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Maria de Fátima Pessoa Capistrano
PAPEL DA LOCALIZAÇÃO DA CARGA EM DETERMINAÇÃO
DOS PARÂMETROS DO CANAL IÔNICO
Tese apresentada ao Programa de pós-
Graduação em Ciências da Saúde da
Universidade Federal do Rio Grande do
Norte, como requisito para obtenção do
Título de Doutor em Ciências da Saúde.
Natal, 2007
Maria de Fátima Pessoa Capistrano
PAPEL DA LOCALIZAÇÃO DA CARGA EM DETERMINAÇÃO
DOS PARÂMETROS DO CANAL IÔNICO
Tese apresentada ao Programa de pós-
Graduação em Ciências da Saúde da
Universidade Federal do Rio Grande do
Norte, como requisito para obtenção do
Título de Doutor em Ciências da Saúde.
Orientador: Prof. Dr. Oleg Vladimirovic
Krasilnikov
Natal, 2007
2
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde:
Prof. Dr. Aldo da Cunha Medeiros
3
PAPEL DA LOCALIZAÇÃO DA CARGA EM DETERMINAÇÃO DOS
PARÂMETROS DO CANAL IÔNICO
Presidente da Banca Examinadora
Prof. Dr. Oleg Vladimirovic Krasilnikov – UFPE
Banca Examinadora:
Prof. Dr. José Brandão Neto - UFRN
Prof. Dr. Cláudio Gabriel Rodrigues – UFPE
Prof. Dr. Artur da Silva Carriço - UFRN
Prof. Drª. Regina de Fátima dos Santos Braz - UFRN
Aprovada em 05 de novembro de 2007
4
DEDICATÓRIA
A Deus, pelo dom da vida, pelo presente da
liberdade, pela benção da inteligência, por se fazer presente em todos os momentos de
minha vida, cabe a ele o louvor e a gloria, e a mim cabe agradecer
A meus pais ( in memorian)
A minha família
5
Maria de Fátima Pessoa Capistrano
Feliz o homem que acha sabedoria e o
homem que adquire conhecimentos.
Provérbios 3: 13
6
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador Prof. Dr. Oleg V. Krasilnikov, pela amizade, compreensão, dedicação
e competência na orientação cientifica que tanto influenciou na minha formação
profissional culminando com a confecção deste trabalho, e a quem serei eternamente
grata.
Ao Prof. Dr. José Brandão Neto, pela ousadia de criar um programa de capacitação
multidisciplinar enfrentando todas as dificuldades para dar oportunidade de capacitação
aos docentes desta instituição.
Ao Dr. Peter Merzlyak pela amizade e ensinamentos científicos que contribuiu de forma
decisiva à realização deste trabalho.
A minha amiga Dra. Lilyia Yuldasheva, pelo incentivo, compreensão e apoio nos
momentos difíceis.
Ao Departamento de Biofisica e Radiobiologia da UNIVERSIDADE FEDERAL DE
PERNAMBUCO, pela valiosa acolhida.
Ao laboratório de Biofísica das Membranas do Departamento de Biofísica e Radiobiologia
da UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO. Por ter proporcionado todas as
condições necessárias e favoráveis à realização deste trabalho.
7
Aos amigos do laboratório de Biofísica das Membranas da UNIVERSIDADE FEDERAL
DE PERNAMBUCO, e em particular ao Prof. Dr. Cláudio Gabriel e Profa. Dra. Paloma
Medeiros, pela amizade, apoio e incentivo durante a realização deste trabalho.
Ao Departamento de Biofísica e Farmacologia da UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO
GRANDE DO NORTE e em particular aos colegas que assumiram minhas atividades
acadêmicas no período de meu afastamento.
A todos aqueles que de forma direta ou indireta contribuíram para execução deste
trabalho, a minha eterna gratidão.
8
SUMÁRIO
1.0 Introdução 1
2.0 Objetivos 4
3.0 Revisão da literatura 5
3.1 Canais iônicos 5
3.2 Propriedades funcionais dos canais iônicos 6
3.3 Alfa-hemolisina (α-HL) do Staphylococcus aureus 9
4.0 Anexação dos artigos publicados 14
4.1 Artigo 1 – Conductance and ion Selectivity of a Mesoscopic
Protein Nanopore Probed With Cysteine Scaning Mutagenesis.
15
5.0 Comentários, críticas e conclusões 27
6.0 Anexo 37
6.1 Outras publicações- Protein electrostriction: a possibility of
elastic deformation of the α-hemolysin channel by the applied
field
38
6.2 Participação em congresso 48
7.0 Referencias bibliográficas 59
Abstract 68
9
LISTA DE ABREVIATURAS
α-HL – Alfa Hemolisin do Staphylococcus aureus
DTT – Ditriton
EXP – expressão
AGR – Acessório regulador do gene
Cys – Cisteína
GV – condutância-voltagem
SH – sulfidrila
Na+ - sódio
K+ - potássio
Ca++ - Cálcio
Copa – parte do canal que protubera da membrana para o lado extracelular.
tronco – parte do canal que esta inserida dentro da membrana.
G130C – Substituição de uma Glicina por uma Cisteina na posição 130 da estrutura
primária da α-HL.
10
RESUMO
Para investigar as influências das cargas sobre as propriedades do canal formado pela α-
HL do Staphylococcus aureus, foi empregada a técnica de “Escaneamento Mutagenese da
Cisteína”. Vinte e quatro mutantes foram produzidos a partir da substituição de um
único aminoácido da estrutura primária da proteína α-HL pela cisteína, em várias
posições. As alterações eletrofisiológicas, em decorrência dessa modificação, foram
analisadas, após a incorporação do canal mutante em bicamada lipídica plana. As
proteínas modificadas foram investigadas na ausência e na presença de reagentes
específicos para sulfidrila, visando introduzir uma forte carga positiva ou negativa na
posição da substituição. A introdução de uma carga negativa, na região “troncular”
(parte trans do poro) do canal formado pela α-HL, converteu a seletividade do canal de
pouco aniônico para mais catiônico, entretanto a introdução de uma carga positiva
aumentou, sua seletividade ao anion. A intensidade dessas alterações foi inversamente
dependente do raio do poro na posição da carga introduzida. Quanto ao parâmetro
assimetria da dependência da condutância-voltagem, a influência da carga foi mais
complexa: a incorporação de uma carga negativa na região “troncular” induziu aumento
da assimetria, já a incorporação à região “copal” (parte cis do poro) provocou uma
diminuição. A intensidade destas alterações dependeu do raio, do tipo da carga móvel
introduzida sobre o eixo longitudinal do canal, sendo maior nas posições das cargas
próxima das entradas do poro. Esses resultados sugerem que a carga livre que reveste a
parede do lume do poro seja responsável pela seletividade cátion-anion do canal.
