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ndice

1. Preparao de Amostras................................................................................................ 2 2. Solues Genricas ....................................................................................................... 4 3. Colorao de bactrias Mtodo de gram.................................................................... 5 4. Contagem padro em placas ......................................................................................... 7 5. Contagem de mofos e leveduras ................................................................................. 10 6. Bolores e leveduras osmoflicos ................................................................................. 11 7. Coliformes .................................................................................................................. 11 8. Coliformes Fecais ....................................................................................................... 12 9. Staphylococcus aureus ............................................................................................... 17 10. Bacillus cereus .......................................................................................................... 19 11. Salmonella sp. ........................................................................................................... 23 12. Viabilidade da flora bacteriana do iogurte ( nmero relativo de Streptococcus thermophilus e Lactobacillus bulgaricus ) .................................................................... 31 13. Esporos Mesfilos..................................................................................................... 32 14. Esporos Termfilos ................................................................................................... 32 15. Lipolticos ................................................................................................................. 33 16. Proteolticos .............................................................................................................. 34 17. Teste de esterilidade comercial Exame de alimentos enlatados ............................ 35 18. Haloflicos ................................................................................................................. 42 19. Clostrdios Sulfito Redutores.................................................................................... 43 20. Teste de Segurana Biolgica - Esterilidade.............................................................42

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1. Preparao de Amostras

As amostras devem ser analisadas o mais breve possvel, de preferncia assim que chegam ao laboratrio. Pesar quantidade adequada para preparar uma diluio 10-1, perto do fogo, usando material estril para no contaminar a anlise. Pesar juntamente com o material para ser analisado, uma poro para contra-prova que dever ficar na geladeira (o recipiente tambm deve ser estril). Diluente 90 mL 99 mL 225 mL g de amostra 10g 11g 25g

O diluente usado para preparar a amostra, como para as diluies decimais a gua peptonada 0,1% (usa-se peptona de casena ou lactopeptona).

1. Produtos slidos e em p (queijos, embutidos, cortes de frango, alimentos preparados, pudins, etc) Descongelar produtos que foram congelados em refrigerador de 2 a 10C por no mximo 18 horas antes da anlise; Com o auxlio de pinas e bisturis estreis, cortar e pesar assepticamente, 25g da amostra; Adicionar 225 ml de gua peptonada 0,1%, preparada conforme descrito no COM 013; Homogeinizar por 30 segundos em liquidificador com copo triturador esterilizado ou em stomacker, usando velocidade mdia para no aquecer a mistura; Preparar as diluies necessrias para realizar o trabalho desejado, conforme o tipo de anlise e amostra a analisar; Expressar os resultados obtidos da contagem com UFC/g de produto.

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2. gua e produtos lquidos Homogeinizar a amostra agitando-a por no mnimo 25 vezes; Preparar as diluies sucessivas necessrias para realizar as anlises do trabalho desejado, considerando o nvel de contaminao. As diluies so preparadas, transferindo-se 1 ml da amostra para um tubo contendo 9 ml de gua peptonada 0,1%. Para preparar a diluio seguinte, retirar 1 ml deste tubo e transferir para outro tubo que contenha 9 ml de gua peptonada 0,1%; Expressar os resultados por ml de produto.

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2. Solues Genricas

lcool iodado Tintura de iodo a 2% Iodo metalide Iodeto de K gua destilada lcool 96 qsp 2,0 g 6,0 g 10 mL 100 mL

Diluir o iodeto com H2O, acrescente o Iodo e por ultimo o lcool. lcool Iodado = 20 mL da tintura de iodo a 2% em 1 litro de lcool 70.

Vaspar

Derreter e misturar juntos quantidades iguais de vaselina slida e parafina. Distribuir em frascos de boca larga e esterilizar em autoclave a 121C por 15 min. Obs.: Parafina lquida estril pode ser usada, mas no permitir deteco de produo de gs.

Soluo Salina

Soluo fisiolgica 0,85% NaCl NaCl H2O 0,85 g 100 Ml

Esterilizar em autoclave a 121C por 15 min.

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3. Colorao de bactrias Mtodo de gram

Com auxlio de ala de platina, coletar parte de uma colnia de bactrias e transferir para lmina de vidro; Fixar o esfregao pelo calor, aproximando-o da chama do bico de Bunsen; Corar o esfregao com uma soluo de cristal violeta, por 1 min; Lavar com gua para retirar o excesso do corante e cobrir com lugol por 1 min; Lavar com gua corrente; Diferenciar com etanol absoluto ou uma soluo de etanol-acetona(1:1), 30 s; Lavar com gua corrente; Corar com fucsina ou safranina; Lavar com gua corrente; Secar e levar ao microscpio.

Interpretao dos resultados - Gram positivo: A parede celular das bactrias desidratada pala ao do lcool, diminuindo sua permeabilidade, com isso o complexo iodo-cristal violeta no removido e no microscpio observa-se colorao prpura. - Gram negativo: A alta concentrao de lipdios aumenta a permeabilidade da parede celular das bactrias gram negativas, facilitando a extrao do completo iodo-cristal, assim, essas bactrias aparecem tingidas apenas pelo tratamento com fuccina fenicada, apresentando portanto, colorao rsea. Exemplo: Pseudomonas, Escherichia coli.

Soluo Cristal Violeta Cristal Violeta Etanol Fenol H2O destilada 1,0 g 10,00 mL 2,0 mL 100,0 mL

Dissolver o corante no lcool. Juntar lentamente o fenol e aps a gua, tambm lentamente, misturando at obter homogeinidade. Deixar em repouso por 24 horas e aps filtrar.

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Soluo de Lugol Iodo Iodeto de Potssio H2O destilada 1,0 g 2,0 g 300,0 mL

Soluo de Fuccina Fenicada Fuccina Etanol Fenol H2O destilada 0,3 g 10,0 mL 5,0 mL 95,0 mL

Dissolver o corante no lcool. Juntar lentamente o fenol e aps a gua, tambm lentamente, misturando at obter homogeinidade. Deixar em repouso por 24 horas e aps filtrar.

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4. Contagem padro em placas

Os mtodos de contagem padro em placas oferecem o nmero de microorganismos viveis no alimento, pela utilizao do meio de cultivo adequado, de maneira a promover o crescimento do mais amplo espectro de microorganismos presentes na amostra sob anlise. Alguma seletividade ser exercida pela temperatura de incubao. Em muitos casos, como nos alimentos processados, a contagem padro demonstra o nvel geral de higiene durante a fabricao, condies de armazenamento e transporte, etc, daquele alimento, enquanto os produtos no processados podem ser indicados pela qualidade do alimento. A preciso do mtodo pode ser limitada pela incapacidade de alguns microorganismos formarem colnias visveis no meio e condies utilizveis, como tambm, pela presena de substncias inibidoras produzidas por microorganismos do prprio alimento durante o crescimento no gar. Quando presentes em nmeros elevados, os psicotrficos podem causar uma variedade de alteraes em produtos conservados sob refrigerao. A maioria dos organismos psicotrficos so destrudos pelo calor. Assim, sua presena pode indicar subprocessamento trmico ou contaminao ps-processamento em produtos

pasteurizados; a elevao do seu nmero est associada a uma estocagem prolongada sob refrigerao ou manuteno a frio inadequada, ou ainda, pode significar risco de alterao tanto para produtos processados como no processados. Microorganismos termfilos so aqueles que podem sobreviver de forma significativa ao tratamento trmico. Usualmente o tratamento trmico inclui temperaturas de pasteurizao ou superiores. A presena de termfilos em grande quantidade est relacionada com a qualidade higinica da matria-prima ou processamento trmico insuficiente.

