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Manual do estágio de RMA

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A reprodução é, sem dúvida, uma das mais importantes funções do Ser Humano.

É esta capacidade que permite a evolução da espécie humana, integrando-a nas mais

variadas formas de sociedade, através da transmissão do material genético aliado ao processo de

Selecção Natural, contribuindo para o seu desenvolvimento e aperfeiçoamento ao longo dos

séculos.

Sem a capacidade de procriar perdemos o nosso vigor, a capacidade de nos substituirmos.

Deixamos de existir como espécie, conforme ocorreu com muitas outras espécies animais

anteriores.

Actualmente, tem-se vindo a assistir a uma diminuição da capacidade de procriar em

consequência dos hábitos errados que a actual sociedade nos impõe, de que são exemplo os

relacionados com a alimentação, stress, sedentarismo, poluição e consumo de substâncias

tóxicas, os quais interferem no ser humano, alterando algo tão intrínseco e pessoal como a sua

capacidade reprodutiva.

No sentido de contribuir para um aumento da fertilidade humana, é necessária a

cooperação de profissionais competentes numa nova área do saber médico, designada de

Reprodução Medicamente Assistida. Esta área do conhecimento imbrica com conhecimentos

integrados noutras especialidades médicas já existentes como a ginecologia, a andrologia, a

patologia clínica, a genética e a psiquiatria, entre outras.

A Reprodução Medicamente Assistida veio contribuir para o reforço da solidariedade

interpessoal, ao permitir que, aqueles que por variadíssimos motivos, não têm capacidade de se

reproduzir, tenham a possibilidade de desempenhar a função primordial do ser humano, a

reprodução.

Para que os estudantes de medicina possam desde já sentir-se incentivados e motivados

para este ramo do saber, importa que tomem conhecimento com esta matéria, o mais

precocemente possível.

A possibilidade de contactar no decorrer do seus estudos com centros nacionais de

referência na Área da Reprodução Medicamente Assistida, através da realização de Estágios de

duas semanas, nas vertentes clínica e laboratorial é possível graças à intervenção do

Departamento de Saúde Reprodutiva e SIDA da Associação Nacional de Estudantes de

Medicina que obteve a anuência desses Centros, que se disponibilizam a acompanhar os

estudantes interessados em realizar este estágio.

Este Estágio pretende contribuir para a abertura de novos horizontes aos estudantes de

Medicina, através da possibilidade de intercâmbio entre as Escolas Médicas, com o objectivo de

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reforçar a investigação, a pesquisa, a curiosidade, o querer saber mais, e não sermos apenas

reprodutores do conhecimento já descoberto, numa forma de selecção anacrónica que coarcta a

evolução científica.

Para que os estudantes interessados possam obter o máximo rendimento durante este

estágio, criámos o Manual do Estágio de RMA, que compila a informação prestada por

especialistas de reconhecido mérito na matéria, integrando textos nas áreas clínicas e

laboratoriais da genética médica, embriologia, ginecologia, andrologia, patologia clínica, como

complemento para os alunos aprofundarem a sua pesquisa.

Espero que todos os que venham a consultar este Manual, obtenham dele o contributo

para o incremento dos seus conhecimentos nesta área, inserindo-os na sociedade actual, tão

carenciada de massa crítica.

Mariana Pinto da Costa

Coordenadora Nacional do Departamento de Saúde Reprodutiva e SIDA

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Área Laboratorial 7

Área da Genética 49

Sistema Reprodutor Feminino 78

Sistema Reprodutor Masculino 163

Agradecimentos 171

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MEDICINA DA REPRODUÇÃO LABORATORIAL. MANUAL DO INTERNATO MÉDICO

Rosália Sá1, Alberto Barros3, Mário Sousa2

1Bióloga, Aluna de Doutoramento, Lab Biologia Celular, ICBAS-UP;

2MD, PhD, Prof. Catedrático; Director de Serviço, Especialista em Medicina da Reprodução, Especialista em Genética Médica, Serviço de Genética, Faculdade de Medicina do Porto e Centro de Genética da Reprodução Prof. Alberto Barros, Porto;

3MD, PhD, Prof. Catedrático, Director de Serviço, Especialista em Medicina da Reprodução Laboratorial pelo Hospital Americano de Paris, França, Especialista em Genética da Reprodução pela Faculdade de Medicina do Porto, Lab Biologia Celular, ICBAS-UP

Trabalho financiado pela FCT (SFRH/BD/23616/2005; POCTI/SAU-MMO/60709/04, 60555/04,

59997/04, UMIB).

Correspondência:

Mário Sousa

Laboratório de Biologia Celular

Instituto de Ciências Biomédicas de Abel Salazar (ICBAS)

Universidade do Porto (UP)

Lg Prof Abel Salazar 2, 4099-003 Porto, Portugal

T: 00-351-22-206.22.17; F: 00-351-22-206.22.32

M: [email protected]

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TÉCNICAS DE REPRODUÇÃO MEDICAMENTE ASSISTIDA

INDUÇÃO DA OVULAÇÃO (OI)

-Indicações femininas. Disfunção ligeira da ovulação. Exige trompas e endométrio normais,

teste de Hunner normal e espermograma normal.

-Indução. Assegura o crescimento folicular e a ovulação, com suplemento hormonal por via oral

ou injectável. O crescimento folicular deve ser monitorizado por ecografias sequenciadas e a

ovulação pode ser artificialmente induzida com hCG, a que se devem seguir relações sexuais

durante 3 dias consecutivos.

-Taxa de gravidez. 6% (igual à taxa de reprodução natural dos casais férteis).

-Frequência. 1x por mês, 3x consecutivas (!35 anos de idade) ou 1x por mês, 6x consecutivas

(<35 anos de idade).

INSEMINAÇÃO INTRA-UTERINA (IUI)

-Origem. Em Portugal por Alberto Barros (1985).

-Indicações femininas. Perturbações psicológicas (vaginismo), muco cervical incompetente,

disfunção ovulatória ligeira. Exige trompas e endométrio normais, e sémen com qualidade.

-Indicações masculinas. Perturbações psicológicas. Na azoospermia, em que o testículo não

produz espermatozóides nem células precursoras (espermatídeos), a IIU pode ser efectuada com

recurso a doação de espermatozóides.

-Indução do crescimento folicular (estimulação controlada do ovário). Indução ligeira do

crescimento folicular com hormonas por via oral ou por administração subcutânea da hormona

rFSH em baixas doses. O crescimento folicular é monitorizado por análises sanguíneas (estradiol)

e ecografias sequenciadas. Geralmente demora 1-2 semanas. Há boa resposta quando 1-3

folículos atingem 17 mm. Riscos. Síndrome da hiperestimulação do ovário (muito raro). Indução

da maturação ovocitária e da ovulação.

Administração da hormona hCG ou rLH (injecção única intramuscular) quando os folículos

atingem 17 mm.

-Colheita dos espermatozóides. Colheita por masturbação, a que se segue a lavagem e

purificação dos espermatozóides fecundantes. Se o homem não conseguir masturbar-se por

motivos psicológicos, a companheira pode ajudá-lo. Se falhar, deve ser dado um sedativo suave.

Se a situação não se resolver, pode tentar em casa, desde que o transporte seja efectuado em

menos de 30 minutos (com o receptáculo contendo o sémen à temperatura de 37ºC: por exemplo,

junto ao corpo, envolvido em toalha aquecida). Em alternativa, dá-se um preservativo especial

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(não tóxico para os espermatozóides) e o casal tem relações sexuais em casa, sendo o

preservativo colocado no contentor estéril e transportado para o centro nas mesmas condições

acima descritas. Se tudo falhar, cancela-se o ciclo de IIU e passa-se para microinjecção (ICSI),

com obtenção dos espermatozóides por punção aspirativa do epidídimo (MESA) ou do testículo

(TESA), sob anestesia troncular.

-Preparação dos espermatozóides. O sémen é colocado numa estufa humidificada a 37ºC,

durante 30 minutos, para o liquefazer (simulação da função vaginal). É depois purificado através

de gradientes, por centrifugação, durante 30 minutos, para remover micro-organismos, leucócitos,

células germinais imaturas e espermatozóides anómalos. Esta etapa corresponde à acção natural

do muco cervical. De seguida, os espermatozóides purificados são recobertos por um meio de

cultura especial, sendo incubados a 37ºC. Ao fim de 1h, recolhem-se os espermatozóides que

migraram activamente até à superfície (fracção swim-up), que são os com melhor morfologia e

mobilidade. Esta etapa corresponde à acção natural das secreções uterinas e das trompas de

Falópio. A fracção swim-up é então colocada num cateter muito fino, mole e não-tóxico, num

volume de 0,1-0,2 mL, contendo 500.000-1 milhão de espermatozóides hiperactivados. No caso

de sémen de dador, descongela-se a amostra e processa-se como acima descrito.

-Inseminação intra-uterina. Os espermatozóides purificados são largados na cavidade uterina

(acima do colo uterino) até 36h após a indução da ovulação, sob controle ecográfico. Período de

repouso após a IIU. 30 minutos deitada. Cuidados após a IIU. Durante duas semanas evitar

relações sexuais, desportos, o trabalho de pé durante horas seguidas e as viagens prolongadas.

Aumentar as horas de repouso diárias, sentada ou deitada. Alimentação equilibrada de 3/3 horas,

com 1,5L de água por dia. Medicação após a IIU. Antibiótico profilático, ácido fólico (protecção

contra defeitos do sistema nervoso do feto).

-Detecção da implantação. Doseamento sanguíneo da hormona "hCG no sangue ao 12-14º dia

após IIU (positiva se !20 U). Detecção de gravidez clínica. Ecografia que avalia a presença de

placenta, líquido amniótico e embrião pós-implantação com batimentos cardíacos à 5-7ª semana

da gravidez.

-Taxa de gravidez da IIU. 14%. Taxa de gravidez gemelar da IIU. Deve ser nula. Para isso, só

se deve efectuar se houver um máximo de 3 folículos dominantes (antes da hCG), com

confirmação desse número após a hCG e imediatamente antes da IIU.

-Frequência das IIU. 1x por mês, 3x consecutivas (!35 anos de idade) ou 1x por mês, 6x

consecutivas (<35 anos de idade).

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FECUNDAÇÃO IN VITRO (IVF)

-Origem. Inglaterra (1978, Patrick Steptoe, Robert Edwards), França (1982, Jacques Testart,

René Frydman), Portugal (1986, Pereira Coelho, HSMaria).

-Indicações Femininas. Disfunção ovulatória moderada a severa; Obstrução tubar; Falhas de

gravidez após ciclos de IIU.

Indicações Masculinas. Défice ligeiro da qualidade do sémen.

-Indução do crescimento folicular (hiperestimulação controlada do ovário). Indução do

crescimento folicular com a administração subcutânea das hormonas antagonista/agonista

hipotalâmico e rFSH. O crescimento folicular é monotorizado por análises sanguíneas (estradiol)

e ecografias, cujos resultados também permitem ajustar as doses dos medicamentos. Geralmente

demora 1-2 semanas. Há boa resposta quando vários folículos (3-8 por ovário) atingem 17 mm.

Riscos. Síndrome de hiperestimulação do ovário (<5%). Pode ser prevenido com a vigilância

acima descrita. A maioria (>95%) não necessita de internamento hospitalar. Indução da

maturação ovocitária. Administração da hormona hCG ou rLH (injecção única intramuscular)

quando os folículos atingem 17 mm. Sob a sua acção, ocorre a maturação genética dos ovócitos

e o crescimento final dos folículos até 20-30 mm de diâmetro.

-Aspiração dos folículos ováricos (dia 0). Por ecografia endovaginal, até 36h após a hCG.

Efectua-se sob ligeira sedação endovenosa por anestesista. É uma técnica indolor que demora

cerca de 5 minutos por ovário.

-Progesterona intravaginal (dia 0). A progesterona (comprimidos vaginais) prepara o

endométrio para a implantação e é necessária porque a aspiração dos ovários remove a teca

folicular. Na altura da transferência embrionária, o endométrio deve ter uma espessura de 10-12

mm (8-14 mm) e um aspecto trilamelar na ecografia. Os comprimidos vaginais aplicam-se de 8/8h

até à 12ª semana de gravidez. Deve ser interrompida se surgir menstruação ou se o doseamento

hormonal da implantação for negativo.

-Colheita e preparação dos espermatozóides (dia 0). Como IIU. Se a colheita falhar, em vez de

IVF efectua-se microinjecção (ICSI), com obtenção dos espermatozóides por MESA ou TESA.

-Técnica laboratorial da FIV (dia 0). Numa placa de cultura, colocam-se os folículos e

espermatozóides (fracção swim-up) numa concentração de 50.000 por folículo ou por mL. A

fecundação e o desenvolvimento embrionário ocorrem in vitro numa incubadora.

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-Taxas médias de maturidade ovocitária, de fertilização e de desenvolvimento

embrionário

As taxas médias de maturidade ovocitária, de fertilização e de desenvolvimento embrionário

pré-implantação são dependentes de factores aleatórios de índole individual (qualidade

genética e estrutural dos ovócitos e dos espermatozóides) e de espécie (70-80% dos embriões

humanos desenvolvem anomalias genéticas) e não das técnicas de RMA.

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Taxa de maturidade ovocitária:

80% dos ovócitos aspirados devem ser MII. Nos casos com um número significativo de

ovócitos imaturos, estes podem ser amadurecidos in-vitro (60-80% de sucesso).

GV: profase I (imaturo) MI: metafase I: imaturo MII: metafase II (maduro)

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Taxas de desenvolvimento embrionário:

Dia 1: Fecundação (12-18 h após a inseminação dos folículos ováricos): embrião de 1 célula,

estádio de dois pronúcleos ou zigoto: 70%.

Dia 2: Embriões AB com 2-5 blastómeros: 60%.

Dia 3: Embriões AB com 6-12 blastómeros: 50%.

Dia 4: Embriões AB na fase de mórula: 40%.

Dia 5: Embriões AB na fase de blastocisto: 30%.

Dia 6: Embriões AB na fase de blastocisto eclodido: 20%.

2 b: 24 h 4 b: 24 h 8 b: 48 h

12 b: 48 h 64 b/Mórula: 4º dia Blastocisto inicial: 5º dia

Eclosão: 6º dia

Zona pelúcida

vazia

Cavidade

blastocélica

Trofoblasto:

Implantação

Placenta

Massa Celular Interna

ou Epiblasto:

Feto

2 b: 24 h 4 b: 24 h 8 b: 48 h

12 b: 48 h 64 b/Mórula: 4º dia Blastocisto inicial: 5º dia

Eclosão: 6º dia

Zona pelúcida

vazia

Cavidade

blastocélica

Trofoblasto:

Implantação

Placenta

Massa Celular Interna

ou Epiblasto:

Feto

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Qualidade embrionária

Embriões de dia 2-4

Grau A: embriões com blastómeros de diâmetro similar e 0% de fragmentos.

Grau B: embriões com <25% de fragmentos.

Grau C: embriões com 25-50% de fragmentos. Só se devem transferir embriões C na ausência

de embriões A/B e desde que o casal assim o peça e sob consentimento, porque contêm uma

maior percentagem (93%) de anomalias genéticas. Não devem ser criopreservados.

Grau D: embriões com >50% de fragmentos. Não devem ser transferidos, porque possuem

(100%) anomalias genéticas. Não devem ser criopreservados.

Embriões de dia 5-6

Grau A: massa celular interna atinge pelo menos 2/3 do raio com ausência de células

degenerativas; presença de trofoblasto contínuo e fino sem células degenerativas; presença de

zona pelúcida fina.

Grau B: massa celular interna 1/3-2/3 do raio com ausência de células degenerativas; presença

de trofoblasto contínuo e fino sem células degenerativas; presença de zona pelúcida fina.

Grau C: massa celular interna 1/3-2/3 do raio e/ou presença de algumas células degenerativas;

trofoblasto mal diferenciado (descontínuo, ou espesso ou com algumas células degenerativas);

zona pelúcida espessa.

Grau D: massa celular interna <1/3 do raio; presença de múltiplas células degenerativas;

trofoblasto mal diferenciado (descontínuo, ou espesso ou com múltiplas células degenerativas);

zona pelúcida espessa.

fragmento

s

Grau A Grau B Grau C Grau D

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Dia da transferência dos embriões

Deve-se transferir o mais tarde possível, de modo a que os embriões escolhidos sejam os de

maior potencial de desenvolvimento. De um modo geral, sempre que existam mais embriões

do que aqueles que serão transferidos, deve-se ir prolongando a cultura. Vantagens da

transferência tardia: estudo da viabilidade embrionária; menor nº de embriões a transferir;

maior taxa de gravidez; menor taxa de gravidez gemelar; maior resistência e sucesso na

criopreservação dos embrões.

Número de embriões a transferir

Dia 1: 3-4 se <35 anos, 4-5 se !35 anos ou se já efectuou 2 ciclos sem gravidez.

Dia 2: 2-3 se <35 anos, 3-4 se !35 anos ou se já efectuou 2 ciclos sem gravidez.

Dia 3/4: 2 se <35 anos, 3 se !35 anos ou se já efectuou 2 ciclos sem gravidez.

Dia 5/6: 1 se <35 anos, 2 se !35 anos ou se já efectuou 2 ciclos sem gravidez.

Taxas de gravidez de termo

Havendo embriões de classe A/B com o número de células indicado acima em relação ao dia

respectivo, e desde que se transfiram pelo menos dois, as taxas de gravidez de termo são

independentes da patologia ou da idade:

Dia 1: 6%.

Dia 2: 19%.

Dia 3: 27%.

Dia 4: 35%.

