Manual de Microbiologia Ambiental II - Tomo II

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Microbiologia Ambiental - universidad del Comahue

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  • MANUAL PRCTICO DE MICROBIOLOGA - Tomo II: Microbiologa Ambiental II

    Manacorda A. M., Cuadros D. P y lvarez A. S. Ao 2006

    AUTORES: Manacorda, A.M., lvarez, A.S. Pezzullo S. D., Cuadros,

    D.P.

    Ao: 2014

    Manual Prctico de MICROBIOLOGA

    Tomo II: Microbiologa Ambiental II

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    MANUAL PRCTICO DE

    MICROBIOLOGA

    Tomo II: Microbiologa Ambiental II

    Ao: 2014

    Departamento de Ciencias del Ambiente

    rea Saneamiento - Orientacin Tratamientos

    Autores:

    MANACORDA, Ana Mara

    LVAREZ, Anah Soledad

    PEZZULLO, Silvina Desire

    CUADROS, Daniela Patricia

    Universidad Nacional del Comahue Facultad de Ciencias del Ambiente y la Salud

    Buenos Aires 1400- Neuqun Capital

    3 Edicin: 2014

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    ndice

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    Captulo 1: DETERMINACIN DE MICROORGANISMOS DEL AIRE ........................................ 4 Captulo 2: RECUENTO EN PLACA DE BACTERIAS HETERTROFAS AEROBIAS MESFILAS TOTALES EN AGUAS ............................................................................................ 9 Anexo I (Cap. 2): TOMA DE MUESTRAS PARA DETERMINACIONES MICROBIANAS ......... 12 Captulo 3: TCNICA DE FERMENTACIN EN TUBO MLTIPLE PARA MIEMBROS DEL GRUPO DE LOS COLIFORMES: COLIMETRA ........................................................................ 14 Captulo 4: PRUEBAS BIOQUMICAS, DIFERENCIACIN DE BACTERIAS COLIFORMES .. 25 Captulo 5: ANTIMICROBIANOS ................................................................................................ 37 Captulo 6: RECUENTO DE MICROORGANISMOS HETERTROFOS EN SUELO ............... 42 Captulo 7: MICROORGANISMOS DE LA CORROSIN .......................................................... 46 Captulo 8: DEMANDA BIOQUMICA DE OXGENO (DBO) ...................................................... 51 Captulo 9 : MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE HIDROCARBUROS ..................... 54 Captulo 11 : MICROORGANISMOS QUE HABITAN EN AMBIENTES EXTREMOS ............... 56 BIBLIOGRAFA............................................................................................................................ 59

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    Captulo 1: DETERMINACIN DE MICROORGANISMOS DEL AIRE

    Objetivo

    Poner en evidencia la presencia de los microorganismos existentes en el aire y su relacin con su ubicacin transitoria en superficies de materiales y del cuerpo.

    Introduccin Los microorganismos se encuentran presentes en todos los ambientes: en el aire, en el agua, en el suelo, en la superficie de los objetos e incluso sobre nuestra piel. El aire, adems de partculas en suspensin, es portador de bacterias en forma vegetativa o esporuladas, esporas de hongos, virus, entre otros. La poblacin microbiana del aire est compuesta principalmente por bacterias y esporas de hongos. El estudio de los microorganismos del aire no ha evidenciado la existencia de una verdadera comunidad area, en el sentido de una poblacin de microorganismos que viven y se reproducen en este medio. Los microorganismos que se identifican en el aire provienen de ambientes terrestres, acuticos o de otros organismos vivos. El hombre en estado sano, desde el momento de su nacimiento y a lo largo de toda su vida aloja miles de especies de bacterias en diferentes sitios de su organismo, entre ellos: la piel, mucosas, boca y saliva. Las bacterias ms frecuentes de estos sitios son cocos gram positivos, como ser: Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermis, Streptococcus hemolticos y Streptococcus hemolticos. Al hablar, toser o tocar objetos, los microorganismos que forman parte de la flora de una persona pueden pasar a otro ambiente usando como va de transporte el aire. Tambin puede ocurrir el mecanismo en sentido inverso, inhalar aire o tocar superficies contaminadas con microorganismos. El concepto higiene est vinculado con las condiciones que debe tener un ambiente para evitar que ste contenga factores que afecten la salud de las personas. La falta de limpieza y desinfeccin en un determinado sitio, por ejemplo en la produccin de alimentos, puede aportar gran cantidad de bacterias, como tambin la falta de higiene personal de los manipuladores puede ocasionar la contaminacin de los alimentos con microorganismos, capaces de producir intoxicaciones e infecciones a travs de los alimentos. Por todo ello, la correcta higiene personal, el lavado cuidadoso de las manos despus de la utilizacin de los servicios y antes de ingerir alimentos o procesarlos, taparse la boca al toser o estornudar, no generar polvillo al barrer, son algunas precauciones que sirven para evitar la presencia y concentracin de microorganismo en el aire de ambientes cerrados, y como consecuencia disminuir las probabilidades de transmisin de enfermedades. Tcnicas para el anlisis microbiolgico del aire Existen distintos mtodos para el anlisis del aire: sedimentacin, filtracin, choque en lquidos y precipitacin electrosttica, entre otros. El mtodo de sedimentacin es uno de los ms sencillos para la determinacin de microorganismos del aire. A pesar de ello, los resultados obtenidos son orientativos de las cifras de microorganismos presentes en el aire, ya que estos niveles varan en funcin de las corrientes de aire y del tamao de las partculas en suspensin. Tambin existen distintos mtodos para el examen microbiolgico de superficies planas y no planas, probablemente contaminadas.

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    Procedimientos Anlisis de esporas de hongos y bacterias por sedimentacin En este estudio se determinar la presencia de hongos y bacterias en el aire de sitios de ambientes cerrados y abiertos. El anlisis se realizar en dos tiempos de sedimentacin diferentes, 30 minutos y una hora, a fin de evaluar el volumen de sedimentacin de inculo en un tiempo frente a otro. Para la determinacin de hongos se utilizar un medio selectivo para el desarrollo de los mismos, el agar Saboureau Glucosado. Mientras que para la determinacin de bacterias se utilizar agar Nutritivo, ya que es un medio completo, sin inhibidores, que permite el crecimiento de microorganismos poco exigenetes en sus requerimientos nutricionales.

    Agar Saboureau Glucosado

    Pluripeptona 10 gr

    Glucosa 40 gr

    Agar 15 gr

    Agua destilada c.s.p 1000 ml

    pH final: 5,6 0,2

    Agar Nutritivo

    Pluripeptona 5 gr

    Extracto de carne 3 gr

    Cloruro de sodio 8 gr

    Agar 15 gr

    Agua destilada c.s.p 1000 ml

    pH final: 7,3 0,2

    Preparar placas con agar Saboureau Glucosado y agar Nutritivo. La cantidad de placas con cada medio de cultivo deber ser el doble de los sitios que se requieran analizar, ya que en cada uno se analizarn dos tiempos.

    Destapar las placas con agar Sabouraud Glucosado y con agar Nutritivo, en un lugar cuyo nivel de contaminacin se desee examinar. Dejarlas destapadas durante diferentes intervalos de tiempo: 30 minutos y 1 hora.

    Transcurrido el tiempo, tapar las placas e incubar durante 24-48 horas a 20 C.

    Observar el desarrollo de colonias.

    Interpretacin de los resultados: Clasificar las placas de acuerdo al sitio de estudio, tiempo de sedimentacin y medio de cultivo. Observar las colonias, y sus caractersticas, que desarrollan en cada medio de cultivo. Analizar si existen correlacin entre los tiempos de sedimentacin y la cantidad de colonias desarrolladas, como as tambin la diferencia de cantidad y tipo de colonias sedimentadas en ambientes cerrados y abiertos. 1. Anlisis de superficies planas por medio de placas de contacto Para este estudio se utilizan placas de Petri especiales, llamadas placas RODAC (Replicate Organisms Direct Agar Contac), segn APHA,1992. Son placas de 6 cm de dimetro, con una superficie de 25 cm

    2, tienen grabado en la tapa una cuadrcula para favorecer el recuento de

    El agar Sabouraud Glucosado es un medio de cultivo usado para el aislamiento, identificacin y conservacin de hongos patgenos y saprofitos. Es un medio de cultivo recomendado para el cultivo y desarrollo de hongos, particularmente los asociados con infecciones cutneas (piel, pelo, etc). El bajo pH favorece el crecimiento de hongos sobre bacterias.

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    colonias (Fig. 1.1). El medio de cultivo a utilizar es agar Nutritivo y se usa adherido a la placa en forma de sello, para poder apoyar el medio sobre la superficie plana a analizar.

    Preparar las placas RODAC con agar Nutritivo. asegurndose que quede la superficie elevada del borde y pueda funcionar como sello. El medio de cultivo una vez fundido y a temperatura cercana a la de solidificar (45 C), se vierte en las placas de manera que sobresalga del borde de la misma, sin volcar y que pueda funcionar como sello, para facilitar el contacto con la superficie a examinar. Dejar enfriar.

    Presionar suavemente la placa sobre la superficie elegida, asegurndose el contacto de esta con el agar.

    Incubar las placas durante 24-48 hs. a 20 C.

    Contar las colonias presentes en la placa.

    Interpretacin de los resultados: Cada clula microbiana viable es capaz de originar una colonia macroscpica que ser utilizada para realizar el recuento, por ello se las denomina Unidades Formadoras de Colonias (UFC). Los cuadrantes facilitan el conteo. La placa tiene una superficie de 25 cm

    2, por lo tanto

    se deber realizar la conversin adecuada para expresar el resultado final como UFC/cm2.

    El principal inconveniente de este mtodo es su ineficacia en superficies muy contaminadas y la posibilidad de no obtener todos los microorganismos presentes en la superficie. Sin embargo, en los casos en los que la carga microbiana es baja da buenos resultados.

    Fig. 1.1: Placa RODAC (Replicate Organisms Direct Agar Contac) 2. Anlisis de superficies no planas: mtodo del hisopo Este sistema es el ms antiguo y el ms utilizado en el examen microbiolgico de superficies, ya que sirve para el anlisis tanto de superficies planas como de no planas.

    Delimitar la superficie que se va a analizar mediante una plantilla de papel aluminio estril con una abertura de dimensin de 9 cm

    2.

    Humedecer el hisopo estril en 10 ml de solucin salina estril y frotar varias veces sobre la superficie delimitada con la plantilla.