Meios utilizados

gua peptonada 0,1% Peptona de casena H2O dest. pH - 7,0 0,2 0,1 g 100 mL

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gar padro para contagem (PCA) Extrato de levedura Triptona Glicose gar H2O dest. pH - 7,0 0,1 2,5 g 5,0 g 1,0 g 15 g 1000 mL

Tcnica Psicotrficos Semeadura de 0,1 mL das diluies sobre a superfcie do gar previamente distribudo em placas. Mesfilos eTermfilos Adicionar o PCA fundido e resfriado a 50C nas placas de Petry contendo1 mL da diluio adequada, misturar e deixar solidificar. Contar as placas com 25 a 250 colnias.

Incubao: Termfilos - 55C por 48 horas. Mesfilos 35 C por 48 horas. Psicrotrficos 7 a 10 C por 7 a 10 dias.

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1 mL

1 mL

10-1

10-2(9 mL)

10-3(9 mL )

1mL

1mL

1mL

1mL

1mL

1mL

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5. Contagem de mofos e leveduras Os mofos e leveduras esto presentes no meio ambiente e podem fazer parte da flora do alimento. As vezes podem ser responsveis pela deteriorao de muitos tipos de alimentos, os quais, pelas suas caractersticas de baixo pH e de atividade de gua, contedo de sal ou acar e estocagem em baixa temperatura, favorecem o seu desenvolvimento. Alguns podem causar problemas nos alimentos devido a sua resistncia ao calor, congelamento, antibiticos e irradiao, alm de formao de toxinas. Podem tambm transformar substratos imprprios em favorveis ao desenvolvimento de bactrias patognicas. Meios utilizados gua peptonada 0,1% gar batata glicosado Glicose gar gua destilada 20 g 15 g 1000 mL

No momento da utilizao, fundir, resfriar a 45 C e acidificar at pH 3,5 (1 mL do cido para 100 ml do meio) com cido tartrico a 10 % estril. No aquecer aps a adio do cido. Tcnica: 1 mL 1 mL

10-1

10-2(9 mL)

10-3(9 mL )

1 mL

1 mL

1 mL

1 mL

1 mL

1 mL

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Adicionar o gar, misturar e deixar solidificar. Incubar as placas invertidas de 3 a 5 dias a 25 C. Contar as placas com 10 a 150 colnias.

6. Bolores e leveduras osmoflicos

No caso de amostras de mel, e outros produtos com alta concentrao de acares, contar bolores e leveduras osmoflicos em paralelo ao gar batata normal. Usar: gar batata + 20% de glicose (gar normal + 18 g de glicose para 100 ml de meio). Diluente gua peptonada 0,1% + 20% de glicose.

7. Coliformes

Coliformes so bastonetes Gram negativos, aerbios e facultativamente anaerbios, que fermentam a lactose com formao de gs em 48 horas a 35 C. A especificao do meio e da temperatura crtica para a interpretao dos resultados. Com base nas evidncias disponveis, 20 ou mais espcies representativas atendem aos critrios que definem o grupo coliforme. O grupo coliforme, que no identifica os membros individualmente, tem menor valor interpretativo que o nico organismo ndice, a E. coli, bem como o grupo coliforme de origem fecal, pois o grupo coliforme pode conter alguns membros no entricos como o gnero Serratia e Aeromonas. Meios utilizados: gua peptonada a 0,1%

Caldo Lauril Sulfato Triptona 20 g

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Lactose NaCl Lauril Sulfato de Sdio K2HPO4 KH2PO4 H2O dest. pH 6,8 0,1

5,0 g 5,0 g 0,1 g 2,75 g 2,75 g 1000 mL

Caldo Verde Brilhante Bile 2% Lactose Peptona Lactose Bile concentrado Verde brilhante H2O dest. pH 7,4 0,1 10 g 10 g 20 g 0,0133 g 1000 mL

Tcnica:

Semear as diluies em srie de 3 tubos de caldo lauril; Incubar a 36 1 C por 48 horas e separar os tubos positivos (gs no tubo de Durham); Tubos positivos = inocular no Caldo verde brilhante bile 2%; Incubar a 36 1 C por 48 horas; Calcular o NMP de colnias atravs do nmero de tubos positivos, consultando tabela especfica; Resultado = (NMP) por g ou mL.

8. Coliformes Fecais

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A separao dos coliformes de origem fecal daqueles de origem no fecal feita atravs de testes baseados em incubao temperaturas elevadas. Tais testes so usados internacionalmente com algumas variaes. Entretanto estes mtodos no so absolutos. O termo coliforme de origem fecal no pretende identificar, mas apenas indicar, a presena de E. coli, no separando esta bactria das demais, geralmente consideradas de pouco ou nenhum significado em sade pblica. Por outro lado, a presena de microrganismos do grupo de origem fecal no alimento pode ser atribudo a uma contaminao pelo ambiente e no necessariamente a uma contaminao fecal direta, e o seu nmero pode estar associado ao desenvolvimento no prprio produto. Como para os demais coliformes, a tolerncia ou no para este grupo, depende do tipo de produto para anlise, e das condies necessrias de higienizao e sanitizao nos locais de estocagem, fabricao e processamento de alimentos. Sua interpretao e tolerncia, portanto, tem mais sentido quando da comparao dos resultados obtidos em funo da padronizao da metodologia analtica.

Meios utilizados

Caldo EC Peptona de casena Lactose Sais biliares K2HPO4 KH2PO4 NaCl H2O dest. pH 6,9 0,2 20 g 5,0 g 1,5 g 4,0 g 1,5 g 5,0 g 1000 mL

gar EMB Seg. Levine Peptona de carne Lactose 10 g 10 g

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K2HPO4 Eosina amarela Azul de metileno gar H2O dest. pH 7,0 0,2

2,0 g 0,4 g 0,065 g 15 g 1000 mL

Caldo triptona Triptona NaCl H2O dest. pH 6,9 0,2 10 g 5,0 g 1000 mL

Caldo VM-VP Proteose peptona Glicose K2HPO4 H2O dest. pH 7,0 0,2gar Citrato Seg. Simons NH2PO4 K2HPO4 NaCl Citrato de sdio MgSO4. 7H2O Azul de Bromotimol gar H2O dest. pH 6,9 0,1 1,0 g 1,0 g 5,0 g 2,0 g 0,2 g 0,08g 15 g 1000 mL

7,0 g 5,0 g 5,0 g 1000 mL

Reagentes:

Reativo de Kovacs

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Paradimetilaminobenzaldedo lcool isoamlico HCl conc.

