Mecanismos de reparo de quebras duplas de DNA em células ...livros01.livrosgratis.com.br/cp149170.pdf · 1. Estabelecimento do Modelo de Estudo 42 2. Comparação das freqüências

Daniela Salles Cesar de Oliveira

Mecanismos de reparo de quebras

duplas de DNA em células BCR-ABL

positivas

TESE DE DOUTORADO SUBMETIDA À UNIVERSIDADE

FEDERAL DO RIO DE JANEIRO VISANDO A OBTENÇÃO DO

GRAU DE DOUTOR EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS (BIOFÍSICA)

Universidade Federal do Rio de Janeiro

Centro de Ciências da Saúde

Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho

Rio de Janeiro

2010

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i


Mecanismos de reparo de DNA em células BCR-ABL positivas

Tese de doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Biofísica), Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências biológicas (Biofísica). Orientador: Dra. Eliana Abdelhay

Rio de janeiro 2010

ii


Mecanismos de reparo de DNA em células BCR-ABL positivas

Rio de Janeiro, 30 de agosto de 2010 ________________________ Dra. Eliana Abdelhay, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho – UFRJ; Instituto Nacional de Câncer ________________________ Dra. Jenifer Saffi, Departamento de Ciências Básicas da Saúde/ Bioquímica - UFCSPA ________________________ Dr. Marcelo de Pádula, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho – UFRJ;

Faculdade de Farmácia – UFRJ

_______________________ Dra. Eleonora Kurtenbach, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho – UFRJ

________________________ SUPLENTE INTERNO: Dr. Álvaro Augusto Costa Leitão, Instituto de Biofísica

Carlos Chagas Filho – UFRJ

________________________ SUPLENTE EXTERNO: Dr. Luis Felipe Ribeiro Pinto, Coordenação de

Pesquisa, Instituto Nacional de Câncer

________________________ REVISOR: Dr Turan Peter Urmenyi, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho –

UFRJ

iii

Salles Cesar de Oliveira, Daniela Mecanismos de reparo de DNA em células BCR-ABL positivas / Daniela

Salles Cesar de Oliveira - - Rio de Janeiro: UFRJ / Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, 2010

144 f.

Orientador: Eliana Abdelhay

Tese de doutorado – Universidade Federal do Rio de Janeiro,

Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Ciências Biológicas –

Biofísica – Programa de Biologia Molecular e Estrutural, 2010

AGRADECIMENTOS _______________________________________________________________

iv

Primeiramente eu gostaria de agradecer a minha família. Aqueles que me

puseram no mundo e sempre me amaram incondicionalmente. Minha mãe e

meu pai. E incluindo meus pai e mãe postiços, vulgo Tio Zé e Tia Maria Alice.

Minha irmãzinha Peck, que mesmo estando “cheia de coisa pra estudar” e

“tenho 7 provas na semana que vem”, sempre encontrava um minutinho e

escutar minhas lamúrias. É minha irmãzinha mais nova, porem não consigo

viver sem seus sábios conselhos.

À minha orientadora de longa data, Eliana Abdelhay. Sempre estendendo a

mão nos momentos mais críticos e sempre encontrando as soluções para

meus “problemas insolucionáveis”. Obrigada por tudo.

À Dra. Lisa Wiesmüller. Vielen Dank für nimm mich auf Ihre wunderbare

Deutsche Familie. Vielen Dank für die einmalige Gelegenheit, ihr habt mir zu.

Ich verliebte mich in ein Land und eine Kultur bedingungslos. Ewige

Dankbarkeit ist so wenig. Ich werde dich nie vergessen. nicht nur als die Chef,

sondern als eine Freundin. Und auch die leckeren roten Früchtenpie!

Ao meu amigo de fé, meu irmão gêmeo siamês camarada, Andre. Breetchy,

para os mais íntimos, poderia realmente ser classificado no quesito família.

Escutou também muitas lamurias (e vice-versa), mas também rimos, cantamos,

contamos piadinhas infames, e fizemos muitos brainstormings regados a

Antártica Original.

Ao meu tamagochi, meu bichinho virtual, Stephany. Quando essa menina achar o verdadeiro significado do mantra: “I see pride! I see power! I see a bad-**s mother who don't take no c**p off of nobody!”; ela vai dominar o mundo.

Ao seres mais estilosos do universo: Tati e Jana

Azamiga de laboratório (ordem alfabética): Amanda (tem meu voto para

presidente), Barbarela (o espinho de porco do lab), Carol (que não ajudou em

nada, mas também não atrapalhou), Gabi (e sua risadinha irônica), Júlia, Lú (e

ao belo menino de belas sobrancelhas!), Naninha (vulgo Elisângela), Nara,

Priscilla, Renata (Qq c tá fazendo?) e minha querida Poison Yve.

Azamiga aus Deutschland: Carol Ming Chiao, Cris Ireno, Kris Bode und Meta

Volcic,

Azamiga do coração: Érika, Laura Lúcia, Lipan, Marinho, Rachel, Ritinha,

Roberta, Rodolpho, Tets et al., Thiaguinho...

Ao Prof. Jose Morgado e ao Júlio, pela ajuda aos 49 minutos do segundo

tempo!

AGRADECIMENTOS _______________________________________________________________

v

Ao Prof. Marcelo Santiago, pela ajuda com a imunofluorescencia.

À Ophelia Baesso, simplesmente por ter sido a melhor avó do mundo e ter me

deixado morrendo de saudades...

Meine zwei Lieben... meine zwei Jungs, Andi und Erick ... meine Liebe zu sie ist

größer als ich.

vi

RESUMO:

A expressão da oncoproteína BCR-ABL em Leucemia Mielóide Crônica (LMC)

promove a transformação neoplásica de células progenitoras hematopoiéticas

através da modulação de diversas vias de sinalização. A LMC é uma doença

multi-fásica que evolui de uma fase inicial crônica e para uma crise blástica.

