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UNIVERSIDADE DO ALGARVE Faculdade de Ciências e Tecnologia Departamento de Química e Bioquímica Manual de laboratório e tratamento de erros em Técnicas Laboratoriais de Análise Isabel Cavaco Ana Rosa Garcia 2003/2004

Manual de laboratório e tratamento de errosw3.ualg.pt/~jpinhei/TeL 05-06/Manual-TeL-0405.pdf · 2005-09-19 · O capítulo I descreve os princípios de boas práticas de laboratório

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UNIVERSIDADE DO ALGARVE Faculdade de Ciências e Tecnologia

Departamento de Química e Bioquímica

Manual de laboratório e tratamento de erros

em Técnicas Laboratoriais de Análise

Isabel Cavaco

Ana Rosa Garcia

2003/2004

Manual de laboratório e tratamento de resultados

1

Preâmbulo

Estas folhas destinam-se aos alunos da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade do

Algarve que frequentem a disciplina de Técnicas Laboratoriais de Análise do curso de Bioquímica.

O capítulo I descreve os princípios de boas práticas de laboratório na medição rigorosa de massas e

volumes, que devem ser seguidos nas aulas práticas da disciplina. As regras descritas neste capítulo

são básicas, mas essenciais para os bons resultados em qualquer trabalho prático de análise

química.

O capítulo II descreve os procedimentos para tratamento e apresentação de números e resultados

experimentais.

As secções A e B sistematizam os conceitos de erros aleatórios e sistemáticos, precisão e exactidão.

devem ser lidas cuidadosamente pelos alunos de todos os níveis. Estes conceitos são fundamentais

para a compreensão do tratamento de resultados.

Na secção C descreve-se o conceito de algarismos significativos, e as regras de tratamento de

números. Deve ser lida cuidadosamente pelos alunos do primeiro ano, e consultado posteriormente

em caso de dúvida.

A secção D descreve o tratamento estatístico de conjuntos simples de resultados.

A secção E descreve o tratamento estatístico de conjuntos de resultados binários.

A secção F descreve o método de cálculo do erro associado a um valor resultante de uma ou mais

operações aritméticas (propagação de erros).

O capítulo III descreve as regras para a elaboração dos relatórios da disciplina.

O capítulo IV contém os protocolos dos trabalhos práticos a realizar no corrente ano lectivo.

Manual de laboratório e tratamento de resultados

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Índice

I. Medições de volumes e massas ...............................................................................................3

A. Medição de volumes de líquidos ........................................................................................3 1. Material para medição de volumes:....................................................................................3

B. Medição de massas ..........................................................................................................4 II. Tratamento de resultados .....................................................................................................5

A. Tipos de erros ..................................................................................................................5 B. Precisão e exactidão.........................................................................................................5 C. Algarismos significativos ...................................................................................................6

1. Regras de arredondamento...............................................................................................7 2. Manuseamento dos dados experimentais (operações matemáticas elementares): ................7

D. Intervalos de confiança .....................................................................................................8 E. Determinação da “melhor recta” que passa pelos pontos experimentais.............................10 F. Propagação de erros ......................................................................................................12

III. Relatório............................................................................................................................13 IV. Trabalhos práticos .............................................................................................................14

1. Medições de massas e volumes ......................................................................................14 2. Medição de pH ...............................................................................................................17 3. Titulação potenciométrica................................................................................................21 4. Cromatografia ................................................................................................................23 5. Cromatografia ................................................................................................................26 6. Espectroscopia de absorção molecular: a lei de Lambert-Beer ..........................................29 7. Espectroscopia de emissão: fluorescência .......................................................................31

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I. Medições de volumes e massas

A. Medição de volumes de líquidos 1. Material para medição de volumes: (1) Material de Vidro A medição de volumes é uma das acções mais frequentes num laboratório de análises. Entre o material volumétrico existente, distinguem-se: Pipetas, existem dois tipos fundamentais: volumétricas e graduadas. � Volumétricas - têm uma só marca indicadora do nível a que o líquido se deve ajustar de modo a que o valor vazado seja o valor fixo indicado na pipeta (mais rigorosas). � Graduadas – têm uma escala que permite o vazamento de quantidades varáveis de líquido (menos rigorosas). Balões volumétricos, o volume final deve ser ajustado, com o solvente, até ao traço. Buretas, tubo cilindrico graduado com uma “válvula” e com o qual é possivel controlar o fluxo e a quantidade de líquido vazado. O volume é lido na escala da bureta. Provetas, graduadas de modo a permitir a medição de volumes variáveis e lídos até ao valor máximo da sua escala. Rigor das medições:

Pipetas volumétricas – Pipetas graduadas – Balões volumétricos – Buretas – Provetas

+ rigor − rigor

As leituras de volume devem ser efectuadas tendo em conta a posição do menisco, considerando que o volume é o correspondente à sua base, tal como indicado na figura:

(a) Procedimento para utilização de pipetas volumétricas:

� Ajustar uma "pompete" à ponta superior da pipeta, segurando sempre a pipeta pela ponta superior (e nunca pelo meio!). � Mantendo a pipeta na posição vertical, mergulhá-la no líquido e enchê-la, por aspiração, utilizando a "pompette", até ligeiramente acima do traço superior .

� Remover quaisquer gotas de água aderentes ao exterior da pipeta, limpando-a num movimento descendente com papel absorvente. �Deixar escorrer a água lentamente e ajustar convenientemente o menisco. Eliminar qualquer gota em excesso que se encontre na extremidade da pipeta, encostando-a à parede molhada dum recipiente. � Assegurar-se que não existem gotas de água aderentes ao exterior da pipeta ou às paredes internas acima do menisco e que não há bolhas de ar nem espuma no líquido. � Deixar escoar livremente o líquido contido na pipeta para o recipiente, mantendo a pipeta na vertical, com a extremidade encostada à parede interna do recipiente, sem a deixar escorregar.

� Quando terminar o escoamento visível (o menisco deve permanecer imóvel ligeiramente acima da extremidade), manter a pipeta na mesma posição durante 3 segundos (ou, se a pipeta tiver tempo de espera, mantê-la durante o tempo indicado).

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(2) Micropipetas automáticas

A necessidade de medição de pequenos volumes de líquidos, na gama do mililitros ou microlitros, levou ao desenvolvimento de uma gama de pipetas automáticas de pontas descartáveis. A fiabilidade destes sistemas depende em grande parte da qualidade do instrumento, mas também de outros factores como a qualidade das pontas, o ambiente e o operador. Pontas descartáveis - a forma, propriedades do material e o ajuste da ponta à pipeta influenciam o rigor da medição. É importante verificar que a ponta encaixa bem na pipeta, testar a forma como se molha, e verificar se ficam gotas remanescentes depois de escoar o líquido. Condições ambientais - As fontes de erro do meio ambiente incluem a temperatura (diferença de temperatura entre a pipeta, o fluido e a temperatura ambiente), a pressão atmosférica e a humidade do ar. A maior contribuição para os erros ambientais é a temperatura. É importante garantir que todos os componentes estão à mesma temperatura, dentro de ±1ºC.

(a) Procedimento para utilização de micropipetas: � Ajustar a ponta na pipeta e ajustar o volume a medir. � Pressionar com o polegar o manípulo até à primeira paragem; � Segurando a pipeta verticalmente, introduzir a ponta cerca de 2-3 mm na amostra; � Soltar gradualmente o manípulo e observar o processo de enchimento (deve evitar-se a turbulência no interior da ponta, para minimizar o risco de formação de aerossóis). Quando o manípulo estiver na posição inicial, remover o polegar completamente (a ausência de pressão melhora a precisão). Lentamente, retirar a ponta da pipeta da amostra, e limpar quaisquer gotas de água que tenham ficado aderentes ao exterior. � Para escoar o volume medido, encostar a ponta da pipeta na parede do recipiente, num ângulo de 10-45º. Colocar o polegar sobre o manípulo e pressionar de forma uniforme até à primeira paragem. Esperar 1 segundo. Pressionar rapidamente até à segunda paragem. Cuidados a ter ao usar micropipetas: � a pipeta e respectiva ponta devem ser escolhidas de forma a minimizar o espaço de ar entre o pistão e o líquido;

� a ponta deve ser mergulhada apenas à superfície da solução (2-3mm de profundidade); � deve molhar-se previamente a ponta com a solução a medir, para melhorar a precisão e exactidão; � deve segurar-se a pipeta na vertical;

� a aspiração deve ser feita de forma suave, e não bruscamente. B. Medição de massas

Uma das operações mais frequentes num laboratório é a pesagem, operaç ão pela qual se determina a massa de uma substância. O grau de exactidão e precisão que é necessário satisfazer numa pesagem dependem da sua finalidade. Uma balança analítica, muito rigorosa, ±0,0001 g, tem uma capacidade que pode variar de 50 a 200 g.