5,0 g 75 mL 25 mL

Dissolver o benzaldedo em lcool e aps adicionar o HCl. Acondicionar em frasco escuro em geladeira.

Alfa Naftol Alfa-naftol Etanol 5,0 g 100 mL

Estocar em frascos escuro e sob refrigerao. Evitar contato.

Hidrxido de potssio KOH H2O dest. 40 g 100 mL

Tcnica:

Tubos positivos de lauril repicar para Caldo EC; Incubar em banho-maria 44,5 0,2 C por 24 horas; Controle teste: + E.coli , - E. aerogenes; Considerar o resultado confivel quando os controles confirmarem. Resultado em NMP.

10-1

10-2 Caldo Lauril

10-3

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48 h a 36C

Tubos positivos

Brilha Broth

Caldo EC

48 h a 36C

24 h a 44,5C

Coliformes totais

Continua com testes bioqumicos os Tubos com resultados positivos

TESTES BIOQUMICOS

24h a 37C

C. Triptona (24h) Interpretao dos resultados:

C. VM(48h)-VP(5 dias)

gar citrato (24h)

Produo de indol no caldo Triptona adiciona-se 0,3 mL do reagente de Kovacs. E. coli = colorao vermelha no lcool. Vermelho de metila 1 mL do meio VM-VP + 3 gotas de vermelho de metila E. coli = colorao vermelha. E. aerogenes = amarelo.

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Vogues Proskauer meio VM-VP + 0,3 mL de alfa-naftol + 0,1 ml de KOH 4% + gotas de creatina a 5% em NaOH 0,1 N. E. coli = sem alterao. E. aerogenes = colorao vermelha.

Citrato E. coli = sem alterao. E. aerogenes = meio fica azul.

9. Staphylococcus aureus

O S. aureus representa um risco para a sade pblica pela produo de enterotoxina estafiloccica, agente causal de intoxicao alimentar. A determinao de S. aureus importante para: Confirmar intoxicao causada pelo mesmo; Identificar alimentos veiculadores desta bactria; Demonstrar contaminao ps-processamento por manipulao humana. No que se refere s matrias-primas, deve-se considerar a possibilidade de sobrevivncia durante o processo de transformao das mesmas. A presena de S. aureus em produtos fermentados pode indicar fermentao imprpria.

Meios utilizados gua peptonada a 0,1%

gar Baird Parker Extrato de carne Triptona Extrato de levedura Piruvato de sdio Glicina 5,0 g 10 g 1,0 g 10 g 12 g

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Cloreto de ltio gar H2O dest. pH 6,8 0,2

5,0 g 20 g 1000 mL

Antes do uso, fundir e resfriar a 50C. Adicionar: 95 mL do meio base; 4,8 mL de emulso de gema de ovo (50%); 1,0 mL de telurito de potssio 1%.

Caldo crebro corao Infuso de crebro de terneiro Infuso de corao de boi Peptona NaCl Na2HPO4 Glicose H2O dest. pH 7,4 0,1 12,5 g 5,0 g 10 g 5,0 g 2,5 g 2,0 g 1000 mL

Tcnica:

Semear em superfcie de gar Baird-Parker, 0,1 mL de cada dil., espalhar o inculo pela superfcie com basto em L; Incubar a 36C por 48 horas. Contar as col. tpicas ( negras, com 2 halos: um opaco e um translcido) e atpicas.

TESTES BIOQUMICOS

Isolar 5 colnias ou a raiz do nmero contado e transferir para gar nutriente inclinado. Incubar a 36C por 24 horas.

Coagulase Inocular uma alada para caldo BHI;

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36C por 24 horas; Retirar 0,3 mL para tubo estril; 0,5 mL de plasma de coelho Resultado = positivo para S. aureus cogulos.

Gram Apresentam-se como coccus Gram positivos agrupados em cachos.

Catalase Em lminas de vidro colocar uma poro da cultura + 1 gota de gua oxigenada (H2O2) 10 volumes. Resultado = Staphylococcus todos positivos. 0,1 ml em Baird - Parker

37C/48 horas

gar nutriente

37C/24 horas

Testes Bioqumicos

BHI (37C/4-24 h) 0,3 ml +0,5 plasma cogulos (+) 10. Bacillus cereus

Catalase

Gram

O Bacillus cereus um bastonete, gram-positivo, esporulado, aerbio e anaerbio facultativo. comum no solo, vegetais, alimentos crus e processados. Alimentos com contagens superiores a 106 UFC/g podem produzir intoxicao alimentar. Normalmente os alimentos implicados em intoxicaes foram submetidos a um tratamento pelo calor, porm no foram esfriados com rapidez, nem conservados em

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temperaturas de refrigerao, permitindo deste modo que os poucos esporos que sobreviveram ao tratamento trmico, germinassem e posteriormente multiplicassem produzindo enterotoxinas.

Meios utilizados gua peptonada 0,1 % gar Bacillus cereus, Seg. Holbrook Peptona Manitol NaCl MgSO4. H2O Na2HPO4 KH2PO4 Azul de metileno Piruvato de sdio Agar H2O dest. pH 7,1 0,1 Antes do uso, fundir e resfriar a 50C, adicionar: 95 mL meio base; 5 mL de emulso de gema de ovo 50%; 0,4 mL de sulfato de polimixina B 0,1% esterilizada por filtrao. 1,0 g 10 g 2,0 g 0,1 g 2,5 g 0,25 g 0,12 g 10 g 14 g 1000 mL

gar Nutriente Extrato de levedura Extrato de carne Peptona NaCl Agar H2O dest. 2,0 g 1,0 g 5,0 g 5,0 g 15 g 1000 mL

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pH 7,0 0,2

Gelatina Nutriente Extrato de carne Peptona Gelatina H2O dest. pH 6,9 0,1 3,0 g 5,0 g 120,0 g 1000 mL

gar Nitrato + Motilidade Extrato de levedura Peptona KNO3 Na2HPO4 Galactose Glicerina Agar H2O dest. 3,0 g 5,0 g 1,0 g 2,5 g 5g 5 mL 7g 1000 mL

gar amido

Fazer placas com gar nutriente e aps solidificar, fazer uma sobrecamada com gar amido (AN + 1% de amido)

Hugh & Leifson (ensaio OF) Peptona de casena Extrato de levedura NaCl K2HPO4 Azul de bromotimol 2,0 g 1,0 g 5,0 g 0,2 g 0,08 g

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Agar H2O dest.

2,5 g 1000 mL

Para 100 mL de meio + 1 mL de glicose 10 %

Tcnica:

Semear 0,1 mL em placas de gar polimixina gema de ovo azul de bromotimol; Espalhar com basto em L ou ala de Drigalski; Incubar a 30C por 24-48 horas; Contar colnias caractersticas; Passar para NA (30C por 24h).

