livros01.livrosgratis.com.brlivros01.livrosgratis.com.br/cp131215.pdf · MARIA ISABEL BALBI-PEÑA RESPOSTAS DE GENÓTIPOS DE TOMATE SUSCETÍVEIS E RESISTENTES A Oidium neolycopersici

MARIA ISABEL BALBI-PEÑA

RESPOSTAS DE GENÓTIPOS DE TOMATE SUSCETÍVEIS E RESISTENTES

A Oidium neolycopersici E Alternaria solani, LOCALIZAÇÃO IN SITU DE

ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO E ATIVIDADE DE ENZIMAS

RELACIONADAS À DEFESA

MARINGÁ

PARANÁ - BRASIL

FEVEREIRO 2010

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Tese apresentada à Universidade Estadual de Maringá como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Agronomia, área de concentração em Proteção de Plantas, para obtenção do título de Doutor.

MARINGÁ

PARANÁ - BRASIL

FEVEREIRO 2010






Tese apresentada à Universidade Estadual de Maringá como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Agronomia, área de concentração em Proteção de Plantas, para obtenção do título de Doutor.

APROVADA em: 1º de fevereiro de 2010

Prof. PhD Sérgio Florentino Pascholati Prof. Dr. José Renato Stangarlin Prof. PhD Dauri José Tessman Profª. Drª. Vivian Carré Missio

Profª. Drª. Kátia Regina Freitas Schwan-Estrada

(Orientadora)

ii

AGRADECIMENTOS

À minha família.

À minha amiga e orientadora Profª. Drª. Kátia R. F. Schwan-Estrada, pelo seu carinho e compreensão em todo momento, sobretudo naqueles de cansaço e de desesperança.

Ao Prof. Dr. José Renato Stangarlin, pelo seu apoio e conselho desde o meu primeiro dia de estudante no Brasil.

Aos meus amigos e colegas da UNIOESTE e da UEM: Renata, Juliana, Adriana, Gilmar, Odair, Cláudia e Marinelva.

A todos os colegas e professores do Laboratório de Biotecnologia do Bloco T-33, UEM.

Aos demais professores e funcionários da UEM que colaboraram no desenvolvimento deste trabalho.

Ao Conselho Nacional de Ciência e Tecnologia (CNPq), pela concessão da bolsa de estudos.

iii

BIOGRAFIA

MARIA ISABEL BALBI PEÑA, uruguaia, nasceu em 5 de julho de 1971,

na cidade de Montevideo. É engenheira agrônoma, formada pela Universidad

de la República Oriental del Uruguay. Após a graduação exerceu atividade

profissional na área de ciência e tecnologia de sementes em empresa de

produção de sementes no Uruguai. Em 2003, já no Brasil, ingressou no

Mestrado no curso de Pós-Graduação em Agronomia da Unioeste –

Universidade Estadual do Oeste de Paraná, desenvolvendo pesquisa na área

de Fitopatologia. Em 2006 iniciou o curso de Doutorado na UEM --

Universidade Estadual de Maringá, na área de concentração de Proteção de

Plantas.

iv

ÍNDICE

LISTA DE QUADROS .................................................................................... VIII

LISTA DE FIGURAS.......................................................................................... X

RESUMO ........................................................................................................ XIII

ABSTRACT .....................................................................................................XV

CAPÍTULO 1 REVISÃO DE LITERATURA..................................................... 1 1. Oídio do tomate...............................................................................................1

1.1 Taxonomia.................................................................................................1 1.2 Morfologia e desenvolvimento no hospedeiro ...........................................3 1.3 Sintomas....................................................................................................4 1.4 Controle .....................................................................................................4 1.5 Cultivares resistentes ................................................................................5

2. Pinta preta do tomateiro..................................................................................6 2.1 Taxonomia.................................................................................................6 2.2 Ciclo da doença.........................................................................................8 2.3 Sintomas....................................................................................................9 2.4 Controle ...................................................................................................10 2.5 Cultivares resistentes ..............................................................................11

3. Mecanismos de defesa das plantas ..............................................................15 3.1 Mecanismos de defesa pré-formados .....................................................15 3.2 Mecanismos de defesa pós-formados.....................................................18

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................ 39

CAPÍTULO 2 DESENVOLVIMENTO DE Oidium neolycopersici EM GENÓTIPOS DO GÊNERO Solanum SEÇÃO Lycopersicon ....................... 54

RESUMO ......................................................................................................... 54

ABSTRACT ..................................................................................................... 55

1. INTRODUÇÃO............................................................................................. 56

2. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................ 58 2.1 Patógeno e material vegetal........................................................................58 2.2 Inoculação e incubação de discos foliares..................................................59 2.3 Observação microscópica do processo de infecção de Oidium

neolycopersici ..............................................................................................59 2.4 Severidade da doença ................................................................................60 2.5 Estatística e delineamento experimental.....................................................60

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................... 61

v

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................ 67

CAPÍTULO 3 RESPOSTAS DE GENÓTIPOS DE TOMATE SUSCETÍVEIS E RESISTENTES A Oidium neolycopersici, LOCALIZAÇÃO IN SITU DE ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO E ATIVIDADE DE ENZIMAS RELACIONADAS À DEFESA ......................................................................... 69

RESUMO ......................................................................................................... 69

ABSTRACT ..................................................................................................... 70

1. INTRODUÇÃO............................................................................................. 71

2. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................ 74 2.1 Patógeno e material vegetal........................................................................74 2.2 Inoculação e coleta de amostras.................................................................75 2.3 Análises histoquímicas................................................................................75

2.3.1 Localização in situ de peróxido de hidrogênio (H2O2)...........................75 2.3.2 Localização in situ de superóxido (O2

.-) ................................................76 2.4 Resposta de hipersensibilidade ..................................................................76 2.5 Análises bioquímicas ..................................................................................77

2.5.1 Obtenção dos extratos enzimáticos......................................................77 2.5.2 Proteínas totais.....................................................................................77 2.5.3 Atividade de peroxidase de guaiacol (EC 1.11.1.7)..............................77 2.5.4 Atividade de catalase (EC 1.11.1.6) .....................................................78 2.5.5 Atividade de polifenoloxidase (EC 1.10.3.2) .........................................78 2.5.6 Atividade de quitinase (EC 3.2.1.14) ....................................................79 2.5.7 Atividade de β-1,3- glucanase (EC 3.2.1.6)..........................................79

2.6 Estatística e delineamento experimental.....................................................80

3. RESULTADOS ............................................................................................ 81 3.1 Desenvolvimento de O. neolycopersici nos genótipos avaliados ................81 3.2 Localização in situ de peróxido de hidrogênio (H2O2) .................................84 3.3 Localização in situ de superóxido (O2

.-) ......................................................86 3.4 Resposta de hipersensibilidade ..................................................................91 3.5 Análises bioquímicas ..................................................................................94

3.5.1 Atividade de peroxidase de guaiacol ....................................................94 3.5.2 Atividade de catalase............................................................................95 3.5.3 Atividade de polifenoloxidase ...............................................................96 3.5.4 Atividade de quitinase...........................................................................97 3.5.5 Atividade de β-1,3- glucanase ..............................................................98

4. DISCUSSÃO.............................................................................................. 100 4.1 Reação de hipersensibilidade ...................................................................100 4.2 Espécies reativas de oxigênio...................................................................102 4.3 Atividade de enzimas relacionadas à patogênese ....................................104

5. CONCLUSÕES.......................................................................................... 111

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................. 112

vi

CAPÍTULO 4 RESPOSTAS DE GENÓTIPOS DE TOMATE SUSCETÍVEIS E RESISTENTES A Alternaria solani, LOCALIZAÇÃO IN SITU DE ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO E ATIVIDADE DE ENZIMAS RELACIONADAS À DEFESA ........................................................................................................ 118

RESUMO ....................................................................................................... 118

ABSTRACT ................................................................................................... 120

1. INTRODUÇÃO........................................................................................... 121

2. MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................... 124 2.1 Experimento 1: Severidade de pinta preta em espécies de Solanum

seção Lycopersicon ...................................................................................124 2.1.1 Patógeno e material vegetal ...............................................................124 2.1.2 Inoculação e avaliação de severidade................................................125 2.1.3 Estatística e delineamento experimental ............................................126

2. 2 Experimento 2: Respostas de genótipos de tomate suscetíveis e resistentes a Alternaria solani, localização in situ de espécies reativas de oxigênio e atividade de enzimas relacionadas à defesa.......................126

2.2.1 Patógeno e material vegetal ...............................................................126 2.2.2 Inoculação e coleta de amostras ........................................................127 2.2.3 Análises histoquímicas .......................................................................127 2.2.4 Resposta de hipersensibilidade..........................................................128 2.2.5 Determinação de papilas....................................................................129 2.2.6 Análises bioquímicas..........................................................................129 2.2.7 Estatística e delineamento experimental ............................................132

3. RESULTADOS .......................................................................................... 133 3.1 Experimento 1: Severidade de pinta preta em espécies de Solanum

seção Lycopersicon ...................................................................................133 3.2 Experimento 2: Respostas de genótipos de tomate suscetíveis e

resistentes a Alternaria solani, localização in situ de espécies reativas de oxigênio e atividade de enzimas relacionadas à defesa.......................134

3.2.1 Desenvolvimento de A. solani sobre os hospedeiros .........................134 3.2.2 Localização in situ de peróxido de hidrogênio (H2O2).........................136 3.2.3 Localização in situ de superóxido (O2

.-) ..............................................137 3.2.4 Resposta de hipersensibilidade..........................................................139 3.2.5 Papilas................................................................................................141 3.2.6 Análises bioquímicas..........................................................................141

4. DISCUSSÃO.............................................................................................. 148 4.1 Experimento 1: Severidade de pinta preta em espécies de Solanum

seção Lycopersicon ...................................................................................148 4.2 Experimento 2: Respostas de genótipos de tomate suscetíveis e

resistentes a Alternaria solani, localização in situ de espécies reativas de oxigênio e atividade de enzimas relacionadas à defesa.......................149

5. CONCLUSÕES.......................................................................................... 160

CONSIDERAÇÕES FINAIS........................................................................... 161

vii

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................. 163

viii

LISTA DE QUADROS

CAPÍTULO 1

Quadro 1. Fontes genéticas de resistência à pinta preta, podridão de colo e lesão da haste (Adaptado de Chaerani & Voorrips, 2006) ............................... 12

CAPÍTULO 2

Quadro 1. Identificação, origem e nível de resistência/suscetibilidade dos genótipos de Solanum seção Lycopersicon empregados na avaliação do processo de infecção por Oidium neolycopersici ............................................. 58

Quadro 2. Características do desenvolvimento dos conídios de O. neolycopersici em discos foliares de genótipos de tomateiro avaliados 19 h pós-inoculação (hpi)................................................................................................ 63

Quadro 3. Esporulação de O. neolycopersici e severidade de oídio em discos foliares de genótipos de tomateiro avaliados aos 8 e 9 dias pós-inoculação, respectivamente............................................................................................... 65

CAPÍTULO 3

Quadro 1. Porcentagem de conídios de O. neolycopersici apresentando diferente número de hifas em tomateiros CNPH 1287 e cv Kada em diferentes horários pós-inoculação (hpi) ........................................................................... 81

Quadro 2. Porcentagem de conídios (e suas hifas) de O. neolycopersici apresentando desenvolvimento de conidióforo 96 e 120 h pós-inoculação (hpi), número de conidióforos por conídio (conídios inoculados com conidióforo) e por conídio total avaliado ....................................................................................... 83

Quadro 3. Porcentagem de sítios de infecção com acúmulo de O2.- e número

de células coradas por sítio de infecção após inoculação de plantas de tomateiro cv. Kada e CNPH 1287 com O. neolycopersici.... ............................... 87

Quadro 4. Porcentagem de sítios de infecção com respostas de hipersensibilidade (HR) após inoculação de plantas de tomateiro cv. Kada e CNPH 1287 com O. neolycopersici. ................................................................ 92

CAPÍTULO 4

Quadro 1. Lista e origem dos genótipos de tomateiro................................... 125

ix

Quadro 2. Tamanho das lesões de pinta preta obtidas por inoculação por método de gota em seis genótipos de tomateiro............................................ 133

Quadro 3. Porcentagem de conídios de A. solani apresentando apressórios e lesões em genótipos de tomateiro em diferentes horários pós-inoculação (hpi)....................................................................................................................... 136

x

LISTA DE FIGURAS

CAPÍTULO 1

Figura 1. Interconversão de espécies reativas de oxigênio (EROs) derivadas do oxigênio molecular (O2) (VRANOVÁ; INZÉ; VAN BREUSEGEM, 2002). ... 19

Figura 2. Interconexões do H2O2, óxido nítrico (NO) e ácido salicílico (AS) para a ativação e coordenação das múltiplas reações de defesa das plantas (adaptado de Hammond-Kosack & Jones, 2000)............................................. 22

Figura 3. Representação da sinalização do NO durante a reação de hipersensibilidade (HR) (traduzido a partir de Delledone, 2005)...................... 23

CAPÍTULO 2

Figura 1. Microfotografias de conídios de O. neolycopersici em discos foliares de tomateiro 19 h pós-inoculação. ................................................................... 62

CAPÍTULO 3

Figura 1. Microfotografias de conídios de O. neolycopersici em discos foliares de tomateiro em diferentes horários pós-inoculação (hpi). .............................. 82

Figura 2. Microfotografias de conídios de O. neolycopersici em discos foliares de tomateiro mostrando acúmulo de H2O2 em células epidérmicas após inoculação de plantas de tomateiro cv. Kada e CNPH 1287............................ 85

Figura 3. Porcentagem de sítios de infecção com acúmulo de H2O2 em células epidérmicas após inoculação de plantas de tomateiro cv. Kada (2 2 2) e CNPH 1287 (XX) com O. neolycopersici. .................................................................... 86

Figura 4. Porcentagem de sítios de infecção com acúmulo de O2.- em células

epidérmicas após inoculação de plantas de tomateiro cv. Kada (2 2 2) e CNPH 1287 (XX) com O. neolycopersici. .................................................................... 88

Figura 5. Microfotografias de conídios de O. neolycopersici em discos foliares de tomateiro mostrando acúmulo de O2

.- em células atacadas após inoculação de plantas de cv. Kada e CNPH 1287.............................................................. 89

Figura 6. Porcentagem de sítios de infecção com resposta de hipersensibilidade (HR) em CNPH 1287 (22) e cv. Kada (2 2 2) em diferentes horários pós-inoculação (hpi). .......................................................................... 91

xi

Figura 7. Microfotografias de conídios de O. neolycopersici em discos foliares de tomateiro às 120 h após inoculação de plantas de tomateiro cv. Kada e CNPH 1287.. .................................................................................................... 93

Figura 8. Dinâmica da atividade de peroxidase de guaiacol em plantas inoculadas com O. neolycopersici (XX) e plantas sadias (2 2 2) de S. habrochaites CNPH 1287 (■) e S. lycopersicum cv. Kada (●). ........................ 94

Figura 9. Dinâmica da atividade de catalase em plantas inoculadas com O. neolycopersici (XX) e plantas sadias (2 2 2) de S. habrochaites CNPH 1287 (■) e S. lycopersicum cv. Kada (●). ....................................................................... 95

Figura 10. Dinâmica da atividade de polifenoloxidase em plantas inoculadas com O. neolycopersici (XX) e plantas sadias (2 2 2) de S. habrochaites CNPH 1287 (■) e S. lycopersicum cv. Kada (●). B...................................................... 96

Figura 11. Dinâmica da atividade de quitinase em plantas inoculadas com O. neolycopersici (XX) e plantas sadias (2 2 2) de S. habrochaites CNPH 1287 (■) e S. lycopersicum cv. Kada (●).. ...................................................................... 97

Figura 12. Dinâmica da atividade de β-1,3- glucanase em plantas inoculadas com O. neolycopersici (XX) e plantas sadias (2 2 2) de S. habrochaites CNPH 1287 (■) e S. lycopersicum cv. Kada (●). ......................................................... 98

CAPÍTULO 4

Figura 1. Microfotografias de conídios de A. solani em discos foliares de tomateiro cv ‘Kada’ em diferentes horários pós-inoculação (hpi). .................. 135

Figura 2. Porcentagem de conídios apresentando apressórios em plantas de tomateiro cv. Kada (2 2●2 2) e CNPH 1287 (X●X) após inoculação com A. solani.............................................................................................................. 137

Figura 3. Microfotografias de conídios de A. solani em discos foliares de tomateiro mostrando acúmulo de H2O2 em células epidérmicas após inoculação de plantas de tomateiro cv. Kada e CNPH 1287............................................ 138

Figura 4. Microfotografias de conídios de A. solani em discos foliares de tomateiro mostrando acúmulo de O2

.- em células atacadas após inoculação de plantas de cv. Kada e CNPH 1287................................................................. 139

Figura 5. Microfotografias de conídios de A. solani em discos foliares de tomateiro após inoculação de plantas de tomateiro cv. Kada e CNPH 1287. 140

Figura 6. Microfotografias de tecidos clareados de tomateiro cv. Kada mostrando papila em paredes de células epidérmicas, sob apressório (seta) após 96 h pós-inoculação com conídios de A. solani..................................... 141

Figura 7. Dinâmica da atividade de peroxidase de guaiacol em plantas inoculadas com A. solani (XX) e plantas sadias (2 2 2) de S. habrochaites CNPH 1287 (■) e S. lycopersicum cv. Kada (●)............................................. 142

xii

Figura 8. Dinâmica da atividade de catalase em plantas inoculadas com A. solani (XX) e plantas sadias (2 2 2) de S. habrochaites CNPH 1287 (■) e S. lycopersicum cv. Kada (●).............................................................................. 143

Figura 9. Dinâmica da atividade de polifenoloxidase em plantas inoculadas com A. solani (XX) e plantas sadias (2 2 2) de S. habrochaites CNPH 1287 (■) e S. lycopersicum cv. Kada (●). ..................................................................... 144

Figura 10. Dinâmica da atividade de quitinase em plantas inoculadas com A. solani (XX) e plantas sadias (2 2 2) de S. habrochaites CNPH 1287 (■) e S. lycopersicum cv. Kada (●).............................................................................. 145

Figura 11. Dinâmica da atividade de β-1,3- glucanase em plantas inoculadas com A. solani (XX) e plantas sadias (2 2 2) de S. habrochaites CNPH 1287 (■) e S. lycopersicum cv. Kada (●).. .................................................................... 146

xiii

RESUMO

BALBI-PEÑA, Maria Isabel. Universidade Estadual de Maringá, fevereiro de 2010. Respostas de genótipos de tomate suscetíveis e resistentes a Oidium neolycopersici e Alternaria solani, localização in situ de espécies reativas de oxigênio e atividade de enzimas relacionadas à defesa. Orientadora: Profª. Drª. Kátia Regina Freitas Schwan-Estrada.

Para investigar as respostas de defesa de dois genótipos do gênero

Solanum Seção Lycopersicon com resposta diferencial frente a Oidium

neolycopersici e Alternaria solani, avaliou-se a histopatologia, a produção e o

acúmulo de espécies reativas de oxigênio (EROs) e a atividade de enzimas

relacionadas à defesa [peroxidase de guaiacol (GPOX), catalase (CAT),

polifenoloxidase (PFO), β-1,3-glucanase (GLU) e quitinase (QUI)] após

inoculação com esses patógenos. Para selecionar um genótipo resistente e

outro suscetível avaliou-se o desenvolvimento do fungo nos hospedeiros no

caso de oídio e a severidade usando o método de inoculação por gota no caso

da pinta preta. O genótipo CNPH 1287 (Solanum habrochaites sin.

Lycopersicon hirsutum) e a cv. Santa Cruz Kada (S. lycopersicum sin.

Lycopersicon esculentum) foram selecionados como resistente e suscetível,

respectivamente, frente aos dois patógenos. Foram instalados dois

experimentos, onde plantas de CNPH 1287 e cv Kada foram inoculadas com os

patógenos separadamente e, posteriormente, coletadas em diferentes tempos

após inoculação. O mecanismo de resistência do genótipo CNPH 1287 frente a

O. neolycopersici esteve associado com resposta de hipersensibilidade (HR) e

explosão oxidativa. Essa associação não foi detectada na resistência frente a

A. solani. O aumento pós-inoculação da atividade de GPOX e PFO (enzimas

envolvidas nos processos fisiológicos relacionados à defesa), da CAT (enzima

envolvida na detoxificação das EROs) e os maiores níveis constitutivos e

aumentos da atividade pós-inoculação das enzimas hidrolíticas QUI e GLU

ocorridos em CNPH 1287 quando inoculado com O. neolycopersici são

coerentes com o acúmulo concomitante de EROs e o desenvolvimento de HR

nos tecidos. Mudanças similares na atividade dessas enzimas foram

xiv

verificadas em CNPH 1287 na interação com A. solani. A exceção foi a

ausência de resposta da CAT, coerente com o escasso acúmulo de EROs nos

tecidos foliares observada durante a interação com A. solani. No caso do

patógeno biotrófico O. neolycopersici, foi observada resistência do tipo gene-a-

gene com manifestação de HR e explosão oxidativa. Já na interação com o

patógeno necrotrófico A. solani, a magnitude da HR e acúmulo de EROs

observada não indicam que cumpram um papel de importância na resistência

frente a esse patógeno.

Palavras-chave adicionais: Oídio de tomate. Pinta preta. Espécies reativas de

oxigênio. Enzimas relacionadas à defesa. Patógeno biotrófico. Patógeno

necrotrófico.

xv

ABSTRACT

BALBI-PEÑA, Maria Isabel. Universidade Estadual de Maringá, February 2010. Defense responses, in situ localization of reactive oxygen species and activity of defense-related enzymes in tomato genotypes resistant and susceptible to Oidium neolycopersici and Alternaria solani. Adviser: Prof. Dr. Kátia Regina Freitas Schwan-Estrada.

To investigate plant defense responses on two Solanum section

Lycopersicon genotypes differing in their resistance against Oidium

neolycopersici and Alternaria solani, histopathology, generation and

accumulation of reactive oxygen species (ROS) and expression of defense-

related enzymes [guaiacol peroxidase (GPOX), catalase (CAT), polyphenol

oxidase (PPO), β-1,3-glucanase (GLU) and chitinase (CHI)] were studied after

inoculation with those pathogens. To select one resistant and one susceptible

genotype, we studied the fungus development on hosts in the case of tomato

powdery mildew and we evaluated disease severity using a droplet inoculation

method in the case of tomato early blight. CNPH 1287 (Solanum habrochaites

syn. Lycopersicon hirsutum) and cv. ‘Santa Cruz Kada’ (Solanum lycopersicum

syn. L. esculentum) were selected like as resistant and susceptible genotypes,

respectively, against both pathogens. Two experiments were performed, where

CNPH 1287 and Kada plants were inoculated with both pathogens and tissue

samples collected for analysis at different time intervals. Oxidative explosion

and hypersensitive response (HR) seem to be associated to resistance in

CNPH 1287 (S. habrochaites) genotype against O. neolycopersici but not

against A. solani. Higher constitutive levels and increased post-inoculation

activity of β-1,3-glucanase and chitinase, increased activity of GPOX and PPO

(enzymes involved with defense mechanisms) and CAT (enzyme involved with

ROS scavenging) that were observed in resistant genotype CNPH 1287 after

inoculation with O. neolycopersici were associated with simultaneously ROS

accumulation and HR in the tissues. When inoculated with A. solani, CNPH

12987 showed similar changes in enzyme activity except for catalase, where no

xvi

significant changes were observed. This agrees with the lower level of ROS

accumulation during the A. solani pathogenesis. Gene-for-gene resistance with

expression of HR and oxidative explosion were observed against the biotrophic

pathogen O. neolycopersici. In the case of the necrotrophic pathogen A. solani,

HR and ROS accumulation did not appear to play important roles in the

resistance against this pathogen.

Additional keywords: Tomato powdery mildew. Tomato early blight. Reactive

oxygen species. Defense-related enzymes. Biotrophic pathogen. Necrotrophic

pathogen.

1

CAPÍTULO 1

REVISÃO DE LITERATURA

O tomateiro [Solanum lycopersicum L. (PERALTA; KNAPP, SPOONER,

2005) sin. Lycopersicon esculentum Mill.] é a segunda solanácea mais cultivada

no mundo, sendo apenas superada pela cultura da batata. No ano 2007, o

Brasil foi o maior produtor dessa hortaliça na América Latina e o oitavo produtor

a nível mundial (FAO, 2009). A produção anual de tomate no Brasil no ano 2007

foi de 3,356 milhões de toneladas em uma área cultivada de 56.275 ha, com

uma produtividade média de 59,64 t ha-1 (IBGE, 2009).

1. Oídio do tomate

O oídio do tomate, causado por Oidium neolycopersici L. Kiss (KISS et

al., 2001), tem causado sérios problemas na cultura de tomate durante os

últimos 15 anos. Infecções severas foram registradas na Europa ocidental

durante a década de 1980, mas o patógeno se disseminou relativamente rápido

para outros centros de produção de tomate na Europa e, na década de 1990,

foi reportado pela primeira vez na América do Norte (MIESLEROVÁ; LEBEDA;

KENNEDY, 2004).

No Brasil, é uma doença relativamente comum nos anos de inverno

seco, mas é raro causar danos à cultura em condições de campo. Entretanto,

com o incremento do cultivo protegido e da área irrigada por gotejamento, o

oídio assume maior importância (KUROZAWA & PAVAN, 2005; BOITEUX et

al., 2005). O número de plantas hospedeiras é elevado, incluindo 60 espécies

em 13 famílias de plantas, principalmente membros de Solanaceae e de

Cucurbitaceae (JONES; WHIPS; GURR, 2001).

1.1 Taxonomia

Os oídios constituem um dos mais importantes e bem estudados

grupos de patógenos de plantas. O termo “oídio” tem sido usado tanto para

designar a doença como também o grupo de fungos ascomicetos, pertencentes

2

à ordem Erysiphales, família Erysiphaceae (STADNIK, 2001). A ordem

Erysiphales tem 28 gêneros e 100 espécies de fungos. Todos os membros

dessa ordem são patógenos biotróficos de folhas e de frutos de plantas

superiores, causando a doença chamada oídio ou míldio pulverulento. A maioria

dos anamorfos da ordem Erysiphales pertence ao gênero Oidium (KENDRICK,

2001).

No final da década de 1970 foi reportado, no Japão e na Austrália, o

aparecimento de um novo oídio causando dano severo em tomate.

Posteriormente, epidemias de uma doença similar foram reportadas em vários

locais da Europa e da América do Norte. Em todos esses relatos, o agente

causal foi descrito como um Oidium anamórfico claramente distinto de

Oidiopsis, o estado anamórfico de Leveillula taurica, o qual afeta tomate em

regiões mais cálidas e apresenta conidióforos ramificados que emergem dos

estômatos (KISS; TAKAMATSU; CUNNINGTON, 2005). A fase sexual do fungo

é desconhecida. Os dados reportados da conidiogênese desse patógeno eram

contraditórios, já que alguns autores descreveram a produção de conídios em

cadeia (ARREDONDO et al., 1996; BÉLANGER & JARVIS, 1994;

KARASEVICZ & ZITTER, 1996; KISS, 1996; PERNEZNY & SONODA, 1998) e

outros a formação de conídios solitários (MAROIS et al., 2001; SMITH;

DOUGLAS; LAMONDIA, 1997; VAKALOUNAKIS & PAPADAKIS, 1992;

WHIPPS; BUDGE; FENLON, 1998). Já que a natureza da conidiogênese tem

um padrão estável em espécies de oídio, essa contradição sugeriu que as

epidemias de oídio poderiam ser causadas por mais de uma espécie em

diferentes partes do mundo ou inclusive na mesma região geográfica (KISS;

TAKAMATSU; CUNNINGTON, 2005).

Para identificar o agente causal das epidemias de oídio em tomate,

Kiss e colaboradores (2001) estudaram mais de 50 espécimens de oídio de

tomate obtidos de todos os continentes onde o tomate é cultivado usando

morfologia clássica, microscopia eletrônica de varredura e análise filogenética.

Eles concluíram que todas as ocorrências recentes de oídio em tomate fora da

Austrália foram causadas por uma espécie que formava conídios solitários, ou,

em condições de alta umidade relativa, em pseudocadeias de 2-6 conídios.

Baseados nisso, descreveram uma espécie nova, chamada de Oidium

3

neolycopersici para esse patógeno. Os isolados australianos, os quais sempre

formaram conídios em cadeia, retiveram o nome de Oidium lycopersici.

1.2 Morfologia e desenvolvimento no hospedeiro

Os esporos de O. neolycopersici possuem forma ovoide-elipsoide ou

doliforme, com tamanho aproximado de 22-46 x 10-20 um. O tubo germinativo

emerge do corpo do conídio, cresce e se alonga na ponta, formando um

apressório lobado. Subsequentemente, o peg de penetração emerge do centro

do apressório e penetra a célula do hospedeiro. A partir do corpo do conídio e

do apressório primário emergem hifas secundárias que colonizam rapidamente

o tecido. Os apressórios secundários se desenvolvem solitários ou em pares a

partir das hifas que se ramificam sobre a superfície da planta (JONES;

WHIPPS; GURR, 2001). As hifas são hialinas, septadas, ramificadas de 2-8 µm

de largura (WEHT, 2001).

Jones et al. (2000) encontraram depósitos de material de matriz

extracelular (ECM) embaixo de tubos germinativos, das hifas, ao redor das

bordas do apressório e ao redor do poro de penetração no sítio de penetração

de O. neolycopersici. A ECM não foi observada sob os esporos que não tinham

germinado. Em testes de adesão realizados com conídios de O. neolycopersici

no estágio de apressório e com conídios não germinados, foi comprovado que o

tecido dos conídios que apresentavam apressório fica aderido ao hospedeiro,

determinando o sucesso da adesão (JONES; WHIPPS; GURR, 2001).

Um pequeno pico na atividade de cutinase no momento da penetração

e a aparência lisa das bordas do orifício de penetração sugerem que as

enzimas têm um papel na penetração da cutícula e parede celular epidérmica

pelo fungo O. neolycopersici (JONES et al., 2000). Jones, Whipps e Gurr (2001)

reportam uma pressão de turgor máxima de aproximadamente 3 MPa no

apressório maduro às 11 h pós-inoculação, o que coincide com momento da

penetração da célula hospedeira.

Os haustórios são estruturas do fungo essenciais para a fixação e o

suprimento nutricional dos oídios, formando uma associação física íntima com o

plasmalema da célula do hospedeiro, sem, no entanto, perfurá-la. O fluido entre

a membrana extra-haustorial e a parede do haustório é denominada matriz

4

extra-haustorial, através da qual ocorre a transferência de nutrientes do

hospedeiro para o parasita (STADNIK & MAZZAFERA, 2001).

O ciclo de vida assexual se completa com a formação de conidióforos

eretos, perpendiculares à superfície do hospedeiro, com uma célula basal

cilíndrica e carregando um único conídio no ápice (JONES; WHIPPS; GURR,

2001).

1.3 Sintomas

O sintoma mais comum são massas de aspecto pulverulento de cor

branca a cinza, que se formam na face adaxial dos folíolos, nos pecíolos e no

caule dos tomateiros, constituídas de micélio e de órgãos de frutificação

assexuada do fungo (KUROZAWA & PAVAN, 2005). As pequenas colônias

iniciais (3-10 mm) se estendem rapidamente e, em cinco dias, podem cobrir

toda a superfície foliar (FLETCHER; SMEWIN; COOK, 1988). Nos estágios

mais avançados, as áreas afetadas passam a apresentar amarelecimento e,

finalmente, necrose. Esses sintomas são mais evidentes nas folhas mais velhas

da planta. Infecções severas levam à senescência prematura e a uma marcada

redução da qualidade e do tamanho do fruto (WHIPPS; BUDGE; FENLON,

1998).

1.4 Controle

Com o surgimento do novo oídio de tomate causado por O.

neolycopersici, a doença propagou-se rapidamente no mundo inteiro. Todos os

cultivares comerciais de tomate testados foram suscetíveis a esse fungo

(LINDHOUT; PET; VAN DER BEEK, 1994). Inicialmente, conseguiu-se bom

controle com o uso de fungicidas tais como benomil, carbendazim, tiabendazol,

triforine, bupirimate e várias preparações com enxofre, entre outros

(KUROZAWA & PAVAN, 2005; JONES; WHIPPS; GURR, 2001).

5

1.5 Cultivares resistentes

O uso de cultivares resistentes constitui a alternativa mais eficiente e

segura para o controle da doença, fundamentalmente por reduzir os custos de

produção e evitar danos à saúde humana e ao ambiente. A obtenção de fontes

de resistência entre as cultivares de tomate não tem tido muito sucesso, o que

tem levado à procura nas espécies selvagens do gênero Solanum seção

Lycopersicon. “Screening” intensivo tem revelado várias fontes potenciais de

resistência em acessos de Solanum habrochaites (sin. Lycopersicon hirsutum),

S. chilense (sin. L. chilense), L. parviflorum (sin S. neorickii), S. peruvianum

(sin. L. peruvianum), S. pimpinellifolium (sin. L. pimpinellifolium), S.

lycopersicum var. cerasiforme (sin. L. esculentum var. cerasiforme) e S.

pennellii (sin. L. pennellii) (LINDHOUT; PET; VAN DER BEEK, 1994;

CICCARESE et al., 1998; HUANG et al., 1998; HUANG et al., 2000;

MIESLEROVÁ; LEBEDA; KENNEDY, 2004; MATSUDA et al., 2005; LI et al.,

2006). Essas espécies selvagens estão agrupadas no complexo “peruvianum”

e no complexo “esculentum”. O complexo “esculentum” está formado por: S.

lycopersicum, S. habrochaites, S. cheesmaniae (sin. L. cheesmaniae), S.

neorickii, S. pimpinellifolium e S. pennellii, e essas espécies são o foco principal

do “screening” de resistência frente a O. neolycopersici, devido à facilidade de

cruzamento com o tomateiro cultivado (S. lycopersicum) (MIESLEROVÁ;

LEBEDA; CHETELAT; 2000).

Tem sido foco de atenção particular a resistência apresentada por S.

habrochaites, atribuída ao gene com dominância incompleta Ol-1, que co-

segrega com outros dois genes de resistência (LINDHOUT; PET; VAN DER

BEEK, 1994). Cicaresse et al. (1998) encontraram resistência em L.

esculentum var. cerasiforme, a qual é devida ao gene recessivo Ol-2. Embora o

foco esteja centrado no complexo “esculentum”, o trabalho com introgressão de

genes de resistência do grupo “peruvianum” em S. lycopersicum continua

(MIESLEROVÁ; LEBEDA; CHETELAT; 2000). Lindhout, Pet e Van Der Beek

(1994) propuseram que os dois complexos podem apresentar mecanismos

diferentes de resistência genética a O. neolycopersici, devido a seus diferentes

locais geográficos de origem, o qual deve ter impedido a cossegregação dos

genes de resistência.

6

2. Pinta preta do tomateiro

A pinta preta caracteriza-se por ser uma das mais importantes e

frequentes doenças da cultura do tomateiro nas condições brasileiras de cultivo.

A doença apresenta alto potencial destrutivo, incidindo sobre folhas, hastes,

pecíolos e frutos do tomateiro, ocasionando elevados prejuízos econômicos

(KUROZAWA & PAVAN, 2005), podendo causar danos em qualquer estádio de

desenvolvimento da planta. As perdas são diretas, através da infecção dos

frutos, e indiretas, através da redução do vigor da planta, além de danos aos

frutos expostos aos raios do sol em decorrência da desfolha. A maior

severidade da doença ocorre durante a fase de frutificação (VALE et al., 2000).

2.1 Taxonomia

O fungo Alternaria solani é um dos membros mais conhecidos e de

maior importância econômica do gênero Alternaria. Esse gênero pertence ao

reino Fungi, filo Ascomycota (classe Dothideomycetes, ordem Pleosporales,

família Pleosporaceae), mas, devido à ausência da fase sexual, o gênero é

usualmente classificado em Deuteromycota (filo artificial ou não filogenético). A

comparação de sequências de DNA assim como de caracteres fenotípicos não

sexuais permite, no entanto, a integração dos fungos assexuais no Filo

Ascomycota (SCHOCH et al., 2006; TAYLOR; SPATAFORA; BERBEE, 2006).

