Marina Medeiros de Araújo Silva - portal.insa.gov.br in vitro... · protocolos de micropropagação de ... produção de plantas ... Suas principais ações e tipos são descritos

Marina Medeiros de Araújo SilvaLais Tomaz Ferreira

Campina Grande (PB) 2016

Presidente da RepúblicaMichel Miguel Elias Temer Lulia

Ministério da Ciência, Tecnologia, Inovações e Comunicações

Ministro de EstadoGilberto Kassab

Secretário ExecutivoElton Santa Fé Zacarias

Instituto Nacional do Semiárido (INSA)

DiretorSalomão de Sousa Medeiros

Projeto GráficoWedscley Melo

Fotos Marina Medeiros de Araújo Silva

Lais Tomaz Ferreira

O cultivo in vitro é uma ferramenta biotecnológica em que

células, tecidos, órgãos e/ou plantas inteiras são cultivadas de

forma asséptica em um meio nutritivo, sob condições controladas

de densidade de fluxo de fótons, fotoperíodo e temperatura. Suas

técnicas já são bastante difundidas e aplicadas para diferentes

espécies de plantas, inclusive com finalidade comercial.

O Laboratório de Cultivo in vitro de Plantas do Instituto Nacional do

Semiárido (LaCIP/INSA) vem desenvolvendo estudos com espécies

nativas e adaptadas ao bioma Caatinga, especialmente cactáceas.

O projeto “Coleções científicas no MCTI: Consolidação, Expansão

e Integração”, que envolve Instituições vinculadas ao Ministério

da Ciência, Tecnologia e Inovação, prevê o desenvolvimento de

protocolos de micropropagação de cactáceas, bem como a realização

de cursos de capacitação para difusão de conhecimentos acerca das

técnicas biotecnológicas e da importância da conservação dessas

espécies.

Esta publicação contém informações básicas e práticas acerca

do cultivo in vitro de plantas, com ênfase em espécies de cactáceas

com relevância para o Semiárido e foi elaborada especificamente

para a realização do curso “Cultivo in vitro de plantas: aplicações

em cactáceas”, oferecido pela Instituição.

Marina Medeiros

APRESENTAÇÃO

Cultivo in vitro de plantas e suas principais aplicações 6

Condições de cultivo in vitro 7

- Laboratório 7

- Meio de cultura 9

- Condições de incubação e microambiente in vitro 11

Técnicas de cultivo in vitro aplicadas em cactáceas 13

- Germinação 14

- Multiplicação 15

- Conservação 18

Atividades práticas 20

- Preparo de meio de cultura 20

- Desinfestação de material vegetal 20

- Manipulação de material em câmara de fluxo 23

- Aclimatização de plantas 23

Referências 25

Glossário 29

Anexo 30

SUMÁRIO

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CULTIVO IN VITRO DE PLANTAS E SUAS PRINCIPAIS APLICAÇÕES

O cultivo in vitro envolve um conjunto de técnicas, mediante as quais células, tecidos, órgãos e plantas inteiras são cultivados de forma asséptica em um meio nutritivo, sob condições controladas de densidade de fluxo de fótons, fotoperíodo e temperatura (CARVALHO et al., 2011). Por possibilitar uma versatilidade de aplicações na biotecnologia vegetal, o cultivo in vitro apresenta grande potencialidade e tem se constituído em um instrumento valioso para o desenvolvimento da agricultura, especialmente quando associado às áreas de fisiologia, melhoramento genético, fitossanidade e fitotecnia (SOUZA et al., 2006).

Entre as suas principais técnicas, podemos citar a micropropagação, que apresenta maior aplicabilidade; a limpeza clonal, utilizada para produção de plantas livres de patógenos; o cultivo de protoplastos, anteras e embriões zigóticos; a conservação de germoplasma (GEORGE et al., 2008); e os estudos básicos de desenvolvimento vegetal e de seleção ou avaliação da tolerância de plantas aos estresses abióticos (RAI et al., 2011). Além disso, suas técnicas oferecem suporte aos trabalhos de transformação genética (ULISSES et al., 2010).

Desde a década de 1970, a micropropagação vem sendo utilizada com finalidade comercial para a produção de mudas certificadas de diferentes espécies (orquídeas, banana, abacaxi, cana-de-açúcar, eucalipto, entre outras). As chamadas biofábricas de plantas são laboratórios que produzem mudas maciçamente através das técnicas de cultivo in vitro e que apresentam processos de produção bem definidos (GERALD; LEE, 2011). Tal aplicação deve-se às diversas vantagens, tais como: possibilidade de multiplicação em larga escala e em curto espaço de tempo de plantas que se propagam lentamente pelas técnicas convencionais; utilização de espaço físico reduzido; obtenção de plantas livres de pragas e doenças; independência quase completa das condições ambientais externas; elevada precisão no estabelecimento de cronogramas de produção e comercialização; elevada qualidade do produto no que diz respeito à homogeneidade e vigor das plantas obtidas, além de outras (RIBEIRO et al., 2011).