TESTES BIOQUMICOS

Gram Bastonetes curtos, gram-positivos. Esporos centrais ou sub-terminais.

Catalase Em lmina de vidro colocar uma poro de cultura + 1 gota de H2O2 10 vol. Resultado = B. cereus positivo.

Gelatinase Em gar gelatina nutriente inocular uma cultura em picada e incubar a 20C por 5 dias. Resultado = B. cereus - positivo (gelatina lquida).

Hidrlise de amido Fazer estrias em gar amido e incubar a 30C por 48 horas. Revelar com 5 a 10 mL de Lugol. Resultado = negativo - azul escuro / B. cereus positivo.

Reduo de nitratos e motilidade Semear em agulha e incubar a 30C por 24 horas, ler motilidade. Para nitratos:

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Adicionar 0,5 mL de alfa-naftil-amina + 0,5 mL de c. Sulfanlico. Resultado = Positivo rosa. (B. cereus).

Ensaio de Oxidao-Fermentao Semear em agulha em duplicata no meio Hugh-Leifson; Em um tubo selar com vaspar ou glicerol estril; Incubar a 30C por 5 dias; Positivo = meio amarelo.

Fermentativo = positivo no tubo fechado. Oxidativo = positivo no tubo aberto. B. cereus oxidativo e fermentativo.

Reagentes: Alfa-naftil amina 0,5g 100 mL

Alfa-naftol amina c. Actico 5N

cido sulfanlico 0,8 g 100 mL

cido sulfanlico cido actico 5N

cido actico 5N 28,75 mL 71,25 mL

HAC gua

Podem ser feitos outros testes: Vogues Proskauer; Citrato; Colorao com negro Sudo.

11. Salmonella sp.

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Os membros do gnero Salmonella so agentes de infeces intestinais humanas e de animais. Dentre os agentes de doenas veiculadas por alimentos o gnero Salmonella um dos principais responsveis por casos fatais e por complicaes clnicas dos afetados. Desta forma, alm da alta taxa de mortalidade, sua incidncia no homem e animais implica em gastos significativos com medicamentos e hospitalizaes. As atividades de inspeo e fiscalizao de alimentos tem, como objetivo crtico, o controle e a preveno dos membros deste grupo e das implicaes de sua presena nos alimentos, assim como da observncia de boas prticas de manufatura e dos programas de controle que devem incluir a certificao da adequacidade das medidas adotadas, em especial para este gnero ou bactria. Os mtodos laboratoriais para a sua pesquisa incluem um etapa de pr-enriquecimento, visando minimizar os efeitos do processo tecnolgico de obteno do alimento capaz de promover a injria fisiolgica, sem inativ-la biologicamente. A presena de Salmonella determinada em 25 g ou ml da amostra sob anlise, no mnimo. O resultado positivo para esta pesquisa interpretado considerando o risco potencial que apresenta, o que significa impropriedade ao consumo do produto em questo.

Meios de Cultura

gua peptonada 1% tamponada Peptona de carne NaCl Na2HPO4 KH2PO4 H2O dest. pH 7,2 0,2 10 g 5g 9,0 g 5,0 g 1000 mL

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Caldo Selenito Cistina Triptona L(-) cistina Lactose Na2HPO4 . 2H2O Bi-selenito de sdio H20 dest. pH 7,0 0,2 NO AUTOCLAVAR 5,0 g 0,01 g 4,0 g 2,0 g 4,0 g 1000mL

Caldo Rappaport Vassiliadis Peptona de soja NaCl KH2PO4 MgCl2 . 6 H2O Verde malaquita H2O dest. pH 5,2 0,2 5,0 g 8,0 g 1,6 g 40 g 0,04 g 1000 mL

gar verde brilhante, vermelho de fenol lactose sacarose (BPLS) Peptona de carne Peptona de casena Extrato de levedura Lactose Sacarose NaCl Na2HPO4 Verde malaquita Vermelho de fenol gar 5,0 g 5,0 g 3,0 g 10 g 10 g 5,0 g 2,0 g 0,0125 g 0,08 g 12 g

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H2O dest. pH 6,9 0,1

1000 mL

Para 100 mL do meio fundido e resfriado a 50C adicionar 1 mL de novobiocina 0,4 % estril gar para enterobactrias de Hektoen Proteose peptona NaCl Extrato de levedura Lactose Sacarose Salicina Na2S2O3 Citrato de ferro e amnio Sais biliares Azul de bromotimol Fucsina cida gar H2O dest. 12 g 5,0 g 3,0 g 12 g 12 g 2,0 g 5,0 g 1,5 g 9,0 g 0,064 g 0,04 g 13,5 g 1000 mL pH 7,5 0,1 - NO AUTOCLAVAR

gar xilose-lisina-desoxicolato Extrato de levedura NaCl D(+) xilose Lactose Sacarose L(+) lisina Desoxicolato de sdio Na2S2O3 Citrato de ferro e amnio Vermelho de fenol gar 3,0 g 5,0 g 3,5 g 7,5 g 7,5 g 5,0 g 2,5 g 6,8 g 0,8 g 0,08 g 13,5 g

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H2O dest.

1000 mL

pH 7,4 0,2 NO AUTOCLAVAR

Caldo Uria Extrato de levedura KH2PO4 Na2HPO4 Vermelho de fenol H2O dest. pH 6,8 0,1 0,1 g 9,1 g 9,5 g 0,01 g 1000 mL

Aps esterilizar, esfriar e adicionar 5 mL de uria 40 % (por litro de meio). Distribuir 10 mL em tubos.

gar lisina ferro (LIA) Peptona Extrato de levedura Glicose L-lisina Citrato de frrico amoniacal Na2S2O3 Prpura de bromocresol gar H2O dest. pH 6,7 0,1 5,0 g 3,0 g 1,0 g 10 g 0,5 g 0,04 g 0,02 g 15 g 1000 mL

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gar trplice acar ferro (TSI) Extrato de carne Extrato de levedura Peptona de casena Peptona de carne Lactose Sacarose D(+)Glicose Citrato de ferro e amnio NaCl Na2S2O3 Vermelho de fenol gar H2O dest. pH 7,4 0,1 3,0 g 3,0 g 15 g 5,0 g 10 g 10 g 1,0 g 0,5 g 5,0 g 0,3 g 0,024 g 12 g 1000 mL

Meio SIM Peptona de casena Peptona de carne Citrato de amnio e ferro III Na2S2O3 gar H2O dest. pH 7,3 0,1 20 g 6,6 g 0,2 g 0,2 g 3,0 g 1000 mL

gar Citrato de Simmons

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Caldo Dulcitol Base: Triptona Peptona de carne NaCl Vermelho de fenol H2O dest. pH 7,4 0,1 Caldo Malonato fenilalanina Extrato de levedura (NH4)2 SO4 K2HPO4 KH2PO4 NaCl Malonato de sdio Azul de bromotimol Fenilalanina H2O dest. pH 6,6 0,1 1,0 g 2,0 g 0,6 g 0,4 g 2,0 g 3,0 g 0,025 g 1,0 g 1000 mL 5,0 g 5,0 g 5,0 g 0,018 g 1000 mL

Adicionar 2,5 mL Dulcitol 20% ( esterilizado por filtrao).