O gênero Alternaria foi estabelecido em 1817 com A. alternata

(originalmente A. tenuis) como o isolado tipo. A característica-chave do gênero

Alternaria é a produção de conídios grandes, multicelulares, escuros

(melanizados) com septos transversais e longitudinais (phaeodictyospores).

Esses conídios são mais largos perto da base e gradualmente se afinam até um

bico alongado, dando a aparência de clava (THOMMA, 2003). Dentro do gênero

Alternaria, as espécies são definidas primariamente com base nas

características dos conídios, sendo descritas mais de 100 espécies em todo o

mundo (SIMMONS, 1992). Devido à grande diversidade de espécies de

Alternaria, tem sido propostas divisões em grupos subgenéricos, como a

sugerida por Nergaard (1945), baseada no número de esporos na cadeia e,

7

mais recentemente, a proposta por Simmons (1992), baseada em grupos de

espécies, cada um tipificado por uma espécie representativa.

O fungo A. solani foi considerado o agente causal de pinta preta no

tomateiro e na batateira, entretanto, devido à considerável variabilidade do

fungo, existe controvérsia acerca se é o mesmo agente causal em ambos os

hospedeiros (FOOLAD; MERK; ASHRAFI, 2008). Em detalhado estudo sobre

espécies de Alternária de tomateiro e batateira, Simmons (2000) reporta duas

espécies diferentes desde o ponto de vista cultural e morfológico: A.

tomatophila E.G. Simmons e A. solani, como agentes causais de pinta preta no

tomateiro e batateira, respectivamente. As diferenças mais importantes se

referiram ao comprimento, largura e padrões de ramificação dos bicos do

conídio, assim como diferencias culturais (ZITTER & DRENNAN, 2005). Além

das diferenças em características morfológicas, têm sido detectadas diferenças

fisiológicas entre essas espécies, através do perfil de metabólitos secundários

usando cromatografia líquida de alta performance (HPLC) (ANDERSEN,

DONGO; PRIOR, 2008), embora a função e estrutura química desses

compostos seja ainda desconhecida. A. tomatophila tem sido detectada nos

Estados Unidos, Austrália, Nova Zelandia e Venezuela (SIMMONS, 2000), mas

não foi reportada ainda no Brasil.

A variabilidade genética de A.solani foi analisada em 112 isolados do

fungo oriundos de tomateiro e batateira usando AFLP (“amplified fragment

length polymorphism analysis”). A análise incluiu isolados de várias regiões de

Cuba, USA, Brasil, Turquia, Grécia, Rússia e China (PÉREZ-MARTINEZ;

SNOWDON; PONS-KÜHNEMANN, 2004). O dendograma obtido por

agrupamento UPGMA baseado em fingerprints AFLP indicou uma

especialização por hospedeiro indicada pela separação dos isolados de

tomateiro e batateira em dois subgrupos diferentes com similaridade genética

de 0,7. Como, no entanto, alguns isolados não foram consistentes com a

hipótese de especialização por hospedeiro, os autores classificaram todos os

isolados como A. solani, até a realização de estudos morfológicos e culturais

detalhados de acordo a Simmons (2000).

Lourenço e colaboradores (2009) coletaram isolados de A. solani de

tomateiro e batateira de várias regiões produtoras de Brasil. Utilizaram

sequências da região do espaçador interno transcrito do rDNA (ITS) e

8

sequências parciais dos genes que codificam a proteína alt a1 (Alt a 1) e a

gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (Gpd) para estimar a diversidade

molecular assim como para análises de coalescência. A existência de

subpopulações associadas com os hospedeiros foi detectada quando foram

analisados os genes Alt a 1 e Gpd, mas não quando se analisaram os

polimorfismos da região ITS, devido à pequena ou inexistente variação nessa

região nas espécies do grupo porri ao qual A. solani pertence. Os resultados

apontam forte evidência de que a subpopulação de A. solani que causa pinta

preta em batata é geneticamente diferente daquela que causa pinta preta em

tomate. Segundo os autores, a associação de haplótipos com as espécies

hospedeiras seria uma evidência de um processo de especialização em

andamento, embora considerem necessária uma análise mais aprofundada das

características morfológicas e de componentes de adaptabilidade (“fitness”)

desses haplótipos, para identificar as possíveis espécies de Alternaria

associadas com pinta preta de tomateiro e batateira no Brasil.

2.2 Ciclo da doença

A pinta preta ocorre em todas as regiões onde o tomateiro é cultivado,

sobretudo em condições de alta umidade e temperaturas entre 25ºC e 30ºC.

Entretanto, pode ocorrer em clima semiárido, onde é verificado orvalho com

frequência (KUROZAWA & PAVAN, 2005).

O fungo A. solani sobrevive como conídio ou micélio em restos

culturais, solo e semente. Os conídios podem servir como fonte primária de

inóculo para o cultivo posterior até começar o ciclo secundário da doença.

Os esporos são dispersos principalmente por vento e, ocasionalmente,

por respingos de chuva, irrigação ou insetos (ROTEM, 1994). Clamidósporos

podem também servir como estruturas de sobrevivência (PATTERSON, 1991),

embora sejam encontrados com baixa frequência (ROTEM, 1994).

Os conídios apresentam paredes celulares grossas conferindo

resistência a baixas temperaturas e outras condições ambientais adversas

(FOOLAD; MERK; ASHRAFI, 2008). As células do conídio são melanizadas, o

que também protege de estresses e de condições desfavoráveis ambientais,

como temperaturas extremas, radiação UV e compostos segregados por

9

microrganismos antagonistas (ROTEM 1994, REHNSTROM & FREE, 1996,

KAWAMURA; TSUJIMOTO; TSUGE, 1999). A germinação do conídio ocorre

na faixa de 6ºC a 34ºC, com fator ótimo entre 28ºC a 30ºC em 35 a 45 min em

água (KUROZAWA & PAVAN, 2005). Os tubos germinativos emergem dos

esporos e se estendem sobre a superfície foliar. A infecção ocorre por

penetração direta das células epidérmicas ou através dos estômatos ou

ferimentos, após a formação de apressório. As lesões tornam-se visíveis sob

condições favoráveis entre um a três dias após a inoculação (ROTEM, 1994,

KUROZAWA & PAVAN, 2005, CHAERANI & VOORRIPS, 2006). A colonização

do hospedeiro é facilitada por enzimas (celulases, pectin-metil-galacturonases)

que degradam a parede celular do hospedeiro e por várias toxinas que matam

as células do hospedeiro permitindo que o patógeno derive nutriente a partir

dessas células mortas (ROTEM, 1994). Foram identificadas 11 toxinas em

filtrados de culturas de A. solani, dentre as quais o ácido alternárico e a

solanapyrone A, B e C são capazes de induzir sintomas necróticos similares

aos sintomas da pinta preta (MONTEMURRO & VISCONTI, 1992).

O ciclo de vida de A. solani é relativamente curto, o que permite

infecções policíclicas. Além disso, o fungo sobrevive no solo, em semente e no

ar, o que torna difícil o manejo desse patógeno pela rotação de cultivos e

desinfecção de sementes (CHAERANI & VOORRIPS, 2006).

Além do tomateiro, A. solani afeta outras solanáceas, tais como

batateira, berinjela, pimentão e jiló (KUROZAWA & PAVAN, 2005).

2.3 Sintomas

Além dos sintomas foliares que são conhecidos como pinta preta, A.

solani causa sintomas de menor importância econômica no tomateiro que

incluem podridão de colo (plântulas), lesões na haste em plantas adultas e

podridão do fruto.

A podridão do colo é caracterizada por lesões de tipo cancro, localizadas

no caule ao nível do solo. Eventualmente, essas lesões circundam o caule

formando colares e danificando o sistema vascular, o que leva à perda de stand

de plantas. A podridão do colo tem importância tanto como doença, assim como

10

fonte de inóculo para a ocorrência de uma epidemia de pinta preta (FOOLAD;

MERK; ASHRAFI, 2008).

Os sintomas foliares podem ocorrer em toda a parte aérea da planta,

mas as lesões são mais abundantes nas folhas mais velhas e próximas ao solo.

Nas folhas totalmente desenvolvidas, as lesões se caracterizam pela presença

de manchas necróticas, pardo-escuras com ou sem zonas concêntricas bem

pronunciadas, bordas definidas, circulares ou elípticas no início e irregulares

mais tarde, com diâmetro de 3 a 20 mm. Em lesões mais velhas, pode

constatar-se halo clorótico que pode tomar extensas áreas dos folíolos

(KUROZAWA & PAVAN, 2005). O ataque severo provoca desfolha acentuada e

expõe os frutos à queima de sol.

Nas hastes de plantas adultas, o sintoma é caracterizado por lesões

grandes, com anéis concêntricos, semelhantes aos que ocorrem nas folhas.

Nos frutos, verifica-se uma podridão de aspecto zonado, deprimida, grande,

circular, próxima ao pedúnculo, coberta por um mofo preto na superfície devido

à presença de frutificações do patógeno (LOPES et al., 2000).

2.4 Controle

As principais medidas de controle para pinta preta consistem em um

conjunto de medidas preventivas, tais como: a) tratamento de sementes com

os fungicidas thiram, captan, thiram + iprodione e uso de mudas livres da

doença; b) rotação de culturas com gramíneas; c) escolha de local para

instalação de culturas evitando áreas de baixada e sujeitas a neblina e

próximas a culturas de tomateiro; d) adubação equilibrada; e) pulverizações

preventivas com fungicidas (MADDEN; PENNYPACKER; MAC NAB, 1978;

KUROZAWA & PAVAN, 2005)

Potencialmente, o uso de cultivares resistentes seria a forma de controle

mais econômica estendendo os intervalos entre as pulverizações de fungicidas

(MADDEN; PENNYPACKER; MAC NAB, 1978; KEINATH; DU BOSE;

RATHWELL, 1996), mas, na prática, o progresso no melhoramento por

resistência à pinta preta tem sido limitado pela falta de genes de resistência no

tomateiro cultivado e pela expressão quantitativa e herança poligênica da

resistência (CHAERANI & VOORRIPS, 2006).

11

2.5 Cultivares resistentes


segura para o controle das doenças, fundamentalmente por reduzir os custos

de produção e evitar danos à saúde humana e ao ambiente. Altos níveis de

resistência à pinta preta são raros no tomateiro cultivado [Solanum

lycopersicum (PERALTA; KNAPP, SPOONER, 2005), sin. Lycopersicon

esculentum Mill.]. No entanto, várias espécies de tomateiro selvagens (S.

habrochaites [sin. L. hirsutum, S. pimpinellifoium [sin. L. pimpinellifolium], S.

peruvianum [sin. L. peruvianum e S. chilense [sin. L. chilense]) têm sido

identificadas como fontes potenciais de resistência (NASH & GARDNER

1988b; POYSA & TU 1996; FOOLAD et al. 2000; THIRTHAMALAPPA &

LOHITHASWA 2000). Chaerani e Voorrips (2006) sumarizam as fontes de

resistência à pinta preta, podridão de colo e lesão da haste em trabalhos

publicados desde 1945 até 2000 (Quadro 1). Esses autores assinalam que o

sucesso na incorporação de resistência é limitado, pois a maioria das linhagens

usadas em melhoramento (NC EBR-1, NC EBR-2 [GARDNER 1988], NC EBR-

4 [GARDNER & SHOEMAKER 1999], HRC90.303 e HRC91.341 [POYSA & TU

1996]) são de amadurecimento tardio, apresentam crescimento indeterminado

e baixo rendimento. Todas essas linhagens são derivadas de acessos de S.

habrochaites (sin. L. hirsutum).

A maioria dos estudos genéticos sobre a herança da resistência à

pinta preta, usando várias espécies de Solanum como fontes de resistência,

concluem que a resistência é uma característica quantitativa e de controle

poligênico (CHAERANI & VOORRIPS, 2006). As estimações de herdabilidade

da resistência à pinta preta são baixas a moderadas (NASH & GARDNER,

1988a; FOOLAD & LIN, 2001; FOOLAD et al., 2000) indicando que o progresso

baseado somente em avaliações fenotípicas é provavelmente baixo.

Chaerani e Voorrips (2006) sugerem que a seleção assistida por

marcadores seria potencialmente útil em acelerar a transferência de genes de

resistência à pinta preta em novos cultivares de tomateiro.

12

Quadro 1. Fontes genéticas de resistência à pinta preta, podridão de colo e lesão da haste (Adaptado de Chaerani & Voorrips, 2006)

Fonte original Linhagem

resistente ou variedade

Testes usados

para confirmar

resistência

Referências

Resistência à pinta preta

Solanum iycopersicum (sin. Lycopersicon esculentum)a

Fonte desconhecida C1943 C Barksdale 1971 68B134 71B2 C Barksdale 1969 sin. Lycopersicon esculentum f. sp. cerasiforme

b PI 406758 - C Martin e Hepperly 1987

C1943 NC NBR-2 C,CV Gardner 1988 Acessos desconhecidos HRC90.145,

HRC90.158, HRC90.159

CV Poysa e Tu 1996

NC EBR-1 NC EBR-4 C Gardner e Shoemaker 1999 NC EBR-1 IHR1816 C Thirthamallappa e

Lohithaswa 2000 NC EBR-1 e -2 NC EBR-3 C Gardner e Shoemaker 1999 NC EBR-3 e -4 Mountain Supreme C Gardner e Shoemaker 1999 NC EBR-5 e -6 Plum Dandy C Gardner 2000 71B2 NC EBR-5 C Gardner 2000 71B2 NC EBR-6 C Gardner 2000

Solanum habrochaites (sin. Lycopersicon hirsutum)a

PI 127827 - L Locke 1949 PI 390514, PI 390662 - C Martin e Hepperly 1987 PI 126445 NC EBR-1 C Gardner 1988 PI 1390662 87B187 C Maiero et al. 1990ª B 6013 H-7, H-22, H-25 C Kallo e Banerjee 1993 Acessos desconhecidos HRC90.303,

HRC91.279, HRC91.341

CV Poysa e Tu 1996

LA2100, LA 2124, LA2204 - CV Poysa e Tu 1996 PI 126445 NC39E C Foolad et al. 2002

Solanum peruvianum (sin. Lycopersicon peruvianum)a

PE 33 - CV Poysa e Tu 1996 Solanum pimpinellifolium (sin. Lycopersicon pimpinellifolium)a

PI 365912, PI 390519 - C Martin e Hepperly 1987 A 1921 P-1 C Kallo e Banerjee 1993 L4394 (IHR1939) - C Thirthamallappa e

Lohithaswa 2000

Resistência à podridão de colo

Fonte desconhecida Devon Surprise C Reynard e Andrus 1945 Fonte desconhecida C1943 CV Maiero et al. 1990b Solanum pimpinellifolium (sin. Lycopersicon racemigerum)b 87610005

- ? Stancheva et al. 1991

Solanum liycopersicum (sin. Lycopersicon humbodltii)b 87610003


Solanum chilense (sin. Lycopersicon chilense)b 87610011


Resistência à lesão da haste

Solanum liycopersicum 83602029 ? Stancheva et al. 1991 Solanum cheesmaniae (sin. Lycopersicon cheesmanii f. typicum)b 15

? Stancheva et al. 1991

Solanum neorickii (sin. Lycopersicon minutum)b 87610006

? Stancheva et al. 1991

C, Campo; CV casa de vegetação; L, laboratório a Peralta; Knapp, Spooner (2005) b Peralta, Knapp e Spooner (comunicação pessoal aos autores)

13

É possível identificar fontes de resistência em avaliações a campo,

mas a duração dos ensaios, a impossibilidade de controlar as condições

ambientais necessárias para a infecção e a presença de outros patógenos

foliares são as maiores desvantagens desse tipo de teste (LOCKE, 1948;

FOOLAD et al. 2000; PANDEY et al. 2003). No campo, a severidade da pinta

preta é avaliada em termos de porcentagem de desfolha e de porcentagem de

área foliar necrosada na planta. Devido ao fato de os sintomas nas folhas

superiores corresponderem a menos de 2% do dano total, a avaliação do dano

se concentra na parte média ou inferior da folhagem. Christ (1991) propôs a

porcentagem de área necrótica no terço médio como boa estimativa da

severidade de pinta preta. As epidemias de pinta preta progridem lentamente

no início, mas aceleram quando as plantas amadurecem, resultando em uma

curva de progresso da doença tipicamente sigmoide (NASH & GARDNER

1988b).

Ocasionalmente a curva é bimodal devido à emergência de novas

folhas sadias após o primeiro ciclo de infecção. Uma única avaliação pode

subestimar ou superestimar o nível de resistência de um hospedeiro em

particular, e por isso as avaliações de campo devem estar baseadas em várias

observações, as quais são usadas para construir a curva de progresso da

doença. A curva de progresso da doença integra os efeitos do hospedeiro, do

patógeno e das condições ambientais que ocorrem durante a epidemia

(PANDEY et al., 2003).

Ensaios em casa de vegetação ou em câmaras de crescimento

oferecem condições ambientais mais uniformes, favoráveis e repetíveis, além

de permitirem vários ciclos de avaliações por ano, determinando resultados

mais confiáveis. Além disso, os resultados obtidos em condições controladas

apresentam boa correspondência com os resultados de campo (FOOLAD et al.,

2000). Os métodos de “screening” usados atualmente em condições de casa

de vegetação estão baseados no método estabelecido por Barksdale (1969).

Geralmente, as plantas são inoculadas através de pulverização quando

apresentam 4 a 6 semanas de idade e mantidas em condições 100% de

umidade relativa (UR) nas primeiras 24 h, seguido de períodos noturnos de 12-

16 h a 100% de UR por 5-7 dias (CHAERANI et al., 2007). A severidade da

pinta preta é avaliada aos 7 dias pós-inoculação através da estimação da

14

porcentagem de área necrosada nas folhas que já estavam presentes no

momento da inoculação. No caso de baixa incidência de manchas necróticas, a

severidade da pinta preta pode ser expressa como o número de lesões

(BARKSDALE, 1969).

As lesões de pinta preta que resultam da uma inoculação por

pulverização estão espalhadas sobre as folhas, o que requer que o avaliador

estime a área combinada de todas as lesões em todos os folíolos e a resuma

em uma porcentagem da área foliar total. Essas leituras de doença, embora

rápidas, apresentam altos níveis de subjetividade, além de não serem

suficientemente sensitivas para discriminar plantas moderadamente resistentes

das suscetíveis (GARDNER, 1990). Testes usando folíolos destacados para

avaliar resistência à pinta preta não se correlacionaram bem com os testes

feitos em casa de vegetação ou a campo, o que poderia indicar que a planta

inteira é requerida para a expressão da resistência (FOOLAD et al., 2000;

CHAERANI et al., 2007).

A severidade da doença pode ser determinada de forma mais precisa e

objetiva através da medição das lesões quando o inóculo é aplicado como

gotas isoladas nos folíolos (NASH & GARDNER, 1988b; CHAERANI et al.,

2007). Esse método foi introduzido primeiramente por Locke (1948) para

encontrar fontes de resistência à pinta preta (LOCKE, 1949). Nash & Gardner

(1988a) aplicaram esse método em um ensaio de plantas inteiras medindo o

diâmetro da lesão. A resistência à pinta preta de três parentais e da F1

resultante foi testada em casa de vegetação e os resultados se

correlacionaram bem com testes a campo. Chaerani et al. (2007) realizaram

um “screening” de um grande número de acessos de uma coleção de

tomateiros com o objetivo de identificar fontes potenciais de resistência à pinta

preta usando o método de inoculação de gota e a inoculação por pulverização.

Seus resultados indicaram que o método de gota é simples de aplicar, oferece

uma leitura objetiva da severidade da pinta preta e uma melhor caracterização

dos acessos. Algumas das discrepâncias encontradas entre os resultados dos

métodos foram explicadas devido a dois fatores principais. Um é de que

algumas espécies de tomateiro selvagens desenvolveram necroses em

condições de casa de vegetação muitas vezes indistinguíveis das lesões de

pinta preta quando a inoculação era feita por pulverização, enquanto que

15

quando a inoculação era feita por gota, as lesões foram facilmente

reconhecidas. O segundo fator foi a queda de folhas que ocorreu devido a

lesões no pecíolo da folha, levando a leituras erradas de grandes lesões no

caso de inoculação por pulverização.

3. Mecanismos de defesa das plantas

A resistência de um hospedeiro a um patógeno pode ser definida como

a capacidade da planta em atrasar ou em evitar a entrada e a subsequente

atividade de um patógeno em seus tecidos (PASCHOLATI & LEITE, 1995). Os

mecanismos de resistência das plantas são divididos em duas categorias: pré-

formados (presentes nas plantas antes do contato com o patógeno) e pós-

formados (produzidos ou ativados em resposta à presença do patógeno). Cada

grupo de mecanismos compreende, por exemplo (RESENDE & MACHADO,

2000; PASCHOLATI & LEITE, 1995; LO & NICHOLSON, 2008):

a) Pré-formados (passivos, constitutivos): estruturais (cutícula, tricomas,

estômatos, fibras/vasos condutores) e bioquímicos (fenóis, alcaloides

glicosídeos, lactonas, glicosídeos fenólicos e cianogênicos, inibidores

protéicos, fototoxinas).

b) Pós-formados (ativos, induzíveis): geração de espécies reativas de

oxigênio (EROs), reforço de paredes celulares (papilas, halos, lignificação),

síntese de proteínas relacionadas à patogênese (PR proteínas), e acúmulo de

fitoalexinas.

3.1 Mecanismos de defesa pré-formados

Análises ultraestruturais das respostas celulares nos hospedeiros

resistentes durante as interações fungo-planta têm revelado múltiplos

mecanismos de defesa para evitar o desenvolvimento das doenças (PARK &

IKEDA, 2008).

As camadas celulares cuticulares e camadas de cera epicuticulares são

consideradas como o primeiro mecanismo de defesa contra os patógenos. A

presença de cera aumentaria a hidrofobicidade da superfície foliar, resultando

em uma folha mais seca que limitaria a germinação de conídios e a formação

16

de tubos germinativos, diminuindo por tanto a incidência de doença (FOOLAD;

MERK; ASHRAFI, 2008).

Os efeitos de folhas cerosas têm sido reportados em várias interações

de Alternaria sp e Brassicas. No patossistema A. brassicae-canola, a maior

quantidade de cera na camada epicuticular presente em alguns cultivares

determinou menor germinação de conídios e menor número de tubos

germinativos produzidos (CONN & TEWARI, 1989). No patossistema A.

brassicae/A. brassicicola – couveflor, as cultivares que foram resistentes frente

ao patógeno apresentaram maior deposição de cera epicuticular nas suas

folhas (SHARMA et al., 1991). Os mecanismos de resistência em canola e

mostarda frente à mancha de Alternaria (causada por A. brassicae, A.

brassicicola, A. raphani e A. alternata) foram identificados como presença de

cera epicuticular e componentes bioquímicos pré-existentes ou de rápido

acúmulo como fenóis, flavonoides e orto-dihidroxi fenóis (SAHARAN &

NARESH MEHTA SANGWAN, 2003).

Tratamentos de calor que resultaram na remoção parcial da camada

cerosa natural do fruto de tomate e condições de congelamento aumentaram a

suscetibilidade dos frutos à infecção de A. alternata (BARKAI-GOLAN &

KOPELIOVITCH, 1989). Os autores destacam que a habilidade do patógeno

em penetrar o pericarpo tem um papel primordial na resistência dos genótipos

de tomateiros à infecção.

Estudos realizados por El-Farnawany (2006) com as cultivares de

tomateiro Castle rock, Strain-B e Super strain indicaram que os diferentes

níveis de suscetibilidade à pinta preta podem estar relacionados a

características estruturais e à composição da superfície foliar. O autor sugere

que a menor densidade estomatal e o conteúdo de cera maior da cv. Castle

rock, em comparação com os outros cultivares explicaria, pelo menos em parte,

sua maior resistência à pinta preta.

Propágulos de fungos que tenham atingido com sucesso a superfície

da folha de uma planta (filoplano) competirão com outros organismos que estão

vivendo ali (filosfera) (LEITE & STANGARLIN, 2008). Vários estudos têm

demonstrado que certos microrganismos presentes na superfície foliar

interferem no crescimento das hifas de fungos fitopatogênicos. Bactérias

isoladas a partir de folhas, coroa e raízes de girassol inibiram o crescimento in

17

vitro de patógenos causadores da mancha de Alternária (A. helianthi), de

murcha (Sclerotium [Corticium] rolfsii) e podridões radiculares (Rhizoctonia

solani e Macrophomina phaseolina). As bactérias antagonistas isoladas do

filoplano foram principalmente actinomicetes e bactérias Gram positivas,

enquanto que as isoladas da coroa e raízes foram identificadas como

Pseudomonas fluorescens-putida, P. maltophilia, P. cepacia, Flavobacterium

odoratum e Bacillus sp (HEBBAR et al., 1991).

A estirpe SON-17 da actinobactéria Nocardioides thermolilacinus,

isolada originalmente da rizosfera de plantas de tomateiro, demonstrou

potencial como agente de biocontrole de pinta preta reduzindo

significativamente a severidade da doença quando pulverizada na parte aérea

de tomateiros em experimentos em casa de vegetação e ensaios de campo. O

único mecanismo inibitório de Nocardioides thermolilacinus testado no trabalho

foi a inibição in vitro da germinação dos conídios de A. solani. O porcentual de

germinação dos conídios em água foi de 65,66% e de 6,66% na presença de

propágulos do antagonista, porcentual estatisticamente igual ao do fungicida

clorotanil (3,0%) (CARRER FILHO; ROMEIRO; GARCIA, 2008).

A epiderme de alguns vegetais apresenta “pelos”, denominados

genericamente tricomas, que, estruturalmente, são extensões da epiderme. Os

tricomas podem ser unicelulares ou pluricelulares e alguns, chamados de

tricomas glandulares, podem produzir exsudatos de composição variada. Esses

exsudatos repelem ácaros e insetos e podem inibir a germinação de esporos

fúngicos e a multiplicação de bactérias (LEITE & STANGARLIN, 2008).

Em algumas espécies selvagens de tomateiro observou-se que os

tricomas glandulares (tipo I, IV e VI) das folhas sintetizam vários fitoquímicos

tóxicos para alguns insetos praga da cultura de tomate. Entre eles, metil-

ketonas, a partir dos exsudatos dos tricomas tipo VI de S. habrochaites, tóxico

a larvas de Manduca sexta; acilglucoses sintetizados em tricomas tipo IV de S.

pennelli, tóxicas a larvas de H. zea e S. exigua e para o áfideo da batata

Macrosiphum euphorbiae (FRELICHOWSKI & JUVIK, 2001). Os tricomas

glandulares tipo VI são particularmente abundantes nas folhas e hastes do

tomateiro cultivado Solanum lycopersicum e Solanum habrochaites. No

entanto, os tricomas de S. lycopersicum acumulam monoterpenos e os de S.

habrochaites, altos níveis de sesquiterpenos, na maioria em forma de

18

derivativos de ácido carboxílico com atividade inseticida (GIANFAGNA;

CARTER; SACALIS, 1992; BESSER et al., 2009).

Em S. pennellii, os tricomas glandulares tipo IV exsudam acilglucoses

que contêm frações hidrofílicas e hidrofóbicas que ajudam a reter a umidade e

contribuem à sobrevivência em condições de seca extrema, característica da

região dos Andes peruanos, onde é nativa essa espécie. Nomomura et al.

(2009) descobriram que, em tratamentos artificiais de umidade em névoa de 30

s de duração, o exsudato condensava a umidade formando gotas de água no

ápice dos tricomas, sendo depois absorvida pela planta através do tricoma.

Tratamentos mais longos (40 s) causaram o deslizamento das gotas

localizadas nos ápices dos tricomas até a superfície foliar. Devido à

característica anfipática dos exsudatos, as gotas formaram uma camada fina

na superfície foliar. Os autores verificaram que esses exsudatos formaram uma

barreira química, mostrando ter atividade antifúngica frente a Oidium

neolycopersici através da supressão da germinação conidial. Embora S.

pennellii seja suscetível ao oídio, o mecanismo de condensação de água dos

exsudatos dos tricomas tipo IV pode contribuir à supressão da infecção por O.

neolycopersici.

É necessária maior investigação das substâncias exsudadas pelos

tricomas de espécies selvagens de tomateiro, para determinar o potencial

dessas substâncias na toxicidade frente a patógenos. A introdução de

características como densidade de tricomas e taxa de produção de compostos,

desde espécies selvagens para o tomateiro cultivado, já é uma alternativa em

alguns programas de melhoramento de tomate (GOFFREDA et al., 1989;

NOMOMURA et al., 2009).

3.2 Mecanismos de defesa pós-formados

3.2.1 Espécies reativas de oxigênio

As espécies reativas de oxigênio (EROs) são moléculas reduzidas,

transitórias e altamente reativas, produzidas no caminho metabólico de

transformação do oxigênio molecular (O2) a água (H2O) (BAKER & ORLANDI,

1995). As seguintes espécies reativas de oxigênio podem ser geradas

19

(HEISER & OßWALD, 2008): oxigênio singlete (singlet oxygen) (1O2), radical

superóxido (O2.-), peróxido de hidrogênio (H2O2), radical hidroxil (OH•) (Figura

1).

Figura 1. Interconversão de espécies reativas de oxigênio (EROs) derivadas do oxigênio molecular (O2). O estado fundamental do oxigênio molecular (O2) pode ser ativado por um excesso de energia, invertendo o giro de um dos elétrons não pareados para formar o oxigênio singlete (1O2). Alternativamente, a redução de um elétron leva à formação do radical superóxido (O2.-). O2.- existe em equilíbrio com seu ácido conjugado, o radical hidroperoxil (HO2●). Reduções sucessivas formam peróxido de hidrogênio (H2O2), radical hidroxil (OH•), e água (H2O). Ions metálicos que estão principalmente presentes nas células na forma oxidada (Fe3+) são reduzidos na presença do O2.- e, consequentemente, podem catalisar a conversão de H2O2 a OH• pela reação de Fenton ou Haber–Weiss (VRANOVÁ; INZÉ; VAN BREUSEGEM, 2002).

Inicialmente, a cadeia de reações necessita de uma entrada de

energia, enquanto os passos posteriores são exotérmicos e podem ocorrer

espontaneamente, sejam catalisados ou não. A aceitação de um excesso de

energia pelo oxigênio molecular inverte o giro de um dos elétrons não pareados

para formar oxigênio singlete (VRANOVÁ; INZÉ; VAN BREUSEGEM, 2002). A

partir da adição de um simples elétron, o oxigênio molecular é convertido ao

radical superóxido (O2.-), um processo mediado, provavelmente, por

peroxidases ou NAD(P)H oxidases associadas à membrana, ou mesmo por

lipoxigenases a partir de ácidos graxos e O2 (MEHDY, 1994). O O2.- é

moderadamente reativo, tem vida curta (vida-média 2-4 µs), e não atravessa

reação de Fenton/

Haber-Weiss

20

membranas biológicas (VRANOVÁ; INZÉ; VAN BREUSEGEM, 2002). O O2.-

existe em equilíbrio com seu ácido conjugado, radical hidroperoxil (HO2●) . Os

radicais hidroperoxil que são formados pela protonação do O2.- em soluções

aquosas podem atravessar membranas celulares e subtrair átomos de

hidrogênio dos ácido graxos poli-insaturados e dos hidroperóxidos lipídicos,

iniciando a auto-oxidação lipídica (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1989).

O superóxido formado pode ser "dismutado" e regenerar O2 e peróxido

de hidrogênio (H2O2), o que pode ocorrer espontaneamente em pH neutro ou

pela ação da enzima superóxido dismutase (SOD). Alternativamente, o O2.-

reduz quinonas e complexos de Fe3+ e Cu2+, o que afeta enzimas que contêm

metais. O H2O2 formado pode sofrer diferentes transformações: reduzido ao

radical hidroxil (OH•); convertido a H2O e O2 pela ação da catalase; convertido

a H2O pela oxidação de moléculas substratos, como ascorbato, via peroxidases

(WOJTASZEK, 1997; HEISER, I.; OßWALD, W.F.; ELSTNER, 1998). O H2O2 é

moderadamente reativo e tem uma vida relativamente longa (vida-média de 1

ms) podendo difundir alguma distância desde seu local de produção. O H2O2

pode inativar enzimas ao oxidar seus grupos tiol, por exemplo Cu/Zn SOD e

enzimas do ciclo de Calvin (VRANOVÁ; INZÉ; VAN BREUSEGEM, 2002).

A mais reativa de todas as EROs é o radical hidroxil que é formado a

partir do H2O2 pela chamada reação de Haber-Weiss ou Fenton usando metais

como catalizadores (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1989). O OH• pode reagir

potencialmente com todas as moléculas biológicas e como as células não têm

mecanismos enzimáticos para eliminá-lo, sua produção em excesso leva à

morte celular. Moller (2001) indica três mecanismos principais pelos quais o

OH• danifica as células: reagindo com proteínas e, portanto, reduzindo a

atividade enzimática, reagindo com lipídios aumentando a permeabilidade das

membranas e reagindo com DNA causando mutações.

Espécies reativas de oxigênio podem se acumular rapidamente no

início do processo infeccioso em ambas as interações patógeno-hospedeiro

compatíveis ou incompatíveis, em um processo conhecido como explosão

oxidativa (LAMB et al., 1989). A explosão oxidativa tem sido verificada em

reações de hipersensibilidade em resposta a infecção por fungos (VERA-

ESTRELLA; BLUMWALD; HIGGINS, 1993) e bactérias (BAKER et al., 1993).

21

Podemos diferenciar artificialmente três fases na produção de EROs

durante a interação planta-patógeno. Na fase I, ocorre o reconhecimento dos

elicitores provenientes do patógeno (carboidratos, proteínas ou porções de

glicoproteínas), o que dispara os eventos de transdução de sinais. Durante a

fase II são iniciados vários processos relacionados à defesa resultante do

reconhecimento ocorrido na fase I, onde se incluem aumento de antioxidantes,

ação de lipoxigenases, a HR, produção de fitoalexinas, lignificação e

resistência sistêmica adquirida (SAR). A fase III compreende o processo de

evolução da patogênese levando ao desenvolvimento de sintomas visíveis. Na

natureza, dependendo das interações, ocorrerá uma sobreposição dos eventos

fisiológicos (BAKER & ORLANDI, 1995).

Em células vegetais, têm sido encontradas duas fases de indução de

EROs por elicitores fúngicos e bacterianos. A fase I é uma resposta muito

rápida (poucos minutos), que possivelmente envolve uma interação elicitor-

receptor, e que nem sempre está correlacionada com a resistência à doença,

pois pode também ocorrer em interações compatíveis. Na fase II ocorre uma

explosão mais forte e prolongada, que está diretamente correlacionada com a

resistência da planta ao patógeno, provocando a morte localizada de células

(resposta de hipersensibilidade), sendo características de interações

incompatíveis (BAKER & ORLANDI, 1995; LAMB & DIXON, 1997).

A rápida geração e acúmulo de espécies reativas de oxigênio,

desencadeadas pela explosão oxidativa após a percepção dos sinais de

avirulência do patógeno atua em diferentes funções de defesa. Dentre as

várias funções das EROs na defesa vegetal, podemos citar o efeito tóxico

direto de H2O2 ao patógeno, agindo como um agente antifúngico e

antibacteriano (MEDHY et al., 1996). O H2O2 participa do cruzamento oxidativo

(“cross-linking”) de proteínas da parede celular formando, com a matriz de

polissacarídeos, um grande polímero de várias glicoproteínas ricas em

hidroxiprolina, reforçando estruturalmente a parede celular. O H2O2 também

atua como importante substrato das peroxidases e, por conseguinte, favorece o

processo de lignificação, com formação de precursores de polímeros de lignina,

via atividade da peroxidase (ALVAREZ et al., 1998). Por último, esses autores

também reportam o papel do H2O2 na sinalização para respostas de defesa da

planta frente ao ataque do patógeno, por causa da sua vida relativamente

22

longa e a capacidade de atravessar membranas biológicas, o que acontece

como consequência de não possuir elétron pareado (Figura 2).