O cultivo in vitro teve origem a partir dos trabalhos de Haberlandt, em 1902, e se baseia no princípio da totipotência, que indica que qualquer célula vegetal tem o potencial para regenerar uma nova planta completa.

Os biorreatores são equipamentos utilizados para o cultivo in vitro em larga escala, oferecendo vantagens, como: o aumento do número de plantas em cultivo, maior crescimento e uniformidade das mudas, além de permitir a redução significativa da mão-de-obra e, consequentemente, dos custos de produção quando comparado ao cultivo convencional em frascos.

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CONDIÇÕES DE CULTIVO IN VITRO

O procedimento básico para o cultivo in vitro consiste em isolar um pequeno fragmento da planta, chamado de explante, e proporcionar-lhe um meio de cultura adequado e condições ambientais controladas (temperatura, umidade e luminosidade) para que suas células possam expressar seu potencial morfogênico. Todo o procedimento deve ocorrer em laboratório específico, utilizando um sistema totalmente asséptico, ou seja, livre de microrganismos contaminantes como fungos e bactérias.

LABORATÓRIO

As atividades desenvolvidas num laboratório de cultivo in vitro envolvem a limpeza e esterilização de vidrarias, outros utensílios e do próprio ambiente de trabalho; o preparo de soluções e de meio de cultura; a desinfestação do material vegetal e sua introdução às condições assépticas, bem como a incubação dos cultivos em ambiente com condições controladas.

O ideal é que o espaço físico do laboratório seja dividido em áreas isoladas, de forma a separar a execução de algumas atividades, criando, assim, um fluxo de trabalho e reduzindo a ocorrência de contaminações. Equipamentos e outros materiais também devem ser organizados de acordo com a atividade a que estão relacionados e de maneira que fiquem facilmente acessíveis a quem for utilizá-los.

Basicamente, um laboratório de cultivo in vitro de plantas deverá ser composto por:

• SALA DE LIMPEZA

Área destinada à lavagem e esterilização de vidrarias e outros materiais, além do descarte adequado de meio de cultura, material vegetal, vidraria e outros resíduos. Nesta sala também poderá ser feita a assepsia inicial do material a ser introduzido ao cultivo in vitro. Deve conter bancadas, armários, pias com cubas fundas, destilador e deionizador de água, barriletes, autoclave, estufa de secagem e lixeiras.

• SALA DE PREPARO DE MEIO DE CULTURA

Área destinada ao preparo de soluções estoque (nutrientes, reguladores de crescimento, etc) e dos meios de cultura. Deve conter bancadas, refrigerador, barrilete, balança, agitador magnético, medidor de pH, forno de micro-ondas, estante para reagentes e armários para vidraria (becker, erlenmeyer, balão volumétrico, pipeta, proveta – com diferentes volumes; vidro de relógio, espátula inox, bastão de vidro, funil, pisseta, pipetador e micropipetador, placas de Petri, tubos de ensaio e frascos para cultivo).

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• SALA DE INOCULAÇÃO OU TRANSFERÊNCIA

Local onde há a manipulação asséptica do material vegetal, portanto, a circulação de pessoas deve ser restrita. Nesta área devem ser instaladas as câmaras de fluxo laminar, onde a manipulação é feita utilizando pinças, bisturis e/ou outros instrumentos estéreis. Deve conter ainda cadeiras, estantes e/ou carrinhos para transporte, microscópio estereoscópio (lupa), lamparina ou bico de Bunsen, álcool (70 e 96 %), algodão e papel esterilizado.

Manipulação de material vegetal em câmara de fluxo laminar - Sala de inoculação

• SALA DE CRESCIMENTO OU INCUBAÇÃO

Local onde os cultivos in vitro são mantidos sob condições controladas de temperatura, umidade, intensidade luminosa e fotoperíodo. A sala deve conter estantes com prateleiras iluminadas por lâmpadas fluorescentes ou LEDs, ligadas a um sistema de controle de fotoperíodo (timer), além de condicionadores de ar e, caso necessário, um desumidificador. Câmaras climatizadas com fotoperíodo também podem ser utilizadas para a manutenção dos cultivos in vitro.

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Incubação dos cultivos in vitro - Sala de crescimento

Uma área externa ao laboratório, com casa de vegetação e/ou telado, também é necessária para realizar a aclimatação das plantas quando estas saem do cultivo in vitro. Este espaço deverá conter bancadas para acondicionamento das bandejas, tubetes ou outros recipientes, pia, sistema de microaspersão e controle da temperatura e umidade relativa do ar.