Tcnica:

25 g de amostra + 225 mL APT 1%

24h / 35C 1 mL 1 mL

30

24h / 36C

Colnias Tpicas para gar nutriente

24h / 36C

Caldo Uria

24h / 36C

Dos tubos (-) para urease, repicar em: TSI base amarela com H2S. LIA violeta com H2S. SIM motilidade (+) H2S (+). Malonato-fenilalanina (-). Citrato (+). Dulcitol (+).

Sendo necessrio, fazer sorologia. Malonato = degradao do malonato pela viragem do indicador. Fenilalanina = gotas de HCl 0,1 N at amarela. 3-4 gotas de FeCl3 10 % amarela (-)

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verde Dulcitol = vermelho (-) e amarela (+)

(+)

12. Viabilidade da flora bacteriana do iogurte ( nmero relativo de Streptococcus thermophilus e Lactobacillus bulgaricus )

Meios utilizados gua Peptonada 0,1%

gar Lee Triptona Extrato de Levedura Lactose Sacarose CaCO3 KH2PO4 gar H2O dest. 2,0 g 2,0 g 1,0 g 1,0 g 0,6 g 0,1 g 3,6 g 1000 mL

Aps esterilizar, adicionar 2 ml de sol. estril de Prpura de bromocresol 0,2%. Tcnica

Diluir o iogurte; Inocular 0,1 mL das diluies adequadas por espalhamento em superfcie; Incubar por 48 horas a 37C. Resultados:

S. thermophilus amarelo. L. bulgaricus - brancos. Proporo normal 1:1.

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13. Esporos Mesfilos

25g + 225 mL gua peptonada 0,1 %

Liquidificador

10 mL em 100 mL de gar BPC

90C por 15 min c/agitao constante

resfriamento rpido ( 50C)

Distribuir em 6 placas

Incubar a 37C por 24-48 horas

Obs: contar todas as placas.

gar BPC Triptona Glicose Prpura de bromocresol 0,2% gar H2O dest. pH 7,0 10 g 5,0 g 10 mL 15 g 1000 mL

14. Esporos Termfilos

20 mL da dil. + 100 mL de gar BPC

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Vapor fluente por 30 min

Distribuir em 6 placas (50C)

Incubar a 55C por 24-48 horas

Flat Sour : colnias amarelas. Resultado x 5 = esporos por 10 g. ( esporos sempre por 10 g do produto).

15. Lipolticos

As gorduras dos alimentos so suscetveis hidrlise e oxidao, o que pode ser causado por bactrias, bolores e leveduras, como tambm por processos qumicos. A deteriorao hidroltica e oxidativa das gorduras levam a alteraes do odor e diminuio da qualidade. Os alimentos mais freqentes envolvidos em problemas de liplise so os cremes de leite, manteigas, margarinas e outros produtos com grande proporo de gorduras. A temperatura e umidade durante o armazenamento podem proporcionar condies de desenvolvimento de microrganismos lipolticos. Os gneros Pseudomonas, Alcaligenes, Staphylococcus possuem espcies lipolticas. As lipases so relativamente ativas em baixa atividade de gua (congelados, alimentos em p) embora o aumento nas condies de atividade de gua aumente a ao enzimtica. As lipases so enzimas exocelulares podendo estar atuando na gordura do alimento mesmo aps a destruio da clula microbiana por processos tecnolgicos.

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Meios utilizados

gua peptonada 0,1%

gar Tributirina Peptona Extrato de levedura gar H2O dest. pH 7,5 0,1 Aquecer o meio 80C e acrescentar 10 g de tributirina neutra a 80C. Esterilizar. 5,0 g 3,0 g 15,0 g 1000 mL

Tcnica: Semear em superfcie 0,1 mL das diluies adequadas. Incubar a 22C por 5 dias. Contar colnias com halo transparente.

16. Proteolticos

Alteraes no sabor e odor podem ser produzidas por microrganismos proteolticos. Alguns psicrotrficos, causando alteraes indesejveis em produtos crneos, laticnios e pescado. Em alguns alimentos, o nmero de proteolticos pode projetar o tempo de vida do produto estocado sob refrigerao e avaliar o processamento tecnolgico. Proteases termorresistentes so produzidas por algumas espcies de Pseudomonas e podem alterar leites esterilizados. Espcies proteolticas so comuns entre os gneros Bacillus, Clostridium, Pseudomonas e Proteus. As colnias de bactrias proteolticas no gar leite apresentam-se rodeadas por uma zona clara como resultado da converso da casena em compostos nitrogenados solveis. Como o meio opaco, utiliza-se um precipitante qumico para detectar a

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protelise. Aps o tratamento com o precipitante qumico, as colnias no podem ser usadas para outras anlises.

Meios utilizados

gua peptonada 0,1% gar leite Peptona de carne Extrato de Levedura gar gua dest. 5,0 g 3,0 g 12 g 0,9 L

Na hora de utilizar, acrescentar ao meio estril, fundido e resfriado 100 mL de leite desnatado reconstitudo (10%), estril. Tcnica: Semear em superfcie de gar leite 0,1 mL das diluies adequadas. Incubar a 22C por 72 horas. Cobrir o gar com sol. de cido clordrico a 1% ou cido actico 10% por 1 min. Retirar o excesso de lquido e contar as colnias rodeadas por um halo transparente.

17. Teste de esterilidade comercial Exame de alimentos enlatados

A incidncia de deteriorao em alimentos enlatados muito baixa, mas quando ocorre importante saber como proceder com a investigao. A deteriorao microbiana ou o hidrognio liberado na reao dos cidos com o metal das latas pode produzir deformaes na lata. Temperaturas de vero e altas altitudes acentuam o grau de estufamento. Nem todos os microrganismos que podem crescer em alimento

enlatado causam anormalidades. Existe a presena de microrganismos sem o estufamento das latas, por exemplo o C. botulinum. A deteriorao de alimentos enlatados pode ser ocasionada por

subprocessamento ou vazamento.

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Subprocessamento Este termo usado para indicar que durante a esterilizao, o tratamento trmico foi insuficiente para destruir os microrganismos capazes de desenvolverem posteriormente no alimento. Pode ocorrer por: (1) subcozimento deliberado visando preservar o frescor do produto; (2) falhas na operao do autoclave ( incluindo termmetros, medidores de presso e controles); (3) contaminao excessiva para a qual o processo normalmente utilizado torna-se insuficiente; (4) Operao inadequada do autoclave. Quando uma lata contm um produto deteriorado e nenhum microrganismo vivel, a deteriorao pode ter ocorrido antes do processamento ou os microrganismos

causadores da deteriorao podem ter morrido durante o armazenamento.