Assim, após o reconhecimento de um patógeno avirulento, ocorre uma

explosão oxidativa que gera O2.- e H2O2 e essas EROs induzem genes de

defesa e morte celular localizada (HR). O H2O2 aumenta a atividade da enzima

ácido benzóico 2-hidrolase, requerida para a biossíntese do ácido salicílico,

potente sinalizador para ocorrência da resistência sistêmica adquirida (SAR)

(RESENDE; SALGADO; CHAVEZ, 2003; MARTINEZ et al., 2000).

Figura 2. Interconexões do H2O2, óxido nítrico (NO) e ácido salicílico (AS) para a ativação e coordenação das múltiplas reações de defesa das plantas (adaptado de Hammond-Kosack & Jones, 2000). SOD (superóxido dismutase), SAGase (AS glicosiltransferase) e BA-2H (ácido benzóico 2-hidrolase).

23

A explosão oxidativa é necessária, mas não suficiente para disparar a

morte celular. Delledonne (2005) indica que a reação de hipersensibilidade

(HR) está caracterizada pelo rápido acúmulo de EROs e óxido nítrico (NO).

Segundo esse autor, as EROs e o NO constituem um sistema de sinalização

que desencadeia morte celular localizada, indução de genes de defesa e são

mediadores da rede envolvida no estabelecimento da SAR (Figura 3). O NO

também teria um papel importante como sinal intracelular que funciona na

propagação célula a célula da HR.

Figura 3. Representação da sinalização do NO durante a reação de hipersensibilidade (HR) (traduzido a partir de Delledone, 2005). AC, ácido cinâmico; Ca2+, fluxo de cálcio; ADPRc, ADP ribose cíclica; Cat, catalase; C4H, ácido cinâmico-4-hidroxilase; CHS, chalcone sintetase; GMPc, GMP cíclico; GPX, glutationa peroxidase; GSNO, S-nitroso-L-glutationa; GST, glutationa S-transferase; NOS, óxido nítrico sintetase; ONOO-, peroxinitrito; FAL, fenilalanina amônia-liase; FA, fenilalanina; PR, proteínas relacionadas à patogênese; AS, ácido salicílico; SOD, superóxido dismutase.

24

Vranová, Inzé e Van Breusegem (2002) sumarizam as fontes que

geram EROs em plantas. Sob condições de estresse ambiental que limitam a

fixação de CO2, a regeneração do NADP+ pelo ciclo de Calvin é reduzida e,

consequentemente, a cadeia de transporte eletrônico sofre super-redução,

formando radicais superóxido e oxigênio singlete. As NAD(P)H oxidases

associadas à membrana que liberam O2.- a partir de oxigênio molecular,

constituem uma fonte importante de radical superóxido. A NADPH oxidase, as

peroxidases de parede celular, oxalato oxidases e amino oxidases têm sido

propostas como fontes de H2O2 no apoplasto.

As EROs ocorrem normalmente no metabolismo celular, porém,

quando acumuladas, tornam-se tóxicas à célula, principalmente quando se

convertem em espécies muito mais reativas como o radical hidroxil (OH-).

Devido aos danos causados pelo acúmulo de EROs, as plantas utilizam

sistemas enzimáticos e não enzimáticos para prevenir o dano nos

componentes celulares do hospedeiro.

A enzima ascorbato peroxidase junto com glutationa redutase e

dehidroascorbato redutase, pertencem a um mecanismo de detoxificação de

H2O2 conhecido como via ascorbato-GSH (ou via Halliwell-Asada)

(TOMÁNKOVÁ et al., 2006). A catalase (CAT) catalisa a reação de degradação

do peróxido de hidrogênio em água e oxigênio, reduzindo, dessa forma, o

excesso de EROs durante o estresse oxidativo. A superóxido dismutase (SOD)

catalisa a dismutação do O2.- a H2O2. Além de gerar H2O2, as peroxidases

também são capazes de reduzir seu nível através de polimerização de álcoois

hidroxicinamil durante a biossíntese da lignina e suberina, de processos como

a ligação cruzada das proteínas de parede celular e de pectinas através de

pontes diferúlicos (TOMÁNKOVÁ et al., 2006; MLÍČKOVÁ et al., 2004).

Sistemas antioxidativos não enzimáticos, tais como glutationa, ascorbato

(BAKER & ORLANDI, 1995), tocoferol e compostos fenólicos: fenilpropanoides,

carotenoides e flavonoides previnem o dano dos componentes celulares pelas

EROs (SEDLAROVÁ et al., 2007).

A detecção e a quantificação de EROs em sistemas biológicos é

particularmente difícil devido à rápida destruição e detoxificação (“scavenging”)

desses radicais por mecanismos antioxidantes celulares. Além disso, as EROs

são difíceis de serem detectadas diretamente por métodos

25

espectrofotométricos ou HPLC. Por isso, a maioria das técnicas de detecção

baseia-se na oxidação ou na redução de certos compostos pelas EROs

(RESENDE; SALGADO; CHAVEZ, 2003). Alguns métodos de detecção de

EROs em plantas podem ser: macroscópico/microscópico (com nitroblue

tetrazólio, amido/iodeto de potássio e cloreto de titânio); espectrofotométrico

(com nitroblue tetrazólio, citocromo C e epinefrina); fluorescente (com piranina

e escopoletina) e quimioluminescente (com luminol e luciginina) (BAKER &

ORLANDI, 1995).

3.2.2 Resposta de hipersensibilidade

O termo hipersensibilidade foi usado por primeira vez por Stakman

(1915), para descrever a morte rápida e localizada das células no sítio de

infecção, induzida pelo fungo da ferrugem em plantas de cereais resistentes ao

patógeno. Usualmente, a resposta de hipersensibilidade (HR) é definida como

a morte rápida de células da planta associada com a restrição do crescimento

do patógeno (GOODMAN & NOVACKY, 1994). A HR é geralmente

reconhecida pela presença de células mortas, de cor marrom, no sítio de

infecção e, dependendo do patógeno, o número de células envolvidas pode

variar de uma a várias. A HR pode estar restringida ou não à célula invadida ou

em contacto direto com patógeno (HEATH, 2000). A necrose do tecido afetado

é diretamente relacionada ao acúmulo, oxidação e polimerização de fenóis

(NICHOLSON; HIPSKIND; HANAU, 1989).

Após a primeira publicação sobre HR, várias mudanças morfológicas,

fisiológicas e moleculares foram identificadas como coincidentes com a rápida

morte celular determinada pela HR. A produção de fitoalexinas, de enzimas

hidrolíticas, de proteínas relacionadas à patogênese, de inibidores de protease

e a deposição de lignina e calose em paredes celulares da planta, têm sido

propostos como contribuintes individuais ou em conjunto à resistência a

doenças. No entanto, já que muitas dessas respostas, incluindo a morte celular

por HR, são induzidas simultaneamente durante o ataque do patógeno, fica

difícil determinar como cada uma contribui na resistência à doença (RICHAEL

& GILCHRIST, 1999).

26

Para patógenos biotróficos, que requerem uma célula viva para se

alimentar, a morte celular da planta no local de infecção (resposta de

hipersensibilidade) é um mecanismo efetivo de resistência à doença. Para

patógenos necrotróficos, com capacidade de utilizar células mortas como

substrato, a morte celular por si só não restringe, no entanto, o crescimento do

patógeno. Essa restrição é atribuída às várias repostas de defesa induzidas

que ocorrem tipicamente nas células que estão morrendo e nas células vivas

vizinhas. Para autores como Heath (2000) e Richael & Gilchrist (1999), a HR

inclui, portanto, tanto a morte celular quanto a expressão de genes de defesa.

É importante ressaltar que a resistência a doenças e todas as respostas de

defesa induzíveis comumente associadas com HR podem ocorrer em plantas

na ausência de morte celular. Além disso, os patógenos podem também causar

morte celular e disparar respostas de defesa enquanto crescem com sucesso

em tecidos suscetíveis (HEATH, 2000). Heath (2000) sugere que a razão pela

qual a morte celular esteja consistentemente associada com resistência a

doenças está relacionada ao fato de que essa morte celular localizada causada

por elicitores de patógenos libera sinais (elicitores endógenos) que causam

respostas defensivas nas células circundantes.

É amplamente aceito que as EROs provocariam ou executariam a HR.

Desde o descobrimento da explosão oxidativa, a geração de EROs é

observada em suspensões de células em resposta a bactérias incompatíveis

(BAKER & ORLANDI, 1995) ou a patógenos oomicetes (NATON;

HAHLBROCK; SCHMELZER et al., 1996), assim como frente a elicitores

inespecíficos (LAMB & DXON, 1997) e específicos (HIGGINS et al., 1998) e

perturbações mecânicas das células (GUS-MAYER et al., 1998). Alguns

estudos, no entanto, não sustentam o papel das EROs na indução da HR

(HEATH, 2000). Estudos citológicos da interação cevada-oídio sugerem que as

EROs, embora presentes, não são um requerimento para a elicitação de HR

(HÜCKELHOVEN & KOGEL, 1998). Em estudos equivalentes no patossistema

feijão caupi-ferrugem não foi detectada geração de EROs prévia ao início de

morte celular por HR (HEATH, 1998). O papel variável das EROs como

provocador da HR pode ser explicado também pelo fato de que os

detoxificadores (“scavengers”) de ROS podem inibir a morte celular induzida

por elicitores em algumas situações (LAMB & DIXON, 1997), mas não em

27

outras (YANO; SUZUKI; SHINSHI, 1999). Estudos que examinaram os efeitos

de detoxificadores de EROs na HR induzida por patógenos revelaram que eles

podem inibir a HR induzida por vírus (KATO & MISAWA, 1976) ou por bactérias

(KEPPLER & NOVACKY, 1987), mas não a HR causada por fungos em

hospedeiros resistentes (HEATH, 1998).

Em conjunto, esses dados sugerem que o papel das EROs na indução

de morte celular por HR pode diferir em diferentes combinações planta-

patógeno (HEATH , 2000).

3.2.3 Papilas

A parede celular da planta representa uma barreira física à entrada de

patógenos em potencial, sendo composta principalmente por celulose,

hemicelulose e pectina. Proteínas estruturais, como as glicoproteínas ricas em

hidroxiprolina, assim como materiais fenólicos, também são importantes

componentes da parede celular e podem ter importantes papéis na contenção

do patógeno e na restrição do aumento da lesão (LO & NICHOLSON, 2008).

A formação de papilas e de justaposições de parede é um tipo de

reforço que ocorre rapidamente na parede celular após a tentativa de invasão

fúngica. As papilas podem se formar após dois ou três minutos ou até horas

após o ataque, na parte interna da parede celular, no local de penetração da

hifa na célula vegetal (ALVES; LEITE; KITAJIMA, 2008). As papilas são

heterogêneas quanto à composição e, embora lignina e calose sejam

tipicamente os maiores componentes das papilas, celulose, proteína, suberina,

gomas, silicone, fenóis simples e quitina também podem estar presentes (LO &

NICHOLSON, 2008). Acredita-se que a função das papilas na defesa frente a

fungos fitopatógenos seja o bloqueio físico da penetração do fungo no interior

do hospedeiro. O papel das papilas na resistência de plantas é, no entanto,

variável nos diferentes sistemas patógeno-hospedeiro (AIST, 1976).

As papilas podem funcionar como mecanismos de resistência em

algumas interações patógeno-hospedeiro, isso podendo ser evidenciado com

uso de inibidores da formação de papilas. Quando coleóptilos de cevada

resistentes a Erysiphe graminis f. sp. hordei foram tratados com 2-deoxi-D-

glucose, a formação de papilas foi inibida, resultando em maior eficiência de

28

penetração dos conídios e maior formação de haustórios (BAYLES;

GHEMAWAT; AIST, 1990). A eficiência da papila como mecanismo de

resistência depende da frequência e da velocidade com que se forma

(VIDHYASAKARAN, 2008).

A formação de papilas e a deposição generalizada de calose não foram

consideradas importantes na ocorrência da resistência em plantas hospedeiras

e não hospedeiras frente a várias espécies de Alternaria, dado que essas

respostas celulares estiveram presentes em locais onde a penetração foi bem

sucedida (Mc ROBERTS & LENNARD, 1996). Araújo e Matsuoka (2004)

sugerem também que a formação de papilas não é uma reação específica à

resistência do tomateiro a A. solani após observarem a ocorrência de papilas e

halos sob apressórios tanto no material resistente (CNPH 417) quanto no

suscetível (cv. ‘Miller’).

3.2.4 Enzimas relacionadas à defesa de plantas

3.2.4.1 Peroxidase (POX) (EC 1.11.1.7)

A enzima peroxidase catalisa a oxirredução entre peróxido de

hidrogênio e vários redutores, estando presente em microrganismos e tecidos

de plantas e animais. POX é uma glicoproteína que contém um grupo heme e,

nas plantas, é codificada por uma família de multigenes. Além de ter um grande

número de isoformas, uma isoforma isolada pode atuar sobre vários substratos

in vitro e também mais de uma isoforma pode atuar sobre o mesmo substrato.

Tem sido demonstrado que várias peroxidases são expressas

constitutivamente em plantas. Algumas das peroxidases são, no entanto,

induzidas durante o estresse causado por patógenos (HIRAGA et al., 2001) e

essas peroxidases são consideradas como proteínas relacionadas a

patogêneses (proteínas - PR) pertencentes à família PR-9 (VIDHYASAKARAN,

2008).

São citadas várias funções das peroxidases na defesa celular. Uma

delas é a participação na lignificação, na suberização e em outros

metabolismos da parede celular. A oxidação desidrogenativa do guaiacol (o-

metoxi-fenol) resulta na formação de radicais fenoxi e a subsequente ligação

29

de radicais instáveis leva à polimerização não enzimática de monômeros. De

forma similar, ácido hidroxicinâmico, hidroxicinamil álcool e seus derivativos

são convertidos em radicais fenoxi. As espécies de hidroxicinamil álcool são

polimerizadas para formar lignina e os ácidos hidroxicinâmicos que contêm

grupos alifáticos são incorporados em suberina (HIRAGA et al., 2001). POXs

também oxidam domínios fenólicos de polissacarídeos ferulicolados

(polissacarídeo ligado a ácido ferúlico) (FRY, 1986) e resíduos de tirosina de

proteínas estruturais da parede celular, como glicoproteínas ricas em

hidroxiprolina. Essas macromoléculas sofrem ligação cruzada formando

moléculas maiores e mais complexas na parede celular. As macromoléculas

polimerizadas pelas POXs da parede celular são depositadas na superfície

extracelular, fortalecendo a parede celular, restringindo a invasão por

patógenos e restringindo a expansão celular, contribuindo ao enrijecimento do

corpo da planta (HIRAGA et al., 2001).

A expressão das POXs também está correlacionada com a ocorrência

de infecção por patógenos. Quando sofrem ataque de patógenos, as plantas

sintetizam um conjunto de proteínas relacionadas à defesa (proteínas PR)

(VAN LOON et al., 1994). Existem relatos de que as POX são induzidas em

infecções de plantas por fungos (THORDAL-CHRISTENSEN et al., 1992), por

bactérias (RASMUSSEN et al., 1995), por vírus (HIRAGA et al., 2000) e por

viroides (VERA; TORNERO; CONEJERO, 1993). O papel delas no processo de

defesa é: reforçar a parede celular através da formação de lignina, de suberina,

de polissacarídeos ferulicolados e de glicoproteínas ricas em hidroxiprolina

(FRY, 1986); o aumento na produção de EROs que atuam como mediadores

na sinalização; agir como agentes antimicrobianos (WOJTASZEK, 1997;

KAWANO & MUTO, 2000); e induzir a produção de fitoalexinas (KRISTENSEN;

BLOCH; RASMUSSEN, 1999).

Sedlářová et al. (2007), em um estudo da localização e metabolismo de

EROs em plantas de alface resistentes e suscetíveis a Bremia lactucae,

descreveram aumentos da quantidade de H2O2 junto com aumento de atividade

de enzimas que detoxificam peróxido de hidrogênio (POX e CAT) nos

genótipos resistentes após inoculação com esse oomiceto. Mlíčcková et al.

(2004) e Tománková et al. (2006) analisaram histoquímica e bioquimicamente a

interação de O. neolycopersici e três genótipos de tomate com níveis de

30

resistência diferentes: Solanum habrochaites var. glabratum (LA 2128)

(altamente resistente), S. chmielewskii (LA 2663) (moderadamente resistente) e

S. lycopersicum (cv. ‘Amateur’) (suscetível). Os autores relataram aumentos

importantes na produção de H2O2, acompanhada de aumentos na atividade da

POX, CAT e ascorbato peroxidase nos genótipos resistentes. Ambos os

trabalhos não registraram mudanças na formação de lignina em nenhum dos

genótipos estudados.

Anjana et al. (2008) registraram a atividade da peroxidase em genótipo

resistente e em um altamente suscetível de girassol frente a Alternaria

helianthi. A atividade da peroxidase foi significativamente maior no genótipo

resistente quando comparado com o suscetível. O papel da peroxidase como

mecanismo de resistência frente à doença foi testado com tratamento com

inibidores (azida de sódio e metabisulfito de sódio). O tratamento com esses

inibidores diminuiu a atividade da peroxidase constitutiva, assim como a

peroxidase induzida pelo patógeno. O pré-tratamento do genótipo resistente

com os inibidores seguido pela inoculação com o patógeno aumentou a

manifestação da doença. Os autores concluem que a peroxidase é uma enzima

importante no sistema de defesa contra o patógeno necrotrófico A. helianthi e

que pode ser usada como um marcador confiável para avaliar resistência em

girassol.

Fernández et al. (1996) estudaram a indução e os padrões

isoenzimáticos da peroxidase de guaiacol em folhas de plantas resistentes e

suscetíveis de tomateiro (S. lycopersicon) inoculadas com A. solani. Eles

verificaram um aumento significativo na atividade da peroxidase nas plantas

inoculadas, em comparação com as plantas sadias. A maior atividade foi

detectada aos sete dias pós-inoculação. Quando comparadas plantas

inoculadas de cultivares resistentes, moderadamente resistentes e suscetíveis,

comprovou-se que os cultivares resistentes apresentaram maior atividade da

enzima, mas não foram observadas diferenças entre seus padrões

isoenzimáticos.

O efeito de filtrados de A. solani sobre a atividade da peroxidase foi

testado em calos e folhas de três cultivares de tomateiro, os quais diferiram no

nível de resistência frente a esse patógeno. Os níveis mais altos de atividade

foram detectados em calos do cultivar resistente às 24 h após inoculação

31

(CAPOTE et al., 2006). Os dados sugerem o envolvimento da peroxidase nas

repostas de defesa do tomateiro frente a A. solani.

3.2.4.2 Catalase (CAT) (EC 1.11.1.6)

As plantas têm a capacidade de lidar com espécies reativas de

oxigênio através de um sistema eficiente de detoxificação. Devido ao fato de

que os radicais hidroxil são muito mais reativos para serem controlados

diretamente, a planta prefere eliminar as formas precursoras menos reativas,

O2.- e H2O2 (VAN BREUSEGEM et al., 2001). A superóxido dismutase tem um

papel importante no sistema antioxidante de defesa, regulando a concentração

celular de O2.- e H2O2. Já o H2O2 é eliminado por catalases e peroxidases. A

catalase remove a maior parte do H2O2, enquanto a ascorbato peroxidase pode

detoxificar o H2O2, que é inacessível para a catalase devido à sua alta

afinidade por H2O2 e à sua presença em vários locais dentro da célula

(SCANDALIOS, 1994; CREISSEN; EDWARDS; MULLINEAUX, 1994).

A catalase é uma enzima tetramérica que contém grupo heme e que

converte o H2O2 em água e oxigênio molecular segundo a seguinte reação:

2H2O2 O2 + 2H2O

A função principal da catalase é prevenir os efeitos potencialmente

danosos causados por mudanças na homeostase do H2O2. As catalases são as

principais enzimas que detoxificam H2O2 em plantas, podendo dismutar H2O2

diretamente ou oxidar substratos tais como metanol, etanol, formaldeído e

ácido fórmico (VAN BREUSEGEM et al., 2001). As plantas apresentam

múltiplas isoformas de catalase, as quais estão presentes nos peroxisomas e

nos glioxosomas. Willekens et al. (1994) dividiram as catalases em três

classes: as catalases da classe 1 são mais comuns em tecidos fotossintéticos e

estão envolvidas na remoção de H2O2 produzido na fotorrespiração, as da

classe 2 são produzidas em grande quantidade nos tecidos vasculares e

podem estar relacionadas com lignificação e as da classe 3 são muito

abundantes em sementes e plantas jovens e sua atividade está ligada à

remoção do excesso de H2O2 produzido durante a degradação de ácidos

graxos no ciclo do glioxilato nos glioxisomas. Plantas transgênicas de fumo,

deficientes nos genes Cat1 e Cat2 (que codificam catalase), mostraram que a

32

catalase funcionaria “absorvendo” o H2O2 celular produzido em condições de

estresse. A grande sensibilidade frente ao ozônio e ao estresse salino

observada nas plantas deficientes em catalase demonstrou que o H2O2 que

provém da fotorrespiração é um mediador importante da toxicidade celular

durante condições adversas e que a atividade de catalase é crucial para a

defesa celular contra esse estresse (WILLIKENS et al., 1997).

O foco no estudo de H2O2 como um sinal potencial nas respostas de

defesa das plantas começou com a identificação da catalase como uma

proteína que se ligava ao ácido salicílico (“SA-binding protein”). A catalase foi

então proposta como sendo o receptor que se inativaria após ligação com o

AS. Essa inativação da catalase levaria ao acúmulo de H2O2, o qual foi

demonstrado que atua como mensageiro secundário na indução de genes

relacionado à patogênese (PR genes) (CHEN; SILVA; KLESSIG, 1993).

Durante a HR – típica em interações planta-patógeno incompatíveis --

uma explosão oxidativa coincide com a indução da morte celular no sítio de

ataque do patógeno. Essa morte celular localizada limita o avanço de

patógenos biotróficos no hospedeiro. O complexo de NADPH oxidase e as

peroxidases de parede celular são considerados como fontes importantes das

EROs da explosão oxidativa (LAMB & DIXON, 1997). Uma diminuição da

atividade de enzimas antioxidantes também pode, no entanto, gerar EROs

durante a HR de várias interações planta-patógeno. Em células de fumo que

desenvolveram HR após a infiltração de um elicitor fúngico, o acúmulo de H2O2

foi correlacionado com a diminuição dos transcriptos dos genes Cat1 e Cat2,

junto com uma redução da atividade total da catalase (DOREY et al., 1998). A

supressão da atividade de detoxificação de H2O2 provavelmente contribui para

o acúmulo de níveis críticos de H2O2 ou mudanças na homeostase do H2O2, os

quais são necessários para a ativação de um programa de morte celular (VAN

BREUSEGEM et al., 2001).

A atividade da catalase não sofreu alterações em calos de Brassica

napus e B. juncea em meio de cultura adicionado com filtrados de cultura

fúngica de Alternaria brassicae, em contraste com o aumento da atividade das

enzimas polifenoloxidase e peroxidase (DHINGRA & KIRAN NARESH MEHTA

SANGWAN, 2004). Chawla, Gupta e Saharan (2001) também relatam o

aumento da atividade da peroxidase e da polifenoloxidase e a ausência de

33

mudanças na atividade da catalase em cultivares resistentes e suscetíves de B.

juncea inoculados com A. brassica. Os autores sugerem que a catalase não

estaria competindo com a polifenoloxidase pelo substrato e isso permitiria a

oxidação dos fenóis a quinonas, moléculas mais tóxicas e, portanto, mais

importantes na resistência à doença.

Em plantas de cártamo (Carthamus tinctorius) regeneradas via

organogênese e via embriogênese somática a partir de culturas in vitro tratadas

com filtrados de culturas fúngicas (FCF) de Alternaria carthami, foi avaliada a

severidade da doença e a atividade das enzimas antioxidantes peroxidase e

catalase e SOD. O número e comprimento das lesões nas plantas FCF

tolerantes foi menor quando comparadas às plantas controle. A atividade da

peroxidase e SOD foi maior e a atividade da catalase levemente inferior nas

plantas CFC tolerantes regeneradas via organogênese e via embriogênese

somática quando comparadas às plantas controle. Os autores concluíram que

o aumento da atividade da peroxidase e da SOD como resposta à produção de

ROS compensou a baixa atividade da catalase (VIJAYA KUMAR et al., 2008).

3.2.4.3 Polifenoloxidase (PFO) (EC 1.10.3.2)

As polifenoloxidases são enzimas que catalisam a reação de oxidação

de o-difenóis transformando-os em o-diquinonas, constituindo, portanto, uma

atividade de difenolase, embora possam também catalisar a o-hidroxilação de

monofenóis, constituindo atividade de monofenolase (VAUGHN & DUKE,

1984). Na literatura também são denominadas de fenol oxidases, catecolases,

fenolases, catecol oxidases ou tirosinases. A grande maioria das PFO

permanecem inativadas intracelularmente, compartimentalizadas dentro dos

tilacóides nos cloroplastos e separadas dos compostos fenólicos,

compartimentalizados nos vacúolos. Uma pequena parte pode, no entanto,

estar extracelularmente na parede celular (VAUGHN; LAX; DUKE, 1988).

A massa molecular das enzimas é bastante variável e, como as

peroxidases, as polifenoloxidases apresentam grande número de isoformas, o

que conferiria maior importância biológica (MAYER & HAREL, 1979).

Os produtos de oxidação do ácido clorogênico pela PFO – as quinonas

-- podem atuar de várias formas na defesa de plantas frente a patógenos.

34

Primeiro, a reatividade de clorogenoquinona pode limitar o desenvolvimento de

patógenos em sítios de infecção, presumivelmente por acelerar a taxa de morte

celular em células próximas ao local atacado e/ou gerar um ambiente tóxico,

que inibe diretamente o crescimento do patógeno nas células vegetais

(PETER, 1989). A segunda forma seria a habilidade da clorogenoquinona de

realizar reações de adição 1,4 com outros nucleófilos, resultando na

possibilidade de adicionar grupos alquil às proteínas, reduzindo, dessa forma, a

biodisponibilidade de proteínas para os patógenos (DUFFEY & FELTON,

19911; citado por LI & STEFFENS, 2002). A terceira é que a reação da

clorogenoquinona com outros fenóis ocasiona a formação de grande número

de polímeros de condensação, e a reação covalente e o “cross-linking” de

clorogenoquinona com proteínas determina a formação de barreiras fenólicas

polimerizadas na parede celular contra ataques de patógenos (LI &

STEFFENS, 2002). Quarto, a conversão do pool endógeno de fenóis a

quinonas (catalisado pela PFO) também dispara uma complexa série de

reações que podem afetar a resistência das plantas frente a patógenos. A

formação de H2O2 pela oxidação enzimática rápida dos fenóis que ocorre na

infecção por patógenos, além de ativar outras respostas de defesa, pode

impulsionar a oxidação de uma ampla gama de substratos fenólicos através da

ação da peroxidase. Por outro lado, as quinonas podem sofrer desproporção2

formando radicais semiquinonas, o que resulta na produção de H2O2

(RICHARD-FORGET & GAUILLARD, 1997).

Li e Steffens (2002) testaram plantas transgênicas de tomate que

superexpressavam a atividade de PFO por meio de inoculação com

Pseudomonas syringae pv. tomato. Essas plantas transgênicas oxidaram o

pool de fenóis endógenos em uma taxa muito maior que as plantas-controle e,

quando inoculadas, mostraram menor severidade de sintomas e forte inibição

do crescimento bacteriano. Posteriormente, Thipyapong, Hunt e Steffens

(2004) introduziram um cDNA de PFO antisense em plantas de tomate para

determinar o impacto da PFO na resistência a Pseudomonas syringae pv.

1 DUFFEY, S.; FELTON, G. Enzymatic antinutritive defenses of the tomato plant against insects. In: P.

Hedin (Ed.). Naturally occurring pest bioregulators. American Chemical Society, Washington, DC, p. 166–197, 1991.

2 Desproporção: redução e oxidação simultânea de uma substância que reage consigo mesma e forma

duas moléculas diferentes. Ex. 2C2H4→C2H6+C2H2.

35

tomato. A expressão antisense da PFO aumentou fortemente a

susceptibilidade das plantas tanto na interação compatível quanto na

incompatível, indicando que altos níveis constitutivos de PFO ou a capacidade

de induzir PFO na infecção por patógenos é fundamental em limitar o

desenvolvimento do patógeno.

A atividade das polifenoloxidases pode ser ativada ou inibida em

algumas plantas por estresses como injúrias, “chilling”, toxicidade de nitrogênio

e ataque de patógenos (SÁNCHEZ et al., 2000).

Nojosa et al. (2003) estudaram os níveis de fenóis solúveis totais e a

atividade das enzimas oxidativas polifenoloxidases e peroxidases em tecidos

foliares sadios de clones de cacaueiro resistentes e suscetíveis a Crinipellis

perniciosa. Os níveis de fenóis solúveis totais foram mais elevados em clones

de cacaueiro com resistência a C. perniciosa, podendo contribuir na resposta

de defesa contra o patógeno. A atividade de polifenoloxidases foi menor nos

clones resistentes que nos clones suscetíveis. Os níveis de fenóis e a atividade

das enzimas oxidativas correlacionaram-se de forma inversa na maioria dos

clones estudados, o que pode indicar uma inibição das enzimas peroxidases e

polifenoloxidases pelos compostos fenólicos.

Solórzano et al. (1996) estudaram a indução de PAL e PFO em três

variedades de tomateiro com nível diferente de resistência frente a A. solani

após inoculação com esse patógeno. Foram detectados níveis mais altos de

atividade enzimática de ambas as enzimas nas folhas inoculadas quando

comparadas com as folhas sem inocular. Além disso, essas atividades foram

maiores na variedade resistente (NCEBR-1) que nas susceptíveis (HC 3880 e

Campbell 28). Os autores sugerem uma relação entre a atividade das enzimas

PAL e PFO nos mecanismos de resistência do tomateiro frente a A. solani.

3.2.4.4 Quitinase (QUI) (EC 3.2.1.14) e β-1,3- glucanase (GLU) (EC 3.2.1.6)

Novas proteínas codificadas pelo hospedeiro, referidas como proteínas

relacionadas à patogênese, têm sido detectadas nos tecidos vegetais, não

apenas após o ataque por microrganismos patogênicos ou parasitas, como

também, em resposta ao tratamento com compostos químicos ou outros tipos

de estresse (VAN LOON & VAN STRIEN, 1999). As proteínas PR representam

36

a maior parte da alteração quantitativa das proteínas solúveis que ocorre no

processo de defesa, podendo alcançar, individualmente, até 1% da

concentração das proteínas totais solúveis em folhas (VAN LOON, 1997).

Em 1994, Van Loon e colaboradores propuseram uma nomenclatura

unificada para designação e classificação das PR proteínas em famílias,

baseando-se na similaridade das sequências de aminoácidos, na relação

sorológica e/ou na atividade enzimática ou biológica. Atualmente, as PR

proteínas são classificadas em 17 famílias distintas.

A família PR-2 é constituída de endo β-1,3-glucanases, que

apresentam atividade enzimática in vitro hidrolisando β-1,3-glucanas e são

agrupadas em três classes distintas baseando-se nas sequências de

aminoácidos de suas estruturas primárias. As glucanases da classe I são

proteínas básicas e estão localizadas no vacúolo da célula vegetal,

especialmente na epiderme de folhas inferiores e nas raízes de plantas sadias,

enquanto as das classes II e III incluem, principalmente, as proteínas ácidas

extracelulares (SELITRENNIKOFF, 2001). As PR proteínas presentes nos

vacúolos geralmente exercem um efeito de defesa após a

descompartimentalização das células, enquanto que as PR proteínas

extracelulares atuam diretamente em contato com o patógeno no processo de

penetração do tecido (STICHER; MAUCH-MANI; MÉTRAUX, 1997). A

atividade antifúngica de β-1,3-glucanases provém de sua ação catalítica na

hidrólise do polímero de β-1,3-glucana, componente estrutural da parede

celular de muitos fungos.

A síntese e acúmulo de β-1,3 glucanases em tecidos vegetais têm sido

associados aos mecanismos de defesa de plantas contra doenças. A

expressão diferencial de β-1,3 glucanases em interações compatíveis e

incompatíveis frente a patógenos obrigatórios vem sendo estudada por vários

autores. Em plantas resistentes de melão, trigo e milheto, frente a

Sphaerotheca fusca, Puccinia recondita f. sp. tritici e Sclerospora graminicola,

respectivamente, detectou-se maior atividade de β-1,3 glucanase (RIVERA et

al. 2002; KEMP et al., 1999; KINI et al., 2000), associado com aumentos

precoces na atividade da enzima ou indução diferencial de isoformas.

As famílias PR-3, PR-4, PR-8 e PR-11 estão constituídas por

endoquitinases. A ação antimicrobiana das quitinases baseia-se na capacidade

37

de hidrolisar os polímeros de quitina, enfraquecendo a parede celular e

tornando as células osmoticamente sensíveis (SELITRENNIKOFF, 2001). A

família PR-3 é constituída por endoquitinases das classes I, II, IV, V, VI e VII,

enquanto que as da família PR-4 são das classes I e II. As PR-11 são

quitinases do tipo I, capazes de hidrolisar quitosanas além de quitina, enquanto

as PR-8 são quitinases da classe III que possuem atividade enzimática

adicional de lisozima, catalisando a hidrólise do peptídeoglicano, componente

estrutural das paredes bacterianas (VAN LOON et al., 1994).

A atividade da β-1,3-glucanase pode ser sinergisticamente melhorada

pela quitinase tanto in vitro (MAUCH; MAUCH-MANI; BOLLER, 1988) quanto in

vivo (VAN LOON, 1997). Além da ação antimicrobiana direta, degradando a

parede celular de fungos, essas enzimas agem indiretamente liberando

fragmentos de parede celular que atuam como elicitores de repostas de defesa

da planta hospedeira (YOSHIKAWA; YAMAOKA; TAKEUCHI, 1993).

A coindução de quitinases e glucanases foi observada em várias

espécies de plantas como café (GUZZO & MARTINS, 1996), ervilha (MAUCH;

MAUCH-MANI; BOLLER, 1988), feijão (STANGARLIN & PASCHOLATI, 2000),

e tomate (JOOSTEN & DE WIT, 1989; LAWRENCE et al., 2000), entre outras.

Em tomateiro, Lawrence, Joosten e Tuzun (1996) verificaram níveis

mais altos de quitinases e β-1,3-glucanase tanto na expressão constitutiva

quanto na induzida pelo patógeno em linhagens resistentes a A. solani que em

genótipos suscetíveis. Após inoculação com A. solani, quatro isoenzimas de

quitinases (26, 27, 30 e 32 kDa) foram induzidas tanto nos genótipos

resistentes quanto nos suscetíveis. As linhagens resistentes (NCEBR-1 e

NCEBR-2) tinham, no entanto, significativamente maior atividade da quitinase

de 30 kDa. Além disso, pela análise de Western blot demonstrou-se que, após

a infecção com A. solani, a linhagem altamente resistente NC 24-E

rapidamente acumula transcritos de mRNA que codificam para múltiplos PR

genes, incluindo isoenzimas de quitinases e β-1,3-glucanases (LAWRENCE et

al., 2000).

Solórzano et al. (1999) estudaram os padrões isoenzimáticos de PFO e

quitinases em folhas de duas variedades de tomateiro, NC EBR-1 (resistente) e

HC 3880 (suscetível). Foram detectadas seis isoformas ácidas de PFO, tanto

na variedade resistente quanto na suscetível. A respeito da quitinase,

38

observaram duas isoformas ácidas presentes nas duas variedades. Entretanto,

na variedade NC EBR-1 uma isoforma foi induzida a partir das 24 hpi, enquanto

que na variedade suscetível HC 3880, a indução ocorreu às 72 hpi. A outra

isoforma foi detectada em ambas as variedades às 72 hpi.

A indução de uma isoenzima de quitinase de 44 kDa e uma de proteína

tipo-taumatina (da família PR-5) de 23 kDa, já foram observadas em cultura de

células e em folhas de tomateiro em reposta a elicitores obtidos a partir de A.

solani (RADHAJEYALAKSHMI et al., 2009).