    Introducir de nuevo el hisopo en la solucin salina y dejar durante 15 - 30 minutos de manera que los microorganismos se liberen del algodn al medio lquido.

    Sembrar 0,1 ml de dicha solucin a una placa de Petri con agar Nutritivo, por extensin en superficie.

    Incubar durante 24-48 hs. a 20 C.

    Observar y contar las colonias formadas.

    Interpretacin de los resultados:

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    La cantidad de colonias observadas corresponde a una superficie de 9 cm2. El nmero hallado

    deber ser expresado como UFC/cm2, por lo tanto deber realizarse la conversin adecuada.

    3. Anlisis de manipuladores

    El objetivo de un anlisis a manipuladores es comprobar que la persona est en condiciones de higiene adecuadas para no contaminar los alimentos durante su manipulacin. Para este anlisis se utilizaran diferentes medios de cultivo selectivos, dado que hay diferentes gneros bacterianos relacionados a enfermedades transmitidas por los alimentos. Si bien pertenecen al grupo de las bacterias mesfilas totales, tienen la caracterstica de ser patgenas para el hombre. 4.1 Para anlisis de enterobacterias

    Agar Violeta Rojo Bilis Glucosa (VRBG)

    Peptona de carne 7,0 gr

    Extracto de levadura 3,0 gr

    Cloruro de sodio 5,0 gr

    Glucosa 10,0 gr

    Mezcla de sales biliares 1,5 gr

    Rojo Neutro 0,03 gr

    Violeta cristal 0,002 gr

    Agar 15,0 gr

    Agua destilada c.s.p 1000 ml

    pH final: 7,3 0,1

    Una vez mezclados los ingredientes se deja reposar 5 minutos y calentar a ebullicin de 1 a 2 minutos. Enfriar a 45 C y verter en placas. Una vez preparado debe usarse de inmediato. No autoclavar.

    Contar con placas estriles. Preparar una placa por cada superficie a evaluar.

    Humedecer el hisopo estril en 10 ml de solucin salina estril y frotar la superficie a analizar (manos, uas, lastimaduras, etc).

    Introducir de nuevo el hisopo en la solucin salina y dejar durante 15 - 30 minutos de manera que los microorganismos se liberen del algodn al medio lquido.

    Introducir una alcuota de 1 ml de dicha solucin en una placa de Petri.

    Aadir 15 ml del medio a 47 C y homogeneizar el medio con el inculo realizando movimientos circulares.

    Una vez solidificado el material cubrir nuevamente con 10 ml del mismo medio y dejar solidificar.

    Incubar las placas en estufa a 35 C durante 72 hs.

    Observar el crecimiento de colonias en los diferentes medios de cultivo.

    Interpretacin de los resultados: La caracterizacin de las colonias tpicas de enterobacterias confirmara la presencia de dichos organismos en la superficie de los manipuladores. Los microorganismos que desarrollan en el agar VRBG sern gram negativos, dado que la presencia de violeta cristal y las sales biliares inhiben la flora acompaante. Las enterobacterias fermentan la glucosa con la consiguiente formacin de cido haciendo virar el medio a rojo, y eventualmente, la precipitacin de cidos biliares alrededor de la colonia. Para

    El agar Violeta Rojo Bilis Glucosa (VRBG) es un medio selectivo para el estudio de entereobacterias totales en alimentos. La presencia de violeta cristal y las sales biliares inhiben la flora acompaante. Las enterobacterias fermentan la glucosa con la consiguiente formacin de cido haciendo virar el medio a rojo y eventualmente la precipitacin de cidos biliares alrededor de la colonia.

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    estimular dicha fermentacin de la glucosa y suprimir el crecimiento de las bacterias gram negativas no fermentadoras durante la siembra se le agreg una segunda capa de medio. Las colonias de Escherichia coli y Salmonella spp. tienen un crecimiento bueno en este medio y sus colonias son rojas. 4.2 Para anlisis de estafilococos

    Agar Manitol Salado

    Extracto de carne 1,0 gr

    Pluripeptona 10,0 gr

    D-manitol 10,0 gr

    Cloruro de sodio 75,0 gr

    Agar 15,0 gr

    Rojo fenol 0,025 gr

    Agua destilada c.s.p 1000 ml

    pH final: 7,4 0,2

    Preparar las placas de Petri con agar Manitol Salado. Contar con una placa por cada superficie a evaluar.

    Humedecer el hisopo estril en 10 ml de solucin salina estril y frotar la superficie a analizar (manos, uas, lastimaduras, etc).

    Introducir de nuevo el hisopo en la solucin salina y dejar durante 15 - 30 minutos de manera que los microorganismos se liberen del algodn al medio lquido.

    Tomar un inculo de 0,1 ml de la solucin con la dilucin de los microorganismos, y realizar una extensin en superficie.

    Incubar las placas en estufa a 35 C durante 72 hs.

    Observar el crecimiento de colonias en los diferentes medios de cultivo.

    Interpretacin de los resultados: La caracterizacin de las colonias tpicas de estafilococos confirmara la presencia de dichos organismos en la superficie de los manipuladores. Las colonias que desarrollan en agar Manitol Salado que son caractersticas de Staphilococcus aureus tienen un crecimiento excelente en el medio formando colonias amarillas. Vibrio parahemolyticus, una especie halfita de este gnero, est relacionada con contaminacin de alimentos, y tambin tiene excelente desarrollo originando una colonia amarilla. Por lo tanto, las colonias sospechosas, se repicarn en un medio sin exceso de cloruro de sodio para efectuarles posteriormente, la prueba de la coagulasa (S.aureus es coagulasa positivo) o una coloracin de Gram (S.aureus es gram positivo y V. parahemolyticus es gram negativo). En agar Manito Salado Staphilococcus epidermidis tienen un crecimiento escaso a bueno y su colonia presenta un color rojo.

    El agar Manitol Salado es un medio de cultivo selectivo recomendado para el aislamiento de estafilococos presuntamente patgenos a partir de alimentos. Su selectividad se basa en su alta concentracin salina. Los estafilococos coagulasa positiva hidrolizan el manitol acidificando el medio; las colonias aparecen rodeadas de una zona amarilla brillante. Los estafilococos coagulasa negativos, presentan colonias rodeadas de una zona roja o prpura.

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    Captulo 2: RECUENTO EN PLACA DE BACTERIAS HETERTROFAS

    AEROBIAS MESFILAS TOTALES EN AGUAS

    Objetivos

    Brindar especificaciones para la toma y conservacin de muestras de agua

    Determinar el nmero de bacterias viables hetertrofas en muestras de agua de diferentes sitios.

    Comparar los resultados obtenidos entre las diferentes muestras y sacar conclusiones.

    Introduccin

    Los estudios microbiolgicos sobre muestras de agua se realizan con el fin de determinar su calidad sanitaria como as tambin conocer la ecologa de dicho ambiente.

    Muchas veces el agua puede estar con los parmetros adecuados de calidad fsico qumica pero estar contaminada por la presencia de microorganismos, por lo que es importante determinar su calidad sanitaria. La potabilidad del agua se determina mediante anlisis fsicos, qumicos y microbiolgicos.

    Los hbitat de agua dulce se clasifican de acuerdo a las propiedades qumicas y fsicas, dando una gran variedad de ambientes. A modo general, la capa superior del curso de agua es un hbitat favorable para microorganismos fotoauttrofos, debido a que los productores primarios tienen acceso ilimitado al dixido de carbono atmosfrico y la radiacin luminosa. All se da un enriquecimiento de algunos nutrientes, acumulados por tensin superficial o bien por la presencia de los productores primarios, por lo tanto los microorganismos hetertrofos tambin proliferan en dicho espacio, utilizando los compuestos orgnicos. En el fondo del curso de agua, zona conocida como sedimento, los microorganismos son principalmente quimitrofos. Algunos nutrientes sedimentan por gravedad, permitiendo as la descomposicin aerbica de los nutrientes orgnicos acumulados. Mientras que debajo de los mismos, donde el oxgeno comienza a agotase, ocurre la descomposicin anaerbica de los compuestos orgnicos. La difusin del oxgeno en la profundidad es muy lenta, por lo cual en esta zona prevalece la presencia de microorganismos de metabolismo anaerobio.

    La descomposicin de la materia orgnica en ambientes acuticos se debe en gran parte a bacterias. Son las primeras en colonizar las partculas orgnicas en descomposicin (detritos), iniciando una red trfica en la que se produce el reciclado de nutrientes orgnicos de los detritos en un ecosistema. Mediante el consumo del material orgnico intervienen en la transformacin del mismo hacia el carbono de la biomasa celular de los miembros autctonos de los ecosistemas de agua dulce.

    Las principales funciones ecolgicas de los microorganismos de agua dulce son: descomponen la materia orgnica muerta liberando nutrientes tiles para la produccin primaria, asimilan y reintroducen en la red trfica la materia orgnica disuelta, son fuente de alimento para otros organismos, como as tambin participan en la transformacin y reciclado de nutrientes como nitrgeno, azufre, hierro, manganeso, etc.

    El nmero de microorganismos, su biomasa y su actividad metablica son las variables biticas fundamentales en los ecosistemas microbianos. Una variacin en el nmero de microorganismos en un perodo de tiempo, o comparando ambientes, se correlaciona con un cambio similar en la biomasa y actividad. Cualquier cambio en la temperatura, en la disponibilidad de nutrientes u otros factores ambientales, alteran la actividad microbiana.

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    El recuento de bacterias hetertrofas proporciona una valiosa informacin sobre la calidad del agua y el comportamiento de los microorganismos relacionados a la presencia de materia orgnica en un ambiente acutico en estudio.

    Frecuentemente las muestras a estudiar tienen un nmero muy elevado de microorganismos, por lo que requieren de diluciones para mejorar su recuento. El mtodo estandarizado y aprobado por APHA-AWWA sugerido para este estudio es el recuento en placa.

    Tcnica de Recuento en Placa de bacterias hetertrofas aerobias mesfilas totales en agua

    Para realizar el recuento de bacterias hetertrofas aerobias mesfilas totales en muestras de agua se deber considerar el paso previo al anlisis, que es la correcta toma de muestra.

    Procedimiento

    1. Toma de muestra de agua para anlisis microbiolgico

    Se denomina toma de muestra al proceso de captacin, conservacin, transporte, manipulacin y etiquetado de la muestra. Se debern considerar una serie de cuidados a fin de que sta conserve la representatividad del ambiente en estudio. En el anexo 1 se detallan los aspectos a considerar para realizar una adecuada toma de muestra.