Essa progressão tem sido associada ao surgimento de novas anomalias

citogenéticas e mutações. Os mecanismos pelos quais BCR-ABL promove esta

instabilidade genômica ainda não são conhecidos. Através da análise

comparativa de diferentes mecanismos de reparo de quebras duplas de DNA

entre linhagens megacariocíticas humanas isogênicas BCR-ABL positivas e

negativas, MBA e Mo7e, e na linhagem LMC K562, foi constatado que BCR-

ABL promove um aumento da ativação das vias mutagênicas de reparo de

quebras duplas – anelamento de fita simples e recombinação por união não

homologa. Interessantemente, a análise da expressão de fatores determinantes

para a promoção das vias de reparo de quebras duplas, revelou um aumento

dos níveis de expressão da nuclease CtIP em células BCR-ABL positivas,

particularmente em resposta ao tratamento com irradiação. Ainda, o tratamento

com o inibidor da atividade tirosina quinase de BCR-ABL, o Mesilato de

Imatinib, reverteu o acúmulo de CtIP. Quando silenciada a expressão de CtIP

em células com BCR-ABL funcional, o enriquecimento da via SSA por BCR-

ABL foi completamente abolida. Além disso, provemos mais evidências que

BCR-ABL estimularia a ressecção de extremidades de DNA quebradas, função

mediada por CtIP. Assim, os resultados sugerem que BCR-ABL promove

reparo mutagênico de quebras duplas de DNA, tendo como mediador a

nuclease CtIP. Além disso, através da análise comparativa dos mapas

proteômicos bidimensionais de extratos de cromatina das linhagens isogênicas

BCR-ABL positivas e negativas pudemos identificar novos alvos putativos de

modulação por BCR-ABL, envolvidos nas vias de manutenção da estabilidade

genômica.

vii

ABSTRACT:

Expression of BCR-ABL oncoprotein in Chronic Myeloid Leukemia (CML)

promotes neoplastic transformation of hematopoietic stem cells through

modulation of diverse pathways. CML is a multistep disease which evolves as a

chronic phase and progresses to blast crisis. This progression has been

associated with the appearance and accumulation of new cytogenetic

anomalies and mutations. The mechanisms underlying the genomic instability

promoted by BCR-ABL remain obscure. Through comparative analysis of

different DNA double-strand break (DSB) repair mechanisms as a function of

the BCR-ABL status in human megakaryocytic and CML cell lines, we found

that BCR-ABL upregulates error-prone DSB repair pathways (SSA and NHEJ)

rather than the high-fidelity mechanism of HR. Intriguingly, expression analysis

of DSB repair pathway choice determining factors revealed increased levels of

the nuclease CtIP in BCR-ABL positive cells, particularly in response to

irradiation. Moreover, treatment with the BCR-ABL kinase inhibitor, Imatinib

Mesylate, abolished CtIP accumulation. When we silenced CtIP expression in

cells with functional BCR-ABL, SSA enhancement by BCR-ABL was completely

abrogated. Importantly, we also provide evidence that BCR-ABL stimulates

DSB end resection, which is mediated by CtIP. Briefly, BCR-ABL promotes

mutagenic DSB repair with the DSB end processing nuclease CtIP acting as the

key mediator downstream of BCR-ABL. Moreover, the comparative analysis of

the bidimensional maps of chromatin extracts of BCR-ABL positive and

negative cell lines provided the identification of new putative BCR-ABL targets,

including proteins involved in the maintenance of the genomic stability.

viii

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS:

ACN – Acetonitrila

cDNA – DNA complementar

CO2 – Dióxido de Carbono

Cy3 – Cyanine 3

Da – Dalton

DABCO – 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane

DTT – Dithiothreitol

DAPI – 4',6-diamidino-2-phenylindole

DNA – Deoxyribonucleic acid – Ácido desoxirribonucléico

DSB – Double Strand Break – Quebra dupla de DNA

EDTA – Ethylenediamine tetraacetic acid

EGFP – Enhanced green fluorescent protein

EGTA – Ethylene glycol tetraacetic acid

FITC – Fluorescein

g – Grama

GEF – Guanine nucleotide Exchange factor - Fator de intercâmbio de guanina

GM-CSF – Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor

Gy – Gray

HDR – Homology Directed Repair – Reparo direcionado por homologia

HEPES – 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid

ICL – Interstrand Cross Link – Intercalantes intra-fitas

IPG – Immobilized pH gradients – Gradientes de pH imobilizados

IPI – International Protein Index

IM – Imatinib Mesylate – Mesilato de Imatinib

Kb – quiilobase

KCl – Cloreto de Potássio

KDa – quilodalton

IL-3 – Interleucina 3

LLA – Leucemia Linfoblástica Aguda

LMC – Leucemia Mielóide Crônica

M – Molar

ix

MALDI-TOF-TOF – Matrix-assisted laser desorption/ionization – Time of Flight

– Time of Flight

MgCl2 – Cloreto de magnésio

mL – Mili Litro

mM – Mili Molar

MMEJ – Microhomology-mediated end joining – união de extremidades

mediada por micro-homologias

MMC – Mitomicina C

mRNA – Ácido ribonucléico mensageiro

NaCl – Cloreto de Sódio

NER – Nucleotide excision repair – Reparo por excisão de nucleotídeo

NES – Nuclear Export Signal – Sinal de Exportação Nuclear

NLS – Nuclear Localization Signal – Sinal de Localização Nuclear

ng – Nano grama

NHEJ - Non-homologous end joining – união não homóloga de extremidades

NP-40 – Octylphenoxypolyethoxyethanol

PBS – Phosphate buffered saline – Tampão fosfato-salino

PBS-T – Tampão fosfato-salino com Tween

Ph – Philadelphia

pH – Potencial hidrogeniônico

PI – Ponto Isoelétrico

PM – Peso Molecular

QRT-PCR – Real-Time Quantitative Reverse Transcription - Polymerase chain

reaction

RH – Recombinação Homóloga

RI – Radiação Ionizante

RPM – Rotações por minuto

ROS – Reactive Oxygen Species – Espécies Reativas de Oxigênio

RT-PCR – Reverse transcriptase - Polymerase chain reaction

SDS – Sodium dodecyl sulfate

SDS-PAGE – Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

Ser-139 – Serina 139

shRNA – Small hairpin RNA

SSA – Single Strand Annealing – Anelamento de fita simples

x

ssDNA – Single strand DNA – DNA fita simples

TFA - Ácido Trifluoroacetico

Tris-HCl – Tris(hidroximetil) aminometano – ácido clorídrico

Tween – Polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate

U – Unidade

UV – Ultra-violeta

V – Volt

ZVAD-fmk – Benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp (OMe) fluoromethylketone