39

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54

CAPÍTULO 2

DESENVOLVIMENTO DE Oidium neolycopersici EM GENÓTIPOS DO GÊNERO Solanum seção Lycopersicon1

RESUMO

O oídio, causado pelo fungo Oidium neolycopersici, é uma doença

comum do tomateiro, sobretudo em condições de cultivo protegido. Para

esclarecer a natureza da resistência a oídio avaliou-se o processo de infecção,

através da histopatologia em diferentes genótipos de tomateiro: CNPH 416,

CNPH 423, CNPH 1287 (Solanum habrochaites sin. Lycopersicon hirsutum),

cv. Santa Cruz Kada, cv. Santa Clara (S. lycopersicum sin. Lycopersicon

esculentum) e CNPH 0081 (S. lycopersicum var. cerasiforme). Para isso, três

discos foliares (da 3ª, 4ª e 5ª folha “verdadeira”) de cada planta com 5-7 folhas

verdadeiras foram cortados e colocados em placas de Petri contendo ágar-

água. Os discos foram inoculados a partir de micélio esporulante desenvolvido

em tomateiro suscetível e incubados a 19ºC-22ºC, 4000 lx e fotoperíodo de 12

h. Os discos foram clareados em etanol aquecido e examinados

microscopicamente 19 h, 8 e 9 dias após-inoculação para se avaliar

desenvolvimento de tubo germinativo, esporulação e severidade da doença,

respectivamente. A germinação dos conídios sobre o tecido foliar não

apresentou diferenças entre genótipos. A formação de hifa secundária,

apressórios e haustórios por conídio germinado foram menores nos genótipos

CNPH 1287 e 423, que também apresentaram menor esporulação e menor

severidade da doença. Os genótipos de S. lycopersicum e S. lycopersicum var.

cerasiforme apresentaram maior suscetibilidade ao oídio. Assim, observou-se

que a resistência a oídio de CNPH 1287 e 423 ficou evidenciada já desde as 19

h após a inoculação, principalmente pela menor porcentagem de hifa

secundária e número de apressórios e haustórios formados quando

comparados com os genótipos suscetíveis.

Palavras-chave: Oídio de tomateiro. Tomateiro. Resistência. Formação de

apressório. Formação de haustório. Histopatologia.

1 Artigo aceito para publicação na Summa Phytopathologica, no vol. 36, n. 1, 2010.

55

ABSTRACT

Development of Oidium neolycopersici on Solanum seção Lycopersicon genotypes

Tomato powdery mildew, caused by Oidium neolycopersici, is a

common disease of tomato, especially in greenhouse conditions. To investigate

the nature of powdery mildew resistance, we studied the histopathology of the

infection process in six different tomato genotypes: CNPH 416, CNPH 423,

CNPH 1287 (Solanum habrochaites syn. Lycopersicon hirsutum), cv. Santa

Cruz Kada, cv. Santa Clara (S. lycopersicum syn. Lycopersicon esculentum)

and CNPH 0081 (S. lycopersicum var. cerasiforme). Leaf discs of the 3rd, 4th e

5th leaves from plants with 5-7 true leaves were placed on water agar in Petri

dishes, inoculated using recent sporulating mycelium of tomato powdery mildew

and incubated at 19-22ºC, 4000 lx and 12h photoperiod. After clearing with

boiling ethanol, the discs were microscopically examined at 19 h, 8 and 9 days

post inoculation to evaluate germ tube development, sporulation and disease

severity. Conidial germination on foliar tissue was similar in all genotypes.

Secondary hypha, appresoria and haustoria per germinated conidia were lowest

in CNPH 1287 and 423, which also exhibited the lowest sporulation and disease

severity. S. lycopersicum and S. lycopersicum var. cerasiforme genotypes

showed the highest mildew susceptibility. Powdery mildew resistance of CNPH

1287 and CNPH 423 was already evident at 19 hours after inoculation based

upon the lower percentage of secondary hypha, appresoria and haustoria

observed than in the susceptible ones.

Additional keywords: Tomato powdery mildew. Tomato. Resistance.

Appresorium formation. Haustorium formation. Histopathology.

56

1. INTRODUÇÃO

Oídio do tomateiro [Solanum lycopersicum L. (PERALTA; KNAPP,

SPOONER, 2005) sin. Lycopersicon esculentum Mill.], causado por Oidium

neolycopersici L. Kiss tem causado problemas sérios na cultura nos últimos

anos, principalmente sob condições de cultivo protegido (KISS et al., 2001;

JONES; WHIPPS; GURR, 2001; CAFÉ FILHO; COELHO; SOUZA, 2001;

MIESLEROVÁ; LEBEDA; KENNEDY, 2004; KUROZAWA & PAVAN, 2005). O

patógeno afeta a superfície adaxial das folhas, pecíolos, caule e cálices, com

presença de micélio e estruturas de frutificação assexuada do fungo conferindo

o característico aspecto pulvurulento de cor branca a cinza. Em estágios mais

avançados, os tecidos subadjacentes apresentam clorose e, finalmente,

necrose. As infecções severas conduzem às plantas a senescência prematura,

desfolha e redução do número e tamanho de frutos (WEHT, 2001;

MIESLEROVÁ; LEBEDA; KENNEDY, 2004; KUROZAWA & PAVAN, 2005).


segura para o controle da doença, pois reduz os custos de produção e evita

danos à saúde humana e ao ambiente. A obtenção de fontes de resistência

entre os cultivares de tomateiro não tem levado a muito sucesso, o que gera a

necessidade da procura entre espécies selvagens do gênero Solanum seção

Lycopersicon. “Screening” intensivo tem identificado diferentes fontes

potenciais de resistência em acessos de Solanum habrochaites (sin.

Lycopersicon hirsutum), S. chilense (sin. L. chilense), L. parviflorum (sin S.

neorickii), S. peruvianum (sin. L. peruvianum), S. pimpinellifolium (sin. L.

pimpinellifolium), S. lycopersicum var. cerasiforme (sin. L. esculentum var.

cerasiforme) e S. pennellii (sin. L. pennellii) (LINDHOUT; PET; VAN DER

BEEK, 1994; CICCARESE et al., 1998; HUANG et al., 1998; HUANG et al.,

2000; MIESLEROVÁ; LEBEDA; KENNEDY, 2004; MATSUDA et al., 2005; LI et

al., 2006).

Embora mecanismos de defesa pré-formados (espessura da cutícula,

presença de tricomas, entre outros) possam prevenir a infecção, por vezes, as

57

plantas mostram respostas ativas ao ataque de patógenos, como transcrição

de genes e formação de produtos de defesa, com o objetivo de retardar o

desenvolvimento do patógeno ou levar à morte da célula vegetal

(PASCHOLATI & LEITE, 1995; MIESLEROVÁ; LEBEDA; KENNEDY, 2004). A

expressão de resistência pode ser determinada em vários níveis, desde

populações de plantas até o estudo de planta individual, através de histologia e

respostas moleculares. A histologia da interação patógeno-hospedeiro é um

recurso eficiente no estudo dos processos de infecção, ajuda a esclarecer os

eventos de pré-penetração, penetração e colonização do hospedeiro, e

possibilita o entendimento da fisiologia da interação e os mecanismos de

resistência do hospedeiro (ARAÚJO & MATSUOKA, 2004).

Existem estudos focados na resistência de tomateiro e de espécies

aparentadas a Oidium neolycopersici (HUANG et al., 1998; MLÍČKOVÁ et al.,

2004; MIESLEROVÁ; LEBEDA; KENNEDY, 2004; MATSUDA et al., 2005;

TOMÁNKOVÁ et al. 2006), onde foram estudados aspectos como germinação

de conídios na superfície do hospedeiro, comprimento de tubos germinativos,

formação de apressórios e haustórios, formação de papilas, respostas de

hipersensibilidade, formação de conidióforos, esporulação, produção de

espécies reativas de oxigênio (EROs) e de atividade de enzimas relacionadas

ao metabolismo de EROs.

O presente trabalho teve como objetivo estudar as etapas iniciais do

processo de infecção de O. neolycopersici, a esporulação e a correspondente

severidade no hospedeiro suscetível vs. resistente, buscando detectar

diferentes estratégias de resistência.

58

2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1 Patógeno e material vegetal

O isolado de O. neolycopersici empregado foi obtido a partir de

tomateiros doentes provenientes do campo experimental da Universidade

Estadual do Oeste de Paraná (Unioeste), Campus de Marechal Cândido

Rondon (Paraná) e mantido em plantas de genótipo com alta suscetibilidade

(Santa Cruz Kada), a 19ºC-22ºC, 4000 lx e 12 h de fotoperíodo. Foram

utilizados seis genótipos do gênero Solanum seção Lycopersicon com

diferentes níveis de resistência a O. neolycopersici (Quadro 1). Os acessos de

Solanum lycopersicum var. cerasiforme e S. habrochaites foram formacidos

pelo Centro Nacional de Pesquisa de Hortaliças (CNPH) da Empresa Brasileira

de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA), Brasília – DF, Brasil.

Quadro 1. Identificação, origem e nível de resistência/suscetibilidade dos genótipos de Solanum seção Lycopersicon empregados na avaliação do processo de infecção por Oidium neolycopersici

Genótipo (cultivar, acesso) Origem Resistência/

suscetibilidade Solanum lycopersicum cv. Santa Cruz Kada Comercial Suscetível

S. lycopersicum cv. Santa Clara Comercial Suscetível

S. habrochaites (CNPH1 416 – PI 126445) CNPH Resistente

S. habrochaites (CNPH 423 – PI 134417) CNPH Resistente

S. habrochaites (CNPH 1287 – PI 126445) CNPH Resistente

S. lycopersicum var. cerasiforme (CNPH 0081 - Silvestre de Felixlândia)

CNPH Suscetível

1CNPH - Centro Nacional de Pesquisa de Hortaliças da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA), Brasília – DF, Brasil.

Os genótipos foram semeados em bandejas contendo substrato

comercial (Plantmax HA®) para produção de mudas. Aos 45 dias após

59

semeadura foram transplantados para vasos plásticos com capacidade para

1,5 L (uma planta por vaso) contendo uma mistura deste substrato, solo e areia

esterilizados (2:1:1 v/v) e mantidos sob condições de casa de vegetação.

2.2 Inoculação e incubação de discos foliares

Aos 63 dias após o transplantio, quando as plantas apresentavam de

cinco a sete folhas totalmente desenvolvidas, três discos com 11 mm de

diâmetro foram retirados do folíolo terminal da 3ª, 4ª e 5ª folhas. Os discos

foliares foram colocados em placas de Petri contendo ágar-água (15 g L-1) com

a face adaxial voltada para cima. A inoculação com O. neolycopersici foi

realizada através de pequenas batidas com folhas de tomate cobertas (80-

100%) por micélio esporulante (MIESLEROVÁ; LEBEDA; CHETELAT, 2000;

MIESLEROVÁ; LEBEDA; KENNEDY, 2004). Na sequência após a inoculação,

as placas de Petri foram fechadas com filme plástico e incubadas em câmara

de crescimento a 19ºC-22ºC, intensidade de luz 4000 lx e fotoperíodo de 12 h,

sendo o período com luz iniciado no momento da colocação das placas na

câmara de crescimento. O número médio de conídios inoculados sobre os

discos foliares foi estimado a partir de contagens ao micrsocópio dos conídios

presentes no disco (39,7 esporos mm-2).

2.3 Observação microscópica do processo de infecção de Oidium neolycopersici

Os discos foliares dos genótipos foram examinados decorridos 19 h, 8

e 9 dias de incubação. Para tanto, procedeu-se a descoloração dos mesmos

pela imersão em etanol (92º) aquecido a 78ºC e conservados até observação

em frascos contendo glicerol 50%. Os discos foram montados em lâminas de

vidro para microscopia com lactofenol-azul de algodão e observados sob

microscópio de luz Leitz Diaplan. Às 19 h pós-inoculação (hpi) determinou-se o

percentual de germinação dos conídios através da contagem daqueles que

apresentavam tubos germinativos de comprimento igual ou maior que a largura

do esporo (contagem de 100 conídios em cada disco foliar). O desenvolvimento

do fungo foi determinado através do número de tubos germinativos por conídio,

60

comprimento deles e presença de apressórios e haustórios, sendo essas

características de desenvolvimento registradas em 20 conídios germinados por

disco de modo a obter-se 300 conídios para cada genótipo.

Para determinar a esporulação, aos oito dias pós-inoculação (dpi) os

conídios foram removidos dos discos foliares mediante a aplicação cuidadosa

de pequenos pedaços (1x1 cm) de fita adesiva transparente sobre os discos e

posteriormente transferidos para lâmina de microscopia com lactofenol-azul de

algodão para observação e contagem de esporos ao microscópio de luz.

2.4 Severidade da doença

O percentual do grau máximo de infecção (ID) foi determinado aos

nove dpi através da observação macroscópica das estruturas fúngicas nos

discos. A severidade foi determinada empregando-se a escala de Kashimoto et

al. (2003a) de acordo com a porcentagem de superfície foliar coberta pelo

fungo: 0 = ausência de sinais do patógeno, 1 = sinais em menos de 25% da

área, 2 = sinais em 25%-50% da área, 3 = sinais em 51%-75% da área, 4 =

sinais em mais de 76% da área. A severidade em cada planta foi determinada

usando a seguinte fórmula:

100cos

(%) ××

=∑

escaladamáximanotadisdenúmero

notasID

2.5 Estatística e delineamento experimental

O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado,

com seis tratamentos e cinco repetições. Cada parcela experimental foi

representada por uma placa de Petri contendo três discos foliares, e a média

dos três discos foi empregada na análise estatística. Foram realizados testes

para homogeneidade da variância (teste de Levene, p=0,05) e para

normalidade dos erros (teste de Shapiro-Wilk, p=0,05) e, quando as

pressuposições foram violadas, procedeu-se transformação dos dados. Foi

realizada análise de variância e as médias foram comparadas pelo teste de

Scott-Knott (p=0,05).

61

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

A forma e a dimensão dos conídios de O. neolycopersici observados

coincidiram com os dados morfológicos relatados para a espécie (JONES;

WHIPPS; GURR, 2001; KASHIMOTO et al., 2003b). Os conídios germinaram

de modo uniforme na superfície foliar de todos os genótipos, com percentual

médio de 54,5% (dados não apresentados). Huang et al. (1998) e Mieslerová,

Lebeda, e Kennedy (2004) reportaram anteriormente que a resistência de

tomateiro a O. lycopersicum não é devida à inibição da germinação de esporos.

Os conídios desenvolveram tubos germinativos primários com

comprimento variável, mas sem diferenças significativas entre genótipos. Na

parte terminal do tubo germinativo foi observado um apressório lobado (Figura

1A). Com frequência, sob o apressório, observou-se a formação de um

haustório (Figura 1B) e desenvolvimento de hifa secundária a partir do conídio

ou do tubo germinativo primário (Figura 1C). Para os conídios que

apresentavam hifa secundária foi detectado um haustório embaixo do

apressório do tubo germinativo. Na coleta, realizada às 19 hpi, não foi

observada a formação de apressório na hifa secundária. Para os diferentes

genótipos não foram observadas diferenças para o comprimento da hifa

secundária (dados não apresentados). Mieslerová, Lebeda, e Kennedy (2004),

em avaliações feitas 6, 24 e 48 hpi, observaram diferenças entre o

comprimento dos tubos germinativos primários, secundários e terciários de

conídios desenvolvidos em genótipos resistentes e suscetíveis de tomateiro.

Às 19 hpi, a maioria dos conídios já apresentava formação de

apressórios no tubo germinativo primário, havendo só um genótipo (CNPH

1287) que se diferenciou dos outros por apresentar menor percentual de

apressórios (Quadro 2). A presença de haustório não lobado sob o apressório

foi observada nos diferentes genótipos, variando de 23 no CNPH 423 a 79,6%

no CNPH 0081. Houve diferenças significativas para essa variável entre

genótipos avaliados às 19 hpi, sendo as menores frequências de haustórios

formados nos genótipos CNPH 1287 e CNPH 423 e a maior no CNPH 0081.

62

Figura 1. Microfotografias de conídios de O. neolycopersici em discos foliares de tomateiro 19 h pós-inoculação. A: Apressório lobado (ap) B: Haustório (seta) desenvolvido sob o apressório. C: Conídio apresentando tubo germinativo primário com apressório e hifa secundária sem apressório. D1: Conídio com tubo germinativo primário com apressório e hifa secundária. D2: Mesmo conídio em plano focal inferior mostrando haustório (seta) sob apressório do tg1º. Abreviações: c = conídio; ap = apressório; tg1º = tubo germinativo primário; h 2ª = hifa secundária. Barra 10 µm.

Kashimoto et al. (2003b), ao avaliarem o desenvolvimento de O.

neolycopersici em cultivar suscetível de tomateiro em vários tempos pós-

infeção, observaram a formação do haustório primário às 12 hpi e que as hifas

secundárias desenvolveram-se a partir do conídio e, posteriormente, do

apressório primário às 24 hpi. Matsuda et al. (2005) verificaram que em

acessos de S. habrochaites completamente resistentes a oídio não se

formaram haustórios funcionais e sugeriram que isso ocorreu devido à reação

de hipersensibilidade ocorrida nas células epidérmicas invadidas pelo

patógeno, o que resultou em falha no estabelecimento da infecção a partir do

tg 1º

h 2ª

ap ap

A

CB

B

D2 D1

tg 1º h 2ª

c

c

c

c

c c ap

ap

63

conídio. Nas plantas de tomateiro suscetíveis, os conídios germinados e que

formaram apressório penetraram as células com sucesso, formaram haustórios

sem resposta de hipersensibilidade e originaram hifas secundárias para

expandir suas colônias.

Quadro 2. Características do desenvolvimento dos conídios de O. neolycopersici em discos foliares de genótipos de tomateiro avaliados 19 h pós-inoculação (hpi)

Genótipos tg 1º (µm)

h 2ª (%)

tg 1º+h 2ª (µm)

Apressório (%)

Haustório (%)

CNPH 1287 18,3 a 0,6a 18,3a 74,5a 28,2a

CNPH 423 17,8 a 3,0a 22,4a 87,0 b 23,0a

CNPH 416 20,2 a 9,5 b 33,3 b 96,5 b 67,3 b

Santa Clara 20.9 a 7,0 b 32,5 b 97,5 b 65,5 b

CNPH 0081 20,3 a 22,2 c 32,0 b 94,5 b 79,6 c

Sta. Cruz Kada 25,0 a 29,5 c 46,4 c 96,7 b 66,1 b

CV (%) 19,2 55,7 23,2 6,9 15,7 Médias na coluna seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott ao nível de 5% de probabilidade.

Abreviações: tg 1º (µm): comprimento do tubo germinativo primário, h 2ª formação de hifa secundária, tg 1º+h 2ª (µm): comprimento do tubo germinativo primário mais hifa secundária.

Diferente dessa situação, Huang et al. (1998) não observaram

diferenças nos percentuais de formação de haustórios primários em genótipos

suscetíveis e resistentes de espécies de Solanum seção Lycopersicon, mas,

sim, em características como formação de haustório secundário, necrose

induzida por haustório 1º e 2º, número de hifas por conídio, número de

apressórios por hifa, número de apressórios por conídio e esporulação às 65

hpi. Esses autores relataram reação de hipersensibilidade nas avaliações

tardias (65 hpi), quando a necrose das células atacadas determinou a

supressão do haustório após sua formação. Vários autores consideram que a

resposta de hipersensibilidade nas células epidérmicas seja a responsável pela

resistência ao oídio em genótipos de tomateiro resistentes (HUANG et al. 1998;

64

MATSUDA et al. 2005). No presente trabalho não foi avaliada a resposta de

hipersensibilidade nas células invadidas, mas a formação de haustórios e

subsequente formação de hifa secundária nas primeiras 19 hpi foram

consideradas fortes indicativos de mecanismos de resistência nos genótipos de

S. habrochaites (CNPH 1287 e 423). Para o genótipo CNPH 416, o maior

número de haustórios formados às 19 hpi pode ter sido seguido por resposta

de hipersensibilidade nas células atacadas e responsável pela posterior

degenerescência dos haustórios.

O patógeno produziu conídios não concatenados, o que confirma sua

identificação como O. neolycopersici (KISS et al., 2001; KISS; TAKAMATSU;

CUNNINGTON, 2005). Foram observadas diferenças entre genótipos quanto à

quantidade de esporos formados nos discos foliares na avaliação do oitavo dia

pós-inoculação (Quadro 3). Essas diferenças permitem distinguir três grupos: o

primeiro grupo compreendido pelos genótipos da espécie S. habrochaites com

baixa esporulação; o segundo grupo compreendido pelo cv. Santa Clara e o S.

lycopersicum var. cerasiforme, que apresentaram esporulação 31 vezes maior

do que o primeiro grupo; e o terceiro grupo representado pela cv. Santa Cruz

Kada, a qual apresentou maior esporulação (cerca de 60 vezes maior do que o

primeiro grupo). Segundo Huang et al. (1998), o desenvolvimento de unidades

de infecção nem sempre é detido quando as células epidérmicas, nas quais o

haustório primário foi formado, se tornam necróticas. Quando o crescimento da

hifa primária é bloqueado por necrose, novas hifas são usualmente formadas

do outro lado do esporo. As hifas secundárias produzem novos apressórios e,

subsequentemente, novos haustórios, embora, eventualmente, todos os

haustórios possam estar associados com necrose de células epidérmicas e a

infecção inibida completamente.

A menor esporulação observada para os genótipos de S. habrochaites,

quando comparada a outras espécies, foi coerente com a observação

macroscópica dos sinais do patógeno nos discos foliares, onde, nos genótipos

de S. habrochaites, não houve sintomas visíveis da doença. Lindhout, Pet e

Van der Beek (1994), em “screening” de 127 acessos de oito espécies

selvagens de Lycopersicon, reportaram que, macroscopicamente, a resistência

a oídio foi caracterizada por uma frequência de infecção muito baixa,

crescimento micelial reduzido e ausência de esporulação.

65

Quadro 3. Esporulação de O. neolycopersici e severidade de oídio em discos foliares de genótipos de tomateiro avaliados aos 8 e 9 dias pós-inoculação, respectivamente.

Esporos/disco (102)1 Severidade da

doença2 Genótipos

Médias originais

Médias transformadas

Médias originais

CNPH 416 71,9 8,5a 0a

CNPH 1287 97,3 9,9a 0a

CNPH 423 137,3 11,7a 0a

Santa Clara 2498,4 50,0 b 13,3 b

CNPH 0081 3867,8 62,2 b 38,3 c

Sta. Cruz Kada 6048,4 77,8 c 75,0 d

CV (%) 28,8 34,6 Médias na coluna seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott ao nível de 5% de probabilidade. 1 Para análise estatística os dados foram transformados em y= x . As médias originais foram obtidas pela operação inversa da transformação. 2 Severidade da doença foi determinada para cada disco segundo a fórmula: ID (%)= [(soma de todas as notas)/(número de discos avaliados x nota máxima da escala)] x 100. Notas: 0 (ausência de sintomas), 1 (sintomas em menos de 25% da área), 2 (sintomas em 25-50% da área), 3 (sintomas em 50-75% da área), 4 (sintomas em mais de 76% da área).

Considerando-se os eventos iniciais e os mais tardios (esporulação e

severidade da doença) da patogênese causada por O. neolycopersici em

diferentes acessos selvagens do gênero Solanum seção Lycopersicon,

observa-se que os genótipos CNPH 1287 e 423 apresentaram comportamento

diferente dos suscetíveis (CNPH 0081, cv. Santa Cruz Kada e cv. Santa Clara),

principalmente quanto ao baixo número de haustórios e hifas secundárias

formadas às 19 hpi, esporulação e severidade da doença aos 8 e 9 dpi,

respectivamente.

66

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem ao CNPq pela concessão da bolsa de estudos a

M.I. Balbi-Peña e pela bolsa de produtividade a K.R.F. Schwan-Estrada e J. R.

Stangarlin. Os autores agradecem também ao Dr. Leonardo Boiteux, do Centro

Nacional de Pesquisa de Hortaliças (CNPH) da EMBRAPA, que, gentilmente,

cedeu as sementes utilizadas no experimento.

67

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ARAÚJO, J. C. A.; MATSUOKA, K. Histopatologia da interação Alternaria solani e tomateiros resistente e suscetível. Fitopatologia Brasileira, Brasilia, v. 29, p. 268-275, 2004. CAFÉ FILHO, A. C.; COELHO, M. V. S.; SOUZA, V. L. Oídios de Hortaliças. In: STADNIK, M. J.; RIVERA M. C. (Ed.) Oídios. Jaguariúna, SP: Embrapa Meio Ambiente, 2001. p. 285-302. CICCARESE, F. et al. Occurrence and inheritance of resistance to powdery mildew (Oidium lycopersici) in Lycopersicon species. Plant Pathology, Oxford, v. 47, p. 417-419, 1998. HUANG, C. et al. Hypersensitivity is the major mechanism of resistance to powdery mildew (Oidium lycopersicum) in Lycopersicon species. European Journal of Plant Pathology, Dordrecht, v. 104, p. 399-407, 1998. HUANG, C. et al. Characterization and mapping of resistance to Oidium lycopersicum in two Lycopersicon hirsutum accessions: evidence for close linkage of two Ol-genes on chromosome 6 of tomato. Heredity, London, v. 85, p. 511-520, 2000. JONES, H.; WHIPPS, J. M.; GURR, S. J. The tomato powdery mildew fungus Oidium neolycopersici. Molecular and Plant Pathology, London, v. 2, p. 303–309, 2001. KASHIMOTO, K. et al. Infectivity of a Japanese isolate of Oidium neolycopersici KTP-01 to a European tomato cultivar resistant to O. lycopersici. Journal of General Plant Pathology, Tokio, v. 69, p. 406–408, 2003a. KASHIMOTO, K. et al. Morphological and molecular characterization for a Japanese isolate of tomato powdery mildew Oidium neolycopersici and its host range. Journal of General Plant Pathology, Tokio, v. 69, p. 176–185, 2003b. KISS, L. et al. Identification of two powdery mildew fungi, Oidium neolycopersici sp. nov. and O. lycopersici, infecting tomato in different parts of the world. Mycological Research, Cambridge, v. 105, p. 684–697, 2001. KISS, L.; TAKAMATSU, S.; CUNNINGTON, J. H. Molecular identification of Oidium neolycopersicias the causal agent of the recent tomato powdery mildew epidemics in North America. Plant Disease, St. Paul, v. 89, p. 491-496, 2005. KUROZAWA, C.; PAVAN, M. A. Doenças do tomateiro. In: KIMATI, H.; AMORIM, L.; BERGAMIN FILHO, A.; CAMARGO, L. E. A.; REZENDE, J. A. M.

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69

CAPÍTULO 3

RESPOSTAS DE GENÓTIPOS DE TOMATE SUSCETÍVEIS E RESISTENTES A Oidium neolycopersici, LOCALIZAÇÃO IN SITU DE

ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO E ATIVIDADE DE ENZIMAS RELACIONADAS À DEFESA

RESUMO

Para investigar as respostas de defesa de dois genótipos do gênero

Solanum seção Lycopersicon com resposta diferencial a Oidium neolycopersici

L. Kiss, avaliou-se a resposta de hipersensibilidade (HR), a produção e o

acúmulo de espécies reativas de oxigênio (EROs) e a atividade de enzimas

relacionadas à defesa. Quando plantas do genótipo resistente CNPH 1287

(Solanum habrochaites sin. Lycopersicon hirsutum) e do suscetível Santa Cruz

Kada (S. lycopersicum sin. Lycopersicon esculentum) apresentavam sete-nove

e cinco-sete folhas totalmente desenvolvidas, respectivamente, foi realizada a

inoculação da 2ª, 3ª e 4ª folha verdadeira. Essas folhas foram coletadas no

momento da inoculação e às 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96 e 120 h pós-inoculação

(hpi). A produção e acúmulo in situ de peróxido de hidrogênio (H2O2) e radical

superóxido (O2.-) foram avaliadas com o uso de diaminobenzidina e

nitrobluetetrazolio, respectivamente. A partir das 24-48 hpi, foi detectado

acúmulo elevado de H2O2 e O2.- e de células epidérmicas, apresentando HR,

principalmente em folhas inoculadas do genótipo resistente (S. habrochaites).

Aumentos na atividade de peroxidase de guaiacol (GPOX), catalase (CAT),

polifenoloxidase (PFO), β-1,3-glucanase (GLU) e quitinase (QUI) foram

registrados principalmente às 24 hpi no genótipo resistente. A associação entre

a produção de EROs e atividade de enzimas relacionadas a seu metabolismo

(GPOX, CAT), enzimas hidrolíticas (GLU, QUI) e do metabolismo dos fenóis

(PFO), assim como de HR, foi evidente durante as repostas de defesa em

CNPH 1287 inoculado com O. neolycopersici.

Palavras-chave adicionais: Oídio de tomate. Hipersensibilidade. Espécies

reativas de oxigênio. Peroxidase. Catalase. Polifenoloxidase. Quitinase, β-1,3-

glucanase.

70

ABSTRACT

Defense responses, in situ localization of reactive oxygen species and activity of defense-related enzymes in tomato genotypes resistant and susceptible to Oidium neolycopersici

To investigate plant tissue defense responses on two Solanum section

Lycopersicon genotypes differing in their resistance against Oidium

neolycopersici L. Kiss, the hypersensitive response (HR), generation and

accumulation of reactive oxygen species (ROS) and activity of defense-related

enzymes were studied. Seven-nine and five-seven true leaves plants of the

resistant CNPH 1287 (Solanum habrochaites syn. Lycopersicon hirsutum), and

the susceptible cv. ‘Santa Cruz Kada’ (S. lycopersicum syn. Lycopersicon

esculentum), respectively, were inoculated at 2nd, 3rd and 4th true leaves. At

differente time intervals (0, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96, and 120 hours after

inoculation), these leaves were collected for analysis. In situ production and

accumulation of hydrogen peroxide (H2O2) and superoxide radical (O2.-) were

detected with diaminobenzidine (DAB) and nitrobluetetrazolium (NBT),

respectively. High accumulation of H2O2 and O2.- and cells undergoing HR were

observed after 24-48 hpi, mainly in inoculated leaves of the resistant genotype

(S. habrochaites). Increased activity of guaiacol peroxidase (GPOX), catalase

(CAT), polyphenol oxidase (PPO), β-1,3-glucanase (GLU) and chitinase (CHI)

were detected mainly at 24 hpi in resistant genotype. High association between

ROS production, activity of enzymes involved in their metabolism (GPOX, CAT),

hydrolytic enzymes (GLU, CHI) and enzymes related to phenol metabolism

(PPO) as well as HR was evident during defense-related response in CNPH

1287 plants inoculated with O. neolycopersici.

Additional keywords: Tomato powdery mildew. Hypersensitive response.

Reactive oxygen species. Peroxidase. Catalase. Polyphenol oxidase. Chitinase,

β-1,3-glucanase.

71

1. INTRODUÇÃO

O oídio do tomate (causado por Oidium neolycopersici L. Kiss (KISS et

al., 2001) tem causado sérios problemas na cultura de tomate [Solanum

lycopersicum L. (PERALTA; KNAPP, SPOONER, 2005) sin. Lycopersicon

esculentum Mill.] durante os últimos 15 anos. No Brasil, com o incremento do

cultivo protegido e da área irrigada por gotejamento, o oídio tem assumido

maior importância (KUROZAWA & PAVAN, 2005; BOITEUX et al., 2005). O

uso de cultivares resistentes constitui a alternativa mais eficiente e segura para

o controle da doença, mas a obtenção de fontes de resistência entre as

cultivares de tomateiro não tem tido êxito, o que gera a necessidade da procura

entre espécies selvagens do gênero Solanum seção Lycopersicon. “Screening”

intensivo tem identificado diferentes fontes potenciais de resistência em

acessos de Solanum habrochaites (sin. Lycopersicon hirsutum), S. chilense

(sin. L. chilense), L. parviflorum (sin S. neorickii), S. peruvianum (sin. L.

peruvianum), S. pimpinellifolium (sin. L. pimpinellifolium), S. lycopersicum var.

cerasiforme (sin. L. esculentum var. cerasiforme) e S. pennellii (sin. L. pennellii)

(LINDHOUT; PET; VAN DER BEEK, 1994; CICCARESE et al., 1998; HUANG

et al., 1998; HUANG et al., 2000; MIESLEROVÁ; LEBEDA; KENNEDY, 2004;

MATSUDA et al., 2005; LI et al., 2006).

As plantas resistem ao ataque dos agentes fitopatogênicos através de

defesas químicas e físicas que podem ser tanto pré-formadas (cutícula e

parede celular) quanto induzidas após o ataque do patógeno (PASCHOLATI &

LEITE, 1995; HUTCHESON, 1998). As defesas induzidas incluem a produção

de espécies reativas de oxigênio (EROs), o fortalecimento da parede celular, a

síntese de fitoalexinas e o acúmulo de proteínas relacionadas à defesa. A

geração localizada de peróxido de hidrogênio (H2O2) e radical superóxido (O2.-)

detectável citologicamente é um dos eventos de resposta mais precoces dos

tecidos vegetais (BAKER & ORLANDI, 1995) e está provavelmente envolvida

com a indução da reação de hipersensibilidade (HR) (LEVINE et al., 1994). As

espécies reativas de oxigênio (EROs), termo que reúne espécies derivadas do

72

oxigênio radicais e não radicais, embora reativas, estão envolvidas em várias

respostas de defesa em células vegetais. O H2O2 é requerido para a ligação

cruzada de componentes de parede celular como parte da resposta de defesa

estrutural da planta (LAMB & DIXON, 1997). O H2O2 pode também contribuir

para criar um ambiente antimicrobiano no apoplasto (PENG & KUC, 1992).

Quando produzidas em excesso, as EROs podem induzir peroxidação de

lipídeos e também danificar DNA e proteínas (MOLLER, 2001).

Vários sistemas enzimáticos estão envolvidos no metabolismo das

EROs. A peroxidase pode gerar H2O2, mas também é capaz de reduzir seu

nível através de polimerização de álcoois hidroxicinamil durante a biossíntese

da lignina e da ligação cruzada das proteínas de parede celular (IIYAMA; LAM;

STONE, 1994). Outra enzima que desempenha papel importante no

metabolismo do H2O2 é a catalase (CAT). A CAT tem duas atividades: a

“catalítica” quando catalisa a degradação de H2O2 em água e oxigênio e

“peroxidativa” quando uma molécula de H2O2 e uma de hidrogênio servem

como substratos (MLÍČKOVÁ et al., 2004). A CAT protege as células dos

efeitos tóxicos do H2O2 (LEBEDA et al., 2001).

Dentro das enzimas relacionadas à defesa, encontram-se as proteínas

relacionadas à patogênese (ou proteínas-PR). Quitinases e β-1,3-glucanases

são enzimas hidrolíticas induzidas em várias interações planta-patógeno (VAN

LOON, 1997). Elas podem degradar componentes da parede celular de muitos

fungos (MAUCH; MAUCH-MANI; BOLLER, 1988) e também podem atuar

liberando fragmentos de parede celular que atuam como elicitores da resposta

de defesa ativas do hospedeiro (YOSHIKAWA; YAMAOKA; TAKEUCHI, 1993).

As polifenoloxidases (PFO) são enzimas localizadas nos plastídios, que

utilizam o oxigênio molecular para a oxidação de mono e o-difenóis em o-

diquinonas (VAUGHN; LAX; DUKE, 1988). As quinonas têm ação

antimicrobiana (MOHAMMADI & KAZEMI, 2002). As PFO também participam

do processo de lignificação durante a invasão pelo patógeno (LI & STEFFENS,

2002). O papel da PFO na geração de EROs está na oxidação de compostos

fenólicos, reação que produz H2O2 em extratos vegetais (RICHARD-FORGET

& GAUILLARD, 1997) e na formação de intermediários, como as semiquinonas

que reduzem o oxigênio molecular a radical superóxido (THIPYAPONG; HUNT;

STEFFENS, 2004).