Dia 5/6: 46%.

Taxas de gravidez gemelar. 20-25%. Pode ser nula se só se efectuar transferência de 1

embrião.

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-Transferência de embriões. Os embriões são transferidos para a cavidade uterina

(transferência intra-uterina) num catéter, sob controlo ecográfico. É um processo indolor que

demora cerca de 5 minutos. Os embriões são libertados 1 cm abaixo do fundo uterino, à saída

das trompas. Após a transferência, o catéter é avaliado no laboratório para confirmar que os

embriões foram correctamente depositados na cavidade uterina. Nos casos em que não se

consegue introduzir o catéter no colo uterino e nos casos em que os embriões não implantam

por anomalia molecular dos receptores do endométrio, pode efectuar-se a introdução dos

embriões directamente no endométrio (transferência trans-endometrial). Neste caso, a taxa

de gravidez é menor devido à reacção inflamatória da picada. Trata-se de um procedimento

indolor e sem complicações, efectuando-se sob controlo ecográfico.

No tratamento, a transferência de embriões é o passo mais crítico em relação às taxas de

gravidez, logo a seguir à qualidade e ao número dos embriões transferidos.

A transferência de embriões não corresponde à implantação. A implantação embrionária é um

processo natural que ocorre ao 8º dia do desenvolvimento embrionário pré-implantação. Ou

seja, se a mulher efectuar a transferência embrionária ao 3º dia, os embriões permanecem na

cavidade uterina a desenvolverem-se até ao 8º dia, altura em que, eventualmente, adquirem a

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capacidade de penetrarem para dentro do endométrio. Após a implantação, entre o 8-10 dia, o

sistema imunológico da mulher vai rejeitar o embrião, que se comporta como corpo estranho.

Neste período, o trofoblasto tem de se revestir com a molécula HLA-G para induzir a tolerância

dos linfócitos.

Período de repouso após a transferência dos embriões. 30-60 minutos deitada.

Cuidados após a transferência de embriões. Após a transferência de embriões, a mulher

não necessita de permanecer deitada nem de ficar em casa em repouso. Apesar de estarem

na cavidade uterina, os embriões não caiem para o exterior porque a cavidade uterina é virtual,

ou seja, as paredes tocam-se e não deixam sair os embriões. No entanto, como se trata de um

tratamento numa situação de dificuldade em conceber, os cuidados são geralmente

aumentados, ficando a mulher 15-60 minutos em repouso após a transferência dos embriões, e

aconselhando-se repouso em casa durante 1 semana. Deve aumentar as horas de repouso

diárias, sentada ou deitada; alimentação equilibrada de 3/3 horas, com 1,5L água/dia;

abstenção de viagens prolongadas, de desportos basculantes (hipismo, motociclismo, ciclismo,

saltos), de relações sexuais e de trabalho de pé prolongado.

Medicação após a transferência dos embriões. Antibiótico profilático, ácido fólico (protecção

contra defeitos do sistema nervoso do feto). Nos casos de mulheres com presença de

autoanticorpos ou de defeitos da coagulação deve-se medicar com ácido

acetilsalicílico/corticóide em baixas doses, efectuar infusão de imunoglobulinas e/ou

administrar heparina.

-Detecção da Gravidez.

Gravidez Bioquímica (implantação). Doseamento sanguíneo da hormona "hCG no sangue ao

12-14º dia após a transferência dos embriões (positiva se !20 U). Esta hormona é segregada pelo

trofoblasto (células responsáveis pela implantação, secreção da "hCG e formação da placenta) e

não pelo epiblasto (células que originam o feto), pelo que, em certos casos (10%), o teste pode

ser falsamente positivo, ou seja, ter ocorrido implantação de um embrião sem capacidade de

originar um feto (gravidez anembriónica).

Gravidez Clínica. Ecografia que avalia a presença de placenta, líquido amniótico e feto com

batimentos cardíacos à 5-7ª semana da gravidez. Na espécie humana, existe uma taxa elevada

de abortamentos espontâneos do primeiro trimestre (14-19%; expulsão espontânea de embriões

com anomalias genéticas ou por defeitos da placenta), pelo que apenas após as 12 semanas

(gravidez evolutiva) é que a gravidez é mais segura.

Page 20: Manual do estágio de RMA

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-Frequência dos ciclos de tratamento. De 3/3, 4/4 ou de 6/6 meses, para repousar os ovários.

Não deve ser superior a 6 meses, uma vez que a estimulação ovárica cíclica aumenta as taxas de

gravidez.

-Criopreservação de embriões. Origem. Em Portugal (criopreservação automática lenta, Alberto

Barros, 1992; vitrificação, Mário Sousa, 2004). Indicações. Embriões excedentários dos ciclos de

tratamento. Tipo de embriões passíveis de criopreservação. Só embriões de classe A/B. A

criopreservação de embriões excedentários é muito útil para os casais, porque evita uma nova

estimulação ovárica da paciente, o que diminui os riscos para a sua saúde e alivia os encargos

financeiros da RMA por não necessitar de um novo ciclo de estimulação ovárica. Por geralmente

se efectuar uma estimulação suave do ovário, com uma média de 6-8 ovócitos maduros por ciclo

de tratamento, quer por se efectuar cultura prolongada de embriões até à fase de blastocisto

sempre que tal é possível, a maioria dos casais não tem embriões excedentários para

criopreservação. Os embriões excedentários podem não ser criopreservados nos casos em que o

casal não deseja a criopreservação ou não deseja outro bebé. A criopreservação de embriões é

pouco frequente em Portugal e os embriões criopreservados são na sua maioria reutilizados pelos

casais. Entre 1997-2003, de 3.000 ciclos só 196 (7%) efectuaram criopreservação de embriões

(382 embriões). Em 63% dos ciclos de criopreservação, 57% dos embriões foram descongelados

e reutilizados após 6 meses, e os embriões restantes foram utilizados pelos casais 3 anos após a

gravidez alcançada.

Transferência de embriões criopreservados. Os embriões excedentários criopreservados

destinam-se a ser transferidos para o útero da paciente nos 6 meses seguintes em caso de falha

de gravidez, ou nos 3 anos seguintes após o nascimento da criança no caso de o casal ter

alcançado a gravidez na tentativa. Taxa de sobrevida na descongelação. Aumenta na medida

da evolução embrionária. Na fase de blastocisto, a sobrevida é de 80%. Taxas de gravidez. As

taxas de gravidez com embriões que sobrevivem ao processo de criopreservação-descongelação

são iguais às obtidas com embriões frescos. Progesterona intravaginal. Início 5 dias antes da

transferência dos embriões. Transferência de embriões. No dia seguinte ao da descongelação.

Número e qualidade de embriões a transferir, Período de repouso, Cuidados e Medicação

após transferência dos embriões, Detecção de gravidez. Como descrito para embriões

frescos.

MICROINJECÇÃO (ICSI)

-Origem. Bélgica (Palermo, 1991). Optimização e generalização da técnica (França, Mário Sousa,

1993). Portugal (Alberto Barros, 1994).

-Indicações Masculinas. Alteração moderada ou severa do sémen; Azoospermia; Anejaculação;

Ejaculação retrógrada; Doentes seropositivos; Diagnóstico Genético Pré-Implantação (PGD).

Page 21: Manual do estágio de RMA

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Estudos obrigatórios masculinos. Se o paciente apresentar oligozoospermia severa, a amostra

restante após a ICSI deve ser criopreservada. Antes dos tratamentos, e na presença de

anomalias dos espermatozóides, devem ser efectuados os seguintes exames de diagnóstico: (a)

Cariótipo. Nas anomalias, deve ser efectuado PGD para apenas se transferirem embriões

euplóides. (b) Nos casos de astenozoospermia total deve ser pedido o estudo do sémen por

microscopia electrónica. Nestes casos, a ICSI deve ser efectuada com espermatozóides

testiculares obtidos por biópsia testicular (TESE). Se mesmo assim os espermatozóides forem

imóveis, antes da microinjecção cada espermatozóide deve ser colocado 10 minutos em meio

hipo-osmótico, devendo-se apenas microinjectar os espermatozóides reactivos. (c) Nos casos

com morfologia normal inferior a 10%, devem ser pedidos os seguintes estudos no sémen:

imaturidade da cromatina (azul de anilina: detecta défice de substituição das histonas pelas

protaminas), fragmentação da cromatina (túnel: detecta digestão endógena por endonucleases

que fragmentam o DNA nos espaços internucleossómicos) e estudo molecular das aneuploidias

(FISH: detecta aneuploidias). No caso de positividade, deve ser efectuado ICSI com

espermatozóides testiculares, com PGD se também houver aumento das taxas de aneuploidias

nos espermatozóides. (d) Na oligozoospermia severa (#5x106/ml) e na azoospermia secretora

devem ser pedidos no sangue venoso periférico o estudo molecular do cromossoma Y para a

região AZF e, se este for normal, o estudo molecular do cromossoma Y para a região DAZ. Na

presença de microdelecções, o casal pode solicitar PGD para selecção de embriões do sexo

feminino de modo a evitar a transmissão da mutação paterna. (e) Nos casos com aumento da

viscosidade do sémen, diminuição do volume do sémen com pH ácido, alterações das vesículas

seminais, ou ausência congénita dos canais deferentes, desde que na ausência de anomalias

congénitas reno-uretero-vesicais, deve ser pedido o estudo completo do gene CFTR. Se positivo,

a mulher deve também efectuar o mesmo estudo. Se os dois forem positivos, deve-se efectuar

PGD para evitar a transmissão da fibrose cística. No caso de positividade apenas paterna, o casal

pode solicitar PGD para selecção de embriões do sexo feminino de modo a evitar a transmissão

da mutação paterna. (f) Na oligozoospermia moderada a severa (<10x106/ml) deve ser pedido o

estudo do imprinting genómico nos espermatozóides. Em caso de positividade, deve ser

efectuado diagnóstico genético pré-natal (PND) para as doenças ligadas ao imprinting genómico.

Page 22: Manual do estágio de RMA

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Indicações Femininas. 1 IVF sem fecundação; !2 IVF sem gravidez; Baixo nº de ovócitos (#4);

Imaturidade ovocitária; Dismorfias ovocitárias; Défice do desenvolvimento embrionário; Ovário

com !35 anos; PGD.

-Indução do crescimento folicular (hiperestimulação controlada do ovário), Riscos, Indução

da maturação ovocitária e da ovulação. Como IVF. Aspiração dos folículos ováricos (dia 0).

Como IVF. No caso de se obterem ovócitos imaturos, estes são amadurecidos in vitro e

microinjectados no dia seguinte.

-Mulheres seropositivas. Como não se pode testar a presença de vírus nos ovócitos, só é aceite

para ICSI a mulher com carta do serviço de medicina interna a garantir que a paciente no

presente momento não apresenta carga viral no sangue passível de transmitir a doença ao feto e

que se encontra sem risco de morte precoce. A gravidez é seguida no Hospital com tratamento

profilático do recém-nascido.

-Progesterona intravaginal (dia 0). Como IVF.

-Preparação dos espermatozóides (dia 0)

Alteração moderada a severa do sémen. Como IVF.

Ejaculação retrógrada. Origem. Em Portugal (Alberto Barros, 1997). Se o homem tem erecção e

orgasmo mas não há saída de sémen, há que saber se o sémen foi ejaculado para trás (para a

bexiga) em vez de o ser para o exterior. A ejaculação retrógrada é mais frequente nos homens

com antecedentes de cirurgia a um tumor abdominal, com patologia da próstata, ou que foram

operados à próstata. Com medicação oral alcaliniza-se a urina, 2-3 dias antes da colheita do

sémen. Após urinar, o paciente efectua a masturbação. De seguida volta a urinar e a urina é

recolhida. A urina é então lavada para se tentar obter os espermatozóides. Apenas se usam

espermatozóides recuperados da urina se forem móveis. Em caso de imobilidade, efectua-se

MESA/TESA.

Aniline blue : imaturidade da cromatina

Tunel : fragmentação da cromatina

FISH: aneuploidias Casp-3active: apoptoseTunel

Aniline blue : imaturidade da cromatina

Tunel : fragmentação da cromatina

FISH: aneuploidias Casp-3active: apoptoseTunel

Page 23: Manual do estágio de RMA

23

Anejaculação. Origem. Em Portugal (Alberto Barros, Mário Sousa, 1997). Nas lesões

neurológicas (traumatismos medulares, tumores da medula espinal, sequelas de cirurgia

abdominal) e vasculares (diabetes, hipertensão), nos distúrbios psicológicos ou em

consequência de fármacos, pode não haver erecção e/ou ejaculação. Nestes casos, o sémen

pode ser obtido por vibração, electroejaculação, por aspiração do epidídimo (MESA) ou por

aspiração testicular (TESA). Efectua-se a erecção e ejaculação assistida com vibrador médico.

Se não resultar, deve-se utilizar a técnica da electro-ejaculação. Neste caso, efectua-se clister

de limpeza intestinal e drenagem da bexiga com algália. Monitoriza-se a pressão arterial e dá-

se por via oral um antihipertensor e por via endovenosa um sedativo e analgésico. De seguida,

introduz-se uma sonda fina no canal anal, que dispara alguns ciclos de descargas eléctricas

(indolor). Se não ocorrer ejaculação, ou se os espermatozóides forem imóveis, usa-se a

MESA/TESA/TESE.

Homens seropositivos. Origem. Em Portugal (Alberto Barros, 2000). Exige-se carta do serviço

de medicina interna a garantir que o paciente no presente momento não apresenta carga viral

(qualquer vírus: HVB, HVC, HIV, etc) no sangue passível de transmitir a doença ao feto e que se

encontra sem risco esperado de morte precoce. Recolha do sémen por masturbação, seguida de

lavagem e purificação dos espermatozóides. Os espermatozóides purificados são divididos em

duas metades e criopreservados. Uma das metades vai para análise molecular. Se a análise

demonstrar a inexistência de material genético vírico, então a outra metade, criopreservada e em

quarentena, poderá ser usada para o tratamento por ICSI.

Page 24: Manual do estágio de RMA

24

Azoospermia obstrutiva. Origem. Bélgica (Devroey, 1994) e França (Mário Sousa, 1994);

Portugal (Alberto Barros, Mário Sousa, Luís Ferraz, 1996). Os espermatozóides são extraídos por

punção microcirúrgica do epidídimo (MESA). Se imóveis, efectua-se extracção de

espermatozóides ou suas células precursoras (espermatídeos) por biópsia testicular (TESE).

Azoospermia secretora. Origem. Bélgica (Devroey, 1994) e França (Mário Sousa, 1994);

Portugal (Alberto Barros, Mário Sousa, Luís Ferraz, 1996). Os espermatozóides ou suas células

precursoras (espermatídeos) são extraídos por biópsia testicular (TESE).

Indicações masculinas. Anejaculação, ejaculação retrógrada, paraplegia (primeiros bébés,

1997, Porto, Portugal, por Alberto Barros e Mário Sousa), astenozoospermia total (primeiros

bébés, 1997, Porto, Portugal, por Mário Sousa e Alberto Barros), teratozoospermia total,

criopreservação de tecido testicular antes de tratamento oncológico, azoospermia obstrutiva

(vasectomia, de causa inflamatória, de causa congénita) e azoospermia secretora. Prognóstico

na azoospermia secretora. Na azoospermia secretora existem indicadores de prognóstico que

se baseiam no volume testicular, nos níveis séricos da hormona FSH, no estudo do cariótipo, no

estudo das mutações do cromossoma Y e no diagnóstico histológico de uma pequena biópsia

testicular. Existem três grandes síndromes na azoospermia secretora. No síndrome de células de

Sertoli (SO), a taxa de sucesso da TESE é de 3%; na paragem da maturação (MA) a taxa de

sucesso da TESE é de 40%; e na hipo-espermatogénese (HP), a taxa de sucesso da TESE é de

90%. Na presença de microdelecções AZFc ou DAZ, a probabilidade de sucesso na TESE,

independentemente do síndrome (SO, MA o HP), é de 90%. Técnica. É efectuada com anestesia

local troncular (sobre o cordão espermático, logo abaixo da região inguinal) por Urologista. É um

processo indolor que demora cerca de 20 minutos, por testículo. Em caso de hipersensibilidade, o

paciente pode requerer anestesia geral (<1% dos casos). Não tem complicações e a cirurgia é de

Page 25: Manual do estágio de RMA

25

ambulatório. Colhem-se fragmentos de 1-2 mm em pontos diferentes do testículo, parando mal se

encontrem espermatozóides ou suas células precursoras (espermatídeos). Em caso de presença

de apenas células-mãe, efectua-se cultura in vitro destas (taxa de maturação com sucesso: 17%;

Mário Sousa, 1998, 2002). Medicação. No fim da biópsia, o paciente faz analgésico oral. Em

casa, durante dois dias, deve fazer 1g de paracetamol de 8/8h. Cuidados. Durante 1-2 dias não

deve conduzir. Durante 1-2 semanas não deve praticar desportos e deve evitar relações sexuais.

Frequência. A TESE só pode ser repetida passados 6-12 meses para permitir a recuperação

testicular.

-Técnica laboratorial da ICSI. Após a aspiração dos ovários, seleccionam-se os folículos

ováricos e deixam-se repousar por 2 h. Depois, os folículos são desnudados (remoção das

células foliculares) e deixam-se repousar por mias 2 h. De seguida, seleccionam-se

espermatozóides com morfologia normal e mobilidade progressiva rápida 4D. Cada um é depois

lavado e imobilizado por esmagamento do flagelo (sem secção). Finalmente, injecta-se um

espermatozóide/espermatídeo em cada ovócito. A fecundação e o desenvolvimento embrionário

ocorrem in vitro numa incubadora como na IVF.