17.1 - EXAME PRELIMINAR

a. Remover os rtulos identificando toda a informao e codificar com nmeros correspondentes; b. Anotar o tamanho e a quantidade das latas, os cdigos, o produto, as condies da lata, defeitos mecnicos, perfuraes e manchas de ferrugem; c. Classificar cada lata de acordo com o que segue: c1) plana ( flat ) a lata na qual ambas as extremidades so e permanecem planas quando invertidas e colocadas bruscamente sobre uma superfcie plana; c2) salincia flutuante ( flipper ) a lata que normalmente parece plana, mas quando colocada bruscamente sobre uma superfcie plana mostra abaulamento em uma extremidade. Aplicando presso nesta extremidade a salincia desaparece e a lata tornase plana; c3) abaulada ( springer ) a lata com uma extremidade permanentemente abaulada. Quando colocada bruscamente sobre uma superfcie plana pela extremidade abaulada, esta torna-se plana mas forar abaulamento da extremidade oposta; c4) estufada ( soft swell ) a lata abaulada em ambas as extremidades, mas no to firmemente que no possa ser pressionada de alguma maneira com o dedo;

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c5) altamente estufada ( hard swell ) a lata abaulada em ambas as extremidades de maneira que a presso do dedo no modifica o formato abaulado. Com o aumento da presso interna acaba-se rompendo e o vazamento ocorre na recravao. 17.2 - PR INCUBAO

As latas, embaladas cartonadas e vidros hermeticamente fechados so colocados sobre papel filtro a fim de constatar-se possveis microfugas e incubados. Incubar 1 amostra na temperatura de 35C por 14 dias e 1 a 55C por 10 dias. Os produtos j bombeados (tufados) na chegada ao laboratrio devero ser analisados imediatamente, dispensando a prova de estufa.

17.3 - ABERTURA DAS LATAS

- Lavar as latas com gua e sabo e esterilizar a extremidade a ser aberta adicionando lcool e flambando. NO FLAMBAR latas altamente estufadas. Apenas passar um pano esterilizado embebido em lcool. - A abertura da lata feita com abridor previamente flambado em lcool.

17.4 - Produtos ralos como leite ou sopa Retirar quantidades de 50 mL do produto com auxlio de pipeta estril e com ponta cortada. Destes 50 mL: (a) 20 mL so transferidos para um tubo estril o qual refrigerador para referncia futura; (b) adicionar 1 a 2 mL a cada um dos tubos de meios de cultura indicados; (c) o resto utilizado para o teste de pH. mantido em

17.5 - Produtos semi-slidos como pudins. Retirar cerca de 30 mL do produto com auxlio de pipetas de ponta larga esterilizadas e transferir para frasco contendo 70 mL de gua destilada esterilizada. Para alguns produtos recomendvel colocar-se algumas prolas de vidro com a gua estril. Agitar vigorosamente e usar a mistura resultante da mesma maneira que o

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produto ralo. ( Quando usar prolas de vidro use tampa de borracha estril para fechar o recipiente ).

17.6 - Produtos slidos como carne. Neste caso fazer uma abertura em toda a tampa da lata. A amostra ento removida utilizando-se de amostrador de queijo, colheres, etc que tenham sido previamente esterilizados. A amostra coletada primeiro no centro da lata e depois nas laterais em 3 ou 4 direes . Transferir a amostra para frascos contendo 70 mL de gua estril ( contendo prolas de vidro ). Fechar o frasco com tampa de borracha e agitar vigorosamente. A mistura utilizada da mesma maneira que o produto ralo.

17.7 - TCNICA DE CULTIVO

Produtos de baixa e media acidez ( pH > 4,5 ) De cada lata ou outro conteiner, inocular 4 tubos de caldo de carne cozida (cooked meat medium) ou caldo de fgado picado (chopped liver broth) previamente aquecido a 100C e resfriado a temperatura ambiente. Inocular tambm 4 tubos de caldo dextrosado prpura de bromocresol. Inocular cada tubo com 1-2 mL do produto lquido ou da mistura aquosa do produto, ou 1-2 gramas do material slido. Incubar como segue: Meio Carne cozida* (ou fgado) Carne cozida* (ou fgado) PBC 2 55 24-48 2 55 24-72 Tubos 2 Tempo(h) 96 Teste para: Anaerbios Putrefativos Anaerbios Termfilos Termfilos

TC 37

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Tipo FLAT SOUR PBC 2 37 96 Devido a Vazamento

*os meios para anaerbios devem ser estratificados com uma camada de Vaspar (partes iguais de vaselina slida e parafina) de cerca de 2 cm de espessura. Verificar a presena ou ausncia de crescimento em cada tubo e aqueles que mostrarem evidncia de crescimento ( turbidez, mudana de colorao do indicador ), fazer colorao de Gram ou colorir com azul de metileno. Observe os tipos morfolgicos. Quando a inoculao do alimento ocasiona turbidez no meio, a presena ou ausncia de crescimento deve ser determinada por exame microscpico. Tambm recomendvel repicar, por estriamento, os tubos que apresentarem indcios de crescimento em placas com gar nutritivo ou gar crebro-corao e incubar por 24 horas nas mesmas condies de temperatura, em aerobiose ou anaerobiose, conforme os tubos de origem. Teste de catalase Quando o tubo de origem for aquele incubado em anaerobiose e ocorrer presena de bastonetes Gram positivos, realizar prova de catalase. A prova de catalase positiva indica a presena de Bacillus sp. E a negativa indica a presena de Clostridium sp.. Ocorrendo a presena de bastonetes termfilos repicar maciamente em gar para esporulao. Incubar a 55C por 2-10 dias. A partir do segundo dia verificar a presena de esporos atravs de esfregao com colorao especfica (verde malaquita). Lavar a cultura a 80C, por 10 min. Aps o choque trmico, semear 2 tubos com caldo PBC, incubar 1 tubo a 35C e outro a 55C por 2-4 dias. 17.8 Produtos cidos ( pH < 4,5 )

Verificar a possvel presena de hidrognio em latas deformadas:

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Quando as latas esto estufadas e apresentam uma contagem baixa de microrganismo, e conveniente analisar os gases para investigar estufamento por hidrognio. Este tipos de deteriorao, de origem no bacteriana, da origem a um gs combustvel e o interior da lata apresenta-se corrodo, enquanto que nos gases resultantes da ao bacteriana predomina o dixido de carbono. A natureza combustvel desse gs pode ser demonstrada fazendo m pequeno orifcio na lata enquanto a mesma mantida junto a uma chama diferencial em um analisador de gs. De cada container, inocular 4 tubos de caldo cido e 2 tubos de caldo extrato de malte com 1-2 mL ou 1-2 g do produto. Incubar como se segue:

Meio Caldo cido

Tubos 2

TC 55

Tempo(h) 48

Teste para: Termfilos FLAT SOUR

Caldo cido*

2

37

72

Anaerbios

Caldo cido

2

30

96

Leveduras, mofos, Lactobacilos

Caldo estrato de malte

2

30

96

Leveduras, mofos, Lactobacilos

*Estratificar com gar simples. Em alguns casos, a deteriorao de produtos tais como tomates, peras , figos e abacaxis causada por Clostridium pasteurianum, um anaerbio esporulado que produz gs e odor de cido butrico.