Dependendo do espaço disponível, da finalidade a que se destina (ensino, pesquisa ou produção de mudas em larga escala) e do número de pessoas que vão trabalhar, o laboratório pode conter instalações mais simples ou incluir outras dependências (área de recebimento e preparo de material vegetal, sala fria para armazenamento de meios de cultura, almoxarifado, escritório ou sala de pessoal, etc). O número, tipo e tamanho de determinados equipamentos e outros materiais também pode variar.

MEIO DE CULTURA

O meio de cultura fornece os nutrientes necessários para o crescimento e desenvolvimento dos tecidos vegetais cultivados in vitro. De forma geral, apresenta em sua composição: água destilada e/ou deionizada, nutrientes minerais (macro e micronutrientes) e vitaminas, além de uma fonte de carbono externa (comumente a sacarose, 2 – 5 %), uma vez que a fotossíntese é ineficiente em plantas cultivadas in vitro. Outros componentes, tais como aminoácidos, carvão ativado, antioxidantes e misturas

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complexas (água de coco, polpa de banana, etc) também podem ser adicionados ao meio a fim de otimizar determinada resposta, bem como fungicidas e antibióticos para o controle da contaminação.

Existem diversas formulações de meio de cultura, uma vez que as exigências nutricionais variam entre as diferentes espécies. Contudo, o meio MS (Anexo I), formulado por Murashige e Skoog em 1962, é o mais conhecido e utilizado em trabalhos de cultivo in vitro. Isso se deve ao fato deles terem trabalhado com o tabaco, uma espécie que apresenta alta demanda nutricional, e terem sido extremamente criteriosos na seleção das diferentes fontes de nutrientes, o que acabou permitindo a aplicação do meio MS para o cultivo de diferentes espécies.

A indução do crescimento e de diferentes padrões de desenvolvimento na maioria das culturas mantidas in vitro é dada pela presença de hormônios ou reguladores de crescimento nos meios de cultura. A adição desses componentes tem o objetivo principal de suprir possíveis deficiências dos teores endógenos de hormônios nos explantes que se encontram isolados das regiões produtoras na planta-matriz (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998). Dentre as classes mais utilizadas estão as auxinas, citocininas e giberelinas. Suas principais ações e tipos são descritos na Tabela 1.

Tabela 1. Reguladores de crescimento utilizados no cultivo in vitro de plantas e seus principais efeitos

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A escolha do(s) regulador(es) a ser(em) utilizado(s) no cultivo in vitro dependerá: da via morfogênica desejada; de seu nível endógeno no explante no momento da excisão; da capacidade do tecido sintetizar o regulador durante o período da cultura e da possível interação entre os fitormônios endógenos e aqueles adicionados ao meio (SANTOS, 2003). Em muitas espécies, a regulação da rediferenciação e posterior regeneração de plantas é controlada por interações quantitativas entre os reguladores, especialmente auxinas e citocininas, comprovando que pequenas variações provocam respostas distintas para as diferentes espécies, variedades e até tecidos de uma mesma planta.

Em função do tipo de cultura e da espécie estudada, os meios podem ser solidificados pela adição de agentes gelificantes, sendo o ágar o mais utilizado, com concentração variando entre 0,5 % e 0,8 %; enquanto as gomas de gelan (Gelrite® e Phytagel®) são utilizadas em concentrações mais baixas, em torno de 0,15 % a 0,25 % (CID; TEIXEIRA, 2010). Cultivos mantidos em meio líquido podem ser estáticos ou ficar sob agitação para assegurar a aeração dos explantes.

Após o preparo do meio de cultura, sua esterilização é feita em autoclave a 121 °C, 1 atm, durante 15 a 20 minutos. Substâncias termolábeis, ou seja, aquelas que são degradadas pela alta temperatura, a exemplo de alguns reguladores de crescimento e antibióticos, precisam ser filtradas em membranas de 0,45 ou 0,2 µm e, então, adicionadas ao meio autoclavado. Os meios de cultura também podem ser esterilizados quimicamente, através da utilização do hipoclorito de sódio (0,002 – 0,005 %) ou de cálcio (0,01 %). Além de reduzir o tempo para a esterilização do meio e evitar a degradação de determinados componentes, a esterilização química também reduz os custos de manutenção e consumo pelo uso da autoclave e se mostra eficiente para diferentes espécies de plantas (RIBEIRO; TEIXEIRA, 2008; RIBEIRO et al., 2011).