Uma balança técnica é menos rigorosa, ±0,01 g, mas tem uma capacidade elevada que pode ser de ~1000 g. (a) Cuidados a ter durante as pesagens: � A balança deve ser mantida sempre limpa, ou seja, não se devem colocar reagentes directamente no prato mas sim sobre uma cápsula de pesagem (ex: vidro de relógio). As substâncias voláteis ou corrosivas devem ser pesadas em recipientes fechados. � A temperatura do objecto a pesar deve ser razoavelmente próxima da temperatura da balança. � As janelas da balança devem estar fechadas durante a pesagem. � Cada passo na pesagem - taragem, colocação do objecto no prato, leitura - deve ser feito lentamente, dando tempo suficiente à balança para atingir o equilíbrio. � O objecto a pesar deve ser cuidadosamente colocado no centro do prato da balança, para evitar erros de excentricidade. � Terminada a pesagem, a balança deve ser limpa, se necessário, as janelas fechadas e desligada se não for utilizada de imediato.

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II. Tratamento de resultados

A. Tipos de erros

Todas as medições experimentais estão sujeitas a erros. O resultado de uma análise pode ser quantitativo ou qualitativo. Quando o resultado é quantitativo, é extremamente importante fazer uma estimativa dos erros envolvidos na medição. Um resultado é inútil se não for acompanhado de uma estimativa dos erros envolvidos na sua medição. Podemos classificar os erros em três tipos:

Grosseiros (irremediáveis) Aleatórios Sistemáticos Erros grosseiros:

� Não entram no padrão normal dos erros associados a uma análise. Não devem ocorrer, e, se ocorrem e são detectados, normalmente é necessário repetir toda a análise.

� Ex: avaria de um instrumento; distracção do operador; contaminação macroscópica de um reagente, etc. Erros Aleatórios (ou Indeterminados):

� As suas fontes podem ser incerteza instrumental, do método ou do operador; � Não são elimináveis, mas podem minimizar-se com trabalho cuidadoso; � Reconhecem-se como uma dispersão dos valores em torno de uma média; � Afectam a precisão; � Podem quantificar-se pela medição da precisão (p. ex., através do desvio-padrão).

Erros Sistemáticos (ou Determinados):

� As suas fontes podem ser erros instrumentais, do método ou do operador; � Em princípio, são reconhecíveis e podem reduzir-se parcial ou completamente; � Reconhecem-se pelo afastamento entre o valor verdadeiro e o valor médio; � Afectam a exactidão; � Podem quantificar-se pela medição da diferença entre o valor verdadeiro e valor médio.

B. Precisão e exactidão Exactidão:

Concordância entre o valor obtido e o valor aceite como verdadeiro Precisão:

Concordância entre os valores obtidos no mesmo ensaio repetido várias vezes

A 201.60 202.20 201.80 202.00 202.40

B 197.60 202.80 200.40 196.00 204.20C 203.80 195.80 193.80 201.00 195.60D 200.80 199.60 200.40 199.40 200.80

200

Prec

isão

Exac

tidão

X

X

X

X

Resultados de análises de de Cl - numa água, em mg/L

A 201.60 202.20 201.80 202.00 202.40

B 197.60 202.80 200.40 196.00 204.20C 203.80 195.80 193.80 201.00 195.60D 200.80 199.60 200.40 199.40 200.80

200

Prec

isão

Exac

tidão

X

X

X

X

Resultados de análises de de Cl - numa água, em mg/L

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Precisão

reprodutibilidade

repetibilidadeprecisão intermédiaPrecisão

reprodutibilidade

repetibilidadeprecisão intermédia

(1) Repetibilidade Precisão obtida nas mesmas condições: � mesmo laboratório � mesmo operador � mesmo equipamento � curto intervalo de tempo

(a) Reprodutibilidade Precisão obtida fazendo variar as condições: � diferentes laboratórios � diferentes operadores � diferentes equipamentos � espaçamento no tempo

Exactidão ⇓

erros sistemáticos ⇓

erro = vxx −

Média: n

x

x

n

ii∑

== 1

Precisão ⇓

erros aleatórios ⇓

desvio-padrão

( )

11

2

=∑

=

n

xx

s

n

ii

variância: s2

desvio padrão relativo(RSD): xs

s r =

coeficiente de variação (CV): srx100 C. Algarismos significativos

O conceito de algarismos significativos permite introduzir de um modo simples a precisão de uma medida sem explicitar a sua incerteza. Este conceito permite também estimar a precisão de um valor que é calculado por combinação de diferentes tipos de medida, pois a incerteza de um valor é propagado em todas as contas que com ele forem feitas.

Contagem do número de algarismos significativos:

Valor Número de algarismos significativos

Obs:

5,630 4 Zero à direita da vírgula com significado

0,270 3 Zero à direita com significado mas o zero à esquerda da virgula sem significado

0,0004 1 Todos os zeros à esquerda da virgula sem significado

1,0007 5 Todos os algarismos com significado

8,1x107 2 Valor em notação científica. Apenas se consideram os algarismos antes do expoente

2x10-7 1

3,60x103 3

3600 2 ou 3 ou 4 Os zeros podem estar apenas a indicar a posição da virgula (ex. 36,0x102)

2,36 2 O número em índice indica um valor estimado (ex. 2,36 cm medidos com uma régua graduada em mm)

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1. Regras de arredondamento (de acordo com a norma Portuguesa NP-37/1961):

Os arredondamentos devem ser feitos de acordo com o valor do algarismo seguinte ao

qual se pretende arredondar, ou seja, quando se arredondar um algarismo à casa de ordem n, deve ser ter-se em conta o algarismo que está na casa de ordem n-1.

� Se o algarismo correspondente à casa de ordem n-1 é menor que 5, o número arredondado mantém inalterado o algarismo de ordem n (ex.: 11341 arredondado às dezenas é 11340, ou 342,53 arredondado às décimas é 342,5).

� Se o algarismo correspondente à casa de ordem n-1 é maior que 5, o número arredondado tem o aumento de uma unidade no algarismo de ordem n (ex.: 11346 arredondado às dezenas é 11350, ou 342,57 arredondado às décimas é 342,6)

� Se o algarismo correspondente à casa de ordem n-1 é 5, e nas casa n-2, n-3... pelo menos um algarismo é diferente de zero, o número arredondado tem também o aumento de uma unidade no algarismo de ordem n (ex.: 11345,01 arredondado às dezenas é 11350, ou 342,552 arredondado às décimas é 342,6).

� Se o algarismo correspondente à casa de ordem n-1 é 5, e nas casa n-2, n-3... não há algarismos, ou são zeros, existem três modos de proceder ao arredondamento:

(a) O valor a arredondar apresenta, com maior probabilidade, erro por excesso do que por defeito (é o caso dos valores resultantes de certos métodos de medida), neste caso o número arredondado mantém inalterado o algarismo de ordem n.

(b) O valor a arredondar apresenta, com maior probabilidade, erro por defeito do que por excesso (é o caso dos valores resultantes de divisões, interrompidas quando ainda deixavam resto; e dos que resultam de certos métodos de medida), neste caso o número arredondado tem o aumento de uma unidade no algarismo de ordem n.

(c) Não há motivos para supor que o valor a arredondar apresenta, com maior probabilidade, erro por excesso ou por defeito, neste caso o valor arredondado é obtido somando uma unidade ao algarismo de ordem n se este for ímpar (ex.: 11335 arredondado à dezenas é 11340; se 342,55 arredondado às décimas é 342,6; se 43,735 arredondado às centésimas é 43,74) ou mantendo inalterado o algarismo de ordem n se este for par (ex.: 11345 arredondado à dezenas é 11340; se 342,65 arredondado às décimas é 342,6; se 43,745 arredondado às centézimas é 43,74).

2. Manuseamento dos dados experimentais (operações matemáticas elementares):

� Adição e subtração: nos cálculos são utilizados todas as casa decimais, mas o número de casa decimais significativas do resultado não pode ultrapassar o menor número de casas significativas das parcelas. Ex.:

22,33

2,23 3

0,22 33

24,78 63 = 24,79

arredondamento

� Multiplição e divisão: o resultado tem o número de algarismos significativos idêntico ao do factor com menor número de algarismos significativos (ex.: 0,2x103,4 = 20,68 ou seja 0,2x102 ou 0,21x102; 0,2x140,7 = 28,14 ou seja 0,3x102 ou 0,28x102). Neste último caso é notário a informação dada pela numenclatura com índice. NOTA: os números inteiros quando multiplicados por reais não afectam o

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número de algarismos significativos, ou seja se um computador custar 6.000 euros, dois computadores custam 12.000 euros e não 1x104 euros...

� Logaritmos: o argumento do logaritmo e a mantissa do seu resultado deverão ter o mesmo número de algarismos significativos (ex.: log 2,02 = 0,305)

D. Intervalos de confiança É importante quantificar os erros aleatórios numa medição experimental. Isto faz-se determinando um intervalo de confiança para o resultado final.

O intervalo de confiança representa-se como

"x ± ∆x, para um nível de confiança de α %"

e significa que há uma probabilidade α de o valor que medimos se encontrar entre x-∆x e x+∆x.

A forma mais simples de estimar um intervalo de confiança é fazer a mesma medição repetidas vezes. Os erros aleatórios que ocorrem em cada medição serão diferentes. Uns serão por excesso, outros por defeito. Fazendo a média de todos os resultados, estaremos a compensar os erros por excesso com os erros por defeito, e, portanto, a minimizar os erros aleatórios de forma geral. Quanto mais medições fizermos, melhor.