    2. Procesamiento de la muestra en laboratorio

    Realizar 10 diluciones seriadas de la muestra, segn la carga microbiana que sospechemos que exista en la muestra problema se podr aumentar o disminuir el nivel de dilucin. Las diluciones debern tener una concentracin de 1/10, para lo cual se deber tomar 1 ml de la muestra y diluir en 9 ml de agua destilada estril, conformando as la primera dilucin. De esta dilucin tomar 1 ml y diluir en 9 ml de agua destilada estril. Continuar esta sucesin de pasos hasta obtener tantas diluciones como sea necesario.

    2.1 Mtodo de recuento estndar en placa (agar volcado)

    Verter 1 ml de cada dilucin, por duplicado, en placas de Petri estriles.

    Volcar 15 ml de agar nutritivo fundido y atemperado (42C) en cada placa, homogeneizar mediante movimientos de translacin y rotacin. Dejar solidificar el agar.

    Incubar las placas a 20-28C durante 7 das.

    Transcurrido el tiempo de incubacin proceder a realizar el recuento. 2.2 Mtodo de siembra por extensin

    Sembrar 0,1 ml de cada dilucin, por duplicado, en placas con agar Nutritivo. Considerar para el recuento final de colonias que este volumen representa la dcima parte de la dilucin que se est sembrando.

    Extender este inculo con esptula de Drigalsky previamente esterilizada, para ello impregnarla en alcohol y pasarla por la llama del mechero.

    Incubar las placas a 20-28C durante 7 das.

    Transcurrido el tiempo de incubacin proceder a realizar el recuento. Interpretacin de resultados:

    Seleccionar las placas con desarrollo de la dilucin en la cual se presente estimativamente un rango de entre 30 y 300 colonias.

    Contar las colonias de ambas placas y obtener el valor promedio de colonias para dicha dilucin, la cual corresponde a la dilucin a partir de la cual se sembraron las placas. El valor promedio de colonias es identificado como las Unidades Formadoras de Colonias (UFC).

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    Multiplicar el valor de UFC por la inversa de la dilucin de la cual proceden, de este modo se estar refiriendo el valor al volumen tomado de la muestra original. El resultado se expresa como UFC/ml de muestra.

    Para el caso de la siembra mediante el mtodo de siembra por extensin, el volumen sembrado en cada placa es 0,1 ml (una dcima parte de la unidad en la que se deben expresar los resultados), por lo cual el nmero de colonias contadas deber ser multiplicado por 10, para referenciar el resultado por cada 1 ml de muestra.

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    Anexo I (Cap. 2): TOMA DE MUESTRAS PARA DETERMINACIONES

    MICROBIANAS

    Objetivos

    Conocer los requerimientos necesarios a cumplir para que la muestra a analizar conserve la representatividad de las caractersticas del ambiente en estudio. Introduccin Para analizar microorganismo en sistemas naturales, basndose en el nmero total de individuos, en el nmero de poblaciones especficas, o en sus actividades metablicas, se han analizado submuestras represetnativas de los mismos y los resultados se han aplicado a la totalidad de la comunidad o del ecosistema (Board & Lovelock, 1973). En muchos ambientes, la distribucin de microorganismos no es homognea, sino irregular. Cada muestra individual es por necesidad minscula en comparacin de todo el medio en que ha sido realizado un muestreo (Bartha y Atlas, 2004). Es importante tener en cuenta que cada determinacin comprende tres fases: recogida de las muestras, procesado de estas y mediciones. La forma de recoger y procesar las muestras influye en el resultado de las mediciones; por consiguiente al interpretar los resultados hay que considerar los tres procedimientos realizados. Los procedimientos de muestreo tienen que asegurar que el nmero y las actividades de los microorganismos no se alteran, ya sea positiva o negativamente, de manera no cuantificable durante la recoleccin y conservacin de la muestra. Tambin tienen que asegurar que las muestras son representativas y que no estn contaminados con microorganismos extraos; es decir, el procedimiento seguido debe asegurar que los microorganismos solo proceden del ecosistema que se est examinando. Recipientes: La muestra se recoger en recipientes limpios y desinfectados. De ser posible, y segn lo requiera la investigacin debern ser estriles. El material del recipiente deber ser de un plstico resistente o de vidrio. Con cierre hermtico. Toma de muestra:

    Al hacer la toma de muestra se deber dejar un amplio espacio areo en la botella / frasco (al menos 2,5 cm) para facilitar la mezcla por agitacin antes de proceder al estudio.

    Los recipientes que vayan a utilizarse para la toma se mantendrn cerradas hasta el momento de llenarlas. Tener cuidado de no contaminar las tapas.

    Se deber llenar el recipiente y volver a vaciarlo, a fin de que las paredes del mismo queden impregnadas del agua a estudiar. Nuevamente se carga el recipiente con la muestra a estudiar. Esto se realiza en el caso de no tener recipientes estriles.

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    Cuando se capta agua del grifo o vlvula, esta se deja fluir libremente por 5 minutos como mnimo, a fin de remover todo sedimento adherido a las tuberas. Finalmente se capta la muestra, se coloca la tapa y se cierra firmemente a fin de evitar contaminacin atmosfrica.

    Para la captacin de muestras en depsitos, estanques, ros, arroyos, lagos y pantanos se har sosteniendo el recipiente cerca de su base con una mano y sumergindolo boca abajo. Grese el recipiente hasta que el cuello o boca apunte hacia arriba con la boca dirigida hacia la corriente. Si no hay corriente apreciable se crea una corriente artificial empujando el recipiente horizontalmente. Se extrae la muestra y se cierra rpidamente el recipiente.

    Tamao de la muestra: El volumen de la muestra debe ser suficiente para poder realizar todos los anlisis necesarios; para anlisis de recuento de bacterias aerobias hetertrofas totales se requiere un volumen de 100 ml. Conservacin: Las muestras de las cuales se analizarn parmetros microbiolgicos deben ser mantenidas en refrigeracin (2 8 C). Evitando que permanezca a temperatura ambiente, ya que podran cambiar los valores originales en un breve perodo de tiempo. El tiempo entre la recoleccin de la muestra y su procesamiento no debe superar las 2 hs. Datos de Identificacin: Las muestras deben estar rotuladas con datos descriptivos e identificativos del material, punto de muestreo, quin realiz la captacin, fecha y hora. En ocasiones se suele acompaar la muestra con los parmetros analizados in situ, que ayuden posteriormente a analizar los resultados, como ser: temperatura, oxgeno disuelto, conductividad, pH. No deben aceptarse muestras sin identificacin.

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    Captulo 3: TCNICA DE FERMENTACIN EN TUBO MLTIPLE PARA

    MIEMBROS DEL GRUPO DE LOS COLIFORMES: COLIMETRA

    Objetivo

    Poner en prctica una tcnica microbiolgica de rutina para estimar la calidad bacteriolgica del agua.

    Introduccin

    Existen numerosas enfermedades como el clera, la fiebre tifoidea, disentera bacilar, hepatitis A, entre otras, que son principalmente transmitidas por el agua. En general los agentes causales de estas enfermedades llegan al agua por el vertido de lquidos cloacales o industriales, sin previo tratamiento de desinfeccin sobre cursos naturales de agua. De esta forma microorganismos patgenos provenientes de la materia fecal, de la higiene personal o de procesos industriales, alcanzan cursos de aguas. Dichos microorganismos patgenos se encuentran en bajas concentraciones en el agua, lo que dificulta su aislamiento e identificacin. Se denomina microorganismos indicadores de contaminacin fecal a aquellos que se encuentran en grandes cantidades en las heces humanas y en las de los dems vertebrados de sangre caliente, que son de fcil identificacin y deteccin, y permiten evaluar la potencial presencia de otros microorganismos patgenos que suelen acompaarlos. El grupo de bacterias generalmente utilizadas como indicadores de contaminacin fecal son los coliformes. Este grupo pertenece a la familia Enterobacteriaceae e incluye varios gneros, entre ellos: Escherichia, Citrobacter, Enterobacter y Klebsiella. Estos microorganismos son bacilos aerobios y anaerobios facultativos, Gram negativos, no formadores de esporas, capaces de utilizar a la lactosa como fuente de carbono y energa con produccin de gas y cido en 48 horas a 35C. Existen microorganismos que renen estas caractersticas que viven asociados a vegetales o al suelo y no necesariamente se asocian a contaminacin fecal. La diferenciacin de los coliformes adquiere valor en el momento de determinar la fuente de la que procede el aumento de la densidad de su poblacin. Por esta razn se han desarrollado diferentes mtodos para la deteccin de coliformes fecales. La determinacin de coliformes mediante la tcnica descripta a continuacin puede ser aplicada a diversas muestras, incluyendo: agua potable, agua dulce, agua salada, lodos, sedimentos, fangos y alimentos (carnes, leche, vegetales, etc).

    Tcnica de fermentacin en tubo mltiple para miembros del grupo de los coliformes

    El anlisis de bacterias coliformes se realiza mediante la Tcnica de Fermentacin en Tubos Mltiples. Esta tcnica consta de tres etapas: la prueba presuntiva, la prueba confirmatoria y la prueba completa. Los resultados se comunican en trminos de Nmero Ms Probable (NMP) de microorganismos existentes por cada 100 ml de muestra. La precisin del mtodo depende del nmero de tubos utilizados, pudiendo ser de tres o cinco rplicas (series de tubos) por dilucin. Procedimiento 1. Prueba Presuntiva

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    En este estudio se determinar el nmero de coliformes totales que presentan diferentes muestras de agua que sern analizadas. Las muestras se debern tomar teniendo en cuenta las indicaciones citadas en el captulo 2, seccin Toma de muestra de agua para anlisis microbiolgico. Para su determinacin se utiliza un medio lquido lactosado, pudiendo elegir cualquiera de las siguientes opciones: caldo Lauril Sulfato; caldo Lactosa (CL); caldo Mac Conkey (CMC).

    Caldo Lauril Sulfato

    Triptosa 20 gr

    Lactosa 5 gr

    Cloruro de sodio 5gr

    Lauril sulfato de sodio 0.1 gr

    Fosfato dipotsico 2.75 gr

    Fosfato monopotasico 2.75 gr.