µg – Micro Grama

µL – Micro Litro

µM – Micro Molar

xi

ÍNDICE Página

I.INTRODUÇÃO

1

1.Biologia Molecular da Leucemia Mielóide Crônica 3

1.1 O cromossomo Philadelphia e os genes envolvidos 3

1.2 BCR-ABL e as principais vias de sinalização envolvidas 5

2. Mecanismos de Reparo de DNA 8

2.1 Reparo de quebras duplas de DNA 9

2.1.1 União não-homóloga de extremidades (Non-homologous end-

joining – NHEJ

10

2.1.2 Reparo direcionado por homologia – Recombinação Homóloga 12

2.1.2.1 Eventos de regulação e sinalização iniciais da recombinação

homóloga em resposta a DSBs

13

2.1.2.2 Mecanismo de Recombinação Homóloga 20

2.1.3 Reparo direcionado por homologia – Anelamento de fita simples 23

2.2 Os efeitos de BCR-ABL nos mecanismos de reparo de DNA 25

II. OBJETIVOS

29

III. MATERIAL & METODOLOGIAS

31

1. Linhagens Celulares 32

2. Tratamentos e Verificação da viabilidade celular 32

3. Ensaio EGFP-FACS e Silenciamento 33

4. RT-PCR e PCR em tempo real (QRT-PCR) 34

5. Preparação de extratos protéicos e Immunoblotting 35

6. Imunofluorescência 36

7. Extração e Isolamento de Cromatina 37

xii

8. Eletroforese Bidimensional 38

9. Espectrometria de massas 39

IV. RESULTADOS

41

1. Estabelecimento do Modelo de Estudo 42

2. Comparação das freqüências dos diferentes mecanismos de

reparo de quebras duplas de DNA entre Mo7e e MBA

44

3. Avaliação da expressão da transcrição de genes envolvidos nos

mecanismos de reparo de DNA e controle do ciclo celular

53

4. Avaliação da expressão de proteínas envolvidas nos mecanismos

de reparo de DNA e controle do ciclo celular

55

5. Análise do possível papel de CtIP na promoção do reparo

mutagênico de DSBs

58

6. Comparação dos perfis proteômicos de extratos de cromatina

entre Mo7e e MBA

63

V. DISCUSSÃO

69

VI. BIBLIOGRAFIA

76

VII. ANEXO 90

I. INTRODUÇÃO _______________________________________________________________

1

I. Introdução

I. INTRODUÇÃO _______________________________________________________________

2

A Leucemia Mielóide Crônica (LMC) é uma doença proliferativa clonal

hematopoiética resultante da transformação maligna e da proliferação anômala

de uma célula progenitora hematopoiética. Em homeostase, há um equilíbrio

entre proliferação, diferenciação e renovação das células progenitoras

hematopoiéticas. Em pacientes com LMC, esse equilíbrio é alterado, e as

células progenitoras apresentam uma proliferação incessante e diferenciação

desordenada (Deininger et al, 2000).

A LMC foi o primeiro câncer humano associado a um marcador

específico, o cromossomo Philadelphia (Ph). Esse é originado a partir da

translocação recíproca entre os cromossomos 9 e 22 (Rowley, 1973) que

culmina na fusão de dois genes: c-bcr e c-abl. O gene quimérico bcr-abl é

traduzido em uma oncoproteína tirosina cinase funcional implicada na

oncogênese e na progressão patogênica da LMC (Shtivelman et al, 1985).

Geralmente a LMC envolve três fases: A fase crônica inicial é seguida

por uma acelerada que evolui para uma fase blástica. Cerca de 80% dos

pacientes progridem para a fase acelerada antes do desenvolvimento da fase

blástica. Enquanto o cromossomo Ph é a única anomalia citogenética

identificada em pacientes recentemente diagnosticados na fase crônica da

LMC, a evolução para a crise blástica é associada ao aparecimento e

acumulação de novas anomalias cromossômicas (Kabarowski e Witte, 2000;

Takahashi et al, 1998).

A doença inicia-se com a expressão da oncoproteína BCR-ABL em

células tronco hematopoiéticas. Apesar de estas serem progressivamente

substituídas pelos clones leucêmicos, pacientes na fase crônica inicial

apresentam células progenitoras Ph-negativas detectáveis na medula óssea.

Dessa forma há a coexistência de uma hematopoiese normal (Kabarowski e

Witte, 2000).

As decisões de tratamento para os pacientes com LMC são baseadas

na idade e fase da doença que eles se encontram. O transplante alogeneico de

células tronco é um tratamento definitivo, sendo mais efetivo se feito durante a

I. INTRODUÇÃO _______________________________________________________________

3

fase crônica. A limitação desse tratamento é a disponibilidade de doadores

compatíveis.

A introdução dos inibidores moleculares na terapia da LMC marcou um

grande avanço. Mesilato de Imatinib (IM) (Gleevec®, Novartis Pharmaceuticals,

Basel, Suíça) tem como alvo específico a oncoproteína tirosina cinase BCR-

ABL e funciona como um competidor inibitório do sítio de ligação do ATP na

proteína, inibindo assim a fosforilação de seus alvos e logo bloqueando as vias

de sinalização cruciais para a leucemogênese. O IM mostrou grande eficácia

na completa remissão hematológica e citogenética na maioria dos pacientes na

fase crônica, com menor efetividade em pacientes nas fases

acelerada/blástica. No entanto, é crescente a incidência de pacientes

resistentes ao IM (Ikeda et al, 2006).

1. Biologia Molecular da Leucemia Mielóide Crônica

1.1. O cromossomo Philadelphia e os genes envolvidos

O cromossomo Philadelphia (Ph) foi a primeira anomalia cromossômica

considerada um marcador em uma neoplasia. Em 1973 Rowley classificou o

cromossomo Ph como o resultado da translocação recíproca entre os braços

longos dos cromossomos 9 e 22, nas posições q34 e q11 (Figura 1) (Kurzrock

et al, 2003).

Encontrado em mais de 90% dos pacientes com LMC, o cromossomo

Ph também já foi identificado em 25% dos pacientes adultos e 5% de pacientes

infantis diagnosticados com Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA). Os casos de

LMC Philadelphia negativos (cerca de 10%) possuem os mesmos sintomas

clinico patológicos, prognóstico e terapia similares aos casos Ph-positivos

(Garcia-Manero et al, 2003).

I. INTRODUÇÃO _______________________________________________________________

4

Cromossomo 9

Cromossomo22

CromossomoPhiladelphia

FIGURA 1. Representação esquemática da translocação t(9;22)(q3.4;q1.1) – O cromossomo Philadelphia. Adaptado de http://www.siteman.wustl.edu/

O cromossomo Ph foi detectado nas linhagens mielóides, eritróides,

megacariocíticas e em células precursoras B; e não foram detectados em

fibroblastos da medula óssea, sugerindo que a LMC origina-se de uma célula

tronco hematopoiética pluripotente.

No cromossomo 9, o gene c-Abl codifica uma tirosina cinase não-

receptora de 145 kDa que se encontra expressa na maioria dos tecidos. Nas

células normais, ABL está distribuída entre o núcleo e citoplasma, tendo assim

duas isoformas resultantes de um splicing alternativo. Os domínios

multifuncionais de ABL permitem sua participação em diversos processos

celulares através da interação com inúmeras proteínas. Logo, a participação de

ABL em funções tão críticas, requer uma regulação intensiva. ABL nuclear,

predominante, tem papéis na regulação transcricional, na resposta a lesões no

DNA, na apoptose, no controle do ciclo celular, e conseqüentemente, na

proliferação celular. Já a ABL citoplasmática é ativada por fatores de

crescimento e adesão celular, localizando-se em regiões dinâmicas do

citoesqueleto, como a F-actina (Van Etten, 1999, Woodring et al, 2003, Levav-

Cohen et al, 2005).