Considerando que a distribuição das cargas entre as entradas seja fundamental, para
determinar a assimetria da curva de dependência condutância-voltagem. Nós esperamos
que esses resultados sirvam de modelo para estudos com outros canais de dimensões
11
nanométricas, em membranas biológicas ou bicamadas lipídicas planas e para aplicações
biotecnológicas.
palavras chaves: canais iônicos; alfa-hemolisina; seletividade; Staphylococcus aureus.
12
1 – INTRODUÇÃO
Há varias décadas, são realizados estudos estruturais sobre proteínas de
membrana. Estes estudos têm produzido uma revolução no entendimento das bases
fundamentais de muitos processos biológicos.
Uma das mais importantes classes dessas proteínas de membrana são os
canais iônicos. Estes canais são responsáveis por funções de transdução de informações
entre os meios intra e extracelular, bem como entre células, permitindo, por exemplo, a
execução de funções tais como: a propagação de informações no sistema nervoso, tecido
muscular, órgãos sensoriais, entre outros, indispensáveis a vida (Kandel et al, 2000;
Kuffer e Nicholis, 1982; Zigmond et al., 1999).
Estruturalmente o canal iônico pode ser formado por uma ou várias
moléculas de proteínas que dão origem a uma via hidrofílica, atravessando toda a
espessura da membrana, permitindo a passagem seletiva de íons através da barreira
apresentada pela bicamada lipídica (Smart et al., 1996) e, assim, contribuindo
decisivamente para a homeostase celular.
O canal iônico apresenta mudanças conformacionais em sua estrutura
protéica, podendo ser encontrado basicamente em pelo menos dois estados “fechado” e
“aberto”, neste último permite a passagem de aproximadamente 107 íons s-1 (Hodgkin e
Husley, 1952), regulando o fluxo de íons permeantes através da membrana celular. Estes
movimentos de íons constituem uma corrente elétrica que pode ser medida por técnicas
adequadas de registro, como: fixação de voltagem (Neher e Sakmann, 1976 a,b) e “patch-
clamp”. Portanto, medindo-se essa corrente pode-se observar a atividade de um único
13
canal na membrana celular e, assim, extrair-se informações acerca das mudanças
conformacionais da proteína ou do complexo molecular, que forma o canal iônico (Hille,
1992; Neher e Sakmann, 1976 a,b).
Estudos das propriedades funcionais dos canais iônicos, tais como:
seletividade, permeabilidade, condutância, dependência condutância–voltagem, bem
como a base molecular das propriedades destes canais, têm sido intensamente estudados.
Mas alguns aspectos continuam obscuros, como a função de resíduos carregados ao longo
do lume do canal aquoso. Desse modo, objetivando aprofundar os conhecimentos destas
propriedades, empregamos o canal unitário aniônico, formado pela α-HL do
Sthafilococcus aureus como modelo, por ter um poro de estrutura já bem conhecida,
apresentar maior facilidade de obtenção em relação aqueles de células excitáveis e muito
utilizados para fins de aplicações biotecnológicas (Astier et al., 2005; Braha et al., 1997;
Kasianowicz et al., 2001; 2004; Krasilnikov et al., 1990).
A descoberta da α-HL como proteína formadora de canais foi
primeiramente realizada por Krasilnikov et al., (1980-1981) quando em seus trabalhos
relataram a formação de canais iônicos em membranas lipídicas planas Fussle et al.,
(l98l) observaram a formação de estruturas anelares 12S da α-HL sobre lipossomos e
eritrócitos, a qual era composta da toxina oligomérica que pareciam formar canais
transmembrana.
Estudos mais recentes mostraram que a formação do poro ocorre quando
os monômeros da α-HL, ligados à membrana interagem, oligomerizando-se, formando
complexos protéicos anfifílicos de estrutura anelar, composta de sete idênticos
monômeros (Bakadi et al. 1993; Song et al. 1996).
14
Para esclarecer a importância da carga ao longo do meio aquoso do
canal, o gene que codifica a α-HL do Staphylococcus aureus foi submetido a mutagênese
sítio-dirigida para mudança de um único aminoádo pela cisteína em diferentes posições
da proteína. As moléculas-mutantes da toxina foram utilizadas para formar canais
iônicos em bicamadas lipídicas planas. Atualmente a mutagênese é muito utilizada no
estudo dos canais iônicos mais a influência da localização dos resíduos carregados ao
longo do meio aquoso do canal ainda carece de elucidação.
Para investigar esses aspectos do canal, vinte e quatro moléculas mutantes
foram usadas, as propriedades funcionais e os parâmetros biofísicos (seletividade,
dependência condutância-voltagem) do canal foram analisadas e comparadas ao da
toxina selvagem.
Em uma segunda etapa, o canal reconstruído foi submetido a um
tratamento com reagentes específicos ao grupamento SH (sulfridila) para introduzir uma
carga positiva ou negativa na cisteína colocada na posição de mutação processo conhecido
como “escaneamento por mutagênese da cisteína” (Akabas et al., 1992; Howorka e
Bayley, 1998).
As propriedades do canal foram examinadas novamente e comparadas
àquelas obtidas antes da modificação química.
15
2 – OBJETIVO
Analisar a influência das cargas e de sua localização ao longo das
paredes do lume aquoso do canal iônico formado pela incorporação da α-hemolisina do
Staphylococcus aureus, em bicamadas lipídicas planas, através das alterações induzidas
nos parâmetros biofísicos de seletividade e dependência condutância-voltagem.
16
3 - REVISÃO DA LITERATURA
3.1 - CANAIS IÔNICOS
Uma das mais importantes classes de proteínas de membranas são os
canais iônicos, os quais ao serem abertos, por mudanças conformacionais na sua
estrutura protéica, criam uma via hidrofílica de baixa energia que permite a passagem de
íons através da barreira hidrofóbica presente na bicamada lipídica (Hille, 1992). Esses
canais são poros de dimensões nanométrica pelos quais os íons se movem rapidamente
(107 íons s-1 por canal) em direção aos seus gradientes eletroquímicos (Tieleman et al.,
2001).
Por se encontrarem presente em todas as membranas plasmáticas,
inclusive nas das organelas celulares, esses canais estão comumente envolvidos em
processos de comunicação e regulação, por meio da permeabilidade seletiva de íons
através deles, e são alvo para muitas drogas (Smart et al., 1998), sendo responsáveis pela
transdução de informações entre os meios intra e extracelular, bem como entre células.
Fig. 01 - mostra diferentes tipos de canais iônicos, nos estados de fechado e aberto
17
Desta forma os canais iônicos permitem a execução de funções como à
propagação de informações no sistema nervoso, tecido muscular e órgãos sensoriais, entre
outras, indispensáveis a vida (Kuffer e Nicoles, 1982). A atividade dos canais iônicos é
fundamental para as propriedades elétricas de células de tecidos excitáveis e, deste modo,
são alvo para grande um número de drogas, toxinas e antibióticos (Hille, 1992).