MESA

TESE

Page 26: Manual do estágio de RMA

26

-Eclosão assistida. Origem. USA (1995) e França (Mário Sousa, 1995). Em Portugal (Alberto

Barros e Mário Sousa, 1996). Indicações. !2 ciclos sem implantação; idade feminina !35 anos.

Técnica. Ao dia 3 do desenvolvimento embrionário (embriões A/B com 6-12 células), abre-se um

pequeno orifício (10-15 $m) no invólucro de cada embrião, para facilitar a sua eclosão no dia 5.

ovócito

Células foliculares

do cumulus oophorus

cabeça

flagelo

micropipeta

ovócito

Zona da placa

metafásica II

1º glóbulo polar

Zona pelúcida

ovócito

Células foliculares

do cumulus oophorus

cabeça

flagelo

micropipeta

ovócito

Zona da placa

metafásica II

1º glóbulo polar

Zona pelúcida

Page 27: Manual do estágio de RMA

27

-Transplante de citoplasma e nuclear. Origem. USA (1995). Em Portugal (Alberto Barros e

Mário Sousa, 1996). Exige análise genética das células dos ciclos anteriores para comprovar que

não existem anomalias genéticas dos ovócitos. Transferência de citoplasma: Em casos com má

qualidade do citoplasma dos ovócitos ou com 2 ciclos com défice total de desenvolvimento

embrionário, e nos casos de doença mitocondrial materna. Na ICSI, é microinjectado um volume

de cioplasma de ovócito dador (transplante parcial de citoplasma). Transferência nuclear. Em

casos com má qualidade do citoplasma dos ovócitos ou com 2 ciclos com défice total de

desenvolvimento embrionário, e nos casos de doença mitocondrial materna resistentes à

transferência parcial de citoplasma. No estádio de zigoto, os pronúcleos são aspirados e

microinjectados num ovócito dador enucleado.

-Transferência de embriões, Número de embriões a transferir, Dia da transferência dos

embriões, Taxas de gravidez. Período de repouso após a transferência dos embriões,

Cuidados após a transferência dos embriões, Medicação após a transferência dos

embriões, Detecção da gravidez, Criopreservação de embriões, Frequência dos

tratamentos. Como IVF.

Page 28: Manual do estágio de RMA

28

-Maturação in vitro de ovócitos. Origem. Bélgica (1995); Em Portugal (Mário Sousa, Alberto

Barros, 1996). Como IVF.

-Taxas de gravidez com espermatídeos. Espermatídeos redondos (ROSI: Sa). 1-3%

(primeiros bebés, França, 1994, Mário Sousa). Espermatídeos em alongamento (ENSI: Sb). 13-

15% (primeiro bebé, Alicante, Espanha, 1997, Mário Sousa). Espermatídeos alongados (ELSI:

Sd). 19-27% (primeiros bebés, Portugal, 1996, Mário Sousa e Alberto Barros).

DIAGNÓSTICO GENÉTICO PRÉ-IMPLANTAÇÃO (PGD)

-Origem. Iniciada em Londres, Inglaterra (1992). Depois parada devido a erro laboratorial.

Aplicada sistematicamente à RMA desde 1995 (Holanda, França, Espanha, Mário Sousa, 1995;

Portugal, Mário Sousa e Alberto Barros, 1997).

-Indicações. Doenças genéticas hereditárias dos progenitores, com risco !25% de transmissão

ao feto; Anomalias do cariótipo dos progenitores, com risco !25% de transmissão ao feto;

Abortamentos de repetição (!2); !2 IVF/ICSI sem gravidez; Mulheres com !35 anos; Necessidade

de procriação de irmão/irmã para recolha de sangue de cordão umbilical (casos de crianças com

doença hemato-oncológica a necessitar de transplante de medula óssea mas sem dador

compatível de medula óssea ou de sangue de cordão umbilical. A selecção efectua-se pelos

genes HLA).

-Exemplos. Fibrose cística, polineuropatia amiloidótica familiar, doença de Machado-Joseph,

doença de Huntington, distrofia muscular, neurofibromatose, hemofilia, talassemia, atraso mental

ligado ao cromossoma X, doença de Tay-Sachs, doença de Fabry, etc. Doenças ligadas aos

cromossomas sexuais (selecção de sexo). Anomalias cromossómicas parentais: translocações,

Células de Sertoli Células estaminais adultas: SGA Células progenitoras adultas: ST1

Células progenitoras adultas: ST2 Sa Sb Sd

Células de Sertoli Células estaminais adultas: SGA Células progenitoras adultas: ST1

Células progenitoras adultas: ST2 Sa Sb Sd

Page 29: Manual do estágio de RMA

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síndrome de Klinefelter (47,XXY). Microdelecções do cromossoma Y (selecção do sexo feminino).

Idade materna !35 anos (despiste de aneuploidias). Risco aumentado de trissomia 21 (idade

materna !35 anos, gestações prévias de fetos com trissomia 21). Abortamentos de repetição

(despiste de aneuploidias). Casais com risco de transmitirem aos filhos situações de cancro

hereditário (mama, cólon, estômago). Doença genética hereditária mitocondrial.

-Indução do crescimento folicular (hiperestimulação controlada do ovário), Riscos, Indução

da maturação ovocitária e da ovulação, Aspiração dos folículos ováricos (dia 0),

Progesterona intravaginal (dia 0), Colheita e preparação dos espermatozóides (dia 0),

Técnica laboratorial da ICSI. Como ICSI.

-Biópsia embrionária. Em embriões de dia 3, classe A/B, com 6-12 blastómeros. Abre-se um

orifício no invólucro de cada embrião (20 $m) e removem-se 1-2 blastómeros. As células

removidas vão para análise genética e os embriões são colocados em cultura, isolados, até ao

dia 5 (fase de blastocisto).

-Transferência de embriões. Apenas se transferem os blastocistos A/B cujo diagnóstico

genético tenha sido normal. Os embriões alterados são analisados geneticamente para confirmar

o diagnóstico. Número de embriões a transferir. Como ICSI. Dia da transferência dos

embriões. Dia 5. Período de repouso após a transferência dos embriões, Cuidados após a

transferência dos embriões, Medicação após a transferência dos embriões, Detecção da

gravidez, Criopreservação de blastocistos normais, Frequência dos tratamentos. Como

ICSI. Taxas de gravidez. Como ICSI se 2 blastocistos transferidos.

Page 30: Manual do estágio de RMA

30

FISHFISHFISH

PCR

RFLP

SSCP

SINGLE CELL-PCR

PCR

RFLP

SSCP

SINGLE CELL-PCR

Page 31: Manual do estágio de RMA

31

CRIOPRESERVAÇÃO DE TECIDO OVÁRICO

Origem. Inglaterra (1999); Portugal (Mário Sousa, Alberto Barros, 2000). Indicações. Pacientes

oncológicos, antes do tratamento: ooforectomia, quimioterapia ou radioterapia. Permite preservar

a fertilidade por transplante de tecido ovárico ou maturação in vitro de folículos primordiais.

Técnica. Sempre que possível, a paciente deve efectuar hiperestimulação controlada do ovário e

recolher ovócitos (imaturos ou maduros) para criopreservar. De seguida, deve efectuar biópsia de

ovário ou remoção de ovário. Destes, preparam-se pequenos fragmentos de tecido ovárico

(córtex) que são criopreservados. Utilização ulterior. Ainda não se sabem cultivar os folículos do

ovário congelado. Pelo contrário, o transplante de fragmento de ovário já permite obter bebés

(Bélgica, 2004).

CRIOPRESERVAÇÃO DE OVÓCITOS

Ovócitos imaturos em Profase I (GV). Indicações. Ovário poliquístico resistente ao tratamento

cirúrgico ou medicamentoso; Pacientes oncológicos antes do tratamento. Ovócitos maduros

(MII). Indicações. Adiamento da fertilidade; Pacientes oncológicos antes do tratamento. Indução

do crescimento folicular (estimulação controlada do ovário). GV. Indução ligeira do

crescimento folicular com a administração subcutânea das hormonas antagonista/agonista

hipotalâmico e rFSH. O crescimento folicular é monotorizado por análises sanguíneas (estradiol)

e ecografias, cujos resultados também permitem ajustar as doses dos medicamentos. Geralmente

demora 1-2 semanas. Há boa resposta quando vários (20-30) folículos atingem 10-14 mm. MII.

Como FIV. Riscos. GV. Raro, porque estimulação muito ligeira. MII. Como IVF. Aspiração dos

folículos ováricos (dia 0). Como IVF. Técnica. Isolamento dos ovócitos e criopreservação. Taxa

de sobrevida na descongelação. 50-60%. Utilização ulterior. Maturação in vitro dos ovócitos

GV até MII (60-80%), seguido de ICSI. Taxa de gravidez. Como IVF/ICSI.

CRIOPRESERVAÇÃO DE SÉMEN E TECIDO TESTICULAR

Origem. Espermatozóides do sémen: Portugal (Alberto Barros, 1985). Espermatozóides

testiculares: Bélgica (1994), França (Mário Sousa, 1994) e Portugal (Alberto Barros e Mário

Sousa, 1996). Células progenitoras testiculares: Portugal (Mário Sousa e Alberto Barros, 1998).

Indicações. Sémen. Oligozoospermia severa; Doentes oncológicos antes do tratamento;

Adiamento da fertilidade. Tecido testicular. Azoospermia; Doentes oncológicos antes do

tratamento. Técnica de colheita e preparação. Como IVF/ICSI/TESE. Utilização ulterior. ICSI-

TESE (azoospermia); Autotransplante, após cura oncológica. Taxa de sobrevida na

descongelação. 70%. Taxa de gravidez. Como ICSI ou ICSI-TESE.

Page 32: Manual do estágio de RMA

32

DOAÇÃO DE OVÓCITOS

-Indicações. Insuficiência prematura do ovário; ovariectomia; anomalias congénitas dos ovários;

ovócitos dismórficos; ovócitos com anomalias genéticas; contra-indicação para hiper-estimulação

hormonal; !4 falhas de gravidez com ICSI e/ou PGD; menopausa.

-Emparelhamento entre dadora e receptora (paciente). Na doação de ovócitos, efectua-se

uma consulta com o casal para se recolherem os dados físicos e uma amostra de sangue da

mulher, enquanto que o homem procede à colecta do sémen que de seguida é criopreservado.

O centro procurará então uma dadora de ovócitos com características genéticas similares à da

mulher do casal infértil, uma procura segundo os processos de transplante e que pode demorar

alguns meses (em média até cerca de 6 meses). Na doação de ovócitos efectua-se um

emparelhamento físico e genético entre a dadora e a mulher infértil, de modo a serem os mais

iguais possíveis: etnia, biótipo, estatura, estatura, cor de pele, cor dos olhos, cor do cabelo, tipo

de cabelo e grupos sanguíneos ABO/Rh. O emparelhamento entre as características da dadora

e as da paciente do casal permite actualmente uma igualdade de 70% entre os genes

maternos e os da dadora. Como o contributo materno para o bebé é de 50%, o ovócito doado

leva 50x70=35% de genes maternos e 15% de genes externos. Se juntarmos os 50% do

contributo paterno, dá um bebé com 85% (35%+50%) de identidade genética dos pais e só

15% de genes exógenos (que ficam limitados aos orgãos internos, e que não interferem nem

aspecto físico nem no tipo de sangue). Trata-se de uma compatibilização do tipo usado nos

transplantes.

-Metodologia. Quando se obtém a dadora, inicia-se a preparação do endométrio da paciente

alguns dias antes (1-2 semanas) da transferência prevista dos embriões. A recolha de ovócitos da

dadora é efectuada por aspiração dos ovários após hiper-estimulação controlada do ovário (ver

IVF/ICSI). Cerca de 1 hora após a recolha, a dadora regressa ao seu domicílio em regime

ambulatório. De seguida, os ovócitos da dadora são microinjectados com os espermatozóides

criopreservados (após descongelação e purificação) do casal. A cultura dos embriões é então

efectuada, e a transferência dos embriões para a paciente deve ocorrer ao 5º dia do

desenvolvimento embrionário (fase de blastocisto). Em alternativa, criopreservam-se os

blastocistos para ulterior transferência programada. Com a evolução tecnológica, espera-se vir a

dispor de bancos de ovócitos em vez de um banco de dadoras potenciais.

-Critérios de selecção das dadoras. Mulheres adultas jovens (20-35 anos de idade), com boa

compleição física, bom quociente intelectual e nível elevado de educação, com ausência de

hábitos alcoólicos, tabágicos ou de consumo de drogas, com ausência de malformações físicas,

défices sensoriais e motores, com ausência de doenças genéticas, de doenças sistémicas

(diabetes, hipertensão arterial, reumatismo, insuficiência renal, insuficiência hepática, etc) e de

Page 33: Manual do estágio de RMA

33

doenças oncológicas, com ausência de agentes infecciosos (HIV1, HIV2, HTLV1, HTLV2, HVB,

HVC, HVD, CMV, EBV, HSV1, HSV2, HPV, Sífilis, Micoplasma, Clamidia, Toxoplasma, priões),

com ausência na família directa de malformações físicas, défices sensoriais e motores, com

ausência de doenças mentais, psiquiátricas e genéticas, com ausência de doenças sistémicas e

neoplásicas. As doenças referidas da dadora têm de ser confirmadas imediatamente antes do

início da estimulação ovárica. O casal deve receber um certificado que garante que todos estes

aspectos foram respeitados.

-Custos. A doação de ovócitos não pode ser gratuita, pois obriga a uma hiper-estimulação

controlada do ovário, anestesia e recolha de ovócitos, processamento dos espermatozóides,

microinjecção, cultura de embriões e transferência de embriões. Em relação ao pagamento da

dadora, como é uma doação benévola, apenas se custeiam os gastos obrigatórios da dadora

(medicação hormonal e 56 h de trabalho perdidas: cerca de 2x1.000 Euros).

-Tipo de banco. A doação é benévola (doação gratuita) e anónima.

-Dúvida de maternidade ou Doença suspeita de ter sido transmitida pela doação de

ovócitos. Nestes casos, o casal tem direito a um estudo adequado da dadora para

comprovação. Neste estudo, o anonimato da dadora é obrigatoriamente mantido e a

responsabilidade da mesma é considerada nula. No caso da criança desenvolver uma doença

nova, ela deve-se a um acaso e não por falta de rastreio das infecções ou das doenças

conhecidas e à data legalmente efectuadas na dadora.

DOAÇÃO DE ESPERMATOZÓIDES

-Origem. Em Portugal (Aberto Barros, 1985).

-Indicações. O recurso a sémen de dador é raro desde a introdução da microinjecção (ICSI), da

biópsia testicular (TESE), da microinjecção de espermatídeos (ROSI, ENSI, ELSI) e da maturação

in-vitro do epitélio germinal masculino para tratamento da infertilidade masculina. A doação de

sémen efectua-se quando o homem infértil não possui espermatozóides/espermatídeos no sémen

(azoospermia) nem no testículo (após biópsia testicular).

-Tipos de bancos de sémen. O sémen de dador encontra-se sempre criopreservado (em azoto

líquido, à temperatura de –196ºC) e está armazenado em contentores próprios. Bancos

fechados. Públicos. Doação anónima, benévola. Bancos abertos. Privados. Doação paga, com

acesso à identidade do dador aos 18 anos de idade da criança. O casal pode optar pelo tipo de

banco que desejar.

-Risco de consanguinidade. Para que não haja qualquer probabilidade de encontro entre

indivíduos com origem no mesmo sémen de dador, cada amostra doada só pode ser utilizado 5-

Page 34: Manual do estágio de RMA

34

10 vezes em casais sem qualquer relação de parentesco e com origem residencial distinta, não

podendo cada dador estar na origem de mais do que 5 crianças nascidas.

-Critérios de selecção dos dadores. Fertilidade comprovada (filhos), com boa compleição física,

bom quociente intelectual e nível elevado de educação, com ausência de hábitos alcoólicos,

tabágicos ou de consumo de drogas, com ausência de malformações físicas, défices sensoriais e

motores, com ausência de doenças genéticas, de doenças sistémicas (diabetes, hipertensão

arterial, reumatismo, insuficiência renal, insuficiência hepática, etc) e de doenças oncológicas,

com ausência de agentes infecciosos (HIV1, HIV2, HTLV1, HTLV2, HVB, HVC, HVD, CMV, EBV,

HSV1, HSV2, HPV, Sífilis, Micoplasma, Clamidia, Toxoplasma, priões), com ausência na família

directa de malformações físicas, défices sensoriais e motores, com ausência de doenças mentais,

psiquiátricas e genéticas, com ausência de doenças sistémicas e neoplásicas. Após esta

selecção clínica, o sémen é colhido e seleccionado se tiver parâmetros normais, ficando

criopreservado de quarentena por seis meses. Ao fim desse período, voltam-se a repetir os testes

infeccioss ao dador. Antes ainda de poder ser usado, o sémen congelado também é testado na

sua qualidade de resistência à descongelação.

-Emparelhamento entre dador e receptor (paciente). Efectua-se um emparelhamento físico

e genético entre o dador e o homem infértil: etnia, biótipo, estatura, cor de pele, cor dos olhos,

cor do cabelo, tipo de cabelo e grupos sanguíneos ABO/Rh. O emparelhamento entre as

características do dador e as do paciente permite actualmente uma igualdade de 70% entre os

genes paternos e os do dador. Como o contributo paterno para o bebé é de 50%, a amostra

doada leva 50x70=35% de genes paternos e 15% de genes externos. Se juntarmos os 50% do

contributo materno, dá um bebé com 85% (35%+50%) de identidade genética dos pais e só

15% de genes exógenos (que ficam limitados aos orgãos internos, e que não interferem nem

aspecto físico nem no tipo de sangue). Trata-se de uma compatibilização do tipo usado nos

transplantes. O casal deve receber um certificado que garante que todos estes aspectos foram

respeitados.