73

Estudos histoquímicos e bioquímicos prévios (MLÍČKOVÁ et al., 2004;

TOMÁNKOVÁ et al., 2006) indicaram diferenças na resposta de defesa de

vários genótipos do gênero Solanum seção Lycopersicon frente à infecção com

Oidium neolycopersici, principalmente pela produção de EROs e atividade de

enzimas relacionadas a seu metabolismo. O objetivo deste trabalho foi

entender as estratégias de defesa de um genótipo resistente de S.

habrochaites e um suscetível de S. lycopersicum a O. neolycopersici, através

da observação da resposta de hipersensibilidade, o estudo da localização in

situ e acúmulo no tempo de H2O2 e O2.-, e da atividade de enzimas

relacionadas ao metabolismo das EROs, enzimas hidrolíticas e enzimas

relacionadas ao metabolismo dos fenóis.

74


2.1 Patógeno e material vegetal

O isolado de O. neolycopersici L. Kiss foi obtido de tomateiros doentes

provenientes do campo experimental da Universidade Estadual do Oeste do

Paraná (Unioeste), Campus de Marechal Cândido Rondon (Paraná) e mantido

em plantas de genótipo com alta suscetibilidade (Santa Cruz Kada), a 19ºC-

22ºC, 4000 lx e 12 h de fotoperíodo (lâmpada fluorescente).

Os conídios procedentes da esporulação desse isolado foram enviados

para o Centro Nacional de Pesquisa de Hortaliças (CNPH) da Empresa

Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA) para identificação da espécie

de oídio. Esta foi realizada via sequenciamento da região ITS (internal

transcribed sequence) e do gene 5.8 S rDNA confirmando as observações

morfológicas de que se tratava da espécie O. neolycopersici.

Os genótipos de tomateiro utilizados foram CNPH 1287 (Solanum

habrochaites) e Santa Cruz Kada (Solanum lycopersicum), resistente e

suscetível a oídio, respectivamente. O nível de resistência a O. neolycopersici

foi avaliado em ensaio prévio (ver Capítulo 2). A semente do cultivar Santa

Cruz Kada (S. lycopersicum) foi de origem comercial, enquanto que a do

genótipo CNPH 1287 (S. habrochaites) foi cedida pelo CNPH -EMBRAPA.


comercial para produção de mudas (Plantmax HA®). Após 28 dias, as plântulas

foram transplantadas para vasos de 0,6 L (uma planta por vaso) contendo o

mesmo substrato com fertilizante de liberação gradual (N 14%, P2O5 16%, K2O

18%, S 8%, Mo 0,2%) e mantidos em câmara de crescimento a 18-24 ºC, 4000

lx e 12 h de fotoperíodo (lâmpada fluorescente).

75

2.2 Inoculação e coleta de amostras

Aos 34 dias após o transplantio, quando as plantas de Kada e de

CNPH 1287 apresentavam cinco-sete e sete-nove folhas totalmente

desenvolvidas, respectivamente, foi realizada a inoculação da 2ª, 3ª e 4ª folha

verdadeira. A face superior de cada folha foi inoculada com O. neolycopersici,

através do contato da face superior de folhas de tomateiro cv. Kada cobertas

(80-100%) por micélio esporulante. Condições de alta umidade do ar foram

mantidas com câmara úmida.

Foram coletadas a 2ª, 3ª e 4ª folhas de plantas de tomateiro às 0, 4, 8,

12, 24, 48, 72, 96 e 120 h pós-inoculação (hpi) com O. neolycopersici. Folhas

de plantas de tomateiro não inoculadas também foram coletadas nesses

mesmos tempos. As folhas foram colocadas em caixa de isopor com gelo e

transportadas ao laboratório. As amostras destinadas para análise bioquímica

(3ª e 4ª folhas) foram pesadas, congeladas em N2 líquido e armazenadas em

congelador para análise posterior.

2.3 Análises histoquímicas

2.3.1 Localização in situ de peróxido de hidrogênio (H2O2)

A detecção histoquímica de H2O2 foi feita de acordo com Romero-

Puertas et al. (2004), com algumas modificações. Foram cortados três discos

de 11 mm de diâmetro de tecido foliar da 2ª folha de cada planta e colocados

submersos em uma solução de diaminobenzidina (DAB) a 0,1% (p/v) em

tampão MES 10 mM (pH 6,5). O corante DAB foi infiltrado em vácuo até a

infiltração total do tecido foliar. Para verificar a especificidade dos precipitados

marrons característicos da reação de DAB com H2O2, alguns discos foram

infiltrados com ácido ascórbico 10 mM (detoxificador de H2O2). Os discos

infiltrados foram incubados à temperatura ambiente por 1 h na luz,

posteriormente descorados por imersão em etanol (92º GL) aquecido a 78ºC e

conservados em glicerol 50% até observação. Os discos foram analisados

usando-se microscópio de luz e lactofenol-azul de algodão para visualizar as

estruturas do patógeno. O desenvolvimento do fungo foi caracterizado através

76

do número de hifas, formação de conidióforos e número de conídios por esporo

germinado. A detecção de H2O2 foi realizada determinando-se o número de

locais com presença de precipitado marrom sob o ponto de penetração da hifa

e as células epidérmicas de cor marrom. Essas observações foram realizadas

em três discos por planta.

2.3.2 Localização in situ de superóxido (O2.-)

A detecção in situ de O2.- foi realizada segundo a metodologia de

Romero-Puertas et al. (2004), com modificações. Foram cortados três discos


submersos em uma solução de nitrobluetetrazólio (NBT) a 0,1% (p/v) em

tampão fosfato de potássio 10 mM (pH 7,8). Foi realizada a infiltração completa

do corante no tecido foliar. Para verificar a especificidade dos precipitados

azuis de formazan característicos da reação de NBT com O2.-, alguns discos

foram infiltrados com superóxido dismutase (SOD) 50 µg mL-1. Os discos

infiltrados foram incubados, descorados, conservados e analisados

microscopicamente segundo descrito no item 2.3.1. A detecção de O2.- através

da redução in situ do NBT foi realizada determinando-se o número de locais

com coloração azul nas células epidérmicas no sítio de penetração do fungo.

Essas observações foram realizadas em três discos por planta.

2.4 Resposta de hipersensibilidade

Após intervalos de 24, 48, 72 e 120 hpi, foi determinada a porcentagem

de sítios de infecção (locais de penetração do patógeno) mostrando morte

celular. Foram contados pelo menos 200 sítios de infecção nos três discos

foliares cortados da 2ª folha de cada planta em cada intervalo de tempo. Os

discos foram descorados e conservados segundo procedimento descrito no

item 2.3.1. A autofluorescência das células epidérmicas foi observada sob luz

azul incidente (excitação 460-490 nm) usando um microscópio Zeiss Axioskop.

A resposta de hipersensibilidade (necrose das células penetradas) foi

detectada como autofluorescência da parede celular ou de toda a célula

77

epidérmica (KOGA et al., 1988). Para visualização das estruturas dos fungos, o

material foliar foi tratado com lactofenol-azul de algodão.

2.5 Análises bioquímicas

2.5.1 Obtenção dos extratos enzimáticos

A 3ª folha de cada planta (aproximadamente 0,5 g) foi macerada com

N2 líquido e homogeneizada mecanicamente em 4 mL de tampão fosfato de

potássio 50 mM (pH 7,0) contendo 0,1 mM EDTA e 1% (p/p) de PVP (poli-vinil-

pirrolidona), em almofariz. O homogenato foi centrifugado a 15.000 g durante

30 min a 4°C, sendo o sobrenadante obtido considerado como extrato

enzimático, para a determinação do conteúdo protéico e da atividade de

peroxidase, catalase e polifenoloxidase.

Para determinação de atividade de quitinase e β-1,3-glucanase foi

utilizado extrato enzimático obtido a partir da 4ª folha utilizando tampão acetato

de sódio 100 mM (pH 5,2). O procedimento de extração e centrifugação foi o

mesmo utilizado anteriormente.

2.5.2 Proteínas totais

O teste de Bradford (1976) foi empregado para a quantificação do

conteúdo total de proteínas nas amostras. A cada 50 µL do sobrenadante foi

adicionado, sob agitação, 2,5 mL do reagente de Bradford. Após 5 min foi

efetuada a leitura da absorbância a 595 nm em espectrofotômetro. A

concentração de proteínas, expressa em mg por mL de amostra (mg proteína

mL-1), foi determinada utilizando-se curva-padrão de concentrações de

albumina de soro bovino (ASB) de 0 a 0,5 mg mL-1.

2.5.3 Atividade de peroxidase de guaiacol (EC 1.11.1.7)

A atividade da peroxidase de guaiacol (GPOX) foi determinada a 30°C,

através de método espectrofotométrico direto, pela medida da conversão do

guaiacol em tetraguaiacol em 470 nm (LUSSO & PASCHOLATI, 1999). A

78

mistura da reação continha 0,10 mL do extrato enzimático (conforme item

2.5.1) e 2,9 mL de solução com 250 µL de guaiacol e 306 µL de peróxido de

hidrogênio em 100 mL de tampão fosfato 0,01M (pH 6,0). A cubeta de

referência continha 3 mL da solução de guaiacol e peróxido de hidrogênio em

tampão fosfato. A atividade da peroxidase foi determinada por um período de 2

min. O diferencial entre a leitura aos 90 s e a leitura aos 30 s foi utilizado para a

determinação da atividade. Os resultados foram expressos em absorbância

min-1 mg-1 de proteína, sendo a determinação de proteínas efetuada como

descrito no item 2.5.2.

2.5.4 Atividade de catalase (EC 1.11.1.6)

A atividade da catalase (CAT) foi quantificada pelo método de Góth

(1991), modificado por Tomanková et al. (2006), através do complexo estável

formado pelo molibdato de amônio com peróxido de hidrogênio (A405). O extrato

enzimático (0,1 mL) (conforme item 2.5.1) foi incubado em 0,5 mL de mistura

de reação contendo 60 mM de peróxido de hidrogênio em tampão fosfato de

potássio 60 mM pH 7,4 a 38ºC por 4 min. A adição de 0,5 mL de 32,4 mM de

molibdato de amônio após 4 min de incubação foi feita para deter o consumo

de peróxido de hidrogênio pela enzima presente no extrato. Foi preparado um

branco para cada amostra através da adição de molibdato de amônio à mistura

de reação, omitindo o período de incubação. O complexo amarelo de molibdato

e peróxido de hidrogênio foi medido a 405 nm. A diferença entre a absorbância

do branco e a amostra incubada indicou a quantidade de peróxido de

hidrogênio utilizado pela enzima. A concentração de H2O2, foi determinada

utilizando-se o coeficiente de extinção є = 0,0655 mM-1 cm-1.

2.5.5 Atividade de polifenoloxidase (EC 1.10.3.2)

A atividade das polifenoloxidases (PFO) foi determinada usando-se a

metodologia de Duangmal e Apenten (1999). O ensaio consistiu em quantificar

a oxidação do catecol convertido em quinona, reação mediada pela enzima

polifenoloxidase. O substrato foi composto por catecol, na concentração de 20

mM, dissolvido em tampão fosfato de potássio 100 mM (pH 6,8). A reação se

79

desenvolveu misturando-se 900 µL do substrato e 100 µL do extrato enzimático

(Item 2.5.1). A temperatura de reação foi de 30°C e as leituras em

espectrofotômetro, a 420 nm, foram realizadas de forma direta por um período

de 2 min. O diferencial entre a leitura no primeiro minuto e a leitura inicial foi

utilizado para a determinação da atividade. Os resultados foram expressos em

absorbância min-1 mg-1 de proteína.

2.5.6 Atividade de quitinase (EC 3.2.1.14)

A atividade da quitinase (QUI) foi avaliada através da liberação de

fragmentos solúveis de “CM-chitin-RBV”, a partir de quitina carboximetilada

marcada com remazol brilhante violeta (“Carboxy Methyl-Chitin-Remazol

Brilliant Violet”, Loewe Biochemica GmbH) (WIRTH & WOLF, 1990;

STANGARLIN; PASCHOLATI; LABATE, 2000). Para isso, foi utilizado 600 µL

do tampão de extração (acetato de sódio 100 mM pH 5,2) misturado com 200

µL de extrato enzimático (item 2.5.1) e 200 µL de “CM-chitin-RBV” (2 mg L-1).

Após incubar por 20 min a 40ºC, a reação foi interrompida com 200 µL de HCl

1M, seguido de resfriamente em gelo e centrifugação a 10.000 g por 5 min. A

absorbância do sobrenadante foi determinada a 550 nm. Os resultados foram

expressos em unidades de absorbância min-1 mg-1 proteína, descontando-se os

valores de absorbância do branco (800 µL de tampão de extração + 200 µL de

“CM-chitin-RBV”).

2.5.7 Atividade de β-1,3- glucanase (EC 3.2.1.6)

Para determinar a atividade da β-1,3-glucanase (GLU), 150 µL do

extrato enzimático (item 2.5.1) foram adicionados a 150 µL de laminarina (1,5

mg mL-1) em tampão de extração (acetato de sódio 100 mM pH 5,2). Como

controle, utilizou-se a mesma reação onde a laminarina foi adicionada

imediatamente antes da determinação de açúcares (sem incubação). A reação

foi conduzida a 40ºC durante 60 min, em banho-maria. Após o período de

incubação, os açúcares redutores formados foram quantificados pelo método

de Lever (1972). Para isso, foi retirada uma alíquota de 50 uL dos tubos

incubados e adicionado 1,5 mL de solução de hidrazida do ácido p-

80

hidroxibenzóico (PAHBAH) 0,5% em NaOH 0,5 M. A mistura foi mantida em

banho-maria fervente, por 10 min e resfriada em banho de gelo. A leitura das

absorbâncias foi realizada a 410 nm, em espectrofotômetro descontando-se os

valores de absorbância do branco. A quantidade de açúcares foi determinada

utilizando-se curva-padrão de concentrações de glicose, variando de 0 a 85 µg

glicose mL-1.

2.6 Estatística e delineamento experimental

A parcela experimental constituiu-se de um vaso contendo uma planta.

O delineamento experimental utilizado foi esquema fatorial considerando-se

dois genótipos (CNPH 1287 e Kada) x presença e ausência do patógeno (O.

neolycopersici) x nove horários de coleta (0, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96 e 120 h

após a inoculação) com três repetições.

Foi realizada análise de variância e as médias foram comparadas pelo

teste de Scott-Knott (p=0,05).

81

3. RESULTADOS

3.1 Desenvolvimento de O. neolycopersici nos genótipos avaliados

O desenvolvimento do fungo foi avaliado em ambos os genótipos em

todos os horários de coleta após inoculação. Na primeira observação, às 4 hpi,

a maioria dos conídios havia germinado e apresentavam tubos germinativos

primários (Figura 1A). Alguns esporos começavam a desenvolver apressório

lobado (Figura 1B). Às 8 hpi, a maioria dos conídios tinha desenvolvido

apressório e alguns apresentavam haustórios sob esse apressório (Figura 1C).

Quando avaliados às 12 hpi, a maioria dos conídios apresentava tubo

germinativo e alguns poucos apresentavam hifa secundária. A partir das 24 hpi

foi avaliada a frequência de conídios apresentando número diferente de hifas

(Quadro 1, Figura 1D).

Quadro 1. Porcentagem de conídios de O. neolycopersici apresentando diferente número de hifas em tomateiros CNPH 1287 e cv Kada em diferentes horários pós-inoculação (hpi)

hpi Genótipos Tg 1ª (%)

h 2ª (%)

h 3ª (%)

h 4ª (%)

h 5ª (%)

h 6ª (%)

CNPH 1287 40,9a1 57,3a 1,8b 24 Kada 31,3a 62,2a 6,5a

CNPH 1287 13,1a 23,9a 60,9a 6,0 b 48 Kada 2,3b 25,0a 61,7a 11,0 a

CNPH 1287 6,8a 7,6a 44,6a 39,3 b 1,7 b 72 Kada 3,2b 2,5b 19,8b 62,2 a 12,3 a

CNPH 1287 0 1,9a 25,6a 51,8 a 20,1 a 0,6a 96 Kada 0 0,4a 15,0a 50,1 a 34,1 a 0,4a

Abreviações: tg 1º: tubo germinativo primário, h 2ª: hifa secundária, h 3ª: hifa terciária, h 4ª: hifa quaternária, h 5ª: hifa quinária, h 6ª: hifa sexternária

1 Dentro de cada horário pós-inoculação, médias na coluna seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott ao nível de 5% de probabilidade.

82

Figura 1. Microfotografias de conídios de O. neolycopersici em discos foliares de tomateiro em diferentes horários pós-inoculação (hpi). Material corado com lactofenol-azul de algodão. A: 4 hpi; conídio com tubo germinativo primário. B: 4 hpi; conídio com apressório lobado (ap) C: 8 hpi; haustório (seta) desenvolvido embaixo do apressório. D: 48 hpi; conídio apresentando quatro hifas e vários apressórios. E: 96 hpi; conídio com hifas e conidióforo. F: 120 hpi; aspecto geral de conídio com hifas ramificadas e conidióforo. Abreviações: c = conídio; ap = apressório; tg1º = tubo germinativo primário; h = hifas; cd = conidióforo. Barra A-E 10 µm, F 20 µm.

c

tg 1º

ap

c

c c

h

h

h

h

c

cd

cd c

A B

C D

F E

83

O Quadro 1 mostra o desenvolvimento sucessivo de hifas a partir dos

conídios inoculados que germinaram no hospedeiro, pela porcentagem de

conídios apresentando uma, duas, três, quatro, cinco e seis hifas nos diferentes

tempos após inoculação. A cultivar Kada apresenta um desenvolvimento de

hifas mais rápido quando comparada com CNPH 1287, demonstrado pela

maior porcentagem de conídios com maior número de hifas desenvolvidas na

maioria dos tempos avaliados (Quadro 1). Somente às 96 hpi não se

detectaram diferenças significativas entre genótipos.

A partir das 96 hpi, foi observado o desenvolvimento de conidióforos

nas hifas produzidas pelos conídios (Figura 1E e 1F). A porcentagem de

conídios (considerando também as hifas desenvolvidas a partir deles)

apresentando conidióforos foi maior na cultivar Kada às 96 e 120 hpi (Quadro

2). Enquanto às 96 hpi o conjunto do conídio e suas hifas apresentavam

somente um conidióforo, às 120 hpi a quantidade de conidióforos por conídio

foi de 5,3 e 2,8 em Kada e CNPH 1287, respectivamente. Com base na

porcentagem de conídios apresentando conidióforo e no número de

conidióforos por conídio, foi calculado também o número de conidióforos por

conídio total avaliado.

Quadro 2. Porcentagem de conídios (e suas hifas) de O. neolycopersici apresentando desenvolvimento de conidióforo 96 e 120 h pós-inoculação (hpi), número de conidióforos por conídio (conídios inoculados com conidióforo) e por conídio total avaliado

1 Dentro de cada horário pós-inoculação, médias na coluna seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott ao nível de 5% de probabilidade.

hpi Genótipos

Conídios que originaram pelo

menos um conidióforo (%)

Nº de conidióforos por

conídio inoculado

Nº de conidióforos por conídio avaliado

CNPH 1287 6,96b1 1 a 0,07b 96

Kada 25,6a 1 a 0,26a

CNPH 1287 31,2b 2,77 b 0,86b 120

Kada 80,8a 5,32 a 4,30a

84

3.2 Localização in situ de peróxido de hidrogênio (H2O2)

A avaliação de sítios de interação fungo-hospedeiro mostrando

acúmulo de H2O2 foi realizada em ambos os genótipos em todos os horários de

coleta após a inoculação.

A adesão do apressório sobre a célula epidérmica e/ou a formação do

haustório às 8 e às 12 hpi induziu acúmulo localizado de H2O2 nas células

epidérmicas, indicado pela coloração marrom-avermelhada da polimerização

da diaminobenzidina sob o sítio de adesão-penetração. Isso ocorreu tanto no

genótipo suscetível como no CNPH 1287 (Figura 2A). A partir das 12 hpi, foi

detectado um acúmulo de H2O2 nas células epidérmicas que sofreram

penetração da hifa e apresentam haustório, sobretudo nas plantas do genótipo

resistente (Figura 2B, 2C, 2D).

Em todos os horários pós-inoculação, o cultivar resistente apresentou

maior número de células epidérmicas de cor marrom, indicando acúmulo de

H2O2. A partir das 72 hpi, observou-se mais de uma célula epidérmica por sítio

de infecção sofrendo acúmulo de H2O2, devido a múltiplos sítios de penetração

das várias hifas produzidas por cada conídio original (Figura 2E-H). O número

de células epidérmicas marrons por sítio de infecção primário às 120 hpi foi de

1,5 na cultivar Kada e de 4,04 para o CNPH 1287.

A quantificação da porcentagem de sítios de penetração apresentando

acúmulo de H2O2 nas células epidérmicas foi realizada em ambos os genótipos

até as 96 hpi (Figura 3). Após esse tempo tornou-se difícil devido à intensa

colonização do tecido foliar pelo patógeno.

No último horário quantificado (96 hpi), o genótipo CNPH 1287 teve

93% dos sítios de infecção com pelo menos uma célula epidérmica com reação

de DAB, enquanto o cultivar Kada apresentava 47%.

Na interação com o genótipo suscetível, nas primeiras fases de

infecção, o acúmulo de H2O2 foi fraco (Figura 2B, 2D e 2F). Em etapas mais

tardias (96 hpi), registrou-se um aumento de células epidérmicas marrons em

contacto com hifas que tinham formado haustórios (Figura 3).

85

Figura 2. Microfotografias de conídios de O. neolycopersici em discos foliares de tomateiro mostrando acúmulo de H2O2 em células epidérmicas após inoculação de plantas de tomateiro cv. Kada e CNPH 1287. Material corado com lactofenol-azul de algodão. Discos foliares foram cortados e infiltrados em solução de diaminobenzidina (DAB) a 0,1% para avaliação microscópica em diferentes horários pós-inoculação (hpi). A: Kada, 12 hpi; acúmulo de H2O2

B A

C D

E F

G H

c

c

c

c

c

c

c c

ap

localizado sob apressório. B: CNPH 1287 24 hpi; célula epidérmica mostra intenso acúmulo de H2O2. C: Kada 24 hpi; coloração fraca de DAB. D: CNPH 1287 72 hpi; duas células epidérmicas mostrando forte acúmulo de H2O2 no sítio de infecção E: Kada 48 hpi; célula epidérmica apresentando coloração fraca. F: CNPH 1287 96 hpi; plano focal inferior: três células epidérmicas mostrando forte acúmulo de H2O2 no sítio de infecção; G: Kada 96 hpi; aspecto geral de conídio com hifas ramificadas sem células com acúmulo de H2O2. H: idem F em plano focal superior: conídio com quatro hifas. Abreviações: c = conídio; ap = apressório. Barra 10 µm.

86

Tempo (horas pós-inoculação)

0 12 24 48 72 96

Por

cen

tage

m d

e s

ítios

co

m c

olor

açã

o m

arr

om (

DA

B)

0

20

40

60

80

100

Figura 3. Porcentagem de sítios de infecção com acúmulo de H2O2 em células epidérmicas após inoculação de plantas de tomateiro cv. Kada (X X X) e CNPH 1287 (XX) com O. neolycopersici. Nos tempos indicados discos foliares foram cortados e infiltrados em solução de diaminobenzidina (DAB) a 0,1%, para avaliação microscópica da frequência dos sítios de infecção com precipitado marrom. Cada ponto representa pelo menos 50 sítios de infecção em cada um dos três discos foliares avaliados. Barras indicam desvio-padrão. ** Indicam diferença estatística a nível de 1% de probabilidade pelo teste de Scott-Knott.

3.3 Localização in situ de superóxido (O2.-)

A coloração com nitrobluetetrazólio (NBT) foi realizada para se detectar

a geração e o acúmulo de O2.- in situ. A porcentagem de sítios de infecção com

acúmulo de O2.- foi quantificada às 24, 48 ,72 e 96 hpi (Quadro 3, Figura 4). No

genótipo resistente, a porcentagem de sítios de penetração com acúmulo de

O2.- aumentou significativamente após a inoculação com O. neolycopersici, com

coloração azul de NBT cada vez mais intensa. No cultivar Kada, a frequência

de sítios com coloração de NBT foi menor em todas as avaliações quando

comparada com CNPH 1287, sendo que, na última avaliação (96 hpi), foi

levemente inferior que às 72 hpi.

**

**

**

**

**

87

Quadro 3. Porcentagem de sítios de infecção com acúmulo de O2.- e número

de células coradas por sítio de infecção após inoculação de plantas de tomateiro cv. Kada e CNPH 1287 com O. neolycopersici. . . . Nos horários pós-inoculacão (hpi) indicados discos foliares foram cortados e infiltrados em solução de nitrobluetetrazólio (NBT) a 0,1%, para avaliação microscópica da frequência dos sítios de infecção com coloração azul

A localização histológica da coloração com NBT foi avaliada

microscopicamente nos diferentes horários pós-inoculação. A partir das 12 hpi

foram detectados os primeiros sítios de penetração com acúmulo de O2.-. Isso

coincide com o desenvolvimento de haustório na maioria dos conídios

observados. A partir das 24 hpi foi possível observar células epidérmicas com

coloração de NBT (Figura 5A e 5B), sobretudo no genótipo resistente (Quadro

3). No cultivar Kada, quando observado acúmulo de O2.- no sítio de penetração,

a coloração foi menos intensa. A partir das 48 hpi, em alguns sítios, foram

observadas duas células do hospedeiro com acúmulo de O2.- em um só sitio de

infecção, sendo mais frequente a ocorrência no genótipo resistente. Nos

tempos posteriores, observou-se coloração azul nas células do mesófilo

adjacentes aos locais que apresentavam haustórios (Figura 5H) e também

morte celular (cor amarelada) nas células epidérmicas com presença de

haustório (Figura 5C, 5E e 5G).

Hpi Genótipos Sítios de infecção

com coloração de NBT (%)

Nº de células coradas por sítio de

infecção primário

Nº de células coradas por

conídio avaliado CNPH 1287 50,1± 10,8 1 0,5

24 Kada 7,6± 2,5 1 0,76

CNPH 1287 70,0± 11,6 1,25 ± 0,12 0,88 48

Kada 24,9± 4,0 1,07 ± 0,06 0,27

CNPH 1287 81,2± 5,0 2,49 ± 0,36 2,02 72

Kada 20,0± 4,0 1,32 ± 0,2 0,26

CNPH 1287 95,0± 2,1 96

Kada 17,6± 1,7 N/A N/A

88


0 24 48 72 96

Po

rce

ntag

em

de

sít

ios

com

co

lora

ção

azul

(N

BT

)

0

20

40

60

80

100

Figura 4. Porcentagem de sítios de infecção com acúmulo de O2.- em células

epidérmicas após inoculação de plantas de tomateiro cv. Kada (2 2 2) e CNPH 1287 (XX) com O. neolycopersici. Nos tempos indicados, discos foliares foram cortados e infiltrados em solução de nitrobluetetrazolium (NBT) a 0,1% para avaliação microscópica da frequência dos sítios de infecção com precipitado azul. Cada ponto representa pelo menos 100 sítios de infecção avaliados. Barras indicam desvio-padrão. ** Indicam diferença estatística ao nível de 1% de probabilidade pelo teste de Scott-Knott.

A frequência de células epidérmicas com coloração amarelada às 72

hpi foi mais alta no genótipo resistente (ver 3.4). O aspecto do sítio de infecção

primário em CNPH 1287 às 120 hpi é o de um quebra-cabeça, sendo as peças

amareladas células mortas e as azuis células vivas que apresentam acúmulo

de O2.- (Figura 5G). As células coradas de azul muitas vezes circundam as

células mortas. No genótipo CNPH 1287, ao longo da extensão das hifas,

algumas células epidérmicas que apresentavam haustórios apresentam cor

amarelada e outras reação de NBT (Figura 5E). Os sítios de infecção que

apresentavam células de cor amarelada foram observados sob luz fluorescente

para confirmar morte celular (Figura 5I e 5J).

**

** **

**

89

(continua na página seguinte)

Figura 5. Microfotografias de conídios de O. neolycopersici em discos foliares de tomateiro mostrando acúmulo de O2

.- em células atacadas após inoculação de plantas de cv. Kada e CNPH 1287. Discos foliares foram cortados e infiltrados em solução de nitro blue tretrazolium (NBT) a 0,1% para avaliação microscópica em diferentes horários pós-inoculação (hpi). Material corado com lactofenol-azul de algodão. A: CNPH 1287, 48 hpi; acúmulo de O2.- na célula epidérmica. B: Kada 48 hpi; células sem acúmulo de O2.- C: CNPH 1287, 72 hpi; acúmulo de O2.- e morte celular em células epidérmicas (setas). D: Kada 72 hpi; célula epidérmica mostrando coloração fraca no sítio de penetração. E: CNPH 1287 96 hpi; células epidérmicas que apresentam haustórios mostrando morte celular e acúmulo de O2.- (seta) no sítio de penetração. F: Kada 96 hpi; células epidérmicas que apresentam haustórios sem sinais de acúmulo de O2.- e células do mesófilo coradas de azul. G: CNPH 1287 120 hpi em plano focal superior; células epidérmicas mortas em alguns sítios de penetração e com acúmulo de O2.- (seta) em outros. H: CNPH 1287 120 hpi em plano focal inferior; células vizinhas do mesófilo com intensa coloração azul. I: CNPH 1287 120 hpi células amareladas rodeadas por células com coloração de NBT (setas). J: idem I observado sob luz fluorescente. Abreviações: MC= morte celular; c= conídio. Barra A-F:10 µm; G: 20 µm.

A B

D C

MC

c

c

c

c

90

Figura 5, continuação

c

MC

H

F

E F

G

MC

MC c

H

I

MC

MC

J

MC

MC

91

3.4 Resposta de hipersensibilidade

Às 24, 48, 72 e 96 hpi, foi determinada a porcentagem de sítios de

infecção com células fluorescentes, indicativo de morte celular por

hipersensibilidade (HR) (Figura 6, Quadro 4).

Figura 6. Porcentagem de sítios de infecção com resposta de hipersensibilidade (HR) em CNPH 1287 (22) e cv. Kada (2 2 2) em diferentes horários pós-inoculação (hpi). Cada ponto representa pelo menos 200 sítios de infecção avaliados. Barras indicam desvio-padrão. ** Indicam diferença estatística ao nível de 1% de probabilidade pelo teste de Scott-Knott.

Nas duas primeiras avaliações realizadas (24 e 48 hpi), a reação de

hipersensibilidade foi observada principalmente como fluorescência da parede

celular sendo muitas vezes parcial. Nas últimas avaliações, nas células onde

ocorreu penetração do fungo, a HR foi observada como fluorescência completa

no microscópio de luz fluorescente ou como cor amarelada no microscópio

comum (Figura 7D). Quando detectada HR na cultivar Kada, a fluorescência

era menos intensa (Figura 7B). O aspecto das células epidérmicas nos sítios

de infecção às 120 hpi adquire o mesmo aspecto de quebra-cabeça

apresentado na coloração com NBT nesse horário (Figura 7)


0 24 48 72 96

Por

cent

age

m d

e s

ítio

s co

m H

R

0

20

40

60

80

100

**

**

**

**

92

Quadro 4. Porcentagem de sítios de infecção com respostas de hipersensibilidade (HR) após inoculação de plantas de tomateiro cv. Kada e CNPH 1287 com O. neolycopersici. Nos horários pós-inoculação (hpi) indicados, foram cortados discos foliares para avaliação da frequência dos sítios de infecção com o uso de microscopia de fluorescência incidente

Em todas as avaliações, no genótipo resistente houve maior frequência

de sítios com células apresentando HR quando comparado com a cultivar

suscetível. Às 96 hpi, 86% dos sítios de infecção avaliados na interação

resistente apresentaram HR, enquanto na interação suscetível a porcentagem

de sítios de penetração com HR foi 30%. O número de células por sítio de

infecção exibindo HR às 96 hpi foi de 2,1 e 1,2 no genótipo resistente e

suscetível, respectivamente (Quadro 4). Quando avaliado o número de células

com HR por sítio de infecção primário, a interação resistente apresentou 5

vezes mais reações de HR que no cultivar Kada.

Hpi Genótipos Sítios de infecção

com HR (%)

Nº de células com HR por sítio de

infecção primário

Nº de células com HR por

conídio avaliado CNPH 1287 56,8± 4,6 1 0,57

24 Kada 10,0± 4,1 1 0,10

CNPH 1287 63,8± 7,3 1 0,64 48

Kada 32,7± 3,5 1 0,33

CNPH 1287 64,9± 6,5 1,5± 0,21 0,97 72

Kada 24,2± 5,5 1,1± 0,07 0,27

CNPH 1287 86,1± 1,7 2,1± 0,22 1,81 96

Kada 30,3± 4,3 1,2± 0,15 0,36

93

Figura 7. Microfotografias de conídios de O. neolycopersici em discos foliares de tomateiro às 120 h após inoculação de plantas de tomateiro cv. Kada e CNPH 1287. Discos foliares foram cortados para avaliação microscópica de resposta de hipersensibilidade (HR). Material corado com lactofenol-azul de algodão. A: Desenvolvimento de hifas a partir de conídio sem presença de células amareladas em cv Kada. B: idem C sob luz fluorescente; não se detectou fluorescência. C: Células epidérmicas de cor amarelado (setas) em CNPH 1287. D: idem C sob luz fluorescente; células amareladas na luz comum apresentam fluorescência. Abreviações: c = conídio. Barra 10 µm.

A B

B A

C D

c c

c c

94

3.5 Análises bioquímicas

3.5.1 Atividade de peroxidase de guaiacol

Nos tempos 0, 12, 24, 72, 96 e 120 após inoculação, a atividade da

peroxidase foi significativamente maior nas plantas de CNPH 1287 em relação

a Kada (Figura 8).

Diferenças na atividade da enzima em plantas inoculadas comparadas

com plantas sadias somente foram detectadas no genótipo CNPH 1287.

Ocorreu maior atividade da enzima às 8, 12, 24 e 120 hpi nas plantas

inoculadas em relação às plantas sadias.


0 4 8 12 24 48 72 96 120

Ab

s m

in-1

mg

-1 p

rote

ína

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Figura 8. Dinâmica da atividade de peroxidase de guaiacol em plantas inoculadas com O. neolycopersici (XX) e plantas sadias (2 2 2) de S. habrochaites CNPH 1287 (■) e S. lycopersicum cv. Kada (●). Barras indicam a média ± desvio-padrão.

Foram detectadas variações na atividade da peroxidase em função do

tempo somente em plantas inoculadas do genótipo CNPH 1287. A atividade de

peroxidase em plantas desse genótipo inoculadas foi maior na coleta realizada

às 24 hpi seguida pela coleta das 120 hpi, das 12 hpi e por último das 72, 8, 48,

95

0 e 96 hpi. A coleta com menor atividade da enzima no genótipo CNPH 1287

foi a das 4 hpi.

3.5.2 Atividade de catalase

Nos tempos 24, 48, 96 e 120 após inoculação, a atividade da catalase

foi significativamente maior nas plantas de CNPH 1287 em relação a Kada

(Figura 9). Nos tempos 8, 12, e 72 hpi, somente as plantas inoculadas de

CNPH 1287 mostraram maior atividade da enzima do que as plantas

inoculadas da cv. Kada.


0 4 8 12 24 48 72 96 120

um

ol m

in-1

mg

-1 p

rote

ína

0

20

40

60

80

100

120

Figura 9. Dinâmica da atividade de catalase em plantas inoculadas com O.

neolycopersici (XX) e plantas sadias (2 2 2) de S. habrochaites CNPH 1287 (■) e S. lycopersicum cv. Kada (●). Barras indicam a média ± desvio-padrão.

As diferenças na atividade da enzima em plantas inoculadas

comparadas com plantas sadias foram detectadas principalmente no genótipo

CNPH 1287. Nos tempos 8, 12, 72 e 120 hpi a atividade da enzima foi maior

nas plantas inoculadas em relação às plantas sem inocular desse genótipo. No

cultivar Kada, somente foi detectada diferença significativa entre as plantas

inoculadas e sem inocular às 12 hpi.