EXAME MICROSCPICO

Prepare um esfregao (filme) do contedo de cada lata aps o subcultivo; Seque, fixe e core com azul de metileno; Se o produto for gorduroso, adicione xileno ( com conta gota ) ao filme quente e fixado; passe pela gua e core.

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PRODUTO

35C (14 dias)

55C (10 dias)

2g am 2 tubos com caldo carne + Vaspar

2g am 2 tubos com caldo PBC

2g am 2 tubos com caldo vaspar + Vaspar

2g am 2 tubos com caldo PBC

35C/ 5d

35C/5d

55C/ 5d

55C/ 5d

cresc.

cresc.

cresc.

cresc.

35C/24 h anaerobiose

35C/24 h aerobiose

55C/24 h anaerobiose

55C/24 h aerobiose

Gram Catalase

Gram

Gram Catalase

Gram

Estrias em tubo com gar p/espor. 55C/2-10 d

Lavar a cultura c/gua est. Choque trmico 80C/10 min Tubos BCP

35C/2-4d

55C/2-4d

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18. Haloflicos

Microrganismos que precisam de sal para crescer so chamados de haloflicos. Em geral, eles precisam de outros sais, no somente o NaCl, como por exemplo: K+ e Mg2+. Os nveis de sal que o microrganismo precisa varia muito. Entretanto, o tipo microbiano associado a um alimento salgado em particular depende da concentrao e do tipo de sal e do tipo de alimento. A classificao mais prtica de haloflicos aquela baseada no nvel de sal: Fracamente haloflicos = 2 5% de sal. Moderadamente haloflicos = 5 20 % de sal. Extremamente haloflicos = 20 30 % de sal.

Tambm existem muitos halotolerantes que crescem tanto em meio sem sal quanto em meios em que a conc. de sal excede 5%. Muitos microrganismos esto envolvidos na deteriorao de alimentos salgados, entretanto outros, como o Staphylococcus aureus, so pategos. Bolores e leveduras, e outros microrganismos osmoflicos esto envolvidos na deteriorao de alimentos com baixo valor de aw, inclusive alimentos salgados.

Meios utilizados (para veg. e carnes)

gua peptonada 0,1% + NaCl 5% Peptona de casena NaCl H2O pH final 6,9 0,2 1,0 g 50 g 1000 mL

Trypticase soy gar + NaCl 5% Triptona Peptona de soja NaCl gar H2O pH final 7,3 0,2 15 g 5,0 g 50 g 15 g 1000 mL

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Tcnica: Realizar as diluies adequadas; Colocar 1 mL em placa de Petry; Verter o gar fundido e deixar solidificar; Incubar as placas invertidas por 4 dias a 25C; Contar as placas.

Obs: Dependendo da amostra o diluente, o meio, a temperatura de incubao e o tempo de incubao devem ser alterados.

19. Clostrdios Sulfito Redutores

Bastonetes Gram-positivos, esporulados, imveis produtores de toxina patognica. anaerbio-aerotolerante. O pH de crescimento varia de 5,5 a 8,0 na faixa de temperatura de 20 a 50C. Seu hbitat natural: solo, guas residuais, poeira, fezes do homem e dos animais.

Meios utilizadosgua peptonada 0,1%

gar seletivo para C. perfringens Seg. Angelotti ou gar SPS Peptona de casena Extrato de levedura Citrato frrico gar H2O pH final 7,0 0,2 15 g 10 g 0,5 g 15 g 1000 mL

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Dissolver os componentes em gua destilada. Autoclavar a 121C/ 15 min. Aps esterilizar, adicionar as seguintes solues, esterilizadas por filtrao por litro de meio: Sulfito de sdio 10% -------------------------------- 5,0 mL Sulfato de polimixina B 0,2%---------------------- 10 mL Sulfadiazina sdica ---------------------------------- 10 mL Na forma desidratada proceder conforme instrues do fabricante.

Tcnica:

Semear 1 ml das diluies em gar SPS (pour plate) fazer sobrecamada; Incubar a 46C/ 48 horas; Contar as colnias mdias e negras.

Obs: A incubao deve ser anaerbia. Para tanto colocar as placas invertidas em jarra apropriada, adicionada de Gaspak ou anaerogen, conforme instrues do fabricante.

20. Teste de Segurana Biolgica - Esterilidade

Os testes so aplicados a insumos farmacuticos, medicamentos e correlatos que, de acordo com a Farmacopia, devem ser estreis, e so adequados para revelar a presena de bactrias e fungos nos mesmos.

Meios utilizados Os meios mais usados atualmente para o teste de esterilidade so: Meio de casena-soja e Tioglicolato Fluido; o primeiro para fungos e aerbios e o segundo para anaerbios, embora haja crescimento de aerbios e at mesmo fungos no tioglicolato.

gua peptonada 0,1% Peptona de carne H2O dest. pH aps esterilizao - 7,1 0,2 0,1 g 100 mL

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Meio de Tioglicolato Fluido L-Cistina Cloreto de sdio Dextrose Extrato de levedura Casena de digesto pancretica Tioglicolato de sdio ou cido tiogliclico Soluo de resarzurina sdica (1:1000) gar H2O dest. pH aps esterilizao - 7,1 0,2 0,5 g 2,5 g 5,5 g 5,0 g 15,0 g 0,5 g 0,3 1,0 mL 0,75 g 1000 mL

Meio de Casena-Soja Casena de digesto pancretica Farinha de soja de digesto pancretica Cloreto de sdio Fosfato de potssio dibsico Dextrose H2O dest. pH aps esterilizao - 7,3 0,1 Pr-Incubao e Teste de Sensibilidade dos Meios de Cultura Os meios de cultura devem apresentar esterilidade e capacidade de promover crescimento de microrganismos que devem ser testadas em cada lote antes do teste das amostras ou em paralelo com ele. Aps a esterilizao os meios de Tioglicolato fludo e Casena-soja devem ser incubados, respectivamente, a 30-35C e 20-25C, durante 7 dias no mnimo. No deve ocorrer o crescimento de microrganismos. Efetuar teste para verificar a capacidade dos lotes de meios em promover o crescimento de microrganismos. Os seguintes microrganismos so adequados para realizar o teste: a) Bacillus subtillis ATCC 6633 ou Micrococcus luteus ATCC 9341 17,0 g 3,0 g 5,0 g 2,5 g 2,5 g 1000 mL

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b) c) d)

Candida albicans ATCC 10.231 Aspergillus niger ATCC 16.404 Clostridium sporogenes ATCC 11.437 ou Bacteroides vulgatus ATCC 8482 Inocular pelo menos 2 tubos de cada meio, com volume de suspenso que contenha