CONDIÇÕES DE INCUBAÇÃO E MICROAMBIENTE IN VITRO

O ambiente de cultivo também exerce influência sobre o crescimento, desenvolvimento e a resposta morfogênica do material cultivado in vitro, especialmente a temperatura e a luminosidade. A sala de crescimento, onde os cultivos são mantidos, apresenta temperatura entre 25 e 30 °C, regulada pela utilização de condicionadores de ar; fotoperíodo (ciclos de claro/escuro) de 12h/12h ou 16h/8h e intensidade luminosa entre 20 e 60 µmol m2 s-1, provida, comumente, por lâmpadas fluorescentes brancas. No entanto, mais recentemente, muitos laboratórios têm substituído tais fontes de luz por lâmpadas de LED (diodos emissores de luz), as quais permitem, dentre outras vantagens, o controle do espectro de luz emitido, a redução no consumo de energia e maior durabilidade (GUPTA; JATOTHU, 2013).

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Durante o cultivo in vitro, as plantas são mantidas em recipientes fechados que limitam o espaço e as trocas gasosas, onde há uma alta umidade relativa do ar (UR > 95%), baixa intensidade luminosa (20 - 60 µmol m-2 s-1), baixa concentração de CO2 e acúmulo de etileno. Além disso, o meio de cultura apresenta elevada concentração de carboidratos; sendo assim, as plantas neste sistema exibem metabolismo heterotrófico ou mixotrófico (KOZAI, 2010). Tais características do microambiente in vitro são bem diferentes daquelas encontradas no ambiente ex vitro, e favorecem a ocorrência de alterações morfológicas, anatômicas e fisiológicas que podem comprometer o sistema de produção de mudas. Dentre as modificações encontradas nas folhas, destacam-se a presença de grandes espaços intercelulares, estômatos pouco funcionais e mudanças na estrutura da cutícula, com redução na deposição de ceras cuticulares, que consequentemente, tornam as plantas suscetíveis a grandes perdas de água por transpiração (HAZARIKA, 2006), resultando na rápida desidratação dos tecidos e baixo percentual de sobrevivência durante a fase de aclimatização (transferência para o ambiente ex vitro).

A fim de reduzir tais modificações, estudos têm sido desenvolvidos com o uso de sistema fotoautotrófico, permitindo o enriquecimento de CO2 no ambiente in vitro. Resultados como redução do tempo da fase de multiplicação, aumento da sobrevivência durante a aclimatização e, consequentemente, diminuição dos custos de produção têm sido descritos para diferentes espécies (XIAO; KOZAI, 2004).

Diferença na distribuição da energia espectral de lâmpadas fluorescentes (FL) e LEDs brancos - RGB (LB)

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TÉCNICAS DE CULTIVO IN VITRO E SUAS APLICAÇÕES EM CACTÁCEAS

As cactáceas apresentam extrema importância para a sustentabilidade do bioma Caatinga, servindo como fonte de forragem e alimento, especialmente nas épocas de seca prolongada, além de possuírem características de interesse medicinal e ornamental (COELHO et al., 2015). Contudo, em decorrência da exploração e degradação de habitats, queimadas e coleta extrativista, suas espécies têm sido drasticamente afetadas, e algumas estão incluídas nas listas de espécies ameaçadas de extinção (ZAPPI et al., 2011). Deste modo, devido ao potencial de uso destas espécies, ações relacionadas à sua propagação e conservação são extremamente necessárias.

O cultivo in vitro é uma ferramenta biotecnológica que vem sendo aplicada para a germinação, multiplicação e conservação de diferentes espécies de cactáceas nativas e adaptadas ao Semiárido brasileiro (Tabela 2). Para as distintas técnicas aplicadas são testadas diferentes formulações de meio de cultura, tipos e concentrações de reguladores de crescimento, tipos de explantes, formas de assepsia do material vegetal, condições de incubação, entre outros.

Tabela 2. Técnicas de cultivo in vitro aplicadas em diferentes espécies de cactáceas.

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GERMINAÇÃO

A germinação in vitro de sementes de cactáceas é importante do ponto de vista biológico, pois permite que a diversidade genética das populações seja mantida. Ademais, proporciona altas taxas de germinação, frequentemente entre 70 - 100 %, dependendo da espécie (BALCH et al., 2015). Cabe ressaltar ainda que a reprodução das plântulas in vitro, embora apresente custo mais elevado, permite um desenvolvimento mais rápido quando comparado com aquelas obtidas por germinação em viveiros ou sistemas naturais (CORREIA et al., 2011).

Inicialmente, é realizado o processo de desinfestação do material a ser introduzido ao cultivo in vitro, a fim de eliminar as contaminações superficiais. Para tanto, as sementes são lavadas em água corrente com detergente neutro, submersas em álcool 70% e colocadas sob agitação em solução de hipoclorito de sódio (NaOCl) ou de cálcio (CaOCl2), em concentrações que variam, geralmente, entre 0,5 e 2,5 %. Posteriormente, já em ambiente asséptico, é realizado o tríplice enxágue com água estéril, para que as sementes possam ser inoculadas no meio de cultura. Trabalhos realizados com diferentes espécies demostram a diversidade da concentração e do tempo de exposição ao desinfestante utilizado para a assepsia das sementes (Tabela 2). A desinfestação também pode ser realizada nos frutos, desde que os mesmos não estejam abertos ou danificados.