I. INTRODUÇÃO _______________________________________________________________

5

O gene c-bcr está localizado no braço longo do cromossomo 22, com

aproximadamente 130 kb. A proteína BCR tem atividade serina-treonina

cinase. Entre outras funções, BCR interage com proteínas G, que são

essenciais em diversas vias de sinais intracelulares, crescimento celular,

organização do citoesqueleto (Kurzrock, 2003).

1.2 BCR-ABL e as principais vias de sinalização envolvidas

Estruturalmente, BCR-ABL contém diversos domínios (Figura 2) que

regulam a atividade quinásica de ABL e/ou a conectam com outras vias. As

redes de sinalização molecular na LMC são muito complexas e BCR-ABL afeta

as vias de sinal de diversas formas. A localização citoplasmática de BCR-ABL

permite seu acesso a diversas proteínas, antes inatingível por c-ABL, que é

predominantemente nuclear (Inokuchi, 2006).

FIGURA 2. Representação da proteína quimérica p210 BCR-ABL assinalando

seus principais domínios funcionais. Adaptado de Kurzrock, 2003. (GEF –

Guanine nucleotide Exchange factor; NES – Nuclear Export Signal; NLS –

Nuclear Localization Signal)

A expressão de BCR-ABL é suficiente para a transformação maligna

como observado em estudos in vitro e in vivo (Mclaughlin et al, 1987 e Voncken

et al ,1995). Já os mecanismos responsáveis pela transição da fase crônica

para a crise blástica ainda são pouco compreendidos. Acredita-se que o

aumento da expressão de BCR-ABL contribua para essa evolução, visto que

alguns estudos em linhagens LMC mostraram que BCR-ABL promove efeitos

doses-dependente na independência de fatores de proliferação, migração e as

taxas de resistência ao IM. (Barnes et al 2005). Ainda, esse aumento promove

Oligomerization Domain

Serine/Threonine Kinase Domain

GEF Domain

SH3 SH2

Tyrosine Kinase Domain

NLS

DNA Binding Actin Binding

NES

C N

p210 BCR - ABL

Oligomerization Domain

Serine/Threonine Kinase Domain

GEF Domain

SH3 SH2

Tyrosine Kinase Domain

NLS

DNA Binding Actin Binding

NES

N C

p210 BCR - ABL

I. INTRODUÇÃO _______________________________________________________________

6

novas mutações e o aparecimento de anomalias cromossômicas que levam ao

aparecimento das características malignas que surgem com o avanço da

doença (Calabretta e Perrotti, 2004).

Com a progressão da LMC é possível observar a ocorrência de

diversas anomalias cromossômicas não-randômicas como: Trissomia do 8

(33%), cromossomo Philadelphia adicional (30%), isocromossomo 17 (20%),

trissomia do 19 (12%), perda do Y (8% dos homens), trissomia do 21 (7%),

monossomia do 7 (7%) (Deininger et al, 2000). Estes são marcadores da

progressão da doença, mas não necessariamente são os agentes da

transformação. Ainda, essas são exemplificações das mudanças visíveis;

genes deletados, mutados, duplicados ou de alguma forma alterados, que não

são visíveis a luz da citogenética e que ainda não foram caracterizados, podem

ser os verdadeiros responsáveis pela transformação e evolução da doença.

Essas principais alterações cromossômicas não aparecem com uma alta

incidência entre os pacientes, sugerindo que a progressão a crise blástica não

depende da aquisição de mutações em uma proteína ou via única e crítica,

mas sim, reflete fenótipo mutador e um estado geral de instabilidade genética

promovido por BCR-ABL (Melo e Barnes, 2007).

A transformação mediada por BCR-ABL envolve, entre outros, a

ativação de vários intermediários de sinalização por citocinas que incluem Ras,

PI3K, Akt, Raf-1, Jak/STAT. Assim, BCR-ABL ativa vias como Ras-MAP

kinase, JAK/STAT e PI3K-Akt. Estando estas constitutivamente ativadas direta

ou indiretamente por BCR-ABL (Steelman et al, 2004).

A via Ras está constitutivamente ativada na LMC e está envolvida nos

processos de proliferação, diferenciação e apoptose induzidos por citocinas

(Sawyers et al, 2005). A ativação de Ras por BCR-ABL pode se dar de maneira

direta, ou pela ativação de outras proteínas downstream a Ras, como Raf-1.

Raf-1 pode interagir diretamente com BCR-ABL, tendo como conseqüência a

alteração da distribuição subcelular da proteína pro-apoptótica BAD, inibindo

sua atividade, e logo a apoptose (Steelman et al, 2004). Ainda, a atividade

aberrante da via Raf/MEK/ERK resulta na atividade elevada de fatores de

I. INTRODUÇÃO _______________________________________________________________

7

transcrição responsáveis pelo crescimento celular e inibição da apoptose

(McCubrey et al 2007).

A via PI3K/Akt possui um papel central na sobrevivência, proliferação,

diferenciação, adesão, metabolismo e mobilidade celular (Fruman et al, 1998).

A ativação constitutiva da via PI3K/Akt é comum a vários tipos de câncer,

assim como também há evidências que a via participe da transformação

mediada por BCR-ABL. A ativação de PI3K induz uma cascata Akt-dependente

que regula a localização subcelular e atividade de seus vários alvos que

incluem BAD, MDM2, caspase 9, membros da família de fatores de transcrição

“Forkhead”, entre outros (Kharas e Fruman, 2005).

BCR-ABL também ativa/suprime genes reguladores do ciclo celular.

BCR-ABL estimula a saída do estado celular quiescente através de seus

efeitos em ciclinas e inibidores de CDK. Estudos em células BCR-ABL positivas

mostraram alterações nos padrões normais de expressão da ciclina D2 ao

longo das diferentes fases do ciclo celular. Os níveis de ciclina D2 se

mantiveram altos através do ciclo celular, implicando em um sinal de

crescimento constitutivo (Jena et al, 2002; Jagani, 2008).

Outra via anti-apoptótica ativada por BCR-ABL é aquela mediada por

STAT5 (Signal transducer and activation of transcription 5). A família STAT de

fatores de transcrição participa de diversos processos celulares que incluem

crescimento, diferenciação, respostas imunes e apoptose. STAT5 é

constitutivamente fosforilada em células BCR-ABL-positivas, induzindo assim a

upregulation da serina-treonina kinase Pim1 e genes da família anti-apoptótica

BCL-2: A1 e BCL-xL (Amarante-Mendes et al, 1998; Hoover et al, 2001).