O valor médio de n repetições da mesma medição, xm, é uma estimativa do valor verdadeiro da propriedade que queremos medir (chamemos a este µ ). Se fosse possível fazer infinitas medições, conseguiríamos eliminar totalmente os erros aleatórios. Só nesse caso é que teríamos a certeza de que o valor médio das medições seria igual ao valor verdadeiro. Na prática, isto é impossível. Nunca conseguimos saber o valor µ com rigor absoluto. O melhor que podemos fazer é estimar um intervalo que tenha uma probabilidade elevada de o conter.

Sabemos que o desvio padrão é uma medida dos erros aleatórios que ocorreram nas medições.

A maior parte dos erros aleatórios obedece a um tipo comportamento estatístico, a que chamamos "distribuição normal" ou "distribuição de Gauss". Se representássemos num histograma1 infinitas medições sujeitas a erros aleatórios, este teria a forma de uma "boca de sino" designada por "curva de distribuição normal". Estas curvas são simétricas, e são definidas por dois parâmetros: a média (µ) e o desvio padrão (σ) 2. Na figura seguinte representam-se duas curvas de distribuição normal com a mesma média (µ=200) e desvios padrão diferentes (σ1=1,0 e σ2=2,5). É de salientar que:

- os valores ocorrem mais frequentemente próximo da média, e são progressivamente menos frequentes quando nos afastamos para os extremos (o máximo da curva está em µ);

- quanto maior o desvio padrão σ (maior é a dispersão dos valores em torno da média µ) mais "larga" é a curva.

1 Um histograma é um gráfico que traduz a frequência com que ocorre cada valor. No eixo das abcissas representam -se os valores, e no eixo das ordenadas o número de vezes que cada um ocorreu.

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0.45

190 195 200 205 210

y

x µ

σ1

σ2

σ1 < σ2

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Uma das propriedades mais úteis das curvas de distribuição normal é que, qualquer que seja µ e σ, cerca de 95% de todas as medições encontram-se no intervalo µ-2σ e µ+2σ. Da mesma forma, encontra-se sempre uma percentagem (p%) bem definida de todas as medições em qualquer intervalo µ±zσ. Isto significa que, quando faço uma medição x, há p% de probabilidade de o valor verdadeiro, µ, estar dentro do intervalo x±zσ. Os valores de z encontram-se tabelados em função da probabilidade (nível de confiança). Os mais vulgarmente usados são:

p% z

95,0% 1,96

99,0% 2,58

99,7% 2,97

Para calcular o intervalo de confiança, já só preciso de saber o valor de σ. Há duas hipóteses:

- se fizer um número elevado de medições 3, posso calcular o desvio padrão s e dizer que σ ≈ s.

- se não for possível fazer um número suficientemente grande de medições, calculo o desvio padrão, s, e em vez de multiplicar por z multiplico por outro factor, o t de student.

O valor t de student encontra-se tabelado em função do nível de risco, (100-p), e do número de graus de liberdade, gl. Este é dado por gl = n - 1 quando estamos a fazer uma média de n medições.

Na Tabela 1 encontram-se alguns valores deste parâmetro4.

Tabela 1 - Distribuição t de student para níveis de risco de

5% e 1%

gl 0.05 0.01 1 12.71 63.66 2 4.30 9.92 3 3.18 5.84 4 2.78 4.60 5 2.57 4.03 6 2.45 3.71 7 2.36 3.50 8 2.31 3.36 9 2.26 3.25 10 2.23 3.17 20 2.09 2.85 30 2.04 2.75 40 2.02 2.70 50 2.01 2.68 60 2.00 2.66 70 1.99 2.65 80 1.99 2.64 90 1.99 2.63

100 1.98 2.63

2 Passaremos a designar por µ e por σ a média e o desvio padrão de uma curva de distribuição normal, que seriam teoricamente obtidos através de infinitas medições e corresponderiam aos valores "verdadeiros", e por xm e por s a média e desvio padrão calculados com um conjunto finito de n pontos experimentais. 3 O que é um "número elevado de medições" varia, conforme os casos. Em geral, considera-se n>30 suficientemente elevado. 4 Também pode calcular-se t numa folha de cálculo excel (versão inglesa) com a função TINV(risco, gl).

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O intervalo de confiança obtido para uma única medição x será então

stx np ×± −1,

No entanto, geralmente fazem-se n medições (são necessárias para determinar s), e o valor médio dessas medições, xm, é uma aproximação melhor ao valor verdadeiro do que as medições individuais. Demonstra-se que o desvio-padrão da média, sm é igual ao desvio-padrão dos valores individuais, s, dividido pela raiz quadrada do número de valores usados na média. O melhor intervalo de confiança que conseguimos assim obter com n medições será:

ns

tx npm 1, −±

E. Determinação da “melhor recta” que passa pelos pontos experimentais Frequentemente fazem-se medições de uma propriedade que varia linearmente com outra (por exemplo, a absorvência de uma solução pode variar linearmente com a sua concentração, segundo a lei de lambert-beer). No entanto, as medições estão sempre sujeitas a erros aleatórios, pelo que, em geral, os pontos experimentais não coincidem com uma recta. Nestes casos, é necessário determinar a equação (y=mx+b) da recta que melhor se ajusta ao conjunto do dados experimentais. A este tipo de cálculo chama-se "regressão linear".

Um dos métodos mais usados para fazer regressão linear é o método dos mínimos quadrados. Neste método, procura-se minimizar a distância "vertical" de cada ponto experimental x a uma recta teórica, mx+b (ver figura).

O método parte de dois pressupostos muito importantes:

1. os erros aleatórios ocorrem apenas nas ordenadas (y), e não nas abcissas (x)

2. a ordem de grandeza dos erros aleatórios não varia ao longo da recta.

Com estes pressupostos, o método calcula os "residuais", que são a distância, na vertical, de cada ponto experimental, yi, à recta: ii yy )−

(onde ýi representa o valor esperado de y, valor que yi teria se não tivesse erro, ou seja, se tivesse "caído" sobre a recta).

A função U é a soma dos quadrados dos residuais, e é uma medida do afastamento de todos os pontos experimentais a uma recta teórica de declive m e ordenada na origem b:

( )

( ) min2

2

→−⋅−=

=−=

iii

iii

bxmy

yyU )

Na função U, as incógnitas são m (o declive da recta) e b (a ordenada na origem). Pode calcular-se o mínimo desta função derivando e igualando a zero. O resultado deste cálculo dá as seguintes fórmulas para m e b:

xmyb

S

Sm

xx

xy

⋅−=

=

onde N é o número de pontos experimentais (x i, yi). Os parâmetros Sxx, Syy e Sxy podem calcular-se por:

y

x

x

x

x x

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( ) ( )

( ) ( )

( )( ) ( )( )∑ ∑ ∑∑∑ ∑ ∑

∑ ∑ ∑

−=−−=

−=−=

−=−=

N

yxyxyyxxS

N

yyyyS

N

xxxxS

iiiiiixy

iiiyy

iiixx

2

22

2

22

Da regressão linear retira-se outro parâmetro muito importante, o desvio padrão dos residuais, sy:

( )22

22

⋅−=

−−

= ∑N

SmS

N

yys xxyyii

y

)

O desvio padrão dos residuais é uma quatificação dos erros aleatórios que afastam os pontos da recta. Pode usar-se para determinar o desvio padrão do declive, sm e da ordenada na origem, sb:

( ) ( )∑∑∑ ∑

∑−

⋅=−⋅

⋅=

=

2

222

2 1

i

i

y

ii

iyb

xx

ym

xx

N

sxxN

xss

S

ss

Assim, podemos determinar a equação da recta que melhor passa pelos pontos experimentais, com intervalo de confiança para o declive e ordenada na origem:

)()( 2,2, bnpmnp stbxstmy ⋅±+⋅⋅±= −−

(Note-se que, neste caso, o número de graus de liberdade para o t de student é n-2, e não n-1)

Um parâmetro que traduz de forma simples se o ajuste da recta é bom ou não é o coeficiente de correlação . O cálculo deste pode ser feito utilizando a expressão:

yyxx

xy

SS

Sr

⋅=

O coeficiente de correlação pode tomar valores entre +1 e –1, quando |r|=1 então existe uma relação linear entre x e y (os resultados experimentais podem ser descritos por uma recta), se r=0 existe uma independência completa entre os valores de x e y (os resultados não apresentam qualquer relação linear).

Em métodos instrumentais de análise a regressão linear é frequentemente usada para construir com soluções padrão uma recta de calibração, que posteriormente é usada para determinar a concentração de uma amostra. Nestes casos, o desvio padrão sc associado à concentração C determinada a partir da recta é:

( )xx

cyc Sm

yyNLm

ss

⋅−

++= 2

211

onde L é o número de réplicas da amostra que foram lidas, y c é a média das L leituras da amostra,

e y é a média das leituras das N soluções padrão que foram usadas para construir a recta.

O intervalo para a concentração da amostra será então C ± 2 sC, para 95% de confiança.

