentes
na fração hemicelulósica dos materiais lignocelulósicos, a hidrólise com ácidos diluídos tem
se mostrado eficiente para a obtenção de hidrolisados fermentescíveis, sendo os ácidos
6
sulfürico e clorídrico os mais comumente empregados para este fim (P ARAJÓ et al., 1998c ).
Esta técnica, também conhecida como pré-hidrólise, apresenta vantagens como minimização
da formação de produtos de degradação e aumento da susceptibilidade da celulose à hidrólise
subseqüente (MAGEE e KOSARIC, 1985).
Uma limitação crítica na utilização de hidrolisados hemicelulósicos em processos de
bioconversão é a presença de inibidores do metabolismo microbiano. Estes inibidores tornam
os hidrolisados substancialmente mais dificeis de serem utilizados por microrganismos em
relação à correspondente mistura de açúcares puros. São, em sua maioria, produtos de
degradação formados durante a fase de hidrólise. O conhecimento dos inibidores e de como
minimizar seus efeitos no metabolismo microbiano é de extrema importância para se alcançar
um processo de fermentação eficiente (WINKELHAUSEN e KUZMANOV A, 1998).
3.1.1 BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR
O Brasil é um dos maiores produtores de cana-de-açúcar do mundo. De acordo com
dados do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, foram processadas cerca de
360 milhões de toneladas deste material para a produção de açúcar e álcool na safra
2003/2004. Tendo em vista que cada tonelada de cana-de-açúcar processada gera de 180 a
280 Kg de bagaço (SANTANA e SOUZA, 1984), pode-se estimar que, somente na safra
2003/2004, o Brasil produziu entre 65 e 100 milhões de toneladas de bagaço de cana. Embora
o bagaço gerado durante a produção de açúcar e álcool seja utilizado em grande parte pela
própria indústria sucro-alcooleira como fonte energética, existe ainda um excedente deste
material, em torno de 1 O %, que gera problemas de estocagem e poluição ambiental. ,,
O bagaço é o subproduto obtido após a moagem da cana-de-açúcar para a extração do
suco, sendo composto basicamente de água, fibras e pequenas quantidades de sólidos
solúveis. Em média, as fibras do bagaço de cana são constituídas por 50 % de celulose, 25 %
de hemicelulose e 25 % de lignina (P ANDEY et a!. 2000), sendo que a xilose pode perfazer
7
até 80 % dos carbohidratos presentes na fração hemicelulósica (KUHAD e SINGH, 1993).
Diversos processos têm sido idealizados para utilização racional do excedente de
bagaço gerado pela indústria sucro-alcooleira. Como exemplo, cita-se a geração de energia, a
produção de polpa e papel e a produção de insumos por via fermentativa (P ANDEY et ai.,
2000; PROCKNOR, 2000). Neste contexto, uma das linhas de pesquisa em desenvolvimento
nos laboratórios do GMBio/Debiq/Faenquil visa o aproveitamento da xilose presente na
fração hemicelulósica do bagaço de cana para a produção de xilitol, um adoçante com várias
aplicações. Espera-se, desta forma, agregar valor a um material de baixo custo, que gera
problemas de estocagem e poluição ambiental.
3.2 XILITOL, PROPRIEDADES E APLICAÇÕES
O xilitol é um álcool pentahidroxilado de fórmula molecular C5H120s. Apresenta
poder adoçante equivalente ao da sacarose (BAR, 1986) e é um produto intermediário do
metabolismo de carbohidratos no homem e em animais (MANZ et ai., 1973). A produção
endógena diária é em média de 5 a 15 gramas em uma pessoa adulta normal (EMODI, 1978).
Este poliol ocorre naturalmente em certas frutas e vegetais, entretanto a extração a
partir destas fontes é economicamente inviável devido às pequenas concentrações (EMODI,
1978).
As suas diversas propriedades despertam interesse comercial por parte de indústrias
alimentícias e farmacêuticas. Prova disso é o número crescente de produtos contendo xilitol
que vêm sendo lançados no mercado. A FIGURA 1 ilustra alguns produtos comercializados
nos mercados europeu e norte-americano. No Brasil, apesar de incipiente, algumas indústrias
já têm utilizado o xilitol na formulação de alguns produtos, podendo-se citar como exemplos
o creme dental Sorriso Ação Total e a bala Smints.
FIGURA 1: Exemplos de produtos que contêm xilitol.
8
O xilitol não é fermentado pelos microrganismos da flora bucal (PEPPER. e
OLINGER, 1988). À luz das evidências científicas disponíveis, é considerado o melhor de
todos os adoçantes alternativos em refação à prevenção de cáries (WINKELHAUSEN e
KUZMANOVA, 1998). Segundo SCHE1N1N et ai. (1975), o xilitol além de prevenir a
formação de cáries, exerce também um efeito sobre as 1esões já existentes ocasionando uma
remineralização do esmalte dos dentes e das cáries já formadas. De acordo com W ÃLER et
al. (1992), este é um efeito único do xilitol entre os demais polióís como sorbitol e manitol.
Pode ser utilizado em substituição à sacarose por pacíentes diabéticos e obesos, uma
vez que seu metabolismo independe de insulina e contribuí pouco para a formação de tecidos
gordurosos (MAKINEN, 1976; YLIKAHRI, 1979). É também indicado para pacientes
portadores de deficiência da enzima glícose-6P-desidrogenase (W ANG e van EYS, 1981) e,
nos últimos anos, alguns estudos têm evidenciado a eficácía do uso de xilitol na prevenção de
otites (UHARI et ai., 1998).
O xilitol não participa de reações de escurecimento do tipo "Maillard", devido à
ausência de grupos aldeídicos e cetônicos na sua mo1écu1a, o que o torna apropriado para a
9
utilização em alimentos processados em temperaturas elevadas (MANZ et al., 1973) e
apresenta elevado calor de dissolução negativo, que confere sensação agradável de frescor,
tornando-o apropriado ao revestimento de gomas de mascar (BÀR, 1986).
Ressalta-se ainda que, pelo fato deste adoçante apresentar poder de edulcoração
relativa igual à sacarose, a sua utilização pela indústria alimentícia na confecção de alimentos
dietéticos em substituição ao açúcar é vantajosa quando comparada aos demais adoçantes.
Como a substituição ocorre na proporção de 1: 1, o balanço de massa dos produtos não é
afetado, proporcionando manutenção das propriedades organolépticas do produto final
(EMODI, 1978).
Este adoçante é classificado como "Generally Recognised as Safe" pelo "Food and
Drug Administratton ". No Brasil, é aprovado como produto dietético pela Divisão Nacional
de Vigilância Sanitária de Medicamentos do Ministério da Saúde (AGUIAR et ai., 1999).
3.2.1 PRODUÇÃO DE XILITOL EM ESCALA INDUSTRIAL
O xilitol é produzido em escala industrial através da redução de xilose pura sob
elevadas condições de temperatura e pressão, utilizando-se como catalisador o níquel de
Raney (MELAJA e HAMALAINEN, 1977).
Nesta via de produção, a solução de xilose, obtida por meio da hidrólise ácida de
materiais lignocelulósicos ricos em xilanas, passa por extensivas operações de troca iônica e
fracionamento cromatográfico de forma a se obter uma solução com elevado grau de pureza.
A etapa de hidrogenação ocorre em reatores descontínuos a pressões elevadas (50 atm) e
temperaturas entre 80 e 140 ºC, na presença de níquel de Raney. Após a remoção do
catalisador por filtração e troca iônica, a solução contendo xilitol é concentrada, sofre
fracionamento cromatográfico através de resinas catiônicas e é cristalizada para a obtenção de
xilitol puro (MELAJA e HAMALAfNEN, 1977; MIKKOLA et al., 2000).
A necessidade dos extensivos passos de fracionamento da solução de xilose ( visando a
10
eliminação de impurezas que podem interferir na catálise), a necessidade dos extensivos
passos de purificação da solução de xilitol (visando a eliminação de resíduos tóxicos do
catalisador e subprodutos gerados durante a redução da xilose) e a necessidade do uso de
elevadas temperatura e pressão durante a catálise química conferem ao processo um custo
relativamente elevado (OJAMO et al., 1988).
3.3 PRODUÇÃO DE XILITOL POR VIA BIOTECNOLÓGICA
Apesar da grande gama de aplicações, o uso do xilitol como adoçante é ainda limitado.
O custo de produção comparativamente alto ( cerca de 1 O vezes o custo de produção da
sacarose ou do sorbitol) parece ser o fator responsável, encorajando o desenvolvimento de
tecnologias capazes de diminuir os custos de produção (P ARAJÓ et al., 1998a). Neste
contexto, a produção por via biotecnológica está se tomando mais atrativa nos últimos anos
porque se espera redução significativa dos custos de produção (WINKELHAUSEN e
KUZMANOV A, 1998).
Os primeiros trabalhos significativos referentes à produção microbiológica de xilitol
relatam a busca por microrganismos adequados para emprego neste bioprocesso (GONG et
ai., 1981; BARBOSA et ai., 1988 ). Entretanto, o interesse científico real iniciou-se nos
últimos anos, quando o xilitol, devido às suas propriedades únicas como adoçante alternativo,
começou a ser amplamente utilizado (WINKELHAUSEN e KUZMANOV A, 1998).
A obtenção de xilitol por via biotecnológica é possível graças à capacidade de alguns
microrganismos de sintetizarem a enzima xilose redutase, a qual catalisa a redução de xilose a
xilitol (JEFFRIES, 1983). Em geral, entre os microrganismos, as leveduras são consideradas
as melhores produtoras de xilitol, especialmente aquelas que pertencem ao gênero Candida
(WINKELHAUSEN e KUZMANOV A, 1998). A eficiência e a produtividade dependem do
microrganismo, do meio de fermentação e das condições de cultivo (BARBOSA et ai., 1990;
TAYLOR et al., 1990).
1 l
O primeiro passo do metabolismo da xilose é o transporte deste açúcar através da
membrana celular. Uma vez dentro da célula, a xilose é reduzida a xilitol pela enzima xilose
redutase (EC l. l .1.21) com a participação das coenzimas NADPH ou NADH. A seguir, o
xilitol é secretado para fora da célula ou oxidado a xilulose pela enzima xilitol desidrogenase
(EC 1.1.1.9), com participação de NAD' (SLININGER et al., 1987). A xilulose é fosforilada
a xilulose 5-fosfato, a qual pode ser convertida em piruvato através do complexo enzimático
transcetolase-transaldolase, que faz a conexão entre via das fosfopentoses e via EMP (WEBB
e LEE, 1992; NOLLEAU et al., 1993). O esquema demonstrado pela FIGURA 2 representa
as principais vias metabólicas envolvidas na fermentação de xilose por leveduras.
Dependendo do microrganismo, a enzima xilose redutase difere na especificidade
pelas coenzimas NADPH e NADH. Em estudos realizados com as leveduras Candida
shehatae e Pichia stipitis. a xilose redutase mostrou ser dependente tanto de NADPH quanto
de NADH (BRUINEMBERG et ai., 1984 ). Para leveduras com baixos níveis de atividade de
xilose redutase dependente de NADH, como Candida guilliermondii (NOLLEAU et al.,
1993; SILVA et al., 1996c), condições de anaerobiose levam a um desbalanço no potencial
redox das células e determinam a paralisação do metabolismo da xilose. Em condições
aeróbias, a oxidação de xilitol em xilulose é o passo limitante da velocidade do metabolismo
da xilose, exercendo a atividade da enzima xilitol desidrogenase papel relevante no acúmulo
de xilitol. Por outro lado, sob condições limitadas de oxigênio, a taxa de transporte através da
membrana pode limitar a velocidade de utilização de xilose pela levedura (A.LEXANDER et
ai., 1988; KILIAN e van UDEN, 1988; LIGTHELM et ai., 1988a; SPENCER-MARTINS,
1994; PARAJÓ et ai., 1998a).
Segundo Jeffiies ( 1982), citado por GONG et ai. (1983 ), o metabolismo de xilose
ocorre em um ciclo fechado, o que garante a regeneração do NADPH necessário para a
redução de xilose em xilitol, já que o x.ilitol produzido é eventualmente catabolizado,
12
produzindo glicose ô-fosfato, a qual é metabolizada pela via das fosfopentoses regenerando
este cofator e mantendo o ciclo.
Xilose Glicose
Membrana Citoplasmática
. . . Glicose
NADPH ::!.-- NADH t: ATP NADPH NADP+ ADP
NADP+ ·~ NAD+ \.. ) Xilitol /.,.,,---.-:~--- Glícose-6P
é NAD+ 6-Fosfo;uconatç, I -: Cr02 t'./NADP+ _/ NADH
~ NADPH Frutose-6P Xilulose :::---1 / Ribulose 5P . .. --··· ·· ...- J: ::: ~-- / \ ·- Frutose-1,6PP
Xilulose-SP Ribose-SP _ . ...- I\ ~··· ~''---. Sedoheptulose-7P . ...- Gliceralde1do-3P Dihidrcccacetona-P "--~,;~ ADP -+- N.ID> V- NADH
Eri ~4P .. -··F···rut·· / 6P ATP~~NADH t-+NAD+
Í trose- .-· · ose- __ ..-- Piruvato Glicerol_3P
__ ... ·· .. · NAD+ ~ 1-- ADP ~-~- .·· C02
_ .. ····~ NADH '7 · ',, . -~ATP · +" C02 ~ .
Frutose-6P Gliceraldeido-Sf .../ Acetil-CoA Acetaldeido Glicerol
. (/ "'"'/C:: ---~ \ Acetato NADH NJ.D+ Etanol
!>!,
FADH -.
DE ~ SISTEMA DE TRANSPORTE \ KREBS
GTP .-\_ NAD+
GDP+Pi_,)'-"-...~ 'NADH
Y..ilose
FADH FAD \
NADH NAD+ t
DE ELÉTRONS
\ ADP+Pi ATP
FIGURA 2: Principais vias metabólicas usadas na fermentação de xilose por leveduras
(HAHN-HAGERDAL et ai., 1994).
De acordo com BARBOSA et ai. ( 1988), durante o metabolismo de xilose em
13
leveduras ocorre a oxidação completa de 1 mol de glicose ô-fosfato a C02 pela via das
fosfopentoses, gerando 12 moles de NADPH a partir de NADP'. Estes autores propõem um
rendimento teórico de O, 9 mal de xilitol para cada mo! de D-xilose utilizado, levando em
consideração a seguinte equação geral da bíoconversão:
60 C'_sH1005: 12 ADP -- 12 Pi · 12 H20 · 3 <h --f5.:/ C5H1205: 12 ATP ' 30 C(h (1)
Entretanto, de acordo com SLlNINGER et ai. ( 1987), o metabolismo de xilose em
leveduras gera vários produtos, como dióxido de carbono, etanol, ácido acético e
polissacarídeos. Os fatores de rendimento em produto são dependentes da regulação do fluxo
de carbono através das rotas metabólicas disponíveis Segundo WINKELHAUSEN e
KUZMANOV A ( 1998), a conversão de xilose em xilitol não pode ser separada da conversão
de xilose nos produtos acima mencionados. O processo de formação de xilitol não pode ser
interrompido após o primeiro passo, quando a xilose é convertida em xilitol. O crescimento
celular depende de alguns produtos metabólicos, sendo também necessário que os cofatores
sejam regenerados através de diferentes passos na via metabólica. Desta forma, para a
obtenção de bons rendimentos em xilitol, a quantidade de xilose que é convertida em xilitol e
a quantidade de xilitol que é disponibilizada para o metabolismo devem ser bem balanceadas.
De acordo com MEYRIAL et ai. (1991), a levedura Candida guilliermondii apresenta
alto potencial para ser empregada na produção de xilitol a partir de materiais ricos em xilose.
Recentemente, o gene que codifica a síntese da enzima xilose redutase nesta levedura foi
isolado, clonado e expressado em Pichia pastoris, uma levedura metilotrófica adequada para
emprego em processos fermentativos a nível industrial (HANDUMRONGKUL et ai., 1998).
Uma linhagem desta espécie, Candida guilliermondii FTI 20037, previamente selecionada
nos laboratórios do GMBio/Debiq/Faenquil por BARBOSA et ai. ( 1988), se mostrou um
biocatalisador promissor para ser empregado na conversão de xilose em xilitol tanto em meio
sintético, quanto em hidrolisados de materiais lignocelulósicos (SILVA et ai., 1996a; FELIPE
14
et al., 1996a; ROBERTO et al., 1996; SILVA et al., 1997).
3.3.l PRINCIPAIS FATORES QUE INTERFEREM NA BIOCONVERSÃO DE XILOSE EM
XILITOL
A bioconversão de xilose em xilitol é influenciada por diversas condições de cultivo,
como nutrição, temperatura, pl-I, concentração de inóculo, concentração de substrato e aeração
(WINKELHAUSEN e KUZMANOY A, 1998). Além do modo de condução da fermentação,
os principais fatores que interferem na bioconversão de xilose em xilitol em meios
constituídos por hidrolisados de materiais lignocelulósicos são: concentração inicial de xilose,
taxa de transferência de oxigênio e presença de inibidores do metabolismo celular.
3.3.1. 1 Concentração Inicial de Xilose
A concentração inicial de xilose no meio de fermentação exerce grande influência na
produção de xilitol. De uma maneira geral, pode-se dizer que a elevação da concentração
inicial de xilose promove o seu rápido consumo e intensifica a produção de xilitol, resultando
em maiores eficiência e produtividade (SILVA e AFSCHAR, 1994; PARAJÓ et al., 1998b ).
Entretanto, o aumento excessivo da concentração de xilose acarreta um decréscimo nas taxas
de crescimento do microrganismo, com conseqüente queda nas taxas de produção de xilitol
(NOLLEAU et al., 1993; SILVA e AFSCHAR, 1994; PARAJÓ et al., 1998b). Dependendo
da espécie de levedura e das condições operacionais, a inibição por excesso de substrato
ocorre geralmente entre 150 e 200 g/L de xilose (P ARAJÓ et ai., 1998b ).
As interferências negativas na produção de xilitol, determinadas pelas maiores
concentrações de xilose. podem ser explicadas em função da pressão osmótica elevada e da
repressão de enzimas que participam do metabolismo deste açúcar (NIGAM e SINGH, 1995),
e podem ser reduzidas ou mesmo eliminadas alterando-se a condução do processo para
descontínuo alimentado (OJAMO et ai., 1988).
IS
Um ponto critico que deve ser observado quando os meios de fermentação são
elaborados com hidrolisados lignocelulósicos é o fato de existirem também efeitos adicionais
relativos à concentração do substrato. Se concentração a vácuo é utilizada para elevar o teor
de xilose por evaporação, ocorre também um aumento simultâneo na concentração de outros
compostos não-voláteis, alguns deles causando inibição do metabolismo microbiano com
conseqüente efeito negativo na produção de xilitol (P ARAJÓ et al., I 998b ). Nestes casos,
deve-se ter em mente que o efeito combinado das concentrações de xilose e inibidores irá
determinar o fator de concentração do hidrolisado adequado para a produção de xilitol
(PARAJÓ et al., 1998c).
Empregando hidrolisado hemicelulósico de palha de arroz para a produção de xilitol
com a levedura Candida guilliermondii FTI 20037, SILVA e ROBERTO (2001)
determinaram uma máxima concentração inicial de xilose da ordem de 80 g/L, de forma a se
evitar problemas de inibição com conseqüente queda nas taxas de bioconversão.
3.3.1.2 Taxa de Transferência de Oxigênio
Dentre os fatores que regulam a bioconversão de xilose em xilitol, a taxa de
transferência de oxigênio ao meio é o mais importante, uma vez que a variação acima ou
abaixo de um valor ótimo leva a uma diminuição significativa do rendimento e/ou da
produtividade (JEFFRIES, 1983; SKOOG e HÀHN-HAGERDAL, 1988; LIGHTELM et al.,
1988b; SILVA et al., 1996b; SILVA et ai., 1997).
De acordo com DELGENES et ai. (1989), o fator de rendimento em xilitol depende
fortemente da velocidade de transferência de oxigênio, estando esta influência relacionada
com a regeneração de coenzimas e com a produção de A TP durante a fosforilação oxidativa
(JEFFRIES, 1983; NOLLEAU et ai., 1993 ). Em condições aeróbias ocorre maior produção de
massa celular, enquanto que em condições limitadas de oxigênio uma grande parte da xilose é
convertida em xilitol (LIGHTELM et ai., 1988b; GROOTJEN et al., 1991). Um rigoroso
16
controle da disponibilidade de oxigênio é fundamental para se obter elevada eficiência
fermentativa, evitando-se o desvio do metabolismo para a formação de células. Por outro
lado, a falta deste nutriente proporciona um desbalanço tio potencial redox das células
ocasionando a paralisação do crescimento celular, da assimilação de xilose e.
conseqüentemente, da formação de xilitol (SCHNEIDER, 1989; NOLLEAU et al., 1995:
V ANDESKA et al., 1995).
O suprimento limitado de oxigênio favorece a produção de xilitol devido ao
desbalanço entre as concentrações de NAD" e NADH (BRUINENBERG et al., 1984) A
taxas específicas de fornecimento de oxigênio decrescentes, o sistema de transporte de
elétrons não é capaz de reoxidar todo o NADH2 produzido. Como conseqüência, o nível de
NADH2 intracelular aumenta, reduzindo a velocidade de reação da enzima xilitol
desidrogenase e determinando acúmulo de xilitol no meio de cultivo (RIZZI et al., 1989a:
1989b).
RIBEIRO ( 1997) estudou a influência da vazão de ar e da agitação sobre a
bioconversão de xilose em xilitol em hidrolisado de bagaço de cana, cultivando a levedura
Candida guilliermondii FTI 20037 em reator de mistura. Neste estudo, que visou definir as
condições operacionais para se obter a máxima produtividade em xilitol, foi empregado um
planejamento fatorial do tipo 22 e, posteriormente, a metodologia da superficie de resposta.
Foi possível elaborar um modelo empírico que descreveu satisfatoriamente o comportamento
do sistema na região de ótimo. A máxima produtividade volumétrica (0,84 g/Lh) foi obtida
utilizando-se uma agitação de 357 rpm e uma vazão de ar de 0,62 vvm, correspondendo a um
K1,a inicial de 21, 6 h º 1. Nestas condições, foi obtida uma concentração de xilitol igual a 4 L 7
g/L e um fator de conversão de xilose em xilitol igual a 0,71 g/g após 48 h de fermentação.
NAKANO et ai. (2000) demonstraram a importância de se manter um ambiente de
microaerobiose durante a produção de xilitol. Utilizando um programa computacional para
17
controlar em tempo real a vazão de ar fornecida ao sistema, em função dos valores de
oxigênio dissolvido e de dióxido de carbono produzido, estes autores conseguiram obter
elevada eficiência na bioconversão de xilose em xilitol, minimizando a produção de massa
celular. Após cinco bateladas sucessivas de fermentação ( o volume de meio retirado no
decorrer de cada batelada para monitorar o consumo de açúcares e a produção de xilitol foi
compensado pela adição de xilose na forma de soluções superconcentradas ao final de cada
uma das bateladas), foi obtida uma concentração de xilitol igual a 3 56 g/L, com um fator de
conversão de O, 75 g/g.
3.3.J.3 Inibidores do Metabolismo Celular
A utilização da hidrólise ácida para a obtenção de hidrolisados hemicelulósicos, apesar
de sua rapidez e simplicidade, apresenta a desvantagem de levar à formação de produtos
secundários (P ALMQVIST e HÃHN-HAGERDAL, 2000b ). Estes produtos secundários são
em sua maioria substâncias inibitórias do metabolismo microbiano (FERRARI et al., 1992;
KUHAD e SINGH, 1993 ), as quais constituem o principal problema relativo ao uso destes
materiais como meio de fermentação (FELIPE et al., 1997b ). Estes inibidores podem limitar o
consumo do substrato, prejudicar o crescimento celular e a formação de produtos, e até
mesmo interromper o processo fermentativo (PARAJÓ et al., 1998c).
De acordo com PALMQVIST e HAHN-HAGERDAL (2000b), os inibidores podem
ser divididos em três grandes grupos de acordo com a sua origem: ácidos fracos, derivados do
furano e compostos fenólicos.
A FIGURA 3 ilustra os principais produtos formados durante a hidrólise ácida de
materiais lignocelulósicos. Conforme pode ser observado, quando a hemicelulose é
despolimerizada, xilose, manose, ácido acético, galactose e glicose são liberadas. Em
condições de elevadas temperatura e pressão, a xilose é posteriormente degradada em furfural.
De maneira similar, hidróxi-metil-furfural é formado a partir da degradação de glicose. Estes
18
derivados do furano podem reagir entre si e formar compostos poliméricos. Ácido fórmico
pode ser formado tanto a partir de furfural quanto a partir de hidróxi-metil-furfural. Por outro
lado, ácido levulínico só é formado a partir da degradação de hidróxi-rnetil-furfural. Os
compostos fenólicos são formados devido à degradação da lignina.
Materiais Lignocelulósicos
------------------~----------------- r ' Hemicelulose Celulose Lignina
1 \ t....----i-i...----i.-------,i, _ ... ,~ ~/
Glicose .......
1
' -, ..... _ --
Ácido Acético Xilose Manose Galactose
... \ 1
Compostos Fenólicos .J:..