96

Foram detectados variações na atividade da catalase em função do

tempo em plantas de CNPH 1287 inoculadas. Essa ativiade foi maior na coleta

realizada às 12 hpi seguida das coletas realizadas às 72 e 48 hpi e pela

atividade às 24, 120 e 8 hpi. Em plantas inoculadas da cv. Kada, somente se

detectou maior atividade às 12 hpi.

3.5.3 Atividade de polifenoloxidase

Nos tempos 8, 12, 24, 48, 96 e 120 após inoculação, a atividade da

polifenoloxidase foi significativamente maior nas plantas de CNPH 1287 em

relação a cv. Kada (Figura 10).


0 4 8 12 24 48 72 96 120

Abs

min

-1 m

g-1 p

rote

ína

0

5

10

15

20

25

30

Figura 10. Dinâmica da atividade de polifenoloxidase em plantas inoculadas com O. neolycopersici (XX) e plantas sadias (2 2 2) de S. habrochaites CNPH 1287 (■) e S. lycopersicum cv. Kada (●). Barras indicam a média ± desvio-padrão.


comparadas com plantas sadias somente foram detectadas no genótipo CNPH

97

1287, sendo que nos tempos 8, 12 e 24 hpi a atividade da enzima foi maior nas

plantas inoculadas.

Foram detectados variações na atividade da polifenoloxidase em

função do tempo somente em plantas de CNPH 1287 inoculadas. Nessas

plantas, a atividade foi maior na coleta realizada às 24 hpi seguida pelas

coletas realizadas às 120, 8, 48 e 12 hpi.

3.5.4 Atividade de quitinase

Nos horários 4, 8, 24 e 96 após inoculação, a atividade da quitinase foi

significativamente maior nas plantas de CNPH 1287 em relação às plantas de

Kada (Figura 11).


0 4 8 12 24 48 72 96 120

Abs

min

-1 m

g-1

pro

teín

a

0

1

2

3

4

5

6

Figura 11. Dinâmica da atividade de quitinase em plantas inoculadas com O.

neolycopersici (XX) e plantas sadias (2 2 2) de S. habrochaites CNPH 1287 (■) e S. lycopersicum cv. Kada (●). Barras indicam a média ± desvio-padrão.


com plantas sadias foram detectadas no genótipo CNPH 1287 às 24 e 72 hpi e

98

na cv. Kada somente às 12 hpi, sendo maior em todos os casos nas plantas

inoculadas do que nas plantas sem inocular.

Foram detectados variações na atividade da quitinase em função do

tempo somente em plantas de CNPH 1287 inoculadas. Essa atividade foi maior

na coleta realizada às 24 hpi seguida pelas coletas realizadas às 72, 8, 120, 48

e 96 hpi.

3.5.5 Atividade de β-1,3- glucanase

Nos horários de 4, 8, 24 e 48 após inoculação, a atividade da β-1,3-

glucanase foi significativamente maior nas plantas de CNPH 1287 do que em

Kada (Figura 12).


0 4 8 12 24 48 72 96 120

mg

glic

ose

min

-1 m

g-1

pro

teín

a

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

Figura 12. Dinâmica da atividade de β-1,3- glucanase em plantas inoculadas com O. neolycopersici (XX) e plantas sadias (2 2 2) de S. habrochaites CNPH 1287 (■) e S. lycopersicum cv. Kada (●). Barras indicam a média ± desvio-padrão.

Diferenças na atividade de β-1,3- glucanase em plantas inoculadas


1287. Nos horários de 8 e 24 hpi, a atividade da enzima foi maior nas plantas

99

inoculadas, enquanto no horário de 120 hpi essa atividade foi maior nas plantas

sem inocular.

Foram detectados variações na atividade da enzima em função do

tempo somente em plantas de CNPH 1287 inoculadas. A atividade da β-1,3-

glucanase foi maior nas coletas realizadas 8 e 24 hpi do que nos outros

horários.

100

4. DISCUSSÃO

4.1 Reação de hipersensibilidade

O termo hipersensibilidade foi usado pela primeira vez por Stakman

(1915) para descrever a morte rápida e localizada das células da planta no sítio

de infecção induzida pelo fungo da ferrugem em cereais com resistência à

ferrugem. Usualmente, a resposta de hipersensibilidade (HR) é definida como a

morte rápida de células da planta associada com a restrição do crescimento do

patógeno (GOODMAN & NOVACKY, 1994). A HR é geralmente reconhecida

pela presença de células mortas, de cor marrom, no sítio de infecção e,

dependendo do patógeno, o número de células envolvidas pode variar de uma

a várias. A HR pode estar restringida ou não à célula invadida ou em contato

direto com patógeno (HEATH, 2000). A necrose do tecido afetado é

diretamente relacionada ao acúmulo, à oxidação e à polimerização de fenóis

(NICHOLSON; HIPSKIND; HANAU, 1989). As interações incompatíveis estão

frequentemente associadas com HR (HAMMOND-KOSACK & JONES, 1996).

A HR pode expressar-se tanto como morte de células individuais quanto

necrose macroscopicamente detectável e é relatada em interações

incompatíveis como um dos mecanismos de defesa resultante da ativação de

genes do hospedeiro como resposta ao reconhecimento de moléculas

sinalizadoras do patógeno (elicitores) (AGRIOS, 2005).

No presente trabalho, as avaliações indicaram que ambos os genótipos

apresentaram HR, embora em diferentes níveis. Considerando-se a frequência

de HR e o número de células envolvidas por interação, a HR apresentada na

interação incompatível no último horário avaliado (96 hpi) é cinco vezes maior

que na compatível.

A autofluorescência das células epidérmicas ocorrida nas primeiras

horas da patogênese pode servir como indicativo de interação incompatível,

embora em fases mais avançadas esteja associada tanto com interações

compatíveis como incompatíveis envolvendo um maior número de células

mortas no hospedeiro (RODRIGUES et al., 2005).

101

Várias evidências sugerem que os compostos autofluorescentes

presentes nas células epidérmicas são compostos fenólicos relacionados

provavelmente à biossíntese da lignina (CARVER et al., 1994; CARVER et al.,

1996; WANG et al., 2007).

O valor relativamente alto de autofluorescência na interação Kada-O.

neolycopersici registrado somente a partir das 48 hpi confirma o

estabelecimento de uma relação biotrófica entre o fungo e a célula epidérmica

suscetível antes do desenvolvimento da morte celular. Já em CNPH 1287, a

autofluorescência ocorrida nas primeiras 24 hpi é um forte indicativo de morte

celular por HR, assim determinando, portanto, a interrupção do acesso a

nutrientes celulares por parte do patógeno. Segundo Dangl, Dietrich e Richberg

(1996), alguns dos mecanismos que conduzem à morte por HR e à morte

celular por doença são comuns.

A maior quantidade de hifas e de conidióforos desenvolvidos na cv.

Kada, nos tempos avaliados, indica que o desenvolvimento do fungo foi mais

rápido do que em CNPH 1287. Neste último genótipo, a elevada frequência de

HR em células epidérmicas atacadas seria responsável pela degenerescência

dos haustórios após sua formação, levando a uma menor colonização do

tecido. Matsuda et al. (2005) verificaram que, em acessos de S. habrochaites

completamente resistentes a oídio, não foram formados haustórios funcionais

devido ao desenvolvimento de resposta de hipersensibilidade nas células

epidérmicas invadidas pelo patógeno. Isso resultou na falha do

estabelecimento da infecção pelo conídio. Esses autores verificaram que, em

plantas de tomate suscetível, os conídios que formaram apressório penetraram

com sucesso e formaram haustórios sem causar resposta de hipersensibilidade

na célula atacada, produzindo hifas secundárias para expandir suas colônias.

Nossas observações indicaram que a HR não foi restrita à célula onde

foi formado o haustório, estendendo-se às células adjacentes. Huang et al.

(1998) também observaram necrose em células adjacentes às invadidas pelo

haustório em dois acessos de S. habrochaites (G1.1257 e G1.1290) inoculados

com O. lycopersicum.

A presença de células epidérmicas amareladas, indicativas de morte

celular, foi verificada a partir das 72 hpi no microscópio de luz normal e a

avaliação de células com autofluorescência a partir das 24 hpi. Segundo

102

Mansfield et al. (1997)1 (citado por MLÍČKOVÁ et al., 2004), a cor amarelada

da célula é típica das últimas etapas de HR, já que as células se tornam

descoloridas várias horas depois de ocorrido dano irreversível nas membranas

celulares. Nas primeiras etapas de HR, outra expressão de incompatibilidade é

a geração de espécies reativas de oxigênio (EROs) (HAMMOND-KOSACK &

JONES, 1996).

4.2 Espécies reativas de oxigênio

Importantes diferenças na produção de EROs foram observadas nos

genótipos estudados. A geração de H2O2 foi detectada nas folhas de CNPH

1287 nos primeiros horários pós-inoculação (12-24 hpi), enquanto no cultivar

suscetível o acúmulo de H2O2 foi pouco frequente e fraco quando presente. O

acúmulo localizado de H2O2 na célula provoca um efeito tóxico direto sobre o

patógeno e dano localizado na membrana celular em sítios de adesão com o

patógeno (MLÍČKOVÁ et al., 2004; RESENDE; SALGADO; CHAVEZ, 2003).

Esse último efeito foi comprovado neste trabalho, onde se detectou acúmulo

intenso de H2O2 sob o apressório, inclusive na interação compatível. Em

contraste com essa resposta presente em ambas as interações no processo de

pré-penetração, o acúmulo de H2O2 pós-penetração foi detectado mais

frequentemente na interação incompatível. Essa situação foi reportada por

Wang et al. (2007) na interação trigo-Puccinia striiformis f. sp. tritici e por

Hückelhoven et al. (1999) na interação cevada-Blumeria graminis f. sp. hordei).

Na interação incompatível, foi registrado um aumento importante de

sítios com acúmulo de H2O2 entre 48 e 72 hpi. A frequência de células com

acúmulo de H2O2 e apresentando HR às 72 hpi é similar em ambas as

interações. Como outros autores reportam no patosistema cevada-Blumeria

graminis f. sp. hordei (THORDAL-CHRISTENSEN et al., 1997;

HÜCKELHOVEN et al.,1999), trigo-Puccinia striiformis f. sp. tritici (WANG et al.,

2007) e Lactuca spp.-Bremia lactucae (SEDLÁŘOVÁ et al., 2007) e inclusive

1 J. MANSFIELD, M. BENNETT, C. BESTWICK, A. WOODS-TÖR. Phenotypic expression of gene-for-

gene interaction involving fungal and bacterial pathogens: variation from recognition to response, In: CRUTE, I.R.; HOLUB, E.B.; BURDON, J.J. (Eds.), The gene-for-gene relationship in plant–parasite interactions. CAB International, Wallingford, 1997. p. 265–291.

103

no mesmo patossistema aqui analisado (MLÍČKOVÁ et al., 2004;

TOMÁNKOVÁ et al., 2006), o acúmulo de H2O2 nas células epidérmicas esteve

associado com a morte celular por HR. O mecanismo proposto é que as EROs,

sendo altamente reativas, causam a hidroxiperoxidação dos fosfolipídios da

membrana celular produzindo hidroperóxidos lipídicos. Esses últimos,

altamente tóxicos, rompem as membranas celulares provocando o colapso e a

morte celular por HR (AGRIOS, 2005).

O aumento de células coradas com DAB registrado a partir das 72 hpi

no cultivar suscetível pode ser explicado como uma reposta não específica do

tecido do hospedeiro resultante da desorganização celular causada pela

colonização do fungo e a subsequente restrição de nutrientes disponíveis.

O teste baseado na redução do NBT pelo radical O2.- formando

formazan (precipitado azul) tem se revelado útil na detecção da geração do

superóxido. Na interação compatível, poucos sítios de penetração mostrando

acúmulo de O2.- foram encontrados às 24 hpi. Por outro lado, na interação

incompatível, a frequência foi cinco vezes mais alta. Esse acúmulo de O2.-

continuou aumentando nas duas avaliações posteriores. A partir das 72 hpi,

observou-se morte celular nas células epidérmicas que apresentavam

haustórios e células vivas gerando O2.- ao redor, enquanto em outras células

atacadas detectou-se acúmulo de superóxido. A quantidade de células

atacadas pelo fungo e apresentando morte celular por HR foi aumentando nos

horários finais, o que foi confirmado com as avaliações de HR usando

fluorescência.

Hückelhoven et al. (2000), estudando a interação cevada-Blumeria

graminis f. sp. hordei, reportou que uma explosão oxidativa foi induzida sob o

sítio de penetração do fungo nas células epidérmicas dos genótipos de cevada

resistentes. As células do mesófilo que acumularam H2O2 e sofreram morte

celular por HR estavam rodeadas por uma camada de células vivas gerando

superóxido. Wang et al. (2007), estudando a interação compatível e

incompatível de trigo-Puccinia striiformis, também reportam acúmulo de O2.- em

células de mesófilo rodeando células com HR. Jabs, Dietrich e Dangl (1996) e

Hückelhoven e Kogel (1998) sugeriram a hipótese de que a geração do radical

superóxido em células adjacentes a células com HR seria um sinal para

restringir a morte celular. O radical O2.- interfere negativamente com a morte

104

celular protegendo as células do óxido nítrico através da formação do

peroxinitrito (ONOO-), o qual, aparentemente, não é muito tóxico para as

plantas (MLÍČKOVÁ et al., 2004). O óxido nítrico junto com H2O2 desencadeia

morte celular (DELLEDONNE, 2005), indicando que o balanço entre O2.- e H2O2

é crucial para a indução e a restrição da morte celular.

Neste trabalho, os resultados indicam que o acúmulo de O2.- e de H2O2

na interação incompatível foi temporalmente diferente nas primeiras fases da

patogênese. Às 24 hpi, 50% dos sítios avaliados apresentavam reação com

NBT, enquanto, no mesmo tempo, somente 18% apresentavam acúmulo de

H2O2. O acúmulo antecipado de O2.- aconteceu mais claramente na interação

resistente trigo-Puccinia striiformis, onde a maior geração do radical superóxido

(12 hpi) foi anterior à máxima geração de H2O2 (24 hpi) (WANG et al., 2007).

Parte desse radical superóxido poderia ter sido convertida a H2O2 pela

superóxido dismutase (SOD) ou por dismutação espontânea, embora a

geração de H2O2 não dependa de uma geração prévia de O2.-, podendo formar-

se a partir de outras fontes geradoras.

EROs nos sítios de interação podem ter diferentes funções tanto na

elicitação quanto na prevenção da morte celular, dependendo de sua

concentração, localização subcelular e duração da sua explosão oxidativa.

Neste trabalho, foram encontradas diferenças nas respostas de acúmulo de

EROs (H2O2 e O2.-) e de morte celular nas interações compatíveis e

incompatíveis entre oídio e duas espécies do gênero Solanum seção

Lycopersicon. Estas respostas foram mais rápidas e extensivas na interação O.

neolycopersici – S.habrochaites.

4.3 Atividade de enzimas relacionadas à patogênese

Na maioria dos tempos pós-inoculação, foi registrada uma maior

atividade de peroxidase de guaiacol (GPOX) no genótipo resistente (Figura 8).

Na cultivar suscetível não foram detectadas alterações na atividade da enzima.

Em CNPH 1287, a atividade aumentou das 4 hpi até 24 hpi, onde alcançou o

máximo, e às 120 hpi, onde houve outro pico de atividade.

105

O aumento da atividade da GPOX em plantas durante ou após ataque

de patógenos tem sido reportado em muitos trabalhos. As mudanças na

atividade da peroxidase indicam três níveis de respostas: mudanças não

específicas associadas com a inoculação, mudanças associadas com repostas

de defesa a nível geral e respostas que têm relevância no desenvolvimento de

HR (MLÍČKOVÁ et al., 2004).

A peroxidase tem um papel multifuncional, atuando como “peroxidase”,

reduzindo o nível de EROs ao metabolizar o H2O2, mas também como

“oxidase” gerando H2O2 (HAMMOND-KOSACK & JONES, 1996). A produção

pH-dependente de H2O2 por peroxidases de parede celular tem sido proposta

como via alternativa durante estresse biótico (BOLWELL & WOJTASZEK,

1997).

As peroxidases participam de vários processos fisiológicos

relacionados à defesa como ligação cruzada de proteínas de parede celular, de

pectinas por pontes diferúlicos e a oxidação de álcoois fenólicos durante a

formação de lignina. As isoenzimas de peroxidase estão presentes em

numerosos compartimentos celulares (retículo endoplasmático, aparelho de

Golgi, mitocôndria, citosol, vacúolos) e na parede celular. Na parede celular, as

peroxidases podem estar presentes em forma solúvel, iônica ou

covalentemente ligadas. O fortalecimento da parede celular, uma das funções

mais importantes da peroxidase, tem sido atribuído principalmente a

peroxidases cuja atividade pode ser detectada pelo uso de siringaldazina como

substrato na mistura de reação dos testes enzimáticos (RANIERI et al., 2001).

No genótipo suscetível, baixo acúmulo de H2O2 nos tecidos

correspondeu a poucas mudanças na atividade de GPOX. Isso é coerente com

o rápido desenvolvimento do fungo e a baixa frequência de necrose celular

nesse genótipo. No genótipo resistente, a ocorrência do pico de atividade de

GPOX registrado no experimento coincide com as primeiras demonstrações de

HR. Considerando o papel da peroxidase no metabolismo de compostos

fenólicos, a intensa HR poderia estar associada com a localização de material

autofluorescente.

Sedlářová et al. (2007) descreveram aumento da peroxidase de

guaiacol solúvel em plantas de alface resistentes a Bremia lactucae após

inoculação com esse oomiceto. Mlíčcková et al. (2004) e Tománková et al.

106

(2006) analisando a interação O.neolycopersici- S.habrochaites var. glabratum

(LA 2128), relatam aumentos importantes na atividade dessa enzima. Enquanto

os primeiros autores registraram aumentos nas primeiras (8-16 hpi) e nas

últimas fases da infecção (48-120 hpi), os últimos detectaram aumentos de

atividade às 24 hpi e 72-168 hpi. Ambos os trabalhos não registraram

mudanças na formação de lignina em nenhum dos genótipos estudados. Esses

antecedentes confirmam os aumentos de atividade de GPOX em

S.habrochaites encontrados neste trabalho.

As EROs ocorrem normalmente no metabolismo celular, porém quando

acumuladas tornam-se tóxicas à célula, principalmente quando se convertem

para espécies ainda mais reativas como o radical hidroxil (OH-). Devido à

natureza daninha das EROs, as plantas utilizam sistemas enzimáticos

(superóxido dismutase, peroxidase de guaiacol, ascorbato peroxidase e

catalase) assim como sistemas antioxidantes não enzimáticos (glutatione,

ascorbato, tocoferol e compostos fenólicos) para prevenir o dano nos

componentes celulares do hospedeiro (SEDLAROVÁ et al., 2007). A catalase

(CAT) catalisa a reação de dismutação do peróxido de hidrogênio em água e

oxigênio, reduzindo dessa forma o excesso de EROs durante o estresse

oxidativo.

Nesse experimento, a atividade de CAT (Figura 9) em plantas

infectadas do genótipo resistente exibiu dois aumentos significativos no período

analisado, o primeiro e mais importante às 12 hpi e o segundo às 72 hpi. No

caso do cultivar suscetível, só foram registradas diferenças na atividade de

CAT entre plantas inoculadas e sadias às 12 hpi. O primeiro aumento de

atividade em CNPH 1287 coincide em tempo com os primeiros sinais de

acúmulo de H2O2 nos locais de infecção de células epidérmicas. O segundo

pico de atividade registrado às 72 hpi poderia interpretar-se como resposta

frente a níveis muito altos de H2O2 que ocorrem nesse momento. O aumento

registrado às 120 hpi sugere que os mecanismos de detoxificação

(“scavenging”) do H2O2 excessivo podem seguir atuando nas fases mais

avançadas da patogênese. Esse comportamento da catalase também foi

reportado no mesmo patossistema por Mlíčková et al. (2004) e Tománková et

al. (2006).

107

A atividade da polifenoloxidase (PFO) foi maior em CNPH 1287 durante

todo o período avaliado (Figura 10). Além disso, somente nesse genótipo foram

detectadas diferenças de atividade entre plantas inoculadas e sadias, o que

ocorreu às 8, 12 e principalmente às 24 hpi. A atividade de PFO em Kada não

sofreu alterações ao longo do tempo e não houve diferenças entre plantas

inoculadas e não inoculadas.

As PFO são enzimas localizadas nos plastídios, que utilizam o oxigênio

molecular para a oxidação de mono e o-difenóis em o-diquinonas (VAUGHN;

LAX; DUKE, 1988). A atividade da PFO está latente até que a enzima é

liberada dos tilacoides por ferimentos, senescência ou ataque de insetos e

patógenos, iniciando o processo de oxidação dos compostos fenólicos. As

quinonas têm ação antimicrobiana (MOHAMMADI & KAZEMI, 2002) e são

altamente reativas participando de complexas reações não enzimáticas

secundárias. Entre elas, a conversão de quinonas em semiquinonas, as quais

tanto podem ligar-se covalentemente a outras moléculas, quanto realizar a

redução do oxigênio molecular a radical superóxido (THIPYAPONG; HUNT;

STEFFENS, 2004) e a reação covalente e ligação cruzada de

clorogenoquinona com proteínas fornecendo barreiras adicionais de fenóis

polimerizados (LI & STEFFENS, 2002). O papel da PFO na geração de EROs

está na oxidação de compostos fenólicos, reação que produz H2O2 em extratos

vegetais (RICHARD-FORGET & GAUILLARD, 1997). A habilidade da PFO em

gerar EROs sugere que PFO não só tem papel direto na resposta de defesa

como também atua potencializando o acúmulo das EROs. O envolvimento da

PFO na resistência de plantas a fitopatógenos foi comprovada em plantas

transgênicas de tomate com superexpressão de PFO, onde os níveis

aumentados de atividade da enzima determinaram uma forte inibição do

crescimento de Pseudomonas syringae pv. tomato (LI & STEFFENS, 2002).

A correlação positiva encontrada nos níveis aumentados de atividade

de PFO até as 24 hpi em plantas resistentes inoculadas com o acúmulo de

H2O2 e de O2.- registrada a partir desse horário confirma o envolvimento dessa

enzima nas repostas de defesa do tomateiro frente a O. neolycopersici.

A reação de hipersensibilidade ocorre como uma expressão de

incompatibilidade entre a planta hospedeira e um patógeno específico, como

resultado da interação entre os genes de resistência e a virulência no

108

hospedeiro e no patógeno, respectivamente. Além de genes específicos para

resistência, as plantas contêm genes que codificam para proteínas com

atividade antifúngica geral. Essas proteínas relacionadas à patogênese

(proteínas PR), muitas delas enzimas, fazem parte da resposta de defesa

natural da planta e usualmente acompanham a HR. O acúmulo de PR

proteínas em plantas após infecção por patógenos está bem documentado

(VAN LOON, 1997). Entre elas, hidrolases como as β-1,3 glucanases (GLU) e

quitinases (QUI) estão envolvidas na resistência de plantas contra patógenos

fúngicos (JOOSTEN & DE WIT, 1989; KIM & HWANG, 1994; KINI; VASANTHI;

SHETTY, 2000; RIVERA et al., 2002). Essas enzimas atuam diretamente

degradando a parede celular de fungos ou interrompendo sua deposição, o que

contribui para a morte do patógeno (MAUCH; MAUCH-MANI; BOLLER, 1988),

e indiretamente para a liberação de fragmentos da parede celular que atuam

como elicitores de repostas de defesa da planta hospedeira (YOSHIKAWA;

YAMAOKA; TAKEUCHI, 1993).

Nesse experimento foi detectada atividade de QUI em ambos os

genótipos (Figura 11), embora o nível tenha sido maior em CNPH 1287. A

atividade de QUI apresentou um aumento importante nas plantas inoculadas do

genótipo resistente às 24 hpi e um aumento menos acentuado às 72 hpi. Já na

cultivar suscetível, houve um pequeno aumento de atividade nas plantas

inoculadas somente às 12 hpi. A atividade de GLU (Figura 12) aumentou às 8

e às 24 hpi em plantas inoculadas de CNPH 1287 enquanto no cultivar Kada

não houve aumento significativo de atividade. A presença de QUI e GLU em

plantas não inoculadas pode ser atribuída à expressão constitutiva dessas

enzimas em ambos os genótipos.

A atividade diferencial de GLU em interações compatíveis e

incompatíveis frente a patógenos obrigatórios tem sido estudada por vários

autores. Rivera et al. (2002) detectaram um aumento mais rápido da atividade

de GLU (às 48 hpi) e dos mensageiros dessa enzima no cultivar resistente de

melão quando inoculado com Sphaerotheca fusca. Kemp et al. (1999),

estudando a atividade de GLU em plantas de trigo resistentes e suscetíveis à

ferrugem da folha, encontraram maior atividade dessa enzima nas plantas

resistentes. Kini, Vasanthi e Shetty (2000) reportam diferentes níveis de

atividade e indução diferencial de isoformas de GLU em plântulas de milheto

109

resistentes e suscetíveis a Sclerospora graminicola. Após inoculação com esse

patógeno, a atividade em plantas inoculadas do cultivar resistente aumentou

em relação às plantas-controle e alcançou um pico às 24 hpi, enquanto nas

plantas do cultivar suscetível, a atividade da GLU foi maior em plantas sadias

do que nas inoculadas.

A atividade antifúngica de QUI pode ser sinergisticamente melhorada

pelas GLU tanto in vitro (MAUCH; MAUCH-MANI; BOLLER, 1988) como in vivo

(VAN LOON, 1997). Em plantas de tomateiro, Joosten e De Wit (1989)

registraram um rápido acúmulo de GLU e QUI em fluídos apoplásticos de

interações tomateiro-Cladosporium fulvum incompatíveis. Eles sugerem que,

devido ao acúmulo apoplástico dessas enzimas hidrolíticas, elas podem

proteger as plantas contra patógenos fúngicos extracelulares. Nas

extremidades das hifas, β-1,3 glucanos e quitina estão expostos na superfície e

poderiam ser atacados diretamente por GLU e QUI. Lawrence et al. (2000)

observaram maiores níveis constitutivos e maior indução de GLU e QUI em

genótipos de tomate altamente resistentes à pinta preta após inoculação com

A. solani em comparação com genótipos suscetíveis.

Nossos resultados também indicam que os níveis de enzimas

hidrolíticas pré-inoculação e os aumentos de atividade registrados após-

inoculação foram maiores no genótipo resistente. Lawrence et al. (2000)

encontraram níveis constitutivos de QUI e GLU cinco vezes e duas vezes mais

altos, respectivamente, em genótipos de tomate resistentes a Alternaria solani.

Embora os níveis constitutivos de QUI em CNPH 1287 sejam somente uma vez

e meia mais altos do que em Kada, o rápido aumento dos níveis detectado às 8

e às 24 hpi pode constituir-se em um dos fatores responsáveis pela defesa

frente ao ataque fúngico. O nível detectado de GLU pré-inoculação no genótipo

resistente foi 3,3 vezes maior do que na cultivar Kada.

As diferentes formas de GLU e QUI e quitinases ocorrem no apoplasto

(extracelular) e no vacúolo (intracelular). As PRs induzíveis são principalmente

proteínas acídicas que são secretadas ao espaço intercelular da folha. As PRs

básicas ocorrem em níveis relativamente baixos no vacúolo e são induzidas na

infecção (VAN KAN et al., 1992). O oídio é um patógeno biotrófico que cresce

na superfície da planta obtendo os nutrientes por meio de haustórios que

invaginam o plasmalema das células epidérmicas. Como consequência disso,

110

para ter algum efeito no patógeno, GLU e QUI extracelulares deveriam atuar na

parede do haustório e na matriz extra-haustorial. Por outro lado, o acúmulo

dessas enzimas nos vacúolos das células penetradas levaria a uma rápida

liberação de GLU e QUI no sítio de penetração (RIVERA et al., 2002). Essa

liberação de enzimas hidrolíticas durante a morte celular por HR ocorrida

possivelmente em plantas inoculadas de CNPH 1287 às 24 hpi pode ter

contribuído para deter o avanço do fungo. O pico de atividade GLU registrado

em CNPH 1287 às 8 hpi pode corresponder a formas extracelulares da enzima

induzidas previamente às formas intracelulares que estariam atuando no pico

das 24 hpi.

Os resultados confirmam a participação de H2O2 e de O2.- e enzimas

relacionadas a seu metabolismo (POX, CAT), assim como enzimas hidrolíticas

(QUI, GLU) e do metabolismo dos fenóis (PFO) nas respostas de defesa

envolvidas nessa interação patógeno-hospedeiro. A variação da intensidade e

do desenvolvimento temporal da produção de EROs, a expressão de enzimas

relacionadas à defesa e o desenvolvimento de HR, sugerem grandes

diferenças nos mecanismos de defesa dos genótipos estudados. Os resultados

de produção de EROs, reação de hipersensibilidade e atividade de POX e

CAT, são coerentes com resultados de experimentos já publicados, enquanto

os resultados de localização in situ de H2O2 e O2.-, assim como de atividade de

GLU, QUI e PFO, são novos nesse patossistema.

111

5. CONCLUSÕES

- O mecanismo de resistência do genótipo CNPH 1287 (Solanum

habrochaites) frente a Oidium neolycopersici esteve associado com resposta

de hipersensibilidade (HR) e explosão oxidativa.

- O aumento pós-inoculação da atividade da peroxidase do guaiacol,

polifenoloxidase e da catalase e os maiores níveis constitutivos e aumentos

pós-inoculação da atividade das enzimas hidrolíticas quitinase e glucanase

ocorridos nesse genótipo, são coerentes com o acúmulo concomitante de

EROs e o desenvolvimento de HR nos tecidos.

112

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118

CAPÍTULO 4

RESPOSTAS DE GENÓTIPOS DE TOMATE SUSCETÍVEIS E RESISTENTES A Alternaria solani, LOCALIZAÇÃO IN SITU DE

ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO E ATIVIDADE DE ENZIMAS RELACIONADAS À DEFESA

RESUMO

Para investigar as respostas de defesa de dois genótipos de Solanum

seção Lycopersicon com resposta diferencial a Alternaria solani, avaliou-se a

resposta de hipersensibilidade (HR), a produção e o acúmulo de espécies

reativas de oxigênio (EROs) e a atividade de enzimas relacionadas à defesa.

Quando plantas dos genótipos CNPH 1287 (Solanum habrochaites) e Santa

Cruz Kada (Solanum lycopersicum) apresentavam sete-nove e cinco-sete

folhas totalmente desenvolvidas, respectivamente, foi realizada a inoculação da

2ª, 3ª e 4ª folha verdadeira. Essas folhas foram coletadas no momento da

inoculação e às 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96 e 120 h pós-inoculação (hpi). A

produção e acúmulo in situ de peróxido de hidrogênio (H2O2) e radical

superóxido (O2.-) foi avaliada com o uso de diaminobenzidina e

nitrobluetetrazolio, respectivamente. Os conídios germinaram igualmente na

superfície foliar de ambos os genótipos sem orientação definida no crescimento

dos tubos germinativos. A menor frequência de lesões por A. solani no

genótipo CNPH 1287 foi conseqüência do menor número de apressórios

formados nesse genótipo. O acúmulo de H2O2 e de O2.- foi observado em baixa

frequência tanto no genótipo suscetível como no resistente. A HR foi observada

nas células epidérmicas onde ocorreu penetração em ambos os genótipos.

Nossos resultados indicam que EROs e HR não parecem contribuir com a

resistência de S. habrochaites frente a A. solani. Aumentos na atividade de

peroxidase de guaiacol, polifenoloxidase, β-1,3-glucanase e quitinase foram

registrados no genótipo resistente. Não foram detectados aumentos

significativos da atividade da catalase em nenhum dos genótipos. O

desenvolvimento diferencial do patógeno nos tecidos dos hospedeiros,

fundamentado na frequência de formação de apressórios, e a expressão de

119

enzimas relacionadas à defesa sugerem grandes diferenças no comportamento

dos genótipos frente a A. solani.

Palavras-chave adicionais: Pinta preta de tomate. Hipersensibilidade.

Espécies reativas de oxigênio. Peroxidase. Catalase. Polifenoloxidase.

Quitinase. β-1,3-glucanase.

120

ABSTRACT

Defense responses, in situ localization of reactive oxygen species and activity of defense-related enzymes in tomato genotypes resistant and susceptible to Alternaria solani

To investigate plant tissue defense responses in two Solanum section

Lycopersicon genotypes differing in their resistance against Alternaria solani,

hypersensitive reponse (HR), generation and accumulation of reactive oxygen

species (ROS) and activity of defense-related enzymes were studied. Seven-

nine and five-seven true leaves plants of CNPH 1287 (Solanum habrochaites)

and cv. ‘Santa Cruz Kada’ (Solanum lycopersicum), respectively, were

inoculated at 2nd, 3rd and 4th true leaves. At different time intervals (0, 4, 8, 12,

24, 48, 72, 96, e 120 hours post inoculation) these leaves were collected for

analysis. In situ production and accumulation of hydrogen peroxide (H2O2) and

superoxide radical (O2.-) was detected with diaminobenzidine (DAB) and

nitrobluetetrazolium (NBT), respectively. Conidia germination occurred equally

over the leaf surface in both genotypes and germination tubes grew without

apparent orientation. Lower lesion frequency in CNPH 1287 was consequence

of lower number of appressoria formed by A. solani in that genotype. H2O2 and

O2.- accumulation were observed in lower frequency in both genotypes. HR was

observed in penetrated epidermal host cells also in both genotypes. It seems

that ROS and HR have not contributed to the resistance of S. habrochaites to A.

solani in this study. The activity of guaiacol peroxidase, poliphenol oxidase, β-

1,3-glucanase and chitinase was significantly increased in the resistant

genotype. No significant changes were detected in catalase activity in any of the

genotypes. Differential pathogen development in leaf host tissues, mainly due to

appressoria formation frequency, and expression of defense-related enzymes

suggest important differences in the resistance of these genotypes against A.

solani.

Additional keywords: Tomato early blight. Hypersensitive response. Reactive

oxygen species. Peroxidase. Catalase. Polyphenol oxidase. Chitinase. β-1,3-

glucanase.

121

1. INTRODUÇÃO

A pinta preta caracteriza-se por ser uma das mais importantes e

frequentes doenças da cultura do tomateiro [Solanum lycopersicum L.

(PERALTA; KNAPP, SPOONER, 20050 sin. Lycopersicon esculentum Mill.] a

nível mundial. Apresenta alto potencial destrutivo causando perdas que podem

ser maiores a 79% em países como Canadá, Índia, Estados Unidos e Nigéria

(FOOLAD; MERK; ASHRAFI, 2008). O uso de cultivares resistentes seria a

forma de controle mais eficiente e segura, mas, na prática, o progresso no

melhoramento por resistência à pinta preta tem sido limitado pela falta de genes

de resistência no tomateiro cultivado e pela expressão quantitativa e herança

poligênica da resistência. Várias espécies de tomateiro selvagens (S.

habrochaites S. Knapp & D. Spooner [sin. L. hirsutum Dunal], S. pimpinellifolium

L. [sin. L. pimpinellifolium (L.) Mill.], S. peruvianum L. [sin. L. peruvianum (L.)

Mill.] e S. chilense (Dunal) Reiche [sin. L. chilense Dunal]) têm sido identificadas

como fontes potenciais de resistência (CHAERANI & VOORRIPS, 2006).

Algumas dessas espécies são utilizadas pelo melhoramento tradicional, mas a

resistência tem se correlacionado negativamente com características

agronômicas e rendimento. Assim, portanto, a obtenção de cultivares

resistentes à pinta preta com melhor comportamento agronômico é ainda

necessária.

Embora mecanismos de defesa passivos ou pré-formados (espessura

da cutícula, presença de tricomas, entre outros) possam prevenir a infecção,

muitas vezes as plantas mostram respostas ativas frente ao ataque de

patógenos, incluindo transcrição de genes e formação de produtos de defesa

com o objetivo de retardar o desenvolvimento do patógeno (PASCHOLATI &

LEITE, 1995; MIESLEROVÁ; LEBEDA; KENNEDY, 2004). O estudo da

histologia das interações patógeno-hospedeiro pode ajudar a identificar

eventos que ocorrem na patogênese e levar, portanto, a um melhor

entendimento dos mecanismos da resistência (DITA et al., 2007).