-Preparação do sémen. Como IUI, após descongelação.

-Técnica. Como IUI.

-Dúvida de paternidade ou de Doença suspeita de ter sido transmitida pela doação de

sémen. Nestes casos, o casal pode pedir um estudo adequado do dador para comprovação.

Neste estudo, o anonimato do dador é obrigatoriamente mantido e a responsabilidade do

mesmo é considerada nula. No caso da criança desenvolver uma doença nova, ela deve-se a

um acaso e não por falta de rastreio das infecções ou das doenças conhecidas e à data

legalmente efectuadas no sémen do dador e no dador.

Page 35: Manual do estágio de RMA

35

DOAÇÃO DE EMBRIÕES

Fonte de embriões excedentários: Embriões frescos supranumerários que o casal não deseja

criopreservar; embriões criopreservados libertados por falecimento de um ou dos dois membros

do casal, ou por o casal desistir da sua utilização devido a terem tido gémeos.

Indicações (por ordem de prioridade). Doação para casais duplamente inférteis. Situações

muito raras, em que ambos os membros do casal são totalmente inférteis (sem ovócitos ou sem

ovário; sem testículo ou sem espermatozóides nem espermatídeos no sémen e na biópsia

testicular). Adopção. No caso de casais em lista de espera para adopção, desde que o casal o

deseje e a mulher tenha condições de saúde para gestação. Doação para transplantes. Na fase

de blastocisto, retiram-se cerca de 50 células estaminais. Estas células estaminais são

pluripotentes, ou seja, não são capazes de originar um embrião nem de implantar, podendo

apenas ser diferenciadas em tecidos para programas médicos de transplantação.

EMPRÉSTIMO BENÉVOLO DE ÚTERO

Indicações. Histerectomia, Ausência congénita de útero, Anomalias congénitas do útero

incompatíveis com gravidez. Dadoras. Pode ser anónima ou familiar/amiga do casal, sendo

obrigatória a doação benévola. Obriga, em qualquer dos casos, a contrato legal específico e

vigilância apertada da grávida por assistente social/psicóloga. Os pais devem acompanhar a

assistente social/psicóloga nas entrevistas de selecção, em visitas regulares durante a gestação,

devem estar presentes nas consultas médicas e assistir ao parto. Compete ao casal o pagamento

das despesas médicas (obtenção da gestação, vigilância da gravidez, parto) e as específicas da

grávida (vestuário, alimentação, etc). Metodologia. IVF/ICSI com gâmetas do casal

(eventualmente com um dos gâmetas sendo de dador/dadora). Cultura de embriões.

Transferência intra-uterina de embriões para o útero da dadora após preparação do endométrio.

Page 36: Manual do estágio de RMA

36

REFERÊNCIAS INTERNACIONAIS

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spermiogenesis. Anat Embryol 185:271-274.

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subzonal insemination and by intracytoplasmic sperm injection. Fertil Steril 62:1197-1204.

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sperm injection. Hum Reprod 9:2374-2380.

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INFERTILIDADE E ABORTAMENTOS DE REPETIÇÃO DE CAUSA GENÉTICA

O problema da infertilidade conjugal faz parte da história da humanidade, com

consequências sociais e individuais, sobretudo para a mulher, pois era esta quem, em regra, era

acusada e muitas vezes desprezada, odiada e maltratada pela circunstância de não ter filhos.

Na realidade, se a capacidade reprodutiva era (e é) fundamental para a sobrevivência das

populações e, por isso, socialmente aceite e encorajada, a esterilidade era, pelo contrário,

considerada como uma doença vergonhosa, até mesmo como uma maldição dos deuses, que era

necessário conjurar com rituais religiosos e mágicos. Assim, e apesar da preocupação crescente,

de pessoas e grupos, em praticar contracepção eficaz e da generalização da interrupção

voluntária da gravidez, a incapacidade de concretizar o instinto procriativo leva a situações de tal

frustração, ansiedade e, até, angústia, que obriga o médico a procurar solucionar esse

comprometimento da aptidão biológica, que afecta cerca de 15% dos casais, sendo a

etiopatogenia repartida em partes sensivelmente iguais por factores masculinos, femininos e

mútuos.

O conhecimento das situações de origem genética - génica e cromossómica - que

produzem infertilidade e, sobretudo, a capacidade de as interpretar correctamente, é de

importância indiscutível para uma prática médica correcta. Isto porque, ao contrário das outras

inúmeras causas de infertilidade resultantes da acção nefasta de agentes biológicos, químicos ou

físicos e cujo combate, em regra, terá uma tradução positiva em termos individuais e de espécie,

a infertilidade de causa genética poderá constituir um mecanismo biológico automático de

eliminação de genes ou cromossomas anómalos pelo que a hipótese do seu combate deve ser

exaustivamente analisada e ponderada.

Na mulher, o síndrome de Turner, pela sua disgenesia ovárica e consequente amenorreia

primária é, claramente, um factor etiológico importante na infertilidade feminina.

A insuficiência ovárica prematura (“menopausa precoce”), a endometriose e o síndrome

dos ovários policísticos são outros factores de infertilidade de causa feminina, com uma etiologia

menos clara mas que, indiscutivelmente, envolvem uma etiologia genética. A insuficiência ovárica

prematura, definida como o fim da função ovárica antes dos 40 anos, ocorre em cerca de 1% das

mulheres, não sendo a causa identificada na maioria das doentes. Esta forma idiopática pode ser

esporádica ou familiar. A incidência de casos familiares de insuficiência ovárica prematura varia

de 4 a 31%. Estudos familiares sugerem uma hereditariedade autossómica dominante limitada ao

sexo ou uma hereditariedade ligada ao cromossoma X com penetração incompleta. O risco das

Page 51: Manual do estágio de RMA

51

familiares das doentes desenvolverem uma insuficiência ovárica prematura pode ser tão alta

como 100% (nos casos familiares) ou tão baixa como 1% (nos casos esporádicos).

A insuficiência ovárica prematura tem sido também progressivamente associada ao

síndrome do X-frágil, doença ligada ao cromossoma X, causada pela ausência da fragile X mental

retardation protein (FMRP). Habitualmente, esta ausência da FMRP resulta da expansão da

repetição de trinucleotídeos que ocorre no promotor do gene e que conduzirá a um processo de

hipermetilação que torna o gene inactivo. Nos casos normais, há < 50 destas repetições (CGG);

os alelos com 50 - 200 repetições são classificados de pré-mutações, enquanto que a mutação

completa contém pelo menos 200 repetições. Durante muitos anos pensou-se que as portadoras

de pré-mutações não revelariam quaisquer anomalias fenotípicas; todavia, há uma evidência

crescente de que a pré-mutação X-frágil é um factor de risco significativo para a insuficiência

ovárica prematura, o que tem óbvias implicações no aconselhamento genético, salientando-se a

importância do estudo genético, pessoal e familiar, e da recomendação para que as portadoras

desta pré-mutação não esperem demasiado tempo para terem filhos.

O desenvolvimento da endometriose parece envolver a aquisição de alterações genéticas

somáticas em genes que regulam o crescimento e a diferenciação celular.

O síndrome dos ovários poliquísticos terá uma transmissão autossómica dominante

(mutações génicas, afectando a síntese de androgéneos, e a secreção e a actividade da insulina,

explicam a maioria dos sintomas endócrinos e metabólicos) enquanto que factores ambienciais

(actuando durante o período pré-natal ou na vida pós-natal) parecem converter uma situação

oculta num síndrome clinicamente manifesto. Para além disto, recentemente, foi evidenciada a

existência de factores genéticos determinando a idade da menopausa.

O carácter indiscutível da etiologia genética na infertilidade masculina tem conduzido a

múltiplos trabalhos procurando a sua quantificação. A análise directa da constituição

cromossómica dos espermatozóides humanos, através da fertilização dos ovócitos do Hamster e

posterior análise cromossómica do pronúcleo masculino, permitiu estudar a constituição

cromossómica de 2468 espermatozóides humanos, tendo sido observada uma incidência de

anomalias cromossómicas de estrutura de 7,7%, sendo as mais frequentes as roturas

cromossómicas, e 1,7% de aneuploidias (incidência global: 9,4%).

Estas observações significam que a estratégia reprodutiva, que inclui mecanismos de

eliminação selectiva dos gâmetas geneticamente desequilibrados, não é completamente eficaz -

Barr et al. concretizam esta selecção em plena espermatogénese humana, referindo uma perda

celular de 35% entre espermatócito I e espermátide.

Page 52: Manual do estágio de RMA

52

Deste modo, quando há uma ineficácia selectiva ao nível da espermatogénese e da

capacidade fecundante - porventura os dois processos biologicamente menos dispendiosos para

a sobrevivência da espécie - e esta ineficácia não é compensada pela morte embrio-fetal, o

resultado pode ser a formação de um indivíduo com anomalias génicas ou cromossómicas

causadoras da infertilidade ou esterilidade por incapacidade de produção ou fecundação dos

gâmetas, interferência com o normal desenvolvimento dos orgãos genitais, morte do doente antes

de alcançar a idade reprodutiva, morte pré-natal dos filhos que receberam a informação genética

anormal ou dificuldade no estabelecimento de relações psico-sociais necessárias para a

reprodução.

Um último mas imprescindível comentário prévio relaciona-se com a circunstância de que a

esquematização das causas genéticas da infertilidade masculina em génicas e cromossómicas

não significa a desvalorização dos outros elementos multifactoriais, tendo sido observado um

aumento altamente significativo da incidência de criptorquidia, hipospádias e outras malformações

urogenitais nas últimas décadas, assim como um declínio secular do número de

espermatozóides.

Etiologia genica

Dada a impossibilidade de estudar integralmente o DNA e verificar a presença ou

ausência da grande maioria dos genes que condicionam uma determinada característica, a

hipótese de doença hereditária, nomeadamente de causa génica, é colocada quando se

observam alguns dos critérios seguintes (Morton, 1955):

- deve estar demonstrado que a característica em questão não tem uma causa

ambiencial

- maior incidência nos familiares do doente que na população geral da mesma região

- maior concordância da característica nos gémeos monozigóticos que nos dizigóticos

- consanguinidade elevada nas famílias dos doentes (sobretudo nos casos de

transmissão autossómica recessiva)

- início aparente da doença a uma idade relativamente constante

- variação da frequência da doença em populações de origem distinta embora

coexistindo no mesmo espaço ecológico.

Page 53: Manual do estágio de RMA

53

No entanto, muitas vezes o número de casos na família ou na população é de tal modo

reduzido e com um tipo de transmissão tão irregular que é difícil, e frequentemente discutível,

reconhecer-se a causa génica e, quando esta é aceite, identificar o tipo de hereditariedade

(autossómica ou ligada ao cromossoma X, dominante ou recessiva).

Em seguida, referem-se alguns exemplos de entidades patológicas, de etiologia génica,

que conduzem à infertilidade (é de realçar a heterogeneidade genética que está presente na

etiologia de muitas destas entidades):

! Anorquia familiar congénita (hereditariedade: X-recessiva ou multifactorial).

! Aplasia das células germinativas ou síndrome das células de Sertoli

(hereditariedade: X-recessiva ou autossómica dominante limitada ao sexo

masculino).

! Aplasia congénita dos canais deferentes (hereditariedade: autossómica recessiva,

X-recessiva, autossómica dominante de expressão limitada ao sexo).

! Fibrose cística (hereditariedade: autossómica recessiva).

! Hipospádias (hereditariedade: autossómica dominante ou multifactorial).

! Infertilidade oligosináptica (hereditariedade: autossómica recessiva, autossómica

dominante ou X-recessiva).

! Síndrome de Kallman ou displasia olfacto-genital (hereditariedade: autossómica

dominante ou recessiva).

! Síndrome dos cílios imóveis (hereditariedade: autossómica recessiva,

heterogeneidade genética).

! Malformação do acrossoma (hereditariedade: autossómica dominante, autossómica

recessiva ou poligénica).

Em 1976, Tiepolo e Zuffardi postularam que, pelo menos, um factor genético, essencial

para o desenvolvimento da linha germinativa masculina, se localizaria na porção distal do braço

longo do cromossoma Y, tendo designado este factor genético de AZoospermia Factor (AZF).

Em 1996, Peter Vogt et al. definiram três diferentes regiões AZF, na porção proximal, média e

distal de Yq11: AZFa, AZFb e AZFc.

A histologia testicular dos indivíduos com microdeleção na região AZFa tem revelado uma

ausência completa de células germinativas (Sertoli cell-only syndrome) enquanto que no caso das

Page 54: Manual do estágio de RMA

54

microdeleções em AZFb tem sido observado um bloqueio da espermatogénese, anterior ou

durante a meiose (paragem da maturação).

As microdeleções em AZFc não podem ser associadas com uma interrupção numa fase

específica da espermatogénese. De facto, há uma grande variabilidade na expressão fenotípica

testicular - desde uma ausência completa de células germinativas até uma espermatogénese

completa com espermatozóides presentes no ejaculado. Esta variação da expressão fenotípica

ocorre de indivíduo para indivíduo mas também pode acontecer no mesmo indivíduo ao longo do

tempo, com uma evolução negativa partindo de um número normal de espermatozóides ou de

uma oligozoospermia (número de espermatozóides inferior a 20 milhões / ml), até hipoplasia,

paragem da maturação ou ausência completa de células germinativas. Este conhecimento

permite entender a importância de um diagnóstico precoce desta microdelecção: para um

tratamento precoce e para uma eventual crioconservação profilática do esperma em azoto líquido.

A pesquisa de microdelecções do cromossoma Y na população masculina infértil,

realizada no Serviço de Genética da FMP, tem revelado uma incidência global de 4-7%.

As microdelecções foram apenas encontradas nas azoospermias secretoras (~12%) e nas

oligozoospermias graves - número de espermatozóides inferior a 1 milhão /ml – (~ 4%).

As microdelecções em AZFc são as mais frequentemente diagnosticadas (~70%), podendo

ser encontradas isoladamente ou em associação com as microdelecções em AZFa ou AZFb.

Como seria de esperar, nas oligozoospermias graves, todas as microdelecções observadas estão

localizadas em AZFc.

O diagnóstico de uma microdelecção em AZFc não tem apenas a importância de

proporcionar um entendimento da causa da alteração mais ou menos grave da espermatogénese

mas também tem um significativo valor prognóstico. De facto, no caso de uma azoospermia

secretora, se a biopsia testicular de diagnóstico (em que se retiram, em regra, 2 ou 3 fragmentos

de testículo) tiver revelado um síndrome de células de Sertoli ou uma paragem da maturação, a

probabilidade de encontrar espermatozóides ou espermátides numa posterior biopsia testicular de

tratamento (em que, em ambos os testículos, são retirados múltiplos pequenos fragmentos) é,

segundo os resultados do nosso grupo, de:

- síndrome de células de Sertoli: 15% na ausência de microdelecção em AZFc mas de

40% se o doente apresentar a microdelecção AZFc;

- paragem da maturação: 44% na ausência de microdelecção em AZFc mas de 82% se o

doente apresentar a microdelecção AZFc.

Page 55: Manual do estágio de RMA

55

Uma explicação para este elemento empírico, aparentemente contraditório, em que a

presença de uma mutação melhora o prognóstico, é que as microdelecções em AZFc são

relativamente benignas em comparação com as outras microdelecções ou com os factores

idiopáticos, e que poderá haver uma predisposição genética, porventura uma pré-mutação, que

se desenvolverá para uma mutação completa pela influência de factores ambienciais ou

poligénicos.

Etiologia cromossómica

Os êxitos e os fracassos reprodutivos da espécie humana estão também intimamente

relacionados com a constituição cromossómica dos produtos de concepção. Desde que

Ferguson-Smith et al. introduziram o cariótipo de linfócitos no protocolo de estudo do homem

infértil, múltiplos trabalhos têm demonstrado a importância das anomalias cromossómicas na

infertilidade masculina, embora a incidência destas anomalias seja variável, o que resulta

fundamentalmente dos diferentes critérios de selecção dos vários grupos avaliados: um estudo

realizado em 2247 homens inférteis revelou uma frequência total de anomalias cromossómicas de

8,9% (7,3% de heterossomopatias e 1,6% de autossomopatias), tendo esta frequência baixado

para 2,1% (1,4% e 0,7% de hetero e autossomopatias, respectivamente) em 2372 homens

inférteis não seleccionados.

Um estudo citogenético realizado no Serviço de Genética da Faculdade de Medicina do

Porto, a 404 homens inférteis, revelou:

! Cariótipo normal 89,6%

! Anomalias cromossómicas de número 3,2%

• S. Klinefelter 2,5%

• 47,XYY 0,7%

! Anomalias cromossómicas de estrutura 3,0%

• T. robertsoneanas 1,7%

• T. recíprocas 0,5%

• Inv. Pericêntricas 0,7%

! Polimorfismos cromossómicos 4,2%

• 9qh+ 3,2%

• 1qh+, micro Y,

• Yq+,15s+ 1,0%

Page 56: Manual do estágio de RMA

56

Este trabalho mostrou também a associação entre a frequência das anomalias

cromossómicas e a concentração de espermatozóides, sendo a incidência das cromossomopatias

tanto maior quanto menor é o número de espermatozóides:

Nº espermatozóides/ml % Anomalias

cromossómicas

_______________________________________________________

0 15,1

< 10 milhões 8,0

" 10 milhões 2,0

Se esta diferença da incidência de anomalias cromossómicas permite esperar com maior

probabilidade uma anomalia cromossómica nos azoospérmicos e oligozoospérmicos, por outro

lado demonstra que o homem infértil, embora normozoospérmico, tem uma probabilidade 3-4

vezes superior à esperada na população geral de possuir uma cromossomopatia (incidência das

cromossomopatias na população geral: 0,5-0,7%).