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O tipo e os componentes do meio de cultura também devem ser ajustados. O meio mais utilizado é o MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962), no entanto, Correia et al. (2011) obtiveram taxa de germinação de 92,6 % para Cereus jamacaru e 95,5 % para Pilosocereus chrysostele utilizando o meio JADS (ANEXO I), que apresenta concentração de íons totais menor que o MS (CORREIA et al., 2011). Resende et al. (2009) observaram que a concentração de sais reduzida para ¼ do meio MS promoveu maior desenvolvimento da parte aérea de Melocactus glaucescens. Para a concentração de sacarose, as respostas também são bem diversificadas; Castro et al. (2011) observaram que altas concentrações de sacarose (acima de 2,5 %) reduziram a taxa de germinação e o desenvolvimento de plântulas de Nopalea cochenillifera. Resende et al. (2009) verificaram que o uso de 1,5 % ou 3 % de sacarose não interferiu na germinação de sementes de M. glaucescens, enquanto Guimarães et al. (2016) obtiveram maior percentual de germinação de M. zehntneri em meio ½ MS adicionado de 1,5 % de sacarose. Isso demostra o quanto as respostas associadas aos componentes do meio de cultura são genótipo dependentes.

Após o desenvolvimento das plântulas, estas poderão ser aclimatizadas, mantidas em meio de crescimento lento com finalidade de conservação ou utilizadas como material inicial para a micropropagação. Cladódios mais desenvolvidos podem favorecer a sobrevivência da planta caso esta venha a ser levada ao ambiente ex vitro (casa de vegetação), bem como possibilitar a extração de um maior número de explantes, caso a plântula seja utilizada como matriz para a fase de multiplicação in vitro.

MULTIPLICAÇÃO

Muitas espécies de cactáceas apresentam baixas taxas de germinação de sementes e crescimento lento, portanto, a micropropagação é uma ferramenta imprescindível por permitir a produção de um grande número de plantas idênticas (clones), sadias e uniformes, em reduzido espaço físico e temporal, e independentemente da época do ano, além de demandar pouco material inicial, o que reduz o impacto sobre as populações nativas.

A micropropagação envolve diferentes etapas que vão desde a escolha da planta matriz (doadora de explantes), passando pela introdução do material vegetal às condições in vitro, sua multiplicação e enraizamento, até chegar ao final do processo, quando as mudas obtidas in vitro são transferidas para um substrato e mantidas em casa de vegetação (ambiente ex vitro), na etapa chamada de aclimatização (GEORGE et al., 2008; SOUZA et al., 2015a). Para cada uma das etapas mencionadas, podem ser utilizados diferentes meios de cultura, tipos e concentrações de reguladores de crescimento, condições de cultivo, entre outros.

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A micropropagação de cactáceas vem sendo estudada há mais de 50 anos, seja por indução da embriogênese somática, de brotações adventícias ou pela ativação de gemas axilares (LEMA-RUMIŃSKA; KULUS, 2014). Esta última técnica, também chamada de ativação de aréolas, é a mais aplicada para a multiplicação de cactos.

Multiplicação in vitro de Arrojadoa rhodantha por ativação de gemas axilares. Barra: 5 mm

Para iniciar um cultivo, dependendo da espécie, pode ser utilizado material vegetal proveniente do campo, de matrizeiro ou da germinação in vitro, tendo este último a vantagem de apresentar menor risco de contaminação. No caso de material proveniente do campo ou matrizeiro, como ocorre para a palma forrageira, devem ser coletados cladódios jovens (< 10 cm), que passarão por processo de desinfestação a ser realizado anteriormente à excisão das aréolas (gemas) que serão introduzidas in vitro. Posteriormente ao período de incubação em sala de crescimento, haverá a formação de uma brotação que servirá como explante secundário para a fase de multiplicação.

Na multiplicação, de modo geral, é preciso haver a quebra da dominância apical da plântula ou brotação, a fim de favorecer o desenvolvimento das gemas axilares e, consequentemente, a formação de novas brotações. Podem ainda ser feitos cortes longitudinais ou transversais, dependendo do tamanho do explante. Nesta etapa, a interação e o balanço entre reguladores de crescimento adicionados ao meio de cultura, principalmente auxinas e citocininas, são responsáveis pelo crescimento e morfogênese in vitro (SOUZA et al., 2012). O uso da citocinina, combinada ou não com baixos níveis de auxinas, é indispensável na fase de multiplicação, uma vez que este regulador é responsável pela quebra da dominância apical e pela indução da proliferação das gemas axilares.