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F. Propagação de erros Na maior parte das análises é necessário efectuar operações aritméticas sobre os resultados de uma medição, ou combinar os resultados de várias medições, cada uma sujeita a erros aleatórios, de forma a obter um resultado final. O desvio padrão deste resultado final pode calcular-se a partir dos desvios padrão de cada medição, aplicando a lei de propoagação de erros de Gauss. Dada um função y=f(x1, x2, x3,...,xn), em que xi são variáveis aleatórias independentes, descritas por desvios padrão sxi, então o desvio-padrão da função y será dado por:

∑=

∂∂

n

1i

2xi

2

is

xy

Resolvendo esta equação para os casos mais simples, obtém-se a tabela seguinte:

Função desvio padrão Função desvio padrão

y = x1 + x2 ou y = x1 - x2

sy = 2

221 xx ss + y = ln x sy =

xsx

y = x1 ⋅ x2 ou y = x1 / x2 y

s y =

2

2

2

2

1

1

+

xs

xs xx y = log x sy =

xsx

10ln1

y = xa

y

s y =

xs

a x y = ex

y

s y= ex

y = ex

y

s y = sx y = 10x

y

s y= (ln 10) ⋅ ex

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13

III. Relatório

O relatório deve conter apenas a informação necessária para o trabalho, não devendo por isso ser muito extenso. Um relatório prático destina-se a:

- explicar a experiência efectuada, descrever os resultados experimentais, apresentar os cálculos efectuados e discutir os resultados obtidos.

Um relatório prático deve ser elaborado de tal forma que: - outra pessoa possa repetir o trabalho efectuado com base nele, qualquer pessoa possa

perceber qual o objectivo do trabalho, o que se fez, quais foram os resultados obtidos e ter uma apreciação crítica dos resultados.

As normas seguintes destinam-se a ajudar na elaboração de relatórios práticos. Um relatório é composto por:

- Titulo - Objectivos/Introdução - Métodos/Parte Experimental - Apresentação de Resultados Experimentais - Cálculos e Discussão de Resultados - Conclusões - Bibliografia

Título: Deve ser claro e descritivo. Objectivos/Introdução: Deve conter uma descrição simples e clara dos objectivos, dos dados que vão ser recolhidos e dos príncipios que vão ser demonstrados. A Introdução pode conter os Objectivos. A Introdução deve ser uma descrição concisa da história e da teoria relevantes para o trabalho prático. Tome em consideração a metodologia específica da(s) experiência(s) realizada(s). Podem ser adicionados esquemas quando forem relevantes. A Introdução não deve ter mais do que meia página A4 (10 a 15 linhas). Métodos/Parte Experimental: Não copie o protocolo prático. Pode adicionar uma cópia do protocolo ao relatório para consulta. Quaisquer modificações, desvios ou adições ao protocolo devem ser registadas. Devem sempre especificar todo o equipamento usado (se necessário) e também descrever os reagentes usados (especialmente o tipo de reagente e o grau de pureza). Apresentação de Resultados Experimentais: Sempre que possível os resultados devem ser apresentados em tabelas. Cada tabela deve ser numerada para eventual referência no texto e incluir uma breve descrição do seu conteúdo (ex: Tabela III - Efeito do ácido clorídrico nas roupas dos estudantes que não usam bata). A primeira linha de cada coluna da tabela deve conter o nome da quantidade e respectiva unidade, incluindo quando necessário o factor multiplicativo usado. As unidades são muito importantes. Não inclua mais do que três algarismos significativos nos números a menos que esteja convencido que o seu erro experimental é extremamente baixo (<1%). (Note que a gota típica deixada numa bureta de 5 ml é de 0.05 ml, ou seja, 1%). Cálculos e Discussão de Resultados: Duma maneira geral os cálculos devem ser apresentados de forma completa. Se tiver muitos cálculos iguais deve apresentar detalhadamente um deles e depois pode apresentar apenas os resultados finais dos outros casos idênticos. Os resultados finais dos cálculos devem ser apresentados em destaque e devem estar sempre em concordância com os erros calculados. A discussão é uma das partes mais importantes do relatório. As discussões não são obrigatoriamente longas, mas devem ser completas e concisas. Pode discutir os cálculos conforme forem sendo apresentados. A discussão deve ser feita do ponto de vista de avaliação dos resultados finais, do seu significado e da sua exactidão. Tente pensar sobre as possíveis implicações dos resultados, relacionando-os com os objectivos do trabalho. Conclusões: As conclusões devem ser uma descrição breve do que foi encontrado ou demonstrado na aula prática. É por vezes também apropriado incluir um resumo dos resultados quantitativos. As conclusões são feitas com base nos objectivos do trabalho.

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IV. Trabalhos práticos

1. Medições de massas e volumes

Objectivos

Nesta aula pretende-se sensibilizar os alunos para as boas práticas de laboratório nas operações mais básicas em laboratórios de análises: a medição de massas e de volumes.

Calibração de Balões Volumétricos

Definição:

O volume nominal dum balão volumétrico define-se como o volume de água destilada, a 20ºC, expresso em cm3, contido no balão, também a 20ºC, quando cheio até ao traço de referência.

Procedimento:

1. Num recipiente apropriado colocar a água com que se vai proceder à calibração e, por intermédio do termómetro, ler a sua temperatura e registá-la.

2. Tarar o balão (incluindo a tampa), perfeitamente limpo, seco e vazio. 3. Colocar o balão numa superfície plana e horizontal e enchê-lo, até ligeiramente abaixo do seu

traço de referência. 4. Acrescentar lentamente água até ajustar convenientemente o menisco. Tapar o balão. 5. Assegurar-se que não existem quaiquer gotas de água aderentes ao exterior do balão ou às

paredes internas acima do menisco e que não há bolhas nem espuma na água. 6. Pesar o balão com a água e registar o valor da massa.

Calibração de Pipetas de um traço e de pipetas graduadas, de escoamento total

Definição:

O volume nominal deste tipo de pipetas define-se como o volume de água destilada, a 20ºC, expresso em cm3, escoado livremente pela pipeta, também a 20ºC, desde o traço mais elevado da escala até ao escoamento total.

Procedimento:

1. Tarar o recipiente de pesagem (incluindo a tampa), perfeitamente limpo, seco e vazio. 2. Num recipiente apropriado colocar a água com que se vai proceder à calibração e, por

intermédio do termómetro, ler a sua temperatura e registá-la. 3. Mantendo a pipeta na posição vertical, mergulhá-la na água e enchê-la, por aspiração,

utilizando uma "pompette", até ligeiramente acima do traço superior (ou do traço correspondente ao volume que se queira calibrar).

4. Remover quaiquer gotas de água aderentes ao exterior da pipeta, limpando-a num movimento descendente com papel absorvente.

5. Deixar escorrer a água lentamente e ajustar convenientemente o menisco. Eliminar qualquer gota em excesso que se encontre na extremidade da pipeta, encostando-a à parede molhada dum recipiente.

6. Assegurar-se que não existem gotas de água aderentes ao exterior da pipeta ou às paredes internas acima do menisco e que não há bolhas nem espuma na água.

7. Deixar escoar livremente a água contida na pipeta para o recipiente de pesagem, mantendo a pipeta na vertical, com a extremidade encostada à parede interna do recipiente, sem a deixar escorregar.

8. Quando terminar o escoamento visível (o menisco deve permanecer imóvel ligeiramente acima da extremidade), manter a pipeta na mesma posição durante 3 segundos (ou, se a pipeta tiver tempo de espera, mantê-la durante o tempo indicado).

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Calibração de Pipetas automáticas

Definição:

O volume nominal deste tipo de pipetas define-se como o volume de água destilada, a 20ºC, expresso em cm3, escoado livremente pela pipeta, também a 20ºC, entre a posição "livre" e a primeira paragem do manípulo.

Procedimento:

1. Tarar o recipiente de pesagem (incluindo a tampa), perfeitamente limpo, seco e vazio. 2. Num recipiente apropriado colocar a água com que se vai proceder à calibração e, por

intermédio do termómetro, ler a sua temperatura e registá-la. 3. Ajustar a ponta na pipeta e ajustar o volume a medir. 4. Em pipetagem directa:

a. pressionar com o polegar o manípulo até à primeira paragem; b. segurando a pipeta verticalmente, introduzir a ponta cerca de 2-3 mm na amostra; c. soltar gradualmente o manípulo e observar o processo de enchimento (deve evitar-se

a turbulência no interior da ponta, para minimizar o risco de formação de aerossóis). Quando o manípulo estiver na posição inicial, remover o polegar completamente (a ausência de pressão melhora a precisão). Lentamente, retirar a ponta da pipeta da amostra, e limpar quaisquer gotas de água que tenham ficado aderentes ao exterior.

d. Para escoar o volume medido, encostar a ponta da pipeta na parede do recipiente, num ângulo de 10-45º. Colocar o polegar sobre o manípulo e pressionar de forma uniforme até à primeira paragem. Esperar 1 segundo. Pressionar rapidamente até à segunda paragem.

5. Em pipetagem reversa: e. ao contrário da pipetagem normal, pressionar com o polegar o manípulo totalmente

até à segunda paragem; f. segurando a pipeta verticalmente, introduzir a ponta na amostra e aspirar o líquido,

como indicado em 12c. Neste caso, a ponta da pipeta conterá um volume de líquido superior ao que se pretende medir.

g. Para escoar o volume medido, pressionar o manípulo apenas até à primeira paragem, e tocar rapidamente com a ponta na parede do recipiente. O líquido que fica retido na ponta é despejado noutro recipiente.