    Agua destilada c.s.p 1000 ml

    pH final: 6,8 0,2

    Caldo Lactosado

    Extracto de carne 3 gr

    Peptona 5gr

    Lactosa 5 gr

    Agua destilada c.s.p 1000 ml

    pH final: 6,9 0,2

    Caldo Mac Conkey

    Bilis de buey 5 gr

    Peptona 20 gr

    Lactosa 10 gr

    Prpura de bromocresol 0.01 gr

    Agua destilada c.s.p 1000 ml

    pH final: 7,3 0,2

    Preparar tubos con 10 ml del medio lquido Mac Conkey de la siguiente forma: 3 tubos a doble concentracin del medio y 6 tubos a simple concentracin del medio. Cada tubo debe llevar una campana Durham invertida (tubo de vidrio ).

    Sembrar con pipetas estriles de la siguiente manera:

    El caldo Lauril Sulfato es recomendado por APHA, para deteccin de coliformes en agua, agua residuales y alimentos. Su alto valor nutritivo permite un rpido desarrollo de microorganismos fermentadores de la lactosa an de los de fermentacin lenta. Esta fermentacin se detecta con la campana de Durham. El lauril sulfato sirve como inhibidor de la flora acompaante. El caldo Lactosado se recomienda como prueba presuntiva para investigar la presencia de bacterias del grupo coliformes en agua, leche, etc. Es un medio rico libre de inhibidores, la fermentacin de la lactosa est demostrada por la presencia de gas en las campanas Durham. El caldo Mac Conkey es un medio selectivo que se utiliza para la investigacin orientativa de microorganismos coliformes en aguas y otros materiales de importancia sanitaria. Los microorganismos que son capaces de utilizar la lactosa se desarrollan en este medio produciendo dos cambios: acidifican el caldo generando un viraje de color por la presencia del indicador prpura de bromocresol (rango de pH: 5.8 6.8), y son capaces de producir gas dentro de la campana Durham como producto de la fermentacin. La bilis de buey estimula el crecimiento de las bacterias coliformes, mientras que inhibe a gran parte de la flora gram positiva.

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    10 ml de la muestra inicial a tubos de doble concentracin, por triplicado.

    1 ml de la muestra inicial a tubos de simple concentracin, por triplicado.

    0,1 ml de la muestra inicial a tubos de simple concentracin, por triplicado. En la figura 1 se indica el procedimiento de la realizacin de las diluciones. Cuando se trabaja con una muestra de calidad desconocida, se debern sembrar ms series de tubos (ms diluciones), para asegurarse de tener alguna serie con todos los resultados negativos. En dicho caso, la metodologa para la realizacin de las diluciones es la misma que la explicada para bacterias hetertrofas totales (figura 2).

    Los tubos sembrados se incuban a 35 0,5 C durante 24 a 48 2 horas para caldo

    Lactosado o caldo Mac Conkey y 32 0,5 C durante 24 a 48 2 para caldo Lauril Sulfato.

    Transcurrido el tiempo de incubacin realizar la lectura de resultados. Interpretacin de los resultados: El desarrollo de bacterias que atacan la lactosa se evidencia, dependiendo del medio de cultivo, por la produccin de gas y cido (manifestado por el viraje del indicador de ph del medio el cual vira de violeta a amarillo por la disminucin del ph). Como la tcnica admite la utilizacin de diferentes caldos lactosados la interpretacin de los resultados depender de su uso, la misma se muestra a continuacin:

    Caldo Lauril Sulfato

    Interpretacin de resultados Crecimiento Gas

    Enterobacter aerogenes Bueno a excelente +

    Salmonella typhimurium Bueno a excelente -

    Escherichia coli Bueno a excelente +

    Staphylococcus aureus Inhibido

    Lactosado caldo

    Interpretacin de resultados Crecimiento Gas

    Enterobacter aerogenes Bueno +

    Enterococcus fecalis Bueno -

    Escherichia coli Bueno +

    Pseudomonas aeuginosa Bueno -

    Mac Conkey caldo

    Interpretacin de resultados Produccin de cido (viraje de color)

    Gas

    Enterobacterias + +

    No enterobacterias + +

    En caso de que no haya reaccin positiva en los tubos a las 24 hs, los mismos deben ser incubados nuevamente y volver a examinarlos a las 24 hs posteriores. Luego se debe registrar la presencia o ausencia definitiva de acido y gas. La aparicin de dichas reacciones, constituye una presunta reaccin positiva, por ello, como existen algunas bacterias grampositivas que son capaces de producir esta reaccin, ste resultado debe confirmarse. En las pruebas posteriores, a estos tubos se los denominar tubos primarios. El desarrollo de bacterias que atacan la lactosa con produccin de gas se evidencia por el viraje de color del medio de cultivo dado por el indicador de pH, prpura de bromocresol (rango de ph: 5.2-6.8) que vira de color violeta a amarillo por la disminucin del pH. A esto se le suma la produccin de gas acumulado en la campana de Durham. En caso que sta reaccin no se produzca, se deben incubar nuevamente aquellos tubos negativos, para volver a examinarlos a

    las 24 2 horas. Registrar la presencia o ausencia de gas y cido. La aparicin de dichas reacciones, constituye una presunta reaccin positiva, por ello, como existen algunas bacterias grampositivas que son capaces de producir esta reaccin, ste resultado debe confirmarse.

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    Figura 1. Procedimiento para la realizacin de las diluciones de tres series de tubos primarios para prueba presuntiva

    Figura 2. Procedimiento de realizacin de las diluciones para ms de tres series de tubos primarios para prueba presuntiva

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    2.- Prueba confirmatoria En esta prueba se confirma la presencia o ausencia de coliformes totales, mediante el cultivo en caldo Verde Brillante Bilis (CLVBB), como as tambin de coliformes fecales, utilizando caldo EC. Ambas preparaciones se colocan en tubos de ensayo, con una campana Durham invertida. Dichos medios son selectivos, pues inhiben notablemente el crecimiento de la flora acompaante indeseable.

    Caldo Verde Brillante Bilis

    Bilis de buey deshidratada 20 gr

    Lactosa 10 gr

    Peptona 10 gr

    Verde Brillante 0.015 gr

    Agua destilada c.s.p 1000 ml

    pH final: 7,2 0,2

    Caldo EC

    Triptosa 20 gr

    Lactosa 5 gr

    Sales biliares 2 gr

    Fosfato dipotsico 4 gr

    Fosfato monopotsico 1.5 gr

    Cloruro de sodio 5 gr

    Agua destilada c.s.p 1000 ml

    pH final: 6,9 0,2

    A la fase de confirmacin se llevan todos los tubos primarios positivos, o sea aquellos tubos en los que el medio se presente de color amarillo por la produccin de cido y con gas en la campana, luego de las 24-48 horas de incubacin. Para confirmar la presencia de coliformes totales, a partir de tubos positivos primarios, se inocula una alcuota, con un ansa estril, en un tubo con CLVBB. Debe sembrarse un tubo con

    CLVBB por cada tubo primario positivo. Se incuban durante 48 3 horas a 35 0,5C en estufa de cultivo. La produccin de gas en la campana Durham despus del tiempo de incubacin constituye un resultado positivo en la fase confirmatoria. La produccin de turbidez no indica resultado positivo. Una vez obtenido los resultados se calcula el valor del NMP a partir de los tubos positivos. La confirmacin de la presencia de coliformes de origen fecal permite diferenciar entre los coliformes de origen fecal y los procedentes de otras fuentes. El procedimiento consiste en inocular una alcuota de los tubos primarios positivos, con un ansa estril, en un tubo con caldo EC. Debe sembrarse un tubo con EC por cada tubo primario positivo. Los tubos sembrados se incuban a 44,5 0,2C durante 24 2 horas, en un bao de agua (ver Fig. 3). Depositar todos los tubos en el bao antes de que transcurran los 30 minutos de la inoculacin y mantenerlos lo suficientemente profundos, como para que el agua del bao est a un nivel superior al que tiene el medio en los tubos. Se considera como reaccin positiva la aparicin de gas a las 24 horas de incubacin. La falta de gas constituye un resultado negativo, que indica que el origen de los microorganismos no es el aparato digestivo de los animales de sangre caliente.

    El caldo EC posee un contenido de lactosa que favorece el crecimiento de bacterias que requieren este sustrato para su metabolismo, mientras que las sales biliares inhiben el crecimiento de gran parte de la flora acompaante.

    El caldo Verde Brillante Bilis (CLVBB) est recomendado para el recuento de coliformes totales y fecales, ya que los componentes de este medio favorecen el crecimiento de bacterias coliformes, mientras que la bilis al 2 % y el verde brillante inhiben gran parte de la flora acompaante.

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    Una vez obtenido los resultados se calculan el valor del NMP a partir de los tubos positivos.

    Recuentos Interpretacin de resultados: La cuantificacin clsica de las bacterias coliformes se realiza por medio del mtodo estadstico denominado NMP. Se basa en el concepto de que una o ms bacterias inoculadas en un medio de cultivo adecuado, darn origen a una poblacin que se evidenciar dando un resultado positivo. En el caso de la prueba confirmatoria el resultado consiste en la produccin gas en la campana Durham. La densidad bacteriana se calcula mediante una frmula a partir de los tubos positivos obtenidos en la siembra, datos que ya estn calculados de acuerdo a las posibles combinaciones de tubos positivos en la tablas de NMP, publicadas por APHA (1989) en Standard Methods for the examination of Water and Wastewater. Como las bacterias en el agua no se distribuyen en forma homognea por lo que al sembrar una serie de tubos con porciones de una misma muestra o dilucin, habr series en las que todos los tubos darn resultados positivos, otros negativos y otras en las que los resultados sern positivos y negativos. Para obtener resultados vlidos, se debern sembrar alcuotas apropiadas de la muestra para lograr que la primera serie de tubos (inoculados con la menor dilucin), presente resultados todos positivos, y la ltima (tubos inoculados con la mayor dilucin) todos negativos. Utilizacin de las Tablas Las tablas ms comunes estn diseadas para tres series de tubos sembrados con 10, 1 y 0,1 ml de la muestra. Se ingresa a la tabla con el nmero caracterstico, que consiste en los positivos confirmados de esas series (Tabla 1, ejemplos 1 y 2). Para cada combinacin posible de resultados positivos de las tres series, corresponde un valor de NMP. Los valores de NMP expresan cantidad de bacterias por cada 100 ml de muestra. Si en lugar de 10, 1 y 0,1 ml de la muestra se sembraron 1, 0,1 y 0,01 ml, el valor de la tabla se multiplicar por 10; si se sembraron 0,1 , 0,01 y 0,001 ml, el valor de la tabla se multiplicar por 100 (Tabla 1, ej. 5 y 6). Cuando se siembran ms de tres diluciones decimales, se ingresa a la tabla con el valor de la mayor dilucin que dio todos los resultados positivos, seguidos de los dos siguientes (Tabla 1, ej. 5, 6 y 7). En el ejemplo 4 se eligen las tres primeras diluciones dejando el nico resultado positivo en la dilucin central. Las tablas 2 y 3, presentan los ndices de NMP, para distintas combinaciones de resultados positivos, cuando se utilizan 5 y 3 tubos por dilucin, respectivamente.