Em virtude disto, os canais iônicos despertam interesses biomédicos.
Algumas doenças conhecidas como “canalopatias” (paralisia periódica hipercalêmica e
hipocalêmica, paramiotonia congênita, miotonia agravada por potássio, síndrome do
alongamento do complexo Q-T do tipo I, II e III, epilepsia generalizada, fibrose cística,
etc...) têm sido descritas como causadas por modificações na estrutura molecular de
canais iônicos dependentes de voltagem, que se expressam por alterações e desordem na
excitabilidade celular (Abbott, 2006; Ashcroft, 2000; Felix, 2006; Graves & Hanna, 2005;
Kass, 2005; Lehmann-Horn e Rüdel, 1997; Marban, 2002; Rüdel, 1997; Schultz et al.,
1996).
3.2 – PROPRIEDADES FUNCIONAIS DOS CANAIS IÔNICOS
As propriedades funcionais dos canais iônicos são caracterizadas pela
determinação de parâmetros biofísicos, que se dá por medição da corrente iônica através
da membrana com o canal incorporado, sob condições de fixação de voltagem. Uma das
propriedades, que podemos citar, é a “permeação” (passagem de íons e moléculas
específicas pela abertura do canal).
Uma outra característica dos canais iônicos é que eles não se
encontram sempre abertos, contrário eles têm “portões”, os quais, por mecanismo de
18
abrir e fechar regulam o movimento de íons permeantes, através do poro do canal
acoplado, via mudanças conformacionais na estrutura da proteína.
Esses processos de abertura e fechamento dos canais iônicos são
denominados de “gating” (Hodgkin e Huxley, 1952) e são controlados por estímulos
adequados, tais como: neurotransmissores (p.ex. acetilcolina); influência modulatória
intracelular (proteína G ou fosforilação); mudança no potencial de membrana (canais
de Na+, K+ e Ca++, dependente de voltagem) ou por estímulos sensoriais de vários tipos
(Krueger, 1989; Colombini, 1989; Hodgkim e Huxely, 1952; Perozo et al. 2002; Villaz et
al. 1995; Yamaoka el al. 2006).
Os canais iônicos apresentam uma outra propriedade, considerada
como uma das mais importantes características dos canais iônicos, que é a seletividade
iônica (Krueger, 1989). Esta característica faz referência a sua capacidade de selecionar o
tipo de íon ou molécula-orgânica ao serem transportadas (Adcock et al., 1998; Bernech &
Roux, 2001; Krueger, 1989; Krasilnikov et al., 1986; Peters, 2005; Tieleman et al., 2001).
Isso sugere que, em alguns locais, o canal deve ser suficientemente estreito ou apresentar
um sítio de interação/reconhecimento, forçando os íons/moléculas a um contato intimo
com a parede do canal, permitindo que, apenas os selecionados, possam passar. Essa
região do canal é conhecida como filtro de seletividade. No caso dos íons, supõe-se que os
permeantes perdem, por cerca de microsegundos, suas moléculas de hidratação, para
poder passar em fila única, através do filtro de seletividade, e em seguida ligar-se a novas
moléculas à medida que são transportados passivamente através do canal. O “gatng” e a
seletividade são, portanto, parâmetros distintos dos canais iônicos.
19
Fig 2 - O canal iônico (poro aquoso) exibindo uma de suas propriedades (seletividade ao íon Na+)
Estudos da estrutura molecular dos canais iônicos têm evidenciado que
uma parte da molécula formadora do canal é concernente com o “gating”, enquanto a
outra parte pode estar relacionada com a seletividade.
Experimentos com membranas artificiais e biológicas têm mostrado que
o fenômeno da excitabilidade celular resulta de canais, cujos processos de abertura e
fechamento são controlados pela voltagem transmembrana. Essa classe de canais é
conhecida como canais dependentes de voltagem. No entanto, não só os canais envolvidos
no fenômeno da excitabilidade celular apresentam “gating” dependente de voltagem,
como outros canais, os que são estimulados por agentes químicos e/ou formados por
toxinas e antibióticos, apresentam comportamentos semelhantes em relação à
20
dependência de voltagem (Casse et al., 1970; Cramer te al., 1995; Jordan, 2005;
Krasilnikov et al., 1988ª; Nogueira & Varanda 1988; Pawlak et al., 1991; Ropele &
Menestrina, 1989).
A base molecular das propriedades dos canais iônicos tem sido muito
investigada, embora, ainda não bem, esclarecidas.
Os canais mais intensivamente estudados, (canais de sódio, canais de
potássio e canais de cálcio) são bastante complexos e cuja geometria do poro e localização
dos resíduos carregados não estão bem compreendida. Para esclarecer esses aspectos dos
canais iônicos, o canal formado pela α-HL do Staphylococcus aureus tem sido bastante
utilizado como modelo, por ser de fácil obtenção e ter uma estrutura molecular
estabelecida.
3 .3 - ALFA HEMOLISINA (α-HL) DO STAPHYLOCOCCUS AUREUS
A α-HL do Staphylococcus aureus foi descoberta a partir de uma tentativa
de vacinação com toxóides da difteria, na cidade australiana de Bundaberg, em 1928,
vinte e uma crianças ficaram gravemente enfermas e doze delas faleceram. Investigando a
causa da tragédia, Burnet (1929; 1930) isolou o Staphylococcus aureus a partir da
preparação desses toxóides e verificou as propriedades tóxicas num filtrado de cultura
bacteriana livre de células. Trabalhos realizados posteriormente conduziram à
identificação da α-HL, produzida pelo Staphylococcus aureus, como a principal causa da
toxicidade observada ( Bhakdi e Tranum-Jensen, 1991).
21
A α-HL é uma exotoxina secretada pelo Staphylococcus aureus
(Gouaux, 1998) e sendo considerada fator de maior patogenicidade da bactéria.
O gene da α-HL foi clonado e seqüenciado por Kehoe e
colaboradores em 1983. Este gene está presente em uma única cópia do cromossomo da
bactéria, em um elemento de controle positivo transativo denominado AGR (acessório
regulador do gene) ou EXP (expressão), identificado por Recsei e colaboradores (1986).
Esse elemento foi mapeado no Loci, denominado, pur B e ilv, que regula a produção de
varias outras exoproteinas, tais como; staphylokinase, alfa, beta e delta-hemolisina
(Morfeldet et al., 1988).
De acordo com os estudos, a α-HL é um polipeptídeo de peso
molecular em torno de 33 KDa. A estrutura primária da α-HL é composta de 293
resíduos de aminoácidos, na qual se tinha observado a ausência de cisteína (Gray e
Kehoe, 1984).
A α-HL é uma proteína hidrofílica e em meio aquoso apresenta-se sob a
forma de monômero (Thelestam et Blomqvist, 1988).