50 a 100 clulas, conforme a tabela:

Meio

Microrganismo B. subtilis ou M. luteus

Temperatura incubao

Tioglicolato fluido

C. albicans C. sporogenes ou B. vulgatus

30-35C

B. Subtilis ou M. luteus Casena-soja C. albicans A. niger 20-25C

Avaliao da Atividade Bacteriosttica ou Fungisttica Antes de iniciar o teste de esterilidade avaliar seu nvel de atividade bacteriosttica e/ou fungicida pelo seguinte procedimento: Preparar, pelo menos, 4 tubos de meio de cultura a serem empregados no teste de esterilidade. Adicionar a todos os tubos quantidade do produto em anlise:

Contedo do recipiente (mL) Menos que 10

Volume mnimo de produto (mL) 1mL ou contedo total, se menor que 1

Volume mnimo de meio (mL)

15 40 80

11 a 50 51 a 100

5 10

Inocular metade dos tubos com microrganismo aerbio e a outra metade com anaerbio conforme indicado na tabela do teste de crescimento dos meios de cultura. Preparar duplicata do conjunto em condies idnticas, porm no adicionar o produto a ser testado. Incubar todos os tubos tioglicolato a 30-35C e a 20-25C, os que contiverem casena soja. Se houver cresimento normal dos microrganismos na presena

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e ausncia do produto, o teste de esterilidade pode ser realizado sem modificaes. Se o crescimento for pequeno ou nulo, o produto exerce atividade bacteriosttica e/ou fungisttica e essa atividade deve ser eliminada antes do teste de esterilidade por meio de agentes neutralizantes ou, no decorrer do mesmo, atravs da diluio do produto. Deve-se repetir o teste at determinar a relao ideal entre volumes do produto e do meio, que no interfira no crescimento de microrganismos. Outra maneira de evitar as atividades bacteriosttica e fungisttica empregar o mtodo de filtrao por membrana, quando a natureza do produto assim o permitir.

Procedimento para o Teste de Esterilidade

O teste de esterilidade pode ser realizado de 2 maneiras: atravs do Mtodo de inoculao do produto diretamente no meio (Mtodo Direto) ou pelo mtodo de filtrao por membrana, o qual deve ser empregado sempre que possvel.

Amostragem

O nmero de amostras de um produto para o teste de esterilidade deve ser, no mnimo, de 20 unidades ou 10% do nmero de unidades que constituem o lote se este for inferior a 199 unidades. Antes do teste proceder a assepsia das paredes externas dos frascos e ampolas, mergulhando-os em soluo anti-microbiana. No caso de artigos cujas as embalagens no resistam a esse tratamento, fazer assepsia das amostras por meio de gaze ou pano estril, embebido em soluo anti-microbiana. Para matrias primas, amostragem satisfatria baseada na raiz quadrada do nmero total de recipientes do lote.

Mtodo de Inoculao ou Direto

a) Procedimento

O teste de esterilidade pelo mtodo de inoculao ou direto consiste na transferncia assptica de quantidade do produto a ser examinado para o meio de tioglicolato fluido e meio de casena-soja seguida de incubao a 30-35C e 20-25C durante 14 dias.

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b) Lquidos

Retirar o lquido do recipiente utilizando pipeta estril ou seringa e agulha estreis. Transferir assepticamente o volume indicado de cada amostra para os tubos contendo os meios conforme a tabela do teste de avaliao da atividade bacteriosttica ou fungisttica. Misturar o lquido com o meio sem arejar excessivamente.

c) Slidos

Transferir quantidade de produto na forma de slido seco (ou de soluo ou suspenso do produto preparada pela adio de gua peptonada estril ao recipiente) correspondente a 300 mg de cada recipiente sob anlise, ou todo contedo se for menor que 300 mg, a volume no inferior a 40 mL dos meios. Misturar e proceder como para lquidos.

d) Controle Negativo ou Branco

Efetuar constantemente controle negativo simulando teste com o diluente utilizado. O resultado do teste deve ser negativo.

e) Observao e Interpretao dos resultados

Durante o tempo de incubao, observar os tubos em anlise, periodicamente, para verificar eventual aparecimento de crescimento microbiano. Se, no final do perodo de incubao, no ocorrer crescimento microbiano, a amostra considerada satisfatria para o teste de esterilidade. Se ocorrer crescimento, o produto no corresponde ao teste de esterilidade, a menos que se possa demonstrar o contrrio por reteste, ou por meios que comprovem no Ter contaminao com causa relacionada com a amostra (ex.: contaminao ambiente, contaminao de controle negativo). O reteste deve ser feito de maneira idntica ao inicial. Se no aparecer evidncia de crescimento, a amostra considerada satisfatria para o teste de esterilidade. Se houver crescimento no reteste, comparar com o primeiro teste. Seo contaminante for o

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mesmo, a amostra no corresponde ao teste de esterilidade. Se os dois contaminantes forem diferentes, deve ser realizado um segundo reteste.

USP XXII, 71- Sterility tests. Pg 1483-1488.

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REFERENCIAS BIBLIOGRFICASBRASIL. Ministrio da Agricultura, do Abastecimento e da Reforma Agrria. Secretaria Nacional de Defesa Agropecuria. Departamento Nacional de Defesa Animal. Coordenao Geral de Laboratrio Animal. Mtodos de Anlise Microbiolgica para Alimentos. 2a reviso. 1991/1992. FOOD AND DRUG ADMINISTRATION - FDA. Bacteriological analytical manual. 7 ed. Arlington: AOAC International, 1992. SPECK, M. L. (Ed.). AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION. Compendium of methods for the microbiological examination of foods. 2 ed. Washington: American Public Health Association, 1984.

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VALORES DE NMP PARA 3 TUBOS INOCULADOS DE 3 DILUIES DECIMAIS (Demeter, Sauer and Miller, 1933) No de tubos positivos observados em cada diluio 1 diluio 2a diluio 3a diluioa

0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

0 0 1 1 2 0 0 0 1 1 2 2 3 0 0 0 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3

0 1 0 1 0 0 1 2 0 1 0 1 0 0 1 2 0 1 2 0 1 2 3 0 1 2 0 1 2 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3

NMP de microrganismos por ml da 1a diluio < 0,3 0,3 0,3 0,6 0,6 0,4 0,7 1,1 0,7 1,1 1,1 1,5 1,6 0,9 1,4 2,0 1,5 2,0 3,0 2,0 3,0 3,5 4,0 3,0 3,5 4,0 2,5 4,0 6,5 4,5 7,5 11,5 16,0 9,5 15,0 20,0 30,0 25,0 45,0 110,0 >110,0

Categoria

3 2 4 4 1 3 4 2 4 3 4 4 1 3 4 2 4 4 3 4 4 4 4 4 4 1 2 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 1 1 -

Resultados das categorias 3 e 4 no devem ser usados como base para decises sobre a qualidade do alimento.