A regulação da proliferação celular em células BCR-ABL positivas

também se dá por alterações em suas propriedades de adesão. Acredita-se

que a adesão de células progenitoras hematopoiéticas ao estroma medular

regule negativamente a proliferação das mesmas. Células hematopoiéticas

isoladas de pacientes com LMC apresentam múltiplas anomalias de função do

citoesqueleto, como o aumento da mobilidade celular, e baixa adesão às

células do estroma. As β-integrinas tem papel importante nessa interação

I. INTRODUÇÃO _______________________________________________________________

8

estroma/células progenitoras. As integrinas são capazes de transduzir um sinal

do meio externo para o interno e é possível que esses sinais inibam sinais de

proliferação. Estudos já demonstraram que BCR-ABL desregula proteínas de

adesão como a β-integrina1 (Deininger et al, 2000; Li et al, 2007).

As vias acima descritas representam uma exemplificação de algumas

que sofrem influência da atividade tirosina cinase BCR-ABL e que levam à

caracterização fenotípica de uma célula BCR-ABL positiva: proliferação celular

constitutivamente ativada, inibição das vias apoptóticas e alteração da

adesividade celular.

2. Mecanismos de reparo de DNA

Ao longo da vida de um indivíduo, o seu genoma está sujeito a sofrer

lesões de naturezas diversas. Podem ter natureza exógena: agentes

genotóxicos ambientais (compostos alquilantes, hidrocarbonetos aromáticos

policíclicos, aminas heterociclicas, etc.), drogas genotóxicas, drogas anti-

câncer, luz Ultravioleta, radiação ionizante (RI); ou endógena: espécies reativas

de oxigênio (EAO) geradas pela respiração celular, hidrólise espontânea de

bases, erros do metabolismo do DNA (recombinação, bloqueio da forquilha de

replicação) (Wyman e Kanaar, 2006).

As células dispõem de diferentes mecanismos para prevenir e reparar

lesões, e evitar o surgimento de mutações. Esses mecanismos abrangem a

parada do ciclo celular, o reparo de DNA, senescência e apoptose. Lesões no

DNA não reparadas podem ter conseqüências graves que se manifestam como

quebras/alterações cromossômicas, mutações gênicas.

A evolução de diversos tipos de câncer reflete a acumulação de

mudanças gênicas que levam a transformação de células normais em células

neoplásicas. A acumulação de alterações em genes supressores de tumor e

proto-oncogenes leva a tumorigênese e, através da seleção de variantes

genéticas, essas alterações também podem afetar as respostas à

quimioterapia e a radioterapia. Evidências vêm mostrando que alterações no

sistema de reparo de DNA associadas aos pontos de checagem do ciclo celular

I. INTRODUÇÃO _______________________________________________________________

9

sejam os responsáveis pela elevada instabilidade genômica em células

cancerosas (Melo e Barnes, 2007).

Dada sua elevada genotoxicidade e letalidade, tomamos como modelo

do presente estudo, o reparo de quebras duplas de DNA (Double strand breaks

– DSBs).

2.1. Reparo de quebras duplas de DNA

DSBs são aparentemente inevitáveis conseqüências da replicação do

DNA. Elas são geradas naturalmente quando forquilhas de replicação são

bloqueadas (estresse replicativo, formações de estruturas hairpins) ou através

da reação com subprodutos metabólicos produzidos pela respiração celular –

espécies reativas de oxigênio (EAO). DSBs são formadas normalmente durante

os rearranjos genômicos programados como no crossing-over da meiose e na

recombinação V(D)J, durante a maturação de linfócitos do sistema imune.

DSBs também podem ser produzidas direta ou indiretamente por agentes

externos como Radiação Ionizante (RI), agentes químicos, luz UV, agentes

intercalantes (cross linkers) e quimioterápicos anti-câncer. A falha no reparo de

DSBs ou seu reparo errôneo pode resultar na morte celular ou em mudanças

cromossômicas como deleções, translocações e fusões (Wyman e Kanaar

2006; Shrivastav et al, 2008).

Diferentes respostas a DSBs podem ocorrer nos diferentes estágios do

ciclo celular, com a concomitante ativação dos pontos de checagem. No

entanto, se a quantidade das lesões sofridas é elevada, são desencadeados

muitos sinais celulares sobrepostos que acabam por culminar na apoptose,

com a finalidade de prevenir a propagação de células cujos genomas são

instáveis (Wyman e Kanaar, 2006).

Células eucarióticas reparam DSBs pelos seguintes mecanismos: A

união não homóloga de extremidades (Non-homologous end-join - NHEJ) e as

vias de Recombinação direcionadas por Homologia (Homology directed repair -

HDR) que podem ser subdivididas em Recombinação Homóloga (RH) ou

Anelamento de fita simples (Single Strand Annealing – SSA). Esses

I. INTRODUÇÃO _______________________________________________________________

10

mecanismos se diferenciam em virtude da fidelidade dos processos, sendo

NHEJ e SSA mutagênicos e a RH representando uma via de reparo de DSBs

fiel.

2.1.1. União não-homóloga de extremidades (Non-homologous end-

joining - NHEJ)

Mecanicamente, a NHEJ parece um processo relativamente simples:

um grupo de enzimas captura ambas as extremidades quebradas do DNA,

forma-se uma “ponte” molecular que une as extremidades e, em seguida, re-

ligam o DNA. Mas a realidade é que o NHEJ é um processo complexo e requer

uma ação extremamente coordenada entre suas enzimas-chave. E muitas

lacunas ainda precisam ser preenchidas para a total compreensão do

processo.

A NHEJ é iniciada pela ligação de alta afinidade do complexo protéico

Ku70/80 em ambas as extremidades quebradas do DNA. Estudos de

cristalografia do complexo revelaram que o heterodímero possui uma estrutura

semelhante a um anel aberto capaz de acomodar a hélice de DNA e promover

modificações conformacionais que permitem o deslizamento do heterodímero

(Walker et al, 2001).

Ku70/80 cria uma base para recrutamento e associação de outros

fatores. Um desses fatores é a proteína serina/treonina quinase DNA-PKcs

(DNA-dependent protein kinase catalitic subunit) que, dentre diversas funções

associadas, forma os complexos sinápticos que unem as extremidades de DNA

(Lees-Miller e Meek, 2003). É possível que a associação de DNA-PKcs à

extremidade de DNA e ao dímero Ku seja necessária para ativar seu sítio

quinase. Alguns alvos de DNA-PKcs já foram identificados in vitro, como

XRCC4, Ku70, Ku80 e p53, o que sugere que DNA-PKcs regule tanto o próprio

mecanismo de NHEJ como também o ciclo celular (Smith e Jackson, 1999;

Lakin e Jackson, 1999). Além disso, o principal alvo de DNA-PKcs é a própria.