Durante muito tempo, pensou-se que a estrutura do poro, formado pela
α-HL, era hexamérica. Porém, este conceito foi contestado: a proteína foi cristalizada e
revelada uma estrutura composta por sete monômeros agregados tridimensionalmente
(Goaux et al., 1994) Desde então, o modelo heptamérico do canal, constituído de sete
subunidades idênticas, foi aceito (Song et al., 1996) e posteriormente confirmado por
experimentos eletrofisiológicos em canais unitários da α-HL, obtidos a partir da
bicamada lipídica plana (Krasilnikov et al., 2000).
22
A B
Fig.3 – Modelo estrutural da molécula α-HL do Stahpylococcus aureus A) - Canal heptamérico formado pela α-HL
B) – A formação do canal vista de cima mostra as sete subunidades
Estudos recentes mostraram que a formação do poro transmembrana
ocorre quando sete monômeros da α-HL ligados à membrana interagem e se
oligomerizam, formando verdadeiros complexos protéicos anfifílicos os quais,
espotaneamente, inserem-se em membranas celulares, constituindo um lume aquoso que
cruza o interior hidrofóbico da membrana (Bayley, 1997; Gouaux et al., 1994;
Krasilnikov et al., 1988b; Song et al., 1996). A análise da sua estrutura molecular mostra
que os canais formados pela α-HL apresentam um arranjo secundário em forma de β-
pregueada (Song et al., 1996; Valeva et al., 1997), originando estruturas
anelares como heptâmeros de 12S (Bhakdi et al., 1981).
23
Fig. 04 –modelo espacial de uma β-pregueada
Resultados experimentais mostraram que a dependência
condutância-voltagem (GV), do canal da α-HL em pH fisiológico, tem uma
moderada assimetria, e não linearidade, sendo muito utilizado como modelo para estudos
de bases fisiológicas de transportes através de poros de escala nanométrica (Howarka et
al., 2004; Kasianowicz et al., l996; Krasilnikov et al., 1988a; Krasilnikov et al., 1990).
O extenso canal é formado por diferentes regiões da α-HL e pode ser
dividido em três regiões, onde somente duas, a “copa” e “tronco”, participam da
formação do poro aquoso. O domínio “copa” é a parte do canal que está parcialmente
localizada fora da bicamada, e protubera ~5nm da superfície da membrana para o lado
da adição da proteína (Fussle et al., 1981; Krasilnikov et al., 1988) É a única parte do
canal com abertura cis e contém uma grande cavidade com um diâmetro interno de
aproximadamente 4,6nm (Howorka et al., 2000; Song et al., 1996). Já o domínio “tronco”
apresenta uma forma aproximadamente cilíndrica e estrutura protéica β-pregueada,
com diâmetro de ~2,6nm que penetra na bicamada e forma a abertura trans (Valeva et
al., 1996).
Nessa região os resíduos das posições de números ímpares estão
voltados para a face aquosa do lume do poro, enquanto os de números pares estão
voltados para a face lipídica. Estes dois domínios são separados por uma constrição, cujo
diâmetro é de aproximadamente 1,2nm (Howorka et al., 2000; Merzlyak et al., 1999; Song
et al., 1996). Ambas as aberturas do canal são relativamente grande: ~2,6nm (Merzlyak et
al., 1999; Song et al., 1996).
24
Fig. 05 - A molécula α-HL inserida na bicamada forma o canal (apenas as regiões copal e troncular participam da formação do poro). Um corte longitudinal mostra o interior do canal, onde podemos observar uma constrição separando as duas regiões.
A parte terminal do domínio “tronco” de um lado e do outro é
formado por um anel composto de aminoácidos ácidos e básicos, os quais se encontram
separados por uma pequena distância de 4nm, constituída de aminoácidos neutros.
Portanto, com uma estrutura e geometria bem conhecida, o canal da
α-HL torna-se muito atrativo como modelo para estudos das propriedades biofísica de
canais iônicos de dimensão nanométricas.
4 – ANEXAÇÃO DO(S) ARTIGO(S) PUBLICADO(S)
25
4.1 – Artigo 1 – Conductance and Ion Selectivity of a Mesoscopic Protein Nanopore
Probed With Cysteine Scanning Mutagenesis
Periodoco – Biophysical Journal – volume 89
Status da publicação - publicada
Qualis – “A” internacional
Impacto – 4,5
26
27 27
28 28
29 29
30 30
31 31
32 32
33 33
34 34
35 35
36
37 37
38 38
5 – COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E CONCLUSÕES
O objetivo da presente investigação foi determinar
experimentalmente a influência da carga elétrica, tipo (positiva ou negativa) e posição
dentro do lume aquoso do canal iônico formado pela α-HL, sobre os parâmetros biofísicos
de: seletividade, condutância e a dependência da curva I-V (corrente-voltagem).
O canal aniônico formado pela α-HL do Staphylococcus aureus
foi escolhido como um bom modelo de canal iônico por apresentar um poro de estrutura
bem conhecida, simplificando estudos em nível molecular e sua interpretação. Além disso,
o canal formado pela α-HL é um poro aquoso de dimensões nanométricas, características
esta utilizadas pela biotecnologia, e de grande importância na fisiologia.
Nesse estudo, a α-H do Staphylococcus aureus foi incorporada na
bicamada lipídica plana e, com a utilização de um amplificador configurado, como
conversor de corrente-voltagem (IV), detectamos e analisamos o transporte iônico através
de um único canal. Em função da alta resolução oferecida pelo amplificador empregado
para o monitoramento da corrente iônica foi possível estimar todos os parâmetros
biofísicos do canal como: condutância, seletividade e a dependência condutância-voltagem
(GV) do canal formado pela α-HL, como ilustra a figura 06.
39
Fig. 06 - Diagrama do sistema experimental (pulsador, eletrodos, câmara experimental, interface eletrônica e micro computador). Abaixo, em detalhe, a câmara experimental mostra o orifício onde ocorre à formação da bicamada lipídica.
Para esclarecer a importância da localização das cargas
elétricas no lume aquoso do poro, a molécula da α-HL do Staphylococcus aureus foi
modificada, por mutagênese sítio-dirigida, para trocar um aninoácido, em varias
posições, por uma cisteína, originando vinte e quatro mutantes.
As moléculas da toxina mutante foram usadas para formar canais em
bicamada lipídica plana. Algumas propriedades biofísicas do canal formado por cada
mutante, foram estudadas. Os grupos sulfridila (SH) foram posteriormente modificados,
por interação com reagentes específicos, para criar na posição uma carga elétrica positiva
ou negativa.
O primeiro canal formado por mutante da α-HL, a G130C, onde uma
glicina, tendo sido substituída por uma cisteína na posição 130, foi por nós estudada,
durante o mestrado em Biofísica na Universidade Federal de Pernambuco. Naquele
40
período, realizamos um estudo das propriedades fundamentais do canal formado pela
G130C, em membranas artificiais (bicamada lipídica plana) e em eritrócitos de coelhos.