A incidência relativa dos dois tipos de translocação nos indivíduos inférteis é

controversa, apresentando alguns autores uma maior frequência das translocações recíprocas

enquanto que outros estudos mostram um predomínio das translocações robertsoneanas.

Outra conclusão retirada deste estudo é que o diagnóstico de teratozoospermia ou de

astenozoospermia não é indicador da existência de uma anomalia cromossómica.

Estas observações permitem afirmar que a indicação indiscutível para realizar o estudo

cromossómico é a infertilidade e não qualquer dos parâmetros definidos no espermograma.

Após estas notas prévias, que pretenderam introduzir e exprimir a importância das

anomalias cromossómicas como causa de infertilidade masculina, analisaremos sucessivamente

as anomalias, de número e de estrutura, mais frequentemente observadas.

Page 57: Manual do estágio de RMA

57

1. Síndrome de Klinefelter

A aneuploidia - termo usado quando o número de cromossomas não é igual nem

múltiplo de n (n=23) - mais frequente nos indivíduos inférteis do sexo masculino é o síndrome de

Klinefelter, cujo cariótipo habitual é 47,XXY. A identificação desta anomalia cromossómica com o

síndrome descrito por Klinefelter et al. (1942) foi a primeira demonstração, no homem, da

associação entre uma anomalia cromossómica e a infertilidade masculina. A incidência na

população masculina geral é de cerca de 1/1000, tornando-se, como vimos, muito mais frequente

na população masculina infértil - cerca de 10/1000. Em regra, estes indivíduos são

azoospérmicos e os testículos apresentam-se pequenos, hialinizados e com aplasia ou bloqueio

da espermatogénese. Porém, existem observações, raras, da presença de espermatozóides no

ejaculado.

Os novos desenvolvimentos na área das técnicas de reprodução medicamente assistida,

concretamente com a fertilização “in vitro” com microinjecção intracitoplasmática, tornaram

legítima e até obrigatória a indicação médica para a pesquisa de espermatozóides nos testículos,

através da realização de uma biopsia testicular com colheita de múltiplos fragmentos de ambos

os testículos, o que tem permitido obter espermatozóides ou espermátides alongadas em cerca

de 33% dos doentes 47,XXY, azoospérmicos, com a consequente possibilidade de obtenção de

uma gravidez.

2. Síndrome dos indivíduos 47,XYY

Embora na maioria dos casos haja fertilidade normal e os descendentes sejam

cromossomicamente normais, há observações contraditórias: as que apontam para uma

incidência semelhante, e até menor, do síndrome na população masculina infértil relativamente à

população controle (l,88 e 1,92/1000, respectivamente) enquanto outras indicam o contrário (2,10

e 1,27/1000). Por outro lado, alguns investigadores observaram alterações da maturação ou

bloqueio da espermatogénese nesses indivíduos - a morte dos espermatócitos pode estar

associada com a univalência do cromossoma Y, o que significará que as alterações da produção

gamética nos homens 47,XYY resultam da rotura do normal emparelhamento dos cromossomas

sexuais.

3. Síndrome de Down

No que diz respeito às aneuploidias autossómicas, a trissomia 21 (síndrome de Down) é

a única situação compatível com a sobrevivência até à idade reprodutiva. Contudo, ao contrário

Page 58: Manual do estágio de RMA

58

das mulheres, cuja fertilidade é frequente, apenas são conhecidos 3 casos de fertilidade

masculina. Esta infertilidade deve-se principalmente ao bloqueio da espermatogénese, embora

estes indivíduos não devam ser considerados inférteis unicamente numa base histológica pois,

em alguns casos, foram observados espermatozóides no ejaculado, por vezes em número

normal. Aqui, a infertilidade terá por base mais a impotência sexual do que a incapacidade de

produzir um número suficiente de gâmetas (esta impotência sexual terá que ser encarada não

apenas numa perspectiva física como também do ponto de vista psicológico e social).

4. Translocações recíprocas e robertsoneanas

As translocações robertsoneanas mais frequentes ocorrem entre os cromossomas do

grupo D (l3, 14, 15), com incidência aproximada de 1/1000 nado-vivos. Destas, cerca de 90% são

translocações entre cromossomas não-homólogos, sendo as mais frequentes entre os

cromossomas 13 e 14.

Os portadores destas translocações autossómicas recíprocas, robertsoneanas ou não,

não apresentam, em regra, anomalias fenotípicas, pelo que são designados portadores ou

heterozigotos equilibrados. Porém, o aumento da frequência de translocações autossómicas

recíprocas em indivíduos com atraso mental tem sido sugerido por diversos autores, sendo

exemplo o caso em que a análise das indicações do cariótipo em 153 indivíduos portadores

equilibrados de translocações recíprocas revelou que, em 26,1% dos casos, a indicação do

cariótipo foi o atraso mental ou malformações congénitas.

O efeito destas translocações sobre a fertilidade parece limitar-se aos heterozigotos

masculinos, embora a repercussão na espermatogénese seja variável, havendo, inclusivamente,

heterozigotos com fertilidade normal. A infertilidade dos portadores de translocações

autossómicas pode ser devida a alterações da espermatogénese (com consequente oligo ou

azoospermia) e/ou produção de gâmetas com alterações cromossómicas que não têm

capacidade fecundante ou conduzem ao abortamento espontâneo do produto de concepção.

Os dados existentes não apoiam a selecção espermática mas a selecção embrionária

precoce. Esta hipótese é reforçada por um trabalho em que, utilizando o Hamster, foram

cruzadas fêmeas cromossomicamente normais e machos portadores de uma translocação

recíproca t(2;10), tendo sido observada não uma selecção gamética ou zigótica mas a paragem

do crescimento de 9,1 - 10,8% dos embriões, numa fase muito precoce do desenvolvimento

embrionário (2 células). Os resultados obtidos indicam que os zigotos, incluindo aqueles com

genomas notavelmente desequilibrados, podem desenvolver-se pelo menos até à fase de

embrião com duas células; para além disto, alguns embriões cromossomicamente anormais

Page 59: Manual do estágio de RMA

59

(principalmente monossomias) possuem ao 4º dia de gestação um número menor de blastómeros

que os embriões cromossomicamente normais, podendo esta divisão celular retardada significar

que a maioria dos embriões monossómicos estão destinados a morrer pouco após a implantação.

Os múltiplos trabalhos apresentados permitem também afirmar que os portadores

equilibrados do sexo masculino têm um número significativamente menor de filhos do que os de

sexo feminino (30,6 e 39,0%, respectivamente, para as translocações robertsoneanas e

recíprocas), o que vem reforçar a ideia de que a mulher parece muito menos susceptível do que o

homem às alterações gametogénicas provocados pelas anomalias cromossómicas - um

argumento mais a favor da selecção gamética preferencial.

Uma explicação para esta diferente capacidade reprodutiva dos portadores de

translocações equilibradas consoante o sexo é a de que o cromossoma X é inactivado durante a

profase I da meiose masculina e no aspecto descondensado do cromossoma X quando

associado com a translocação, isto é, a translocação interferirá com a normal inactivação do

cromossoma X durante a meiose. Visto que a inactivação do cromossoma X em espermatócito I

será um mecanismo de controle da espermatogénese normal, esta desrepressão do cromossoma

X durante a meiose masculina originará a descontinuidade na diferenciação espermatogénica.

Como os cromossomas X não são inactivados durante a oogénese, este mecanismo poderá

explicar a razão pela qual as translocações não provocam infertilidade às portadoras do sexo

feminino.

5. Cromossomas marcadores e supranumerários

De acordo com o ISCN (International System for Human Cytogenetics Nomenclature), um

cromossoma estruturalmente anormal e não identificado é designado marcador (47,XX ou

XY,+mar) podendo substituir um cromossoma normal ou acrescentar-se ao cariótipo habitual,

recebendo então a designação de cromossoma supranumerário.

A incidência dos cromossomas supranumerários nos nado-vivos é de cerca de 0,05%. Em

75000 amniocenteses precoces, a frequência de cromossomas supranumerários foi de 0,03%,

cerca de metade dos quais bisatélites; têm sido descritos em diversos indivíduos fenotipicamente

normais, mas são também responsabilizados por atrasos mentais e malformações congénitas.

Estas diferentes consequências clínicas serão devidas à sua heterogeneidade estrutural e

etiológica, sendo frequentemente encontrados em mosaicismo.

O motivo da infertilidade destes indivíduos relaciona-se com alterações da

espermatogénese do que resulta oligozoospermia, o que justifica a sua alta incidência na

população masculina infértil - 12 vezes superior à da população controle.

Page 60: Manual do estágio de RMA

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6. Inversões

As inversões - anomalias cromossómicas produzidas por duas roturas no mesmo

cromossoma e rotação de 180º do segmento assim formado - dividem-se em pericêntricas (as

roturas verificam-se uma de cada lado do centrómero) e paracêntricas (as roturas situam-se no

mesmo braço cromossómico, pelo que o centrómero não se encontra no segmento rodado). As

inversões pericêntricas têm uma incidência, na população geral, de cerca de 1-2%, 5-10 vezes

superior à das inversões paracêntricas.

Vários autores têm relacionado casos de inversões pericêntricas, sobretudo do

cromossoma 9, com abortamentos espontâneos e infertilidade (oligozoospermia, explicando-se

esta diminuição da actividade meiótica por uma aneussomia de recombinação). Quando um

cromossoma é normal e o outro é portador duma inversão, o emparelhamento cromossómico, em

profase I da meiose, na fase de paquiteno, só é possível se o bivalente formar uma ansa, de

modo a que as zonas homólogas possam emparelhar adequadamente. Se não se verificar um

crossing-over (entrecruzamento) e recombinação na área da ansa os dois cromossomas

separam-se em anafase I, sem haver desequilíbrio cromossómico; todavia, se existir crossing-

over no referido local, o resultado é a aneussomia de recombinação, formando-se dois

cromossomas, ambos com delecções e duplicações parciais de certas sequências

cromossómicas (nulissomias e dissomias parciais). No caso das inversões paracêntricas, a figura

é similar, mas podem formar-se dois cromossomas, com idênticas aneussomias e, paralelamente,

um acêntrico (sem centrómero) e outro dicêntrico (presença de dois centrómeros).

Ao contrário do que acontece com as inversões pericêntricas do cromossoma 9, as

inversões pericêntricas do cromossoma 1 são raras. Em 1986, publicamos a primeira descrição

mundial de uma inversão per (1), que abrange todo o braço curto, diagnosticada em três irmãos,

todos com oligozoospermia acentuada (cerca de 200 mil espermatozóides/ml), e transmitida pela

mãe - 46,XX,inv per (1) (p36.3 q12).

Os possíveis mecanismos etiopatogénicos propostos para explicar as anomalias da

espermatogénese são as alterações da sinapse, o efeito de posição e a interferência com a

inactivação do bivalente X-Y. Destas hipóteses, apenas a última poderá explicar por que razão

estas anomalias cromossómicas perturbam seriamente a meiose masculina e não causam efeitos

negativos na oogénese.

A infertilidade destes indivíduos poderá ser, então, causada quer pela incapacidade

fecundante dos gâmetas ou inviabilidade dos embriões (ambas consequência da aneussomia de

recombinação) , quer por deficiência da espermatogénese.

Page 61: Manual do estágio de RMA

61

7. Polimorfismos cromossómicos

Os polimorfismos cromossómicos consistem na ocorrência, numa população, de

cromossomas com duas ou mais formas estruturalmente diferentes mas sem o significado de

anomalia estrutural. A sua interpretação é um dos capítulos da citogenética em que as

observações antagónicas se sucedem e a discussão persiste, sendo controverso se estas

variações cromossómicas, com a frequência de 2-3% na população geral, aumentam o risco de

abortamentos de repetição, malformações congénitas nos descendentes ou diminuição da

capacidade reprodutiva.

As variações do cromossoma Y são os polimorfismos mais frequentes na população

masculina. O aumento do tamanho do cromossoma (Yq+) em 2% dos homens e a incidência das

deleções varia de 0 - 0,25%. Alguns autores sugerem a associação entre deleções do

cromossoma Y e infertilidade masculina e abortamentos de repetição. Todavia, a maioria dos

investigadores considera as variações do Y sem importância significativa, pois são

frequentemente observadas nos homens férteis. A discordância na interpretação destas

observações mantém-se, sendo de importância fundamental para a sua clarificação o estudo dos

familiares masculinos, procurando averiguar se estas variações do Y são novas mutações que

podem causar infertilidade ou são herdadas e, consequentemente, não afectam grandemente a

aptidão biológica.

As variações morfológicas das zonas de heterocromatina constitutiva (demonstradas

pelas bandas C) são também consideradas polimorfismos pois ocorrem com elevada frequência

nas populações humanas - 1qh+ (0,5%), 9qh+ (1,2%) e l6qh+ (0,88%) -, não estão associadas a

alterações do desenvolvimento e são hereditárias. Estas variações localizam-se em regiões ricas

em DNA de sequências repetitivas, que provavelmente não possuem genes estruturais, sendo

impreciso o seu significado funcional e biológico. Para alguns, estas variações poderão resultar

de um crossing-over desigual das sequências repetitivas de DNA dispostas em tandem, cujo

aumento será tolerado sem consequências fenotípicas. Todavia, também para estes

polimorfismos há quem estabeleça relações com a patologia: maior incidência de 1qh+ e 9qh+ em

crianças com malformações múltiplas do que em recém-nascidos fenotipicamente normais. No

entanto, a opinião generalizada é a de que estes polimorfismos não serão responsáveis por

quaisquer malformações, podendo, quando muito e devido a uma eventual dificuldade de

emparelhamento meiótico, prejudicar a capacidade fecundante e predispor para abortamentos

espontâneos, com redução da aptidão biológica.

Page 62: Manual do estágio de RMA

62

8. Mutações meióticas

O estudo histológico testicular dos indivíduos inférteis permite verificar frequentemente

que a proporção dos espermatócitos II, espermátides e espermatozóides relativamente às

espermatogónias e espermatócitos I está diminuída, o que significa que há um bloqueio da

meiose. Este bloqueio pode ter uma causa genética pelo que o estudo citogenético do tecido

testicular, com a realização do cariótipo de meioses e o estudo dos complexos sinaptonémicos

(estrutura proteica que permite o emparelhamento dos cromossomas homólogos na profase da 1ª

divisão meiótica), poderá ser importante no diagnóstico e prognóstico de muitas situações de

esterilidade e infertilidade, podendo observar-se mutações meióticas - assinapse (falta de

emparelhamento dos cromossomas) ou dessinapse (emparelhamento anormal).

Conclusão

O diagnóstico de um factor genético, génico ou cromossómico, como causa de

infertilidade, implica uma análise própria e uma actuação médica muito particular. Na realidade, a

identificação de uma causa genética, quer no indivíduo afectado (que expressa a doença) quer

num portador (que a transmite), deve orientar o médico no sentido de tornar ainda mais criteriosa

a aplicação de qualquer terapêutica favorecedora da fecundação, não apenas pela sua potencial

inutilidade como, em face de um hipotético êxito terapêutico, pelo risco de aumentar a frequência

de determinadas anomalias génicas ou cromossómicas. Deste modo, compete ao clínico explicar

ao casal, com toda a clareza, compreensão e tacto, a etiopatogenia e possibilidades (ou

impossibilidades) terapêuticas da situação, bem como, nomeadamente nos casos em que um dos

membros do casal é portador de uma anomalia cromossómica, indicar-lhes o possível recurso ao

diagnóstico pré-natal, por amniocentese precoce ou biópsia do trofoblasto.

Assim, em face de um casal infértil, e particularmente nos casos de infertilidade masculina,

parece-me indiscutível defender, do ponto de vista da avaliação genética, e para além do

cuidadoso e pormenorizado estudo clínico e colheita da história pessoal e familiar, a realização do

cariótipo de linfócitos, que permite esclarecer frequentemente a etiologia de muitos casos de

infertilidade. Deste modo, será possível evitar submeter o doente a outros exames diagnósticos e

a esquemas terapêuticas que manterão o doente numa expectativa que, infelizmente, não tem

fundamento biológico.

O impacto emocional provocado pelo conhecimento da incapacidade de procriar deve

constituir para o médico, durante o conselho genético, uma preocupação permanente, sendo

importante, até como medida de suporte psicológico, transmitir ao doente a ideia de que a

infertilidade não deve ser sempre encarada como algo a combater, pois pode ser porventura a

Page 63: Manual do estágio de RMA

63

única manifestação de um processo, complexo e enigmático, de selecção natural, no sentido de

evitar o nascimento de seres biologicamente anormais.

Os abortamentos espontâneos são um fenómeno comum, constituindo as anomalias

cromossómicas uma causa importante tanto dos abortamentos espontâneos esporádicos como

dos de repetição. Embora apenas cerca de 15% das gravidezes diagnosticadas terminem em

abortamento espontâneo, frequentemente é referido na literatura que, pelo menos, cerca de 50-

60% dos produtos de concepção se perdem espontânea e precocemente.