\ \
' ... ... ' ' \
1 ~ ( 1
I
Furfural Hidróxi-metil-furfural
L :J .. ,,. ......
Ácido :r:~c~- -- - - - - - - - --- --- ... ~
Ácido Levulínico FIGURA 3: Produtos formados durante a hidrólise ácida de materiais lignocelulósicos
(P ALMQVJST e HAHN-HAGERDAL 2000b ).
Para um dado material lignocelulósico, o tipo e a quantidade de inibidores formados
são função da temperatura, do tempo e da concentração e tipo de ácido utilizados na hidrólise
(PARAJÓ et ai., 1998c). Por exemplo, MARTIN et ai. (2002), empregando diferentes agentes
impregnantes para a obtenção de hidrolisados de bagaço de cana por meio de explosão a
vapor, verificaram que, embora a concentração total de compostos fenólicos tenha
permanecido mais ou menos constante nos diferentes hidrolisados obtidos, as proporções
entre os diferentes compostos variaram significativamente dependendo das condições
empregadas. Utilizando técnicas de HPLC e GC-MS, foram identificados e quantificados
treze compostos fenólicos oriundos da degradação da lignina durante a fase de hidrólise.
O efeito inibitório dos ácidos fracos é dependente do grau de dissociação, que por sua
19
vez é função do pH do meio de fermentação (PARAJÓ et al., 1998c; WINKELHAUSEN e
KUZMANOV A, 1998). Estes ácidos apresentam valores de pKa relativamente elevados. Por
exemplo, os valores de pKa para os ácidos acético, fórmico e levulínico são 4,75 (25ºC), 3,75
(20ºC) e 4,66 (25ºC), respectivamente (P ALMQVIST e HAHN-HAGERDAL, 2000b ). Em
valores de pH inferiores aos respectivos pKas, estes compostos encontram-se principalmente
nas formas não dissociadas. Nestas formas, os ácidos não dissociados são lipossolúveis e
podem difundir-se através da membrana citoplasmática. No citoplasma, ocorre a dissociação
destes ácidos, determinando decréscimos no pH intracelular para valores inferiores aos limites
fisiológicos (LOHMEIER-VOGEL et ai., 1998). Os mecanismos pelos quais estes ácidos
afetam a homeostase intracelular ainda não são bem compreendidos. O acúmulo intracelular
de ânions (RUSSEL, 1992) e o desacoplamento da produção de A TP pela ATPase da
membrana citoplasmática (LOHMEIER-VOGEL et ai., 1998) têm sido sugeridos.
Dentre os ácidos fracos, o ácido acético tem sido o inibidor mais estudado. Dados
relacionados ao efeito deste ácido na bioconversão de xilose em xilitol sugerem que o efeito
inibitório deste composto depende também da composição e origem do meio de fermentação
(FELIPE et ai., 1997a), bem como da taxa de aeração. Em condições de maior aeração, o
ácido acético é consumido mais rapidamente (PAR.;\JÓ et ai., 1997).
Especificamente com relação aos efeitos inibitórios dos ácidos fracos, vale ressaltar
que o pH inicial do meio de fermentação é uma variável crucial a ser observada durante os
processos de bioconversão de materiais lignocelulósicos. O crescimento celular em meios
preparados a partir destes hidrolisados é fortemente dependente do pH inicial, uma vez que a
concentração de ácidos fracos não dissociados é extremamente sensível a pequenas variações
de pH em torno de 5,0 (PALMQVIST et ai., 1998).
O modo preciso de ação do furfural e do hidróxi-metil-furfural sobre a atividade
microbiana ainda não é completamente entendido, sendo a de-energização celular um dos
20
possíveis mecarusmos envolvidos na ação inibitória (LOHMEIER-VOGEL et ai., 1998).
Entretanto, para a levedura Sacharomyces cerevisiae, foi demonstrada a capacidade deste
microrganismo em reduzir estes compostos até os respectivos álcoois (furfurílico e hidróxi-
metil-furfurílico) em condições anaeróbias (PALMQVIST e HAHN-HAGERDAL, 2000b).
Devido à natureza hidrofóbica, os compostos fenólicos oriundos da degradação da
lignina acarretam em perda da integridade das membranas biológicas, afetando a sua
habilidade em servir como barreiras seletivas e matrizes enzimáticas (HEIPIEPER et al.,
1994). De acordo com PALMQVIST e HAHN-HAGERDAL (2000b), o mecanismo de
inibição destes compostos ainda não está bem elucidado, principalmente devido à falta de
análises qualitativas e quantitativas acuradas.
A máxima concentração de cada inibidor permitida no meio de fermentação, de modo
a não interferir no processo fermentativo, não pode ser estabelecida de forma geral, uma vez
que é dependente de fatores como espécie e grau de adaptação do microrganismo utilizado,
modo de condução da fermentação e presença simultânea de outros inibidores (P ARAJÓ et
ai., l 998c). Entretanto, de acordo com DELGENES et ai. (1996), o grau de inibição depende
fortemente da natureza e concentração de cada um dos inibidores presentes no meio.
Face aos problemas que ocasionam, os compostos que inibem o metabolismo
microbiano devem ser removidos do meio ou terem suas concentrações reduzidas para que os
hidrolisados possam ser utilizados em processos de bioconversão, uma vez que a interferência
na atividade microbiológica leva a uma diminuição nas taxas e rendimentos de conversão dos
açúcares presentes.
Diversos métodos químicos, fisicos e biológicos têm sido empregados para a
detoxificação de hidrolisados lignocelulósicos. Entre estes, citam-se: alteração do pH por
meio da adição de ácidos e bases (RANATUNGA et ai., 2000), evaporação sob condições
reduzidas de pressão (PALMQVIST et ai., 2000a), adição de sulfito (CONVERTI et ai., '
21
1999), extração com solventes orgânicos (CRUZ et ai., 1999), tratamento com carvão ativo
(ALVES et al., 1998), tratamento com resinas trocadoras de íons (DOMÍNGUEZ et ai., 1996)
e oxidação enzimática (JONSSON et ai., 1998). Ressalta-se que estes métodos são, em sua
maioria, específicos para a remoção de um determinado grupo de substâncias. Desta forma,
para que uma detoxificação eficiente seja alcançada, muitas vezes é necessário combinar mais
de um tratamento durante a fase de preparo do meio de fermentação. Uma observação
importante, feita por P ALMQVIST e HAHN-HAGERDAL (2000a), reporta à necessidade de
se utilizar um procedimento de detoxificação que remova os inibidores de maneira seletiva,
sem afetar a composição dos açúcares fermentescíveis, barata e fácil de ser integrada ao
processo considerado.
ALVES et ai. (1998) definiram uma metodologia para o tratamento do hidrolisado de
bagaço de cana que consiste na alteração do pH com óxido de cálcio e ácido fosfórico seguida
da adição de carvão ativo. Posteriormente, um estudo da influência exercida por estes
tratamentos sobre o hidrolisado de bagaço de cana comprovou a capacidade de remoção de
alguns compostos inibidores (CARVALHO, 2000). Enquanto o tratamento com carvão ativo
reduziu a concentração dos compostos fenólicos derivados da lignina e dos compostos
derivados do furano, a quantificação dos inibidores avaliados não mostrou resultados
concretos na tentativa de se atribuir efeitos específicos ao tratamento por meio da alteração do
pH com óxido de cálcio e ácido fosfórico. Nenhum dos dois tratamentos influenciou a
concentração de ácido acético no hidrolisado.
De acordo com RANATUNGA et ai. (2000), pelo menos teoricamente, a alteração de
pH com ácidos e bases pode remover compostos inibitórios por precipitação e/ou por
conversão para formas não tóxicas. Além disso, estes autores postulam também a
possibilidade de complementação do hidrolisado, durante a adição de ácidos e bases, com
alguma substância que melhore a capacidade de fermentação dos microrganismos.
22
Estratégias biotecnológicas, como emprego de altas concentrações celulares iniciais e
adaptação dos microrganismos aos compostos tóxicos presentes nos hidrolisados, também
têm sido utilizadas com sucesso para superar os efeitos inibitórios dos hidrolisados
lignocelulósicos sobre a atividade fermentativa dos microrganismos utilizados (FELIPE et ai.,
l 996a,b; P ARAJÓ et ai., 1996). Enquanto o uso de altas concentrações celulares no início das
fermentações limita a morte celular causada pela assimilação ou degradação dos inibidores
(PARAJÓ et ai., 1998c), a adaptação das células propicia um aumento na resistência das
mesmas pela exposição a concentrações gradativamente crescentes destes inibidores (FELIPE
et ai., l 996b ). Ressalta-se que estas técnicas não excluem os tratamentos que visam reduzir a
concentração dos compostos inibidores no meio de fermentação. Ao contrário, os métodos de
detoxificação e as estratégias biotecnológicas podem ser utilizados em conjunto de modo a
promover uma melhor conversão dos açúcares presentes no hidrolisado.
3.3.1.4 Modo de Condução da Fermentação
O modo de conduzir a fermentação exerce grande influência sobre os parâmetros
fermentativos da bioconversão de xilose em xilitol.
A condução da fermentação na modalidade de batelada alimentada tem sido sugerida
por alguns autores como forma de aumentar o fator de conversão de xilose em xilitol através
da suplementação constante de glicose (Y AHASHI et ai., 1996; OH e KIM, 1998) e de
amenizar as interferências negativas determinadas pela alta concentração de xilose sobre o
metabolismo celular (OJAMO et ai., 1988). Por outro lado, o emprego desta técnica tem sido
sugerido também para amenizar a toxicidade de hidrolisados lignocelulósicos. A adição do
meio de fermentação através do uso de baixas vazões permite que as concentrações de
inibidores que podem ser bioconvertidos no reator ( como é o caso do furfural e hidróxi-metil-
furfural em relação à Sacharomyces cerevisiae) permaneçam baixas, minimizando o efeito
inibitório (P ALMQVIST e HAHN-HAGERDAL, 2000a).
23
O sistema contínuo tem sido recomendado para o estudo da fisiologia celular, uma vez
que permite a obtenção de respostas mais acuradas (WINKELHAUSEN et ai., 1996).
Entretanto, quando analisado como um sistema a ser empregado para a produção de xilitol em
nível industrial, deve-se observar que o percentual de consumo da xilose presente nestes
hidrolisados decresce à medida que se aumenta a vazão específica de alimentação,
principalmente devido às baixas taxas de consumo desta pentose em condições de limitação
de oxigênio. Desta forma, para o consumo integral da xilose. presente no meio, faz-se
necessário o emprego de elevados tempos de residência, dificeis de serem executados na
prática (WINKELHAUSEN e KUZrv1ANOV A, 1998). Uma alternativa que tem sido sugerida
para minimizar esta limitação é o emprego de sistemas com alta densidade celular, obtidos
através de imobilização ou reciclo de células por meio de filtração, centrifugação ou
deposição (PALMQVIST e HAHN-HAGERDAL, 2000a; CHOI et ai., 2000).
A modalidade de processo mais investigada para a produção de xilitol tem sido a
batelada convencional. Este modo de condução é caracterizado por elevadas concentrações
iniciais de substrato, elevadas concentrações de produto no final da fermentação e
produtividades relativamente baixas, devido aos tempos mortos entre as bateladas
(WINKELHAUSEN e KUZMANOV A, 1998). Entretanto, de acordo com PARAJÓ et ai.
( l 998b ), esta modalidade de processo oferece versatilidade e facilidade de condução.
O inóculo necessário para a condução de um processo em batelada pode ser preparado
em um fermentador separadamente para cada batelada ou, mais economicamente, as células
podem ser reutilizadas após o término de cada fermentação. Deve-se observar que a
reutilização de células pode ser benéfica em processos que visam a utilização de açúcares
presentes em hidrolisados hemicelulósicos, uma vez que este procedimento pode levar à
adaptação das células aos compostos inibidores. Um ponto importante a ser observado é a
viabilidade celular, que deve permanecer alta ao final das bateladas (P ALMQVIST e HAHN-
_,)
24
HAGERDAL, 2000a).
A avaliação do efeito da adaptação de células de Candída guilliermondii na produção
de xilitol a partir de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana foi realizada por SENE et
ai. (1998). Estes autores verificaram que o emprego desta técnica resultou em melhor fator de
rendimento e melhor produtividade. Além disso, quando as células adaptadas foram
recicladas, as taxas e rendimentos de bioconversão apresentaram pequenas variações ao longo
de cinco bateladas repetidas de fermentação, com coeficientes de variação inferiores a l O %.
Um estudo prévio, desenvolvido nos laboratórios do GMBio/Debiq/Faenquil
(CARVALHO, 2000), teve por objetivo determinar condições adequadas de imobilização da
levedura Candida guilliermondii FTI 2003 7 em esferas de alginato de cálcio para a produção
de xilitol em hidrolisado hernicelulósico de bagaço de cana. Naquele estudo, as condições de
imobilização definidas ( concentração de alginato de sódio igual a 2 %, concentração de
cloreto de cálcio igual a O, 1 M em íons Ca2+ e tempo de cura igual a 24 h) permitiram a
- reutilização das células imobilizadas durante cinco bateladas sucessivas, sem prejuízos na
produção de xilitol. Ao contrário, a reutilização das células proporcionou aumentos na
produção, na produtividade e na eficiência de bioconversão após a primeira batelada da série
de repetições. O diâmetro das esferas de alginato de cálcio, monitorado periodicamente para
se estimar a estabilidade das esferas frente às condições operacionais utilizadas, manteve-se
inalterado ao longo das fermentações. Os valores de concentração final (28, 4 g/L ),
produtividade (0,59 g/Lh) e eficiência de bioconversão (61,5 %) obtidos com a utilização de
células imobilizadas (CARVALHO et ai., 2002b) foram comparáveis àqueles obtidos com a
utilização de células livres em suspensão, em condições de cultivo semelhantes (SENE et ai.,
1998).
3.4 IMOBILIZAÇÃO DE CÉLULAS EM GEL DE ALGINATO DE CÁLCIO
Existem diversos métodos para a imobilização de biocatalisadores. Estes métodos
25
podem ser divididos em quatro grandes grupos, conforme ilustrado na FIGURA 4. Da mesma
forma, também existem diversos materiais que podem ser utilizados como suportes de
imobilização através destes métodos. Apesar disso, não existe um método e um suporte
universais, adequados para qualquer processo (BÁLES, 1994).
BIOCATALISADORES IMOBILIZADOS
1 Auto
1
Ligação a i agregação superflcies
1
Artificial Adsorção Ligação
Natural natural. quimica
Aprisionamento em Contenção matrizes porosas por barreiras
1 1 1
Suportes Aprisionamento Barreiras Gel pré-formados em fase pré-formadas
1
1
Micro Enwlsõesde encapsulação duas fases
FIGURA 4: Métodos de imobilização de enzimas e células (BÁLES, 1994).
O método de aprisionamento em alginato de cálcio é a técnica de imobilização mais
extensivamente utilizada para a imobilização de células viáveis (RAMAKRISHNA e
PRAKASHAM, 1999). Como a formação do gel ocorre rapidamente na presença de íons
cálcio sem alterações drásticas de temperatura, pH e pressão osmótica, a atividade e a
viabilidade dos . . rrucrorgamsmos imobilizados é conservada (CORCORAN, 1985;
BRODELIUS e MOSBACH, 1987; BRODELIUS e VANDAMME, 1987). Vantagens como
baixo custo (CORCORAN, 1985), grande disponibilidade no mercado (GUISELEY, 1989),
26
versatilidade da técnica (BRODELIUS e V ANDAMME, 1987) e possibilidade de ampliação
de escala (CHAMPAGNE et al., 2000) têm sido citadas na literatura. Além disso, as
substâncias utilizadas para a imobilização (alginato e cloreto de cálcio) são aceitas como
aditivos na produção de alimentos (CHAMPAGNE et al., 2000).
De acordo com FREEMAN e LILL Y ( 1998), entre os vários tipos de técnicas e
suportes utilizados para a imobilização de células, a maior parte dos trabalhos que relatam
estabilidades operacionais superiores a 100 horas referem-se à utilização da técnica de
imobilização por aprisionamento em gel de alginato de cálcio.
A produção de etanol pela indústria Kyowa Hakko Kogyo Co., localizada em Tóquio
(BRODELIUS e V ANDAMME, 1987), e a produção de cerveja pela indústria Hwa Kuang
Co., localizada em Shanghai (LINKO e LINKO, 1984), são exemplos de aplicações
industriais que fizeram uso do alginato de cálcio como matriz para a imobilização de células.
Atualmente, este material tem sido avaliado como suporte para a imobilização de células
animais (ORIVE et al., 2003) e vegetais (GILLET et ai., 2000), algas (JIMÉNEZ-PÉREZ et
ai., 2004), enzimas (PRASHANTH e MULIMANI, 2005), bactérias (TRELLES et ai., 2004),
leveduras (NAJAFPOUR et ai., 2004) e fungos (ELLAIAH et ai., 2004).
Entre as desvantagens do uso deste polímero como suporte de imobilização, são
citadas: instabilidade química na presença de agentes quelantes do íon cálcio ( como fosfato,
lactato, citrato e EDTA), tendência das esferas em sofrer dilatação na presença de cátions
monovalentes e limitações impostas à transferência de massa de substratos e produtos
(BRODELIUS e V ANDAMME, 1987; BRODELIUS e MOSBACH, 1987; FREEMAN e
LILL Y, 1998).
A instabilidade na presença de quelantes de cálcio e a tendência em sofrer dilatação na
presença de cátions monovalentes podem ser superadas pela escolha do alginato utilizado
(MARTINSEN et ai., 1989), pela adição de íons cálcio no meio· de fermentação
27
(BRODELIUS e V ANDAMME, 1987), por tratamentos adicionais como lavagem das esferas
em solução de agentes estabilizantes (BRODELIUS e MOSBACH, 1987) ou pela manutenção
das esferas recém-produzidas em solução de cloreto de cálcio previamente à utilização
(OGBONNA et ai., 1989).
Por outro lado, as limitações impostas à transferência de massa de substratos e
produtos podem ser minimizadas através da seleção adequada das condições de imobilização
(BRODELIUS e V ANDAMME, 1987). Além disso, estratégias como adição de carreadores
de oxigênio ( como hemoglobina e perfluorquímicos) ao meio de fermentação, geração de
oxigênio "in situ" na matriz ( como coimobilização de microrganismos fotossintéticos ou
adição de H202 ao meio de fermentação com posterior decomposição em H20 + 02 pela
enzima catalase do microrganismo imobilizado) e oxigenação eficiente do meio de
fermentação ( como aumento da agitação e da vazão de ar ou utilização de 02 puro) têm sido
também utilizadas para minimizar os problemas relativos à transferência de oxigênio até as
células imobilizadas (OGBONNA et ai., 1991). Para uma melhor transferência de massa de
substratos (principalmente oxigênio) e produtos, entretanto, o método mais eficiente consiste
na redução do diâmetro das esferas (OGBONNA et ai., 1991).
O alginato é um polissacarídeo presente em todas as "algas marrons", embora poucas
espécies sejam comercialmente importantes. A espécie Macrocystis pyrifera constitui a
principal fonte (GUISELEY, 1989). Algumas bactérias, principalmente aquelas derivadas do
gênero Pseudomonas, também são capazes de produzir quantidades abundantes deste
polímero como exopolissacarídeo (REHM e V ALLA, 1997).
Quimicamente, os alginatos consistem de polímeros lineares dos ácidos D-manurônico
e L-gulurônico unidos entre si através de ligações glicosídicas do tipo í3(1-+t) e a(l---,,4),
respectivamente. Estes polímeros encontram-se arranjados em três tipos de grupamentos
diferentes: MMI\tfMMM (Blocos M), GGGGGG (Blocos G) e MGMGMG (Blocos MG)
28
(GEMEINER et ai., 1994). A forma como esses blocos se encontram e a proporção de cada
um deles depende da fonte, da época da colheita e da parte da alga a partir da qual o alginato é
extraído (GUISELEY, 1989).
As propriedades mecânicas dos géis de alginato de cálcio são fortemente influenciadas
pela distribuição dos ácidos manurônico e gulurônico no polímero, assim como pelo peso
molecular e pelo grau de polidispersibilidade (BRODELIUS e V ANDAMME, 1987;
MARTINSEN et ai., 1989). Os géis formados a partir de alginatos ricos em ácido gulurônico
são mais quebradiços, enquanto aqueles formados a partir de alginatos ricos em ácido
manurônico são mais maleáveis (GUISELEY, 1989). Os géis quimicamente mais estáveis são
aqueles obtidos a partir da utilização de polímeros com alta relação de blocos G
(BRODELIUS e V ANDAMME, 1987).
A formação do gel ocorre quando cátions como Ca +2 são introduzidos em soluções do
sal de sódio (alginato de sódio). A troca dos íons Na+1 pelos íons Ca+2 leva à formação de gel
consistente, quebradiço e geralmente túrbido, cujas características reológicas dependem do
tipo de alginato e do modo de introdução dos íons divalentes (GEJ\1EINER et ai., 1994). De
acordo com Clark e Ross-Murphy (1987), citados por GEMEINER et ai. (1994), os íons
cálcio se ligam preferencialmente aos blocos G. Este processo é altamente cooperativo se o
número de resíduos de guluronato excede 20 unidades. Não existem evidências da existência
de especificidade ou cooperação em relação à ligação dos íons Ca+2 aos blocos M ou MG. Os
íons Ca +2 ligados cooperativamente durante a gelificação são dispostos dentro das cavidades
eletronegativas dos resíduos de poliguluronato, como ovos dentro de uma caixa apropriada. A
associação se inicia entre duas cadeias somente, lado a lado. Maiores agregados somente
ocorrem sob condições forçadas de elevada concentração de íons Ca+2 (GEMEINER et ai.,
1994). Este modelo de formação da malha de alginato de cálcio é ilustrado na FIGURA 5.
Tendo em vista que as propriedades de gelificação do alginato, vitais para a sua
29
utilização como suporte de imobilização, variam de acordo com a composição monomérica,
com o arranjo seqüencial e com o comprimento dos blocos G, a seleção cuidadosa do material
de partida é essencial para a obtenção de bons resultados (MARTINSEN et ai., 1989).
FIGURA 5: Modelo para a formação da malha de alginato de cálcio envolvendo: a)
dimerização inicial, e b) subseqüente agregação dos dímeros pré-formados induzida por íons
cálcio (GEMEINER et ai., 1994).
3.5 CUL TJVO DE CÉLULAS }MOBILIZADAS
A questão mais importante relativa ao uso de células imobilizadas em bioprocessos
consiste na resistência à transferência de massa entre a fase líquida, na qual se encontram os
nutrientes, e a fase sólida, na qual se encontram as células imobilizadas. A área superficial
reduzida destes agregados celulares e a presença do suporte de imobilização compreendem
barreiras adicionais à transferência de massa de substratos e produtos, podendo determinar
redução nas taxas de reação e criar um microambiente diferente daquele verificado na fase
líquida (KAREL et ai., 1985).
A transferência de massa entre o meio líquido e os biocatalisadores imobilizados é
30
dividida em duas fases: a) transferência de massa externa, que envolve a transferência de
nutrientes do meio de fermentação através de um filme líquido estagnado até a superficie do
suporte de imobilização, e b) transferência de massa interna, que descreve a transferência de
substratos e produtos no interior do suporte de imobilização e através da membrana celular
das células imobilizadas (PILKINGTON et al., 1998). A concentração de metabólitos em
íntimo contato com as células imobilizadas pode ser alterada devido a limitações de
transferência de massa externa e/ou interna. Isto pode levar a alterações no metabolismo e,
conseqüentemente, na qualidade e eficiência do processo fermentativo.
Além das resistências à transferência de massa externa e interna, o "rnicroambiente"
no qual as células imobilizadas se encontram é determinado por efeitos de partição entre a
fase líquida e a matriz sólida de imobilização. O coeficiente de transferência de massa no
filme líquido (KL), a difusividade efetiva do soluto na matriz de imobilização (DE) e o
coeficiente de partição do soluto (Kp }, respectivamente, são os parâmetros utilizados na
quantificação destes fenômenos para a determinação dos fatores de efetividade globais, que
permitem determinar se o sistema é limitado ou não pela transferência de massa
(PILKINGTON et ai., 1998).
As limitações à transferência de massa interna são de particular importância em
sistemas nos quais as células são imobilizadas por meio da técnica de aprisionamento em
matrizes porosas, como alginato de cálcio. A taxa de transferência de uma determinada
substância nestas matrizes (assumindo que a transferência ocorre somente por difusão e
considerando a matriz de imobilização esférica e homogênea) é proporcional ao gradiente de
concentração da espécie difundente, conforme a equação:
.! = -DôC lôr (2)
Onde J é a taxa de transferência da substância por unidade de área, C é a concentração
da substância na matriz de imobilização, r é o raio da esfera e D é o coeficiente de difusão da
31
substância na matriz de imobilização (PILKlNGTON et ai., 1998).
A transferência de massa interna pode ser otimizada pelo ajuste da textura e
porosidade da matriz de imobilização e pela redução do diâmetro das esferas de imobilização,
sendo esta última opção uma alternativa eficiente. Deve-se ter em mente, entretanto, que as
esferas devem ser pequenas o suficiente para evitar limitações à transferência de massa e
grandes o suficiente para permitir fácil recuperação do meio fermentado (OGBONNA et ai.,
1991).