Os dois métodos de estudos apresentaram os mesmos resultados, o que mostrou ser a
técnica de bicamada lipídica plana bastante eficaz. Os dados obtidos foram, então,
comparados aos do canal formado pela α-HL nativa. Os resultados experimentais
revelaram que a substituição de um único aminoácido da estrutura primária da molécula
provocara consideráveis modificações nas propriedades biofísicas do canal. Esses
resultados foram publicados em periódicos internacionais (Krasilnikov O.V. et al., 1997
a,b).
Ao término do trabalho, novas mutantes estavam sendo produzidas,
e o desejo de continuar investigando era muito, mas foi frustrado por vários motivos: a
Universidade Federal de Pernambuco não tinha um programa de pós-graduação em nível
de doutorado e, por motivos familiares, não poderia cursá-lo em outro centro acadêmico;
o Departamento de Biofísica e Farmacologia da Universidade Federal do Rio Grande do
Norte, no qual sou lotada e desempenho minhas funções acadêmica, encontrava-se com
carência de professores e contava com o meu retorno.
Contudo, como docente da Universidade Federal do Rio Grande do
Norte, tenho acompanhado, nos últimos anos, o empenho e esforços, por parte da
Instituição e, em particular do Departamento de Biofísica e Farmacologia, do qual eu faço
parte, em investir na titulação de seus professores em níveis acadêmicos mais elevados.
Reconhecemos que, o saber e a qualidade da Universidade, só atingem o seu máximo
quando cada docente concretiza seus graus acadêmicos, e estes conhecimentos são
repassados de imediato para a sociedade como um todo, através do ensino da graduação,
da pesquisa e da extensão.
41
Com a criação do Programa de Pós-graduação em Ciências da
Saúde (PPGCSA) da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, de caráter
multidisciplinar, vi a oportunidade de sanar os anseios e, finalmente, dar continuidade ao
trabalho de pesquisa e obtenção da titulação desejada e necessária para o desempenho
acadêmico.
O primeiro passo foi entrar em contato com o Doutor Oleg
Vladimirovic Krasilnikov, professor da Universidade Federal de Pernambuco,
pesquisador de renome internacional, com o qual tive a honra de trabalhar e ser
orientada como aluna do mestrado. Assim, falei dos meus anseios em realizar este
trabalho e a disposição de dar continuidade, em parte, ao trabalho de mestrado. Com o
aceite, por parte do referido Doutor, tratamos de credencia-lo junto ao programa e tendo
sido aprovado, submetemos o projeto de pesquisa intitulado “Papel da localização da
carga em determinação dos parâmetros do canal iônico”, como pré-requisito para a
seleção em nível de doutorado.
Para a execução deste projeto, contávamos com o Laboratório
de Biofísica das Membranas do Departamento de Biofísica e Farmacologia da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, o qual possuía alguns equipamentos
básico tais como: balança, medidor de pH (pH-metro), um osciloscópio, gerador de
funções, ultras som, computador, Freezer, microscópio, estereomicroscópio, conversor
corrente-voltagem, câmara experimental e uma placa de aquisição de dados. Logo no
inicio quando ainda estávamos para desenvolver os experimentos pilotos, ficamos sem o
osciloscópio, uma das nossas principais ferramentas de trabalho. Assim, surgiu mais uma
dificuldade para a execução do projeto que, em virtude da exigüidade de recursos, não se
tinha como adquirir novos equipamentos, melhorar os já existentes e custear a compra de
reagentes.
42
Em contato com o Professor Krasilnikov, o mesmo disponibilizou
o laboratório de Biofísica das Membranas do Departamento de Biofísica e Radiobiologia
da Universidade Federal de Pernambuco, do qual é o chefe da equipe, para que fossem
realizados os primeiros experimentos. A oportunidade foi imprescindível para o
treinamento e aprendizado das técnicas empregadas na investigação, para a
familiarização com os novos equipamentos e para a definição dos protocolos. Após esta
etapa, a pesquisa continuaria na Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
Obtive meu afastamento e, embora sem nenhuma ajuda financeira
por parte da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, desloquei-me para Recife,
custeando todas as despesas inerentes a passagens e estadias.
Cumprida a primeira etapa, e como as dificuldades apresentadas
no inicio não tinham sido sanadas, não tínhamos meios para dar continuidade ao trabalho
na Universidade Federal do Rio Grande do Norte. E, mais uma vez, para a realização
deste trabalho, contamos, com o apoio decisivo da Universidade Federal de Pernambuco,
através do Departamento de Biofísica e Radiobiologia e em particular do Laboratório de
Biofísica das Membranas e do Professor Krasilnikov e da sua equipe. Assim, foram
proporcionadas todas as condições favoráveis ao desempenho da pesquisa, desde a
disponibilidade de instalações, equipamentos, até custeio das despesas inerentes aos
produtos químicos, lipídios, proteínas e reagentes utilizados no desenvolvimento dos
experimentos, já que o Departamento de Biofísica e Farmacologia da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte não dispunha de recursos para co-participar.
Apesar de todas as dificuldades apresentadas é importante
ressaltar que todas as etapas previstas na execução do projeto foram atingidas.
Antes de iniciarmos a nossa investigação do “papel da
localização das cargas em determinação dos parâmetros do canal iônico”, desenvolvemos
43
um outro trabalho intitulado: “O mecanismo da influência de eteres de coroa sobre o
canal iônico”, no qual o canal, formado pela α-HL selvagem, foi utilizado como modelo.
Esse trabalho nos proporcionou conhecer os aprimoramentos da técnica, manuseio de
novos equipamentos e adequação do desempenho experimental, que, posteriormente, nos
serviram de base para melhor execução e compreensão dos resultados no
desenvolvimento do projeto inicial.
Além desses benefícios, os resultados obtidos foram publicados em
periódico em nível internacional (anexado em outras publicações) e apresentados em
congressos nacional e internacional.
Portanto, com o domínio da técnica e com o conhecimento da
metodologia testada, foi possível aplicá-los no desenvolvimento do estudo proposto no
projeto inicial, o que possibilitou alcançar os objetivos traçados.
Algumas investigações foram feitas, anteriormente, para descrever
teoricamente, as propriedades do canal formado pela α-HL, através de estudos
qualitativos (Krasilnikov et al., 1989; Misakian et al., 1997) e de aproximação
quantitativa (Noskov, S.Y. et al., 2004). Os quais sugerem que a carga fixa no interior do
poro, ou próximo à entrada deste, afeta as propriedades do canal.