Para algumas espécies é preciso ter ainda uma etapa de alongamento das brotações, anteriormente ao enraizamento. A adição de GA3 ao meio de cultura promove o aumento do comprimento das brotações, devido ao estímulo da divisão e do alongamento celular.

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Procedimentos básicos para a multiplicação in vitro de cactáceas

Brotação obtida após a introdução (semente/aréola)

Quebra da dominância apical e fragmentação do cladódio

Indução da multiplicação por ativação de aréolas

Formação de novas brotações -↑[citocinina] e ↓[auxina]

Enraizamento das brotações - ↑[auxina]

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CONSERVAÇÃO

O cultivo in vitro também pode ser aplicado para a conservação ex situ das cactáceas, através dos bancos de germoplasma in vitro. Para tanto, são utilizadas estratégias para reduzir a atividade metabólica da planta, sendo utilizados métodos de crescimento mínimo, por meio da redução da temperatura (10 - 20 °C) e da intensidade luminosa na sala de crescimento, redução da concentração de sais e componentes orgânicos no meio de cultura e adição de agentes osmóticos e retardantes do crescimento. Assim, é possível manter as culturas incubadas por volta de 06 a 24 meses, sem a necessidade de realizar subcultivos, garantindo a conservação a curto e médio prazo (PASQUAL et al., 2014; ZAPPI et al., 2011).

Souza et al. (2015b), estudando diferentes concentrações de sacarose para a conservação in vitro de M. azureus, espécie endêmica da Bahia ameaçada de extinção, verificou que as plantas podem ser mantidas por até 240 dias em meio MS suplementado com 90 g L-1 de sacarose. A conservação in vitro, além de garantir a redução do espaço para a manutenção das espécies, reduz os custos de manutenção, possibilita altas taxas de multiplicação independente das condições climáticas e fica livre das intempéries e riscos que existem no campo. Ademais, permite obter culturas livres de patógenos, facilitando a disponibilidade de material para intercâmbio de germoplasma (ZAPPI et al., 2011).

Já para a indução do enraizamento são adicionadas auxinas ao meio de cultura, onde as brotações permanecem durante 15 a 30 dias. Em contrapartida, em outras espécies, e dependendo dos níveis de citocininas utilizados, a formação de raízes adventícias nos brotos já se inicia na etapa de multiplicação. Tal fato pode ser vantajoso no sentido de reduzir o tempo total de obtenção das mudas e possibilitar a redução dos custos de produção.

Por fim, as brotações são separadas, têm suas raízes lavadas em água corrente para a retirada do meio de cultura, são transferidas para recipientes (vasos, tubetes, bandejas ou sacos plásticos) contendo substrato e levadas à casa de vegetação. A aclimatização é uma etapa crítica, pois envolve a passagem da planta que está sendo cultivada in vitro para o ambiente ex vitro, ou seja, é necessário haver uma adaptação climática ao novo ambiente. Nesta etapa são testados tipos de substrato, uso de sombreamento, frequência de rega, entre outros. A maioria das cactáceas apresenta elevadas taxas de sobrevivência, chegando até a 100%, quando comparada a outras espécies. De acordo com Malda et al. (1999), a suculência do caule dos cactos representa um atributo positivo que minimiza o estresse ocasionado na planta durante a aclimatização.

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O cultivo in vitro também pode servir para a germinação de sementes que foram conservadas por meio da técnica de criopreservação, a qual permite manter o germoplasma por tempo mais prolongado, sob temperatura de -196 °C. Bárbara et al. (2015) mantiveram sementes de P. pachycladus criopreservadas por até 360 dias sem comprometer sua qualidade fisiológica, apresentando germinabilidade de até 36 % e desenvolvimento de plântulas normais em meio ½ MS suplementado com 15 g L-1 de sacarose, demonstrando que a criopreservação de sementes pode ser um eficiente método que, quando associado às técnicas de cultivo in vitro, possibilita a conservação e multiplicação de espécies nativas.

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ATIVIDADES PRÁTICAS

PREPARO DE MEIO MS

O meio de cultura básico ou meio basal é constituído por misturas de sais minerais, vitaminas, sacarose e mio-inositol; estes componentes fornecem todos os nutrientes necessários para os explantes. Para o preparo de 1 L de meio MS são utilizados*:

- Ligar os equipamentos que serão utilizados: balança, agitador magnético e pHmetro;- Pesar a sacarose, o inositol e o ágar;- Colocar 500 mL de água destilada e deionizada em um becker e adicionar os

componentes listados, com exceção do ágar;- Utilizando uma proveta, completar o volume para 1 L;- Ajustar o pH do meio de cultura para 5,8. - Acrescentar o ágar e aquecer o meio no forno de micro-ondas para dissolver o ágar

(aproximadamente 10 minutos);- Distribuir o meio em recipientes específicos e tampá-los;- Esterilizar o meio em autoclave a 121 °C, durante 20 minutos.- Retirar os recipientes da autoclave e deixá-los solidificar em superfície plana.