Cálculos

Conversão do peso para volume Têm de se efectuar sempre duas pesagens: uma correspondente ao recipiente cheio e outra correspondente ao recipiente vazio. A diferença entre os resultados das duas pesagens fornece a massa aparente da água contida no recipiente calibrado. Para se obter o volume contido no recipiente calibrado, à temperatura de referência, é necessário ter em atenção os seguintes factores: - a massa volúmica da água, à temperatura de calibração; - o efeito da impulsão do ar na água e nos pesos da balança; - a expansão térmica do material do recipiente calibrado entre a temperatura de calibração e a temperatura de referência. A equação geral para o cálculo do volume, à temperatura de referência de 20ºC, V20, a partir da massa aparente da água contida ou escoada, é dada por5:

( )[ ]20111

20 −−×

−×

−×= tMV

B

A

Aw

γρρ

ρρ (1)

onde V20 é o volume, à temperatura de 20ºC, em ml; M é a massa aparente, em g; ρw é a massa volúmica da água, à temperatura de calibração t, em g/ml (obtida na tabela anexa), ρA é a massa volúmica do ar, em g/ml (para temperaturas muito próximas de 20ºC e à pressão atmosférica normal pode usar-se o valor médio de 0,0012 g/ml); ρB é a massa volúmica de referência dos pesos da balança (normalmente este valor é de 8,0 g/ml); γ é o coeficiente de expansão cúbica do material de

5 "Guia RELACRE 1 - Calibração de Material Volumétrico", RELACRE, 1995

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16

que é feito o recipiente calibrado, em ºC-1 (para vidro classe A é 0,000010ºC-1), e t é a temperatura da água utilizada na calibração, em ºC. Substituindo:

( )[ ]201010012,0

99985,0 520 −−×

−×= − tMV

wρ (2)

Cálculo do volume médio

Determinar a massa média, xm de um conjunto de 10 pesagens. Calcular o volume médio, Vm a partir da equação (2), substituindo M por xm.

Determinação do erro de indicação (exactidão)

Erro absoluto: Ea = xmedido - xverdadeiro = Vindicado - Vm

Erro relativo: E(%) = 100×mV

Ea

Cálculo do desvio-padrão:

( )

11

2

−=

∑=

n

xxs

n

imi

m

onde sm é o desvio-padrão das pesagens, n é o número de pesagens efectuadas (n=10), xi o resultado de cada pesagem i individual e xm a massa média de todas as pesagens. O desvio-padrão do volume, sv , é dado pela equação (2), substituindo M por sm. Cálculo do coeficiente de variação:

CV(%) = 100×m

v

Vs

Comparar os resultados com as especificações indicadas no material volumétrico. O material cumpre as especificações se o erro e o coeficiente de variação forem iguais ou inferiores aos especificados. Especificações vulgares para pipetas automáticas:6

Volume nominal da pipeta (µl) Erro máximo (µl) 1-50 0,1 - 0,8

>50 - 1000 1,0 - 10 > 1000 > 10

Bibliografia: J. A. Martinho Simões, M. A. R. Botas Castanho, I. M. S. Lampreia, F. J. V. Santos, C. A. Nieto de Castro, M. de Fátima Norberto, M. teresa Pamplona, L. Mira, M. M. Meireles, "Guia do Laboratório de Química e Bioquímica", Lidel, 2000.

6 "Standard Operating Procedure for Pipettes", Brinkmann/Eppendorf, 2001, disponível em http://www.brinkmann.com/pdf/5101-C201.pdf, em Fevereiro 2003.

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2. Medição de pH Objectivos Nesta aula pretende-se sensibilizar os alunos para os erros associados à medição de pH. Introdução

A determinação do pH é muito importante num grande número de áreas, desde a determinação da qualidade de uma água até à análise do pH do sangue. O pH é a medida da actividade dos protões livres em solução, e define-se como:

pH = −log10 aH+

A técnica padrão para esta determinação é a potenciometria, usando eléctrodos de membrana de vidro.

O eléctrodo de vidro é sensível aos iões H+. A base do funcionamento de um eléctrodo de membrana de vidro é a permuta iónica nas duas superfícies de uma membrana de vidro especial, normalmente composta por grupos Na2O e SiO2. Antes de utilizar um eléctrodo de vidro é necessário saturar a membrana em água. Esta formará na superfície do vidro uma camada gel hidratada. Se a membrana for mergulhada em água à temperatura ambiente, a formação desta camada demorará entre 24 a 48 h. O contacto com meios abrasivos, solventes orgânicos e soluções contendo iões F- danifica a camada gel hidratada.

A figura 1 mostra a constituição de um eléctrodo combinado de vidro.

Eléctrodo de referência exterior

Diafragma

Eléctrodo de referência interior

Solução tampão interior (Cl -, pH=7)

Eléctrodo de referência exterior

Diafragma

Eléctrodo de referência interior

Solução tampão interior (Cl -, pH=7)

Figura 1 - Consituição de um eléctrodo combinado de vidro para a medição do pH.

Potencial de assimetria Quando o eléctrodo de vidro é introduzido numa solução idêntica à solução tampão interior, o

potencial medido E deveria ser igual a zero, visto que os eléctrodos de referência interior e exterior são idênticos. Existe no entanto uma contribuição para o potencial da célula, designada por potencial de assimetria, que causa um desvio de alguns mV. Este potencial depende da construção do eléctrodo e do estado da membrana, e deve-se à falta de uniformidade na sua composição, a tensões exercidas sobre a membrana, a ataques mecânicos e químicos que tenha sofrido ao longo do tempo, ou a diferentes graus de hidratação da membrana.

Declive O medidor de pH mede o potencial de uma célula electroquímica constituída pelo eléctrodo de

vidro e por um eléctrodo de referência. Este potencial varia linearmente com o pH, e, num eléctrodo real, pode ser descrito como

)((int)

l303.210 exta

aog

FRTQE

H

Hcel

+

+−= β

onde Q é uma constante (igual ao potencial de assimetria, se os dois eléctrodos de referência forem idênticos) e aH+(int) e aH+(ext) são as actividades dos iões H+ na solução interior e no exterior da membrana de vidro, respectivamente. Se a resposta do eléctrodo fosse perfeitamente nernstiana, o declive teria o valor 0,05916 mV a 25 ºC. Na realidade o declive é ligeiramente inferior, e vai diminuindo ao longo da vida do eléctrodo. O termo β (vulgarmente designado por slope pelos fabricantes de medidores de pH) traduz este efeito, e é uma boa medida do estado de funcionamento do eléctrodo.

Num eléctrodo combinado novo e em boas condições, o valor do potencial de assimetria deve ser próximo de zero, e β próximo de 1.

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Erro alcalino Em soluções muito alcalinas, podem ocorrer erros provocados pelo facto de a membrana

responder também aos iões de metais alcalinos, indicando assim um valor de pH demasiado baixo. O erro alcalino depende do valor de pH, da temperatura e do tipo e concentração dos iões

alcalinos presentes em solução.

6 7 8 9 10 11 12 13 14

-400

-300

-200

-100

0

100

pHU /

mV

Recta teórica

Desvio alcalino

E / mV

6 7 8 9 10 11 12 13 14

-400

-300

-200

-100

0

100

pHU /

mV

6 7 8 9 10 11 12 13 14

-400

-300

-200

-100

0

100

pHU /

mV

Recta teórica

Desvio alcalino

E / mV

Figura 2 - Erro alcalino na medição do pH.

Calibração do medidor de pH

O estado da membrana de vidro, e especialmente da camada hidratada, está sujeito a

variações ao longo do tempo. Por esta razão, é necessário fazer periodicamente a calibração do pH, por exemplo diariamente ou sempre que se faz uma medição. O objectivo da calibração é fazer coincidir as características do eléctrodo, sob a forma do potencial de assimetria e do declive nernstiano, com as características do medidor de pH, de forma que este atribua leituras de pH aos valores de potencial medidos.

A calibração é feita recorrendo a duas soluções tampão de pH conhecido. Atenção que o valor de pH destas soluções varia com a temperatura. No caso de soluções comerciais, a variação do pH com a temperatura encontra-se geralmente tabelada na embalagem.

Seleccionam-se duas soluções tampão de tal modo que as leituras de pH das amostras fiquem dentro do intervalo de calibração. Normalmente usa-se o pH 7 como uma das soluções tampão. Preferencialmente, as duas soluções não devem diferir mais de 3 unidades de pH entre si (por exemplo, pH 4 e 7 ou pH 7 e 10).

Os potenciómetros dispõem de dois botões de regulação, um para acertar o potencial de assimetria (Ea) e outro para acertar o declive (s ). No primeiro passo da calibração introduz-se o eléctrodo na solução tampão de pH 7, e regula-se o botão Ea do potenciómetro de modo a indicar pH=7. Este potencial corresponde ao potencial de assimetria (Figura 3).

7 14

-200

0

200

pH

U /

mV

pHas

Eas

E / mV

7 14

-200

0

200

pH

U /

mV

pHas

Eas

7 14

-200

0

200

pH

U /

mV

pHas

Eas

E / mV

Figura 3 – Primeiro passo da calibração: acerto do potencial de assimetria.