Para investigar esses aspectos do poro, em detalhe, a técnica de
escaneamento pela mutagênese da cisteína, foi utilizada para o canal heptamérico,
formado pela proteína α-HL do Staphylococcus aureus. Vinte e quatro mutantes da
proteína α-HL foram produzidas pela substituição de um único aminoácido, em várias
posições, pela cisteina. Além disso, as consequências eletrofisiológicas, decorrente das
substituições foram por nós avaliadas, após a formação do canal em uma membrana
lipídica plana.
44
As mutantes examinadas foram divididas em três grupos: as mutações
que foram feitas na região “copal” da molécula da proteína α-HL (I7C e D108C) e os
outros dois grupos foram as mutantes contendo uma cisteina, introduzida nas posições
pares (G126C, D128C, G130C, Y118C, F120C, G122C, V124C, I132C, G134C, I136C,
A138C e V140C) e nas posições impares (T129C, K131C, G133C, N12lC, D127C, L135C,
G137C, N139C, S141C e G143C) da região “troncular” do canal.
fig 07 - canal da α-HL, mostrando a posição de alguns aminoácidos ao longo do canal
Das vinte e quatro mutantes examinadas, apenas seis, as quais estão
localizadas próximo da abertura trans (mutações nas posições 126, 128, 129, 130, 131 e
133 da região “troncular”), apresentaram grande influência sobre a condutância do
canal. As mutações feitas nas posições impares, mas que estão afastadas da abertura
trans, tiveram uma pequena, porém significante influência na condutância do canal. As
mutações nas posições pares afastadas da entrada trans apresentaram uma influência
mínima, ou seja, praticamente desprezíveis.
45
Esses resultados sugerem a importância tanto da carga, como da sua
localização no lume do poro aquoso, sobre as propriedades do canal iônico. E, para
certificarmos sobre estes efeitos, a cisteína introduzida foi então alterada quimicamente
por reagentes específicos para o grupamento SH (sulfridila) visando introduzir na posição
uma nova carga elétrica positiva ou negativa.
Neste estudo nós demonstramos experimentalmente como a
intensidade da influência da carga depende de sua posição ao longo do eixo longitudinal
do canal, e como esta se correlaciona com a geometria do mesmo. Os resultados
permitem-nos às seguintes principais conclusões: a seletividade e a assimetria da
dependência condutância-voltagem (GV) do canal da α-HL, dependem da força iônica.
Este fato indica que as cargas, que reveste a face aquosa no interior do poro de dimensões
nanoscópicas, ainda “sentem” as propriedades da solução banhante da bicamada lipídica,
ou seja, efeitos da força iônica e do pH.
Assim os reagentes específicos para o SH (solúveis em água) foram
capazes de mudar as propriedades do canal pré-inserido, formado pela proteína α-HL
mutante.
Entretanto, as mudanças foram observadas apenas para as
mutações em que as substituiçôes pela cisteína foram realizadas nas posições impares, da
molécula da α-HL. O mesmo não foi notado quando as mutações foram feitas nas posições
pares, com exceção da mutação G130C (localizada próximo da abertura trans) que teve
suas propriedades mudadas pelos reagentes. Esses resultados confirmaram a estrutura
β-pregueada da região “troncular” do poro em pleno funcionamento.
As mudanças nas propriedades de um canal pré-inserido é
resultado da introdução de uma carga fixa localizada na parede do lume aquoso do canal.
46
A eficácia da carga introduzida é dependente do tipo e da localização ao longo do eixo do
canal.
Os efeitos provocados pela ação destes reagentes SH podem ser
revertidos pelo DTT que reverte parcialmente à ação das cargas.
A introdução de uma nova carga negativa na parte trans do poro (do
domínio “troncular”) converte a seletividade do canal de pouco aniônico para catiônico,
enquanto que, a introdução de uma carga positiva, aumenta a seletividade a anion.
A intensidade destas alterações foi inversamente dependente do raio
do canal no local carga introduzida. Tudo indica que a malha de carga da parede interna
do poro aquoso seja responsável pela seletividade do mesmo, e que as cargas nas entradas
do canal é o fator determinante do perfil da curva condutância-voltagem.
Um aumento da assimetria da curva GV foi encontrado nos canais
formados pelas mutantes, em que uma carga positiva e ou resíduo neutro, foi substituída
pela fraca carga negativa da cisteína.
A introdução de uma forte carga negativa MTSES (pelo processo da
alteração química) aumentou a assimetria da curva GV, especialmente se estava
localizada próximo da abertura trans do poro. Entretanto, quando a introdução foi de
uma forte carga positiva – MTSET (reagente específico ao grupo SH, com carga elétrica
positiva) ocorreu diminuição da assimetria. Este resultado corrobora a importância, da
carga elétrica e da sua posição na determinação da assimetria da curva.
Por outro lado, quando a introdução de uma forte carga negativa –
MTSES (reagente específico SH, com carga elétrica negativa), foi na região “Copal” (lado
cis do poro) esta provocou diminuição da assimetria. Logo a incorporação de carga
positiva afetou as propriedades do canal de maneira oposta.
47
Com os resultados obtidos neste trabalho, esperamos que eles possam
contribuir com outros estudos sobre poros aquosos de dimensões nanoscópicas em
membranas biológicas ou artificiais, e principalmente, em aplicações na biotecnologia,
quando o canal da α-HL é muito utilizado como detector de moléculas, como toxinas,
polímeros, DNA.
48
6 – ANEXOS
6.1 – Outras Publicações
6.1.1 – Artigo 1 – Protein electrostriction: a possibility of elastic deformation of the α-
hemolysin channel by the applied field
Periodico: - Eur Biophys Journal
Estatus da publicação: - Publicado
Qualis: - A inernacional
Impacto: 1.8
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51 51
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56 56
57 57
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59 59
6.2 – Participação em Congresso
6.2.1 – The Mechanism of Crown Ethers Influence on Ion Channels
Capistrano, M.F.P.; Merzlyak, P.; Yuldasheva, L.: Krasilnikov, O.
Apresentado sob a forma de painel na XVII reunião Anual da FeSBE
Salvador Bahia (2002)
6.2.2 – Does the electric field evoke on elastic defornation of ion channel being in high
conductancestate experimental approach.
Oleg V. Krasilnikov: Petr G. Merzlyak; Lillya N. Yuldasheva, and Maria F. Capistrano.
Erbacher Hof
Maínz, Germany
6.2.3 – The Channel Properties in Light of the Cysteine Scanning Mutagenesis. Alpha-
Hemolysin Channel in Planar Bilayers
Merzlyak, P.; Capistrano, M. F. P.; Valeva, A.; Krasilnikov, O. V.
Apresentado sob a forma de painel na XX Reunião Anual da FeSBE em Águas de Lindóia
- São Paulo (2005)
6.2.4 –The Channel Properties in Light of the Cysteine Scanning Mutagenesis, Alpha-
Hemolysin Channel in Planar Bilayers.
Merzlyak P.; Capistrano, M. F. P.; Valeva, A.; Oleg Vladimirivich Krasilnikov.