A frequência de anomalias cromossómicas em 4813 produtos de abortamentos

espontâneos estudados foi de 46% , com as seguintes frequências relativas:

.Trissomias

autossómicas

51%

. Poliploidias 23%

. Monossomia X 19%

. Anomalias estruturais 4%

. Mosaicismos 3%

Todos os autossomas têm sido encontrados em trissomia, embora com frequências

distintas. A trissomia 16 aparece em cerca de 1/3 dos casos enquanto a trissomia dos

autossomas do grupo D(l3,14,15) e G(21,22) se observam na mesma proporção.

Aproximadamente 75% dos produtos de concepção com trissomia 21 e 99,5% dos 45,X não

sobrevivem; isto significa que, se não fosse esta forma de manifestação da selecção natural, 2%

dos recém-nascidos teriam o síndrome de Down e 3% dos recém-nascidos de sexo feminino

apresentariam o síndrome de Turner.

Outro aspecto a salientar é que a incidência das anomalias cromossómicas nos

abortamentos espontâneos varia conforme o tempo de gestação, diminuindo progressivamente à

medida que a gravidez evolui:

semanas de

gestação

8-11 8-15 8-19 8-23 8-27

% de anomalias

cromossómicas

49,5 44 38 32,8 29,5

Page 64: Manual do estágio de RMA

64

Ao contrário dos abortamentos espontâneos esporádicos, em que os dois membros do

casal são, em regra, cromossomicamente normais, nos abortamentos espontâneos de repetição

as anomalias cromossómicas dos progenitores constituem um elemento causal significativo.

Desde que em 1967 foi estabelecida a relação causa-efeito entre anomalias

cromossómicas e abortamentos de repetição, milhares de casais têm sido avaliados do ponto de

vista citogenético. Os resultados deste estudo apresentam uma ampla variação da frequência

das cromossomopatias, sendo exemplos extremos os valores de 0% e 50%. Esta diferença tão

acentuada será principalmente devida ao tamanho da amostra (o número de casais estudados foi

de 50 e 4, respectivamente) e também a consequência dos diferentes critérios de selecção dos

casais para estudo. De facto, alguns investigadores incluem casais com dois ou mais

abortamentos espontâneos ao passo que outros apenas consideram casais com o mínimo de três

abortamentos; para além disso, há quem integre casais com antecedentes de filhos nado-mortos

ou com malformações congénitas, independentemente do número de abortamentos.

Deste modo, múltiplas conclusões têm sido referidas, em alguns parâmetros com uma

tendência comum, embora quantitativamente diferentes. Concretamente, é inequívoco que a

frequência das anomalias cromossómicas é significativamente superior na população com

abortamentos de repetição do que na população geral (em cerca de 6-7% dos casais com

antecedentes de abortamentos de repetição um dos seus membros apresenta uma

cromossomopatia) e que as translocações recíprocas são mais frequentemente observadas do

que as translocações robertsoneanas (cerca de 3-4% versus 1-2%).

O predomínio significativo das translocações recíprocas sobre as robertsoneanas é

relevante se atendermos a que a incidência das duas na população geral é idêntica (0,8/1000).

Deste modo, e dado que a (in)capacidade reprodutiva é semelhante para as duas translocações,

a junção dos dados fornecidos pelo estudo europeu de colaboração (Boué e Gallano, l984) - em

que foram efectuadas 1356 amniocenteses precoces quando qualquer dos progenitores era

portador de uma anomalia cromossómica de estrutura, e que revelou uma frequência de

desequilíbrios cromossómicos fetais de 5,4% e 11,7 %, quando um dos membros do casal

possuía uma translocação robertsoneana ou recíproca, respectivamente - sugere um maior e/ou

mais precoce efeito da selecção natural sobre os desequilíbrios cromossómicos resultantes das

translocações robertsoneanas relativamente aos causados pelas translocações recíprocas.

Uma diferença notória encontrada frequentemente resulta dos polimorfismos

cromossómicos. Na realidade, é de assinalar a elevada percentagem obtida em alguns estudos

(cerca de 15% dos casais), muito distante dos resultados de outros trabalhos. Os diferentes

Page 65: Manual do estágio de RMA

65

critérios de interpretação, a maior ou menor utilização de técnicas citogenéticas não de rotina

(nomeadamente, as bandas C e a técnica NOR) e a valorização relativa do seu significado

etiopatogénico (em alguns estudos os polimorfismos não aparecem citados, o que é estranho

atendendo à sua incidência na população geral) podem explicar, pelo menos parcialmente, estas

variações.

Estas observações são a base da controvérsia existente à volta do significado dos

polimorfismos cromossómicos pois enquanto alguns autores não encontram diferenças

significativas na frequência destes na população geral e nos casais com abortamentos

espontâneos de repetição, muitos outros descrevem nestes últimos um aumento significativo de

polimorfismos, cujo hipotético mecanismo de acção será o de dificultar o emparelhamento

cromossómico e, consequentemente, facilitar a separação anormal dos cromossomas.

Da multiplicidade de resultados obtidos, alguns contraditórios, resumem-se

seguidamente alguns dos aspectos mais importantes:

! a relação directa entre o número de abortamentos espontâneos e a frequência de

anomalias cromossómicas encontrada por alguns (5,2% de cromossomopatias para os

casais com dois ou três abortamentos e 13,3% para os com um número igual ou superior a

quatro) é contrariada por outros, que não observam essa tendência.

! aumento da frequência de anomalias cromossómicas em casais que, para além dos

abortamentos espontâneos, têm antecedentes de filhos nado-mortos ou com

malformações congénitas - valor 3 vezes superior em relação aos casais apenas com

abortamentos espontâneos (16,7% e 5,4%, respectivamente).

! os casais com abortamentos de repetição possuem um maior risco de terem um filho com

malformações congénitas (18% dos recém-nascidos) comparado com a frequência na

população geral (3-4%).

! as alterações citogenéticas são mais frequentes nos casais que têm exclusivamente

perdas embrio-fetais do que naqueles com uma história mista de fracassos e sucessos

reprodutivos - 11,1% nos casais sem filhos e 2,1% nos que têm, pelo menos, um filho

normal.

! o cariótipo de linfócitos realizado aos casais com abortamentos de repetição tem permitido

a alguns autores demonstrar um aumento estatisticamente significativo de células

aneuplóides relativamente à população geral. O estudo de 145 casais permitiu demonstrar

que 2,9% dos elementos masculinos do casal eram mosaicos (com cerca de 20% de

células 45,X) assim como 10,3% das mulheres (portadoras de, aproximadamente, 20% de

linhas celulares 45,X e 47,XXX). Esta aparente tendência dos linfócitos para a aneuploidia

Page 66: Manual do estágio de RMA

66

nos indivíduos com abortamentos de repetição poderá não ser devida ao acaso mas, pelo

contrário, significar que a meiose e a mitose estão, pelo menos em parte, sob um

mecanismo comum de controle genético.

A imprescindibilidade do cariótipo é, porventura, o único ponto de indiscutível unanimidade

na problemática citogenética dos abortamentos de repetição. De acordo com os resultados

obtidos no Serviço de Genética e por muitos outros centros, a indicação do estudo cromossómico

impõe-se quando o número de abortamentos é igual ou superior a dois, dada a frequência

semelhante das anomalias cromossómicas, aparentemente não relacionada com o número de

abortamentos.

Após o diagnóstico de uma anomalia cromossómica em qualquer dos membros do casal,

ao médico é exigido informar tão clara e completamente quanto possível sobre as possibilidades

e riscos que corre o casal se persistir na sua intenção reprodutiva, tal como dos possíveis meios

de diagnóstico pré-natal. Deste modo, um dos fundamentos do conselho genético é transmitir ao

casal o risco teórico, baseado em dados empíricos, de se originar um ser cromossomicamente

anormal, e que pode manifestar essa anomalia como abortamento espontâneo, nado-mortalidade

e/ou malformações congénitas.

Consequentemente, o diagnóstico pré-natal (por biópsia do trofoblasto ou amniocentese)

adquire uma importância fundamental, tanto no esclarecimento das situações antes analisadas

como por poder também constituir um meio de evitar uma desnecessária interrupção voluntária

da gravidez. Esta perspectiva adquire um grande significado nas translocações robertsoneanas

entre homólogos, em que os gâmetas formados serão nulissómicos ou dissómicos dando origem

a produtos de concepção monossómicos ou trissómicos. Contudo, a já observada transmissão de

mãe para filha de uma translocação equilibrada entre cromossomas homólogos -t (22q;22q)-, faz

com que devamos ter sempre presente esta possibilidade, excepcionalíssima, originável por não-

disjunção, pós-zigótica ou na gametogénese, no outro membro do casal, e que pode

inclusivamente permitir o nascimento de um indivíduo cromossomicamente normal.

Em conclusão, a complexidade destes processos biológicos faz com que seja

imprescindível utilizar todos os métodos de diagnóstico disponíveis, não esquecendo também o

estudo citogenético do produto de abortamento ou feto morto, visando um conselho genético cada

vez mais rigoroso e fundamentado.

Page 67: Manual do estágio de RMA

67

IMPLICAÇÕES GENÉTICAS DAS TECNOLOGIAS DA REPRODUÇÃO

Diagnóstico Genético Pré-Implantação

Introdução

Um breve olhar histórico à intervenção médica conducente a resolver, por meios técnicos,

situações de infertilidade conjugal conduz-nos a 1770 (Londres), quando John Hunter realizou a

primeira inseminação artificial intraconjugal, e a 1884 (Filadélfia), altura em que Pancoast iniciou a

prática da inseminação artificial com esperma de dador. Estes métodos, de carácter rudimentar

porque traduziram apenas uma manipulação do esperma total e não dos espermatozóides, deram

origem à metodologia contemporânea em que é realizada a lavagem e a capacitação dos

espermatozóides com a posterior introdução na cavidade uterina (inseminação intrauterina).

A inseminação artificial intraconjugal tem indicações ainda indiscutivelmente actuais como as

malformações do pénis, impotência, ejaculação retrógrada, volume de esperma muito reduzido,

alterações moderadas do número, morfologia e motilidade dos espermatozóides, formação de

anticorpos anti-espermatozóides, muco cervical hostil e infertilidade de causa desconhecida. A

perspectiva de sucesso da inseminação artificial é de 10-15% por ciclo, valor que não constitui mais

do que um ponto de referência já que é inevitavelmente influenciado, entre outras variáveis, pelos

critérios de selecção dos casais.

A inseminação artificial com espermatozóides de dador tem actualmente indicações muito

mais restritas do que há pouco mais de meia década já que um enorme número de situações que

conduziam à sua aplicação como a azoospermia (ausência de espermatozóides no ejaculado) de

causa obstrutiva, muitas das azoospermias secretoras e as anomalias graves ou muito graves do

número, morfologia e motilidade dos espermatozóides têm uma consistente via de solução através

da microinjecção intracitoplasmática. De facto, as actuais indicações da inseminação artificial com

espermatozóides de dador circunscrevem-se às azoospermias secretoras em que a biopsia testicular

múltipla não permitiu encontrar espermatozóides ou espermatídeos alongados, às doenças génicas

em que não é possível fazer diagnóstico genético pré-implantação ou diagnóstico pré-natal, e às

situações consequentes ao tratamento cirúrgico, citostático ou com radiações ionizantes de

neoplasias malignas (em que não foi realizada previamente crioconservação do esperma em azoto

líquido).

A tentativa de resolução intraconjugal da infertilidade deu origem à realização da fertilização in

vitro (FIV), cuja grande motivação foi ultrapassar a impossibilidade de gravidar devido à obstrução ou

Page 68: Manual do estágio de RMA

68

à ausência bilateral das trompas. Rapidamente, a prática da FIV estendeu-se a outras indicações de

carácter ginecológico e também a situações em que a infertilidade era causada por alterações do

número, morfologia ou motilidade dos espermatozóides. Todavia, estas técnica não demonstrou

capacidade para resolver os numerosíssimos casos em que estas alterações assumiam um carácter

de significativa gravidade.

Neste contexto de incapacidade, surgiu a descrição das primeiras gestações após a

microinjecção de um único espermatozóide no citoplasma do ovócito (ICSI - Intracytoplasmic Sperm

Injection). A capacidade evidente da ICSI em conseguir taxas de fertilização e de gravidez elevadas,

quase que independentemente dos parâmetros dos espermatozóides presentes no ejaculado,

alargou a sua aplicação para os casos de azoospermia, o que permitiu as primeiras gestações com

espermatozóides obtidos directamente no testículo e no epidídimo e com espermatídeos (entidade

celular que, após diferenciação, dá origem aos espermatozóides).

A enorme expectativa criada pelos primeiros resultados levou-nos a iniciar em Portugal, em

meados de 1994, a prática da microinjecção intracitoplasmática, o que tem proporcionado a

resolução de muitas situações de:

1. Azoospermia obstrutiva: após colheita de espermatozóides a nível epididimário (MESA -

Microsurgical Epididymal Sperm Aspiration) ou por biopsia testicular (TESA - Testicular Sperm

Aspiration ou TESE - Testicular Sperm Extraction).

O potencial fecundante dos espermatozóides testiculares (ou do epidídimo) congelados faz com que

a crioconservação dos espermatozóides, em azoto líquido, seja uma prática de rotina para uma

eventual utilização posterior. A repetição da biopsia testicular antes de decorridos 6 meses pode

diminuir a possibilidade de colheita dos espermatozóides e aumenta o risco de desvascularizar

permanentemente algumas áreas testiculares.

2. Anejaculação (por causas psicogénicas ou por lesão medular): com colheita de espermatozóides

por electroejaculação com sonda endorectal. A lesão medular é uma causa de infertilidade

masculina por ocasionar problemas de erecção e, principalmente, de ejaculação (mais de 90% dos

indivíduos com lesões medulares (TXI-LII) não têm ejaculação, anterógrada ou retrógrada). A

qualidade dos espermatozóides obtidos com estimulação eléctrica endorectal é invariavelmente

baixa, com alterações graves ou muito graves do número, morfologia ou motilidade dos

espermatozóides, devido à própria electroejaculação ou à doença subjacente, pelo que, muito

frequentemente, não existem condições minimamente satisfatórias para a realização da inseminação

artificial ou da fertilização in vitro. A associação da electroejaculação e da ICSI permitiu-nos

descrever a primeira gravidez a nível mundial num caso de paraplegia resultante de um acidente com

uma arma de fogo. Nas situações em que a colheita do esperma dos paraplégicos com anejaculação

Page 69: Manual do estágio de RMA

69

é realizada com electroestimulação endorectal, a microinjecção intracitoplasmática é, muito

provavelmente, o tratamento de eleição, pela sua eficácia indiscutível e pela vantagem adicional de,

exigindo apenas um pequeno número de espermatozóides, permitir a congelação em azoto líquido

do esperma restante, em múltiplas fracções, o que evitará a necessidade de repetir a

electroejaculação. No caso de insucesso na colheita do esperma por estimulação eléctrica

endorectal, a ICSI permite ainda a possibilidade de gravidez após a injecção ovocitária de

espermatozóides obtidos por aspiração, epididimária ou testicular, ou por biopsia testicular.

3. Ejaculação retrógrada: com espermatozóides recolhidos na urina através de micção após

masturbação.

4. Anomalias do número, morfologia ou motilidade extremamente graves, que incluem situações

muito graves como a concentração de espermatozóides inferior a 2 mil por ml, e um caso em que

obtivemos a primeira gravidez mundial numa situação, de causa desconhecida, em que todos os

espermatozóides do ejaculado estavam imóveis.

5. Azoospermia secretora. Os doentes com azoospermia secretora - identificada por biopsia

testicular diagnóstica - podem ser submetidos a TESE-ICSI com o objectivo de, realizando uma

biopsia testicular bilateral múltipla, procurar encontrar um ou mais focos de maturação até

espermatídeos ou espermatozóides. A azoospermia secretora está associada a um risco significativo

de não se encontrarem espermatídeos ou espermatozóides na biopsia testicular múltipla pelo que

estes casais são colocados perante a alternativa da fertilização in vitro com espermatozóides de

dador.

Na Europa, iniciam-se anualmente mais de 200.000 ciclos de fertilização in vitro (FIV) ou de

microinjecção intracitoplasmática (ICSI), calculando-se que, a nível mundial, este número

ultrapassará significativamente os 500.000 ciclos. A taxa de sucesso destas técnicas é obviamente

variável em função de múltiplos parâmetros, considerando-se como referência a percentagem de

gravidez clínica por transferência de 25-30%. Nos países “desenvolvidos”, as crianças nascidas em

consequência destas metodologias de reprodução medicamente assistida (RMA) constituem 1-3% do

número global de recém-nascidos.

As preocupações sobre as possíveis consequências embrionárias, fetais, neonatais ou a longo prazo

da manipulação e da cultura laboratorial dos gâmetas ou dos embriões envolvem a incidência de

malformações congénitas em geral, a taxa de anomalias cromossómicas, as mutações do gene da

fibrose cística associadas com a ausência bilateral congénita dos canais deferentes e as

microdelecções do cromossoma Y, mas também os riscos de modificações da expressão génica e

Page 70: Manual do estágio de RMA

70

das características fenotípicas por factores epigenéticos nomeadamente por alterações do imprinting

genómico (factores epigenéticos: qualquer factor que pode afectar o fenótipo sem alterar o genótipo;

p.ex: modificações da metilação do DNA e/ou da estrutura da cromatina podem modificar a

expressão génica e as características fenotípicas).

Page 71: Manual do estágio de RMA

71

Problemas relacionados com a prática da microinjecção intracitoplasmática:

1- Possibilidade de uso da técnica em casos em que a infertilidade de causa tão grave é a expressão

de uma patologia genética subjacente.