122

As defesas induzidas incluem a produção de espécies reativas de

oxigênio (EROs), o fortalecimento da parede celular, a síntese de fitoalexinas e

o acúmulo de proteínas relacionadas à defesa. A geração localizada de

peróxido de hidrogênio (H2O2) e radical superóxido (O2.-) detectável

citologicamente é um dos eventos de resposta mais precoces dos tecidos

vegetais (BAKER & ORLANDI, 1995) e está provavelmente envolvida com a

indução da reação de hipersensibilidade (HR) (LEVINE et al., 1994).

Vários sistemas enzimáticos estão envolvidos nas respostas de defesa

da planta frente ao ataque de fitopatógenos. O papel das peroxidases (POX) no

processo de defesa é reforçar a parede celular através da formação de lignina,

suberina, polissacarídeos ferulicolados e glicoproteínas ricas em hidroxiprolina

(FRY, 1986), aumento na produção de EROs que atuam como mediadores na

sinalização e como agentes antimicrobianos (WOJTASZEK, 1997; KAWANO &

MUTO, 2000) e induzindo a produção de fitoalexina (KRISTENSEN; BLOCH;

RASMUSSEN, 1999). A catalase (CAT) desempenha um papel importante no

metabolismo das EROs, protegendo as células dos efeitos tóxicos do H2O2

(LEBEDA et al., 2001). Dentro das proteínas relacionadas à patogênese (ou

proteínas PR), quitinases e β-1,3-glucanases são enzimas hidrolíticas que são

induzidas em várias interações planta-patógeno (VAN LOON, 1997). Elas

podem degradar componentes da parede celular de muitos fungos (MAUCH;

MAUCH-MANI; BOLLER, 1988) e também podem atuar liberando fragmentos

de parede celular, os quais atuam como elicitores da resposta de defesa ativas

do hospedeiro (YOSHIKAWA; YAMAOKA; TAKEUCHI, 1993). As

polifenoloxidases (PFO) são enzimas que oxidam mono e o-difenóis em o-

diquinonas (VAUGHN; LAX; DUKE, 1988) com ação antimicrobiana

(MOHAMMADI & KAZEMI, 2002). Também participam do processo de

lignificação durante a invasão pelo patógeno (LI & STEFFENS, 2002) e na

geração de EROs (RICHARD-FORGET & GAUILLARD, 1997; THIPYAPONG;

HUNT; STEFFENS, 2004).

Estudos histoquímicos (ARAÚJO & MATSUOKA, 2004) e bioquímicos

prévios (FERNÁNDEZ et al., 2006; SOLÓRZANO et al., 1996; SOLÓRZANO et

al., 1999; LAWRENCE et al., 2000) indicaram diferenças na resposta de várias

espécies do gênero Solanum seção Lycopersicon frente à infecção com A.

solani.

123

O objetivo deste trabalho foi esclarecer os mecanismos de defesa de

um genótipo resistente de S. habrochaites e um suscetível de S. lycopersicum

frente a A. solani, através do estudo do desenvolvimento do fungo nos tecidos,

a localização in situ de H2O2 e O2.-, formação de papilas, reação de

hipersensibilidade e atividade de enzimas relacionadas à defesa nos

hospedeiros. Foi realizada uma seleção previa dos hospedeiros através de

avaliação da severidade de pinta preta utilizando um método de inoculação por

gota.

A análise morfológica dos esporos e as características culturais do

isolado de Alternaria utilizado neste trabalho indicam que o patógeno apresenta

algumas das características de A. tomatophila, descritas por Simmons (2000)

em seu artigo “Alternaria themes and variations”. Considerando a controvérsia

entre o trabalho de Simmons e aqueles baseados em análises de AFLP, como

o de Pérez-Martinez, Snowdon e Pons-Kühnemann (2004), e para evitar

problemas de comunicação, o agente causal de pinta preta de tomateiro neste

trabalho foi designado como A. solani.

124


2.1 Experimento 1: Severidade de pinta preta em espécies de Solanum

seção Lycopersicon

Com o objetivo de selecionar um hospedeiro resistente e um suscetível

para o experimento 2 (item 2.2), a severidade de pinta preta foi avaliada em

seis genótipos de tomateiros usando um método de inoculação por gota.

2.1.1 Patógeno e material vegetal

O isolado de A. solani (Ellis e Martin) Sorauer utilizado foi 1707 EH

cedido pelo Centro Nacional de Pesquisa de Hortaliças (CNPH) da Empresa

Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA), Brasília – DF, Brasil. Para a

manutenção, o fungo foi cultivado em meio V8 e incubado a 25ºC e fotoperíodo

de 8 h luz e 16 h de escuro. Para a indução de esporulação, quando a cultura

do fungo crescido no meio V8 atingiu 4/5 da placa, foi realizada raspagem do

micélio aéreo e lavagem do meio por 4 h em água corrente. Em seguida,

deixou-se a placa invertida para secar. Após 24 h, a placa foi fechada com

filme plástico e incubada nas condições já citadas. Para coletar os esporos,

acrescentou-se 10 mL de água destilada (com 0,1% ágar) nas placas contendo

culturas de aproximadamente 10 dias de idade e procedeu-se à raspagem do

micélio e filtragem em gaze, sendo determinado o número de conídios mL-1

com auxílio de câmara de Neubauer ao microscópio de luz.

Foram utilizados seis genótipos de Lycopersicon spp. com diferentes

níveis de resistência a A. solani (Quadro 1). Os acessos de Solanum

lycopersicum var. cerasiforme e S. habrochaites foram cedidos pelo Centro

Nacional de Pesquisa de Hortaliças (CNPH) da Empresa Brasileira de

Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA), Brasília – DF, Brasil.


comercial para produção de mudas de hortaliças. Após 20 dias foram

transplantados para vasos de 0,5 L (duas planta por vaso) contendo o mesmo

125

substrato com fertilizante de liberação gradual (N 14%, P2O5 16%, K2O 18%, S

8%, Mo 0.2%) e mantidos em câmara de crescimento a 20ºC-22ºC, 4000 lx e

12 h de fotoperíodo (lâmpada fluorescente).

Quadro 1. Lista e origem dos genótipos de tomateiro

Genótipo (cultivar, acesso) Origem

Solanum lycopersicum cv. Santa Cruz Kada Comercial

S. lycopersicum cv. Santa Clara Comercial

S. habrochaites (CNPH1 416 – PI 126445) CNPH

S. habrochaites (CNPH 423 – PI 134417) CNPH

S. habrochaites (CNPH 1287 – PI 126445) CNPH

S. lycopersicum var. cerasiforme (CNPH 0081 - Silvestre de Felixlândia)

CNPH

1CNPH - Centro Nacional de Pesquisa de Hortaliças da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA), Brasília – DF, Brasil.

2.1.2 Inoculação e avaliação de severidade

Aos 35 dias após o transplantio, quando as plantas apresentavam de

quatro a seis folhas totalmente desenvolvidas (dependendo da espécie), foi

realizada a inoculação utilizando o método de gota (“droplet inoculation

method”) (CHAERANI et al., 2007). Para isso, uma gota de 10 uL da

suspensão de esporos na concentração de 4,25x104 conídios de A. solani mL-1

foi colocada no espaço internerval dos três folíolos apicais das quatro folhas

expandidas superiores. Adicionou-se ágar à suspensão de esporos para

melhorar a aderência da gota nas folhas. As plantas foram mantidas a 100% de

UR nas primeiras 48 h e, posteriormente, a 60%-75% de UR em câmara de

crescimento a 20ºC-22ºC, intensidade de luz 4000 lx e fotoperíodo de 12 h

(lâmpada fluorescente). O período de luz começou logo após a inoculação. A

avaliação de sintomas foi realizada aos 7 dias pós-inoculação (DPI) através

das medições da largura e comprimento das lesões. Plantas não inoculadas

foram usadas como controle.

126

2.1.3 Estatística e delineamento experimental

O delineamento usado foi inteiramente casualizado, com seis genótipos

e quatro repetições. A unidade experimental constituiu-se de um vaso contendo

duas plantas, nas quais se avaliaram os três folíolos apicais das quatro folhas

expandidas superiores. Foram realizados testes para homogeneidade da

variância (teste de Levene, p=0,05) e para a normalidade dos erros (teste de

Shapiro-Wilk, p=0,05). A transformação raiz quadrada de (x + 1) foi aplicada

nos dados antes da análise estatística para estabilizar as variâncias. Foi

realizada análise de variância e as médias foram comparadas pelo teste de

Scott-Knott (p=0,05).

2. 2 Experimento 2: Respostas de genótipos de tomate suscetíveis e resistentes a Alternaria solani, localização in situ de espécies reativas de oxigênio e atividade de enzimas relacionadas à defesa

2.2.1 Patógeno e material vegetal

O isolado utilizado neste experimento assim como a metodologia usada

na indução da esporulação e a preparação do inóculo foram os mesmos

descritos no experimento 1 (item 2.1.1).

Os genótipos de tomateiro utilizados foram CNPH 1287 (Solanum

habrochaites) e Santa Cruz Kada (S. lycopersicum), resistente e suscetível à

pinta preta, respectivamente (o nível de resistência frente a A. solani foi

avaliado no experimento 1, item 2.1). A semente do cultivar Santa Cruz Kada

foi de origem comercial, enquanto a do genótipo CNPH 1287 foi cedida pelo

CNPH - EMBRAPA.


comercial para produção de mudas. Após 18 dias as plântulas foram

transplantadas para vasos de 0,6 L (uma planta por vaso) contendo o mesmo

substrato com fertilizante de liberação gradual (N 14%, P2O5 16%, K2O 18%, S

8%, Mo 0,2%) e mantidos em câmara de crescimento a 20-25 ºC, 4000 lx e 12

h de fotoperíodo (lâmpada fluorescente).

127

2.2.2 Inoculação e coleta de amostras

Aos 38 dias após o transplantio, quando as plantas de Kada e de

CNPH 1287 apresentavam cinco-sete e sete-nove folhas totalmente

desenvolvidas, respectivamente, foi realizada a inoculação da 2ª, 3ª e 4ª folha

verdadeira. A face superior de cada folha foi inoculada com uma suspensão de

esporos de 1,25 x 103 conídios mL-1 de A. solani, usando pulverizador manual.

Condições de alta umidade do ar foram mantidas com câmara úmida.

Foram coletadas a 2ª, 3ª e 4ª folhas de plantas de tomateiro às 0, 4, 8,

12, 24, 48, 72, 96 e 120 h pós-inoculação (hpi) com O. neolycopersici. Folhas

de plantas de tomateiro não inoculadas também foram coletadas nesses

mesmos tempos. As folhas foram colocadas em caixa de isopor com gelo e

transportadas ao laboratório. As amostras destinadas para análise bioquímica

(3ª e 4ª folhas) foram pesadas, congeladas em N2 líquido e armazenadas em

congelador para análise posterior.

Foram coletadas a 2ª, 3ª e 4ª folhas de cada tratamento, colocadas em

caixa de isopor com gelo, transportadas ao laboratório e pesadas, congeladas

em N2 líquido e armazenadas em freezer para análise posterior.

2.2.3 Análises histoquímicas

2.2.3.1 Localização in situ de peróxido de hidrogênio (H2O2)

A detecção histoquímica de H2O2 foi feita de acordo com Romero-

Puertas et al. (2004), com algumas modificações. Foram cortados três discos


submersos em uma solução de diaminobenzidina (DAB) a 0,1% (p/v) em

tampão MES 10 mM (pH 6,5). O corante DAB foi infiltrado em vácuo até a

infiltração total do tecido foliar. Para verificar a especificidade dos precipitados

marrons característicos da reação de DAB com H2O2, alguns discos foram

infiltrados com ácido ascórbico 10 mM (detoxificador de H2O2). Os discos

infiltrados foram incubados à temperatura ambiente por 1 h na luz e,

posteriormente, descorados por imersão em etanol (92º GL) aquecido a 78ºC e

conservados em glicerol 50% até observação. Os discos foram analisados

128

usando-se microscópio de luz e lactofenol-azul de algodão para visualizar as

estruturas do patógeno. O desenvolvimento do fungo foi caracterizado através

do número da porcentagem de germinação de conídios, número de tubos

germinativos por conídio germinado, formação de apressórios e de lessóes. A

detecção de H2O2 foi realizada determinando-se o número de locais com

presença de precipitado marrom sob o ponto de penetração da hifa e as células

epidérmicas de cor marrom. Essas observações foram realizadas em três

discos por planta.

2.2.3.2 Localização in situ de superóxido (O2.-)

A detecção in situ de O2.- foi realizada segundo a metodologia de

Romero-Puertas et al. (2004), com modificações. Foram cortados três discos


submersos em uma solução de nitrobluetetrazólio (NBT) a 0,1% (p/v) em

tampão fosfato de potássio 10 mM (pH 7,8). Foi realizada a infiltração completa

do corante no tecido foliar. Para verificar a especificidade dos precipitados

azuis de formazan característicos da reação de NBT com O2.-, alguns discos

foram infiltrados com superóxido dismutase (SOD) 50 µg mL-1. Os discos

infiltrados foram incubados, descorados, conservados e analisados

microscopicamente segundo descrito no item 2.2.3.1 A detecção de O2.-

através da redução in situ do NBT foi realizada determinando-se o número de

locais com coloração azul nas células epidérmicas no sítio de penetração do

fungo. Essas observações foram realizadas em três discos por planta.


Foram avaliados os sítios de infecção (locais de penetração do

patógeno) mostrando morte celular nos três discos foliares da 2ª folha de cada

planta em cada intervalo de tempo. Os discos foram descorados e conservados

segundo procedimento descrito no item 2.2.3.1. A autofluorescência das

células epidérmicas foi observada sob luz azul incidente (excitação 460-490

nm) usando um microscópio Zeiss Axioskop. A resposta de hipersensibilidade

(necrose das células penetradas) foi detectada como uma autofluorescência da

129

parede celular ou de toda a célula epidérmica (KOGA et al., 1988). Para a

visualização das estruturas dos fungos, o material foliar foi tratado com

lactefenol-azul de algodão.

2.2.5 Determinação de papilas

Em amostras onde foi constatado acúmulo de H2O2 sob o apressório,

utilizou-se azul-de-O toluidina para verificar a presença de compostos fenólicos

e confirmar formação de papilas. Os compostos fenólicos foram visualizados

por uma cor azul-turquesa em folhas descoloradas e, posteriormente, coradas

por 5 min em uma solução de azul-de-O toluidina ao 0,01 % (p/v) em tampão

fosfato de potássio 0,1 M, ph 6 (O´BRIEN; FEDER; MC CULLY, 1964;

MELLERSH et al., 2002; BORDALLO et al., 2002).

2.2.6 Análises bioquímicas

2.2.6.1 Obtenção dos extratos enzimáticos

A 3ª folha de cada planta (aproximadamente 0,5 g) foi macerada com

N2 líquido e homogeneizada mecanicamente em 4 ml de tampão fosfato de

potássio 50 mM (pH 7,0) contendo 0,1 mM EDTA e 1% (p/p) de PVP (poli-vinil-

pirrolidona), em almofariz. O homogenato foi centrifugado a 15.000 g durante

30 min a 4°C, sendo o sobrenadante obtido considerado como extrato

enzimático, para a determinação do conteúdo protéico e da atividade de

peroxidase, catalase e polifenoloxidase.

Para determinação de atividade de quitinase e β-1,3-glucanase foi

utilizado extrato enzimático obtido a partir da 4ª folha utilizando tampão acetato

de sódio 100 mM (pH 5,2). O procedimento de extração e centrifugação foi o

mesmo utilizado anteriormente.

2.2.6.2 Proteínas totais

O teste de Bradford (1976) foi empregado para a quantificação do

conteúdo total de proteínas nas amostras. A cada 50 µL do sobrenadante foi

130

adicionado, sob agitação, 2,5 mL do reagente de Bradford. Após 5 min foi

efetuada a leitura da absorbância a 595 nm em espectrofotômetro. A

concentração de proteínas, expressa em mg por mL de amostra (mg proteína

mL-1), foi determinada utilizando-se curva padrão de concentrações de

albumina de soro bovino (ASB) de 0 a 0,5 mg mL-1.

2.2.6.3 Atividade de peroxidase de guaiacol (EC 1.11.1.7)

A atividade da peroxidase de guaiacol (GPOX) foi determinada a 30°C,

através de método espectrofotométrico direto, pela medida da conversão do

guaiacol em tetraguaiacol em 470 nm (LUSSO & PASCHOLATI, 1999). A

mistura da reação continha 0,10 mL do extrato enzimático (conforme item

2.2.6.1) e 2,9 mL de solução com 250 µL de guaiacol e 306 µL de peróxido de

hidrogênio em 100 mL de tampão fosfato 0,01M (pH 6,0). A cubeta de

referência continha 3 mL da solução de guaiacol e peróxido de hidrogênio em

tampão fosfato. A atividade da peroxidase foi determinada por um período de 2

min. O diferencial entre a leitura aos 90 s e a leitura aos 30 s foi utilizado para a

determinação da atividade. Os resultados foram expressos em absorbância

min-1 mg-1 de proteína, sendo a determinação de proteínas efetuada como

descrito no item 2.2.6.2.

2.2.6.4 Atividade de catalase (EC 1.11.1.6)

A atividade da catalase (CAT) foi quantificada pelo método de Góth

(1991), modificado por Tomanková et al. (2006), através do complexo estável

formado pelo molibdato de amônio com peróxido de hidrogênio (A405). O extrato

enzimático (0,1 mL) (conforme item 2.2.6.1) foi incubado em 0,5 mL de mistura

de reação contendo 60 mM de peróxido de hidrogênio em tampão fosfato de

potássio 60 mM pH 7,4 a 38ºC por 4 min. A adição de 0,5 mL de 32,4 mM de

molibdato de amônio após 4 min de incubação foi feita para deter o consumo

de peróxido de hidrogênio pela enzima presente no extrato. Foi preparado um

branco para cada amostra através da adição de molibdato de amônio à mistura

de reação, omitindo o período de incubação. O complexo amarelo de molibdato

e peróxido de hidrogênio foi medido a 405 nm. A diferença entre a absorbância

131

do branco e a amostra incubada indicou a quantidade de peróxido de

hidrogênio utilizado pela enzima. A concentração de H2O2, foi determinada

utilizando-se o coeficiente de extinção є = 0,0655 mM-1 cm-1.

2.2.6.5 Atividade de polifenoloxidase (EC 1.10.3.2)

A atividade das polifenoloxidases (PFO) foi determinada usando-se a

metodologia de Duangmal e Apenten (1999). O ensaio consistiu em quantificar

a oxidação do catecol convertido em quinona, reação mediada pela enzima

polifenoloxidase. O substrato foi composto por catecol, na concentração de 20

mM, dissolvido em tampão fosfato de potássio 100 mM (pH 6,8). A reação se

desenvolveu misturando-se 900 µL do substrato e 100 µL do extrato enzimático

(Item 2.2.6.1). A temperatura de reação foi de 30°C e as leituras em

espectrofotômetro, a 420 nm, foram realizadas de forma direta por um período

de 2 min. O diferencial entre a leitura no primeiro minuto e a leitura inicial foi

utilizado para a determinação da atividade. Os resultados foram expressos em

absorbância min-1 mg-1 de proteína.

2.2.6.6 Atividade de quitinase (EC 3.2.1.14)

A atividade da quitinase (QUI) foi avaliada através da liberação de

fragmentos solúveis de “CM-chitin-RBV”, a partir de quitina carboximetilada

marcada com remazol brilhante violeta (“Carboxy Methyl-Chitin-Remazol

Brilliant Violet”, Loewe Biochemica GmbH) (WIRTH & WOLF, 1990;

STANGARLIN; PASCHOLATI; LABATE, 2000). Para isso, foi utilizado 600 µL

do tampão de extração (acetato de sódio 100 mM pH 5,2) misturado com 200

µL de extrato enzimático (item 2.2.6.1) e 200 µL de “CM-chitin-RBV” (2 mg L-1).

Após incubar por 20 min a 40ºC, a reação foi interrompida com 200 µL de HCl

1M, seguido de resfriamente em gelo e centrifugação a 10.000 g por 5 min. A

absorbância do sobrenadante foi determinada a 550 nm. Os resultados foram

expressos em unidades de absorbância min-1 mg-1 proteína, descontando-se os

valores de absorbância do branco (800 µL de tampão de extração + 200 µL de

“CM-chitin-RBV”).

132

2.2.6.7 Atividade de β-1,3- glucanase (EC 3.2.1.6)

Para determinar a atividade da β-1,3-glucanase (GLU), 150 µL do

extrato enzimático (item 2.2.6.1) foram adicionados a 150 µL de laminarina (1,5

mg mL-1) em tampão de extração (acetato de sódio 100 mM pH 5,2). Como

controle, utilizou-se a mesma reação onde a laminarina foi adicionada

imediatamente antes da determinação de açúcares (sem incubação). A reação

foi conduzida a 40ºC durante 60 min, em banho-maria. Após o período de

incubação, os açúcares redutores formados foram quantificados pelo método

de Lever (1972). Para isso, foi retirada uma alíquota de 50 uL dos tubos

incubados e adicionado 1,5 mL de solução de hidrazida do ácido p-

hidroxibenzóico (PAHBAH) 0,5% em NaOH 0,5 M. A mistura foi mantida em

banho-maria fervente por 10 min e resfriada em banho de gelo. A leitura das

absorbâncias foi realizada a 410 nm, em espectrofotômetro descontando-se os

valores de absorbância do branco. A quantidade de açúcares foi determinada

utilizando-se curva-padrão de concentrações de glicose, variando de 0 a 100

µg glicose mL-1.

2.2.7 Estatística e delineamento experimental

A parcela experimental constituiu-se de um vaso contendo uma planta.

O delineamento experimental utilizado foi esquema fatorial considerando-se

dois genótipos (CNPH 1287 e Kada) x presença e ausência do patógeno (A.

solani) x nove horários de coleta (0, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96 e 120 h após a

inoculação) com três repetições.

Foi realizada análise de variância e as médias foram comparadas pelo

teste de Scott-Knott (p=0,05).

133

3. RESULTADOS



As primeiras lesões resultantes da inoculação apareceram aos quatro

dias após a inoculação. No experimento foi usada a concentração de inóculo

de 425 conídios gota-1, superior àquela usada por Chaerani et al. (2007) (40 a

200 conídios gota-1), embora o tamanho das lesões obtidas tenha sido similar

às desse autor.

A média do tamanho das lesões nos genótipos de tomateiro aos 7 DPI

está apresentada no Quadro 2.

Quadro 2. Tamanho das lesões de pinta preta obtidas por inoculação por método de gota em seis genótipos de tomateiro

Genótipos Tamanho de lesão (mm2)1

Solanum habrochaites (CNPH 416 – PI 126445) 0,47 a

S. habrochaites (CNPH 1287 – PI 126445) 5,86 a

S. lycopersicum var. cerasiforme (CNPH 0081 – Silvestre de Felixlândia)

22,03 b

S. lycopersicum cv. Santa Clara 31,28 b

S. habrochaites (CNPH 423 – PI 134417) 38,73 b

S. lycopersicum cv. Santa Cruz Kada 41,13 b

C.V (%) 29,8

Médias na coluna seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott ao nível de 5% de probabilidade. Médias originais. Para análise estatística, os dados foram transformados em raiz (x+1). 1 Largura x comprimento medidos aos 7 DPI. Cada valor é uma média de 4 repetições de 24 folíolos (3 folíolos x 4 folhas x 2 plantas).

Houve diferenças entre genótipos, formando-se dois grupos no teste de

diferenças de médias. O grupo que apresentou menor tamanho de lesão

134

estava formado por CNPH 416 e CNPH 1287. O outro grupo esteve formado

por todos os outros materiais que formaram lesões maiores. O fato de que

CNPH 416 e CNPH 1287 integraram o mesmo grupo é coerente com a origem

comum de ambos os materiais, o acesso PI 126445. O genótipo CNPH 416

resultou de uma seleção feita no Centro Nacional de Produção de Hortaliças da

EMBRAPA a partir do acesso PI 126445 e o CNPH 1287 teve sua origem em

uma seleção do USDA (United States Department of Agriculture) a partir do

mesmo acesso.

3.2 Experimento 2: Respostas de genótipos de tomate suscetíveis e resistentes a Alternaria solani, localização in situ de espécies reativas de oxigênio e atividade de enzimas relacionadas à defesa

3.2.1 Desenvolvimento de A. solani sobre os hospedeiros

O desenvolvimento do fungo foi avaliado em ambos os genótipos em

todos os horários de coleta após inoculação. Na primeira avaliação, às 4 hpi, a

maioria dos conídios havia germinado, sendo a porcentagem de germinação

média de 83,7% e 84,9% para Kada e CNPH 1287, respectivamente. O

máximo de germinação de conídios foi registrado às 12 hpi com 93,3% e 93,2%

nos materiais suscetíveis e resistentes, respectivamente. A emissão de tubos

germinativos ocorreu a partir de células situadas na base, na metade ou na

extremidade dos conídios (Figura 1A). O número de tubos germinativos por

conídio atingiu um máximo de 3,7 e 2,8 em Kada e CNPH 1287,

respectivamente, às 12 hpi. Os tubos germinativos alcançaram tamanhos

variados. A maioria deles cresceu e formou hifas na superfície do hospedeiro e

alguns formaram dilatações tipo apressórios (Figura 1B e 1C). Não foi

observada orientação definida no crescimento dos tubos germinativos em

nenhum dos genótipos de tomateiro. A maioria dos apressórios observados

localizou-se nas extremidades dos tubos germinativos e lateralmente nas hifas

e formaram-se principalmente nas junções das células epidérmicas (Figura 1C)

e raramente no complexo estomatal (Figura 1D). O número de apressórios

formados na cv. Kada foi significativamente maior do que no CNPH 1287 em

todos os horários pós-inoculação (Quadro 3, Figura 2 ).

135

Figura 1. Microfotografias de conídios de A. solani em discos foliares de tomateiro cv “Kada” em diferentes horários pós-inoculação (hpi). Material corado com lactofenol-azul de algodão. A: 4 hpi; conídio com tubos germinativos. B: 48 hpi; conídio com apressórios (setas) nas extremidades dos tubos germinativos C: 48 hpi; apressórios (setas) nas junções das células epidérmicas. D: 48 hpi; apressório (seta) sobre as células do estômato. E: 48 hpi; dois apressórios (seta) sobre a mesma célula epidérmica. F: 96 hpi; local de penetração (seta) e lesão desenvolvida a partir deste. Abreviações: c = conídio; ap = apressório. Barra 50 µm.

A B

C DA

c

c

c

c

E F

136

A partir das 72 hpi foi constatado o aparecimento de lesões em ambos

os genótipos (Figura 1F), embora o número de lesões avaliadas às 96 e às 120

hpi tenham sido significativamente menores no genótipo resistente (Quadro 3).

Quadro 3. Porcentagem de conídios de A. solani apresentando apressórios e lesões em genótipos de tomateiro em diferentes horários pós-inoculação (hpi)

Apressórios (%) Lesões (%) Hpi

Kada CNPH 1287 Kada CNPH 1287

12 29,1 a1 1,3 b 0,0 0,0

24 20,6 a 6,6 b 0,0 0,0

48 28,0 a 5,3 b 0,0 0,0

72 28,6 a 6,8 b 0,0 0,0

96 36,5 a 8,8 b 7,0 a 0,0 b

120 23,2 a 11,8 b 16,6 a 2,2 b 1Em cada horário pós-inoculação, médias na linha seguidas de mesma letra não diferem entre

si pelo teste de Scott-Knott ao nível de 5% de probabilidade.

3.2.2 Localização in situ de peróxido de hidrogênio (H2O2)

A avaliação de sítios de interação fungo-hospedeiro mostrando

acúmulo de H2O2 foi realizada em ambos os genótipos em todos os horários de

coleta após inoculação.

Embora pouco frequente, a adesão do apressório sobre a célula

epidérmica induziu acúmulo de H2O2 nas células epidérmicas, indicada pela

coloração marrom-avermelhada da polimerização da Diaminobenzidina nas

células penetradas pelo fungo. Isso ocorreu tanto no genótipo suscetível como

no resistente a partir das 12 hpi (Figura 3A-D). A partir das 96 hpi, foi detectado

um acúmulo de H2O2 localizado sob o apressório, sobretudo nas plantas do

genótipo suscetível (Figura 3E e 3F).

137


0 12 24 48 72 96

Po

rce

nta

gem

de

co

níd

ios

apre

sen

tan

do a

pre

ssó

rios

(%)

0

10

20

30

40

50

Figura 2. Porcentagem de conídios apresentando apressórios em plantas de tomateiro cv. Kada (2 2●2 2) e CNPH 1287 (X●X) após inoculação com A. solani. Cada ponto representa pelo menos 75 conídios avaliados. Barras indicam desvio-padrão. ** e * indicam diferença estatística a nível de 1% e 5% de probabilidade, respectivamente.

3.2.3 Localização in situ de superóxido (O2.-)

A coloração com nitrobluetetrazólio (NBT) foi realizada para detectar a

geração e o acúmulo de O2.- in situ. A localização histológica da coloração com

NBT foi avaliada microscopicamente nos diferentes horários pós-inoculação. A

partir das 72 hpi foram detectadas, em ambos os genótipos, células

epidérmicas com leve acúmulo de O2.- ao redor das lesões (Figura 4A e 4B).

Menos frequentemente, detectou-se acúmulo de O2.- localizado no local de

adesão do apressório sem indícios de aparecimento de lesão (Figura 4C).

Quando observada a lesão, as células epidérmicas penetradas e as vizinhas

apresentavam cor amarelada no microscópio de luz normal. Os sítios de

infecção que apresentavam células de cor amarelada foram observados sob

luz fluorescente para confirmar morte celular.

** *

** **

**

138

Figura 3. Microfotografias de conídios de A. solani em discos foliares de tomateiro mostrando acúmulo de H2O2 em células epidérmicas após inoculação de plantas de tomateiro cv. Kada e CNPH 1287. Discos foliares foram cortados e infiltrados em solução de diaminobenzidina (DAB) a 0,1% para avaliação microscópica em diferentes horários pós-inoculação (hpi). Material corado com lactofenol-azul de algodão. A: Kada, 12 hpi; acúmulo de H2O2 localizada em complexo estomatal sob apressório. B: idem A em plano focal inferior. C: CNPH 1287 72 hpi; célula epidérmica mostra acúmulo de H2O2. D: idem C em plano focal superior. E e F: Kada 96 hpi; coloração de DAB sob apressório sobre junção de células epidérmicas. Abreviações: c = conídio; ap = apressório. Barra 50 µm.

c

c

c c

ap

ap

E F

D C

BE

A

139

Figura 4. Microfotografias de conídios de A. solani em discos foliares de tomateiro mostrando acúmulo de O2

.- em células atacadas após inoculação de plantas de cv. Kada e CNPH 1287. Discos foliares foram cortados e infiltrados em solução de nitro blue tretrazolium (NBT) a 0,1% para avaliação microscópica em diferentes horários pós-inoculação (hpi). Material corado com lactofenol-azul de algodão. A: Kada 72 hpi; células epidérmicas mortas no local de penetração e célula vizinha mostrando leve acúmulo de O2.- (seta). B: CNPH 1287 96 hpi; células epidérmicas mortas no local de penetração e célula vizinha mostrando leve acúmulo de O2.- (seta). C: Kada 96 hpi; apressório (seta) sobre célula epidérmica apresentando reação de NBT; C1 plano focal superior mostrando conídio, C2 plano focal inferior mostrando apressório na célula epidérmica e C3 plano focal médio mostrando acúmulo de O2.- na célula epidérmica. Barra A-B 10 µm, C 50 µm.


Nas avaliações realizadas a partir das 72 hpi, observou-se cor

amarelada nas células onde ocorreu penetração e autofluorescência quando

observadas no microscópio de luz fluorescente (Figura 5A-D). Isso aconteceu

tanto no genótipo suscetível quanto no resistente. Em estágios mais avançados

da patogênese, detectou-se fluorescência nas células do mesófilo sob áreas

lesionadas (Figura 5E e 5F).

A

C2

B

C1 C3

140

Figura 5. Microfotografias de conídios de A. solani em discos foliares de tomateiro após inoculação de plantas de tomateiro cv. Kada e CNPH 1287. Discos foliares foram cortados para avaliação microscópica de resposta de hipersensibilidade (HR) em diferentes horários pós-inoculação (hpi). Material corado com lactofenol-azul de algodão. A: Kada 96 hpi; local de penetração sob apressório (seta) e reação das células epidérmicas à penetração por A. solani. B: Kada 96 hpi; idem A sob luz fluorescente: células epidérmicas apresentando reação de HR. C: CNPH 1287 96 hpi; local de penetração sob apressório (seta) e reação das células epidérmicas à penetração por A. solani. D: CNPH 1287 96 hpi; idem C sob luz fluorescente: células epidérmicas apresentando reação de HR. E: CNPH 1287 120 hpi; lesão restrita pelos vasos condutores (vc) na região superior e tecido epidérmico normal na região inferior. F: CNPH 1287 120 hpi; idem E sob luz fluorescente. F1:

A B

EC

F1

vc

C D

F2

tecido lesionado e F2: tecido normal sem autofluorescência. Abreviações: vc = vasos condutores. Barra 10 µm.

141

3.2.5 Papilas

Para verificar a ocorrência de papilas, as amostras em que se detectou

acúmulo de H2O2 localizado sob o apressório (item 3.2.2) foram coradas com

azul-de-O toluidina para confirmar a presença de compostos fenólicos. Nas

avaliações realizadas às 96 hpi, observaram-se modificações da parede celular

de tipo papilas nas células epidérmicas do hospedeiro sob apressórios (Figura

6A e 6B). Isso aconteceu com maior frequência no genótipo suscetível, em

aparente conformidade com o maior número de apressórios formados nesse

material.

Figura 6. Microfotografias de tecidos clareados de tomateiro cv. Kada mostrando papila em paredes de células epidérmicas, sob apressório (seta) após 96 h pós-inoculação com conídios de A. solani. A: acúmulo de H2O2

apresentando coloração de DAB (seta) sob apressório sobre junção de células epidérmicas B: mesma interação mostrando compostos fenólicos em papila (seta) corados com azul-de-O toluidina após infiltração de DAB 0,1%. Barra 50 µm.

3.2.6 Análises bioquímicas

3.2.6.1 Atividade de peroxidase de guaiacol

Nos horários 0, 4, 8, 24, 48 e 120 após inoculação, a atividade da

peroxidase foi significativamente maior nas plantas de CNPH 1287 em relação

a Kada (Figura 7).

A B

142


com plantas sadias, somente foram detectadas no genótipo CNPH 1287. A

atividade da enzima às 24, 72 e 120 hpi foi maior nas plantas inoculadas que

em plantas sadias.


0 4 8 12 24 48 72 96 120

Abs

min

-1 m

g-1 p

rote

ína

0

5

10

15

20

25

30

Figura 7. Dinâmica da atividade de peroxidase de guaiacol em plantas inoculadas com A. solani (XX) e plantas sadias (2 2 2) de S. habrochaites CNPH 1287 (■) e S. lycopersicum cv. Kada (●). Barras indicam a média ± desvio padrão.

A atividade da peroxidase em plantas de CNPH 1287 inoculadas foi

maior nas coletas realizadas às 72, 24 e 120 hpi, enquanto que, em plantas

sem inocular, a atividade da enzima foi maior no horário de 48 hpi. Em plantas

inoculadas da cv. Kada, a atividade foi maior às 72, 120, 96, 12 e 48 hpi.

143

3.2.6.2 Atividade de catalase

Somente às 48 hpi, a atividade da catalase foi significativamente maior

nas plantas de CNPH 1287 em relação a Kada (Figura 8). Em plantas

inoculadas de CNPH 1287, somente às 4 e 96 hpi a atividade da enzima foi

maior quando comparada com a atividade da enzima em plantas sadias. Na cv.