60
Apresentado sob a forma de comunicação Oral no Módulo Temático Molcular Structure
and Ionic Channels Function na XX reunião Anual da FeSBE- na cidade de Águas de
Lindóia - São Paulo ( 2005 )
61
62 62
63 63
64 64
65 65
66 66
67 67
68 68
69 69
70
70
7 - REFERÊNCIAS
Ashgroft, F.M. (2000). Ion Channels and Disease. San Diego: Academic Press
Bhakdi S., Fuessely, R. and Tranum Jensen, J., 1981. Proc. Natl Acad. Sci, USA 78:
5475-5479
Bhakadi, S., and J. Tranum-Jensen. 1991. Alpha-toxin of Staphylococcus aureus.
Microbiol . Rev. 55: 733-751.
Bhakadi,S., Weller, U., Walev, I., Martin, E., Jonas, D. and Palmer, M. 1993. A guide
to used of poro-forming toxins for controlled permeabilization of cell membranes.
Med. Microbiol. Immunol. 182: 167
Braha O., Walker, B., Cheley, S., Kasianowicz, J.J., Song L., Gouaux, J.E., and
Bayley, H. (1997) Designed protein pores as components for biosensors. Chem Biol. 4:
497-505
Burnet, F.M. 1929. The exotoxins of Staphylococcus pyogenes aureus. J. Pathol.
HNacteriol 32: 717-734
Burnet, F.M. 1930. The production of Staphylococcal toxin. J. Pathol. Bacteriol 33: 1-
16
Cannon , S.C., 1996. Sodium Channel defects in myotonia and periodic paralysis.
Annu. Ver. Neurosci, 19: 141-164
71
Fussle, R., S. Bhakadi, , A. Sziegoleit, Tranum-Jensen, T. Kranz, and H. J.
Wellensiek, 1981. On the mechanism of membrane damage by Staphylococcus aureus
., Braha O. Hobaugh M. Song, L., Cheley S., Shustak C. and Bayley, H.
994. Proc. Natl Acad. Sci, USA 91: 12828- 12831;
ysin from Staphylococcus aureus : an archetype of beta-
arrel, channel-forming toxins. J, Struct Biol 121: 110-122
n of the channel-forming colicins.Annu ver.
iophys. Struct 24 611-641
occus aureus. Wood 46, infect immune 46: 615-618
deriand, MA.
α-toxin. J. Cell Biol. 91: 83-94
Gauaux. E
1
Gouaux, E. 1998 alpha-Hemol
b
Gramer, W. J.B.Heymann, S.L. Shendel, B.N. Derey, F.S. Cohen, P. end C.V.
Stauffacher, 1995. Structure-Functio
B
Grey G.S., Kchoe M. 1984. Primary Sequence on the alpha toxin Gene from
Staphyloc
Hille B. 1984. Ionic channels of excitable membranes Ed. Sinauer Associates Inc
Publishers
Hille, B. 1992. Ionic channels of excitable membranes. Sinauer Associates,
Sun
72
Howorka, S., Nam, J., Bayley, H. and Kahne, D. Stochastic detection of monovalent
and bivalent protein-ligand interactions.2004. Angew. Chem. Int. Ed. 43: 842-846
Kandel, E.R., Schwartz, J.H. & Jessel, T.M. Principles of neural science. Ed McGraw-
asianowicz J. J., E. Brandin, D. Branton and D. W. Deamer. 1996. Characterization
and V.
tions
lyte sensing. In Structure and Dynamics of Confined
olymers.
ores, Kluwer Academic
ublishers, Dordrecht, the Netherlands. 141-163
Duncan, I., Foster, T., Fairweather, N. and Dougan, G. 1983. Cloning,
xpression and mapping of the Staphylococcus aureus alpha-hemolysin determinant
rasianowiaz, J. J. Diesease Markers, 2002, 18; 185-191
Hill, 2000
K
of individual polymucleotide molecules using a membrane channel. Proc. Natl. Acad.
Sci USA. 93: 13770-773
Kasianowicz, J.J., S. E. Henrickson, M. Misakian, H.H. Weetall, B. Robertson
Stanford. 2002. Physics of DNA threading through a nanometer pore and applica
to simultaneous multi-ana
P
J.J.Kasianowicz, M. Kellemayer, and D.W. Deamer, edit
P
Kehoe, M.,
e
in Escherichia coli K-12. Infect. Imunun. 41: 1105-1111
K
73
Krasilnikov , O.V., Ternovsky, V.I., Musaev, Y.M. and Tashmukhamedov, B.A. 1980.
Influence of staphylotoxin on conductance of bilayer phospholipid membranes.
oklady AN UzSSR. N7: 66-68
v , O.V., Ternovsky, V.I. and Tashmukhamedov, B.A. 1981. Properties of
n channels induced by alpha-staphylotoxin in bilayer lipid membranes. Biofisic 26:
. Sabirov, V.L. Temovsky, P.G. Merzliak, and B.A.
ashmukhamedov. 1988. The structure of Staphylococcus aureus α-toxin induced
rs by Staphylococcus aureus α-toxin. Gen. Physiol. Biophys. 8213-222
channels formed by Staphylococcus
ureus α-toxin. Gen. Physiol. Biophys. 9: 569-575
lyak,M. F. P. Capistrano &
Romildo A. Nogueira., 1997. The hinge portion of the S. aureus α-toxin
D
Krasilniko
io
271-275
Krasilnikov, O.V., R.Z
T
ionic chennel. Gen. Physiol . Biophys. 8: 213-222
Krasilnikov O.V. and R.Z. Sabirov , 1989. Ion transport through channels formed in
lipid bilaye
Krasilnikov, O.V., P. G. Merzliak, R. Z. Sabirov and B. A. Tashmukhamedov. 1990.
Memory is a property of an ion channels pool-ion
a
Krasilnikov, O.V.; Merzliak P.G.; Sabirov, R. Z.; Tashmukhamedov, B.A. General
Physiology and Biophysics 1990; 9: 569-575
KrasilniKov O, V,. Liliya N. Yuldasheva, Petr G.Merz
74
crosses the lipid bilayer and is part of trans-mouth of the channel. Biochim.Biophys.
Acta. 1329: 51-60
Krasilnikov, O.V.,M.F.P.Capistrano, L.N. Yuldasheve, R.A.Nogueira, 1997. Influence
rasilninikov, O.V.; Merzlyak, P.G.: Yuldasheva, L.N.; Rodrigues, C.G., Bhakdi,S.;
.J. Zigmond; F.E. Bloom; S. C. Roberts; J.L. & Squire, l.R. Fundamental
.Theestam, and L. Blomquist, 1988, Staphylococcal Alhpa-toxin – Recent advances.
of Cys -130 S.aureus Alpha-toxin on Planar Lipid Bilayer and Erythocyte
Membranes. J. Membrane Biol 156:157-172
K
Valeva, A., 2000. Eletrophysiological evidence for heptameric atoichiometry of ion
channels formed by Staphylococcus aureus α-toxin in planar lipid bilayers. Mol.