Com relação à transferência de massa externa, o fluxo de um substrato qualquer até a
superficie do suporte de imobilização depende do coeficiente de transferência de massa no
filme líquido e da concentração deste substrato na fase líquida, sendo expresso por meio da
equação:
J=KL(CML-- Css) (3)
Onde J é a taxa de transferência do substrato, KL é o coeficiente de transferência de
massa, CML é a concentração de substrato na fase líquida e Css é a concentração de substrato
na superficie do suporte de imobilização. A diferença de concentração (CML - Css) é a força
motriz para a transferência de massa (PILKlNGTON et ai., 1998).
O coeficiente de partição do soluto (Kp), definido através da equação:
(4)
Onde Cs é a concentração de substrato na matriz de imobilização e CML é a
concentração de substrato na fase líquida, vai estabelecer a proporção entre estas duas
concentrações do mesmo substrato em condições de equilíbrio (PILKINGTON et ai., 1998).
Fatores como tipo, tamanho e condições de operação do bioreator utilizado irão
influenciar a transferência de massa externa em sistemas com células imobilizadas, afetando o
coeficiente de transferência de massa no filme líquido (KL). A otimização da mistura entre a
fase líquida e a fase sólida maximiza o contato superficial entre estas fases, minimizando a
32
espessura do filme líquido estagnante que envolve o suporte de imobilização, maximizando o
valor de KL e, conseqüentemente, minimizando as limitações impostas à transferência de
massa (PILKINGTON et ai., 1998). Entretanto, se o estresse causado à matriz de
imobilização é muito intenso, o suporte de imobilização pode se romper. Desta forma, o
estresse imposto à matriz de imobilização deve ser ajustado de forma a permitir a manutenção
da integridade fisica aliada a uma adequada mistura entre as fases (FUKUDA, 1994;
PILKINGTON et ai., 1998).
Os reatores para trabalhos com células imobilizadas podem ser divididos em três
categorias, de . acordo com o padrão de fluxo: reatores de - mistura, reatores de leito
empacotado e reatores de leito fluidizado. Estes reatores podem também ser modificados para
melhorar as caracteristicas de transferência de massa e a capacidade de controle das condições
de cultivo ou para minimizar o estresse imposto ao suporte de imobilização (FUKUDA,
1994).
Entre os fatores que devem ser levados em consideração quando da escolha de um
determinado tipo ou configuração de reator para trabalhos com células imobilizadas são
citados na literatura: requerimentos de transferência de massa (principalmente suprimento de
oxigênio e remoção de gases), método de imobilização empregado e características da matriz
de imobilização utilizada, natureza do substrato e requerimentos para o cultivo do
microrganismo utilizado (KAREL et ai., 1985; FUKUDA, 1994; BARON et ai., 1996;
PILKINGTON et ai., 1998).
Como vantagens da utilização do reator de mistura (STR), podem ser citadas a
flexibilidade de operação, a possibilidade de se ajustar a intensidade de mistura, a facilidade
de controle de pH e temperatura, a possibilidade de manutenção de uma concentração
homogênea de substrato em todo o reator e a adequação para trabalhos em meios viscosos.
Embora vários tipos de agitadores possam ser utilizados, a principal desvantagem refere-se à
33
tensão de cisalhamento imposta a matrizes sensíveis (FUKUDA, 1994; BARON et ai., 1996).
Neste contexto, uma configuração alternativa denominada reator tipo cesta (BSTR), que
consiste na adaptação de uma cesta no interior da cuba e permite que o contato direto das
esferas de imobilização com as turbinas seja evitado, foi proposta e utilizada com sucesso na
produção de etanol (GAMARRA, 1988; TA V ARES, 1998) e ácido lático (ABEL Y AN e
ABELYAN, 1996).
Diversos trabalhos têm descrito o uso de reatores de mistura no cultivo de células
imobilizadas por meio da técnica de aprisionamento em polímeros naturais, apesar das
elevadas tensões de cisalhamento caracteristicas destes reatores. Entre os polímeros testados,
encontram-se a pectina (KESAVA e PANDA, 1996), a carragena (JAIN et ai., 1985; NUNEZ
et ai., 1991; NORTON et ai., 1994; LAMBOLEY et ai., 1997) e o alginato (KROUWEL et
ai., 1983; QURESHI e MANDERSON, 1991; VIVES et ai., 1993; OY AAS et ai., 1996;
BUZZINI e ROSSI, 1998; HERNÁNDEZ et ai., 2001 ).
Na maior parte dos trabalhos em que o alginato de cálcio foi o suporte utilizado, os
autores relataram boa estabilidade das esferas nas condições experimentais avaliadas, com
agitação das turbinas variando entre 200 e 300 rpm. Por exemplo, KROUWEL et ai. ( 1983 ),
utilizando meio sintético para a produção de isopropanol-butanol-etanol em modo contínuo de
fermentação, relatam como uma das conclusões mais importantes do trabalho a possibilidade
de reutilização dos pellets por períodos prolongados. QURESHJ e MANDERSON ( 1991 ),
utilizando hidrolisado de Pinus sp. para a produção de etanol, também em modo contínuo de
fermentação, classificam o sistema de "opção atrativa para a fermentação de açúcares obtidos
por meio de hidrólise ácida". Deve-se observar, entretanto, que a determinação de uma
agitação adequada, de forma a se prevenir o rompimento das esferas de imobilização, é um
fator muito importante para a obtenção de resultados satisfatórios (VIVES et ai., 1993).
34
4 MATERIAIS E MÉTODOS
j
4.1 OBTENÇÃO, CONCENTRAÇÃO E TRATAMENTO DO HIDROLISADO HEMICELULÓSICO
DO BAGAÇO DE CANA DE AÇÚCAR
O hidrolisado hemicelulósico foi obtido por hidrólise ácida do bagaço de cana de
açúcar proveniente da Usina Santa Helena (Rio das Pedras - SP) em reator de aço inox com
capacidade de 250 litros. O bagaço foi hidrolisado utilizando-se lhS04 98 % de pureza como
catalisador em uma razão de 100 mg H2SOJg de bagaço {peso-seco) durante 20 minutos à
temperatura de 121 ºC, utilizando-se uma proporção de 1 : 1 O entre bagaço e volume da
solução de H2S04. Após resfriamento e homogeneização, a fração líquida foi separada da
fração sólida por centrifugação e estocada em câmara fria a uma temperatura de l O ºC.
Para a realização dos ensaios fermentativos com diferentes concentrações iniciais de
xilose, o hidrolisado obtido foi concentrado sob pressão reduzida a uma temperatura de 70 ºC
(aproximadamente) em diferentes lotes, de acordo com a demanda, utilizando-se fatores de
concentração iguais a três, quatro ou cinco vezes.
Os hidrolisados concentrados foram tratados por meio da elevação do pH até 7.0 pela
adição de óxido de cálcio, redução do pH até 5. 5 pela adição de ácido fosfórico comercial e
adição de carvão ativo 2.5 % com posterior agitação em incubadora com movimento rotatório
a 200 rpm e 30 ºC por 1 h (ALVES et ai., 1998). Após cada etapa deste tratamento, os
hidrolisados foram filtrados em papel de filtro quantitativo para a remoção dos precipitados
formados. Após o tratamento, os hidrolisados foram autoclavados a 0.5 atm por 15 min.
4.2 MICRORGANISMO E OBTENÇÃO DAS CÉLULAS
Para a realização dos ensaios fermentativos, foi utilizada a levedura Candida
guilliermondii FTI 20037, descrita por BARBOSA et ai. (1988). As células foram mantidas
em agar malte a 4 ºC, sendo repicadas a cada 7 dias.
35
Para a obtenção das células utilizadas na etapa de imobilização, foi transferida uma
alçada de células provenientes da cultura-estoque para frascos Erlenmeyer de 125 mL
contendo 50 mL de meio sintético composto de: xilose (30.0 g/L}, sulfato de amônio
(3.0 g/L), cloreto de cálcio (O. l g/L) e extrato de farelo de arroz (1 O% v/v). As células foram
cultivadas em incubadora com movimento rotatório a 200 rpm e 30 ºC por 24 h. Após o
cultivo, as células foram coletadas por centrifugação a 2000 g por 20 min, lavadas, coletadas
novamente por centrifugação e re-suspensas em água destilada esterilizada.
O extrato de farelo de arroz foi preparado em água destilada, utilizando-se uma
concentração de 200 g/L. Esta suspensão foi autoclavada a 0.5 atm por 15 min. Após
resfriamento, o sobrenadante foi separado por centrifugação a 2000 g por 20 min e utilizado
nos ensaios. A solução-estoque de xilose foi preparada na concentração de 250 g/L e
autoclavada a 0.5 atm por I 5 min. A solução-estoque de sulfato de arnônio foi preparada na . ·;;:,.,·.-···---··-- ·········
concentração de 250 g/L e autoclavada a I. O atm por 20 min. A solução-estoque de cloreto de
cálcio foi preparada na concentração de 50 g/L e autoclavada a 1.0 atm por 20 min. Estes
nutrientes foram misturados com água destilada, esterilizada a 1.0 atm por 20 mm, em
proporções adequadas para o preparo do meio utilizado para a obtenção das células.
4~3 IMOBILIZAÇÃO DAS ,CÉLULAS
As células foram imobilizadas pelo método de aprisionamento em esferas de gel de
alginato de cálcio. A suspensão celular, obtida conforme descrito no item anterior, foi
adicionada a uma solução de alginato de sódio (Satialgine S JJOO - Degussa Texturant
Systems, França) previamente autoclavada a 0.5 atm por 15 min, de modo a se obter
suspensões homogêneas com concentrações celulares (em peso-seco) iguais a 2.0, 4.0 ou
6.0 g/L (de acordo com o experimento em questão) e concentração de alginato de sódio igual
a 20.0 g/L. Esferas de gel foram produzidas pelo gotejamento destas suspensões em uma
solução de cloreto de cálcio 0.1 M, previamente preparada em água deionizada e esterilizada a
36
1.0 atm por 20 min, mantida sob agitação. Para o gotejamento das suspensões celulares na
solução de cloreto de cálcio, foram utilizadas duas bombas peristálticas e duas agulhas 19 G
(1 Yz polegada), conforme ilustrado na FIGURA 6. As esferas formadas, contendo as células
imobilizadas, foram mantidas na solução de cloreto de cálcio a uma temperatura de 1 O ºC por j,
um periodo de 24 h. Após este periodo, as esferas foram lavadas com água destilada /
esterilizada e utilizadas nos ensaios fermentativos (CARVALHO, 2000). O diâmetro médio
das esferas no início dos ensaios foi de 2.75 mm (crn.1 = 0.05 mm).
FIGURA 6: Ilustração do equipamento utilizado para a imobilização das células de Candida
guilliermondü em esferas de gel de alginato de cálcio.
4.4 MEIO E CONDIÇÕES DE FERMENTAÇÃO
O meio de fermentação foi preparado pela adição de sulfato de amônio, cloreto de
cálcio e extrato de farelo de arroz ao hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar
(após concentração, tratamento e autoclavagem) em proporções adequadas para a obtenção de
concentrações destes nutrientes idênticas às utilizadas· durante a etapa de obtenção das células
(item 4.2).
No início das fermentações e em intervalos regulares de 48 h, adicionou-se
benzilpenicilina potássica (Benzecilin 1.000.000 UI, Teuto Brasileiro Ltda.) ao meio de
fermentação em uma concentração igual a 1. 000. 000 UI para o controle de possíveis
• 37
contaminantes. De acordo com as especificações contidas na bula deste medicamento, as
penicilinas são rapidamente inativadas na presença de soluções de carbohidratos em pH
alcalino.
Os ensaios fermentativos foram divididos em 4 etapas: 1) Avaliação da performance
das células imobilizadas na produção de xilitol em diferentes sistemas fermentativos; 2)
Identificação dos principais fatores que influenciam a produção de xilitol em reator de
mistura; 3) Elaboração de modelos empíricos para a predição da produção de xilitol em reator
de mistura; 4) Avaliação da estabilidade operacional do sistema de produção de xilitol em
reator de mistura.
4.4.1 A V ALlAÇÃO DA PERFORMANCE DAS CÉLULAS IMOBILIZADAS NA PRODUÇÃO DE
XILITOL EM DIFERENTES SISTEMAS FERMENTATIVOS
Nesta etapa, três sistemas fermentativos foram utilizados para realizar a bioconversão
de xilcse em xilitol: frascos Erlenmeyer, reator de mistura e reator tipo cesta.
Excepcionalmente nestes experimentos, foi utilizado um hidrolisado proveniente de um lote
diferente. Este hidrolisado apresentou em sua composição (g/L): glicose (4.5), xílose (59.4),
arabinose (5.2), ácido acético (4.0), furfural (0.06) e hidróxi-metil-furfural (0.14).
Os frascos Erlenmeyer (125 mL), contendo 7.4 g de esferas com células imobilizadas
e 40 mL de meio de fermentação, foram mantidos em agitador rotatório a uma temperatura de
30 ºC e a uma agitação de 200 rpm por um período de 48 h.
O reator de mistura (2.4 L) (FIGURA 7), contendo 200 g de esferas com células
imobilizadas e 1.3 L de meio, foi operado a uma agitação de 500 rpm por um período de 60 h,
utilizando-se vazão de ar igual a 1. 7 L/min e temperatura igual a 30 ºC.
O reator tipo cesta (2.4 L) (FIGURA 8), contendo 200 g de esferas com células
imobilizadas e 1.3 L de meio, foi operado a uma agitação de 1300 rpm por um período de
72 h, utilizando-se vazão de ar igual a O.OI L/min e temperatura igual a 30 ºC.
: Erirada : deAr ... - .
~
~
o 4:l:mm
Sensores -----'~ Exaustão de
Gases
38
FIGURA 7: Representação esquemática do reator de mistura utilizado para a bioconversão de
xilose em xilitol.
o 00
•100
~·-·---·-·--···---·-·-···--,·······-··· ] Entrada+ _ i
de Ar
1-=l L::_J
Amostragem
O 4:lmm
-+ meio
Bomloe Peristálica
FIGURA 8: Representação esquemática do reator tipo cesta utilizado para a bioconversão de
xilose em xilitol.
39
Conforme ilustrado na FIGURA 8, o reator tipo cesta consistiu na adaptação de um
leito empacotado com células imobilizadas no centro da cuba do reator de mistura. Uma
bomba peristáltica foi utilizada para recircular o meio de fermentação através do leito
empacotado utilizando-se um fluxo de 350 mL/min.
4.4.2 IDENTIFICAÇÃO DOS PRINCIPAIS FATORES QUE INFLUENCIAM A PRODUÇÃO DE
XILITOL EM REATOR DE MISTURA
Nesta etapa, foram realizados 19 ensaios de fermentação, de acordo com a
metodologia de planejamento experimental (BOX et al., 1978), para a identificação dos
principais fatores/interações que influenciam a produção de xilitol no reator de mistura
ilustrado na FIGURA 7. Os efeitos das variáveis/ator de concentração do hidrolisado, vazão
de ar, agitação, concentração inicial de células e pH inicial do meio de fermentação
(variáveis independentes) sobre a produtividade e o rendimento da bioconversão de xilose em
xilitol (variáveis dependentes) foram avaliados através da realização de 16 ensaios de
fermentação, de acordo com um planejamento fatorial fracionado do tipo 2/-1. Três ensaios
nos níveis centrais das variáveis independentes foram adicionalmente realizados, de forma a
verificar a existência de curvatura significativa na região de estudo.
A TABELA 1 ilustra os valores reais das variáveis independentes avaliados nos
ensaios. Para a realização das análises estatísticas, estes valores foram codificados em níveis
(inferior, central e superior) de acordo com a equação:
(5)
Onde Vc é o valor codificado da variável independente, VR é o valor real da variável
independente, V0 é o valor real da variável independente no nível central e L1VR é a diferença
entre o valor real máximo e o valor real mínimo da variável independente (BOX et ai., 1978).
40
TABELA 1: Valores reais das variáveis independentes utilizados nos ensaios, de acordo com
um planejamento fatorial fracionado do tipo 2/-1
Variáveis Independentes Unidades Códigos Níveis
o +
Fator de cone. do hldrolisado A 3.0 4.0 5.0 Vazão de ar L/min B 1.30 1.95 2.60 Agitação rpm e 300 400 500 Cone. inicial de células g/L D 0.6 ± 0.1 l.O ± 0.1 l.4 ± 0.1 pH inicial do meio E 4.0 5.0 6.0
A TABELA 2 ilustra a matriz experimental do planejamento fatorial fracionado 2/-1,
com os níveis codificados das variáveis independentes testados em cada ensaio.
TABELA 2: Matriz experimental do planejamento fatorial fracionado do tipo 2/-1 utilizado
para a identificação dos principais efeitos I interações que influenciam a produção de xilitol
Ensaio A B e D E=+ABCD
OI + 02 +
03 +
04 + + +
05 +
06 + + +
07 + + +
08 + + +
09 +
10 + + +
11 + + +
12 + + +
13 + + +
14 + + +
15 -t- + +
16 + + + + +
17 o o o o o 18 o o o o o 19 o o o o o
41
As influências das variáveis independentes sobre as variáveis resposta (dependentes)
foram avaliadas de acordo com conceitos 'de estatística descritiva e multivariada, utilizando-se
os softwares Statgraphics plus 6.0 e Design Expert 5.0. A significância destas influências e da
existência de curvatura na região estudada foi avaliada por meio de análise de variância,
considerando-se como influências estatisticamente significativas aquelas que apresentaram
níveis de significância inferiores a 20 % (p < 0.20).
Considerando o padrão de superposição de efeitos do planejamento adotado, os efeitos
de interação de 3ª e 4ª ordem foram considerados desprezíveis para a realização das análises
estatísticas.
4.4.3 ELABORAÇÃO DE MODELOS EMPÍRICOS PARA PREDIÇÃO DA PRODUÇÃO DE
XILITOL EM REATOR DE MISTURA
Nesta etapa, o planejamento fatorial inicial foi composto em um planejamento de face
centrada, de acordo com a metodologia de superficie de resposta (BOX et ai., í 978), com a
finalidade de permitir a elaboração de modelos empíricos para predição das variáveis
dependentes produtividade e rendimento da bioconversão de xilose em xilitol. No total, foram
realizados 12 ensaios adicionais de fermentação dentro da região de estudo inicial conforme
ilustrado na TABELA 3, sendo 2 destes ensaios conduzidos nos níveis centrais das variáveis
independentes de forma a permitir a neutralização de possíveis efeitos causados pela
utilização de hidrolisados concentrados provenientes de lotes diferentes.
Os modelos empíricos foram elaborados através de ajuste aos dados experimentais
pelo método dos mínimos quadrados com o software Design Expert 5.0, de acordo com a
seguinte equação:
n n n-1 n
Yi=bo+í:.biXi+'J:.biiX:+'J:. í:.bijXiXj i=I i=I i=I j=i+I
(6)
42
Onde Y; representa a variável dependente, b0, b., b; e bu representam os coeficientes
de regressão, e X e~· representam as variáveis independentes.
TABELA 3: Matriz experimental utilizada para compor o planejamento fatorial fracionado
do tipo 2v5-' em face centrada
Ensaio A B e D E=+ABCD
20 o o o o 21 + o o o o 22 o o o o 23 o + o o o 24 o o o o 25 o o + o o 26 o o o o 27 o o o + o 28 o o o o 29 o o o o +
30 o o o o o 31 o o o o o
A significância dos coeficientes de regressão do modelo foi avaliada considerando-se
como coeficientes estatisticamente significativos aqueles que apresentaram níveis de
significância inferiores a 20 % (p < 0.20). A validação dos modelos obtidos foi feita levando-
se em consideração a significância estatística, a capacidade de predição, a falta de ajuste e a
análise gráfica dos resíduos. As superficies de resposta descritas por estes modelos foram
plotadas com o software Statistica 5.0.
4.4.4 AVALIAÇÃO DA ESTABILIDADE OPERACIONAL DO SISTEMA DE PRODUÇÃO DE
XILITOL EM REATOR DE MISTURA
Nesta etapa, a estabilidade operacional da produção de xilitol em reator de mistura foi
avaliada conduzindo-se a fermentação na modalidade de bateladas repetidas. Ao final de cada
batelada, as células imobilizadas foram reutilizadas como inóculo para a batelada seguinte.
43
Ao todo, foram realizadas 5 bateladas sucessivas de fermentação com duração de 120 h cada.
As fermentações foram conduzidas no reator de mistura (FIGURA 7), utilizando-se fator de
concentração do hidrolisado igual a 5.0, vazão de ar 1.30 L/min, agitação de 300 rpm,
concentração inicial de células de 1.4 g/L e pH inicial do meio de fermentação igual a 6.0.
4.4.4.1 Avaliação das Necessidades Nutricionais da Levedura para a Produção de
Xilitol na Modalidade de Bateladas Repetidas de Fermentação
Nesta etapa, a bioconversão de xilose em xilitol foi realizada em frascos Erlenmeyer
na modalidade de bateladas repetidas de fermentação, conforme ilustrado na TABELA 4.
TABELA 4: Planejamento experimental utilizado para avaliar as necessidades nutricionais da
levedura visando a produção de xilitol no modo de bateladas repetidas de fermentação
Ensaio Batelada Nutrientes Adicionados
A r SA,FA
2· SA,FA .. ·. -
3• SA,FA
B 1" SA, FA
SA,FA
e SA.FA
D FA
FA
FA
E r SA
AS
AS
2·
F
3"
SA: Sulfato de amônio; FA: Extrato de Farelo de Arroz;»: Sem adição de nutrientes
Os frascos Erlenmeyer ( 125 mL ), contendo 7. O g de esferas com células imobilizadas
44
e 43 mL de meio de fermentação, foram mantidos em agitador rotatório a uma temperatura de
30 ºC e a uma agitação de 200 rpm por um período de 96 h. Ao final de cada batelada, as
células imobilizadas foram reutilizadas como inóculo para a batelada seguinte. Utilizou-se
fator de concentração do hidrolisado, concentração inicial de células (na 1ª batelada) e pH
inicial do meio de fermentação iguais a 5.0, 1.4 e 6.0, respectivamente, para a realização
destes experimentos. Nos ensaios sem nutrientes, adicionou-se água esterilizada ao
hidrolisado - nas mesmas proporções dos nutrientes omitidos - de forma a manter a
concentração inicial de xilose constante.
4.5 MÉTODOS ANALÍTICOS
Todas as fermentações foram acompanhadas por meio do controle analítico de
amostras retiradas periodicamente. As observações foram feitas com relação ao consumo de
açúcares (glicose, xilose e arabinose) e ácido acético, produção de xilitol, crescimento celular,
e variação de pH. Os resultados destas determinações analíticas encontram-se descritos nos
Anexos 1 a 6.
4.5.1 DETERMINAÇÃO DAS CONCENTRAÇÕES CELULARES
Os precipitados formados durante a elaboração dos meios de fermentação, pela adição
dos nutrientes aos hidrolisados, foram removidos por meio de centrifugação a 2000 g por
20 min antes do início das fermentações.
As concentrações celulares foram determinadas por turbidimetria em
espectrofotômetro no comprimento de onda de 600 nm e correlacionadas com o peso seco de
células (g/L) através de curvas de calibração correspondentes. A fase líquida das amostras
retiradas durante as fermentações foi centrifugada a 2000 g por 20 min e as células foram re-
suspensas em água para a determinação das concentrações de células livres. Uma massa
conhecida (precisão de 0.01 g) de esferas de alginato de cálcio retiradas durante as
45
fermentações e previamente secas com papel absorvente foi dissolvida em citrato de potássio
2.0 % sob agitação em vórtex. A suspensão resultante foi centrifugada a 2000 g por 20 mine
as células foram re-suspensas em água para a determinação das concentrações de células
imobilizadas. A densidade das esferas de alginato de cálcio, considerada constante durante as
fermentações, foi de 1. O g/mL.
O crescimento celular foi considerado como concentração de células livres no meio de
cultivo (XM) e de células imobilizadas nas esferas de alginato de cálcio (X1), ou como
concentração celular total no reator (XR), conforme proposto por TA V ARES (1998). Para o
cálculo da concentração celular total no reator (XR), empregou-se o seguinte balanço material:
(7)
Onde VR é o volume do reator (L ), XR é a concentração celular total presente no reator
(g/L), Vi é o volume de esferas de gel (L), X1 é a concentração celular nas esferas de gel (g/L),
VM é o volume de meio de cultivo (L) e XM é a concentração celular no meio de cultivo (g/L).
A concentração de células livres no meio de fermentação (XM) e a concentração de
células imobilizadas nas esferas de alginato de cálcio (X1) foram relacionadas ao volume de
trabalho do reator (VR) utilizando-se as seguintes equações:
XRA1 = {XM VMIVR]
XRJ = [(X1 Vi)IVR}
(8)
(9)
Onde XRM é a concentração de células livres no reator (g/L) e XRI é a concentração de
células imobilizadas no reator (g/L). Assim, a soma das concentrações celulares no meio e
imobilizada, expressas em volume de reator, forneceu a concentração celular total em relação
ao volume de reator (XR), conforme a equação:
(10)
4.5.2 DETERMINAÇÃO DA ESTABILIDADE DAS ESFERAS DE ALGINATO DE CÁLCIO
A solubilização das esferas foi acompanhada com a finalidade de se estimar a
46
estabilidade da matriz de imobilização frente às condições operacionais empregadas. Foi feita
uma amostragem de 30 esferas, coletadas aleatoriamente no início e no final das
fermentações, para a determinação do diâmetro médio utilizando-se paquímetro com precisão
de 0.05 mm. Os valores de volume médio foram então calculados, considerando uma
geometria esférica constante durante as fermentações, de acordo com a seguinte equação:
V= [4/3 J[ (Dl2/J (11)
Onde V é o volume médio das esferas de alginato de cálcio (mnr') e D é o diâmetro
médio das esferas de alginato de cálcio (mm).