DESINFESTAÇÃO DE MATERIAL VEGETAL

Antes de introduzir uma cultura in vitro é necessário fazer uma limpeza superficial dos explantes a serem utilizados, livrando-os de microrganismos. O tipo e a concentração da solução desinfestante, bem como o tempo de exposição a esta, variam de acordo com o explante utilizado. A desinfestação deve ser rápida e eficiente, a fim de poupar o tecido vegetal dos possíveis efeitos tóxicos causados pelas substâncias.

Em relação à vidraria, estas devem ser esterilizadas por calor úmido (autoclave). Pinças, bisturis e demais utensílios metálicos usados para a manipulação dos explantes devem ser flambados em lamparina com álcool ou bico de Bunsen, em câmara de fluxo laminar.

*Os valores podem variar de acordo com a concentração das soluções estoque preparadas em cada laboratório.

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Desinfestação de sementes de mandacaru: sementes após lavagem em água corrente (A), imersão em álcool 70 % (B) e em hipoclorito de sódio (C), tríplice enxágue (D) e sementes prontas para serem inoculadas (E).

• PROCEDIMENTOS PARA ASSEPSIA DE SEMENTES DE MANDACARU

- Coletar os frutos, extrair e lavar as sementes em água corrente e detergente neutro;

- Imergir as sementes em álcool 70 % por um minuto e, posteriormente em solução de hipoclorito de sódio comercial (2,5 %) adicionado de 1 gota de Tween 20, mantendo sob agitação por 15 minutos;

- Em câmara de fluxo laminar, realizar o tríplice enxágue com água destilada estéril e inocular as sementes no meio de cultura.

Desinfestação de sementes de mandacaru: sementes após lavagem em água corrente (A), imersão em álcool 70% (B) e em hipoclorito de sódio (C), tríplice enxágue (D) e sementes prontas para serem inoculadas (E).

A B C

D E

Desinfestação da palma forrageira: Lavagem do cladódio em água corrente (A), imersão em álcool 70% (B) e NaOCl 2,5% (C), enxágue em água estéril (D) e fragmentação do cladódio (E).

A B C

D E

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• PROCEDIMENTOS PARA ASSEPSIA DE CLADÓDIOS DE PALMA

- Coletar cladódios jovens e lavá-los em água corrente com detergente neutro;- Imergir o cladódio em álcool 70 % por um minuto e, posteriormente em solução

de hipoclorito de sódio comercial (2,5 %) adicionado de 1 gota de Tween 20, mantendo-o sob agitação por 15 minutos;

- Em câmara de fluxo laminar, realizar o tríplice enxágue com água destilada estéril, fracionar o cladódio em segmentos de 1 cm2 que contenham ao menos uma aréola e inoculá-los no meio de cultura.

Desinfestação da palma forrageira: lavagem do cladódio em água corrente (A), imersão em álcool 70 % (B) e NaOCl 2,5 % (C), enxágue em água estéril (D) e fragmentação do cladódio (E).

Desinfestação de sementes de mandacaru: sementes após lavagem em água corrente (A), imersão em álcool 70% (B) e em hipoclorito de sódio (C), tríplice enxágue (D) e sementes prontas para serem inoculadas (E).

A B C

D E

Desinfestação da palma forrageira: Lavagem do cladódio em água corrente (A), imersão em álcool 70% (B) e NaOCl 2,5% (C), enxágue em água estéril (D) e fragmentação do cladódio (E).

A B C

D E

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MANIPULAÇÃO DE MATERIAL EM CÂMARA DE FLUXO

Todos os procedimentos com material asséptico devem ser realizados em câmara de fluxo laminar, na sala de inoculação. O piso deste ambiente e da sala de crescimento deve ser limpo apenas com água, hipoclorito de sódio e desinfetante, a fim de evitar a suspensão de partículas de poeira.