Microbiol 37: 1372-1378;
Kuffer, S. W. & Nicholis , J. G. . De la neurona al cerebro . Ed. Editorial Reverté S.
A., 1982
L. Hodgkin, A.I. Huxley 1952. A quantitative descriptron of membrane current and
its application to conduction and excitation in nerve. J. Physiol (Lond) 117: 500-544
M
neuroscience. Ed. Academic Press, 1999
M
Toxicon 26: 51-65;
75
Merzlyak, P.G., L.N.Yuldasheva, C.G. Rodrigue, C.M.M.Carneiro, O.V. Krasilnikov,
1999. Polymeric nonelectrolytes to probe pore geometrry:Application to the α-toxin
ansmembrane channel. Biophys Journal , 77: 3023-3033
5; 137-146
orfeldet, E., Janzon, L., Arvidson, S. and Löfdahl, S., 1988. Cloning of a
lococcus aureus. Mol. Gen. Genet. 211: 435-440
embranes in aqueous solution. J. Phys Chem.
7; 534-535
tr
Misakian M. and J.J. Kasianowicz, 2003. Electrostatic influence on ion transport
through the α-HL channel J. Membr. Biol. 19
Montal, M. and P. Muller, 1972. Formation of bimolecular membranes from lipid
monolayers and a study of their of their electrical properties. Proc. Natl. Acad. Sci
Usa. 69-3561-3566
M
chromosomal locus (exp) which regulates the expression of several exoprotein genes
in Staphy
Mueller, P., Rudin, D.O., Tien, H.T., Wescott, W.C. 1963. Methods for the formation
on sigle biomelecular lipid membranes in aqueous solution. J. Phys Chen. 67: 534-535
Muller , P., Rudin, D.O. Tien, H.t. AND Wescott, W.C. 1963. Meethods for the
formation on single biomolecular lipid m
6
76
Nogueira, R.A., Varanda, W.A.,1988. Properties of Channels formed by collicin in
planar bilayer membranes, J. Membrane Biol. 105: 143-153:
Noskov S. Y. , S. Bemeche, and B. Roux. 2004 Control of ion selectivity in potassium
liver S. Smart and Guy M.P. Coates, 1998. Structure – Based Prediction of the
.A. Wallace and Mark S. P.
ansom, 1996. Hole: A program for the analysis of the pore dimensions os ion channel
awlak, M.S. Stankowski, end G.Schwarz, 1991 – Melittin induced voltage-deendent
reiswirth, B. O’Reilly, M. and Schlievat, P., Gruss, A. and Novick, R.V.
986. Regulation of exoprotein gene expression in Staphylococcus aureus by agr. Mol.
en. Genet. 202: 58-61
channels by electrostatic and dynamic properties of carbonyl ligands. Nature. 431:
830-834
Ogston, A., 1881. Report upon microorganisms in Surgical diaseases, Br. Med. J. May,
369-375;
O
Conductance Properties of Ion Channels. Faraday Discuss, 111:185-191.
Oliver S. Smart, Joseph G.Neduvelil, Xiaonan Wang, B
S
structural modls. Jornal of Molecular Graphics 14: 354-360
P
conductance in DOPC lipid bilayrs. Biochim, et Biophys Acta 1062: 94-102
Recsei, P. K
1
G
77
Schultz, G. S.; Andreoli, T.E.; Brown, A.M.; Fambrough, D. M.; Hoffman, J.F. &
Welsh, M.J. Molecular biology of membrane transport disorders. Ed. Plenum Press,
996
of Stafilococcal α-hemolysin , a heptameric transmembrane pore. Science.
74: 1859-1866;
D.Peter, Phil C. Biggin, Graham R. Smith and MarK S.P.Sansom, 2001.
imulation approaches to ion channel structure- function reletionships. Quarterly
aleva, A., Weisser A, Walker B, Kehoe M, Bayley H, Bhakadi S and Palmer M,.
aleva A., Pongs J, Bhakdi S., Palmer M. Staphylococcus α-toxin: the role of the N-
9-699, l995.
1
Song, L.Z.; M.R. Hobaugh; C. Shustak.; S.Cheley; H. Bayley and J.E. Gouaux, 1996.
Strurure
2
Tieleman
S
Reviews of Biophysics 34,4: 473-561
V
1996 . Molecular architecture of a toxin pore: a 15-residue sequence lines the
transmembrane channel of staphylococcal α-toxin. EMBO J. 15(8): 1857-1864.
V
terminus in formation of the heptameric pore – a fluorescence study. Biochimical. Et
Biophysica Acta, Biomembranes. 1325(2): 281-286. 1997
Villaz M., Cinniger JC, Moody W J. A voltage-gated chloride channel in ascidian
embryos modulated by both the cell cycle clock and cell volume. The Journal of
Physiology, 488 (Pt3): 68
78
Yamaoka K, Vogel S M, Seyama I. Na+ channel phamacology and molecular
mechanisms of gating. Current Pharmaceutical Design. 12:429-442,2006.
Zigmond MJ, Bloom FE, Roberts SC, Squire JL. Fundamental neurocience. Ed.
Academia Press, 1999.
79
ABSTRACT To aureus α-HL
channel, we used the cysteine- scanning mutagenesis technique. Twenty-four mutants were
produced from the substitution of a single aminoacid of the primary structure of the α-HL
pro
this yzed after the incorporation of a mutant channel in planar lipid
bilayer membranes. The modified proteins were studied in the absence and presence of water-
soluble specific sulphydryl-specific reagents, in order to introduce a strong positive or negative
harge at positions of substitution. The introduction of a negative charge in the stem region
onverted the selectivity of the channel from weak anionic to more cationic. However, the
troduction of a positive charge increased its selectivity to the anion. The degree of these
alterations was inversely dependent on the channel radius at the position of the introduced
harge (selectivity). As to the asymmetry of the conductance-voltage, the influence of the
harge was more complex. The introduction of the negative charge in the stem region (the trans
art of the pore) provoked a decrease. The intensity of these alterations depended on the radius,
and on the type of free charge at the pore entrance. These results suggest that the free charge
at surrounds the pore wall is responsible for the cation-anion selectivity of the channel. The
istribution of the charges between the entrances is crucial for determining the asymmetry of
e conductance-voltage curves. We hope that these results serve as a model for studies with
other nanometric channels, in biological or planar lipid bilayer membranes or in
iotechnological applications.
Keywords: channels ionics; selectivity; α-hemolysin; Staphylococcus aureus
investigate the influence of charges on the properties of the Staphylococcus
tein by various proportions of cysteine. The electrophysiological alterations resulting from
modification were anal
c
c
in
c
c
p
th
d
th
b
80