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19

No segundo passo, introduz-se o eléctrodo na outra solução tampão e regula-se o botão s de modo a indicar o valor de pH correspondente. Deste modo acerta-se o declive da recta (Figura 4)

7 14

-200

0

200

pH

U /

mV

s

E / mV

7 14

-200

0

200

pH

U /

mV

s

7 14

-200

0

200

pH

U /

mV

s

E / mV

Figura 4 – Segundo passo da calibração: acerto do declive.

Em medições rigorosas, é necessário que a temperatura da calibração seja igual à temperatura

das medições.

Manutenção dos eléctrodos de pH

Armazenamento - eléctrodos de vidro: mergulhados em água destilada. - eléctrodos de pH combinados e eléctrodos de referência: mergulhados numa solução de

electrólito, 3M em KCl. Nunca se devem guardar em água destilada, pois há o risco de precipitação de AgCl no diafragma. Execução Experimental: 1. Calibração do medidor de pH

1) Preparar duas soluções tampão de pH 7 e pH 4.

2) Medir a temperatura das soluções com o termómetro destinado ao efeito. Consultar a tabela temperatura vs pH de cada solução tampão e anotar o valor de pH dos tampões para a temperatura lida.

3) Lavar o eléctrodo com água destilada e seguidamente com a solução tampão pH 7.

4) Mergulhar os eléctrodos na primeira solução tampão e esperar que a leitura estabilize.

5) Seleccionar a leitura de potencial, e anotar o valor do potencial medido (E7).

6) Seleccionar a leitura de pH. Ajustar o medidor para ler o valor de pH do tampão pH 7 corrigido para a temperatura da solução.

7) Lavar o eléctrodo com água destilada e seguidamente com a 2ª solução tampão.

8) Mergulhar o eléctrodo na 2ª solução tampão e esperar que a leitura estabilize.

9) Seleccionar a leitura de potencial, e anotar o valor do potencial medido (E4).

10) Seleccionar a leitura de pH. Ajustar o medidor para ler o valor de pH do 2º tampão corrigido para a temperatura da solução.

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2. Análise do pH de uma água.

11) Lavar o eléctrodo com água destilada e seguidamente com a solução de amostra.

12) Mergulhar o eléctrodo na amostra e esperar que a leitura estabilize. Registar a leitura de potencial e de pH.

Observações:

- Durante as medições, remover a tampa do furo de enchimento do eléctrodo de referência.

- Entre medições, lavar o eléctrodo com água destilada e seguidamente com a próxima solução a medir. No caso de ser necessário limpar o bolbo do eléctrodo com papel, evitar friccioná-lo, para reduzir a possibilidade de erros por polarização.

- Agitar sempre as amostras e soluções tampão antes de efectuar as medições.

- As amostras e soluções tampão devem estar à mesma temperatura. Se as soluções tampão estiverem guardadas no frigorífico, devem retirar-se com antecedência para que atinjam a naturalmente temperatura ambiente antes de ser utilizadas.

Cálculos

Determinação dos parâmetros do eléctrodo

13) Calcule o declive (s) e a ordenada na origem (Q) da recta de potencial vs pH:

s = (E7 – E4) / (pH7 – pH4)

Q = E7 + s . pH7

onde E7 e E4 são os potenciais medidos para as soluções tampão pH 7 e pH 4, e pH7 e pH4 são os valores de pH das mesmas soluções corrigidos para a temperatura.

14) Calcule o valor do slope, β:

β = ( )t

declive+⋅ 15.273001982.0

onde t é a temperatura da solução, em graus Celsius.

Cálculo do pH da amostra de água:

15) Calcular o valor de pH a partir da leitura de potencial, usando a recta calculada anteriormente. Comparar com o valor de pH indicado pelo medidor.

Bibliografia:

D. C. Harris, “Quantitative Chemical Analysis”, 5th ed., Freeman, 1998. U. Tinner, “Electrodes en potentiométrie”, Metrohm, 1989. ISO 10523 – “Water quality – Determination of pH”

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3. Titulação potenciométrica Objectivo: Titulação do ácido acetilsalícílíco com uma base forte, por meio de titulações potenciométrica. Execução Experimental Aparelhagem - Material corrente de laboratório, - Condutimetro CONSORT K120, - Aparelho de pH com eléctrodo combinado de vidro. Reagentes - Borax, - Solução de hidróxido de potássio 0,100 M. - Solução de ácido clorídrico 0,010 M aferida. - Solução de aspirina. Pese um comprimido de aspirina e dissolva num copo com água, aquecendo ligeiramente. Perfaça o volume de 250 ml num balão graduado. A solução de aspirina fica sempre turva por conter um excipiente (amido). Procedimento experimental Titulação potencimétrica:

1- Prepare uma montagem constituída por: i) uma bureta cheia com uma solução de NaOH 0.100 M. ii) copo com 50 ml de HCl 0.010 M (medidos rigorosamente), ao qual se adicionam 100 ml água destilada e uma barra de agitação. iii) Aparelho de pH com o eléctrodo mergulhado no ácido e agitador magnético. 2- Preparação do aparelho de pH i) Calibre o aparelho de pH. ii) Meça o pH e a temperatura da solução. Anote o valores lidos. 3- Aferição da base (Depois de cada adição de titulante espere que a leitura da diferença de potencial estabilize e anote o valor lido e a temperatura da solução). i) Calcule primeiro aproximadamente o volume de titulante que deve gastar até ao ponto de equivalência. ii) Adicione 0,5 ml de NaOH de cada vez até perto do ponto de equivalência. ii) Perto do ponto de equivalência reduza as adições de base para 0.05 ml. iii) Depois do ponto de equivalência, adicione 0.5 ml de cada vez. 4- Titulação da amostra a) Para um outro copo pipete 100 ml da solução de aspirina e perfaça 150 ml com água. Titule potenciometricamente com a solução de hidróxido de potássio, procedendo do mesmo modo que anteriormente.

Anexo 1

Determinação da concentração duma base ou ácido forte por titulação Na maioria dos casos a concentração do ácido forte, depois de aferida uma vez, mantém-se por algum tempo, mas a concentração duma base forte tem que ser determinada frequentemente devido a problemas de carbonatação. a) A partir do conhecimento do ponto de equivalência da titulação Numa titulação ácido forte/base forte o ponto de equivalência corresponde ao ponto de inflexão da curva de pH (ou do potencial), como se pode ver na figura seguinte.

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0

2

4

6

8

10

12

0 0.1 0.2 0.3 0.4

n. moles OH adicionadas

pH

Ponto de equivalência

Outra maneira de localizar o ponto de equivalência é usar a primeira derivada do pH (ou do potencial) em função do número de moles adicionadas (ou do volume de base adicionado), como se pode ver na figura seguinte:

0

100

200

300

400

500

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

n. moles OH adicionadas

pH

/n

.mo

les

A reacção duma base forte (NaOH) com um ácido forte (HCl) é equimolar ou seja no ponto de equivalência o número de moles de base gastas é igual ao número de moles de ácido presentes no início pelo que se pode usar a expressão:

Cb = ( Ca Va )/ Vb (A1.1)

onde Ca e Va são respectivamente a concentração e o volume de ácido no início e Vb é o volume de base gasto até ao ponto de equivalência.

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4. Cromatografia Objectivos

Pretende-se ilustrar a técnica de cromatografia em camada fina (TLC), aplicando-a na separação e identificação de aminoácidos na cerveja. Introdução:

A cromatografia permite analisar separadamente os componentes de uma mistura, tirando partido das diferentes afinidades de cada componente por uma fase estacionária. Baseia-se no mesmo princípio da extracção, mas no caso da cromatografia existe uma fase (fase móvel, ou eluente) que se move continuamente sobre outra (fase estacionária). A cromatografia em camada fina é uma técnica cromatográfica de adsorção, o que significa que a interacção entre a fase estacionária e os componentes a separar se dá essencialmente por processos de adsorção-desorção. A fase estacionária é sólida e forma um revestimento fino de uma face de uma placa plana metálica, em vidro ou em plástico, a qual lhe serve de suporte. Neste trabalho usar-se-á como fase estacionária um adsorvente polar, a sílica-gel. A ordem de eluição dos componente seguirá portanto a sua polaridade. O método mais comum de proceder à cromatografia em camada fina é o indicado na figura 1. A mistura a analisar á colocada sob a forma de manchas distanciadas de 1,5 cm entre si e 2,0 cm do bordo da placa TLC. Aplicam-se na mesma placa manchas separadas para as amostras e para os padrões. Para que todas as manchas estejam alinhadas paralelamente ao bordo da placa, marca-se levemente a lápiz uma linha sobre a qual se aplicam as manchas.

a b c

Figura 1. a) Colocação das amostras numa placa TLC. b) Eluição c) Placa TLC após eluição e revelação.