A solubilização das esferas de alginato de cálcio foi finalmente expressa como
percentagem de redução de volume, de acordo com a seguinte equação:
(12)
Onde R% é o percentual de redução do volume das esferas de alginato de cálcio
durante as fermentações (% ), Vo é o volume médio das esferas no início da fermentação
(mm') e VF é o volume médio das esferas no final da fermentação (mm').
4.5.3 DETERMINAÇÃO DO TEOR DE AÇÚCARES, XJLITOL, ÁCIDO ACÉTICO, FURFURAL
E HIDRÓXI-METIL-FURFURAL
A determinação destas substâncias foi realizada por cromatografia líquida de alta
eficiência. Para a análise do teor de açúcares, xilitol e ácido acético, foi utilizada uma coluna
BIO-RAD AMINEX HPX-87H (300 x 7,8 mm) e detector de índice de refração mantidos a
45 ºC, fase móvel H2S04 0,01 N, e fluxo de 0,6 mL/min. Após diluição apropriada, as
amostras foram filtradas em filtro Sep Pak Cl8 e 20 µL foram injetados no cromatógrafo.
Para a análise do teor de furfural e hidróxi-metil-furfural (HMF), foi utilizada uma coluna RP
18 (200 x 4,6 mm) mantida a 25 ºC e detector de ultravioleta em 276 nm, fase móvel
acetonítrila/água 1 :8 adicionada de 1 % de ácido acético, e fluxo de 0,8 mL/min. Após diluição
47
apropriada, as amostras foram filtradas em membrana Minisart e 20 µL foram injetados no
cromatógrafo.
4.5.4 DETERMINAÇÃO DO TEOR DE PRODUTOS DE DECOMPOSIÇÃO DA LIGNINA
O teor dos produtos de decomposição da lignina foi analisado através da quantificação
da lignina Klason solúvel em meio ácido, conforme proposto por ROCHA (2000).
Uma alíquota do hidrolisado foi alcalinizada até pH 12 pela adição de NaOH 6 M e
diluída com água destilada de forma a se obter uma leitura inferior a 1 unidade de
absorbância. A absorbância desta solução foi determinada num comprimento de onda de
280 nm utilizando-se água destilada como referência. A concentração de lignina foi calculada
por meio das equações seguintes, levando-se em consideração a normalização das
concentrações em função do fator de diluição utilizado.
CJJc = [4, 187 x 10·2 (AJJmso-ÀPD2Bo) - 3,279 x 10-4] (13)
(14)
Onde Cuc é a concentração de lignina Klason solúvel em meio ácido (g/L), Auc280 é a
absorbância da solução em 280 nm, CF e Cm.1F são as concentrações (g/L) de furfural e
hidróxi-metil-furfural determinadas por HPLC, e f:f· e &HMF são os coeficientes de extinção
(L/g cm) do furfural (146.85) e do hidróx.i-metil-furfural (114.00), determinados por
espectrofotometria em 280 nm.
4.5.5 DETERMINAÇÃO DOS PARÂMETROS FERMENTATIVOS
O percentual de células imobilizadas no reator (! %) foi determinado por meio da
equação:
1% = XRIIXR (15)
Onde 1% é o percentual de células imobilizadas no reator, XRI é a concentração de
células imobilizadas no reator (g/L) e XR é a concentração celular total no reator (g/L).
48
O percentual do consumo de xilose (S%) foi determinado por meio da seguinte
equação:
(16)
Onde S% é o percentual do consumo de xilose, So é a concentração inicial de xilose
(g/L) e SFé a concentração final de xilose (g/L).
O fator de rendimento da conversão de xilose em xilitol ( Yr,·s) foi determinado por
meio da seguinte equação:
Yl'/s = Pr/(So - SF) (17)
Onde Yp;s é o fator de rendimento da conversão de xilose em xilitol (g/g), Pr é a
concentração final de xilitol (g/L ), So é a concentração inicial de xilose (g/L) e Sr é a
concentração final de xilose (g/L).
A eficiência da bioconversão de xilose em xilitol (E%) foi determinada por meio da
seguinte equação:
E%= Yp;s/0.917 (18)
Onde E% é a eficiência da conversão de xilose em xilitol e Yp;s é o rendimento da
conversão de xilose em xilitol (g/g). Considerou-se, como valor teórico máximo de Yp;s, o
rendimento de 0.917 g/g proposto por BARBOSA et ai. (1988).
O fator de rendimento da conversão de glicose e xilose em células (Yxd foi
determinado por meio da seguinte equação:
Y X1C = (XRF - XRo)l(So - SF + Go) (19)
Onde Yx1c é o fator de rendimento da conversão de glicose e xilose em células (g/g),
XRF é a concentração celular total no reator (g!L ), XRo é a concentração celular total no reator
no início das fermentações (g/L ), So é a concentração inicial de xilose (g/L ), SF é a
concentração final de xilose (g/L) e Go é a concentração inicial de glicose (g/L).
A produtividade em xilitol (Qp) foi determinada por meio da seguinte equação:
49
Qp = Pp/t (20)
Onde Qp é a produtividade em xilitol (g/L h), PF é a concentração final de xilitol (g/L)
e t é o tempo decorrido durante a fermentação (h).
A produtividade específica em xilitol (qp) foi determinada por meto da seguinte
equação:
qr = Q/XR (21)
Onde qp é a produtividade específica em xilitol (g/g h), Qp é a produtividade em xilitol
(g/L h) e XR é a concentração celular total no reator (g/L).
A taxa do consumo de xilose (Qs) foi determinada por meio da seguinte equação:
Qs = (SF - So)/t (22)
Onde Qs é a taxa do consumo de xilose (g/ L h), SF é a concentração final de xilose
(g/L), S0 é a concentração inicial de xilose (g/L) e t é o tempo decorrido durante a
fermentação (h).
A taxa específica do consumo de xilose (qs) foi determinada por meio da seguinte
equação:
qs = Qs!XR (23)
Onde qs é a taxa específica do consumo de xilose (g/g h), Qs é a taxa do consumo de
xilose (g/L h) e XR é a concentração celular total no reator (g/L).
50
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 CARACTERIZAÇÃO PARCIAL DOS HIDROLISADOS OBTIDOS
O bagaço de cana, após secagem ao sol e determinação do teor de umidade, foi
submetido à hidrólise ácida. O hidrolisado obtido, cuja composição média é apresentada na
TABELA 5, apresentou um pH igual a 1.3.
TABELA 5: Caracterização parcial do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana obtido
após hidrólise ácida
Componente Concentração (g/L)
Glicose
Xilose
Arabinose
Ácido Acético
Furfura/
HMF
Lignina K/ason
1.4
22.2
1.8
2.6
0.15
0.03
2.6
Uma parte deste hidrolisado, suficiente para a realização dos ensaios do planejamento
inicial (item 4.4.2), foi concentrada utilizando-se fatores de concentração iguais a três, quatro
ou cinco vezes. Os hidrolisados obtidos apresentaram valores médios de pH iguais a 0.8, 0.6 e
0.5, respectivamente. A TABELA 6 ilustra a composição média destes hidrolisados.
Conforme pode ser observado nas TABELAS 5 e 6, os teores dos açúcares presentes
no hidrolisado original (hidrolisado não concentrado) aumentaram de maneira proporcional
aos fatores de concentração utilizados. Comportamento semelhante foi evidenciado com
relação ao teor de HMF, um dos inibidores normalmente encontrados em hidrolisados
lignocelulósicos. Com relação aos teores dos demais inibidores quantificados, verificou-se um
comportamento diferenciado dependendo do composto em questão. Enquanto a concentração
de furfural foi drasticamente reduzida, independentemente do fator de concentração, o teor de
ácido acético foi aumentado de maneira não proporcional ao fator de concentração quando o
51
hidrolísado foi concentrado três vezes. O aumento do fator de concentração para quatro e
cinco vezes não acarretou em maiores aumentos na concentração deste inibidor. Verificou-se
um aumento no teor dos produtos de decomposição da lignina de maneira proporcional ao
fator de concentração quando o hidrolisado foi concentrado três vezes. Diferentemente do
comportamento observado para o ácido acético, o aumento do fator de concentração para
quatro e cinco vezes levou a aumentos progressivos no teor dos produtos de decomposição da
lignina.
TABELA 6: Caracterização parcial dos hidrolisados hemicelulósicos de bagaço de cana
submetidos à concentração por fatores iguais a três (H3), quatro (H4) e cinco (H5)
Componente Concentração {g/L)
H3 84 Hs
Glicose 4.7 6.1 7.3 Xilose 64.6 85.5 105.8
Arabinose 6.4 8.6 10.4
Ácido Acético 4.1 4.3 .. 4.4 - - Furfural 0.02 0.02 0.03
HMF 0.1 l 0.14 0.17 Lignina Klason 7.3 9.0 IO.O
Durante a realização dos ensaios do planejamento inicial (item 4.4.2), foram retiradas
amostras dos hidrolisados antes da elaboração do meio de fermentação, após os
procedimentos de detoxificação e autoclavagem. A composição média destes hidrolísados é
apresentada na TABELA 7.
Conforme pode ser observado na TABELA 7, o tratamento empregado na
detoxificação do hidrolisado foi capaz de reduzir fortemente as concentrações dos inibidores
em todos os hidrolisados. Especificamente, o furfural e o HMF foram praticamente
eliminados dos hídrolisados, independentemente do fator de concentração. Apesar da
considerável redução nos teores dos produtos de decomposição da lignina em todos os
hidrolisados, resíduos destes compostos permaneceram em concentrações progressivamente
52
crescentes nos hidrolisados concentrados três, quatro e cmco vezes, respectivamente. Não
foram verificadas reduções nos teores de ácido acético após o tratamento, independentemente
do fator de concentração.
TABELA 7: Caracterização parcial dos hidrolisados hemicelulósicos de bagaço de cana
submetidos à concentração por fatores iguais a três (H3), quatro (Ha) e cinco (H5),
detoxificação e autoclavagem
Componente Concentração (g/L)
HJ H4 Hs
Glicose 4.3 5.8 6.5
Xüose 60.1 77.8 92.1
Arabinose 5.9 8.3 9.2
Ácido Acético 3.9 4.4 3.9
Furfural 0.00 0.00 0.01
HMF 0.00 O.OI O.OI
Lignina Klason 0.8 1.5 1.8
Um outro aspecto importante observado durante o tratamento destes hidrolisados foi a
tendência de perda dos açúcares presentes provocada pelo método de detoxificação.
Enquanto, no hidrolisado concentrado três vezes, não foram detectadas diferenças
estatisticamente significativas (p < O.OS) entre os teores dos açúcares antes e após o
procedimento de detoxificação, verificou-se redução no teor de xilose (9.0 %) do hidrolisado
concentrado quatro vezes e nos teores de glicose (11.0 %), xilose (13.0 %) e arabinose
(11.5 %) do hidrolisado concentrado cinco vezes após os procedimentos de detoxificação e
autocla vagem.
Para a realização dos ensaios de composição do planejamento inicial (item 4.4.3), uma
nova parte do hidrolisado original foi concentrada utilizando-se os mesmos fatores de
concentração da etapa anterior. A composição média dos hidrolisados concentrados é
apresentada na TABELA 8.
A comparação das composições médias entre os hidrolisados utilizados nos ensaios do
53
planejamento inicial (TABELA 6) e os hidrolisados utilizados nos ensaios de composição do
planejamento inicial (TABELA 8) mostrou diferenças significativas (p < 0.05) com relação
aos teores de arabinose, furfural e produtos de decomposição da lignina, embora a
composição do hidrolisado original (TABELA 5) tenha permanecido inalterada com relação a
todos os compostos quantificados. Verificou-se que os teores médios de arabinose, furfural e
produtos de decomposição da lignina foram maiores nos hidrolisados utilizados nos ensaios
de composição do planejamento inicial (TABELA 8). Com relação aos demais compostos
quantificados e aos valores de pH, não foram observadas diferenças estatisticamente
significativas.
TABELA 8: Caracterização parcial dos hidrolisados hemicelulósicos de bagaço de cana
submetidos a concentração por fatores iguais a três (H3), quatro Il-ía) e cinco (Hj)
Componente Concentração (g/L)
83 li4 Hs
Glicose 4.6 6.3 8.1
Xllose 62.7 84.8 106.4
Arabinose 8.1 12.0 13.5
Ácido Acético 4.1 3.9 4.0
Furfural 0.07 0.04 0.06
HMF 0.10 0.15 0.16
Lignina Klason 10.7 11.7 15.2
Acredita-se que as diferenças descritas no parágrafo anterior ( com relação aos teores
de arabinose, furfural e produtos de decomposição da lignina) possam estar relacionadas ao
tempo e à temperatura utilizados para a concentração do hidrolisado. Sabe-se que muitos dos
compostos presentes em hidrolisados hemicelulósicos são bastante reativos (FENGEL e
WEGENER, 1989), alguns deles podendo reagir entre si e formar outros compostos
dependendo da temperatura e do tempo de residência (P ALMQVIST e HAHN-HAGERDAL,
2000b). No presente estudo, utilizou-se um concentrador aquecido por vapor proveniente de
uma autoclave e, tanto a temperatura quanto o tempo de concentração não puderam ser
54
controlados precisamente.
Com a finalidade de neutralizar efeitos causados pela utilização de hidrolisados
concentrados provenientes de lotes diferentes, com conseqüente interferência na análise
estatística dos dados obtidos, dois ensaios (ensaios 30 e 31 - TABELA 3) foram
adicionalmente realizados nos níveis centrais das variáveis independentes durante a
composição do planejamento inicial, de forma a permitir uma distinção entre os efeitos reais
causados pelas variáveis em estudo e aqueles devidos ao uso de hidrolisados com
características distintas.
Para a avaliação da estabilidade operacional da produção de xilitol em reator de
mistura (item 4.4.4), uma nova parte do hidrolisado original foi concentrada utilizando-se um
fator de concentração igual a cinco vezes. A composição média do hidrolisado obtido, que
apresentou um valor médio de pH igual a 0.4, é apresentada na TABELA 9.
TABELA 9: Caracterização parcial do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana
submetido à concentração por fator igual a cinco
Componente Concentração (g/L)
Lignina Klason
8.5
106.3
11.3
4.7
0.02
0.15
14.0
Glicose
Xilose
Arabinose
Ácido Acético
Furfural
HMF
5.2 AVALIAÇÃO DA PERFORMANCE DAS CÉLULAS IMOBILIZADAS NA PRODUÇÃO DE
XILITOL EM DIFERENTES SISTEMAS FERMENTATIVOS
Nesta etapa, a bioconversão de xilose em xilitol pelas células imobilizadas nas esferas
de alginato de cálcio foi realizada utilizando-se três sistemas fermentativos diferentes: frascos
Erlenmeyer (EF), reator de mistura (STR) e reator tipo cesta (BSTR).
55
Conforme pode ser observado nas FIGURAS 9 - 11, verificou-se um crescimento
expressivo de célul_as livres no meio de fermentação em todos os três sistemas fermentativos,
caracterizando-os como mistos, sendo compostos por células imobilizadas e células livres. O
crescimento de células livres no meio de fermentação durante a produção de xilitol com
células imobilizadas em esferas de alginato de cálcio foi também observado em meio sintético
(Y AHASHI et al., 1996) e, previamente, em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana
(CARVALHO et ai., 2002c).
30-,-----------===---.-10 .-------· ::i' E!
6 x."' -----!::,. Q)
:E ------o 4 ><."'
8 25
20
- '><.'ii.
5 ==:::::=:::::::=======e 2 J ~e- -- º o o
o 12 24 36 Tempo (h)
48
FIGURA 9: Bioconversão de xilose em xilitol em frascos Erlenmeyer. Concentração de
células imobilizadas nas esferas de alginato de cálcio, X1 (•), e no reator, XRI (O);
concentração de células livres no meio de fermentação, XM (e), e no reator, XR!vt (O);
concentração celular total no reator, XR (.6).
De acordo com QUIRÓS et ai. ( 1995), a perda de células das esferas de alginato de
cálcio para o meio de fermentação ocorre naturalmente devido ao aparecimento de poros
semelhantes a crateras na superfície das esferas, determinado pelo crescimento das células
imobilizadas. Entretanto, conforme pode ser observado na TABELA 1 O, o menor percentual
de células imobilizadas no reator (1%) observado ao final da fermentação conduzida no
sistema STR sugere que a abrasão das esferas, resultante do contato direto com as turbinas de
agitação, contribuiu para o aumento na perda de células para o meio de fermentação.
A TABELA 1 O apresenta os resultados obtidos nos diferentes sistemas fermentativos
56
avaliados. Conforme pode ser observado, os sistemas EF e STR apresentaram resultados
semelhantes com relação à concentração, rendimento e produtividade ao final das
fermentações. Entretanto, as taxas específicas de consumo de xilose e produção de xilitol, que
alcançaram valores iguais a 0.152 g/g h e 0.082 g/g h, respectivamente, no sistema EF,
diminuíram para valores iguais a 0.082 g/g h e 0.047 g/g h, respectivamente, quando o
sistema STR foi empregado.
40
35
30
25
~ 20 .9 ),( 15
10
5
o o
. .....-----.-• !:, -----.6-- 8 6 ::i s
6 x."' D o-D G>
:!;
4 x."'
o 12 24 36
Tempo (h) 48 60
FIGURA 1 O: Bioconversão de xilose em xilitol em reator de mistura. Concentração de
células imobilizadas nas esferas de alginato de cálcio, X1 (•), e no reator, XRJ (O); ;
concentração de células livres no meio de fermentação, XM (e), e no reator, XRJ..f (O);
concentração celular total no reator, XR (.6).
De acordo com SPENCER-MARTINS (1994), a mudança para condições anaeróbias
pode alterar o mecanismo de transporte de xilose através da membrana plasmática de
leveduras, levando a uma menor taxa de entrada desta pentase para o interior das células.
Desta forma, tendo em vista os dados comentados no parágrafo anterior, acredita-se que uma
melhor transferência de oxigênio no sistema STR possa ter favorecido a formação de maiores
colônias de células imobilizadas na superficie das esferas de imobilização, limitando a
transferência de oxigênio para as células confinadas mais internamente. Em conseqüência, a
existência de possíveis zonas anaeróbias no interior das esferas de imobilização teria levado a
um decréscimo na taxa de transporte de xilose através da membrana plasmática das células
57
confinadas nestas zonas, explicando as reduções nas taxas específicas de consumo de xilose e
de produção de xilitol.
TABELA 10: Performance dos sistemas fermentativos empregados na bioconversão de xilose
em xilitol
Sistema Fermentativo EF" STR6 BSTR6
PF(g/L) 21.0 23.5 15.0
Qp (g/L h) 0.44 0.39 0.21
qp (glg h) 0.082 0.047 0.043
Yp1s (glg) 0.54 0.58 0.46
Qs(g/L h) 0.82 0.68 0.45
qs (glg b) 0.152 0.082 0.092
1% (-) 0.70 0.62 0.69
s% <-> 0.90 0.89 0.71
Yx;c(glg) 0.089 0.149 0.089
ª: So = 43.4 g/L; XRo = 1.6 g/L : So = 45.5 g/L; XRo = 1. 7 gil
Foi observada uma redução de 10.7 % (p < O.OS) no volume médio das esferas de
alginato de cálcio durante a fermentação conduzida no sistema STR. De acordo com BARON
et ai. (1996), a adaptação de uma cesta no centro da cuba do reator de mistura, de forma a
conter um leito empacotado com células imobilizadas, permite a manutenção da integridade
do suporte de imobilização e oferece vantagens sobre a utilização de reatores de leito
empacotado tradicionais. De fato, reatores tipo cesta (BSTR) contendo células imobilizadas
em esferas de alginato de cálcio foram utilizados com sucesso na produção de etanol
(GAMARRA et al., 1986; TAVARES, 1998) e ácido lático (ABELYAN e ABELYAN,
1996). No presente estudo, entretanto, a configuração do reator tipo cesta utilizado não
produziu resultados satisfatórios na produção de xilitol. Conforme pode ser observado na
TABELA 10, uma produção de 15.0 g/L foi observada no sistema BSTR após 72 h de
fermentação, resultando em uma produtividade de apenas 0.21 g/L h. ROCA et ai. (1996), por
exemplo, utilizando um reator de leito empacotado tradicional na produção de xilitol em
58
modo contínuo de fermentação, obtiveram excelentes resultados em termos de rendimento
(1.03 g/g) e produtividade (5.80 g/L h), mesmo levando em consideração o fato de terem
utilizado um meio de fermentação preparado com xilose comercial ao invés de hidrolisado
hemicelulósico.
30~-------------~10
o 12 24 36 48 Tempo (h)
60 72
FIGURA 11: Bioconversão de xilose em xilitol em reator tipo cesta. Concentração de células
imobilizadas nas esferas de alginato de cálcio, X1 (•), e no reator, XRI (O); concentração de
células livres no meio de fermentação, XM {9), e no reator, )ú<ii1 (O); concentração celular
total no reator, XR (..6.).
A FIGURA 11 apresenta os perfis de crescimento das células imobilizadas e livres
durante a fermentação no sistema BSTR. Diferentemente dos perfis observados nos sistemas
EF (FIGURA 9) e STR (FIGURA 1 O), as esferas de a1ginato de cálcio se tornaram
aparentemente repletas de células apenas após 60 h de fermentação, sugerindo limitações na
transferência de oxigênio e nutrientes até as células imobilizadas. Além disso, foi necessário o
uso de uma agitação demasiadamente elevada para manter as células livres homogeneamente
suspensas no meio de fermentação. Devido à elevada relação entre altura e diâmetro da cuba
do reator e ao fato de que a cesta foi adaptada logo acima da turbina de agitação, uma baixa
eficiência de mistura foi observada na parte superior da cuba, mesmo utilizando-se uma
agitação de 1.300 rpm. Abaixo desta velocidade, verificou-se grande heterogeneidade no
59
padrão de mistura ao longo da cuba e as células livres, presentes no meio de fermentação,
tenderam a aderir nas paredes superiores da cuba e da cesta, interrompendo a bioconversão de
xilose em xilitol.
Além das desvantagens mencionadas no parágrafo anterior, um outro aspecto
importante observado durante a realização da fermentação no sistema BSTR foi a dificuldade
em se manter condições de assepsia durante a transferência das esferas contendo as células
imobilizadas para o reator.
5.2.1 COMPARAÇÃO DOS RESULTADOS C_OM DADOS DA LITERATURA
A TABELA 11 apresenta dados reportados na literatura sobre o uso de células
imobilizadas em alginato de cálcio para a produção de xilitol em meios sintéticos e
hidrolisados hernicelulósicos.
TABELA 11: Dados reportados na literatura sobre o uso de células imobilizadas em esferas
de alginato de cálcio para a produção de xilitol em meios sintéticos e hidrolisados
hemicelulósicos
Modo de Tipo de Tipo de So PF Qp Yp1s Referência
Operação Meio Reator (g/L) (g/L) (g/L b) (glg)
Leito Roca et al. Contínuo Sintético 50 16.0 5.80 1.03
Empacotado (1996)
Frascos Yahashi et Batelada Sintético 170 86.2 2.16 0.50
Erlenmeyer ai. (1996)
Batelada Frascos 37.6ª 0.31ª 0.37ª Domínguez Sintético 120
94.3b l.97b 0.74b Repetida Erlenmeyer (1998)
Frascos Domínguez Batelada Eucalipto 12 3.4 0.02 0.50
Erlenmeyer et ai. (1999)
Batelada Bagaço de Frascos 23.8ª 0.50ª 0.49ª Carvalho et 50
27.6b 0.58b 0.56b Repetida Cana Erlenmeyer al. (2002b)
ª: Primeira batelada : Quinta batelada
Conforme pode ser observado na TABELA 11, é notável que o uso de meios de
fermentação preparados com xilose comercial (Y AHASHI et al., 1996; DOMÍNGUEZ, 1998)
60
em lugar de hidrolisados hemicelulósicos propiciou a obtenção de valores de concentração
final e produtividade em xilitol pelo menos quatro vezes superiores àqueles obtidos nos
sistemas EF e STR (TABELA 1 O). Estes incrementes na produção de xilitol podem ser
atribuídos às maiores concentrações de xilose presentes no meio ao início das fermentações e
à ausência dos compostos inibidores normalmente encontrados em hidrolisados.
