Fiziopatologia Generală - 7. Imunitatea și Mecanismele Bolilor Imunitare

79

LUCRARE PRACTICĂ 7

7. IMUNITATEA ȘI MECANISMELE BOLILOR IMUNITARE

1. Fagocitoza

2. Reacțiile de hipersensibilitate de tip I (anafilaxia)

3. Determinarea formulei leucocitare pe un frotiu de sânge colorat Dia Panoptic

Test de verificare a cunoștințelor – 10 întrebări grilă cu 5 variante de răspuns

1. Fagocitoza

Fagocitoza este proprietatea unor celule specializate (leucocite) de a încorpora şi digera intracelular particule de dimensiuni microscopice străine din organism (ex: bacterii, substanţe macromoleculare, resturi celulare, etc).

Sistemul fagocitar este alcătuit, în mod normal, din celulele (leucocitele) fagocitare circulante (ex: granulocite neutrofile sau microfagele şi monocitele sau macrofagele), respectiv din celule ale sistemului fagocitelor mononucleare:

- celulele Kupffer din ficat; - celulele gliale din SNC; - celulele stelate din sinusoidele splinei; - celule specializate din măduva osoasă, ţesutul limfoid şi ganglioni limfatici; - în măsură mai redusă fibroblaştii, histiocitele, endoteliile capilare. Leucocitele reprezintă partea cea mai importantă a aparatului fagocitar, atât

prin faptul că sunt elementele cele mai mobile, cât şi prin posibilitatea creşterii rapide a numărului lor prin intensificarea diabazei medulare.

Mobilizarea şi activarea leucocitelor se află sub controlul direct al sistemului nervos vegetativ, în care veriga efectoare este reprezentată de secreţia de adrenalină/noradrenalină de către medulosuprarenală.

Fagocitoza este un proces care se desfăşoară în mai multe etape:

- identificarea factorului patogen; - migrarea celulei fagocitare (chemotaxie) înspre focarul lezional;

- emiterea de pseudopode (posibilă prin scăderea tensiunii superficiale locale a membranei celulare) spre subiectul de fagocitat;

- etapa de apropiere și de aderare (adeziune);

- etapa de înglobare a particulei străine (faza de ingestie);

- formarea în interiorul citoplasmei a unui fagozom;

- formarea fagolizozomului și digestia intracelulară.

Prin formarea fagolizozomului şi declanşarea acţiunii enzimelor lizozomale hidrolitice (ex: proteaze, nucleaze, lipaze, fosfataze, carbohidraze), care acţionează

Fiziopatologia Generală - 7. Imunitatea și Mecanismele Bolilor Imunitare

80

în mediul acid al vacuolei digestive, se ajunge la etapa finală a fagocitozei (exocitoza), în care are loc eliminarea resturilor de digestie

Fig. 1 Etape implicate în realizarea procesului de fagocitoză de către neutrofile

2. Reacțiile de hipersensibiliutate de tip I (imediate)

Hipersensibilitatea imediată poate evolua ca o tulburare cu caracter local sau

sistemic. Manifestările sistemice ale hipersensibilității imediate sunt declanşate de administrarea parenterală (injectabilă) a unor antigeni la care organismul gazdă a fost în prealabil sensibilizat. De cele mai multe ori, în decurs de câteva minute se declanşează o stare de şoc (anafilactic), care este fatal.

Răspunsul imediat constă în vasodilataţie, plasmexodie şi, dependent de localizare, spasmul musculaturii netede, respectiv eliberarea de secreţii glandulare. Aceste manifestări devin evidente în 5 până la 30 minute după expunerea la alergen şi se consumă în maximum 60 de minute.

Mastocitele joacă un rol central în declanşarea şi evoluţia reacţiilor de hipersensibilitate imediată. Celulele mastocitare îşi au originea în măduva osoasă hematogenă, fiind distribuite în majoritatea ţesuturilor şi organelor, iar în citoplasma au granule care conţin cantităţi mari de amine biologic active.

Majoritate a reacţiilor de hipersensibilitate imediată sunt mediate de imunoglobulinele de tip E (IgE)

Mediatorii primari ai hipersensibilităţii imediate: Aminele biogene – histamină, care determină contracţii ale musculaturii

netede bronşiolare, creşterea permeabilităţii vasculare şi creşterea secreţiilor la nivelul glandelor nazale, bronhiale şi gastrice.

Fiziopatologia Generală - 7. Imunitatea și Mecanismele Bolilor Imunitare

81

Enzime, conţinute de granulele citoplasmatice mastocitare, fiind reprezentate de o serie de proteaze neutre (ex: kinaza, triptaza) şi numeroase hidrolaze acide. Eliberarea acestor enzime determină leziunile tisulare, fapt ce determină eliberarea de noi kinine şi componente activate ale complementului.

Proteoglicanii – reprezentați de heparina şi condroitinsulfatul, servesc la acumularea şi stocarea altor mediatori în granulele citoplasmatice.

Fig. 2 Mecanismul fiziopatologic al hipersensibilității imediate (de tip I), mediată de imunoglobulinele de tip IgE. Necesită sensibilizare prealabilă. Recontactul cu alergenul sensibilizant (ex: polen, praf, medicamente etc.) va determina degranularea celulelor mastocitare și eliberarea explozivă de amine biogene în circulația sangvină. Histamina este efectorul principal implicat în reacțiile vasculare care vizează organe țintă, determinând la acest nivel vasodilatație și creșterea permeabilității capilare, cu manifestări de plasmexodie la nivel alveolar și edem pulmonar.