Os riscos de natureza genética estão relacionados com:

- Patologia mendeleana: importância do estudo da árvore genealógica, procurando identificar uma

eventual etiologia hereditária para a infertilidade, e das técnicas de biologia molecular, para a

identificação génica. Exemplo importante é o da aplasia congénita bilateral dos vasos deferentes

(incidência: 1:5000 homens), que se encontra em 1-2% dos homens inférteis e em 5% dos casos

de azoospermia obstrutiva. É de destacar a heterogeneidade genética desta aplasia dos canais

deferentes: a maioria dos estudos familiares permitiram definir uma hereditariedade autossómica

recessiva, observando-se uma mutação do gene da fibrose cística em 60-66% destes indivíduos

que, com a excepção da aplasia, são saudáveis, mas também estão descritos casos que parecem

representar uma transmissão de tipo X-recessivo e autossómico dominante ligado ao sexo.

Questão pertinente: a possibilidade de transmissão para os descendentes do sexo masculino das

microdelecções em AZF constituirão uma contra-indicação para a realização da ICSI ?, e uma

indicação genética para a pré-determinação do sexo ?

- Patologia cromossómica: os casais com indicação para a ICSI têm um risco aumentado de serem

portadores de anomalias cromossómicas. Estudos citogenéticos mostraram uma incidência

aumentada de cromossomopatias na população masculina infértil (6,2%), observando-se que esta

incidência aumenta à medida que diminui o número de espermatozóides (valores de 2,0%, 8,0% e

15,1% para, respectivamente, as normo-, oligo- e azoospermias).

- Imprinting genómico: o imprinting genómico é um mecanismo de regulação da expressão génica

que permite apenas a expressão de um dos alelos parentais. Ao contrário da maioria dos genes

em que a expressão é bialélica, os genes que estão submetidos a este mecanismo (genes

imprinted) têm expressão monoalélica; por definição, num loci imprinted, apenas um alelo está

activo (materno ou paterno), e o inactivo está epigeneticamente marcado por modificação histónica

e/ou metilação das citosinas. No genoma humano, estão identificados cerca de 75 genes

imprinted. De um modo geral, os genes submetidos a imprinting encontram-se próximos ou

associados no genoma (domínios de imprinting) e a marca de imprinting consiste na metilação das

citosinas dos dinucleotídeos CG, em zonas do genoma em que a frequência deste dinucleotídeo é

elevada. Estas ilhas de dinucleotídeos encontram-se normalmente associadas ao promotor de um

gene, sendo que a sua metilação inactiva, em regra, a expressão desse gene. Estas alterações

epigenéticas ocorrem num dos alelos do gene imprinted, enquanto que o outro alelo permanece

Page 72: Manual do estágio de RMA

72

desmetilado e activo. Deste modo, o encontro dos dois alelos parentais, um metilado e outro não

metilado, na fertilização, vai permitir um desenvolvimento embrionário normal.

Existem duas fases de (re)programação epigenética. Numa fase inicial do desenvolvimento das

gónadas fetais, há uma desmetilação global de todo o genoma nas células germinativas

primordiais. Posteriormente, nas fases iniciais da gametogénese, há uma vaga de metilação

dependente do sexo embrionário (imprinting parental), que estará concluída em metafase II

(ovócitos) e em espermátide redonda. A outra fase ocorre durante o período de desenvolvimento

embrionário pré-implantação, verificando-se uma onda de desmetilação e remetilação dos

genomas materno e paterno - com excepção dos genes submetidos a imprinting que, por isso,

permanecem metilados.

A maioria dos genes submetidos a imprinting parental são genes essenciais para o

desenvolvimento normal do embrião e a sua expressão é iniciada no estadio de 6-8 células.

Os estudos epidemiológicos relacionando a ICSI e a FIV com alguns síndromes associados com

genes imprinted, como o de Beckwith-Wiedemann ou de Angelman, ainda não estabelecem uma

ligação causal. No entanto, a realização destas técnicas durante um período crítico para o

estabelecimento e a manutenção da informação epigenética, nos gâmetas e nos embriões numa

fase precoce do desenvolvimento, exigem a avaliação, imediata e a longo prazo, das crianças

nascidas, nomeadamente tendo em atenção as malformações congénitas, o desenvolvimento

físico e neuro-psíquico e a incidência de neoplasias malignas.

- Hereditariedade mitocondrial: a transmissão das mitocôndrias paternas presentes na peça

intermediária do espermatozóide não difere do que acontece na fertilização natural. As

mitocôndrias do espermatozóide (cerca de 75) desaparecem em 2 dias, pensando-se que por

degenerescência ou porque são eliminadas por proteólise (número de mitocôndrias do ovócito:

100.000 ou superior)

2- A infertilidade masculina tem uma causa idiopática em cerca de 60% dos casos.

3- A ICSI ultrapassa diversos passos que ocorrem durante a fertilização natural, tais como a ligação

dos espermatozóides à zona pelúcida, a penetração da zona pelúcida e a fusão das membranas

dos dois gâmetas. Todavia, a selecção a este nível faz-se contra os espermatozóides com

alterações morfológicas ou funcionais e não contra um espermatozóide geneticamente anormal.

4- Um conceito consensual é de que os parâmetros espermáticos não permitem estabelecer uma

relação directa, inequívoca, com a qualidade do DNA dos espermatozóides. Os estudos de

hibridização in situ com sondas de DNA específicas para cada cromossoma (Fluorescent In Situ

Hybridization – FISH -), realizados em espermatozóides morfologicamente normais e anormais,

permitiram obter resultados contraditórios: uns, que as anomalias cromossómicas per se não

Page 73: Manual do estágio de RMA

73

provocam alterações morfológicas ou funcionais dos espermatozóides e que os espermatozóides

morfologicamente anormais não têm uma maior probabilidade de serem portadores de anomalias

cromossómicas; outros, demonstraram um aumento significativo da frequência de aneuploidias

nos espermatozóides de indivíduos com oligoteratoastenozoospermias relativamente aos de

fertilidade normal (ex. 3,1% versus 0,84% e 19,6% versus 1,45%).

5- Activação mecânica do ovócito (pode induzir a partenogénese).

6- Perturbação física (pressão negativa através da micropipeta de fixação, picada e aspiração do

citoplasma) e bioquímica (exposição à hialuronidase e à polivinilpirrolidona -PVP-) do citoplasma

do ovócito, que pode interferir com a meiose e a mitose (pós-zigótica). A exposição à hialuronidase

deve ser cuidadosamente limitada no tempo (não deve exceder os 30 segundos) devido ao risco

de induzir a partenogénese. A análise das “sister-chromatid-exchange” demonstrou que o PVP não

causa alterações cromossómicas.

7- Selecção arbitrária do espermatozóide.

8- Possibilidade de injectar no ovócito DNA exógeno incorporado no espermatozóide. Os gâmetas

masculinos parecem ter uma capacidade espontânea de interiorizar DNA exógeno pelo que alguns

autores consideram que esta ocorrência pode ter estado implicada na transferência de informação

nova durante o processo de evolução natural; a aplicação exagerada da ICSI acelerará a evolução

humana?

9- Potenciais efeitos teratogénicos de algumas substâncias utilizadas, como o PVP e a pentoxifilina.

Um forte argumento contra a eventualidade deste efeito é a regra “tudo ou nada” da teratologia.

Argumentos a favor da incapacidade da selecção natural contra os espermatozóides com

anomalias génicas ou cromossómicas e a favor do conceito de que esta selecção ocorre

depois da fertilização do ovócito, durante o desenvolvimento embrionário e fetal:

1- O DNA do espermatozóide está altamente condensado e funcionalmente inactivo.

2- A observação das leis da hereditariedade mendeleana quando o gene patológico se transmite por

via paterna.

3- A observação de embriões, fetos e de recém-nascidos com aneuploidias resultantes de

segregações cromossómicas anormais durante a espermatogénese: o cromossoma

supranumerário tem uma origem paterna em 100% dos casos 47,XYY, 50% dos casos 47,XXY e

em 5% dos indivíduos com 47,XXX, trissomia 21 ou trissomia 13, enquanto a monossomia 45,X

tem uma origem paterna em 80% dos casos.

Page 74: Manual do estágio de RMA

74

4- A observação de embriões, fetos e de recém-nascidos cromossomicamente anormais, filhos de

homens portadores de translocações recíprocas ou robertsoneanas, em cuja espermatogénese

ocorrem segregações adjacentes I, II ou 3:1, significa que os espermatozóides portadores de

anomalias cromossómicas graves, de número ou de estrutura, têm capacidade fecundante. Em 31

translocações recíprocas estudadas através da fertilização dos ovócitos do hamster pelos

espermatozóides humanos, a frequência de espermatozóides cromossomicamente

desequilibrados variou entre 19 a 77%, em função dos cromossomas envolvidos, com uma média

de 54%. Esta frequência é muito superior aos 11,7% de fetos cromossomicamente anormais

registados no Estudo Europeu de Colaboração - em que foi realizado diagnóstico pré-natal às 14

semanas de gestação, por amniocentese, quando um dos progenitores era portador de uma

translocação recíproca ou robertsoneana. A explicação mais provável para esta diferença é a

acção da selecção natural pós-zigótica, com a consequente desvitalização de muitos dos embriões

com desequilíbrios cromossómicos. A hipótese da selecção sobre os espermatozóides é pouco

provável, já que se verificou a mesma frequência de fetos com desequilíbrios cromossómicos

(11,7%) independentemente da origem paterna ou materna da translocação.

5- O estudo cromossómico dos espermatozóides de homens comprovadamente férteis e com filhos

normais, usando a hibridização in situ (FISH), revelou que a frequência da não-disjunção meiótica

é aproximadamente a mesma para todos os cromossomas, autossomas ou cromossomas sexuais,

não havendo diferenças significativas em função da idade do homem, situando-se a taxa de

dissomia para cada um dos cromossomas entre 0,31 e 0,41: isto significa que cerca de 7,1 a 9,4%

dos espermatozóides da população masculina com fertilidade normal são portadores de um

cromossoma supranumerário. Outros trabalhos apontam para uma maior susceptibilidade dos

cromossomas X, Y e 21 para a não-disjunção durante a espermatogénese e também para a

relação entre a idade paterna e algumas dissomias (ex. dos cromossomas 1 e Y).

6- A observação de que a frequência de anomalias cromossómicas vai diminuindo ao longo do

desenvolvimento embrionário: recém-nascidos - 0,6% (foi observada uma incidência de 5% de

anomalias cromossómicas em abortamentos provocados, realizados à 17ª semana de gestação).

7- 98-99% dos embriões com anomalias cromossómicas terminam em abortamento espontâneo (ex.

100% das trissomias 16, 80% das trissomias 21, 99% dos 45,X) e 60% dos abortamentos

espontâneos apresentam anomalias cromossómicas.

8- Esta rigorosa selecção pré-natal, embrionária e fetal, não se aplica apenas sobre as anomalias

cromossómicas mas também sobre malformações de causa não-cromossómica:

Incidência ( / 1000 ) de malformações em embriões e em recém-nascidos

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Malformação 2º mês de gravidez RN Redução

Anencefalia 2.8 0.64 4.4x

Mielosquisis 3.0 0.21 14.3x

Hidrocefalia 7.3 0.33 22.2x

Ciclopia 6.2 0.06 103.3x

Lábio leporino 9.0 2.3 3.7x

Lábio leporino e fenda palatina 21.4 2.3 6.7x

Polidactilia 9.0 1.0 9.0x

Microinjecção intracitoplasmática - elementos empíricos:

1- A frequência de abortamentos espontâneos e de gémeos “rejeitados” é semelhante à observada

na FIV (as perdas embrionárias antes das 12 semanas são consideradas um bom indicador da

toxicidade embrionária e das anomalias genéticas).

2- Esta frequência semelhante de abortamentos espontâneos, independentemente da gravidez ter

resultado de ICSI ou FIV, verifica-se tanto para os abortamentos pré-clínicos (gravidez bioquímica)

como para os abortamentos clínicos (o modo mais precoce de diagnosticar uma gravidez clínica é

a observação ecográfica do embrião às 5-6 semanas de gestação).

3- A frequência de anomalias cromossómicas nos produtos de abortamento é semelhante à da FIV (a

maioria dos abortamentos do 1º trimestre têm uma origem genética).

4- Os resultados obstétricos das gestações consequentes à realização da ICSI são semelhantes aos

obtidos pela FIV, nomeadamente em relação ao peso dos recém-nascidos e à frequência de

gestações múltiplas, de recém-nascidos vivos e viáveis, de partos de pré-termo e da mortalidade

perinatal.

5- A frequência de malformações congénitas nos recém-nascidos resultantes da microinjecção

intracitoplasmática é semelhante à observada na população geral.

- Conclusões -

A intervenção terapêutica da microinjecção intracitoplasmática assume um relevo inquestionável, por

constituir a concretização do que esteve, até há pouco tempo, no domínio da utopia. A frequência

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significativa de anomalias cromossómicas e de microdeleções no cromossoma Y, sobretudo em

casos de azoospermia e de oligozoospermia grave, conduz à imprescindibilidade do estudo genético,

citogenético e molecular, e de aconselhamento genético, nomeadamente tendo em consideração a

possibilidade de realizar o diagnóstico genético pré-implantação e o diagnóstico pré-natal.

O carácter recente da aplicação da microinjecção intracitoplasmática não permite a existência de

dados suficientemente extensos para permitir conclusões definitivas sobre os seus riscos, pelo que:

1- A indicação terapêutica da ICSI deve ser muito criteriosamente definida, evitando que a sua

fantástica capacidade de resolver situações gravíssimas, sem solução até o advento da

microinjecção, condicione uma tendência precipitada e imprudente à sua prática generalizada.

2- Antes de iniciar um ciclo de ICSI está indicado realizar o cariótipo aos dois membros do casal, bem

como o estudo molecular do cromossoma Y (nos casos de oligozoospermia grave ou azoospermia

secretora) ou da fibrose cística (na azoospermia obstrutiva), com o objectivo de identificar uma

eventual infertilidade de causa genética para o consequente aconselhamento genético

3- O aconselhamento genético do casal deve incluir a abordagem das indicações e riscos do

diagnóstico pré-natal.

4- A gestação deve ser considerada de alto risco, atendendo à infertilidade subjacente e por ter sido

alcançada através da ICSI, pelo que a monitorização materno-fetal assume um relevo ainda mais

significativo (rastreio bioquímico, ecografia fetal de alta-resolução às 10-12 e às 18-22 semanas de

gestação,...).

5- É necessária a avaliação, imediata e a longo prazo, das crianças nascidas, nomeadamente tendo

em atenção as malformações congénitas e o desenvolvimento físico e neuro-psíquico.

- Diagnóstico Genético Pré-Implantação -

Diagnóstico genético pré-implantação (DGPI): método muito precoce de diagnóstico pré-natal para os

casais com um elevado risco de transmissão de patologia génica ou cromossómica; evita a

implantação de embriões anormais; a selecção embrionária in vitro “elimina” a necessidade de uma

futura interrupção de gravidez.

Argumento importante a favor da sua realização: a obrigação de prevenir a doença genética e o seu

impacto em gerações futuras.

Posição incompreensível: em alguns países é ilegal mas é possível realizar diagnóstico pré-natal (ex:

amniocentese) e interromper a gravidez ...

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Realizado apenas num número limitado de centros em todo o mundo - razão principal: a necessidade

de combinar as tecnologias de micromanipulação gamética e embrionária no âmbito da reprodução

medicamente assistida com as de PCR (Polymerase Chain Reaction) ou FISH (Fluorescent In Situ

Hybridization) em célula única.

Metodologias:

- após a biopsia do 1º e 2º glóbulo polar (permite o despiste de mutações ou aneuploidias maternas,

tem a vantagem de ser eticamente mais aceitável para muitos mas tem vários inconvenientes: não

permite diagnosticar doenças autossómicas dominantes transmitidas pelo homem, não-disjunções

paternas, mosaicismos ou o sexo do embrião, e, nas doenças autossómicas recessivas, apenas se

transferirão 50% dos embriões e não 75%),

- após a obtenção de embriões por microinjecção intracitoplasmática: através da biopsia de

blastocistos (permitirá retirar até cerca de 10 células da trofoectoderme mas tem limitações: apenas

cerca de 40-50% dos embriões chegam a blastocisto e o material genético pode divergir

geneticamente da massa celular interna, de onde resultará o feto) ou, na esmagadora maioria dos

centros, após a remoção (biopsia) de uma ou duas células (blastómeros) de embriões no seu terceiro

dia de desenvolvimento (número total de células variável entre 6 e 12) e posterior diagnóstico de uma

patologia génica (por PCR) ou cromossómica (por FISH), tendo como objectivo a transferência de

embriões geneticamente normais no que respeita à patologia estudada.

Indicações fundamentais do DGPI: doenças génicas, diagnóstico de aneussomias quando um dos

progenitores é portador de uma translocação recíproca ou robertsoneana, identificação do sexo,

diagnóstico de aneuploidias e prevenção da recorrência da doença neoplásica do trofoblasto.

A principal limitação desta técnica reside no facto de apenas uma ou duas células poderem ser

retiradas do embrião pelo que o rigor diagnóstico não pode ser igual ao permitido pelo diagnóstico

pré-natal realizado por amniocentese (cerca das 16 semanas de gravidez). Por este motivo, embora

o risco de erro diagnóstico seja baixo, há a opinião generalizada de que o diagnóstico pré-natal por

amniocentese (ou por biopsia das vilosidades coriónicas) é recomendável em todos os casos. Outra

limitação, questionável, do DGPI é a eventual diminuição da taxa de gravidez por ciclo de

microinjecção intracitoplasmática (taxa global publicada pela Sociedade Europeia de Reprodução

Humana e Embriologia - ESHRE PGD Consortium Data, 2007: 25 %).