Com relação aos valores de rendimento em xilitol, os valores obtidos nos sistemas EF
e STR (TABELA l O) foram comparáveis àqueles obtidos em meios preparados com xilose
comercial (TABELA 11 ). Exceção a este comportamento foi observada somente durante o
uso de uma cepa de Saccharomyces cerevisiae geneticamente modificada, que resultou em
rendimento de 1.03 g/g (ROCA et ai., 1996). Neste contexto, vale ressaltar que a reciclagem
das células imobilizadas em sistemas de bateladas repetidas de fermentação acarretou em
aumentos no rendimento em xilitol tanto em meio preparado com xilose · comercial
(DOMÍNGUEZ, 1998) quanto em meio preparado com hidrolisado de bagaço de cana
(CARVALHO et ai., 2002b ), conforme pode ser verificado na TABELA 11.
5.3 IDENTIFICAÇÃO DOS PRINCIPAIS FATORES QUE INFLUENCIAM A PRODUÇÃO DE
XILITOL EM REATOR DE MISTURA
Nesta etapa, a bioconversão de xilose em xilitol pelas células imobilizadas nas esferas
de alginato de cálcio foi realizada em reator de mistura (STR), variando-se as seguintes
condições de cultivo: fator de concentração do hidrolisado, vazão de ar, agitação,
concentração inicial de células e pH inicial do meio de fermentação.
Os parâmetros fermentativos determinados após 72 h de fermentação empregando-se
as diferentes condições para o cultivo das células (item 4.4.2.) são apresentados na TABELA
12. Conforme pode ser observado, a combinação dos níveis das variáveis independentes
( condições de cultivo) acarretou em mudanças bruscas no comportamento da levedura
Candida guilliermondii. Especificamente com relação à produção de xilitol, os melhores
61
valores de concentração final (PF = 27.9 g/L), produtividade (Qr = 0.39 g/L h) e rendimento
(Yp;s = O. 79 g/g) foram obtidos no ensaio 1 O. Neste ensaio, foram utilizados os níveis
superiores de fator de concentração do hidrolisado (5.0), concentração inicial de células
(1.4 g/L) e pH inicial do meio (6.0) aliados aos níveis inferiores de vazão de ar (1.30 L/min) e
agitação (300 rpm).
TABELA 12: Parâmetros fermentativos determinados após 72 h de fermentação
Pr Q,, Yp1s YX!c XRI XRM XR /% Ensaio
(g/L) (g/L.h) (glg) (glg) (g/L) (g/L) (glL) (-)
01 21.1 0.29 0.60 0.10 1.8 2.9 4.7 0.38
02 3.3 0.05 0.43 0.09 1.2 0.6 1.8 0.67
03 11.3 0.16 0.58 0.18 1.9 2.9 4.8 0.40
04 16.9 0.24 0.68 0.29 2.6 6.2 8.8 0.30
05 17.4 0.24 0.66 0.16 1.8 3.5 5.3 0.34
06 14.1 0.20 0.54 0.33 3.1 8.1 11.2 0.28
07 6.0 0.08 0.32 0.47 4.6 6.2 10.8 0.43
08 7.5 0.10 0.28 0.24 2.4 5.9 8.3 0.29
09 7.1 0.10 0.59 0.12 2.3 0.9 3.2 0.72
10 27.9 0.39 0.79 0.11 3.3 2.6 5.9 0.56
11 15.1 0.21 0.46 0.30 4.0 8.2 12.2 0.33
12 9.5 0.13 0.50 0.14 2.8 2.1 4.9 0.57
13 9.8 0.14 0.37 0.43 4.1 10.1 14.2 0.29
14 9.4 0.13 0.50 0.14 3.1 1.5 4.6 0.67
15 12.9 0.18 0.38 0.28 3.4 8.7 12.1 0.28
16 23.6 0.33 0.44 0.24 3.9 11.7 15.6 0.25
17 22.9 0.32 0.64 0.19 2.4 6.2 8.6 0.28
18 19.5 0.27 0.51 0.18 2.6 6.2 8.8 0.30
19 25.2 0.35 0.57 0.15 2.6 6.0 8.6 0.30
Com relação aos demais parâmetros fermentativos quantificados, observou-se que o
fator de rendimento da conversão de glicose e xilose em células (Yx;tc) variou entre 0.09 e
0.47 g/g, a concentração de células imobilizadas no reator (XRI) variou entre 1.2 e 4.6 g/L, a
concentração de células livres no reator (XRM) variou entre 0.6 e 11. 7 g/L, a concentração
celular total no reator (XR) variou entre 1. 8 e 15. 6 g/L, e o percentual de células imobilizadas
62
no reator (]%) variou entre 25 e 72 %, dependendo das condições de cultivo empregadas.
Utilizando-se a metodologia de planejamento de experimentos, foram quantificados os
efeitos principais e de interações entre 2 fatores que influenciam a produtividade (Qp) e o
rendimento (Jp s) da bioconversão.
A TABELA 13 ilustra os níveis de significância estatística dos efeitos principais e de
interações entre 2 fatores sobre a resposta produtividade (Qp ), enquanto a TABELA 14 ilustra
os níveis de significância estatística dos efeitos principais e de interações entre 2 fatores sobre
a resposta rendimento (Yp;s). Efeitos que apresentaram valor de t calculado inferior a 1.0
foram excluídos previamente à análise de variância.
TABELA 13: Análise de variância dos efeitos principais e de interações entre 2 fatores sobre
a produtividade (Qp)
Efeito GL SQ MQ Fc:a1c p
A 01 0.0018 0.0018 0.94 0.3664
e 01 0.0018 0.0018 0.94 0.3664
D 01 0.0039 0.0039'·· 2.02 .. 0.1854
E 01 0.0390 0.0390 20.19 0.0012
AD 01 0.0176 0.0176 9.09 0.0130
AE 01 0.0315 0.0315 16.31 0.0024
CE 01 0.0218 0.0218 11.26 0.0073
Curvatura 01 0.0412 0.0412 21.33 0.0010
Erro total 10 0.0193 0.0019
Total 18 0.1779
GL: graus de liberdade; SQ: soma quadrática; MQ: média quadrática; A: fator de concentração do hidrolisado; C: agitação; D: concentração inicial de células; E: pH inicial do meio de fermentação R2: 0.89
Conforme pode ser observado na TABELA 13, a concentração inicial de células
(p < 0.20) e o pH inicial do meio de fermentação (p < O.OI) influenciaram significativamente
a produtividade em xilitol no sistema em estudo. Além disso, a interação entre o fator de
concentração do hidrolisado e a concentração inicial de células (p < 0.05), a interação entre o
fator de concentração do hidrolisado e o pH inicial do meio de fermentação (p < 0.01) e a
63
interação entre a agitação e o pH inicial do meio de fermentação (p < O.OI) se mostraram
providas de significância estatística, influenciando a produtividade em xilitol.
Conforme pode ser observado na TABELA 14, a vazão de ar (p < O.OI), a agitação
(p < O.OI) e o pH inicial do meio de fermentação (p < 0.20) influenciaram significativamente
o rendimento em xilitol no sistema em estudo. Além disso, a interação entre o fator de
concentração do hidrolisado e a concentração inicial de células (p < O. O l ), a interação entre o
fator de concentração do hidrolisado e o pH inicial do meio de fermentação (p < 0.01), a
interação entre a vazão de ar e a agitação (p < 0.05) e a interação entre a agitação e o pH
inicial do meio de fermentação (p < 0.05) se mostraram providas de significância estatística,
influenciando o rendimento em xilitol.
TABELA 14: Análise de variância dos efeitos principais e de interações entre 2 fatores sobre
o rendimento ( f p;s)
Efeito GL SQ MQ F.,..k p -·-··
- !il;..I~" --
A 01 0.0016 0.0016 0.79 0.4098
B OI 0.0400 0.0400 19.70 0.0022
e 01 0.0756 0.0756 37.25 0.0003
D 01 0.0006 0.0006 0.31 0.5999
E OI 0.0064 0.0064 3.15 0.1137
AD OI 0.0306 0.0306 15.08 0.0046
AE 01 0.0841 0.0841 41.42 0.0002
BC 01 0.0110 0.0110 5.43 0.0481
CE 01 0.0182 0.0182 8.98 0.0172
Curvatura OI 0.0101 0.0101 4.99 0.0559
Erro total 08 0.0162 0.0020
Total 18 0.2946
GL: graus de liberdade; SQ: soma quadrática; MQ: média quadrática; A: fator de concentração do hidrolisado; B: vazão de ar; C: agitação; D: concentração inicial de células; E: pJJ inicial do meio de fermentação R2: 0.95
D'e acordo com a teoria de planejamento de experimentos (BOX et ai., 1978), a
existência de interações significativas entre 2 ou mais fatores cujos efeitos principais não são
significativos não é plausível. Desta forma, com base nos dados apresentados nas TABELAS
64
13 e 14, experimentos adicionais para confirmar ou refutar a significância estatística dos
efeitos principais do fator de concentração do hidrolisado, da agitação e da concentração
inicial de células se mostraram necessários, uma vez que estas variáveis estavam envolvidas
em interações estatisticamente significativas. A existência de curvaturas significativas para as
duas respostas, indicando que possíveis modelos quadráticos seriam mais adequados para se
ajustarem aos dados experimentais, também apontou para a necessidade da realização de
experimentos adicionais.
De uma maneira geral, com base nos dados apresentados nas TABELAS 13 e 14, a
única conclusão tirada a respeito do sistema em estudo com os resultados dos 19 ensaios
iniciais foi que a vazão de ar não influenciou a produtividade. Nem o seu efeito principal nem
nenhuma das interações em que esta variável estava envolvida apresentou um valor de t
calculado superior a 1. O previamente à análise de variância.'
Apesar do planejamento fracionado empregado no presente estudo apresentar
resolução V e, portanto, dos efeitos de interação entre 2 fatores estarem confundidos com
efeitos de interação entre 3 fatores, a interpretação dos resultados em termos de interações
entre 2 fatores ( assumindo-se que as interações entre 3 fatores poderiam ser desprezadas) para
as duas respostas (produtividade e rendimento) se mostrou coerente com a literatura. Mais que
isso, estas interações evidenciaram claramente a influência determinada pelos compostos
inibidores, gerados durante a fase de hidrólise ácida, sobre a atividade fermentativa dos
microrganismos. Apesar de detoxificados, os hidrolisados apresentaram ainda alguns
compostos inibidores em suas composições, conforme apresentado na TABELA 7. A
interpretação das interações entre 2 fatores sugeriram a possibilidade de minimização das
influências negativas determinadas por estes inibidores residuais sobre a atividade
fermentativa dos microrganismos através do ajuste das condições de cultivo.
A FIGURA 12 apresenta os valores preditos para produtividade (a) e rendimento (b),
65
em função do fator de concentração do hidrolisado e da concentração inicial de células.
Conforme pode ser observado, a maior produtividade (0.24 g/L.h) e o maior rendimento (0.56
g/g) são obtidos quando se utiliza os níveis superiores de concentração inicial de células
(1.4 g/L) e fator de concentração do hidrolisado (5.0).
~ ~
B ~ !:!!
~ ~ ~ ~ " = 1.4 .. 1.4 = :.; :-.; o u o
"O u -;;; "O
ºõ ~ :s .s .5 o o "" o- "" .. E! ~ o-
B ~ J:, .. s 0.6 J:, 0.6 e o u e o o e o o
J.O 5.0 u 3.0 5.0
fator de concentração do hidrolisado Fator de concentração do hidrolísado
(a) (b)
FIGURA 12: Valores preditos para a produtividade (a) e rendimento (b), em função do fator
de concentração do hidrolisado e da concentração inicial de células.
Ao se trabalhar com hidrolisado concentrado três vezes, a elevação da concentração
celular inicial de 0.6 g/L para 1.4 g/L acarreta em decréscimos na produtividade e no
rendimento. Por outro lado, ao se trabalhar com hidrolisado concentrado cinco vezes, a
mesma elevação na concentração celular inicial favorece a bioconversão de xilose em xilitol,
aumentando em 60 % a produtividade e em 17 % o rendimento.
De acordo com os dados apresentados na FIGURA 12, o aumento na concentração
inicial de células é um procedimento que contribui para aliviar os efeitos negativos
determinados pela maior concentração de compostos inibidores presentes no hidrolisado mais
concentrado. De fato, melhoras na produtividade e no rendimento em xilitol devido à
utilização de inóculos mais concentrados foram também observadas quando se cultivou a
levedura Candida guilliermondii em hidrolisados de eucalipto (FELIPE et al., 1996a), bagaço
de cana (FELIPE et al., l 997b) e palha de arroz (SILVA e ROBERTO, 1999). De acordo com
P ARAJÓ et ai. (1998c ), o aumento da concentração inícial do inóculo favorece a produção de
66
xilitol em hidrolisados hemicelulósicos limitando a morte celular causada pela assimilação
dos inibidores presentes (P ARAJÓ et al., l 998c).
A FIGURA 13 apresenta os valores preditos para produtividade (a) e rendimento (b),
em função do fator de concentração do hidrolisado e do pH inicial do meio de fermentação.
Conforme pode ser observado, a maior produtividade (0.29 g!L.h) e o maior rendimento
(0.61 g/g) são obtidos quando se utiliza os niveis superiores de pH inicial do meio (6.0) e
fator de concentração do hidrolisado (5.0).
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o 4.0 :s :ê - :r: ~ e.. 3.0 5.0 3.0 5.0
Fator de concentração do hidrolisado Fator de concentração do hidroliaado
(a) (b)
FIGURA 13: Valores preditos para a produtividade (a) e rendimento (b), em função do fator
de concentração do hidrolisado e do pH inicial do meio de fermentação.
Ao se trabalhar com hidrolisado concentrado três vezes, a elevação do pH inicial do
meio de 4.0 para 6.0 praticamente não influencia a produtividade além de acarretar em
redução no rendimento. Por outro lado, a mesma elevação de pH em um meio preparado com
hidrolisado concentrado cinco vezes determina um aumento de 190 % na produtividade e de
cerca de 42 % no rendimento.
De acordo com os dados apresentados na FIGURA 13, o aumento do pH inicial do
meio de fermentação também ajuda a aliviar os efeitos negativos determinados pela maior
concentração de inibidores presentes no hidrolisado mais concentrado. Os efeitos
determinados pelo pH inicial do meio de fermentação sobre a atividade fermentativa dos
microrganismos podem ser explicados em função da toxicidade do ácido acético, uma vez que
67
a alteração do pH entre 4.0 e 6.0 não é suficiente para alterar a toxicidade dos derivados da
lignina (Fengel e Wegener, 1989). O efeito inibitório do ácido acético é dependente do grau
de dissociação, sendo que a variação do pH do meio entre 4.0 e 6.0 influencia o percentual de
moléculas presentes na forma não dissociada (P ALMQVIST e HAHN-HAGERDAL, 2000b ).
As moléculas não dissociadas difundem-se através da membrana citoplasmática,
determinando decréscimos no pH intracelular para valores inferiores aos limites fisiológicos e
alterando a homeostase intracelular (LOHMEIER-VOGEL et ai., 1998). Desta forma, ao
elevar o pH inicial do meio de fermentação, o percentual de moléculas na forma não
dissociada é reduzido, minimizando assim o efeito deste tipo de inibidor no metabolismo
microbiano.
Por outro lado, conforme pode ser observado na TABELA 7, não foram detectadas
diferenças significativas com relação aos teores médios de ácido acético entre os hidrolisados
concentrados três, quatro e cinco vezes, após detoxificação e autoclavagem. Como a elevação
do pH inicial do meio de fermentação de 4.0 para 6.0 no hidrolisado concentrado três vezes
praticamente não influenciou a produtividade, além de ter acarretado em decréscimo no
rendimento, acredita-se que a maior concentração de produtos de decomposição da lignina
presente no hidrolisado concentrado cinco vezes (TABELA 7) tenha potencializado a ação
inibitória do ácido acético, realçando o efeito determinado pela elevação do pH inicial do
meio de fermentação. Desta forma, os dados apresentados na FIGURA 13 confirmam a teoria
de P ARAJÓ et ai. ( 1998c ), segundo a qual o potencial inibitório de um dado composto não
pode ser estabelecido de uma forma geral, uma vez que depende da presença simultânea de
outros inibidores e de suas respectivas concentrações.
A FIGURA 14 apresenta os valores preditos para produtividade (a) e rendimento (b),
em função do pH inicial do meio de fermentação e da agitação. Conforme pode ser observado,
a maior produtividade (0.28 g/L.h) e o maior rendimento (0.63 g/g) são obtidos quando se
68
utiliza o nível inferior de agitação (300 rpm) e o nível superior de pH inicial do meio (6.0).
Enquanto ao se trabalhar com uma agitação de 500 rpm, a elevação do pH inicial do
meio de 4.0 para 6.0 praticamente não influencia a produtividade e o rendimento, a mesma
elevação de pH em uma fermentação conduzida com uma agitação de 300 rpm determina um
aumento de aproximadamente 155 % na produtividade e de aproximadamente 21 % no
rendimento.
o .. e- ~ ê 6.0 .s o
"O o ·.; E o -e -;; ·e:; ~ :s 4.0 ~
o .... "" !! j 6.0
o -e o ·.; E o -e
300 500 300 500
Velocidade de agitação (rpm) Velocidade de agitação (rpm)
(a) (b)
FIGURA 14: Valores preditos para a produtividade (a) e rendimento (b), em função do pH
inicial do meio de fermentação e da velocidade de agitação.
! -. -
De acordo com os dados apresentados na FIGURA 14, o aumento da agitação (e
conseqüentemente da taxa de transferência de oxigênio para o meio de cultivo) praticamente
anula os ganhos em produtividade e rendimento obtidos quando se eleva o pH inicial do meio
em fermentações conduzidas com menores velocidades de agitação. Estando o efeito do pH
inicial do meio relacionado com a toxicidade do ácido acético, conforme discutido
previamente, é também plausível associar o efeito da taxa de transferência de oxigênio para o
meio de cultivo com a toxicidade provocada por este ácido fraco. De fato, P ARAJÓ et ai.
( 1997) verificaram que o ácido acético foi consumido mais rapidamente em condições de
maior aeração, sendo o potencial tóxico deste composto reduzido como conseqüência.
FELIPE et ai. (1997a) também observaram efeito semelhante na atividade fermentativa da
levedura Candida guilliermondii FTI 20037. No presente estudo, também se verificou uma
69
maior velocidade média de consumo do ácido acético nos ensaios nos quais se utilizou uma
maior velocidade de agitação. Entretanto, apesar da utilização de uma maior taxa de
transferência de oxigênio favorecer o consumo de ácido acético, resulta em menores valores
de produtividade e rendimento, conforme pode ser observado na FIGURA 14.
A FIGURA 15 apresenta os valores preditos para rendimento, em função da vazão de
ar e da velocidade de agitação. Conforme pode ser observado, o maior rendimento (0.60 g/g)
é obtido quando se utiliza os níveis inferiores de vazão de ar (1.30 L/min) e de velocidade de
agitação (300 rpm).
.52.60 ~ ~ J:
1.30
300 500
Velocidade de agitação (rpm)
FIGURA 15: Valores preditos para rendimento, em função da vazão de ar e da velocidade de
agitação.
Independentemente da vazão de ar empregada, o aumento da velocidade de agitação
acarreta em decréscimos no rendimento. Enquanto o aumento na agitação de 300 rpm para
500 rpm em fermentação conduzida com vazão de ar igual a 1.30 L/min leva a um decréscimo
de cerca de 13 % no rendimento, o mesmo aumento na agitação quando a fermentação é
conduzida utilizando-se vazão de ar igual a 2.60 L/min provoca redução de aproximadamente
35 % no rendimento.
Com base no exposto, fica claro que as interações que se mostraram providas de
significância estatística, influenciando a produtividade e o rendimento da bioconversão, foram
consideradas plausíveis e coerentes com a literatura. Entretanto, para uma interpretação final
dos dados obtidos, a realização de experimentos adicionais se mostrou necessária não somente
70
para confirmar ou refutar a significância dos efeitos principais de variáveis envolvidas em
interações significativas, mas também para se obter dados suficientes para a elaboração dos
modelos quadráticos sugeridos pela existência de curvaturas significativas.
Para a realização dos experimentos adicionais, o planejamento inicial foi composto em
um planejamento de face centrada com todas as variáveis independentes. Optou-se por este
tipo de planejamento porque a ampliação da região de estudo por meio da composição do
planejamento inicial em um planejamento rotacional (a = ± 2.0) ou ortogonal (a = ± 2.25)
apresentaria problemas devido à necessidade de utilização de valores de pH inicial do meio
iguais ou superiores a 7. O (inativação da penicilina empregada para o controle de
contaminantes) e à necessidade de emprego de fatores de concentração do hidrolisado iguais
ou superiores a 6.0 (perda de xilose durante o tratamento de detoxificação).
5.3.1 COMPARAÇÃO DOS RESULTADOS COM DADOS DA LITERATURA
Conforme mencionado previamente, os melhores valores de concentração final,
produtividade e rendimento foram obtidos no ensaio 1 O, utilizando-se os níveis superiores de
fator de concentração do hidrolisado, concentração inicial de células e pH inicial do meio
aliados aos níveis inferiores de vazão de ar e agitação.
Todas as análises estatísticas foram realizadas considerando-se o tempo de 72 h de
fermentação como referência, uma vez que alguns ensaios tiveram que ser finalizados neste
tempo por problemas de contaminação. No caso específico do ensaio 10, foi possível conduzir
a fermentação até 120 h. A TABELA 15 apresenta os parâmetros fermentativos determinados
para este ensaio nos tempos de 72 e 120 h.
Conforme pode ser observado na TABELA 15, foi possível prolongar a fermentação
até 120 h, maximizando o consumo de xilose e a concentração de xilitol no caldo fermentado,
sem provocar prejuízos nos valores de rendimento e produtividade. Entretanto, verificou-se
uma redução nas velocidades específicas de consumo de xilose (15.7 %) e de produção de
71
xilitol ( 18.2 % ), sugerindo limitação de algum nutriente ( como oxigênio, por exemplo) ou
algum outro problema de transferência de massa, que pode ter sido determinado pelo aumento
da concentração celular no reator e/ou pela redução do teor de xilose no meio de fermentação.
TABELA 15: Parâmetros fermentativos determinados nos tempos de 72 e 120 h de
fermentação. Condições de cultivo: fator de concentração do hidrolisado (5.0), vazão de ar
(1.30 L/min), agitação (300 rpm), concentração inicial de células (1.4 g/L), pH inicial do meio
(6.0)
Parâmetros Fermentativos Tempo de Fermentação (b)
72 120
27.9 47.9
0.39 0.40
0.066 0.054
0.79 0.77
0.86 0.84
0.49 0.52
0.083 0.070
0.48 0.84
3.3 3.3
2.6 4.1
5.9 7.4
0.56 0.45
0.ll 0.09
PF(g{L)
Qp (g/L h)
qp (g/g h)
Yp;s (g/g)
E%(-)
Qs (gfL h)
qs (gfg h)
S%(-)
Xiu (g{L)
XRM (g/L)
XR (g/L)
]% (-)
Yx;c(gfg)
So = 74.3 g!L; XRo = 1.5 gil
A TABELA 16 ilustra alguns resultados obtidos através do cultivo da levedura
Candida guilliermondii em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana, utilizando-se
diferentes sistemas de fermentação e modos de operação. Conforme pode ser observado,
embora hidrolisados com concentrações similares de xilose tenham sido utilizados no início
destes experimentos, grandes variações na concentração, produtividade e rendimento em
xilitol foram obtidas ao final das fermentações. A utilização do reator de mistura no modo de
batelada (SILVA et ai., 1997) permitiu a obtenção dos melhores valores de concentração
(41.8 g/L) e produtividade (0.87 g/L h) aliados a um bom rendimento em xilitol (0.67 g/g),
72
com a vantagem adicional de requerer um inóculo consideravelmente pequeno (0.5 g/L). O
maior valor de rendimento em xilitol (O. 79 g/g) foi observado durante o emprego do reator de
mistura em modo semicontínuo (RODRIGUES et al., 1998), enquanto o menor valor de
concentração obtido (18.0 g/L) foi observado quando se utilizou o reator de mistura em modo
contínuo de operação (MARTINEZ et ai., 2003). A reutilização das células imobilizadas em
um sistema de bateladas repetidas de fermentação determinou aumentos de aproximadamente
15 % nos valores de concentração, produtividade e rendimento em xilitol após a primeira
batelada da série de repetições (CARVALHO et al., 2002b). Apesar da melhora na produção
de xilitol observada pela reutilização dos biocatalisadores imobilizados, os valores de
concentração, produtividade e rendimento em xilitol foram ainda inferiores àqueles
observados quando se empregou um sistema de fermentação semelhante (frascos
Erlenmeyer ), porém com células livres em suspensão (FELIPE et al., 1997b ).