    Nota: Para aplicar la tcnica de fermentacin en tubo mltiple en muestras slidas o semislidas, stas se deben de preparar de la siguiente manera: se pesa la muestra y diluye en un lquido de dilucin hasta conseguir una de 10

    -1. Por ejemplo, se aaden 50 g de muestra en una jarra

    mezcladora estril de 450 ml de tampn de fosfato estril o de agua de dilucin con peptona al 1%, y mezclar durante 1 a 2 minutos a baja velocidad (800 rpm). Preparar las diluciones decimales correspondientes del homogeneizado resultante lo antes posible para reducir al mnimo la sedimentacin.

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    Tabla 1. Ejemplos de utilizacin de tablas de NMP con tres rplicas por dilucin.

    Ej. 10 1 0,1 0,01 0,001 0,0001 N Carac. Valor Tabla Bact./ 100 ml

    1 3/3 2/3 0/3 3-2-0 93 93

    2 3/3 0/3 0/3 3-0-0 23 23

    3 3/3 2/3 1/3 0/3 3-2-1 150 150

    4 0/3 1/3 0/3 0/3 0-1-0 3 3

    5 3/3 3/3 2/3 0/3 3-2-0 93 93x10

    6 0/3 3/3 3/3 2/3 1/3 3-2-1 150 150x100

    7 -- -- 3/3 3/3 2/3 0/3 3-2-0 93 93x1000

    Tabla 2: ndice de NMP y lmites de confianza del 95% para varias combinaciones de resultados positivos, cuando se utilizan 5 tubos por dilucin (10 ml, 1 ml y 0,1 ml)

    Combinacin de tubos positivos

    NMP/ 100 ml Lmites de Confianza 95%

    Combinacin de tubos positivos

    NMP/ 100 ml Lmites de Confianza 95%

    Superior Inferior Superior Inferior

    0- 0- 0 < 2 --- --- 4-3-0 27 12 67

    0- 0- 1 2 1.0 10 4-3-1 33 15 77

    0- 1- 0 2 1.0 10 4-4-0 34 16 80

    0- 2- 0 4 1.0 13 5-0-0 23 9.0 86

    1- 0- 0 2 1.0 11 5-0-1 30 10 110

    1- 0- 1 4 1.0 15 5-0-2 40 20 140

    1- 1- 0 4 1.0 15 5-1-0 30 10 120

    1- 1- 1 6 2.0 18 5-1-1 50 20 150

    1- 2- 0 6 2.0 18 5-1-2 60 30 180

    2-0-0 4 1.0 17 5-2-0 50 20 170

    2-0-1 7 2.0 20 5-2-1 70 30 210

    2-1-0 7 2.0 21 5-2-2 90 40 250

    2-1-1 9 3.0 24 5-3-0 80 30 250

    2-2-0 9 3.0 25 5-3-1 110 40 300

    2-3-0 12 5.0 29 5-3-2 140 60 360

    3-0-0 8 3.0 24 5-3-3 170 80 410

    3-0-1 11 4.0 29 5-4-0 130 50 390

    3-1-0 11 4.0 29 5-4-1 170 70 480

    3-1-1 14 6.0 35 5-4-2 220 100 580

    3-2-0 14 6.0 35 5-4-3 280 120 690

    3-2-1 17 7.0 40 5-4-4 350 160 820

    4-0-0 13 5.0 38 5-5-0 240 100 940

    4-0-1 17 7.0 45 5-5-1 300 100 1300

    4-1-0 17 7.0 46 5-5-2 500 200 2000

    4-1-1 21 9.0 55 5-5-3 900 300 2900

    4-1-2 26 12 63 5-5-4 1600 600 5300

    4-2-0 22 9.0 56 5-5-5 > 1600 --- ---

    4-2-1 26 12 65

    Fuente: APHA, 1991

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    Tabla 3: ndice de NMP, para distintas combinaciones de resultados positivos, cuando se utilizan 3 tubos por dilucin (A: 10 ml, B: 1 ml y C: 0,1 ml)

    Combinacin de tubos positivos A- B- C

    NMP/ 100 ml Combinacin de tubos positivos A- B- C

    NMP/ 100 ml Combinacin de tubos positivos A- B- C

    NMP/ 100 ml

    0- 0- 1 3 1- 1- 2 15 2- 2- 3 42

    0- 0- 2 6 1- 1- 3 19 2- 3- 0 29

    0- 0- 3 9 1- 2- 0 11 2- 3- 1 36

    0- 1- 0 3 1- 2- 1 15 2- 3- 2 44

    0- 1- 1 6 1- 2- 2 20 2- 3- 3 53

    0- 1- 2 9 1- 2- 3 24 3- 0- 0 23

    0- 1- 3 12 1- 3- 0 16 3- 0- 1 39

    0- 2- 0 6 1- 3- 1 20 3- 0- 2 64

    0- 2- 1 9 1- 3- 2 24 3- 0- 3 95

    0- 2 -2 12 1- 3- 3 29 3- 1- 0 43

    0- 2- 3 16 2- 0- 0 9 3- 1- 1 75

    0- 3- 0 9 2- 0- 1 14 3- 1- 2 120

    0- 3- 1 13 2- 0- 2 20 3- 1- 3 160

    0- 3- 2 16 2- 0- 3 28 3- 2- 0 93

    0- 3- 3 19 2- 1- 0 15 3- 2- 1 150

    1- 0- 0 4 2- 1- 1 20 3- 2- 2 210

    1- 0- 1 7 2- 1- 2 27 3- 2- 3 290

    1- 0- 2 11 2- 1- 3 34 3- 3- 0 240

    1- 0- 3 15 2- 2- 0 21 3- 3- 1 460

    1- 1- 0 7 2- 2- 1 28 3- 3- 2 1100

    1- 1- 1 11 2- 2- 2 35 3- 3- 3 >1100

    Fuente: APHA, 1989

    Anlisis de los resultados Los recuentos de bacterias coliformes se utilizan internacionalmente para establecer criterios de calidad de aguas para diferentes usos. Si bien existen otros mtodos para deteccin y determinacin de bacterias coliformes, el NMP es el ms usado a punto tal que en los informes se omite mencionarlo. Los entes oficiales de control frecuentemente utilizan la tcnica estndar, sembrando 10, 1 y 0,1 ml de muestra con tres rplicas. Este esquema de trabajo no permite obtener un recuento preciso cuando la poblacin de bacterias excede 1100 NMP/100 ml. Sin embargo, como este nmero supera la mayora de las reglamentaciones, es suficiente para definir el uso de un recurso hdrico y permite un trabajo de rutina normalizado. Tabla 4: Valores gua recomendados por diferentes normativas nacionales e internacionales

    vigentes.

    Indicador Uso del agua Valor gua Referencia

    C. totales Riego 1000/100 ml * A

    C. fecales Riego 100/100 ml *

    C. totales Recreacin 500/100 ml ** B

    C. fecales Recreacin 200/100 ml * A

    C. totales Potable 3/100 ml ** C

    C. fecales Potable 0/100 ml **

    * Media geomtrica de un mnimo de cinco anlisis en 30 das. ** Frecuencia mnima quincenal.

    Referencia:

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    A. Canadian Water Quality Guidelines. Canadian Council of Resourse and Environmental Ministers. Marzo 1987.

    B. Ltat de lenvironnement. Premier Rapport. Commission des Comunauts Europennes. C. Cdigo Alimentario Argentino. Decreto 141/53. Provisin de agua potable. Decreto 352/79.

    3.- Prueba completa

    Esta tercera fase consiste en aislar los microorganismos en agar LES Endo o en EMB1

    (Eosina Azul de Metileno), por cada tubo de EC CLVBB que haya producido gas. Si existen coliformes y se quiere obtener una elevada proporcin de aislamientos satisfactorios, se deben tomar las siguientes precauciones: (a) sembrar con ansa estril; (b) abrir e inclinar el tubo evitando la toma con aguja de cualquier membrana o espuma; (c) introducir el ansa a una profundidad de 0,5 cm; (d) sembrar en la placa, evitando no daar el medio y flameando el ansa antes de los cuadrantes segundo y tercero, para mejorar el aislamiento de colonias.

    Las placas se deben incubar en forma invertida a 35 0,5C durante 24 2 horas.

    Las colonias desarrolladas (ver tabla 5) pueden ser tpicas (rosas a rojo oscuras con un brillo metlico superficial), atpicas (rosas, rojas, blancas o incoloras sin brillo) a las 24 horas de incubacin o negativas (todas las dems). Tmese de cada placa una o ms colonias tpicas bien definidas o, si no existen, dos o ms, dentro de las que se consideran como probablemente formadas por microorganismos del grupo de los coliformes y se pasan a un

    tubo con agar en pico de flauta. Incubar los tubos a 35 0,5C durante 24 2 horas, s

    Estudiar microscpicamente colonias obtenidas con tincin de Gram.

    El resultado positivo de la prueba completa requiere la demostracin de bacilos gramnegativos no esporulados procedentes de los cultivos con agar, demostrando as, la presencia de un miembro del grupo de los coliformes.

    Tabla 5. Interpretacin de Resultados Siembra en EMB

    Microorganismos Tipo de colonias

    Escherichia coli Verdosas con brillo metlico y centro negro azulado

    Enterobacter, Klebsiella spp. Mucosas, rosadas, confluentes

    Proteus, Salmonella, Shigella Incoloras

    Candida spp. Incoloras o rosadas, secas, puntiformes

    Acinetobacter spp. Azul lavanda, pequeas a medianas.

    1 Placas preparadas color prpura anaranjado verdoso

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    Figura 3: Bao de Agua

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    Esquema 1. Esquema de Prueba Confirmatoria y Completa para la deteccin de coliformes totales y fecales (APHA, 1989).