Kada, às 8 e 96 hpi as plantas inoculadas mostraram uma atividade da

catalase superior a das plantas sadias, enquanto que às 24 hpi ocorreu o

inverso, plantas sem inocular mostraram maior atividade.


0 4 8 12 24 48 72 96 120

umo

l min

-1 m

g-1 p

rote

ína

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Figura 8. Dinâmica da atividade de catalase em plantas inoculadas com A.

solani (XX) e plantas sadias (2 2 2) de S. habrochaites CNPH 1287 (■) e S. lycopersicum cv. Kada (●). Barras indicam a média ± desvio-padrão.

Foram detectados variações na atividade da catalase em função do

tempo em plantas de CNPH 1287 inoculadas e não inoculadas. Nas plantas

inoculadas,, a atividade foi maior nas coletas realizadas às 24, 96 e 48 hpi,

enquanto que em plantas sem inocular, a atividade da enzima foi maior nos

144

horários das 24, 48 e 0 hpi. Em plantas inoculadas da cv. Kada, a atividade foi

maior às 96 hpi, seguida pela atividade às 72 e 8 hpi, enquanto que, em

plantas sadias, a atividade foi maior às 24 hpi.

3.2.6.3 Atividade de polifenoloxidase

A atividade da polifenoloxidase foi significativamente maior nas plantas

de CNPH 1287 quando comparadas a cv. Kada em todos os horários até as 72

hpi (Figura 9).


0 4 8 12 24 48 72 96 120

Abs

min

-1 m

g-1 p

rote

ína

0

2

4

6

8

10

12

14

Figura 9. Dinâmica da atividade de polifenoloxidase em plantas inoculadas com A. solani (XX) e plantas sadias (2 2 2) de S. habrochaites CNPH 1287 (■) e S. lycopersicum cv. Kada (●). Barras indicam a média ± desvio-padrão.


comparadas com plantas sadias foram detectadas no genótipo CNPH 1287 às

72 e 96 hpi quando a atividade da enzima foi maior nas plantas inoculadas. Na

cv Kada, somente às 120 hpi a atividade da enzima nas plantas inoculadas foi

maior do que nas plantas sadias.

145

Foram detectados variações na atividade da polifenoloxidase em

função do tempo somente em plantas de CNPH 1287. A atividade de

polifenoloxidase em plantas de CNPH 1287 sem inocular foi maior na coleta

realizada às 48, 24 e 0 hpi.

3.2.6.4 Atividade de quitinase

Nos horários das 0, 24 e 72 após inoculação, a atividade da quitinase

foi significativamente maior nas plantas de CNPH 1287 do que em Kada

(Figura 10).


0 4 8 12 24 48 72 96 120

Abs

min

-1 m

g-1

pro

teín

a

0

1

2

3

4

Figura 10. Dinâmica da atividade de quitinase em plantas inoculadas com A.

solani (XX) e plantas sadias (2 2 2) de S. habrochaites CNPH 1287 (■) e S. lycopersicum cv. Kada (●). Barras indicam a média ± desvio-padrão.


com plantas sadias somente foram detectadas no genótipo CNPH 1287 às 96

hpi e sendo maior nas plantas inoculadas do que nas plantas sem inocular.

Foram detectados variações na atividade da quitinase em função do

tempo somente em plantas de CNPH 1287. A atividade da enzima em plantas

146

inoculadas foi maior na coleta realizada às 96 hpi seguida pelas coletas

realizadas às 24 e 72 hpi e em plantas sadias às 24, 72 e 0 hpi.

3.2.6.5 Atividade de β-1,3- glucanase

Nos horários 0, 4, 8, 24, 72 e 96 após inoculação, a atividade da β-1,3-

glucanase foi significativamente maior nas plantas de CNPH 1287 do que em

Kada (Figura 11).


0 4 8 12 24 48 72 96 120

mg

glic

ose

min

-1 m

g-1

pro

teín

a

0

1

2

3

Figura 11. Dinâmica da atividade de β-1,3- glucanase em plantas inoculadas com A. solani (XX) e plantas sadias (2 2 2) de S. habrochaites CNPH 1287 (■) e S. lycopersicum cv. Kada (●). Barras indicam a média ± desvio-padrão.

Diferenças na atividade de β-1,3- glucanase em plantas inoculadas


1287 ás 96 hpi, momento em que a atividade da enzima foi maior nas plantas

inoculadas.

Foram detectadas variações na atividade da glucanase em função do

tempo somente em plantas do genótipo CNPH 1287. A atividade da enzima em

147

plantas inoculadas foi maior nas coletas realizadas 24, 96, 0 e 4 hpi do que nos

outros horários e em plantas sadias às 24 e 0 hpi.

148

4. DISCUSSÃO



O método de inoculação utilizado permitiu diferenciar eficientemente o

nível de resistência à pinta preta de um grupo de genótipos de tomateiro.

Embora a considerável quantidade de tempo requerido para a medição das

lesões, este método é objetivo e útil quando é necessária uma discriminação

detalhada do nível de resistência e quando são requeridos dados quantitativos

precisos em programas de melhoramento.

Chaerani e colaboradores (2007) utilizaram esse método para avaliar

54 acessos de tomateiro (incluindo espécies selvagens) em condições de casa

de vegetação. O método de inoculação por gota utilizando várias

concentrações de esporos foi o que melhor discriminou o nível de resistência

dos acessos quando comparado com o método de inoculação por pulverização.

As lesões geradas aos 7 dpi pela inoculação por gota foram desde pequenas

pintas até grandes manchas com uma distribuição exponencial de tamanhos de

lesões. Além disso, foram observadas correlações positivas significativas entre

os 54 acessos através de três testes diferentes.

Os resultados deste trabalho indicam que o método de inoculação por

gota é de simples aplicação e permite uma avaliação objetiva da severidade da

pinta preta. Esse método já foi utilizado anteriormente para avaliar com

sucesso severidade de pinta preta (CHAERANI et al., 2007) e componentes da

resistência à pinta preta (O´LEARY & SHOEMAKER, 1983) em acessos de

tomateiro.

149

4.2 Experimento 2: Respostas de genótipos de tomate suscetíveis e resistentes a Alternaria solani, localização in situ de espécies reativas de oxigênio e atividade de enzimas relacionadas à defesa

Os conídios de A. solani germinaram igualmente na superfície foliar de

ambos os genótipos. Essa informação é coerente com a obtida por Araújo e

Matsuoka (2004) quando estudaram a histopatologia da interação A. solani- S.

lycopersicon (anteriormente L. esculentum) e A. solani-S. habrochaites

(anteriormente L. hirsutum var. glabratum). Em geral, os esporos de Alternaria

spp. germinam sobre folhas de cultivares resistentes e de plantas não

hospedeiras tão bem como nas plantas hospedeiras (ROTEM, 1994). Conídios

de A. brassicae, A. brassicicola, A. raphani e A. solani germinaram quase na

mesma taxa sobre as folhas de plantas hospedeiras e não hospedeiras, que

incluíam colza (Brassica napus), papoula (Papaver rhoeas), tomate (S.

lycopersicon) e trigo (Triticum aestivum) (McROBERTS & LENNARD, 1996).

A ausência de orientação definida no crescimento dos tubos

germinativos encontrada em ambos os genótipos de tomateiro está de acordo

com o observado por Araújo e Matsuoka (2004) no mesmo patossistema e por

Dita et al. (2007) no patossistema A.solani - batata. Resultados análogos em

outras interações de Alternaria spp. foram observados em A. porri - cebola

(AVELING; SNYMAN; RIJKENBERG, 1994) e A. brassicae, A. brassicicola e A.

raphani - brássicas (McROBERTS & LENNARD, 1996), A. cassiae - Vigna

unguiculata (VAN DER BERG; AVELING; VENTER, 2003) e A. panax –

ginseng americano (QUAYYUM; DOBINSON; TRAQUAIR, 2005).

Apesar da aparente ausência de orientação do crescimento dos tubos

germinativos, a grande maioria dos apressórios formou-se nas junções de

células epidérmicas, o que ocorre comumente em A. solani (ARAÚJO &

MATSUOKA, 2004; DITA et al., 2007) e em outras espécies do gênero

Alternaria (AVELING; SNYMAN; RIJKENBERG, 1994; McROBERTS &

LENNARD, 1996; BOEDO et al., 2008). Como possível causa dessa tendência

geral de os patógenos formarem apressórios nas junções de células tem sido

proposto que os estímulos para a formação de apressórios nessas espécies

sejam características gerais da topografia foliar e das flutuações de nutrientes

no microambiente das junções celulares (ARAÚJO & MATSUOKA, 2004).

150

A porcentagem de conídios apresentando apressórios foi sempre

inferior na superfície foliar de plantas de CNPH 1287 em comparação com cv.

Kada em todas as amostragens a partir das 12 hpi (momento em que foram

inicialmente detectados). Na análise do processo de infecção de A. solani em

tomateiro suscetível cv. Miller (S. lycopersicon) e resistente CNPH 417 (S.

habrochaites [anteriormente L. hirsutum var. glabratum]), a formação de

apressório foi um passo necessário para o sucesso da infecção, existindo uma

relação clara entre baixos níveis de formação de apressório e baixo número de

lesões no genótipo resistente (ARAÚJO & MATSUOKA, 2004). A influência do

genótipo na formação de apressórios parece ser, no entanto, um fato incomum

entre Alternaria spp. Apesar da escassez de estudos sobre o comportamento

dessas espécies em interações com mais de um hospedeiro, McRoberts &

Lennard (1996) estudaram o crescimento de A. brassicae, A. brassicicola e A.

raphani em oito espécies de crucíferas hospedeiras e A. solani, A. alternata, A.

brassicae, A. brassicicola e A. raphani, em colza, tomate, papoula e trigo

(representando hospedeiras e não-hospedeiras) e constataram que, pelas

taxas globais de formação de apressórios, ocorreram diferenças

interespecíficas entre os patógenos, mas apenas pequena variação para

espécies individuais de Alternaria spp. sobre as diferentes plantas, hospedeiras

ou não. Na interação A. solani - batata não foi detectada relação entre a

formação de apressório e a resistência da cultivar ou idade da folha, o que

sugere que a resistência à pinta preta da batata não estava associada com a

inibição da formação de apressórios nos cultivares testados (DITA et al., 2007).

As lesões se desenvolveram a partir de penetrações que ocorreram

após a formação de apressórios. A penetração por Alternaria spp. comumente

ocorre a partir de apressórios, o que comprovaria o caráter essencial dessa

estrutura para a patogênese (AVELING; SNYMAN; RIJKENBERG, 1994;

McROBERTS & LENNARD, 1996; ARAÚJO & MATSUOKA, 2004; DITA et al.,

2007). Em consequência, pode-se inferir que a menor frequência de lesões por

A. solani no genótipo CNPH 1287 foi consequência direta do menor número de

apressórios formados nesse genótipo.

O acúmulo de H2O2 foi detectado mais precocemente (a partir das 12

hpi) do que o acúmulo de O2.- (a partir das 72 hpi), embora em baixa

frequência. Ambas as espécies reativas de oxigênio foram observadas tanto no

151

genótipo suscetível como no resistente. A reação de hipersensibilidade foi

observada nas células epidérmicas onde ocorreu penetração às 72 hpi em

ambos os genótipos. Como, no entanto, penetrações e lesões foram mais

frequentes no genótipo Kada, a frequência de aparecimento de HR em células

epidérmicas desse genótipo foi mais elevada.

Os mecanismos moleculares por trás da ativação de mecanismos de

defesa são muito complexos. Frequentemente, as respostas começam com um

reconhecimento gene a gene do patógeno. A produção de certos fatores de

virulência pelo patógeno leva ao seu reconhecimento pelas plantas que

carregam o gene de resistência (R gene) correspondente (FLOR, 1971). O

reconhecimento resulta na rápida ativação das respostas de defesa e à

consequente limitação do crescimento do patógeno. A resistência mediada pelo

R-gene está usualmente acompanhada de uma rápida produção de EROs. A

produção de EROs é requerida para a ocorrência de outro componente da

resposta, a HR, um tipo de morte celular programada que limita o acesso do

patógeno a nutrientes. A resistência mediada por R-gene está associada

também com a ativação da via de sinalização dependente do ácido salicílico

(AS) que leva à expressão de certas proteínas relacionadas à patogênese (PR)

que contribuem para a resistência. Outras respostas de defesas vegetais estão

controladas por mecanismos dependentes do etileno (ET) e/ou jasmonatos

(JA). As vias de sinalização dependentes do AS, JA e ET interagem

extensivamente (GLAZEBROOK, 2005).

Os patógenos de plantas estão divididos em duas categorias de

acordo com seus estilos de vida: biotróficos e necrotróficos. Os biotróficos se

alimentam de tecido vegetal vivo enquanto os necrotróficos matam as células

do hospedeiro para alimentar-se do tecido morto. No caso dos biotróficos, a

resposta de HR privará a esses patógenos de sua fonte de alimento. No caso

dos necrotróficos, no entanto, a morte celular programada no hospedeiro

simplificaria a vida desses patógenos. A resistência gene a gene é uma forma

importante de resistência contra patógenos biotróficos e está associada com a

ativação de sinalização dependente do AS e resistência sistêmica adquirida. A

resistência gene a gene não deveria, no entanto, ser observada em interações

com patógenos necrotróficos, já que a morte celular do hospedeiro não limita

seu crescimento. Nesses patógenos, as respostas de defesa dependem da

152

sinalização de JA e ET (GLAZEBROOK, 2005). No caso de plantas de

Arabidopsis com a mutação coi1 que apresentavam a sinalização dependente

do JA bloqueada, foram suscetíveis frente a A. brassicicola indicando que a

sinalização dependente do JA era necessária para a resistência (THOMMA et

al., 1998). A produção da fitolalexina camalexina também é requerida, já que

mutantes pad3 (deficientes no gene da biossíntese da camalexina) são

suscetíveis (ZHOU; TOOTLE; GLAZEBROOK, 1999).

O acúmulo de EROs assim como a observação de HR foram

verificados em outros patossistemas envolvendo espécies do gênero Alternaria.

A inoculação com Alternaria brassicicola levou ao desenvolvimento de

pequenas lesões necróticas nas folhas de Arabidopsis thaliana e a grandes

lesões em plantas mutantes pad3-1 (deficientes em camalexina, fitoalexina do

tipo dos indóis). A produção de H2O2 e a HR foram similares em ambos os tipos

de plantas, levando à conclusão de que a diferença estava nas respostas de

defesa após a ocorrência de morte celular (NARUSAKA et al., 2003). As

mudanças nos padrões de expressão de aproximadamente 7000 genes foram

examinadas por meio de análise de microarranjos de cDNA após inoculação

com A. brassicicola. Baseados nos resultados, os autores sugerem que a

mutação do gene pad3-1 alterou não só o acúmulo de camalexina como

também a coordenação da expressão de vários genes relacionados à defesa

na resposta ao desafio com A. brassicicola.

A geração de EROs foi examinada na interação compatível e

incompatível de Alternaria alternata patótipo pêra japonesa e plantas

hospedeiras (SHINOGI et al., 2003). As EROs foram induzidas nas paredes

celulares de apressórios e de pegs de penetração tanto em cultivares

suscetíveis quanto em resistentes, sendo o volume produzido maior na

interação suscetível do que na resistente. A geração de EROs pelas células do

hospedeiro só foi detectada, no entanto, na interação compatível, o que estaria

associado à morte celular facilitando, portanto, a colonização do patógeno.

Sharma e colaboradores (2007) estudaram duas linhagens de Brassica

derivadas de um cruzamento interespecífico entre Brassica napus e B. carinata

a respeito da sua tolerância frente a Alternaria brassicae. Uma das linhagens

mostrou tolerância frente ao patógeno, enquanto a outra se mostrou suscetível.

Usando eletroforese bi-dimensional, os autores analisaram as mudanças

153

produzidas ao nível proteómico que aconteceram em resposta ao patógeno.

Na linhagem tolerante, o nível de 48 proteínas foi afetado significativamente em

vários momentos diferentes (41 aumentaram e 7 diminuíram), enquanto na

linhagem suscetível modificou-se somente o nível de 23 proteínas (4

aumentaram e 19 diminuiram). As proteínas identificadas na linhagem tolerante

incluíram enzimas envolvidas com a geração de EROs e sua detoxificação,

com a transdução de sinais, assim como respostas mediadas pelo fitohormônio

auxina.

Em folhas destacadas de fumo e infiltradas com a toxina AT (Alternaria

alternata patótipo fumo) foi verificado o desenvolvimento de lesões necróticas

além da ocorrência de morte celular, níveis aumentados de H2O2,

malondialdeído e prolina livre e da atividade das proteases totais. Um acúmulo

extensivo de EROs foi detectado com DAB e 2’,7’– diclorofluoresceina

diacetato nas lesões produzidas pela toxina AT. O envolvimento das proteases

tipo caspase e das EROs no processo de morte celular sugere que a morte

celular induzida pela toxina AT é uma forma de morte celular programada

(YAKIMOVA et al., 2009).

Govrin e Levine (2000) examinaram a indução de explosão oxidativa e

de HR em Arabidopsis após inoculação com B. cinerea. O crescimento de B.

cinerea (necrotrófilo) foi suprimido no mutante dnd1 deficiente em HR e

favorecido pela HR causada pela infecção simultânea com uma raça avirulenta

de Pseudomonas syringae. A HR teve efeito oposto – inibitório -- sobre uma

raça virulenta de P. syringae (biotrófico). Além disso, os níveis de H2O2 durante

a HR se correlacionaram positivamente com o crescimento de B. cinerea, mas

de forma negativa com o de P. syringae. Baseados nesses resultados, os

autores concluíram que a HR não protegeu as plantas contra a infecção dos

patógenos necrotróficos B. cinerea e Sclerotium sclerotiorum, mas, sim,

favoreceu a colonização dos tecidos.

Contrariamente, Dita e colaboradores (2007) verificaram que o número

de sítios de infecção apresentando HR era maior em plantas de batateira de

genótipo resistente a A. solani do que no genótipo suscetível após inoculação

com esse patógeno. Também encontraram relação entre o número de sítios de

penetração apresentando HR e idade das folhas, sendo mais frequentes em

lesões das folhas mais novas (da parte superior da planta).

154

Os resultados do presente trabalho não indicam que a geração de

EROs e a HR cumpram um papel importante na resistência frente a A. solani,

no entanto a ocorrência mais frequente de HR no genótipo suscetível, como

consequência da maior quantidade de lesões nesse genótipo, poderia ser um

fator que favoreceu a colonização dos tecidos do hospedeiro. Dessa forma, a

interação A. solani - tomateiro seguiria o modelo geral proposto para patógenos

necrotróficos, onde não parece existir resistência gene a gene caracterizada

por uma rápida produção de EROs e a consequente ocorrência de HR, e sendo

que, possivelmente, ocorrem defesas dependentes da sinalização de JA/ET

(GLAZEBROOK, 2005). Por outro lado, a produção de fitoalexinas, que tem se

revelado importante para a ocorrência de resistência na interação Arabidopsis -

A. brassicicola, não foi avaliada no atual experimento, mas poderia estar

envolvida na resistência na interação S. habrochaites - A. solani.

A observação de modificações de parede celular de tipo papilas em

ambos os genótipos sugere que a formação dessas estruturas não é uma

reação específica à resistência. Resultados similares foram reportados por

Araújo e Matsuoka (2004) na análise histopatológica da interação suscetível A.

solani - S. lycopersicon (cv. Miller) e A. solani – S. habrochaites (CNPH 417).

No trabalho de Mc Roberts e Lennard (1996), as papilas estiveram presentes

em locais onde a penetração foi bem sucedida e, portanto, não foram

consideradas importantes na ocorrência da resistência em plantas hospedeiras

e não hospedeiras frente a várias espécies de Alternaria.

Na maioria dos tempos pós-inoculação, a atividade da peroxidase do

guaiacol foi maior no genótipo resistente (Figura 7). Somente nesse genótipo

houve diferenças significativas de atividade entre plantas inoculadas e plantas

sadias (às 24, 72 e 120 hpi), sendo essa atividade maior nas plantas

inoculadas.

As peroxidases participam de vários processos fisiológicos

relacionados à defesa, como ligação cruzada de proteínas de parede celular,

de pectinas por pontes diferúlicos e a oxidação de álcoois fenólicos durante a

formação de lignina. As isoenzimas de peroxidase estão presentes em

numerosos compartimentos celulares (retículo endoplasmático, aparelho de

Golgi, mitocôndria, citosol, vacúolos) e na parede celular. Na parede celular, as

peroxidases podem estar presentes em forma solúvel, iônica ou

155

covalentemente ligadas. O fortalecimento da parede celular, uma das funções

mais importantes da peroxidase, tem sido atribuído, principalmente, a

peroxidases cuja atividade pode ser detectada pelo uso de siringaldazina como

substrato na mistura de reação dos testes enzimáticos (RANIERI et al., 2001).

As peroxidases também têm um papel multifuncional no metabolismo das

EROs, já atuando como “peroxidase”, reduzindo o nível de EROs ao

metabolizar o H2O2, mas também como “oxidase” gerando H2O2 (HAMMOND-

KOSACK & JONES, 1996).

Trabalhos anteriores estudaram a atividade de peroxidase em

genótipos de tomateiro com diferente nível de resistência frente a A. solani.

Fernández et al. (1996) verificaram um aumento significativo na atividade da

peroxidase nas plantas inoculadas, em comparação com as plantas sadias. A

maior atividade foi detectada aos sete dias pós-inoculação. Quando

comparadas plantas inoculadas de cultivares resistentes, moderadamente

resistentes e suscetíveis, comprovou-se que as cultivares resistentes

apresentaram maior atividade da enzima, mas não se observaram diferenças

entre seus padrões isoenzimáticos. Capote et al. (2006), em um experimento

desenvolvido com calos e folhas de três cultivares de tomateiro que diferiram

no nível de resistência frente a A. solani, estudaram o efeito dos filtrados desse

patógeno sobre a atividade da peroxidase. Maior atividade da enzima foi

detectada em calos da cultivar resistente às 24 h após inoculação.

Esses resultados são coerentes com os aumentos de atividade da

peroxidase do guaiacol que acorreram principalmente no genótipo resistente

(S. habrochaites), após inoculação com A. solani.

As EROs ocorrem normalmente no metabolismo celular, porém,

quando acumuladas, tornam-se tóxicas à célula, principalmente quando se

convertem para espécies ainda mais reativas, como o radical hidroxil (OH-).

Devido à natureza daninha das EROs, as plantas utilizam sistemas enzimáticos

(superóxido dismutase, peroxidase de guaiacol, ascorbato peroxidase e

catalase), assim como sistemas antioxidantes não enzimáticos (glutatione,

ascorbato, tocoferol e compostos fenólicos) para prevenir o dano nos

componentes celulares do hospedeiro (SEDLAROVÁ et al., 2007). A catalase

(CAT) catalisa a reação de dismutação do peróxido de hidrogênio em água e

156

oxigênio, reduzindo, dessa forma, o excesso de EROs durante o estresse

oxidativo.

Neste trabalho, a atividade de CAT (Figura 8) não mostrou

comportamento diferencial entre genótipos nem aumentos destacáveis ao

longo da avaliação. A ausência de mudanças significativas na atividade da

catalase sugere que os mecanismos de detoxificação (“scavenging”) de EROs

propostos para essa enzima não estariam acontecendo nessa interação devido

à ausência de EROs em volume significativo.

A atividade da catalase não sofreu alterações em calos de Brassica

napus e B. juncea em meio de cultura adicionado com filtrados de cultura

fúngica de A. brassicae (DHINGRA & KIRAN NARESH MEHTA SANGWAN,

2004) nem em cultivares resistentes e suscetíves de B. juncea inoculados com

A. brassicae (CHAWLA; GUPTA; SAHARAN, 2001). De forma similar, a

atividade da peroxidase e SOD foi maior e a atividade da catalase levemente

inferior nas plantas de cártamo (Carthamus tinctorius) tolerantes regeneradas

via organogênese e via embriogênese somática a partir de culturas in vitro

tratadas com filtrados de culturas fúngicas de A. carthami, quando comparadas

com as plantas controle (suscetíveis) (VIJAYA KUMAR et al., 2008).

A atividade da polifenoloxidase (PFO) foi significativamente maior em

CNPH 1287 em quase todos os horários avaliados (Figura 9), sendo

detectadas diferenças de atividade entre plantas inoculadas e sadias às 72 e

96 hpi. A atividade de PFO em Kada não sofreu alterações ao longo do tempo

e somente houve diferenças entre plantas inoculadas e sem inocular às 120

hpi.

As PFO são enzimas localizadas nos plastídios, que utilizam o oxigênio

molecular para a oxidação de mono e o-difenóis em o-diquinonas (VAUGHN;

LAX; DUKE, 1988). A atividade da PFO está latente até que a enzima é

liberada dos tilacóides por ferimentos, senescência ou ataque de insetos e

patógenos, iniciando o processo de oxidação dos compostos fenólicos. As

quinonas têm ação antimicrobiana (MOHAMMADI & KAZEMI, 2002) e são

altamente reativas participando de complexas reações não enzimáticas

secundárias. Entre elas, a conversão de quinonas em semiquinonas, as quais

tanto podem ligar-se covalentemente a outras moléculas, quanto realizar a

redução do oxigênio molecular a radical superóxido (THIPYAPONG; HUNT;

157

STEFFENS, 2004) e a reação covalente e ligação cruzada de

clorogenoquinona com proteínas fornecendo barreiras adicionais de fenóis

polimerizados (LI & STEFFENS, 2002). O envolvimento da PFO na resistência

de plantas a fitopatógenos foi comprovada em plantas transgênicas de tomate

com super-expressão de PFO, onde os níveis aumentados de atividade da

enzima determinaram uma forte inibição do crescimento de Pseudomonas

syringae pv. tomato (LI & STEFFENS, 2002).

O envolvimento de PFO nas respostas de defesa foi verificado também

em genótipos resistentes frente a A. solani após inoculação com esse patógeno

(SOLÓRZANO et al., 1996). Os autores detectaram níveis mais altos de

fenilalanina amônia-liase e PFO na variedade resistente (NCEBR-1) em

comparação com as suscetíveis (HC 3880 e Campbell 28).

Quando patógenos fúngicos invadem tecidos vegetais, algumas

proteínas novas aparecem e se acumulam nos tecidos infectados. Essas

proteínas são chamadas proteínas relacionadas à patogênese (proteínas PR)

porque aparecem durante a patogênese. As proteínas PR são definidas como

proteínas codificadas pelo genoma da planta hospedeira e induzidas

especificamente em interações com patógenos (VIDHYASEKARAN, 2002). O

acúmulo de PR proteínas em plantas após infecção por patógenos está bem

documentado (VAN LOON, 1997). Entre elas, hidrolases como as β-1,3

glucanases (GLU) e quitinases (QUI) estão envolvidas na resistência de

plantas contra patógenos fúngicos (JOOSTEN & DE WIT, 1989; KIM &

HWANG, 1994; KINI; VASANTHI; SHETTY, 2000; RIVERA et al., 2002). Essas

enzimas atuam diretamente degradando a parede celular de fungos ou

interrompendo sua deposição, o que contribui para a morte do patógeno

(MAUCH; MAUCH-MANI; BOLLER, 1988) e, indiretamente, liberando

fragmentos de parede celular que atuam como elicitores de repostas de defesa

da planta hospedeira (YOSHIKAWA; YAMAOKA; TAKEUCHI, 1993).

Neste trabalho foi detectada atividade de QUI em ambos os genótipos

(Figura 10), embora o nível fosse quase sempre maior em CNPH 1287. A

atividade de QUI apresentou um aumento importante nas plantas inoculadas do

genótipo resistente às 96 hpi. A atividade de GLU (Figura 11) também foi

superior no genótipo resistente do que no suscetível em quase todos os

tempos pós-inoculação. De forma similar ao acontecido com a atividade da

158

QUI, a atividade de GLU em plantas inoculadas comparadas com plantas

sadias foi significativamente maior somente no genótipo CNPH 1287 às 96 hpi.

No cultivar Kada não houve aumento significativo de atividade. A presença de

QUI e GLU em plantas não inoculadas pode ser atribuída à expressão

constitutiva dessas enzimas em ambos os genótipos.

A atividade antifúngica de QUI pode ser sinergisticamente melhorada

pelas GLU tanto in vitro (MAUCH; MAUCH-MANI; BOLLER, 1988) como in vivo

(VAN LOON, 1997). Em plantas de tomateiro, Joosten e De Wit (1989)

registraram um rápido acúmulo de GLU e QUI em fluídos apoplásticos de

interações tomateiro - Cladosporium fulvum incompatíveis. Eles sugerem que,

devido ao acúmulo apoplástica dessas enzimas hidrolíticas, elas podem

proteger as plantas contra patógenos fúngicos extracelulares. As extremidades

das hifas, β-1,3 glucanos e quitina estão expostas na superfície e poderiam ser

atacadas diretamente por GLU e QUI. Em tomateiro, Lawrence, Joosten e

Tuzun (1996) verificaram níveis mais altos de QUI e GLU tanto na expressão

constitutiva quanto na induzida pelo patógeno em linhagens resistentes a A.

solani do que em genótipos suscetíveis. Solórzano et al. (1999) estudaram os

padrões isoenzimáticos de QUI em folhas de duas variedades de tomateiro, NC

EBR-1 (resistente) e HC 3880 (suscetível) após inoculação com A. solani. Eles

observaram duas isoformas ácidas presentes nas duas variedades, mas uma

delas era induzida precocemente na variedade resistente (24 hpi), enquanto,

na cultivar suscetível, era somente induzida às 72 hpi.

Nossos resultados também indicam que os níveis de enzimas

hidrolíticas pré-inoculação e os aumentos de atividade registrados após-

inoculação foram maiores no genótipo resistente. Os níveis constitutivos de

QUI e GLU foram uma vez e meia e três vezes mais altos em CNPH 1287 do

que em Kada. Lawrence et al. (2000) encontraram níveis constitutivos de QUI e

GLU cinco vezes e duas vezes mais altos, respectivamente, em genótipos de

tomate resistentes a Alternaria solani.

Formas apoplásticas (extracelulares) e vacuolares (intracelulares) são

reportadas nas GLU assim como em outras proteínas PR. As PRs induzíveis

são principalmente proteínas acídicas que são secretadas ao espaço

intercelular da folha. As PRs básicas ocorrem em níveis relativamente baixos

no vacúolo e são induzidas na infecção (VAN KAN et al., 1992). A liberação

159

das GLU e QUI intracelulares durante a morte celular das células penetradas

contribuiria a deter ou matar o fungo invasor (RIVERA et al., 2002). A maior

quantidade de enzimas hidrolíticas constitutivas no genótipo resistente e o

aumento de atividade detectado em plantas inoculadas desse genótipo às 96

hpi determinariam menor desenvolvimento de A. solani nos tecidos.

Os resultados confirmam a participação de POX, enzimas hidrolíticas

(QUI, GLU) e do metabolismo dos fenóis (PFO) nas respostas de defesa

envolvidas nessa interação patógeno - hospedeiro. O desenvolvimento

diferencial do patógeno nos tecidos dos hospedeiros, fundamentalmente na

frequência de formação de apressórios, e a expressão de enzimas

relacionadas à defesa sugerem grandes diferenças no comportamento dos

genótipos frente ao patógeno. Os resultados de formação de apressórios, de

lesões, de papilas, de reação de hipersensibilidade e de atividade de enzimas

relacionadas à defesa são coerentes com resultados de experimentos já

publicados, enquanto os resultados de localização in situ de H2O2 e O2.- são

novos neste patossistema.

160

5. CONCLUSÕES

- A resistência do genótipo CNPH 1287 (Solanum habrochaites) frente

a Alternaria solani não esteve associada com a geração de espécies reativas

de oxigênio (EROs) nem com resposta de hipersensibilidade (HR).

- O aumento pós-inoculação da atividade de peroxidase de guaiacol e

polifenolxidase e os maiores níveis constitutivos e aumentos pós-inoculação da

atividade das enzimas hidrolíticas quitinase e glucanase indicam maior

envolvimento dessas enzimas em repostas de defesa nesse genótipo.

- A ausência de resposta na atividade da catalase (enzima envolvida na

detoxificação das EROs é coerente com o escasso acúmulo de EROs nos

tecidos foliares.

161

CONSIDERAÇÕES FINAIS

As plantas desenvolveram a habilidade de reconhecer e de responder

às moléculas elicitoras dos patógenos ativando rapidamente respostas de

defesa. Antes do advento da genética molecular, esse fenômeno foi observado

como uma interação entre patógenos carregando genes dominantes (genes de

avirulência) que determinavam o reconhecimento das plantas hospedeiras que

carregavam genes dominantes de resistência (R genes), o que levou à

nomenclatura chamada de gene a gene. Os patógenos que são reconhecidos

nessa forma e que, portanto, falham na tentativa de causar doença, são

chamados de patógenos avirulentos e o hospedeiro é chamado resistente e a

interação é chamada incompatível. Na ausência de um reconhecimento gene a

gene, devido à ausência do gene de avirulência no patógeno e/ou do gene de

resistência no hospedeiro, o patógeno é virulento, o hospedeiro é suscetível e a

interação é compatível. Parte das rápidas mudanças de expressão dos genes

que ocorrem nas respostas gene a gene também ocorrem nas interações

suscetíveis, mas com menor cinética e amplitude reduzida. Resistência e

suscetibilidade não seriam alternativas binárias, já que há um continuum de

interações possíveis, que vão da resistência completa à suscetibilidade

extrema.

Há duas respostas de defesa que são consideradas distintivas da

resistência gene a gene. Uma delas é a rápida produção de espécies reativas

de oxigênio (EROs), chamada de explosão oxidativa. Esse aumento das EROs

pode ter um efeito antimicrobiano direto, assim como servir como sinal para a

ativação de outras respostas de defesa. A outra é uma forma de morte celular

programada conhecida como resposta de hipersensibilidade (HR). A HR agiria

contra patógenos biotróficos restringindo o acesso do patógeno a água e a

nutrientes. A resistência mediada por R-gene está associada também com a

ativação da via de sinalização dependente do ácido salicílico (AS) que leva à

expressão de certas proteínas relacionadas à patogênese (PR) que contribuem

para a resistência. A resistência gene a gene é uma forma importante de

resistência contra patógenos biotróficos, mas não deveria ser observada em

162

interações com patógenos necrotróficos, já que a morte celular do hospedeiro

não limita seu crescimento. Nesses patógenos, as respostas de defesa

dependem da sinalização dependente do ácido jasmônico (AJ) e do etileno

(ET) (GLAZEBROOK, 2005).

De acordo com esse modelo, a resistência do tipo gene a gene é uma

forma de resistência frente a patógenos biotróficos e está associada com a

ativação da sinalização dependente do ácido salicílico. Resultados a partir de

estudos com mutantes de Arabidopsis thaliana com defeitos em várias

respostas de defesa contra Peronospora parasitica, Erysiphe spp. e

Pseudomonas syringae apoiam a ideia de que a sinalização dependente do AS

é importante para a resistência em patógenos biotróficos. Por outro lado, os

resultados com esses mesmos mutantes de Arabidopsis na interação com

Alternaria brassicicola indicaram a ausência de resistência gene a gene. A

resistência frente a esse patógeno necrotrófico dependeu da sinalização

dependente do AJ e a produção de camalexina (fitoalexina) e a resistência

mediada por genes de resistência, a sinalização pelo AS e pelo ET não

cumpriram papéis importantes (GLAZEBROOK, 2005).

O presente trabalho mostra resultados da interação resistente e

suscetível de plantas de tomateiro frente a um patógeno biotrófico e um

necrotrófico. No caso da interação com o patógeno biotrófico O. neolycopersici,

foi observada resistência do tipo gene a gene com manifestação de HR e

explosão oxidativa. Já na interação com o patógeno necrotrófico A. solani, a

magnitude da HR e acúmulo de EROs observados não indicam que cumpram

um papel de importância na resistência frente a esse patógeno. Esses

resultados são coerentes com o modelo proposto por Glazebrook (2005),

embora o papel das fitoalexinas na interação com o patógeno necrotrófico não

tenha sido investigada.

163

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