O status de fosforilaçao de DNA-PKcs determina as modificações

conformacionais necessárias para a formação do complexo sináptico. A

presença da grande molécula de 460 kDa de DNA-PKcs na sua forma não-

I. INTRODUÇÃO _______________________________________________________________

11

fosforilada bloqueia fisicamente o acesso de outras enzimas e logo inibe a

ligação efetiva das duas extremidades de DNA (Weterings e Chen, 2003).

Diversos estudos sugerem então um modelo onde a forma não

fosforilada de DNA-PKcs proteja as extremidades do DNA contra ligação de

enzimas ou degradação prematuras, até que ambas as extremidades estejam

propriamente unidas pelo complexo sináptico. A autofosforilação introduz uma

mudança conformacional que resulta na acessibilidade de novas enzimas.

Dependendo da natureza da quebra, como a formação de pontas

coesivas, deve ser feito um processamento das extremidades quebradas até

que adquiram forma de ponta abrupta. As pontas coesivas podem ser

processadas em abruptas de duas formas: através da ação enzimas como a

TdT (deoxynucleotidyltransferase) (Mickelsen et al, 1999), DNA pol µ ou DNA

pol λ que se associam ao complexo Ku (Lee et al, 2004) e atuam adicionando

nucleotídeos, utilizando-se como molde a própria fita complementar; ou através

da ressecção do DNA fita simples (single strand DNA – ssDNA) a partir das

pontas coesivas, função que vem sendo atribuída a endonuclease Artemis

(Dahn, 2007). Nesse ponto, pode haver a perda ou ganho de nucleotídeos na

região da quebra.

Após o processamento adequado das extremidades do DNA, o

complexo sináptico, já previamente associado, aproxima as extremidades que

vão ser ligadas por um complexo formado pelas proteínas Ligase IV e XRCC4.

A ilustração esquemática do mecanismo de NHEJ está representada pela

figura 3.

O mecanismo descrito acima se refere à forma clássica do NHEJ. No

entanto, vem sendo descrita mais recentemente uma via alternativa de NHEJ,

independente dos fatores descritos acima (Bennardo et al, 2008). A via

alternativa de NHEJ também pode ser referida como micro-SSA,

microhomology-mediated end joining (MMEJ) ou Ku-independent end joining.

Ainda não existe um consenso entre essa diversidade de terminologias, nem

com a distinção entre os eventos. Mas esse quadro reflete crescente número

de evidências da existência de múltiplas subclasses de NHEJ que estão para

serem descritas.

I. INTRODUÇÃO _______________________________________________________________

12

FIGURA 3. Modelo proposto para a via clássica de NHEJ. Após a ligação do heterodímero Ku70/80, DNA-PKcs são recrutadas. DNA-PKcs tem sua atividade ativada pela formação do complexo sináptico, o que promove sua autofosforilação e a fosforilação de outros alvos. As extremidades são processadas por ressecção (Artemis) ou por polimerização de nucleotídeos (DNA pol). O complexo formado por Ku, Ligase IV, XRCC4, DNA-PKcs e uma DNA polimerase, alinham, unem e ligam as extremidades, restaurando a molécula de DNA.

2.1.2. Reparo direcionado por homologia – Recombinação Homóloga

Enquanto NHEJ funciona de maneira independente de moldes para a

reunião das extremidades quebradas, o reparo mediado por homologia re-

sintetiza seqüências lesionadas ou perdidas nos sítios de quebra utilizando

uma seqüência homóloga ao longo do genoma (Wyman e Kanaar, 2006).

I. INTRODUÇÃO _______________________________________________________________

13

A RH é considerada um sistema de reparo livre de erros, onde

seqüências homólogas servem como molde para o reparo da região lesada.

Devido à proximidade das cromátides irmãs na fase S/G2, a maquinaria de RH

pode valer-se e assim promover o reparo. Além disso, muitos componentes da

maquinaria de reparo por RH dependem da ativação/interação com

determinadas CDKs, que estão especificamente ativadas durante essas fases

(Helleday et al, 2007). Já com a compactação da cromatina e a ausência de

cromátides irmãs durante a fase G1, a NHEJ parece predominar no reparo de

DSBs durante essa fase (Wyman et al, 2006).

Outro fator determinante na “escolha” da via de reparo de DSBs é a

estrutura das extremidades quebradas. Quebras simples abruptas são

substratos que favorecem a rápida ligação do complexo Ku. Já quebras com

estruturas mais complexas, como longas extremidades coesivas e a própria

forquilha de replicação em colapso, são mais propensos a atrair a maquinaria

de recombinação homóloga (Helleday et al, 2007).

2.1.2.1. Eventos de regulação e sinalização iniciais da recombinação

homóloga em resposta a DSBs

A sinalização de lesões no DNA para a RH compreende três

mecanismos iniciais principais: Ligação do complexo de proteínas MRN ao

DNA, modificação da cromatina e a ressecção das quebras duplas, com a

formação de DNA fita simples.

A iniciação exata desses eventos ainda permanece desconhecida, mas

há evidências que sugerem que o complexo MRN seja um dos principais

sensores de lesões no DNA e que este inicie a sinalização para os outros

componentes da maquinaria de reparo. O complexo MRN (formado pelas

proteínas MRE11, NBS1 e RAD50) tem funções descritas como capacidade de

ligação a extremidades de DNA – na manutenção de telômeros, atividade

nucleásica, desenovelamento do DNA e controle de pontos de checagem do

ciclo celular (Lee e Paull, 2005) (Figura 4A).

I. INTRODUÇÃO _______________________________________________________________

14

DSBs levam a ativação de duas importantes quinases: ATM (ataxia

telangiectasia mutated) e ATR (ataxia telangiectasia and Rad3 related), que

orquestram as respostas a lesões no DNA levando a ativação dos pontos de

checagem do ciclo celular que permitem o reparo da lesão. No entanto, os

determinantes estruturais do DNA que ativam ATM e ATR, e como elas se

coordenam, ainda são pouco compreendidos (Cimprich e Cortez, 2008). Ambas

quinases compartilham alvos e funções. No entanto, enquanto ATM funciona

em resposta a formação de DSBs ocasionais (como radiação ionizante e/ou

EAO), e ATR funciona a cada ciclo celular acompanhando e mantendo as

forquilhas de replicação. ATR é ativada quando a forquilha de replicação

encontra uma lesão que provoque a parada de seu andamento (Stiff et al,

2005), como moléculas intercalantes intra-fitas (interstrand crosslinks - ICLs ), e

mudanças na conformação do DNA devido ao estresse replicativo (Cimprich e

Cortez, 2008). Porém, como ICLs e a resolução parcial de forquilhas de

replicação bloqueadas também levam a formação de DSBs intermediárias,

estas podem ser também prontamente reconhecidas por ATM (Pichierri et al,

2004). Pelo fato das proteínas-foco do presente estudo serem alvos

predominantes de ATM, as vias relacionadas à mesma serão

preferencialmente descritas a seguir.