    Sembrar los tubos de fermentacin con medio lquido lactosado. Incubarlos 48 3 horas a 35 0,5C

    Produccin de gas y acidez. Transferir a

    EC/CLVBB. Incubar 48 3 horas a 35 0,5C

    Ausencia de gas.

    Resultado negativo. Ausencia de grupo

    coliforme

    Presencia de esporas y bacilos Gram negativos. Ausencia de

    grupo coliforme.

    Presencia de bacilos Gram negativos,

    ausencia de esporas. Presencia de grupo coliforme

    Tincin de Gram.

    Produccin de gas.

    Confirma (1.a.1)

    ( Colonias de coliformes tpicas o atpicas.

    Transferir a agar nutritivo en pico de flauta y tubo de fermentacin con caldo lactosado. Incubar el primero 18 a 24

    horas y el segundo 48 3 horas a 35

    0,5C

    Produccin de gas. Transferir a placas con

    medio selectivo para Gram negativas.

    Incubar 24 2 horas a 35 0,5C

    Colonias

    negativas. Ausencia de grupo

    coliforme

    Ausencia de gas o acidez. Incubar

    durante otras 24 horas ms (total, 48 hs)

    Produccin de

    gas. Continuar en (1)

    Ausencia de gas o acidez. Resultado negativo. Ausencia de grupo coliforme

    Crecimiento cido.

    Confirmar (1)

    Ausencia de gas.

    Resultado negativo. Ausencia de grupo

    coliforme

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    Captulo 4: PRUEBAS BIOQUMICAS, DIFERENCIACIN DE BACTERIAS

    COLIFORMES

    Objetivos

    Conocer el fundamento de la realizacin de las diferentes pruebas bioqumicas.

    Identificar las bacterias coliformes presentes en aguas contaminadas.

    Introduccin

    Como la mayor parte de los seres vivos, las bacterias son capaces de modificar el ambiente que las rodea captando sustancias necesarias para su multiplicacin y liberando al medio productos de desecho, enzimas, exotoxinas, etc. Las interacciones que cada tipo bacteriano establece con el entorno son propias caractersticas. Esta especificidad depende del genotipo de la bacteria y se expresa en un determinado equipo enzimtico. Por ello, la caracterizacin de dichas enzimas es una til herramienta para la identificacin y clasificacin bacterianas.

    En ocasiones es necesario identificar a las bacterias que forman el grupo de coliformes fecales para establecer la naturaleza de la contaminacin. Para ello, se utilizan pruebas diferenciales, sabiendo que todas las cepas taxonmicamente asignadas al grupo de los coliformes

    *, no se

    ajustan necesariamente a la definicin de los mismos, pues a veces no fermentan la lactosa o, si lo hacen, pueden no producir gas. Adems, existen otras bacterias gramnegativas que, como los coliformes, fermentan la lactosa y producen brillo (por ejemplo Aeromonas spp.) y no todas las cepas de una especie reaccionan en el medio de manera uniforme. El significado de los distintos tipos de coliformes que existen en el agua ha sido y es objeto de amplios estudios. En conjunto, se considera a los coliformes como indicadores, ya que indican la existencia de heces humanas o animales. En las heces, se pueden encontrar todo tipo de coliformes. Aunque Escherichia coli se encuentra casi siempre en las contaminaciones recientes procedentes de animales de sangre caliente, tambin pueden hallarse otros coliformes en casos de contaminacin en los que aqul no existe. No todas las especies de enterobacterias muestran siempre las reacciones caractersticas de los microorganismos indicadores. Las pruebas IMViC (es decir, utilizacin de indol, rojo de metilo, Voges- Proskauer y el citrato) pueden bastar en algunos casos, aunque por lo general slo permiten una identificacin parcial, siendo necesario para una total identificacin, recurrir a pruebas bioqumicas adicionales (como la prueba de la oxidasa, motilidad, catalasa, entre otras). En la tabla 1 se presentan las pruebas bioqumicas usadas para identificar algunos de los gneros principales de enterobacterias. Los equipos comerciales de identificacin son alternativas tiles y econmicas a los tradicionales mtodos de identificacin, algunas de las cuales se citan a continuacin:

    Nombre del sistema Descripcin API Veinte microcpsulas en una tarjeta pueden proporcionar 21 resultados

    Enterotube Cilindro de plstico que contienen 12 compartimentos llenos de medio.

    Se inoculan secuencialmente todos los compartimentos con una sola

    aguja y se obtienen 15 resultados

    Inolex Enteric 1&2 Micromtodo con 10 unidades capilares en una tarjeta. Dos tarjetas

    distintas permiten obtener 20 resultados

    Microlab ID Micromtodo que permite 15 resultados en cuatro pasos.

    * Bacilos gramnegativos no esporulados que fermentan la lactosa, dando lugar a la formacin de gas en

    48 horas a 35C

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    Minitek Discos impregnados de reactivo, colocados mecnicamente en pequeos

    pocillos. 34 discos proporcionan 36 resultados

    Procedimiento

    El procedimiento para realizar la diferenciacin de enterobacterias, consiste en aislar la cepa en estudio, mantenindola en estado puro (aislamiento por estra en un medio de cultivo selectivo, como el Agar EMB), y posteriormente, sembrar en los diferentes medios. Cuando se toma una colonia de un cultivo primario en un medio selectivo, hay que tener presente que pueden existir clulas viables que no hayan formado colonias alrededor de la colonia de la que se hace la toma. Por ello es que se debe de tener especial atencin en que se extraiga el inculo del centro de una colonia bien separada. Luego del tiempo de incubacin,

    de 24 horas, a 35 0,5C, se debe realizar una prueba de Gram, para confirmar la presencia de bacilos gramnegativos no esporulados. El paso siguiente consiste en realizar la prueba de la Oxidasa. Si el resultado es positivo, aunque estemos en presencia de un bacilo gramnegativos y no esporulado, no se trata de una bacteria del grupo de los coliformes, sino que pueden ser Aeromonas, no consideradas como indicadoras de contaminacin fecal.

    Prueba de la Oxidasa

    Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. Los citocromos son protenas que forman parte de algunas protenas que forman parte de algunas cadenas transportadoras de electrones, propias del metabolismo respirador. Determinar la presencia o ausencia de estas protenas proporcionar informacin til para la clasificacin de grupos bacterianos. La prueba de la citocromo c oxidasa detecta la presencia de citocromo c en la bacteria. Se basa en la capacidad del colorante tetrametil-p-fenilendiamonio de oxidarse al ceder electrones al citocromo c. Este colorante es incoloro en estado reducido y puede oxidarse rpidamente en presencia del citocromo c, produciendo formas coloreadas (azul). Por lo general, el sistema citocromooxidasa slo se encuentra en los organismos aerobios, algunos anaerobios facultativos y, excepcionalmente, en algn microaerfilo (Vibrio fetus), pero los anaerobios estrictos carecen de actividad oxidasa. Asimismo, la presencia de oxidasa va ligada a la produccin de catalasa, ya que sta degrada el perxido de hidrgeno que se produce como consecuencia de la reduccin del oxgeno y cuya acumulacin es txica. Las bacterias coliformes, son oxidasa negativas. Para su aislamiento, los medios de cultivo que pueden utilizarse son el agar nutritivo o el agar de soja trptica, segn sea la tcnica a seguir. El reactivo de la oxidasa ms recomendado es la solucin acuosa al 1% de diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina (reactivo de Kovacs), recin preparada o refrigerada no ms de 1 semana. Esta solucin es menos txica y mucho ms sensible que el correspondiente compuesto dimetilo (reactivo de Gordon y McLeod: clorhidrato de dimetil -p- fenilendiamina), pero es ms caro.

    Procedimiento

    3. Mtodo en placa directa

    Agregar directamente 2-3 gotas de reactivo a algunas colonias desarrolladas en el agar de soja trptica (la ausencia de carbohidratos se debe a que en agar nutritivo los resultados son inconsistentes). No inundar toda la placa y no invertirla.

    Observar los cambios de color. Con el reactivo de Kovacs la reaccin se produce en unos 10-15 segundos, mientras que con el de Gordon y McLeod es dentro de los 10-30 minutos.

    Las colonias positivas desarrollan un color rosa, que vira progresivamente a marrn, rojo oscuro y, por ltimo, negro

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    4. Mtodo indirecto sobre papel

    Colocar un trozo de papel de filtro (Whatman N1 o equivalente) de 3x3 cm aproximadamente en una placa de Petri.

    Agregar 2-3 gotas del reactivo de Kovacs en el centro del papel.

    Extender con el ansa de siembra una colonia sobre el papel impregnado. El ansa debe ser de un material no reactivo, como el platino (los materiales reactivos como el hierro o el alambre, pueden producir resultados falsos). Tambin puede utilizarse una varilla de vidrio, o un aplicador de madera o plstico.

    La reaccin de color positiva se produce a los 5-10 segundos, desarrollndose un intenso color prpura.

    5. Discos embebidos

    Preparar en tubo de hemlisis una suspensin densa del microorganismo en estudio en 0.2 ml de agua destilada.

    Colocar un disco de oxidasa

    Dentro de los 30 segundos siguientes se producir un color rosado que se intensificar hacia el fucsia cuando la reaccin es positiva.

    Una reaccin lenta, pasando los 2 minutos, debe considerarse negativa.

    Interpretacin de los resultados

    Esta tcnica permite diferenciar el grupo Enterobacteriaceae (que carecen de citocromo c) del gnero Pseudomonas (que posee citocromo c). Otros resultados son: Vibrio spp. (+) y Aeromonas spp. (+)

    Prueba de la Catalasa

    En los ambientes acuosos que contienen oxgeno disuelto, como el citoplasma de las clulas, aparecen formas txicas derivadas del oxgeno. Las bacterias que viven en ambientes aerobios necesitan un equipo enzimtico capaz de neutralizar estas formas txicas. Entre estas enzimas se encuentra la catalasa que convierte el perxido de hidrgeno en agua y oxgeno molecular. La prueba de la catalasa es positiva cuando se ponen en contacto una bacteria con actividad catalasa con perxido de hidrgeno al 3% y se producen burbujas de oxgeno. El perxido de hidrgeno se forma como uno de los productos finales del metabolismo oxidativo aerbico de los hidratos de carbono. Si se deja acumular, el perxido de hidrgeno es letal para las clulas bacterianas. La catalasa transforma el perxido de hidrgeno en agua y oxgeno de acuerdo a la siguiente reaccin:

    H2O2 H2O + O2 (burbujas de gas)

    Procedimiento

    1. Prueba en portaobjetos

    Transferir, con ansa, clulas del centro de una colonia bien aislada (proveniente de un cultivo de 24 horas en un medio no selectivo y que no contenga sangre), a la superficie de un portaobjetos en el que se coloco una pequea gota de agua. Emulsionar bien.