Estas limitações não são motivo para que não se perspective um aumento crescente da prática do

diagnóstico genético pré-implantação, nomeadamente porque permite a redução das interrupções de

gravidez consequentes ao diagnóstico de patologia fetal e também pelo facto de não haver aumento

da incidência de malformações congénitas nas gestações em que o DGPI foi realizado.

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INFERTILIDADE CONJUGAL

AVALIAÇÃO DO FACTOR MASCULINO

Introdução

A infertilidade conjugal não tem sido tema frequente nas revistas médicas, nem nas

reuniões entre Urologistas e muito menos no programa dos alunos de Medicina. Este

desinteresse tem tido consequências

nefastas porque os avanços importantes que, nos últimos anos, se conseguiram neste campo não

mereceram grande divulgação. Este esquecimento reveste-se de maior gravidade quando se

verifica que a infertilidade é uma patologia muito frequente atingindo 15% dos casais em idade

reprodutiva havendo, ainda, mais 10% que têm menos filhos que o desejado. Esta alta incidência,

com indícios de estar a aumentar, começa a transformar esta patologia num preocupante

problema de saúde pública.

Infertilidade Conjugal, por factor masculino

A infertilidade conjugal é definida como a impossibilidade de um casal obter uma gravidez

após um ano de relações regulares e desprotegidas. Assim, entende-se que um casal infértil deve

iniciar o estudo a partir destes 12 meses, podendo este período ser antecipado se a mulher tiver

mais de 35 anos ou se houver história de patologia anterior do factor masculino ou feminino.

A idade do homem tem um interesse muito relativo, pois o testículo mantém uma

capacidade de produzir espermatozóides férteis praticamente desde o início da puberdade até à

morte. A atestar a veracidade desta afirmação estão os inúmeros exemplos de figuras conhecidas

que foram pais biológicos em idade tardia. Pelo contrário, a idade da mulher é um factor muito

importante, afectando de maneira negativa a sua capacidade reprodutora. Este ciclo biológico,

limitado no tempo, põe um problema importante na mão de todos os médicos. Hoje, é normal os

casais recorrerem à anticoncepção até tarde e quando programam a sua primeira gravidez a

mulher tem frequentemente entre 32 a 35 anos. Se ocorre um problema de infertilidade conjugal,

o casal entra em pânico e procura ajuda rápida, muitas vezes sem o conhecimento da sua própria

família. Os médicos que vão iniciar estes estudos devem estar preparados para

orientar bem o casal, caso contrário podem-se causar perdas de tempo

irreparáveis.

O estudo inicial de um casal infértil deve contemplar a avaliação simultânea do homem e

da mulher. É importante que o casal seja considerado como uma unidade durante o estudo e o

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tratamento. Durante muitos anos cometeu-se um erro grave ao pensar que as causas da

infertilidade eram quase todas devidas ao factor feminino. Este esquecimento do homem levou a

atrasos no diagnóstico e provocou sacrifícios desnecessários a muitas mulheres. A situação

actual mostra-nos que as causas da infertilidade estão repartidas em partes iguais devendo, por

isso, o início do estudo ser simultâneo. Mesmo quando há conhecimento de patologia antiga da

mulher ou o homem tem um filho de um casamento anterior, a avaliação tem sempre de recair

sobre os dois.

Como se deve iniciar o estudo do homem?

Pela história clínica, exame físico e meios auxiliares de diagnóstico (espermograma).

História Clínica

Deve ser bem colhida e contemplar todos os incidentes a partir do momento da concepção.

Doenças e medicações da mãe durante a gravidez podem ser a causa de muitas alterações que

irão ser encontradas na vida adulta. Também, as exposições pré-natais a químicos ambientais

podem ter graves consequências no aparelho reprodutor masculino. Provavelmente, secundário a

estes efeitos, está a aparecer em alguns países mais industrializados, um aumento de anomalias

do aparelho genital masculino: hipospádias, criptorquidias, micropénis, tumor do testículo e

alterações da qualidade espermática. As doenças da infância, principalmente as localizadas ao

nível das gónadas ou as cirurgias ao nível do cordão espermático, podem ter consequências

nefastas. É importante saber se os testículos ao nascer estavam nas bolsas ou pelo contrário se

havia história de criptorquidia (unilateral ou bilateral) e a que idade foi feita a sua correcção.

A existência de orquites ou orquiepididimites é um factor negativo. São muito populares as

orquites pós papeira que tantas infertilidades provocaram, pois muitas vezes eram bilaterais e

levavam a fibrose testicular. Felizmente, hoje em dia, com a obrigatoriedade da vacina da

parotidite, essa situação é bastante rara.

Outra situação dramática e que continua a levar á infertilidade por atrofia total do testículo

é a torção do cordão espermático. Esta é uma das maiores emergências cirúrgicas urológicas. O

seu diagnóstico diferencial com a orquite é muito difícil ocasionando frequentes causas de erro.

Por este motivo sugere-se que, numa criança, adolescente ou até adulto jovem, uma dor escrotal

súbita deve ser sempre considerada uma torção e como tal referenciada rapidamente a um

serviço de urgência.

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Toda a cirurgia inguinal na criança deve fazer suspeitar de lesão na vascularização do

testículo ou de secção acidental do canal deferente.

As estruturas do cordão, por nesta idade serem demasiado finas, impõem que esta cirurgia

só deverá ser efectuada por urologistas ou cirurgiões pediátricos com treino na área, para se

evitarem lesões irreparáveis. Temos encontrado em casos de cirurgia inguinal bilateral situações

de azoospermia obstrutiva por secção bilateral dos canais deferentes!!!

Outra situação importante na história é o conhecimento das profissões exercidas, bem

como o tempo de actividade e os produtos contactados. Todo o homem exposto a temperaturas

elevadas pode apresentar depressão marcada na espermatogénese.

Numerosas substâncias químicas, manipuladas ou inaladas podem causar alterações

espermáticas severas ou levar mesmo à azoospermia. Os trabalhadores das indústrias dos

plásticos contactam com produtos altamente gonadotóxicos.

Os herbicidas e os pesticidas quando usados sem precaução e em larga escala causam

também grave lesão na espermatogénese. Há, actualmente, milhares de substâncias produzidas

pela indústria química e denominadas disruptores endócrinos para as quais nunca foi avaliada a

sua gonadotoxicidade no homem. É necessário não esquecer os efeitos secundários das

medicações usualmente utilizadas, pois há vários fármacos que têm efeitos deletérios na função

espermática: os bloqueadores dos canais de cálcio, a cimetidina, a colchicina, a sulfasalasina, a

ciclosporina, a espironolactona, a eritromicina, a nitrofurantoina, os anti-androgénios, são alguns

deles.

Outros produtos, quase sempre negligenciados e que cada vez assumem maior

importância, pela frequência com que são utilizados, são os esteróides anabolizantes. Estes

produtos são consumidos de maneira quase rotineira, por todos aqueles que fazem musculação e

querem desenvolver rapidamente maior massa muscular. Para os utilizadores, os resultados

alcançados fazem esquecer o grave malefício que causam. Estes produtos provocam um

profundo declínio na contagem espermática ou mesmo azoospermia que pode ser difícil de

reverter mesmo após cessação do esteróide. Na história é importante o registo de antecedentes

de traumatismo do testículo, nomeadamente em acidentes com veículos de duas rodas, ou em

desportos de contacto.

Por último é essencial o registo de eventuais tratamentos com quimioterapia ou

radioterapia. Os tumores do testículo e as doenças de Hodgkin são muito frequentes nesta faixa

etária. Hoje, os grandes avanços na terapêutica destas doenças permitem uma cura superior a

95% dos casos. Infelizmente, as consequências do tratamento são nefastas para o testículo, pois

destroem as células germinativas e conduzem a azoospermias, que poderão ser definitivas.

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Para evitarmos um doente curado e definitivamente infértil, é fundamental que antes destes

tratamentos seja oferecida a possibilidade de se realizar a criopreservação de esperma.

Exame Físico

Deve ser orientado para os caracteres sexuais primários e secundários. A palpação dos

genitais externos é a parte mais importante de todo o exame.

O doente deve ser examinado de pé e num gabinete com temperatura agradável para se

evitarem contracções do cremaster com consequentemente subida do testículo. Como registo

inicial é importante termos o peso e altura. Situações de peso exagerado desde a adolescência e

mantidas na vida adulta estão muitas vezes associadas a uma hipotrofia testicular e

consequentemente a uma diminuição da espermatogénese. Isto pode acontecer porque na

gordura periférica a testosterona sob a acção da aromatase passa a estradiol, levando a uma

diminuição da testosterona disponível. O tratamento definitivo passa sempre pela correcção do

peso.

A rarefacção da barba e do pêlo púbico apontam para situações de hipoandrogenismo. A

ginecomastia, quando presente e fora de uma obesidade excessiva, deve fazer pensar em tumor

secretor de estrogénios, medicações ou se associada a testículos pequenos e duros sugere o

diagnóstico de síndroma de Klinefelter. É fundamental a determinação do volume testicular, sua

localização e consistência.

Os testículos, ao nascer, devem estar nas bolsas e aí devem permanecer pela vida fora. A

temperatura no saco escrotal é 2 a 3 graus inferior à temperatura do corpo, sendo este o factor

essencial para uma boa espermatogénese. A produção de espermatozóides começa no início da

adolescência e coincide com a libertação da testosterona pelas células de Leydig.

O volume testicular está de algum modo relacionado com a produção de espermatozóides.

Os testículos adultos têm em média 20 ml. Um médico treinado consegue, pela palpação,

determinar o volume aproximado. Quem não tiver essa experiência pode recorrer a aparelhos

próprios para esse fim. Um testículo diz-se atrófico quando o volume é inferior a 6 ml e hipotrófico

quando o volume está entre 6 e 15 ml.

Na parte posterior do testículo e praticamente colado a ele está o epidídimo. É aqui onde

os espermatozóides, saídos do testículo, permanecem cerca de 12-15 dias para completarem o

seu processo de maturação. No exame físico é importante a pesquisa de indurações ou de

dilatações da cabeça do epidídimo que quase sempre apontam para patologia obstrutiva.

A presença dos canais deferentes deve ser sempre procurada. O canal deferente é fácil de

ser detectado ao exame físico pois aparece-nos, à palpação, como uma estrutura dura e roliça

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que se localiza na parte posterior do cordão. A sua ausência, associa-se quase sempre a outras

anomalias genéticas a nível das vesículas seminais e renais. Estes doentes têm todos uma

azoospermia e muitos deles apresentam mutações ao nível do gene da fibrose cística(CFTR). Na

palpação dos genitais externos deve ser dada particular atenção à presença de varicocelo, pois

este diagnostica-se em cerca de 30-40% dos inférteis, enquanto que na população geral não

ultrapassa os 15%.

Apesar de tudo, a relação entre varicocelo e infertilidade permanece controversa, devendo

a sua correcção ser ponderada com o casal e tendo em consideração a idade da mulher e a

existência de patologias associadas. O varicocelo deve-se a um refluxo de sangue venoso da

veia espermática interna e que origina dilatações varicosas a nível do plexo pampiniforme. Dado

o grande comprimento desta veia à esquerda faz com que o varicocelo praticamente só se faça

sentir desse lado. O seu diagnóstico é essencialmente clínico; com o doente de pé, a palpação da

bolsa escrotal transmite-nos a sensação de um "saco de vermes". Se há dúvida, pede-se ao

doente para fazer a manobra de Valsalva e estas varicosidades aumentam ou pede-se para se

deitar e elas praticamente desaparecem. As causas pelas quais o varicocelo provoca infertilidade

ainda não estão bem esclarecidas ( aumento da temperatura, congestão venosa, toxinas das

supra-renais, … e mais recentemente aponta-se o aumento da fragmentação do DNA

espermático).

Estudo Laboratorial

No estudo inicial de todo o casal infértil é obrigatória a realização de um espermograma.

Este exame ainda hoje permanece como o teste mais importante na avaliação inicial do homem.

Ele examina a quantidade e a qualidade do esperma, dando-nos indicações sobre o estado

funcional dos testículos e via seminal.

A sua importância é capital pois poderá decidir a orientação futura do casal. Se o exame é

normal justifica-se investir profundamente no estudo da mulher; se o exame está alterado,

sugere-se que passados 3

meses (tempo que demora uma espermatogénese) seja repetido. Se este confirmar a anomalia

anterior, o doente deverá ser enviado a uma consulta de Urologia /Andrologia para estudos mais

aprofundados.

A importância deste exame, implica que a sua execução seja realizada em laboratórios

especializados e segundo as normas da OMS. Na maioria das vezes isso não acontece, o que é

muito perigoso, pois a má

qualidade tem tendência a considerar normal um exame que doutro modo apresentaria

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anomalias. Actualmente, a má realização dos espermogramas ainda permanece como uma das

causas que origina atraso no estudo do homem.

Outra causa para o atraso do estudo do homem é a má interpretação dos resultados. O

espermograma tem de ser avaliado nos seus vários parâmetros: Volume do ejaculado, número de

espermatozóides por mililitro, motilidade e morfologia (percentagem de espermatozóides

normais). Só será considerado normal o exame que tiver todos os parâmetros normais, pois basta

um estar alterado para o exame ser considerado

anormal.

A leitura de um espermograma normal deve apresentar os seguintes valores:

! Número de espermatozóides por mililitro > 20 milhões

! Motilidade rápida e muito rápida > 25%

! Morfologia > 14% de espermatozóides normais( critérios estritas de Kruger).

! Hipoosmolaridade > 50%

! Vitalidade > 50%

! Leucócitos < 1 milhão

! Sem fenómenos de aglutinação

Se um destes parâmetros estiver alterado o exame será considerado anormal, embora

quase sempre a anomalia não se confine apenas a uma alteração. Se tivermos uma diminuição

do número de espermatozóides por mililitro falaremos em oligozoospermia; uma diminuição da

morfologia é uma teratozoospermia e a diminuição da motilidade é uma astenozoospermia.

Quando há uma imotilidade total ou quase total mas com boa viabilidade devemos pensar em

síndroma dos Cílios Imóveis ou,

se associado a dextrocárdia, síndroma de Kartagener.

A situação mais frequente é uma associação das três anomalias e falaremos em

oligoastenoteratospermia. Quando não existem espermatozóides no ejaculado estamos perante

uma azoospermia

Esta situação é sempre bastante embaraçante para o casal, pelo que a primeira função do

clínico é tranquilizá-los e esclarecê-los.

Actualmente, esta situação não significa impossibilidade total de engravidar, pelo que o

doente deverá, em primeiro lugar, ser avaliado no sentido de se esclarecer que tipo de

azoospermia está presente: Ou é uma azoospermia obstrutiva, situação em que existe uma

espermatogénese normal, sendo a ausência de espermatozóides no ejaculado causada por uma

obstrução ou por ausência congénita dos canais excretores. É, portanto, um problema

mecânico. Nestes casos é sempre possível colher espermatozóides no testículo ou epidídimo e

através da injecção intracitoplasmática (ICSI) conseguir uma gravidez ou então, sempre que

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possível, corrigir cirurgicamente a obstrução e possibilitar uma gravidez espontânea.

Ou é uma azoospermia não obstrutiva onde há um pior prognóstico. A via excretora está toda

permeável, mas há uma falência do testículo, ocasionando uma ausência ou uma alteração grave

da espermatogénese.

Naqueles doentes em que há um hipogonadismo hipogonadotrófico congénito, como é o caso do

Síndroma de Kallman pode-se iniciar um tratamento médico e por vezes consegue-se induzir uma

pequena

espermatogénese. Nas situações de hipogonadismo hipogonadotrófico adquirido a situação é

muito mais fácil, pois a substituição das gonadotrofinas faz rapidamente reiniciar a

espermatogénese. Nos casos de hipogonadismo hipergonadotrófico, como é o caso muito

frequente do síndroma de Klinefelter, só há lugar para medicações, se a testosterona estiver

baixa. Quando estes doentes apresentam uma azoospermia no ejaculado, por vezes consegue-

se colher espermatozóides testiculares através de uma biopsia testicular aberta (Tese).

Nas situações de hipoespermatogénese, paragem da maturação ou síndroma "Só células

de Sertoli" embora não se encontrem espermatozóides no ejaculado, por vezes existem

pequenos focos de espermatogénese e através de biópsias múltiplas e bilaterais, é possível

colher espermatozóides do testículo e através da ICSI conseguir-se uma gravidez.

Conclusão

A infertilidade está a aumentar e tornar-se-á num grave problema de saúde pública.

Estima-se que os 15% de casais inférteis passarão para 30% no ano de 2015, causando uma

acentuada diminuição da população europeia. Para tratar este grave problema temos de contar

com a dedicação de muitos especialistas mas também com a colaboração de todos os médicos

de família. Para muitos destes a preparação deverá começar na Faculdade. Só com jovens

médicos sensibilizados para este problema poderemos conseguir mais sucesso na prevenção e

uma orientação mais precoce destes casais.

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Gostaria de agradecer a todos os que contribuíram na elaboração deste manual.

Em particular ao Dr. Mário de Sousa, ao Dr. Luís Ferraz, ao Dr. Pedro Xavier e ao Dr.

Alberto Barros pela cooperação e disponibilidade sempre demonstrados no decorrer da

elaboração do Manual do Estágio de RMA, que se mostraram certamente imprescindíveis e

cruciais.

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