As manchas devem ser tão estreitas quanto possível, para que sejam arrastadas pela fase móvel com um mínimo de alargamento. Devem ser aplicadas sobre a paca usando um tubo capilar de diâmetro muito estreito, ou com uma micropipeta. Os volumes aplicados devem ser entre 1 e 10 µl. Após a aplicação das amostras, a placa deve ser eluída. Para tal coloca-se numa câmara de eluição contendo a fase móvel, líquida. A fase móvel sobe pela placa por capilaridade, arrastando consigo as manchas. Os componentes da mistura movem-se com a fase móvel a velocidades diferentes ao longo da fase estacionária e, se a mistura for colorida, a separação é visível na placa. Quando a mistura não é colorida, é necessário recorrer a uma técnica de revelação. Uma técnica simples é a exposição a vapor de iodo, que é absorvido na maior parte das manchas, tornando-as visíveis. Alternativamente, pode adicionar-se uma substância fluorescente à ase estacionária, antes de efectuar a eluição, de modo que as manchas serão visíveis sob luz ultravioleta por não fluorescerem, enquanto a fase estacionária circundante fluoresce. Um outro método consiste em pulverizar a placa com um agente revelador, que desenvolve cor em contacto com as manchas. Este método é útil na identificação de aminoácidos, e será seguido neste trabalho. O exame visual do cromatograma permite identificar os componentes da mistura, por comparação com os padrões colocados na mesma placa. Alguns agentes reveladores desenvolvem cores específicas para deerminados componentes, ajudando à sua identificação. O factor de retenção (Rf ) é um parâmetro usado na análise qualitativa em TLC. Pode calcular-se para cada componente e relaciona a sua velocidade com a velocidade da fase móvel.

distância percorrida pela mancha Rf =

distância percorrida pela fase móvel

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Execução experimental Material

Câmara de eluição 20x20 cm Folhas de papel de filtro 20x20 cm Secador de ar quente Estufa, programada para a temperatura de 100ºC Pipetas de Pasteur Pulverizador Régua graduada de 20 cm Lápis Placa de TLC 20x20 cm

Reagentes Soluções padrão de aminoácidos, 1,0.10-2 mol/l. Etanol Butanol Ácido propiónico Solução reveladora I: 0,124g de ninidrina em 50 cm3 de etanol, 10 cm3 de ácido acético glacial e 2 cm3 de 2,4,6-colidina (2,4,6-trimetilpiridina). Solução reveladora II: 1% de Cu(NO3)2.H2O em etanol absoluto.

Procedimento experimental 1- Preparação do eluente: Prepare o eluente numa hotte com a aspiração ligada. Numa proveta de 100 ml, misture 40 ml de etanol, 40 ml de butanol, 20 ml de ága e 8 ml de ácido propiónico. Homogenize bem. 2- Preparação da câmara de eluição: Coloque nas paredes interiores da câmara de eluição as folhas de papel de filtro cortadas com a dimensão adequada. Com a ajuda de uma vareta de vidro, faça escorrer todo o eluente pelo papel de filtro, de modo que este fique saturado e adira às paredes da câmara. Procure evitar a fomação de bolhas de ar entre o papel e o vidro. Tape a câmara e deixe repousar durante cerca de ½ hora, para que o seu interior fique saturado em eluente. 3- Preparação da placa TLC Procure não ferir o revestimento da placa TLC, nem tocá-lo com as mãos. Usando um lápiz pouco afiado, trace levemente uma linha a 2,0 cm de distância do bordo da placa. Sobre esta linha, marque levemente 12 pontos distanciados entre si de 1,5 cm. Sobre estes pontos colocar-se-ão as amostras a analisar. Trace outra linha distanciada 10 cm da primeira. Esta linha marcará o fim da eluição. 4-Colocação das amostras

Usando uma pipeta de pasteur, retire um pequeno volume da primeira solução a analisar (1-1µl). Coloque-o cuidadosamente sobre o primeiro ponto marcado, procurando não tocar na placa com a ponta da pipeta. Seque imediatamente com ar quente, de modo a evitar que a mancha alastre.

Coloque do mesmo modo as restantes soluções padrão de aminoácidos e a amostra de cerveja sobre os outros pontos marcados. 5-Eluição Coloque cuidadosamente a placa dentro da câmara de eluição. O nível do eluente deve estar abaixo da linha das amostras. Tape a câmara e deixe eluir. Quando o eluente atingir a linha superior (cerca de 1h) retire a placa e seque com um secador de ar quente, para interromper a eluição. 6-Revelação Misture 25 ml da solução reveladora I com 1,5 ml da solução II. Coloque a mistura no pulverizador e pulverize a placa, numa hotte. Coloque imediatamente no interior da estufa a 100ºC, durante 2 min. Retire a placa e tome nota das cores e posição das manchas. Obs: as cores desaparecem ao fim de algum tempo, pelo que é conveniente marcar a lápis a posição das manchas.

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Elaboração do relatório Apresentação de Resultados

a) Calcule o factor de retenção para cada um dos aminoácidos usados como padrão. b) Apresente uma tabela com os aminoácidos usados como padrão, os factores de

retenção e as cores das manchas respectivas. c) Calcule os factores de retenção de todas as manchas observadas no cromatograma da

amostra de cerveja. d) Apresente uma tabela com as cores e factores de retenção de todas as manchas

observadas na amostra de cerveja. Discussão

e) Que aminoácidos consegue identificar na amostra de cerveja? Justifique. f) Justifique as diferenças de Rf , com base na natureza da fase estacionária e na estrutura

de cada aminoácido. g) O processo de eluição do cromatograma foi demorado. Sugira uma forma de diminuir o

tempo de eluição, assim como uma desvantagem associada ao processo que sugeriu.

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5. Cromatografia Objectivo:

Análise de cafeína em bebidas por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) Introdução

A cafeína é um produto conhecido pela sua presença no café, no chá, em bebidas da família das colas e em produtos farmacêuticos. É um estimulante, e o seu doseamento por este método é bastante rápido e de aplicação simples.

A constituição de um equipamento para cromatografia líquida de alta eficiência está representada esquematicamente na figura seguinte:

Figura 1 - Representação esquemática de um cromatógrafo para HPLC

A amostra é colocada na válvula de injecção sendo posteriormente injectada na coluna. O eluente, que é continuamente bombeado para a coluna, vai arrastar os componentes da

amostra que vão sendo separados uns dos outros devido aos diferentes equilíbrios de distribuição a que estão submetidos (entre a fase móvel - eluente e a fase estacionária - leito da coluna).

Em seguida os componentes da amostra vão ser detectados por absorção no ultravioleta sendo o tempo de chegada ao detector dependente da forma como cada componente interactua com a fase estacionária da coluna. Um registador, que está ligado ao detetctor, permite obter automaticamente o sinal enviado por este o qual, em primeira aproximação, é proporcional à concentração do componente na solução que passa nesse instante através da célula do detector.

A representação gráfica do sinal enviado pelo detector em função do volume de efluente da coluna constitui o cromatograma da mistura. Sendo conhecido o caudal de eluente, pode facilmente transformar-se a escala de volumes de efluente em unidades de tempo.

volume

A

B

Figura 2 - Cromatograma como representação gráfica de concentrações de componentes ao

passarem no detector em função do volume de efluente da coluna.

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Execução Experimental 2.1. Aparelhagem

O cromatógafo tem os seguintes componentes principais: a) bomba b) válvula de injecção c) coluna RP -18 de 250 mm d) detector de ultravioleta

2.2. Reagentes - ácido benzóico - cafeína - metanol - acetonitrilo - ácido acético (solução 1%)

2.3. Soluções a preparar: Prepare as seguintes soluções em balões volumétricos: - solução-mãe de ácido benzóico 1x10-4 M - solução-mãe de cafeína 1x10-3 M Soluções padrão:

Solução 0 1 2 3 4 5 6 conc. cafeína (M) 0 2x10-5 4x10-5 8x10-5 1x10-4 2x10-4 4x10-4

conc. ácido benzóico (M) 5x10-5 5x10-5 5x10-5 5x10-5 5x10-5 5x10-5 5x10-5 Preparar o eluente a utilizar misturando 150 mL de acetonitrilo (grau HPLC) com 850 mL de

uma solução aquosa de ácido acético 1%. Filtrar o eluente com a montagem apropriada para esse efeito.

2.4. Condições experimentais

Caudal de eluente: 1,2 mL/min Comprimento de onda de detecção: 225 nm.

2.5. Procedimento Obs: Antes de iniciar o trabalho e depois de o terminar, passe a coluna sucessivamente por uma solução de água:metanol 85:15 e por metanol 100%, de modo a garantir que qualquer resíduo de análises anteriores seja removido. Entre utilizações, a coluna deve ser mantida em metanol.

Para fazer as injecções das soluções: a) lave a seringa varias vezes com a solução a ensaiar. b) Em seguida encha várias vezes com a solução a válvula de injecção na posição de "load",

tendo o cuidado de não introduzir ar na válvula quando pressiona o êmbolo da seringa c) Para introduzir a amostra na coluna rodar a válvula de injecção para a posição de "inject".

Iniciar simultaneamente o registo do cromatograma. d) Proceder à injecção de cada uma das soluções padrão, por ordem crescente de

concentração. Após a injecção da solução padrão mais concentrada, injecte um branco para confirmar que não ficaram quaisquer contaminações na seringa.