Em células nas quais os sinais de reparo não estão ativos, a cinase

ATM está inativa, na forma de homodímeros, defosforilada e dispersa no

núcleo. Com o aparecimento de lesões, como DSBs por RI, ATM converte-se

em sua forma ativa em monômeros e fosforilada em Ser1981. Essa fosforilação

tem sido atribuída ao complexo MRN. Uma vez ativada, ATM fosforila diversos

substratos e/ou os recruta aos sítios de lesão (Uziel et al, 2003; Carson et al

2003). Entre os principais substratos de ATM podemos destacar NBS1, H2AX,

BRCA1, MDC1, 53BP1, Artemis, p53, CHK2 e DNA-PKs (Kobayashi et al,

2008). Alterações estruturais na cromatina também podem ativar ATM

independente de lesões (Zgheib et al, 2005) (Figura 4B).

A fosforilação da histona H2AX por ATM, considerada o primeiro

evento do reparo de DNA em muitos modelos, constitui um sinal epigenético

que é reconhecido por diversas proteínas de reparo. Entre elas podemos

I. INTRODUÇÃO _______________________________________________________________

15

destacar as proteínas adaptadoras MDC1, BRCA1, 53BP1 e RAD51, entre

outras (van Attikum e Gasser, 2009). As proteínas adaptadoras ou mediadoras

constituem uma classe de proteínas envolvidas com a promoção dos pontos de

checagem do ciclo celular, e com a propagação do sinal a partir da lesão de

DNA ao promoverem um ambiente favorável à formação de múltiplas

interações entre ATM e seus substratos (Stewart et al, 2003).

Entre as mais diversas proteínas adaptadoras da interface reparo-ciclo

celular, a proteína MDC1 é uma das primeiras proteínas a focalizar-se nos

sítios de lesão juntamente com H2AX fosforilada. O silenciamento da

expressão de MDC1 leva ao decréscimo da ativação de ATM, da sua

capacidade de focalização, e logo da fosforilação de seus substratos (Mochan

et al, 2003). Apesar da fosforilação de H2AX ser um evento independente de

MDC1, esta é menos intensa e deficiente na propagação de sinal quando

MDC1 é silenciada (Xu e Stern, 2003).

Assim, sugere-se um modelo onde, em resposta a lesão no DNA, o

complexo MRN ative ATM e essa, em seguida, fosforila seus substratos que

incluem H2AX e MDC1. A ligação H2AX-MDC1 forma um loop de ativação que

recruta a focalização de ATM e MRN. ATM amplifica a fosforilação de H2AX,

expandindo o sinal e promovendo modificações na cromatina necessárias para

o recrutamento de outras proteínas de reparo (Lou et al 2003; Lou et al, 2006;

Mochan et al, 2003) (Figura 4C).

Estudos apontam MDC1 como uma plataforma de interação proteína-

proteína que permite a ligação sustentável de proteínas como NBS1, 53BP1 e

BRCA1 aos sítios de lesão. O silenciamento de MDC1 leva a diminuição de

capacidade de focalização NBS1 e 53BP1, mas a focalização de MDC1 não é

afetada pelo silenciamento das mesmas, o que sugere que MDC1 atue

upstream (Stewart et al, 2003).

53BP1 também parece ter um papel importante na ativação de ATM,

segundo os estudos que mostraram que a fosforilação de diversos substratos

de ATM como CHK2 e BRCA1 estava bloqueada quando 53BP1 estava

I. INTRODUÇÃO _______________________________________________________________

16

silenciado, e como conseqüência, a promoção dos pontos de checagem do

ciclo celular estava prejudicada (Ward et al, 2003; Wilson e Stern, 2008).

53BP1 mostrou grande afinidade de ligação a histonas metiladas; entre

elas a H4K20me2, cuja interação com 53BP1 mostrou ter papel chave na

promoção da NHEJ. Histonas como H4K20me2 são constitutivas, mas

encontram-se inacessíveis devido à compactação da cromatina. Com a lesão

ao DNA, a cromatina pode sofrer modificações em sua estrutura e levar a

exposição dessas histonas. MDC1 possui um domínio rico em SQ que pode

modificar a cromatina ao ligar-se de forma estável a H2AX, expondo as

histonas metiladas e permitindo sua conexão com 53BP1 (Xie et al, 2007).

Outra proteína mediadora, BRCA1, também é alvo de ATM e sua

ligação à cromatina também é dependente de MDC1 (Lou et al, 2003). No

entanto, a focalização de BRCA1 requer ainda pelo menos duas proteínas

adicionais: RAP80 e ABRA1 (Wang et al, 2007).

A retenção de BRCA1 nos sítios de lesão envolve uma série de

eventos que começam com a formação do complexo MDC1-H2AX, aumento da

concentração de ATM, fosforilação de MDC1 e a focalização da proteína

ubiquitina-ligase RNF8. RNF8 tem como papel primordial ubiquitinar histonas e

proteínas fosforiladas circundantes as DSBs, promovendo assim a

reestruturação da cromatina e a exposição das histonas marcadoras. Isso

aumenta a afinidade de ligação de 53BP1 e BRCA1 à cromatina (Mailand et al,

2007). A proteína RAP80, através de seus domínios UIM, reconhece cadeias

de poliubiquitinas formadas possivelmente por RNF8, tornando viável uma

focalização mais estável de BRCA1 (Kim et al, 2007).

BRCA1 também foi reportada como tendo a capacidade de promover a

ubiquitinação de proteínas nos sítios de DSBs. A ubiquitinação de proteínas

tem como conseqüência, na maioria dos casos, a sinalização de degradação

de proteínas via proteossomo. A participação dos proteossomos no reparo de

DNA ainda é pouco conhecida. Porém diversas subunidades de proteossomos

já foram descritas como alvos de fosforilação de ATM e ATR em resposta a

lesões no DNA geradas por RI. À parte da poliubiquitinação que sinaliza para a

I. INTRODUÇÃO _______________________________________________________________

17

degradação protéica, a ubiquitinação tem sido observada como um elemento

regulatório importante que governa respostas como transcrição gênica, reparo

de DNA e controle do ciclo celular (Huen e Chen, 2008).