TABELA 16: Dados reportados na literatura sobre a produção de xilitol em hidrolisados
hemicelulósicos de bagaço de cana com a levedura Candida guilliermondii FTI 20037
Modo de Tipo de XRo So PF Q,, Yprs Referência
Operação Reator (g/L) (g/L} (g/L) (g/L h) (glg)
Frascos Felipe et ai. Batelada 3.0 54.5 34.4 0.75 0.74
Erlenmeyer (1997b)
Silva et ai. Batelada STR 0.5 62.1 41.8 0.87 0.67
(1997)
Semi l.Ob 62.lb 34.0b 0.65b 0.79b
Rodrigues STR
Contínuo et al. (1998)
Martinez et Contínuo STR 0.5 51.0 18.0 0.68 0.69
al. (2003)
Semi Frascos 1.0ª 23.8ª 0.50ª 0.49ª Carvalho et . 50.0 Continuo Erlenmeyer 3. lc 27.6c 0.58c 0.56c al. (2002b)
': Células imobilizadas;ª: Primeira batelada; 6: Segunda batelada; e_. Quinta batelada
Comparando os dados obtidos com o uso de células imobilizadas nas melhores
condições de cultivo (TABELA 15) com aqueles reportados na literatura para a mesma
levedura (TABELA 16), verifica-se que no sistema com células imobilizadas foi possível
73
obter uma elevada concentração de xilitol no caldo fermentado (47.9 g/L) e um bom
rendimento da conversão de xilose em xilitol (O. 77 g/g), que foi de aproximadamente 85 % do
valor teórico máximo proposto por BARBOSA et ai. (1988). Por outro lado, o valor de
produtividade obtido nestas condições de cultivo (0.40 g/L h) foi ainda inferior àqueles
alcançados com a utilização de células livres em suspensão no meio.
5.4 ELABORAÇÃO DE MODELOS EMPÍRICOS PARA PREDIÇÃO DA PRODUÇÃO DE
XILITOL EM.REATOR DE MISTURA
Nesta etapa. o planejamento fatorial fracionado inicial foi composto em um
planejamento de face centrada. Estes ensaios adicionais permitiram a elaboração de modelos
quadráticos para predição da produtividade e do rendimento da bioconversão em função das
variáveis independentes que influenciam cada uma destas duas respostas.
Os parâmetros fermentativos determinados após 72 h de fermentação empregando-se
as diferentes condições para cultivar as células (item 4.4.3) são apresentados na TABELA 17.
TABELA 17: Parâmetros fermentativos determinados após 72 h de fermentação
Pr Qp YP!s YXtc XRI XRM XR I-,. Ensaio
(g/L) (g/L.b) (glg) (glg) (g/L) (g{L) (g/L) (-)
20 21.2 0.29 0.51 0.19 2.1 7.7 9.8 0.21
21 29.8 0.41 0.66 0.11 2.2 4.4 6.6 0.33
22 24.4 0.34 0.70 0.09 2.1 2.5 4.6 0.46
23 22.0 0.31 0.54 0.24 2.5 9.9 12.3 0.20
24 30.5 0.42 0.69 0.08 2.2 3.0 5.2 0.42
25 23.8 0.33 0.53 0.30 2.5 10.7 13.3 0.19
26 25.8 0.36 0.64 0.12 1.8 4.3 6.1 0.30
27 27.4 0.38 0.62 0.11 2.5 4.6 7.1 0.35
28 14.4 0.20 0.55 0.10 1.9 2.2 4.1 0.46
29 18.0 0.25 0.53 0.37 3.2 9.9 13.l 0.24
30 26.6 0.37 0.70 0.14 2.3 4.5 6.8 0.34
31 32.0 0.44 0.66 0.12 2.2 5.5 7.7 0.29
Conforme pode ser observado na TABELA 17, os melhores valores de concentração
74
final (PF == 32.0 g/L) e produtividade (Qp == 0.44 g/L h) foram obtidos no ensaio 31, enquanto
o melhor valor de rendimento (Yns == 0.70 g/g) foi obtido nos ensaios 22 e 30. Com relação
aos demais parâmetros fermentativos quantificados, observou-se que o fator de rendimento da
conversão de glicose e xilose em células (Yxíc) variou entre 0.08 e 0.37 g/g, a concentração de
células imobilizadas no reator (Xm) variou entre 1.8 e 3.2 g/L, a concentração de células livres
no reator (XRi11) variou entre 2.2 e 10.7 g/L, a concentração celular total no reator (XR) variou
entre 4.1 e 13.3 g/L, e o percentual de células imobilizadas no reator (/%) variou entre 19 e
46 %, dependendo das condições de cultivo empregadas.
Utilizando-se a metodologia da superficie de resposta, uma nova análise de variância
(com os dados de todos os 31 ensaios) foi realizada, obtendo-se os coeficientes de regressão
dos modelos quadráticos que relacionam a produtividade (Qp) e o rendimento (YPls) da
bioconversão com as variáveis independentes que influenciam estas respostas.
Adicionalmente, a significância daqueles efeitos pnncipais não-significativos de variáveis
envolvidas em interações significativas (TABELAS 13 e 14) foi reavaliada.
A TABELA 18 apresenta os valores dos coeficientes de regressão mantidos no modelo
que relaciona Qp com as variáveis que a influenciam, bem como seus respectivos níveis de
significância. Conforme pode ser observado, os efeitos principais do fator de concentração do
hidrolisado e da agitação passaram a apresentar significância estatística (p < 0.20) depois que
os dados dos 12 experimentos adicionais de composição do planejamento foram incluídos na
análise, estando de acordo com o esperado pela teoria (BOX et ai., 1978).
Considerando os coeficientes de regressão apresentados na TABELA 18, o modelo
que relaciona a produtividade em xílitol com as variáveis independentes que a influenciam é
expresso pela seguinte equação:
Qp = 0.34 + 0.016A - 0.014C + 0.015D + 0.047E - 0.13E2 + 0.033AD + 0.044AE - 0.037CE (24)
Onde Qp é o valor de produtividade obtido em função dos valores codificados
75
(equação 5) de fator de concentração do hidrolisado (A), agitação (C), concentração inicial de
células (D) e pH inicial do meio de fermentação (E).
TABELA 18: Valores dos coeficientes de regressão mantidos no modelo proposto para a
predição da produtividade em xilitol
Fator Coeficiente Erro-padrão lc.ic p
Constante 0.340 0.013
Bloco 1 -0.023
Bloco 2 0.023
A 0.016 0.010 1.63 O.1184
e -0.014 0.010 -1.46 0.1592
D 0.015 0.010 I.52 0.1445
E 0.047 0.010 4.72 0.0001
E! -0.130 0.021 -6.47 0.0001
AD 0.033 0.010 3.16 0.0048
AE 0.044 0.010 4.23 0.0004
CE -0.037 0.010 -3.51 0.0021
A: fator de concentração do hidrolisado; C: agitação; D: concentração inicial de células; E: pH inicial do meio de fermentação
A TABELA 19 ilustra a análise de variância do modelo quadrático ( equação 24) e da
falta de ajuste dos dados experimentais a este modelo, bem como a sua capacidade em
predizer os valores de produtividade. Conforme pode ser observado, o modelo proposto
apresenta elevada significância estatística (p < O. O 1 ), não sendo verificada falta de ajuste
estatisticamente significativa (p > 0.20) no ajuste aos dados experimentais. Além disso,
apresenta uma boa capacidade de predição, conseguindo explicar 84 % da variação total.
Conforme pode ser observado na FIGURA 16, o plote dos resíduos em função dos
valores preditos pelo modelo apresenta uma distribuição aleatória, não sendo identificadas
tendências que poderiam invalidar o modelo proposto.
76
TABELA 19: Análise de variância do modelo quadrático e da falta de ajuste dos dados
experimentais a este modelo
CV GL Bloco
Modelo 8
Resíduo 21
Falta de ajuste 18
Erro puro 3
Total 30
SQ MQ Fca1c p
0.140 0.140
0.200 0.025 13.91 0.0001
0.037 0.002
0.031 0.002 0.91 0.6236
0.006 0.002
0.370
CV: causa de variação; GL: graus de liberdade; SQ: soma quadrática; MQ: média quadrática R2: 0.84
O.OS- D
o 01><1- e, e e
o D o
"' o a
0.01_ e e "'e o o o ::, D " :E " - - "' "' o: e
-0.02- o D o
o D
-0.00- e D o o 1 1 • 1
0.04 0.13 0.22 0.30 0.311
Valores preditos
FIGURA 16: Plote dos resíduos em função dos valores preditos pelo modelo quadrático
proposto para a predição da produtividade.
A equação 24 foi então reduzida, de forma a permitir a elaboração da superfície de
resposta em função do fator de concentração do hidrolisado e do pH inicial do meio de
fermentação. Para esta redução, as variáveis independentes vazão de ar e agitação foram
fixadas nos seus níveis inferiores (-1) e a variável independente concentração inicial de
células foi fixada no seu nível superior ( + 1 ), resultando na seguinte equação:
Qp == 0.369 + 0.049A + 0.084E - 0.13E2 + 0.044A.E (25)
Onde Qp é o valor de produtividade obtido em função dos valores codificados
77
(equação 5) de fator de concentração do hidrolisado (A) e pH inicial do meio de fermentação
(E). A superficie de resposta descrita por esta equação é apresentada na FIGURA 17, onde os
melhores valores de produtividade no sistema em estudo (acima de 0.40 g/L h) são obtidos na
região experimental demarcada em amarelo.
0,50
0,45
0,40
0,35
1.0 ~ o.s 1
.g ,g
º·º -1 -0,S §
-es -·"1 .. 0 ~
o.o -o .es -1.0 ~
- 0,200 ~ 0,250 ~ 0,300 CJ 0,350
- 0.400 CJ above
a.. o 0,30
0,25
0,20
0,15
"'f .. O 075
pH ínicial do meio de Ferrnen-tação
FIGURA 17: Superficie de resposta descrita pela equação 25, que relaciona a produtividade
com o fator de concentração do hidrolisado e com o pH inicial do meio de fermentação.
A TABELA 20 apresenta os valores dos coeficientes de regressão mantidos no modelo
que relaciona Yp;s com as variáveis que o influenciam, bem como seus respectivos níveis de
significância. Conforme pode ser observado, o efeito principal da concentração inicial de
células não apresentou significância estatística (p > 0.20) nem depois que os dados dos 12
experimentos adicionais de composição do planejamento foram incluídos na análise. Desta
forma, estima-se que a elevada significância estatística da interação AD esteja relacionada a
um possível efeito de interação entre 3 fatores (interação BCE), sobreposto à interação AD
devido ao planejamento fracionado empregado (BOX et al., 1978).
Considerando os coeficientes de regressão apresentados na TABELA 20, o modelo
que relaciona o rendimento em xilitol com as variáveis independentes que o influenciam é
expresso pela seguinte equação:
78
Yp1s = 0.60 + 0.019A - 0.056B - 0.072C - 0.004D + 0.014E - 0.073E2 +
0.041AD + 0.075AE - 0.029BC - 0.036CE (26)
Onde Yp;s é o valor de rendimento obtido em função dos valores codificados ( equação
5) de fator de concentração do hidrolisado (A), vazão de ar (B), agitação (C) e pH inicial do
meio de fermentação (E).
TABELA 20: Valores dos coeficientes de regressão mantidos no modelo proposto para a
predição do rendimento em xilitol
Fator Coeficiente Erro-padrão tcAlc p
Constante 0.600 0.013
Bloco 1 -0.022
Blocol 0.022
A 0.019 0.010 1.94 0.0673
B -0.056 0.010 -5.54 0.0001
e -0.072 0.010 -7.21 0.0001
D -0.004 0.010 -0.44 0.6624
E 0.014 0.010 1.44 0.1658 .. - E2 -0.073 0.021 -3.54 0.0022 -- AD 0.041 0.011 3.88 0.0010
AE 0.075 0.011 7.06 0.0001
BC -0.029 0.011 -2.70 0.0140
CE -0.036 0.011 -3.41 0.0029
A: fator de concentração do hidrolisado; B: vazão de ar; C: agitação; D: concentração inicial de células; E: pH inicial do meio de fermentação
A TABELA 21 ilustra a análise de variância do modelo quadrático ( equação 26) e da
falta de ajuste dos dados experimentais a este modelo, bem como a sua capacidade em
predizer os valores de rendimento. Conforme pode ser observado, o modelo quadrático
proposto apresenta elevada significância estatística (p < O. O 1 ), não sendo verificada falta de
ajuste estatisticameme significativa (p > 0.20) no ajuste aos dados experimentais. Além disso,
apresenta uma boa capacidade de predição, conseguindo explicar 91 % da variação total.
Conforme pode ser observado na FIGURA 18, o plote dos resíduos em função dos
valores preditos pelo modelo apresenta uma distribuição aleatória, não sendo identificadas
tendências que poderiam invalidar o modelo proposto.
79
TABELA 21: Análise de variância do modelo quadrático e da falta de ajuste dos dados
experimentais a este modelo
CV GL
Bloco
Modelo 10
Resíduo 19
Falta de ajuste 16
Erro puro 3
Total 30
SQ MQ Fca1c p
0.064 0.064
0.330 0.033 18.50 0.0001
0.034 0.002
0.025 0.002 0.51 0.8409
0.009 0.003
0.430
CV: causa de variação; GL: graus de liberdade,· SQ: soma quadrática; MQ: média quadrática If: 0.91
0.08- D
D
CJ D 0.03- o
e"'º o D o .., D o n D ;:,
-0.01 - ~ e 3? .,a
"' e ... e o o o a: D " o
JJ.05 -
D
.0.00- D
t 1 ' ' 1
0.28 0.41 0.53 O.ll6 0.7Q
Valores preditos
FIGURA 18: Plote dos resíduos em função dos valores preditos pelo modelo quadrático
proposto para a predição do rendimento.
A equação 26 foi então reduzida, de forma a permitir a elaboração da superficie de
resposta em função do fator de concentração do hidrolisado e do pH inicial do meio de
fermentação. Para esta redução, as variáveis independentes vazão de ar e agitação foram
fixadas nos seus níveis inferiores (-1) e a variável independente concentração inicial de
células foi fixada no seu nível superior ( + 1 ), resultando na seguinte equação:
80
Yp1s = 0.695 + 0.06A + O.OSE - 0.073E2 + 0.075AE (27)
Onde Yp;s é o valor de rendimento obtido em função dos valores codificados ( equação
5) de fator de concentração do hidrolisado (A) e pH inicial do meio de fermentação (E). A
superfície de resposta descrita por esta equação é apresentada na FIGURA 19, onde os
melhores valores de rendimento no sistema em estudo (acima de 0.75 g/g) são obtidos na
região experimental demarcada em amarelo.
0,85
0,80
0,75
U) 0,70 a:: >- 0,65
0,60
0,55
-, .e> C> .. :!:->
, .<~
C>.C> • o.sso mo.ooo ~ 0,650 CJ 0,700 lm 0,750 c:::J above
o.s
-0.o!!'5
-1 .. o -1~0
FIGURA 19: Superfície de resposta descrita pela equação 27, que relaciona o rendimento
com o fator de concentração do hidrolisado e com o pH inicial do meio de fermentação.
5.4.1 DEFINIÇÃO DAS CONDIÇÕES DE CULTIVO PARA A PRODUÇÃO DE XILITOL EM
REATOR DE MISTURA
As curvas de nível descritas pelas equações que relacionam a produtividade ( equação
25) e o rendimento ( equação 27) em xilitol com o fator de concentração do hidrolisado e com
o pH inicial do meio de fermentação foram sobrepostas, de forma a permitir a definição das
condições de cultivo mais adequadas para a produção de xilitol no sistema em estudo.
Os critérios adotados para a definição das condições de cultivo mais adequadas para a
produção de xilitol foram: As variáveis independentes vazão de ar e agitação foram fixadas
nos seus níveis inferiores (1.30 L/min e 300 rpm, respectivamente); A variável independente
81
concentração inicial de células foi fixada no seu nível supenor (1.4 g/L ); A variável
dependente produtividade em xilitol deveria ser superior a 0.40 g/L h; A variável dependente
rendimento em xilitol deveria ser superior a 0.75 g/g.
A área não sombreada da FIGURA 20 corresponde à região experimental onde os
critérios adotados para a definição das condições de cultivo mais adequadas para a produção
de xilitol no sistema em estudo foram satisfeitos.
Utilizando-se fator de concentração do hidrolisado igual a 5. O, vazão de ar de
1.30 L/min, agitação de 300 rpm, concentração inicial de células de 1.4 g/L e pH inicial do
meio de fermentação igual a 6.0, valores de produtividade e rendimento em xilitol iguais a
0.41 g/L h e 0.81 g/g, respectivamente, foram preditos pelos modelos propostos, no tempo de
72 h de fermentação. Os intervalos de confiança (p < O.OS) das predições compreenderam
valores entre 0.35 g/L h e 0.48 g/L h (produtividade) e entre 0.74 g/g e 0.88 g/g (rendimento).
o •«> o, ffl 0.50 e Q)
ê .!!!
Q) -e o 0.00
ºõi E o
-e
~ .!:::! -0.50 e: I o..
Fator de concentração do hidrolisado
FIGURA 20: Superposição das curvas de nível que relacionam a produtividade e o
rendimento em xilitol com o fator de concentração do hidrolisado e com o pH inicial do meio
de fermentação.
Com a finalidade de comprovar os modelos empíricos propostos e concluir as análises
82
estatísticas dos dados obtidos, foi realizado um ensaio fermentativo utilizando-se as condições
de cultivo descritas no parágrafo anterior. A TABELA 22 apresenta os parâmetros
fermentativos determinados para este ensaio nos tempos de 72 e 120 h. Devido a problemas
de contaminação, evitou-se a abertura do reator para a retirada de amostras das esferas de
alginato de cálcio durante a fermentação. Por este motivo, a concentração de células
imobilizadas foi determinada apenas no início e ao final da batelada.
TABELA 22: Parâmetros fermentativos determinados nos tempos de 72 e 120 h de
fermentação. Condições de cultivo: fator de concentração do hidrolisado (5.0), vazão de ar
(1.30 L/min), agitação (300 rpm), concentração inicial de células (1.4 g/L), pH inicial do meio
(6.0)
Parâmetros fermentativos Tempo de Fermentação (b)
72 120 PF(g/L) 25.2 47.5
Qp (glL h) 0.35 0.40
s» (g/g h) 0.062 - . . ·--
YP1s (g/g) 0.83 0.81
E'-'(-) 0.91 0.88
Qs (glL h) 0.42 0.49
qs (g/g h) 0.075
S'-'(-) 0.44 0.86
XRJ (g/L) 2.7
X&v (glL) 2.3 3.8
XR (glL) 6.5
1.,. (-) 0.42
Yx,c (g/g) 0.08
So = 68.8 g/L; XRo = 1.4 g/L
Conforme pode ser observado na TABELA 22, verificou-se uma produção de xilitol
igual a 25.2 g/L após 72 h de fermentação, com valores de produtividade e rendimento iguais
a 0.35 g/L h e 0.83 g/g, respectivamente. Estes dados comprovaram a validade dos modelos
propostos, considerando-se os intervalos de confiança das predições descritos previamente.
De maneira semelhante ao observado no ensaio 1 O (TABELA 15), no qual empregou-
83
se as mesmas condições de cultivo, foi novamente possível prolongar a fermentação até 120 h
de cultivo, maximizando o percentual de consumo de xilose e a concentração de xilitol no
caldo fermentado, sem prejuízos na produtividade e no rendimento da bioconversão. A
FIGURA 21 ilustra os perfis do consumo de glicose, xilose, arabinose e ácido acético, da
produção de xilitol, e do crescimento de células livres no reator, observados durante esta
fermentação.
70
60
:::. ~ 50 (1) Ul o e 40 :e ro iii_ 30 õ :!: ~ 20 oi ~ ·x 10
o o -o-,o-,.~,---,--,-~..---.----.-~.-- ......... -,-~..---11110
144 24 48 72
tempo (h) 96 120
FIGURA 21: Perfis do consumo de glicose (V), xilose <•), arabinose (e) e ácido acético
( <> ), da produção de xilitol (~), e do crescimento de células livres no reator, XRM (O).
Conforme pode ser observado na FIGURA 21, observou-se uma produção de xilitol
igual a 47.5 g/L com um fator de rendimento (Yp;s) de 0.81 g/g após 120 h de fermentação,
resultando em uma produtividade (Qp) de 0.40 g/L h. Estes dados evidenciam a possibilidade
de obtenção de elevados valores de rendimento da bioconversão de xilose em xilitol no
sistema em estudo. De fato, a eficiência de bioconversão obtida nesta fermentação foi de
aproximadamente 90 % do valor máximo teórico proposto por BARBOSA et ai. (1988). Por
outro lado, a produtividade observada após 120 h de fermentação (0.40 g/L h) foi inferior
àquelas obtidas durante o cultivo da levedura Candida guilliermondii em suspensão ( células
não imobilizadas), conforme pode ser observado na TABELA 14.
84
É possível que a presença de glicose no meio tenha contribuído para o aumento no
tempo de fermentação. Conforme pode ser observado na FIGURA 21, a curva de crescimento
das células livres apresentou um padrão de diauxia com uma fase lag aparente entre 12 e 24 h
de fermentação, período no qual observou-se uma redução das taxas de consumo de xilose e
de produção de xilitol. WALTHER et ai. (2001) também observaram um comportamento
semelhante durante a fermentação de meios sintéticos ( elaborados com glicose e xilose)
durante a produção de xilitol com a levedura Candida tropicalis. De acordo com estes
autores, a presença de glicose no meio de fermentação acarretou em consideráveis
decréscimos na produtividade obtida ao final das fermentações.
Por outro lado, tendo em vista que o uso de sistemas com células imobilizadas tem
sido considerado como uma alternativa para se aumentar a produtividade de processos
fermentativos, em razão das elevadas densidades celulares que podem ser utilizadas
(RAMAKRISHNA e PRAKASHAM, 1999), deve-se ressaltar também que o presente
trabalho não explorou o uso de altas densidades celulares para a condução das fermentações.
Conforme pode ser observado na TABELA 1, a máxima concentração celular inicial
empregada neste estudo foi de apenas 1.4 g/L. Conforme pode ser observado na TABELA 18,
a concentração inicial de células foi uma das variáveis que influenciaram significativamente a
produtividade em xilitol, sendo o seu efeito positivo (maior concentração inicial de células,
maior produtividade).
5.5 AVALIAÇÃO DA ESTABILIDADE OPERACIONAL DO SISTEMA DE PRODUÇÃO DE
XILITOL EM REATOR DE MISTURA
Nesta etapa, a estabilidade operacional do sistema de produção de xilitol em reator de
mistura foi avaliada conduzindo-se a fermentação na modalidade de bateladas repetidas,
reutilizando-se as células imobilizadas ao final de cada batelada como inóculo para a batelada
seguinte. Para o cultivo das células, foram utilizadas as condições previamente definidas.
85
Buscou-se verificar a possibilidade de: 1) minimizar os custos relativos ao preparo de
inóculo, 2) minimizar os tempos mortos entre bateladas, 3) eliminar a necessidade de uso de
equipamentos para a recuperação das células ao final de cada batelada, e 4) adaptar as células
aos compostos inibidores residuais presentes no meio de fermentação.
A TABELA 23 apresenta os parâmetros fermentativos determinados ao final de cada
uma das 5 bateladas repetidas de fermentação. Conforme pode ser observado, não foram
verificadas grandes alterações nos parâmetros avaliados ao longo das 5 bateladas, uma vez
que os valores de coeficiente de variação destes parâmetros foram inferiores a 1 O %. Em
valores médios, foi possível obter 51. 6 g/L de xilitol em cada uma das bateladas, com
produtividade de 0.43 g/L h e rendimento de 0.71 g/g.
TABELA 23: Parâmetros fermentativos determinados ao final de cada uma das 5 bateladas
repetidas de fermentação
Batelada Média DP CV
r 2ª 3ª 4• 5ª (%)
P)(g!L) 46.7 51.3 55.7 53.9 50.3 51.6 3'.5 6.8
Qp(g/Lh) 0.39 0.43 0.46 0.45 0.42 0.43 0.03 7.0
Yp;s (g/g) 0.71 0.72 0.69 0.70 0.71 0.71 O.OI 1.4
Qs (gfL h) 0.55 0.53 0.60 0.57 0.53 0.56 0.03 5.4
S~(-) 0.86 0.86 0.90 0.88 0.82 0.86 0.03 3.5
V(mm3) 10.84 7.42
DP: Desvio-Padrão; CV.- Coeficiente de Variação= (Desvio-Pudrão/Médiaix Iõõ
De acordo com os dados apresentados na TABELA 23, pode-se afirmar que a
produção de xilitol na modalidade de bateladas repetidas permite minimizar os custos
relativos ao preparo de inóculo, uma vez que as células imobilizadas puderam ser reutilizadas
durante as 5 bateladas repetidas de fermentação sem prejuízos evidentes nos parâmetros
avaliados. Além disso, este sistema permite que os tempos mortos entre bateladas sucessivas
de fermentação sejam minimizados e não requer o uso de equipamentos ( como centrífugas,
por exemplo) para a recuperação das células ao final de cada batelada. Sabe-se que a
86
reutilização das células pode ser benéfica em processos que visam a utilização de açúcares
presentes em hidrolisados lignocelulósicos, uma vez que este procedimento pode levar à
adaptação das mesmas aos compostos inibidores (P ALMQVIST e HAHN-HAGERDAL,
2000a). Entretanto, no presente estudo, a reciclagem das células imobilizadas não levou a
melhoras nos parâmetros avaliados.