Para a análise das amostras: (i) desgasifique à trompa as amostras (principalmente se se tratar de refrigerantes

gaseificados). (ii) repita a), b) e c) mas agora com cada uma das amostras. (iii) misture em volumes iguais cada uma das amostras que vai analisar com a solução de

padrão interno e repita a), b) e c) mas agora com cada uma destas misturas.

Cálculos a) Calcule a eficiência da coluna, através do número de pratos teóricos, N, e altura

equivalente de um prato teórico, H. b) Calcule os factores de capacidade para a cafeína e o ácido benzóico, o factor de

selectividade e o factor de resolução. c) Trace a recta de calibração normal. Calcule os parâmetros da recta e respectivos

intervalos de confiança.

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d) Calcule as concentrações de cafeína nas amostras em mol/L e em mg/100mL, usando a recta de calibração normal. Calcule os intervalos de confiança respectivos. Critique os resultados.

e) Trace a recta de calibração pelo método do padrão interno. Calcule os parâmetros da recta e respectivos intervalos de confiança.

f) Calcule as concentrações de cafeína nas amostras em mol/L e em mg/100mL, usando o método do padrão interno. Calcule os intervalos de confiança respectivos. Critique os resultados.

g) Compare o método de calibração normal com o método do padrão interno.

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6. Espectroscopia de absorção molecular: a lei de Lambert-Beer

Objectivos

Nesta aula pretende-se sensibilizar os alunos para os problemas envolvidos na escolha de

um método espectrofotometrico para análise de soluções.

Introdução

Alguns dos parâmetros mais importantes dum espectrofotómetro, que têm efeito directo sobre as determinações analiticas quantitativas (determinação de concentrações), são:

(1) reprodutibilidade fotométrica, (2) linearidade fotométrica, e (3) reprodutibilidade do comprimento de onda.

A gama espectral do ultra-violeta é a zona que apresenta erros de medição mais pronunciados, sendo este facto devido à intensidade da radiação analisada ser menor e também ao aumento da influência da luz dispersa. Assim, a reprodutibilidade e linearidade fotométricas vão ser determinadas nesta região do espectro electromágnetico, utilizando como composto padrão o brometo de potássio (KBr) em solução aquosa. Este sal, em solução aquosa, apresenta um espectro de absorção na

região 180 a 250 nm, correspondente à absorção do ião Br-.

A concentração analítica pode ser correlacionada com as absorvências medidas atravês da lei de Lambert-Beer: A = ε.b.c em que A é a absorvência medida, c a concentração analítica molar (mol.L-1), ε a absortividade molar (mol-1.L.cm-1) e b o percurso óptico, ou seja a espessura da célula de medida (cm). O benzeno (C6H6), o seu espectro de absorção (espectro vibrónico), em fase gasosa será utilizado para reprodutibilidade do comprimento de onda. Na zona espectral em causa, ultra-violeta, o espectro de absorção electrónico do benzeno, em fase gasosa, apresenta uma série de bandas vibracionais bem resolvidas e com comprimentos de onda máximos muito específicos (bem conhecidos). Execução Experimental

As células que vão ser utilizadas nas medições espectrofótometricas para este trabalho são de quartzo, sendo necessários alguns cuidados especiais na sua utilização.

1 - Soluções a preparar Soluções aquosas de KBr numa gama de concentrações entre 1 M até cerca de 10-6 M. Na preparação das soluções deve ter em conta que:

a) as soluções devem ser em número suficiente (num mínimo de 10) de modo a garantir alguma confiança nos resultados obtidos;

b) as soluções podem ser preparadas por diluição da solução mais concentrada ou por diluição de soluções de concentração intermédia preparadas a partir da primeira;

c) as concentrações escolhidas para os padrões devem ter um número de pontos mais elevado na zona em que prevê existir relação linear A vs c, ou seja nos extremos, isto é menos soluções com concentrações próximas de 1 M e 10-6 M.

2 - Medições Programar o espectrofotómetro para traçar um espectro de absorção entre 190 e 300 nm, e que corresponde à zona de absorção do Br

- (ver anexo 1), de modo a determinar uma gama de

comprimentos de onda que pareça razoável para o ensaio. A fenda a utilizar será de cerca de 1 nm. Deve escolher uma solução com concentração elevada de KBr para traçar este espectro. De seguida, programar o espectrofotómetro para medir em modo de comprimentos de onda múltiplos “multi-wavelenght”, três comprimentos de onda escolhidos de acordo com o espectro de absorção que traçou na alínea anterior (por exemplo a: 190, 195, 200, 210, 220 ou 240 nm). A fenda a utilizar será de cerca de 1 nm. Fazer a leitura do “branco” e de cada uma das soluções padrão aos comprimentos de onda escolhidos. Nota: para evitar as lavagens, deve começar pela solução mais díluida e seguir a ordem directa do aumento de concentração.

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Observações: Cuidados a ter na utilização das células de quartzo:

a) quando não está dentro do espectrofotómetro, deve ser posta num suporte para evitar a sua queda e destruição;

b) ao manusear a célula nunca deve colocar dedadas nas paredes transparentes da célula; c) a célula deve ser cheia até cerca de ¾, depois de a lavar, pelo menos uma vez, com uma

pequena quantidade de solução a analisar; d) antes das medições deve limpar as paredes com um papel macio para retirar solução que

esteja na zona exterior da célula mas sem riscar a mesma; e) e a célula deve ser colocada dentro do espectrofotómetro de modo a que a radiação

atravesse as paredes transparentes.

Cálculos

h) Representar os valores de absorvência medidos (a cada comprimento de onda) para cada uma das amostras (cada concentração) num gráfico tipo XY, com escala logaritmica em ambos os eixos, A (ordenada) vs c (abcissa).

i) Determinar o intervalo de linearidade da absorvência para cada comprimento de onda, interpretando esta gama de concentrações e os desvios à linearidade.

j) Representar (para cada λ) na gama de concentrações onde existe linearidade A vs c (escala linear) e proceder a um ajuste linear dos pontos que pareçam convenientes.

k) Determinar os parâmetros estatísticos relativos a cada um dos ajustes

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7. Espectroscopia de emissão: fluorescência Objectivo: Determinar a quantidade de quinino numa água tónica por espectroscopia de emissão molecular na gama espectral do ultravioleta-visível. Introdução: O quinino em solução ácida (0,05 M de H2SO4) apresenta duas bandas de absorção centradas em 250 e 350 nm, correspondentes a duas transições electrónicas. Devido ao efeito de Kasha qualquer que seja o comprimento de onda de excitação o máximo de emissão situa-se sempre a 450 nm resultante do decaimento radiativo do 1º estado excitado. Na figura seguinte apresentam-se os espectros de absorção e de emissão de fluorescência do quinino

250 450nm

IfA

350250 450nm

IfA

350 Figura 1: Espectros de absorção (____) e de emissão de fluorescência (_ _ _ _) de uma solução de sulfato de

quinino em H2SO4 0,05 M. O quinino pode existir na água tónica sob a forma de hidrocloreto ou sulfato de quinino até uma concentração máxima de 65,4 ppm de quinino. A unica interferência que pode aparecer na dosagem do quinino na água tónica é o ião cloreto que actua como seu agente de extinção de fluorescência. No entanto esse efeito pode ser desprezado se a concentração em ião cloreto for inferior a 4x10-4 M, como acontece vulgarmente. Para a concentração de cloreto indicada o erro cometido é inferior a 0,4 %. Execução Experimental: Reagentes: - Sulfato de quinino di-hidratado: (C20H24N2O2)2.H2SO4.2H2O - Soluções de H2SO4 com concentrações: 1 e 0,05 M

Material e aparelhagem: - Espectrofluorímetro - Célula de quartzo - Material corrente de laboratório Preparação de soluções de sulfato de quinino: (A) Solução mãe (100 ppm de quinino): pesar 120,7 mg de sulfato de quinino e transferir para um balão de 1000 mL, juntar 50 mL de H2SO4 1 M e perfazer ao traço com água destilada; (B) Solução intermédia (10 ppm de quinino): preparar 50 mL de solução por diluição de A perfazendo o volume H2SO4 0,05 M; (C) Soluções padrão de concentração 0,4; 0,8; 1,2; 1,6; e 2,0 ppm em balões de 25 mL, perfazendo o volume com H2SO4 0,05 M. Prepare ainda um branco.

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Preparação da amostra: Fazer uma toma de 5 mL de água tónica para um balão de 250 mL e perfazer ao traço com H2SO4 0,05 M. Espectro de emissão: Programar o espectrofluorímetro para fazer o registo do espectro de emissão de uma solução padrão de sulfato de quinino com excitação a 350 nm. Análise quantitativa: Programar o espectrofluorímetro para fazer estudos quantitativos com excitação a 350 nm e emissão a 450 nm. - Introduzir o branco e fazer a respectiva leitura. - Introduzir cada um dos padrões e registar as respectivas intensidades de emissão. - Introduzir a amostra e registar a intensidade de emissão. Tratamento dos resultados 1. Fazer a recta de calibração e calcular os erros associados 2. Calcular a concentração da amostra e o erro associado. Tendo em conta a diluição da amostra determinar o teor de quinino na água tónica analisada e o erro associado. Comparar o resultado com as indicações do rótulo.