    Aadir 1 o 2 gotas de perxido de hidrgeno al 3%. Se recomienda no aadir el organismo al reactivo, especialmente si se utilizan ansas que contengan hierro, ya que se pueden producir falsos positivos.

    2. Prueba en tubos o placas de agar

    Aadir unas gotas de perxido de hidrgeno al 3% directamente sobre la superficie de una placa o tubo de agar donde se ha desarrollado un cultivo puro del organismo en estudio.

    La rpida aparicin y produccin sostenida de burbujas de gas o efervescencia, indica una prueba positiva. Dado que algunas bacterias pueden poseer enzimas distintas de la catalasa,

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    capaces de descomponer el perxido de hidrgeno, unas pocas burbujas diminutas, formadas a los 20 a 30 segundos no se consideran una prueba positiva. Interpretacin de los resultados La prueba de catalasa, es comnmente para diferenciar el gnero Staphylococcus (catalasa positivo) del gnero Streptococcus (catalasa negativo).

    Prueba de Motilidad

    Las bacterias tienen movilidad por medio de sus flagelos que se encuentran principalmente en los bacilos aunque existen otras formas mviles. Agar Nutritivo semiblando (0,3- 0,5%) Extracto de buey .................................................. 3,0 g Peptona ................................................................ 10,0 g Cloruro de Sodio .................................................. 5,0 g Agar ...................................................................... 4,0 g Agua destilada ...................................................... 1000 ml pH 7,4 Nota: dividir en porciones de 8 ml que se colocan en tubos de ensayo para esterilizacin. Medio SIM

    (ver frmula en Prueba del indol)

    Procedimiento

    Inocular por puncin profunda (hasta 5 mm) con aguja. Incubar durante 1-2 das a 35C. Si el resultado es negativo, incubar durante otros 5 das a 22- 25C. Un crecimiento difuso a partir del punto de inoculacin se considera como resultado positivo (ver Fig. 1). Tambin es posible preparar el medio sin agar y examinar un cultivo joven utilizando la tcnica de la gota pendiente para microorganismos mviles (Fig. 4). Interpretacin de los resultados: Movilidad positivo: Escherichia coli Movilidad negativo: Klebsiella pneumoniae

    Prueba TSI (Triple Sugar Iron)

    El agar triple azcar hierro es un medio de cultivo diferencial que permite estudiar la capacidad de produccin de cido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un nico medio. Tambin permite la deteccin de la produccin de H2S. Es un medio til para la identificacin de enterobacterias. Medio TSI Extracto de carne....................... 3,0 g Extracto de levadura.................. 3,0 g Peptona..................................... 15,0 g Proteosa peptona....................... 5,0 g Lactosa...................................... 10,0 g Sacarosa..................................... 10,0 g Glucosa ..................................... 1,0 g Cloruro de sodio........................ 5,0 g Sulfato ferroso........................... 0,2 g Tiosulfato de sodio.................... 0,3 g Agar .......................................... 12,0 g

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    Rojo fenol.................................. 0,024 g Agua destilada ......................... 1000 ml Medio preparado color rojo. Procedimiento El agar se prepara en forma de pico de flauta. Esto determina que existan 2 cmaras de reaccin dentro del mismo tubo. La porcin inclinada (pico) expuesta en toda su superficie al oxgeno es aerobia y la porcin inferior (fondo) est protegida del aire y es relativamente anaerobia. Inocular los tubos de TSI con aguja (puncin en profundidad). Para eso introducir la punta hasta 3 a 5 mm del fondo del tubo. Tras retirar el alambre del fondo, estriar el pico (siembra en superficie) con un movimiento hacia uno y otro lado. Incubar a 35C durante 24 horas. Observar el crecimiento y reaccin en el pico de flauta, observar desarrollo reaccin en profundidad, produccin de gases (CO2 e H2) y produccin de SH2 Interpretacin de los resultados: (Fig. 2) - Fermentacin de la glucosa: viraje a color amarillo en el fondo del slant. Si la bacteria

    fermenta slo la glucosa, en la superficie del slant la utilizar por va respiratoria y, donde la tensin de oxgeno disminuya lo suficiente, emplear una pequea proporcin por va fermentativa. Esto generar una pequea cantidad de cidos que sern neutralizados por las aminas derivadas de la descarboxilacin oxidativa de las protenas (proceso que depende del oxgeno). Como resultado, el medio mantendr su color rojo en la superficie, al no haber cambio de pH. Por el contrario, las bacterias crecidas en la profundidad del slant emplearn desde el primer momento la glucosa por va fermentativa, generando cidos que no sern neutralizados, provocndose un descenso del pH y el color del medio en el fondo del tubo cambiar a amarillo. Ejemplo: Shigella spp.

    - Fermentacin de la lactosa: viraje a color amarillo en la superficie del slant. Si la bacteria fermenta la lactosa, los cidos producidos modifican el pH de la superficie del medio. En este caso las aminas no son capaces de neutralizar la cantidad de cidos producidos en esta fermentacin, ya que la lactosa se encuentra en el medio a mayor concentracin que la glucosa. Como consecuencia, el color del medio en la superficie cambiar a amarillo. Ejemplo: E.coli fermenta la glucosa, la sacarosa y la lactosa, sin produccin de H2S.

    - No- fermentacin de los azcares: el slant no cambia de color. Si la bacteria es aerobia estricta (no fermentadora), el medio permanecer de color rojo. En este caso, los azcares son respirados, degradndose completamente hasta CO2, que se elimina y no modifica el pH. Ejemplo: Pseudomona spp.

    - Produccin de gas en la fermentacin: aparicin de burbujas, rotura o elevacin del agar del fondo del tubo.

    - Produccin de cido sulfhdrico: Las cepas productoras de sulfhdrico se distinguen por la formacin de un precipitado negro de sulfuro de hidrgeno en el fondo del tubo, a partir del tiosulfato siempre que el medio se mantenga a un pH mayor a 7,2. Algunas bacterias respiradoras anoxibinticas son capaces de emplear el tiosulfato sdico como aceptor final de electrones en la cadena transportadora. Como consecuencia, este compuesto se reduce a cido sulfhdrico, que, a su vez, reacciona con el hierro (Fe

    2+) presente en el medio

    formando un precipitado negro de sulfuro de hierro. Los iones Fe2+

    proceden de los iones Fe

    3+ del citrato frrico y aparecen debido a los cambios en los potenciales redox producidos

    al someter al autoclave el medio de cultivo. Interpretacin de resultados: Cepas SH2 positivas: ennegrecimiento del medio a lo largo de la lnea de siembra. Proteus mirabilis. Cepas SH2 negativas: sin cambio de color (algunas bacterias productoras de melanina como M. Morganii, pueden dar un color parduzco), Escherichia coli.

    Interpretacin de los resultados

    Microorganismo

    Respuesta esperada

    Fondo Superficie SH2

    Enterobacter aerogenes Escherichia coli Proteus vulgaris

    AG AG AG

    A A A

    - - +

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    Shigella sonnei Salmonella typhimurium Salmonella enteritidis Pseudomonas aeruginosa

    A A AG K

    NC o K K K K

    - + + -

    AG: cido con gas (amarillo) A: cido K: alcalina

    Pruebas IMViC

    Prueba del Indol

    El indol es uno de los productos de degradacin metablica del aminocido triptofano. Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano con produccin de indol, cido pirvico y amonaco. La produccin de indol es una caracterstica importante para la identificacin de muchas especies de microorganismos. La enzima triptofanasa presentes en las bacterias degrada el aminocido triptfano a indol, que es el compuesto que se detecta en este ensayo. Si la bacteria posee la enzima triptofanasa, al aadir al medio el reactivo de Kovacs se producir un anillo de color rojo en la superficie del caldo (el indol reacciona con el grupo aldehdo del p-dimetilaminobenzaldehdo, este es el principio activo de los reactivos de Kovacs y Ehrlich) y la prueba ser considerada positiva. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptofano.

    Reactivo de Kovacs Alcohol amlico o isoamlico ...................... 75 ml p-metilaminobenzaldehdo .......................... 5,0 g HCl concentrado........................................... 5 ml El reactivo es color amarillo. Reactivo de Ehrlich Etanol absoluto............................................ 190 ml p-dimetilaminobenzaldehdo........................ 2,0 g HCl concentrado .......................................... 40 ml Medio SIM

    Triptena .............................................................. 20,0 g Peptona ................................................................. 6,1 g Sulfato de hierro y amonio ................................... 0,2 g Tiosulfato de sodio ............................................... 0,2 g Agar ...................................................................... 3,5 g Agua destilada ...................................................... 1000 ml El medio SIM preparado es semislido y de color mbar. En este medio de cultivo puede verse ya sea la movilidad, la produccin de sulfhdrico y de indol. Para ver la produccin de cido sulfhdrico, ver explicacin en TSI. Procedimiento 1. Con caldo triptofano: Inocular porciones de 5 ml de medio con un cultivo puro e incubar a

    35 0,5C durante 24 2 horas. 2. Con Medio SIM: sembrar por puncin profunda con aguja de inoculacin recta una cepa

    aislada e incubar a 35C durante 24 horas. 3. Aadir 0,2 - 0,3 ml del reactivo y agtese. Reposar 10 minutos y observar los resultados

    posteriores.