Observou-se uma redução significativa (p < 0.05) no diâmetro médio das esferas de
alginato de cálcio ao final da 5ª batelada. O diâmetro médio após as 600 h de fermentação foi
de 2.40 mm (crn-1 = 0.10 mm), resultando em um percentual de redução de volume (R%) igual
a 31.6 %. De acordo com SANTOS et ai. (1997), a abrasão observada nas esferas de
imobilização em reatores de mistura é determinada pelo estresse hidrodinâmico, pelo contato
direto com as turbinas de agitação, e pelas colisões das esferas entre si e com as partes
internas do reator. Este conjunto de fatores atuando nas esferas leva à fadiga da matriz de
imobilização, provocando o desenvolvimento e a propagação de fraturas a partir da superficie
das mesmas. Aliado a estes fatores, o crescimento das células na matriz de imobilização
também pode contribuir para desestabilizar a estrutura do gel, modificando a arquitetura da
matriz de alginato de cálcio e levando ao aparecimento de poros semelhantes à "crateras" na
região superficial das esferas (CHEN e HUANG, 1988; QUIRÓS et al., 1995).
Tendo em vista o valor relativamente elevado de R% ao final das bateladas repetidas de
fermentação, estima-se que a utilização de um suporte de imobilização mais resistente às
condições de processo seria uma estratégia mais adequada para a obtenção de xilitol com
células imobilizadas em reator de mistura. Neste contexto, sugere-se a utilização de gel de
álcool polivinílico (PV A-gel) como suporte de imobilização celular. Segundo LOZINSKY e
PLIEV A (1998), o PV A-gel apresenta características reológicas de estrutura não quebradiça
excelentes, permitindo sua utilização na maior parte dos biorreatores e exibindo insignificante
erosão abrasiva em condições de agitação intensa. Por outro lado, a utilização de um reator
87
mais apropriado para o cultivo de células imobilizadas em gel de alginato de cálcio seria uma
outra alternativa a ser seguida. Neste contexto, sugere-se a utilização do reator de leito
fluidizado. De acordo com GROBOILLOT et ai. (1994), este tipo de reator busca aliar as
boas condições de mistura características dos reatores de mistura às baixas tensões de
cisalhamento características dos reatores de leito empacotado. Por último, vale ressaltar os
valores de produtividade (0.65 g/L.h) e de rendimento (0.79 g/g) da bioconversão de xilose
em xilitol obtidos por RODRIGUES et ai. (1998) em cultivo semi-contínuo com células em
suspensão (TABELA 16). Utilizando um sistema de cortes bastante simples, no qual parte do
meio fermentado contendo células em suspensão foi deixado no fermentador e utilizado como
inóculo para a batelada seguinte, os autores também conseguiram se beneficiar de vantagens
como minimização de custos relativos ao preparo de inóculo, minimização de tempos mortos
entre bateladas e exclusão da necessidade do uso de equipamentos acessórios para a
recuperação das células ao final de cada batelada.
5.5. l COMPARAÇÃO DOS RESULTADOS COM DADOS DA LITERATURA
A TABELA 24 apresenta dados reportados na literatura sobre o uso da levedura
Candida guilliermondii FTI 20037 para a produção de xilitol em hidrolisado de bagaço de
cana na modalidade de bateladas repetidas de fermentação. Conforme pode ser observado,
SENE et ai. (1998), utilizando células em suspensão cultivadas em frascos Erlenmeyer ( os
autores utilizaram uma centrifuga para recuperar as células ao final de cada batelada),
observaram pequenas variações nos parâmetros fermentativos avaliados ao longo de 5
bateladas repetidas. Por outro lado, CARVALHO et ai. (2002b), utilizando células
imobilizadas em alginato de cálcio cultivadas em frascos Erlenmeyer, observaram melhora
nos parâmetros fermentativos avaliados após a primeira batelada da série de repetições. Esta
melhora nos parâmetros fermentativos foi atribuída ao crescimento limitado e à adaptação das
células imobilizadas após a primeira batelada da série de repetições.
88
TABELA 24: Dados reportados na literatura sobre o uso da levedura Candida guilliermondii
FTI 20037 para a produção de xilitol em hidrolisado de bagaço de cana na modalidade de
bateladas repetidas de fermentação
Batelada Média Referência
1ª 2ª 3• 4• 5• PF(g/L) 25.1 23.5 25.7 26.5 28.3 25.8 Sene et ai. (1998)1
Qp (g/L h) 0.52 0.49 0.54 0.55 0.60 0.54
Yp;s (g/g) 0.63 0.58 0.64 0.62 0.62 0.62
PF(g/L) 23.8 28.3 28.6 28.9 27.6 27.4 Carvalho ct ai. (2002b)7"
Qp {g/L b) 0.50 0.59 0.60 0.60 0.58 0.57
Yp1s (glg) 0.48 0.54 0.56 0.56 0.55 0.54
: Células em suspensão; ·: Células imobilizadas em alginato de cálcio
Embora não tenha sido observada melhora nos parâmetros fermentativos durante a
reciclagem das células imobilizadas em reator de mistura (TABELA 23 ), contrariamente ao
observado em frascos Erlenmeyer (TABELA 24), as condições de cultivo previamente
definidas em reator de mistura acarretaram em aumentos consideráveis na concentração e no
rendimento em xilitol obtidos ao final de cada uma das bateladas repetidas de fermentação,
em comparação aos valores obtidos em frascos Erlenmeyer. Em valores médios, estes
aumentos foram da ordem de 90 e 30 %, respectivamente. Por outro lado, a produtividade
obtida em reator de mistura foi cerca de 25 % inferior à produtividade obtida em frascos
Erlenmeyer.
5.5.2 AVALIAÇÃO DAS NECESSIDADES NUTRICIONAIS DA LEVEDURA PARA A
PRODUÇÃO DE XILITOL NA MODALIDADE DE BATELADAS REPETIDAS DE
FERMENTAÇÃO
A suplementação nutricional de hidrolisados hemicelulósicos pode influenciar a
bioconversão de xilose em xilitol, dependendo do microrganismo (P ARAJÓ et ai., 1998c;
WINKELHAUSEN e KUZMANOV A, 1998). Com relação à levedura Candida
guilliermondii FTI 20037, a necessidade de suplementação depende da matéria-prima a partir
89
da qual o hidrolisado é obtido. Enquanto a suplementação do hidrolisado de palha de arroz
com sulfato de amônio e extrato de farelo de arroz se mostrou, além de desnecessária,
prejudicial à bioconversão de xilose em xilitol (SILVA e ROBERTO, 1999), a suplementação
do hidrolisado de cavacos de eucalipto com os mesmos nutrientes se mostrou necessária para
um melhor desempenho da bioconversão (CANNETTIERI et ai., 2001 ).
Com base no exposto, foram programados ensaios utilizando hidrolisados
suplementados ou não com nutrientes, de forma a permitir uma avaliação das necessidades
nutricionais da levedura para a produção de xilitol em hidrolisado de bagaço de cana na
modalidade de bateladas repetidas de fermentação. A TABELA 25 apresenta os parâmetros
fermentativos determinados nas diferentes condições de cultivo (item 4. 4. 4. 1).
Ensaio Batelada Nutrientes
TABELA 25: Parâmetros fermentativos determinados nas bateladas repetidas de fermentação
Yws (g/g) Q,,(g/L h)
A 1" AS,FA
AS,FA
AS,FA
25.9
46.8
48.7
0.27
0.49
0.51
0.45
0.58
0.55
2"
·------------------------------------------------------------------------------------------· B 1" AS. FA 26.7 0.28 0.47
3" AS,FA ·------------------------------------------------------------------------------------------- e 1" AS, FA 27.5 0.29 0.47
14.1
42.0
15.2
12.0
0.15
0.44
0.16
0.13
0.25
0.58
0.22
0.19 -------------------------------------------------------------------------------------------· D 1" FA 16.5 0.17 0.34
3"
FA
FA
25.0
26.5
0.26
0.28
0.50
0.52
2ª
E I" AS 14.2 0.15 0.33
3"
AS
AS
12.4
9.6
0.13
0.10
0.27
0.25
2ª
F I" 12.1 0.13 . 0.30
3• 9.0
8.7
0.09
0.09
0.20
0.18
SA: Sulfato de amônio; FA: Extrato de Farelo de Arroz:»: Sem adição de nutrientes
Conforme pode ser observado na TABELA 25, a levedura Candida guilliermondii FTI
90
20037 produziu, após 96 h de fermentação, 12.1 g/L de xilitol no hidrolisado não
suplementado com nutrientes, resultando em produtividade de 0.13 g/L h e rendimento de
0.30 g/g (Ensaio F). Tanto a suplementação do hidrolisado com sulfato de amônio (Ensaio E)
quanto a suplementação com extrato de farelo de arroz (Ensaio D) promoveram uma melhora
nos valores de concentração final, produtividade e rendimento em xilitol obtidos após 96 h de
fermentação. Entretanto, os melhores resultados foram obtidos quando o hidrolisado foi
suplementado através de adição conjunta dos nutrientes sulfato de amônio e extrato de farelo
de arroz, resultando em valores médios de concentração, produtividade e rendimento iguais a
26.7 g/L, 0.28 g/ Lhe 0.46 g/g, respectivamente, ao final da 1ª batelada da série de repetições
(Ensaios A, B e C).
As FIGURAS 22-24 ilustram o comportamento da levedura com relação à produção
de xilitol em função da suplementação ou não do hidrolisado com nutrientes ao longo das
bateladas repetidas de fermentação.
:::i' -.. -9 a.""20
10
40
30
2
Batelada 3
FIGURA 22: Valores de concentração final (PF) obtidos durante a produção de xilitol, em
frascos Erlenmeyer, no sistema de bateladas repetidas de fermentação: Ensaio A (•); Ensaio
B (e); Ensaio C (À); Ensaio D (O); Ensaio E (O); Ensaio F (.6).
Conforme pode ser observado nas FIGURAS 22-24, os valores de concentração final,
produtividade e rendimento em xilitol foram aumentados consideravelmente na 2ª batelada da
91
série de repetições e permaneceram aparentemente constantes na batelada seguinte quando se
empregou o hidrolisado suplementado com ambos os nutrientes nas 3 bateladas (Ensaio A).
Por outro lado, a suplementação do hidrolisado com ambos os nutrientes apenas na 1 ª das 3
bateladas (Ensaio C), a suplementação do hidrolisado com apenas sulfato de amónio em todas
as 3 bateladas (Ensaio E) e a ausência de suplementação do hidrolisado com nutrientes em
todas as bateladas (Ensaio F) resultaram em decréscimos progressivos nos valores de
concentração final, produtividade e rendimento em xilitol ao longo das bateladas repetidas de
fermentação.
s: ~ 0,3 ~
Q.
O 0,2
0,5
0,4
0,1 .- e '
2
Batelada 3
FIGURA 23: Valores de produtividade (Qp) obtidos durante a produção de xilitol, em frascos
Erlenmeyer, no sistema de bateladas repetidas de fermentação: Ensaio A (•); Ensaio B (e);
Ensaio C (.6.); Ensaio D (D); Ensaio E (O); Ensaio F (.6.).
Contrariamente ao observado quando o hidrolisado de bagaço de cana foi
suplementado apenas com sulfato de amónio em todas as bateladas (Ensaio E), a reutilização
das células imobilizadas promoveu aumentos consideráveis nos valores de concentração final,
produtividade e rendimento em xilitol na 2ª batelada da série de repetições, os quais
permaneceram aparentemente constantes na batelada seguinte, quando o hidrolisado foi
suplementado somente com extrato de farelo de arroz em todas as bateladas da série de
repetições (Ensaio D).
92
A utilização de hidrolisado não suplementado com nutrientes entre 2 bateladas nas
quais utilizou-se hidrolisado suplementado com sulfato de amônio e extrato de farelo de arroz
não afetou a capacidade da levedura Candida guilliermondii FTI 20037 em converter xilose
em xilitol (Ensaio B), mostrando que o cultivo da levedura em hidrolisado não suplementado
com nutrientes, apesar de resultar em piora nos parâmetros avaliados, não altera a capacidade
intrínseca da célula em efetuar a bioconversão.
C) E! 0,3
~ >· 0,2
0,1
0,4
2
Batelada 3
FIGURA 24: Valores de rendimento (YP1s) obtidos durante a produção de xilitol, em frascos
Erlenmeyer, no sistema de bateladas repetidas de fermentação: Ensaio A(•); Ensaio B (e);
Ensaio C (Ã.); Ensaio D (O); Ensaio E (O); Ensaio F (~).
De uma maneira geral, os resultados obtidos nestes ensaios permitem afirmar que,
embora não essencial para a bioconversão de xilose em xilitol pela levedura Candida
guilliermondii FTI 20037, a suplementação do hidrolisado de bagaço de cana com sulfato de
amônio e extrato de farelo de arroz acarreta em melhor desempenho da bioconversão. Durante
as bateladas repetidas de fermentação, os melhores valores de concentração, produtividade e
rendimento em xilitol foram obtidos quando se suplementou o hidrolisado com os dois
nutrientes em todas as 3 bateladas.
93
6 CONCLUSÕES
./ A detoxificação do hidrolisado de bagaço de cana por meio da alteração de pH associada
à adsorção em carvão ativo determinou perda de açúcares, dependendo do fator de
concentração do hidrolisado. Embora tenha se mostrado eficiente para a remoção de furfural,
hidróxi-rnetil-furfural e derivados da lignina, esta estratégia se mostrou ineficaz para a
remoção de ácido acético .
./ Enquanto os sistemas EF e STR resultaram em produções equivalentes de xilitol, com
rendimentos e produtividades semelhantes, a bioconversão de xilose em xilitol no sistema
BSTR foi prejudicada por limitações na transferência de massa .
./ O fator de concentração do hidrolisado, a agitação, a concentração inicial de células e o
pH inicial do meio de fermentação influenciaram significativamente a produtividade em
xilitol no sistema STR .
./ O fator de concentração do hidrolisado, a vazão de ar, a agitação e o pH inicial do meio
de fermentação influenciaram significativamente o rendimento em xilitol no sistema STR .
./ Os modelos empíricos ajustados aos dados experimentais foram capazes de predizer
satisfatoriamente a produção de xilitol no sistema STR. A partir destes modelos, condições
adequadas para a produção de xilitol foram definidas, a saber: fator de concentração do
hidrolisado (5.0), vazão de ar (1.30 L/min), agitação (300 rpm), concentração inicial de
células (1.4 g/L), pH inicial do meio de fermentação (6.0). Utilizando estas condições, obteve-
se uma produção de xilitol igual a 47.5 g/L após 120 h de fermentação, resultando em
produtividade e rendimento iguais a 0.40 g/L h e 0.81 g/g, respectivamente .
./ As células imobilizadas puderam ser reutilizadas durante 5 bateladas repetidas de
fermentação sem prejuízos evidentes nos parâmetros fermentativos. Em valores médios,
foram obtidos 51.6 g/L de xilitol em cada uma das bateladas, com produtividade e rendimento
iguais a 0.43 g/L h e O. 71 g/g, respectivamente. Após as 600 h de fermentação necessárias
94
para a realização das 5 bateladas repetidas, observou-se um percentual de redução no volume
médio das esferas de alginato de cálcio igual a 31.6 % .
./ A suplementação do hidrolisado de bagaço de cana com sulfato de amônio e extrato de
farelo de arroz, embora não essencial para a bioconversão de xilose em xilitol pela levedura
Candida guilliermondii FTI 20037, acarretou em melhor desempenho da bioconversão. Esta
suplementação se mostrou benéfica ao longo de todas as bateladas repetidas de fermentação.
95
7 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS
./ Buscar definir uma estratégia para a detoxificação de hidrolisados mais concentrados que,
ao mesmo tempo, promova uma boa redução nos teores de todos os compostos inibidores
(furfural, hidróxi-metil-furfural, derivados da lignina e ácido acético) e não determine perda
de açúcares. ,
./ Avaliar o comportamento da produção de xilitol com células em suspensão (não-
imobilizadas) na modalidade de bateladas repetidas de fermentação, reciclando-se as células
por meio de cortes ( deixando uma parte do caldo fermentado no reator ao final de cada
batelada como inóculo para a batelada seguinte ) .
./ Avaliar o comportamento da produção de xilitol com células imobilizadas em alginato
de cálcio utilizando-se elevada densidade celular no início da fermentação .
./ Avaliar o comportamento da produção de xilitol em reator de leito fluidizado, com
células imobilizadas em gel de alginato de cálcio .
./ Avaliar o comportamento da produção de xilitol em reator de mistura, com células
imobilizadas em gel de álcool polivinílico.
96
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~ -· -
Anexo 1 -·- ..
-. -- .. _,..
Tabela Al.l: Fermentação do hidrolisado de bagaço de cana por Candida guilliermondii
imobilizada em gel de alginato de cálcio: Ensaio em.frascos Erlenmeyer
Tempo Glicose Xilose Arabinose Xilitol A. Acético pH XRJ XRM XR (b) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (-) (g!L) (g!L) (g!L)
o 3.7 43.4 4.4 2.8 5.0 1.6 1.6
24 27.9 3.6 7.5 1.8 5.0 3.7 1.1 4.8
48 4.3 3.3 21.0 0.5 5.9 3.8 1.6 5.4
Tabela Al.2: Fermentação do hidrolisado de bagaço de cana por Candida guilliermondii
imobilizada em gel de alginato de cálcio: Ensaio em reator de mistura
Tempo Glicose Xilosc Arabinose Xilitol A. Acético pH Xm XRM XR (b) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (-) (g/L) (g/L) (g/L)
o 3.9 45.6 4.1 2.8 4.9 1.7 1.7
24 29.1 3.5 5.6 1.5 5.0 4.9 2.3 7.2
48 12.1 2.4 19.0 0.6 5.5 5.0 2.9 7.9
60 5.2 2.3 23.5 5.6 5.1 3.2 8.3
Tabela Al.3: Fermentação do hidrolisado de bagaço de cana por Candida guilliermondii
imobilizada em gel de alginato de cálcio: Ensaio em reator tipo cesta
Tempo Glicose Xilose Arabinosc Xilitol A. Acético pH Xm XRM XR (b) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (-) (g/L) (g/L) (g/L)
o 3.7 45.4 4.1 2.7 5.1 1.7 1.7
24 36.2 3.8 3.6 2.4 4.9 2.4 l.O 3.4
48 23.7 3.3 10.3 1.8 5.0 3.1 1.7 4.8
60 16.0 3.0 13.7 1.5 5.0 3.3 1.7 5.0
72 13.1 3.0 15.0 1.2 5.0 3.4 1.6 4.9
Anexo2
Tabela A2.l: Fermentação do hidrolisado de bagaço de cana por Candida guilliermondii
imobilizada em gel de alginato de cálcio: Ensaio 01 da matriz do planejamento experimental
Tempo Glicose Xilosc Arabinosc Xilitol A. Acético pH XRJ XRM XR
(h) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (-) (g/L) (g/L) (g/L)
o 5.0 49.2 5.1 2.8 6.0 0.7 0.7 24 37.3 4.6 3.8 2.5 5.6 1.7 1.7 3.4 48 27.9 4.4 12.2 2.1 5.9 1.7 2.2 3.9 72 13.9 3.8 21. l 1.8 6.1 1.8 2.9 4.7 96 3.8 3.8 27.8 1.3 6.2 1.9 4.4 6.3
Tabela A2.2: Fermentação do hidrolisado de bagaço de cana por Candida guilliermondii
imobilizada em gel de alginato de cálcio: Ensaio 02 da matriz do planejamento experimental
Tempo Glicose Xilose Arabinosc Xilitol A. Acético pH XRI XRM XR
(b) (g/L) (g/L) (g/L) {g/L) (g/L) (-) (g!L) (g/L) (g/L)
o 5.8 73.6 10.2 2.7 4.0 0.6 0.6 24 5.7 72.4 9.8 2.7 4.1 0.7 0.1 0.8 48 1.9 69.7 8.5 1.5 2.5 4.1 1.2 0.2 1.4 72 66.0 8.2 3.3 2.1 4.1 1.2 0.6 1.8 96 61.2 8.1 6.2 1.5 4.2 1.2 0.8 2.0 120 53.8 7.8 11.1 1.0 4.3 1.2 1.1 2.3
Tabela A2.3: Fermentação do hidrolisado de bagaço de cana por Candida guilliermondii
imobilizada em gel de alginato de cálcio: Ensaio 03 da matriz do planejamento experimental
Tempo Glicose Xilose Arabinosc Xilitol A. Acético pH XRI XRM XR (b) (g!L) {g/L) {g/L) (g/L) (g/L) (-) (g/L) (g/L) (g/L)
o 2.9 41.8 7.0 2.6 4.0 0.7. 0.7 24 38.8 5.8 2.5 2.4 4.1 1.7 0.3 2.0 48 31.1 5.2 6.1 1.1 4.3 1.8 1.0 2.8 72 22.3 4.5 11.3 4.6 1.9 2.9 4.8 96 13.4 3.6 15.5 4.3 1.9 5.5 7.4 120 8.4 3.3 18.4 4.1 1.9 7.7 9.6
Tabela A2.4: Fermentação do hidrolisado de bagaço de cana por Candida guilliermondii
imobilizada em gel de alginato de cálcio: Ensaio 04 da matriz do planejamento experimental
Tempo Glicose Xilose Arabinosc Xilitol A. Acético pH Xru XRM XR
(h) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (-) (g/L) (g/L) (g/L)
o 3.7 65.0 12.3 2.5 6.0 0.6 0.6 24 56.1 9.3 5.6 2.1 5.7 2.4 1.5 3.9 48 47.3 9.1 12.0 1.2 6.7 2.4 3.6 6.0 72 40.l 8.5 16.9 0.5 7.2 2.6 6.2 8.8
Tabela A2.5: Fermentação do hidrolisado de bagaço de cana por Candida guilliermondii
imobilizada em gel de alginato de cálcio: Ensaio 05 da matriz do planejamento experimental
Tempo Glicose Xilosc Arabinose Xilitol A. Acético pH Xru XRM XR (h) (g/L) (g/L) . (g/L) (g/L) (g/L) (-) {g/L) (g/L) (g/L)
o 3.9 45.9 4.8 2.7 4.0 0.5 0.5 24 42.2 4.8 1.8 2.1 4.1 1.7 0.4 2.1 48 32.9 4.5 7.9 0.7 4.3 1.8 1.8 3.6 72 19.6 3.9 17.4 4.3 1.8 3.5 5.3
-. 96 7.3 3.3 27.6 4.2 1.8 4.1 5.9 '-. - ~ 120 1.0 2.0 32.8 4.1 1.8 4.9 6.i
Tabela A2.6: Fermentação do hidrolisado de bagaço de cana por Candida guilliermondii
imobilizada em gel de alginato de cálcio: Ensaio 06 da matriz do planejamento experimental
Tempo Glicose Xilose Arabíaose Xilitol A. Acético pH Xru XRM XR (h) (g/L) (gfL) (g/L) (glL) (g/L) (-) (g/L) (g/L) (g/L)
o 6.5 76.l 8.8 3.1 6.0 0.6 0.6 24 66.2 8.6 4.4 2.4 5.8 2.7 2.1 4.8 48 58.0 8.4 9.7 1.3 6.9 2.9 5.3 8.2 72 50.0 8.1 14.l 0.7 7.1 3.1 8.1 11.2
Tabela A2. 7: Fermentação do hidrolisado de bagaço de cana por Candida guilliermondii
imobilizada em gel de alginato de cálcio: Ensaio 07 da matriz do planejamento experimental
Tempo Glicose Xilose Arabinose Xilitol A Acético pH Xm XRM XR (b) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (-) (g/L) (g/L) (g/L)
o 2.8 41.1 6.7 2.7 6.0 0.6 0.6 24 32.6 5.4 3.9 2.1 6.5 3.2 3.1 6.3 48 27.9 5.4 5.4 0.7 6.7 4.5 5.7 10.2 72 22.3 5.1 6.0 7.1 4.6 6.2 10.8
Tabela A2.8: Fermentação do hidrolisado de bagaço de cana por Candida guilliermondii
imobilizada em gel de alginato de cálcio: Ensaio 08 da matriz do planejamento experimental
Tempo Glicose Xilose Arabinose Xilitol A .t\cético pH Xru XRM XR (b) (g/L) (gfL) (g/L) (g/L) (gil,) (-) (gfL) (gfL) (gfL)
o 5.6 70.0 9.7 2.5 4.0 0.6 0.6 24 3.0 67.4 8.4 1.4 2.2 4.1 1.2 0.4 1.6 48 62.8 7.9 3.9 1.4 4.1 2.1 1.3 3.4 72 43.3 7.9 7.5 4.1 2.4 5.9 8.3 96 31.6 7.6 11.6 3.9 2.4 9.5 11.9 120 17.0 7.2 14.8 .., -r 2.4 12.9 15.3 .)./
Tabela A2.9: Fermentação do hidrolisado de bagaço de cana por Candida guilliermondii
imobilizada em gel de alginato de cálcio: Ensaio 09 da matriz do planejamento experimental
Tempo Glicose Xilose Arabinose Xilitol A Acético pH Xru XRM XR (b) (gfL) (gfL) (gfL) (gfL) (gfL) (-) (gfL) (gfL) (g/L)
o 3.1 42.9 4.7 2.7 4.0 1.4 1.4 24 0.6 41.l 4.6 2.3 2.6 4.0 2.3 0.1 2.4 48 36.0 4.4 4.2 2.1 4.1 2.3 0.4 2.7 72 30.9 4.2 7.1 1.5 4.1 2.3 0.9 3.2 96 23.4 3.8 11.8 0.9 4.2 2.3 1.3 3.6 120 14.0 3.7 17.0 4.2 2.3 1.9 4.2
Tabela A2.10: Fermentação do hidrolisado de bagaço de cana por Candida guilliermondii
imobilizada em gel de alginato de cálcio: Ensaio 10 da matriz do planejamento experimental
Tempo Glicose Xilosc Arabinosc Xilitol A. Acético pH Xru XRM XR
(b) (g/L) (g/L) (g/L) {g/L) (g/L) (-) (g/L) (g/L) (g/L)
o 6.6 74.3 7.9 2.9 6.0 1.5 1.5 24 66.4 7.5 6.3 2.7 5.6 3. l l. l 4.2 48 51.4 7.2 14. l 2.3 5.7 3.3 2.1 5.4 72 38.9 6.9 27.9 1.9 6. l 3.3 2.6 5.9 96 25.7 6.9 38.9 1.7 6.4 3.3 3.2 6.5 120 12.0 6.7 47.9 1.3 6.5 3.3 4.1 7.4
Tabela A2.ll: Fermentação do hidrolisado de bagaço de cana por Candida guilliermondii
imobilizada em gel de alginato de cálcio: Ensaio 11 da matriz do planejamento experimental
Tempo Glicose Xilosc Arabinosc Xilitol A. Acético pH Xru XRM XR (b) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (-) (g/L) (g/L) {g/L)
o 3.5 46.0 4.6 3.1 6.0 1.3 1.3 24 31.7 4.5 7.0 2.3 5.8 3.5 2.3 5.8 48 18.5 4.4 13.9 1.3 6.9 3.7 5.7 9.4 72 13.2 4.4 15.1 0.7 7.5 4.0 8.2 12.2
Tabela A2.12: Fermentação do hidrolisado de bagaço de cana por Candida guilliermondii
imobilizada em gel de alginato de cálcio: Ensaio 12 da matriz do planejamento experimental
Tempo Glicose Xilose Arabinosc Xilitol A. Acético pH Xru XRM XR (b) (g/L) {g/L) (g/L) (g/L) {g/L) (-) (g/L) (g/L) (g/L)
o 6.2 73.2 8.1 2.6 4.0 1.4 1.4 24 4.3 70.7 7.9 1.9 2.4 4.1 2.5 0.2 2.7 48 0.8 64.4 7.4 4.6 1.6 4.1 2.8 0.7 3.5 72 54.3 7.2 9.5 0.7 4.1 2.8 2.1 4.9 96 36.1 6.8 18.4 4.0 2.8 4.1 6.9 120 16.6 6.7 30.5 3.8 2.8 5.2 8.0
Tabela A2.13: Fermentação do hidrolisado de bagaço de cana por Candida guilliermondii
imobilizada em gel de alginato de cálcio: Ensaio 13 da matriz do planejamento experimental
Tempo Glicose Xilose Arabinose Xilitol A Acético pH Xru XRM XR (h) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (-) (g/L) (g/L) (g/L)
o 3.3 45.4 5.4 2.7 6.0 1.3 1.3
24 32.4 4.9 5.2 1.8 6.6 4.0 3.7 7.7
48 24.0 4.6 8.1 0.9 6.9 4.0 7.8 11.8
72 18.8 4.4 9.8 0.7 7.5 4.1 10.1 14.2
Tabela A2.14: Fermentação do hidrolísado de bagaço de cana por Candida guilliermondii
imobilizada em gel de alginato de cálcio: Ensaio 14 da matriz do planejamento experimental
Tempo Glicose Xilose Arabinose Xilitol A Acético pH Xru XRM XR (h) {g/L) {g/L) {g/L) (g/L) (g/L) (-) {g/L) (g/L) (g/L)
o 4.8 73.3 8.3 2.7 4.0 1.3 1.3
24 4.4 70.8 7.7 2.5 2.7 4.1 2.1 0.1 2.2
48 63.5 7.3 5.1 2.1 4.2 3.1 0.3 3.4
72 54.4 6.8 9.4 1.2 4.3 3. 1 1.5 4.6
96 39.4 6.8 19.4 4.4 3.1 3.0 6.1
120 19.9 6.2 28.9 4.4 3.1 5.6 8.7
Tabela A2.15: Fermentação do hidrolisado de bagaço de cana por Candida guilliermondii
imobilizada em gel de alginato de cálcio: Ensaio 15 da matriz do planejamento experimental
Tempo Glicose Xilose Arabinose Xilitol A. Acético pH Xru XRM XR (h) (g/L) (g/L) {g/L) {g/L) {g/L) (-) (g/L) (g/L) (g/L)
o 3.6 44.6 5.7 2.6 4.0 1.5 1.5
24 37.8 5.1 3.7 2.0 4.1 3.0 0.4 3.4
48 23.9 4.9 9.0 4.1 3.1 3.6 6.7
72 10.5 4.3 12.9 3.8 3.4 8.7 12.l
96 1.9 3.8 13.5 3.7 3.4 12.5 15.9
Tabela A2.16: Fermentação do hidrolisado de bagaço de cana por Candida guilliermondit
imobilizada em gel de alginato de cálcio: Ensaio 16 da matriz do planejamento experimental
Tempo Glicose Xilosc Arabinosc Xilitol A. Acético pH Xru XRM XR (b) (g/L) (g/L) (g(L) (g(L) (g(L) (-) (g(L) (g(L) (g/L)
o 3.6 68.0 8.6 1.8 6.0 1.5 1.5 24 59.8 7.1 4.8 1.6 5.9 3.7 3.7 7.4 48 35.5 6.9 12.7 0.9 6.6 3.8 8.0 11.8 72 13.7 6.0 23.6 0.3 7.2 3.9 11.7 15.6
Tabela A2.17: Fermentação do hidrolisado de bagaço de cana por Candida guilliermondii
imobilizada em gel de alginato de cálcio: Ensaio 17 da matriz do planejamento experimental
Tempo Glicose Xilosc Arabinosc Xilitol A. Acético pH Xru XRM XR (b) (g/L) (gfL) (g(L) (g/L) (g/L) (-) (g/L) (g/L) (g/L)
o 3.7 58.6 9.1 2.9 5.0 1.1 1.1
24 47.0 7.0 5.9 2.3 5.2 2.4 1.0 3.4 48 35.3 6.2 14.0 1.5 5.8 2.4 3.6 6.0 72 22.9 4.9 22.9 1.0 6.7 2.4 6.2 8.6 ··- ..