Antes de iniciar a manipulação:- Ligar e limpar a câmara de fluxo laminar com álcool 70 %;- Organizar os utensílios a serem utilizados na câmara de fluxo: lamparina a álcool,

tubo de ensaio e suporte, placas de Petri, algodão ou papel estéril, pinças e suporte para bisturi, lâmina de bisturi, pisseta com álcool 70 % e filme plástico;

- Ligar a lâmpada germicida (UV) por 15 a 20 minutos; não permanecer na sala enquanto a UV estiver ligada;

- Desligar a lâmpada UV e ligar a lâmpada de iluminação da câmara; - Antes de iniciar a manipulação, retirar anéis, pulseiras e relógio; lavar bem as

mãos com água e sabão, colocar jaleco e máscara;- Utilizar álcool 70 % nas mãos, sempre que julgar necessário;- Desembalar o material estéril dentro da câmara de fluxo, acender a lamparina e

encher o tubo de ensaio com álcool 96 %; organizar os utensílios dentro do fluxo de modo que não atrapalhe a manipulação;

- Flambar pinças e bisturis antes de iniciar a manipulação e sempre que julgar necessário; esperar os instrumentos esfriarem para poder utilizá-los;

- Manipular o material com cuidado; não retirar objetos ou material vegetal da câmara e depois retornar, pois há possibilidade de contaminação.

- Antes de abrir um recipiente de cultivo, certificar-se de que não há contaminação no mesmo.

ACLIMATIZAÇÃO DE PLANTAS

A aclimatização refere-se ao processo de adaptação gradual das plantas quando transferidas das condições in vitro para as condições ex vitro, devendo ser realizado com bastante atenção, uma vez que pode tornar-se um obstáculo ao êxito no processo de micropropagação. São sugeridas as seguintes recomendações:

- Retirar as plantas dos frascos e lavá-las em água corrente para a retirada do excesso de meio de cultura, tomando-se o cuidado de não causar danos às raízes;

- Escolher o substrato adequado, bem como o tipo de recipiente (bandeja de isopor ou polipropileno, tubete, saco plástico ou copos descartáveis);

- Encher o recipiente com substrato e molhá-lo até umedecer completamente;

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- Fazer orifícios no substrato e colocar as plantas, fazendo uma leve pressão para fixá-las;

- Levar os recipientes com as plantas para ambiente protegido. Dependendo das condições ambientais, pode ser utilizada malha para 50 % de redução da luz (tela sombrite 50 %), durante os primeiros 20 - 30 dias;

- As regas devem ser feitas de acordo com a umidade do substrato, geralmente 1 a 2 vezes por semana, tomando-se o cuidado para não encharcar e colocar a água apenas no substrato e não sobre a planta;

- Após atingirem o tamanho ideal, as plantas podem ser transferidas para pleno sol;- O ideal é que a aclimatização seja realizada no fim da tarde, a fim de evitar a perda

excessiva de água por transpiração.

Aclimatização de coroa-de-frade

Aclimatização de palma forrageira

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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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GLOSSÁRIOAclimatização/Aclimatação - processo de adaptação gradual das plantas quando transferidas da condição in vitro para a ex vitro.Biotecnologia - utilização de processos biológicos, incluindo a manipulação de micro-organismos, plantas e animais, para a obtenção de processos e produtos de interesse.Calo - proliferação desorganizada de células a partir de segmentos de tecidos vegetais, irregularmente diferenciadas.Clones - organismos geneticamente idênticos, produzidos por propagação assexuada. Desdiferenciação - processo no qual uma célula diferenciada reassume características de célula meristemática (indiferenciada).Dominância apical - inibição hormonal das gemas laterais (axilares) pelas gemas apicais.Embriogênese somática - formação de embriões a partir de tecidos somáticos cultivados in vitro.Explante - segmento de tecido ou órgão retirado da planta matriz e utilizado para iniciar o cultivo in vitro.Germoplasma - conjunto da variabilidade genética de uma espécie. Hiperidricidade - distúrbio fisiológico em que plantas ou brotos cultivados in vitro apresentam-se intumescidos e com aspecto translúcido/aquoso. É geralmente desencadeada pelas condições de cultivo, especialmente pela exposição a altas concentrações de reguladores de crescimento.Morfogênese - formação de novos órgãos/formas em um organismo.Organogênese - formação de parte aérea ou raízes a partir de um explante ou calo.Oxidação - liberação de compostos fenólicos que causam escurecimento dos tecidos, geralmente ocasionada por injúrias.Propagação in vitro (micropropagação) - (in vitro, do latim = “em vidro”), técnica para propagar plantas dentro de recipientes específicos, como frascos, tubos de ensaio ou similares.Propágulo - estrutura utilizada para propagação vegetativa de uma planta.Repicagem - transferência de material cultivado in vitro para um novo meio de cultura, sem subdividi-lo.Subcultivo - subdivisão de material já estabelecido in vitro e sua transferência para novo meio e subsequente incubação, em condições controladas. Variação somaclonal - variação espontânea de plantas regeneradas de cultura de células ou tecidos in vitro.

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Marina Medeiros de Araújo Silva - portal.insa.gov.br in vitro... · protocolos de micropropagação de ... produção de plantas ... Suas principais ações e tipos são descritos