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    Existe reaccin positiva a la prueba del indol cuando aparece un color rojo oscuro en el alcohol amlico, si se mantiene el color original del reactivo, la prueba es negativa. Un color naranja indica probable presencia de escatol, un producto de la degradacin del indol (ver Fig.1). Interpretacin de los resultados Escherichia coli: + Klebsiella pneumoneae: - (mayora de las cepas)

    Prueba del Rojo de Metilo

    Una de las caractersticas taxonmicas que se utilizan para identificar los diferentes gneros de enterobacterias lo constituyen el tipo y la proporcin de productos de fermentacin que se originan por la fermentacin de la glucosa. Se conocen 2 tipos generales:

    La fermentacin cido-mixta, y

    La fermentacin del, 2,3 butanodiol. En la fermentacin cido-mixta se forman fundamentalmente cido lctico, actico y succnico, adems de etanol, H2 y CO2. En la va del butanodiol se forman cantidades menores de cido (acetato y succinato) y los principales productos son el butanodiol, etanol, H2 y CO2. La prueba del rojo de metilo mide el pH terminal, es decir, marca la produccin por las bacterias de cido a partir de la glucosa (fermentacin cido-mixta). Es un indicador de pH con un intervalo entre 6,0 (amarillo) y 4,4 (rojo). Las reacciones metablicas demostradas por la aparicin de gas y rojo de metilo, y la prueba de Voges- Proskauer estn relacionadas entre s y resultan tiles para diferenciar los miembros del grupo de los coliformes. El medio de cultivo utilizado es el caldo RM/VP ( o medio de Clark y Lubs).

    Caldo RM/VP Peptona.................................................................. 5,0 g Glucosa ................................................................. 5,0 g Fosfato de hidrgeno dipotsico (K2HPO4).......... 5,0 g Agua destilada....................................................... 1000 ml Dividir en porciones de 5 ml en tubos de ensayo y esterilizar. Asegurar que el tiempo total de exposicin al calor no supere los 30 minutos. El medio preparado es color mbar claro, transparente, sin precipitado. Solucin Indicadora Rojo de metilo........................................................ 0,1 g Etanol 95% ............................................................ 300 ml Agua destilada........................................................ 500 ml Procedimiento Inocular el caldo RMVP con un cultivo puro de no ms de 24 horas del microorganismo en estudio. Incubar a 35C durante 5 das. Finalizada la incubacin, agregar unas gotas de la solucin indicadora, Rojo de Metilo. En la mayora de los casos, basta con una incubacin de 48 horas, pero no deben hacerse incubaciones inferiores a este tiempo. Si los resultados de la prueba son equvocos a las 48 horas, repetir la misma con cultivos incubados durante 4-5 das. Comprobar los cultivos a los 2, 3, 4 y 5 das, ya que el resultado positivo puede aparecer antes del ltimo da. Los resultados positivos son aquellos que han producido aparicin de un color rojo, mientras que un color claramente amarillo constituye un resultado negativo. Los matices intermedios son resultados cuestionables, que indican posiblemente una purificacin incompleta del cultivo (ver Fig. 3). Interpretacin de los resultados La fermentacin cido-mixta la realizan las bacterias del grupo de E.coli y los productos finales son cidos orgnicos (cidos frmico, actico, lctico y succnico) que provocan un fuerte descenso del pH inicial del medio. Enterobacter aerogenes y Klebsiella pneumoniae son negativos (Fig. 2).

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    Prueba de Voges- Proskauer

    En la prueba de Voges-Proskauer se determina la va de fermentacin del butanodiol descripta en la prueba de rojo de metilo. El acetil-metil-carbinol (o acetona) es un producto intermediario en la produccin de butanodiol. En medio alcalino y en presencia de oxgeno la acetona es oxidada a diacetilo. Este se revela en presencia de alfa- naftol dando un color rojo- fucsia. Esta prueba detecta la acetona, producida metablicamente por determinadas bacterias coliformes en un medio de peptona glucosa. El medio utilizado es: el caldo RM/VP (o el medio de Clark y Lubs) y el reactivo es una solucin de naftol e hidrxido de potasio. Solucin de Naftol alfa-naftol purificado......................... 5 g alcohol etlico absoluto..................... 100 ml Esta solucin, conservada a 5-10C, se mantiene estable durante 2 semanas. Solucin de Hidrxido de Potasio KOH................................................. 40 g Agua destilada ................................. 100 ml Procedimiento Inocular el caldo RMVP con un cultivo puro de no ms de 24 horas del microorganismo en

    estudio. Incubar a 35 0,5C durante 48 horas. Luego de finalizado el tiempo de incubacin transferir 1 ml del caldo RM/VP a un tubo limpio y agregar 0,6 ml de solucin de naftol y 0,2 ml de la de KOH. El resultado positivo viene dado por la aparicin a los minutos de un color rosa a carmes (ver Fig. 4), lo que indica la presencia de diacetilo, producto de oxidacin de la acetona. No se debe leer despus de los 5 minutos. Se rechazarn los tubos en los que aparezca un color cobre. Interpretacin de los resultados La fermentacin butiln gliclica la realizan las bacterias del grupo Klebsiella-Enterobacter (antiguo aergenes). Escherichia coli es negativo.

    Prueba del Citrato de Sodio

    Esta prueba sirve para determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como nica fuente de carbono y energa. El medio utilizado contiene citrato como nica fuente de carbono, fosfato de amonio como nica fuente de fosfato en su metabolismo y azul de bromotimol, como indicador de pH. nicamente las bacterias capaces de metabolizar el citrato podrn multiplicarse en este medio y, al hacerlo, liberarn iones amonio. Esta liberacin de iones bsicos, junto con la eliminacin del citrato (cido) generar la fuerte basificacin del medio que ser aparente por un cambio de color del indicador de pH, de verde a azul. Este aumento de pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol (agar citrato de Simmons) que vira al alcalino a pH 7,6.

    Se cultiva el microorganismo en caldo citrato de Koser o en agar citrato de Simmons. Estos medio contienen citrato de sodio como nica fuente de carbono. Caldo citrato de Koser

    Fosfato de hidrgeno amonio sodio (NaNH4HPO4 . H2O)............. 1,5 g Fosfato de hidrgeno dipotsico .................................................... 1,0 g Sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4. 7H2O) .................... 0,2 g Citrato de sodio dihidratado (en cristales)........................................ 3,0 g

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    Agua destilada ................................................................................. 1000 ml El medio preparado es incoloro, transparente y sin precipitaciones.

    Agar Citrato de Simmons

    Fosfato de hidrgeno amonio (NH4H2PO4 . H2O)......................... 1,0 g Fosfato de hidrgeno dipotsico ................................................... 1,0 g Cloruro de sodio.............................................................................. 5,0 g Citrato de sodio dihidratado............................................................ 2,0 g Sulfato de magnesio heptahidratado .............................................. 0,2 g Agar................................................................................................. 15,0 g Azul de bromotimol........................................................................ 0,08 g Agua destilada c.s.p........................................................................ 1000 ml El medio preparado es color verde.

    Procedimiento

    1) Si se utiliza Caldo Citrato Koser: inocular ligeramente el medio lquido con una aguja

    recta, nunca con una pipeta. Incubar a 35 0,5C durante 72- 96 horas, registrndose como resultado positivo un crecimiento variable y como negativo la ausencia de crecimiento (ver Fig. 5).

    2) Si se utiliza el Agar Citrato de Simmons: inocular el agar inclinado en una sola estra en el pico. Utilizar un cultivo de 24 horas en un medio slido y cuidando no arrastrar medio de cultivo, ya que se pueden producir falsos positivos por crecimiento a partir del medio de cultivo

    del inculo. Incubar a 35 0,5C durante 48 horas. La reaccin positiva viene dada por la aparicin de un crecimiento a lo largo de la estra, acompaado o no de un viraje del indicador al azul; el resultado negativo consiste en la ausencia de crecimiento manteniendo el color verde del medio (ver Fig. 6). Interpretacin de los resultados Entre las enterobacterias estas caractersticas se dan en los siguientes gneros: Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Citrobacter y algunas especies de Salmonella. Sin embargo, Escherichia, Shigella, Salmonella typhi y Salmonella paratyphi son incapaces de crecer con esos nutrientes.

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    Fig. 1: Medio SIM: Pruebas de produccin de sulfhdrico, Indol y Motilidad

    Fig. 2: Medio TSI: Pruebas de fermentacin de azcares (glucosa, lactosa y sacarosa),

    produccin de gas y sulfhdrico.

    Fig. 3: Prueba de Rojo de Metilo

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    Fig. 4: Prueba Voges-Poskauer

    Fig. 5 y 6 : Prueba de Citrato, realizada con Caldo Citrato Koser y Agar Citrato Simons,

    respectivamente, y sus reacciones positivas.

    Tabla 1: Pruebas bioqumicas usadas para la identificar algunos de los gneros principales de enterobacterias

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    Prueba o Sustrato

    Escherichia

    Salm

    onella

    Shig

    ella

    Kle

    bsie

    lla

    Ente

    robcte

    r

    Serr

    ant

    a

    Pro

    teus

    Yers

    inia

    Rojo Metilo + + + + o - - - + +

    Voges-Proskauer - - - + o - + + o - + o - -

    Citrato - + - + o - + + + o - -

    Beta- lactosidasa + + o - + o - + + + - +

    Motilidad + o - + - - + + + -

    Indol + - - - - - + o - + o -

    CNK (crecimiento en) - + o - - + + + + -

    SH2 (sobre TSI) - + - - - - + o - + o -

    Hidrlisis de la urea - - - + - - + + o -

    Fenilalanina desaminasa - - - - - - + -

    Lactosa + + o - + o - + o - + - - -

    Sorbitol + + + o - + + + - + o -

    Sacarosa + o - - + o - + + + + o - + o -

    Arabinosa + + + o - + + - - +

    Gas de la glucosa + + - + + + + o - -

    + o indica que ocurre una variacin entre las especies, pero que la mayora son positivas.

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    Captulo 5: ANTIMICROBIANOS

    Objetivos

    Verificar el grado de sensibilidad o la resistencia de los microorganismos frente a

    distintos agentes antimicrobianos.

    Reflexionar acerca de los riesgos que implica la posible dispersin de la resistencia

    a los antimicrobianos en el ambiente.

    Introduccin

    Es un hecho ampliamente documentado que la aparicin de resistencia a antibiticos se debe

    primariamente a su uso excesivo y frecuentemente innecesario en humanos y animales. Los

    factores de riesgo para la dispersin de la resistencia tanto en centros de salud como en la

    comunidad en general incluyen sobrepoblacin, falta de higiene y prcticas deficientes en el

    control de las infecciones (Rao, 1998).

    La resistencia a frmacos por parte de los microorganismos ha sido extensamente estudiada

    no slo desde el punto de vista clnico sino desde el punto de vista de la gentica molecular. Se

    sabe que la informacin relacionada con tal resistencia esta frecuentemente codificada en

    genes que son portados en plsmidos. Los plsmidos son molculas circulares de ADN

    extracromosmico, que se pueden replicar en forma independiente del cromo soma bacteriano

    y que son transmisibles