96 14.4 4.0 27.5 0.6 6.6 2.4 8.9 11.3 - -- 120 10.2 3.7 27.9 6.5 2.4 10.4 12.8
Tabela A2.18: Fermentação do hidrolisado de bagaço de cana por Candida guilliermondii
imobilizada em gel de alginato de cálcio: Ensaio 18 da matriz do planejamento experimental
Tempo Glicose Xilosc Arabinosc Xilitol A. Acético pH Xru XRM XR (b) (g/L) (gfL) (g/L) (g/L) (g!L) (-) (g/L) (g/L) (g/L)
o 5.7 62.3 7.1 2.8 5.0 0.9 0.9 24 52.2 7.0 4.7 2.0 5.1 2.4 1.2 3.6 48 38.4 6.8 14.0 1.0 6.0 2.5 3.8 6.3 72 23.7 6.6 19.5 6.3 2.6 6.2 8.8 96 14.4 6.3 21.1 5.8 2.6 8.7 11.3 120 5.8 6.2 22.1 5.7 2.6 11.2 13.8
Tabela A2.19: Fermentação do hidrolisado de bagaço de cana por Candida guilliermondii
imobilizada em gel de alginato de cálcio: Ensaio 19 da matriz do planejamento experimental
Tempo Glicose Xilose Arabinose Xilitol A Acético pH XRJ XRM XR (b) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (-) (g/L) (g/L) (g/L)
o 5.8 63.3 7.0 3.0 5.0 1.0 1.0 14 52.3 6.7 4.3 2.3 5.1 2.4 1.2 3.6 48 39.1 6.3 15.0 1.2 5.7 2.5 3.4 5.9 72 19.3 6.2 25.2 0.4 6.8 2.6 6.0 8.6 96 9.8 6.1 27.5 6.4 2.6 9.2 11.8
120 4.9 6.1 29.5 6.2 2.6 11.6 14.2
Anexo 3
Tabela A3.1: Fermentação do hidrolisado de bagaço de cana por Candida guilliermondii
imobilizada em gel de alginato de cálcio: Ensaio 20 da matriz do planejamento experimental
Tempo Glicose Xilosc Arabinosc Xilitol A Acético pH XRJ XRM XR (b) (g{L) (g{L) (g{L) (g{L) (g{L) (-) (g{L) (g{L) (g{L)
o 4.0 48.4 7.0 3.1 5.0 1.0 1.0
24 35.8 5.1 5.0 2.1 5.0 1.9 1.5 3.4
48 17.7 4.4 16.9 0.9 6.0 2.0 3.4 5.4
72 6.8 4.3 21.2 7.1 2.1 7.7 9.8
Tabela A3.2: Fermentação do hidrolisado de bagaço de cana por Candida guilliermondii
imobilizada em gel de alginato de cálcio: Ensaio 21 da matriz do planejamento experimental
Tempo Glicose Xilose Arabinosc Xilitol A Acético pH XRJ XRM XR (h) (g{L) (g/L) (g{L) (g{L) (g{L) (-) (g!L) (g{L) (g/L)
o 6.3 75.0 11.3 2.7 5.0 1.1 1.1
24 63.9 8.7 5.9 2.2 5.1 2.1 1.0 3.0
48 49.8 7.5 13.4 1.3 5.4 2.1 2.6 4.7
72 30.0 6.8 29.8 0.6 6.1 2.2 4.4 6.6
Tabela A3.3: Fermentação do hidrolisado de bagaço de cana por Candida guilliermondii
imobilizada em gel de alginato de cálcio: Ensaio 22 da matriz do planejamento experimental
Tempo Glicose Xilose Arabinosc Xilitol A Acético pH XRJ XRM XR (b) (g/L) (g{L) (g/L) (g/L) (g/L) (-) (g/L) (g/L) (g/L)
o 5.1 62.7 8.6 2.8 5.0 0.9 0.9
24 52.7 6.7 4.9 2.4 5.1 2.1 1.0 3.0
48 40.8 6.3 12.8 1.9 5.3 2.1 1.8 3.9
72 27.6 5.8 24.4 1.3 5.8 2.1 2.5 4.6
Tabela A3.4: Fermentação do hidrolisado de bagaço de cana por Candida guilliermondii
imobilizada em gel de alginato de cálcio: Ensaio 23 da matriz do planejamento experimental
Tempo Glicose Xilose Arabinosc Xilitol A. Acético pH XRI XRM XR (b) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (-) (g/L) (g/L) (g/L)
o 5.4 64.7 9.2 3.0 5.0 1.0 1.0 24 50.8 7.4 6.2 2.0 5.2 2.0 1.9 3.9 48 32.9 6.8 17.6 0.7 6.7 2.3 5.2 7.5 72 23.7 6.7 22.0 6.8 2.5 9.9 12.3
Tabela A3.5: Fermentação do hidrolisado de bagaço de cana por Candida guilliermondii
imobilizada em gel de alginato de cálcio: Ensaio 24 da matriz do planejamento experimental
Tempo Glicose Xilosc Arabinose Xilitol A. Acético pH Xru XRM XR (b) (g/L) (g{L) (g/L) (g/L) (g/L) (-) (g(L) (g(L) (g(L)
o 5.7 65.6 7.4 3.2 5.0 1.1 1.1
24 53.6 6.2 5.1 2.5 5.0 2.0 1.3 3.3 48 38.8 6.0 15.7 1.7 5.4 2.1 2.2 4.3 72 21.5 5.9 30.5 1.0 6.3 2.2 3.0 5.2
-·-·· - -
Tabela A3.6: Fermentação do hidrolisado de bagaço de cana por Candida guilliermondii
imobilizada em gel de alginato de cálcio: Ensaio 25 da matriz do planejamento experimental
Tempo Glicose Xilosc Arahinose Xilitol A. Acético pH Xru XRM XR (b) (g(L) (g/L) (g/L) (g/L) (g(L) {-) (g(L) (g(L) {g/L)
o 5.7 65.l 8.0 3.0 5.0 1.1 1.1
24 51.2 6.7 5.6 1.9 5.3 2.3 2.4 4.8 48 34.3 6.5 15.1 6.9 2.4 7.5 9.9 72 20.2 6.5 23.8 6.5 2.5 10.7 13.3
Tabela A3.7: Fermentação do hidrolisado de bagaço de cana por Candida guilliermondii
imobilizada em gel de alginato de cálcio: Ensaio 26 da matriz do planejamento experimental
Tempo Glicose Xilose Arabinose Xilitol A. Acético pH XRI XRM XR (h) (g/L) {g/L) (g/L) (g!L) (g/L) (-) (g!L) (g/L) (g/L)
o 5.1 62.3 9.7 2.8 5.0 0.6 0.6
24 53.6 7.2 4.2 2.5 5.0 1.8 0.4 2.2
48 39.9 6.2 11.3 1.5 5.4 1.8 2.5 4.3
72 22.2 5.6 25.8 0.7 6.6 1.8 4.3 6.l
Tabela A3.8: Fermentação do hidrolisado de bagaço de cana por Candida guilliermondii
imobilizada em gel de alginato de cálcio: Ensaio 27 da matriz do planejamento experimental
Tempo Glicose Xilosc Arabinosc Xilitol A. Acético pH XRI XRM XR (b) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (g!L) (-) (g/L) (g/L) (g/L)
o 3.6 61.7 8.1 3.1 5.0 1.5 1.5
24 51.0 6.9 6.1 2.1 5.1 2.4 1.4 3.7
48 34.0 6.3 16.2 1.1 5.6 2.4 3.0 5.5
72 17.6 5.1 27.4 0.4 6.6 2.5 4.6 7.1
Tabela A3.9: Fermentação do hidrolisado de bagaço de cana por Candida guilliermondii
imobilizada em gel de alginato de cálcio: Ensaio 28 da matriz do planejamento experimental
Tempo Glicose Xilose Arabinosc Xilitol A. Acético pH XRI XRM XR (h) (g/L) (g!L) (g!L) (g/L) (g/L) (-) (g/L) (g!L) (g/L)
o 5.0 60.l 9.7 2.7 4.0 1.0 1.0
24 0.7 55.2 7.5 2.5 2.3 4.1 1.8 0.2 2.0
48 46.4 6.8 5.7 1.4 4.1 1.9 1.2 3.1
72 33.7 6.1 14.4 0.5 4.2 1.9 2.2 4.1
Tabela A3.10: Fermentação do hidrolisado de bagaço de cana por Candida guilliermondii
imobilizada em gel de alginato de cálcio: Ensaio 29 da matriz do planejamento experimental
Tempo Glicose Xilose Arabinosc Xilitol A. Acético pH Xru XRM XR (h) (g/L) (g/L) (g/L) {g/L) (g/L) (-) (g/L) (g/L) (g/L)
o 5.4 64.0 7.5 3.0 6.0 0.9 0.9 24 51.9 7.2 5.4 2.2 6.1 2.8 2.9 5.6 48 38.3 6.5 13.2 1.1 6.9 3.1 6.5 9.6 72 30.0 6.4 18.0 0.5 7.2 3.2 9.9 13.1
Tabela A3.11: Fermentação do hidrolisado de bagaço de cana por Candida guilliermondii
imobilizada em gel de alginato de cálcio: Ensaio 30 da matriz do planejamento experimental
Tempo Glicose Xilose Arabinosc Xilitol A. Acético pH Xru XRM XR (h) (g/L) (gfL) (g/L) (g/L) (g/L) (-) (g/L) (g/L) (g/L)
o 3.6 59.7 7.4 3.1 5.0 0.9 0.9 24 51.2 7.0 7.5 2.2 5.1 2.3 1.0 3.3 48 37.3 6.2 17.5 1.3 6.1 2.3 2.7 5.0 72 21.6 4.7 26.6 0.9 6.8 2.3 4.5 6.8
Tabela A3.12: Fermentação do hidrolisado de bagaço de cana por Candida guilliermondii
imobilizada em gel de alginato de cálcio: Ensaio 31 da matriz do planejamento experimental
Tempo Glicose Xilose Arabinose Xilitol A. Acético pH Xru XRM XR (h) (g/L) (gfL) (g/L) (g/L) (gfL) (-) (g/L) (g/L) (g/L)
o 5.4 64.l 7.9 3.0 5.0 1.0 1.0 24 52.7 6.3 4.7 2.2 5.1 2.0 1.6 3.6 48 35.2 6.0 16.8 1.1 5.8 2.1 3.6 5.6 72 15.6 5.9 32.0 0.3 6.5 2.2 5.5 7.7
Anexo 4
Tabela A4.1: Fermentação do hidrolisado de bagaço de cana por Candida guilliermondii
imobilizada em gel de alginato de cálcio: Ensaio de comprovação dos modelos
Tempo Glicose Xilose Arabinose Xilitol A. Acético pH XRI XRM XR (b) (g{L) (gfL) (gfL) (g{L) (g{L) (-) (g{L) (g{L) (g{L)
o 4.8 68.8 9.4 3.0 6.0 1.4 1.4 6 1.4 66.9 8.2 0.3 2.9 5.5 0.1
12 62.4 8.1 3.3 2.8 5.5 0.6 24 59.4 ~-º 5.9 2.6 5.5 0.8 48 51.6 7.5 12.9 2.5 5.6 1.7 72 38.4 7.2 25.2 2.1 5.9 2.3 96 22.0 6.3 36.6 1.8 6.2 2.7
120 9.9 5.7 47.5 1.7 6.3 3.2 144 4.6 50.1 1.3 6.4 2.7 3.8 6.5
Anexo 5
Tabela A5.l: Fermentação do hidrolisado de bagaço de cana por Candida guilliermondii
imobilizada em gel de alginato de cálcio, em reator de mistura, no sistema de bateladas
repetidas - 1 a batelada
Tempo Glicose Xilose Arabinose Xilitol A. Acético pH XRJ XR/11 XR (h) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (-) (g/L) (g/L) (g/L)
o 6.3 76.4 7.2 3.7 6.0 1.4 1.4 6 1.6 74.1 7.1 0.9 3.7 5.5 0.2
24 64.2 7.1 5.1 3.3 5.5 1.2
48 52.8 6.9 12.3 2.9 5.6 2.0 72 40.2 6.7 22.3 2.5 5.9 2.5 96 24.7 6.5 34.7 2.1 6.1 2.6 120 10.8 6.3 46.7 1.8 6.2 3.2 2.9 6.1
Tabela AS.2: Fermentação do hidrolisado de bagaço de cana por Candida guilliermondii
imobilizada em gel de alginato de cálcio, em reator de rrústura, no sistema de bateladas
repetidas - 2ª batelada
Tempo Glicose Xilose Arabinosc Xilitof A. Acético pB XRJ XRM XR (b) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (-) (g/L) (g/L) (g/L)
o 6.4 73.0 9.8 6.0 4.2 6.0 3.2 0.1 3.3 6 1.0 77.6 8.9 7.8 4.0 5.7 0.5
24 64.0 8.4 15.8 3.1 5.7 1.5
48 54.7 8.1 23.4 3.0 5.7 2.0 72 40.3 8.1 34.3 2.6 5.9 2.3 96 30.2 7.6 42.2 2.5 6.1 2.7 120 9.9 7.5 51.3 2.4 6.2 3.8 3.0 6.8
Tabela A5.3: Fermentação do hidrolisado de bagaço de cana por Candida guilliermondii
imobilizada em gel de alginato de cálcio, em reator de mistura, no sistema de bateladas
repetidas - 3ª batelada
Tempo Glicose Xilose Arabinosc Xilitol A. Acético pH Xm XRM XR (b) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (-) (g/L) (g/L) (g/L)
o 6.2 80.6 8.3 5.8 4.3 6.0 3.8 0.3 4. l 6 l.7 79.8 8.1 6.l 4.0 5.8 0.7
24 69.4 8.0 13. l 3.9 5.7 2.0 48 55.6 7.9 22.7 3.5 5.9 2.7 72 41.0 7.9 34.6 3. l 6.1 3.5 96 25.2 7.7 48.5 2.6 6.4 3.7 120 8.1 6.9 55.7 1.9 6.5 3.5 4.3 7.8
Tabela AS.4: Fermentação do hidrolisado de bagaço de cana por Candida guilliermondii
imobilizada em gel de alginato de cálcio, em reator de mistura, no sistema de bateladas
repetidas - 4ª batelada
Tempo Glicose Xilose Arabinosc Xilitol A. Acético pH Xm XRM XR (b) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (-) (g/L) (g/L) (g/L)
o 5.0 77.5 8.6 6.6 4.5 6.0 3.5 0.7 4.2 6 2.0 76.8 7.9 7.1 4.0 5.6 1.2
24 68.4 7.8 11.6 3.9 5.6 2.5 48 54.8 7.8 21.0 3.7 5.8 2.7 72 40.l 7.4 31.3 3.0 6.0 3.2 96 23.4 6.8 43.5 2.2 6.2 3.5 110 9.4 6.5 53.9 2.0 6.2 3.5 3.9 7.4
\
Tabela AS.5: Fermentação do hidrolisado de bagaço de cana por Candida guilliermondii
imobilizada em gel de alginato de cálcio, em reator de mistura, no sistema de bateladas
repetidas - 5ª batelada
Tempo Glicose Xilosc Arabinosc Xilitol A. Acético pH XRI XRM XR (h) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (-) (g/L) (g/L) (g/L)
o 5.0 77.0 8.9 5.5 4.0 6.0 3.5 0.6 4.1 6 2.2 75.5 8.1 6.5 3.9 5.6 1.0
24 70.8 7.6 9.5 3.8 5.6 2.5 48 55.7 7.6 17. l 3.3 5.7 2.7 72 42.6 7.4 28.2 3.2 5.9 3.3 96 29.0 7.4 40.0 2.7 6.0 3.4 120 13.9 7.3 50.3 2.4 6.1 3.3 3.9 7.2
Anexo 6
Tabela A6.1: Fermentação do hidrolisado de bagaço de cana por Candida guilliermondii
imobilizada em gel de alginato de cálcio, em frascos Erlenmeyer, no sistema de bateladas
repetidas - Ensaio A: Adição de sulfato de amônia e de extrato de farelo de arroz em todas as
bateladas
Batelada Tempo (h) Xilose (g/L) Xilitol (g/L)
1· o 96
78.0
20.7
o 25.9
o 96
76.5
2.6
4.0
46.8
o 96
76.8
1.7
7.1
48.7
Tabela A6.2: Fermentação do hidrolisado de bagaço de cana por Candida guilliermondii
imobilizada em gel de alginato de cálcio, em frascos Erlenmeyer, no sistema de bateladas
repetidas - Ensaio B: Adição de sulfato de amônio e de extrato de farelo de arroz na 1ª e na 3ª
bateladas
Batelada Tempo (h) Xilose (g/L) Xilitol (g/L)
o 96
75.0 O
18.3 26.7 ------------------------· l8 O 70.2 3.7
96 28.4 14.1 ------------------------· 3• O 70.2 4.3
96 4.8 42.0
Tabela A6.3: F ennentação do hidrolisado de bagaço de cana por Candida guilliermondii
imobilizada em gel de alginato de cálcio, em frascos Erlenmeyer, no sistema de bateladas
repetidas - Ensaio C: Adição de sulfato de amônio e de extrato de farelo de arroz na 1ª
batelada
Batelada Xilose (g/L) Xilitol (g/L) Tempo (h)
1· 74.6 O o 96 15.8 27.5
o 96
75.9
25.9
4.1
15.2
3• 76.2
25.8
2.7
12.0
o 96
Tabela A6.4: Fermentação do hidrolisado de bagaço de cana por Candida guilliermondii
imobilizada em gel de alginato de cálcio, em frascos Erlenmeyer, no sistema de bateladas
repetidas - Ensaio D: Adição de extrato de farelo de arroz em todas as bateladas
Batelada Tempo (h) Xilose (g/L) Xilitol (g/L)
1· 77.9 O o 96 28.6 16.5 ------------------------· 2• O 81.l 2.3
96 35.3 25.0 ------------------------· 3• O 79.7 3.3
96 35.4 26.5
Tabela A6.5: Fermentação do hidrolisado de bagaço de cana por Candida guilliermondii
imobilizada em gel de alginato de cálcio, em frascos Erlenmeyer, no sistema de bateladas
repetidas - Ensaio E: Adição de sulfato de amônio em todas as bateladas
Batelada Tempo (b) Xilose (g/L) Xilitol (g/L)
l" o 96
76.4 O
32.8 14.2
o 96
81.5
43.5
2.0
12.4
o 96
78.5
49.3
2.4
9.6
Tabela A6.6: Fermentação do hidrolisado de bagaço de cana por Candida guilliermondii
imobilizada em gel de alginato de cálcio, em frascos Erlenmeyer, no sistema de bateladas
repetidas - Ensaio F: Sem adição de sulfato de amônio e de extrato de farelo de arroz em
todas as bateladas
Batelada Tempo (b) Xilose (g/L) Xilitol (g/L)
1· o 72.3 o 96 31.4 12.1
.. - -- ------------------------· 2· o 74.5 2.5
96 42.2 9.0
3• o 96
79.7
40.7
1.7
8.7