Fiziopatologia Generală - 7. Imunitatea și Mecanismele Bolilor Imunitare

82

3. Efectuarea frotiului de sânge și determinarea formulei leucocitare

Scopul lucrării : efectuarea, colorarea și exameninarea microscopică a unui

frotiu din sânge periferic pentru determinarea procentuală a diferitelor categorii de leucocite, prin numărarea a 100 de elemente celulare.

Materiale necesare: - probă de sânge de la un animal cu o boală inflamatorie; - lame, lame rodate sau lamele; - baterie pentru colorația Dia Quick Panoptic; (fig. 4) -microscop optic cu obiectiv de 20 și imersie (x 100) - ulei de imersie.

Tehnică de lucru:

- se ia o picătură de sânge cu diametrul de 2-3 mm cu marginea unei lame șlefuite, apoi se aplică pe lama port-obiect, în așa fel incât cele 2 lame să formeze un unghi de 30-45˚;

- se lasă timpul necesar pentru ca sângele să se distribuie omogen pe linia de contact dintre cele două lame;

- se imprimă lamei șlefuite o mișcare de translație ușoară, spre înainte pentru ca sângele să se întindă într-o peliculă subțire și uniformă;

Grosimea frotiului de sânge depinde de mărimea picăturii de sânge, respective de unghiul pe care îl formează lama de întindere cu lama port-obiect, dar și de viteza cu care se întinde frotiul. Frotiul se usucă prin agitare sau într-un curent de aer imediat după ce a fost realizat. În cazul unei uscări lente cu umiditate mare, celulele sanguine apar ratatinate, își pierd conturul normal.

Frotiul trebuie să fie subțire, cu margini drepte și paralele aproximativ la 1-2 mm de marginile lamei și să se termine cu franjuri.

Colorarea trebuie efectuată cât mai curând după uscarea frotiului.

Dacă acest lucru nu este posibil, se recomandă fixarea frotiului prin introducerea lui timp de 2-3 minute într-o baie de alcool metilic.

Fig. 3 Kitul de colorare Dia-Quick Panoptic în ordinea utilizării soluțiilor de colorare.

Fiziopatologia Generală - 7. Imunitatea și Mecanismele Bolilor Imunitare

83

Colorația Dia-Quick Panoptic

Reactivi: 1. Dia Fix Panoptic-soluție de fixare și precolorare 2. Dia Red Panoptic-soluție eozinofilă 3. Dia Blue Panoptic-soluție bazofilă

Medoda de lucru: - Pregătirea frotiurilor în mod obișnuit

Frotiul este introdus în soluția de fixare de 10-12 ori timp de 1 secundă;

Frotiul fixat se introduce în soluția Dia Red 1 secundă de 13-15 ori; Frotiul se introduce în soluția Dia Blue 1 secundă de 15-20 ori; Spălare cu apă distilată (nu este nevoie de spălare între colorări) Uscare

Fig. 4 Frotiu din sînge periferic pretabil pentru colorare (stînga) și frotiu

colorat (dreapta).

Intensitatea culorii se controlează prin numărul introducerilor în soluții a

frotiurilor. În momentul apariției precipitațiilor în soluție sau dacă nuanțele colorării nu mai corespund, soluțiile respective sunt uzate și trebuie schimbate

Pentru efectuarea formulei leucocitare se execută frotiuri din sânge periferic, se colorează și se examineaă la un microscop cu obiectivul de imersie.

Fiziopatologia Generală - 7. Imunitatea și Mecanismele Bolilor Imunitare

84

Se numără câte 100 de leucocite pe fiecare margine a frotiului. În scopul evitării examinării aceluiași câmp de mai multe ori, se recomandă deplasarea frotiului în același sens, făcând incursiuni succesive spre interiorul frotiului.

Pentru efectuarea formulei leucocitare, se întocmește un tabel ce cuprinde diferite tipuri de leucocite. Fiecare element (leucocit) identificat pe frotiu se notează în rubrica corespunzătoare categoriei sale.

Fig. 5 Imagine microscopică ale elementelor figurate din sânge periferic.

În principiu, se numără 200 de leucocite pentru o formulă leucocitară

corectă, câte 100 pe fiecare din marginile frotiului. Numărul de celule identificate pentru fiecare categorie leucocitară se împarte la 2, iar exprimarea finală a valorilor obținute se face în procente (%).

Înregistrarea rezultatelor:

FORMULA LEUCOCITARĂ (%) Polimorfonucleare granulocitare (PMN) Mononucleare agranulocitare

Neutrofile EozinofilE Bazofile Monocite Limfocite

Interpretarea rezultatelor:

La examenul microscopic, un frotiu reușit se recunoaște prin faptul că eritrocitele sunt etalate pe un singur strat, bine individualizate, cu margini apropiate și nu suprapuse . Valorile obținute sunt comparate cu valorile normale.

Valorile procentuale (relative) ale formulei leucocitare nu oferă o indicație certă pentru diagnostic sau pronostic, decât dacă sunt asociate cu numărarea leucocitelor totale, determinându-se astfel valorile absolute ale fiecărei subpopulații leucocitare. Cunoscând numărul total de leucocite pe mm3 (stabilit prin numărarea

Fiziopatologia Generală - 7. Imunitatea și Mecanismele Bolilor Imunitare

85

lor în hemocitometru), precum și procentul pe care il reprezintă fiecare categorie de leucocite (stabilit prin formula leucocitară), se poate calcula numărul de elemente albe din fiecare categorie pe unitate de volum.