A proteína CtIP é um dos principais alvos dessa ubiquitinação por

BRCA1 em resposta a DSBs e é um procedimento importante para seu

recrutamento aos sítios de DSBs (Yu e Chen, 2004). BRCA1 contém um

domínio N-terminal “ring-finger” que se dimeriza com a proteína BARD1

conferindo uma atividade de ubiqutina-ligase. Especula-se que a ligação-

ubiquitinação de CtIP por BRCA1 tenha um papel importante na regulação do

ciclo celular, principalmente durante as fases G2 e M, e na fosforilação de

CHK1 (Yu e Chen, 2004; Barber e Boulton, 2006) (Figura 4D).

Foi recentemente demonstrado que CtIP interage com o complexo

MRN na promoção da ressecção de DSBs, promovendo o reparo de DNA via

RH. Essas descobertas mostram CtIP como um regulador crítico da sinalização

para pontos de checagem e para o reparo através da regulação de MRN

(Sartori et al, 2007).

A escolha do mecanismo de reparo de DSBs depende da fase do ciclo

celular. Devido à disponibilidade de cromátides irmãs coesas durante a fase

G2/S, a recombinação homologa pode realizar-se, predominando sobre a

NHEJ. O aumento da expressão de CDKs na fase G2/S também pode

influenciar na “escolha” das vias. CtIP é fosforilado por CDKs e essa

fosforilação parece ser crucial para que haja interação entre CtIP e BRCA1. Foi

demonstrado que CDKs tem papel na formação do substrato ativador da RH: A

atividade nucleásica de MRN-CtIP na formação de ssDNA é dependente da

atividade de CDK; e o recrutamento das RPAs e RAD51 via BRCA2 é CDK-

dependente (Ira et al, 2004; Aylon et al, 2004).

Mais tardiamente, proteínas como BRCA2 e RAD51 cofocalizam-se

nas mesmas frações de cromatina. BRCA2 e RAD51 são essenciais para a

efetivação da recombinação homóloga (Hussain et al, 2004; Wang e D’Andrea,

2004). Os domínios BRC de BRCA2 ligam-se diretamente a RAD51. Esta, por

sua vez é uma enzima de recombinação que se liga a DNAs fita simples

I. INTRODUÇÃO _______________________________________________________________

18

formando um filamento nucleoprotéico essencial para os mecanismos de

recombinação. A formação do filamento nucleoprotéico permite que RAD51

ligada a DNA fita simples “invada” e promova o pareamento com as bases

homologas em dupla-fita, iniciando o intercâmbio de informação entre as

cromátides irmãs. RAD51 também interage com fatores de replicação como

PCNA e RPA, e com o complexo BLM – topo III α. Este último está envolvido

na dissolução de junções Holliday (Meetei et al, 2003; Wu et al, 2005) (Figura

4E).

RAD51 também se focaliza nos sítios de DSBs de forma dependente

de MDC1, nos primeiros momentos pós formação de DSBs. O silenciamento de

MDC1 levou a aumento da degradação de RAD51, sugerindo que MDC1 regule

a RH através do controle da estabilidade de RAD51 e do seu acesso aos sítios

de recombinação (Zhang et al, 2005).

I. INTRODUÇÃO _______________________________________________________________

19

FIGURA 4. Representação esquemática do modelo de focalização e associação das proteínas envolvidas na promoção dos pontos de checagem do ciclo celular e reparo por recombinação homologa em resposta a quebras duplas de DNA. (A) Devido as suas atividades intrínsecas, foi sugerido um modelo onde o complexo MRN seja o primeiro grupo de proteínas a associar-se ao sítio de lesão e tendo papel na ativação de ATM. (B) ATM concentra-se no sítio de lesão, gera um loop de auto-ativação e fosforila diversos substratos, incluindo a histona H2AX. (C) MDC1 liga-se diretamente a H2AX e provocam modificações na estrutura da cromatina necessárias para o recrutamento de outras proteínas mediadoras do reparo e da promoção dos pontos de checagem do ciclo celular como NBS1, 53BP1 e BRCA1. (D) A estabilização da ligação de BRAC1 requer uma modificação por ubiquitinação, possivelmente promovida pela ubiquitina ligase RNP8. Uma vez estabilizada, BRCA1 pode ter função de ubiquitina ligase que por sua vez tem como alvo a proteína CtIP. (E) O complexo MRN-CtIP promove a formação de fragmentos ssDNA. E a interação e concomitante ativação das proteínas focalizadas nos possíveis pontos de quebra dupla de DNA ativam e atraem diversas proteínas que vão promover a parada do ciclo celular necessária para a realização da RH.

I. INTRODUÇÃO _______________________________________________________________

20

2.1.2.2. Mecanismo de Recombinação Homóloga

Conforme a descrição do modelo na seção anterior, as respostas

celulares iniciais a DSBs são caracterizadas pela formação de estruturas sub-

nucleares denominadas “foci” que são formados por diversas proteínas

envolvidas com o reparo de DNA e controle do ciclo celular. Apesar de

intensamente estudados, a organização estrutural e a dinâmica pelas quais as

proteínas são recrutadas para a formação dos foci ainda não foram totalmente

elucidadas.

O primeiro passo da RH é manter a proximidade das seqüências

homólogas, possivelmente através da coesão entre as cromátides irmãs

promovidas pelas coesinas SMCs e pelo complexo RAD50/MRE11 (Wyman e

Kanaar, 2006). Em seguida, inicia-se com um extensivo processamento das

extremidades quebradas, resultando na formação de segmentos de DNA fita

simples (ssDNA) que são reconhecidas e ligadas pela proteína RPA. Essa

ressecção do DNA em ssDNA vem sendo atribuída a atividade nucleásica de

MRE11 (Valerie e Povirk, 2003) e CtIP (Sartori et al, 2007).

RAD51, uma proteína crucial na RH, liga-se a ssDNA formando um

filamento nucleoprotéico que vai buscar e invadir sua seqüência homóloga, em

um processo controlado pela proteína BRCA2 (Lord e Ashworth, 2007).

Parálogos de RAD51, RAD52 e RAD54, tem suas funções atribuídas a

mudanças conformacionais do DNA (desenovelamento da α-hélice,

despareamento das bases da seqüência a ser invadida) em um mecanismo

ATP-dependente, que também favorece a ligação de outros fatores de reparo

(Baumann et al, 1996; Gupta et al, 1997). RAD52 interage tanto com RAD51

quanto RPA, acelerando o deslocamento de RPA da ssDNA para a eficiente

interação do DNA com RAD51 (Sugiyama e Kowalczykowski, 2002). A ligação

de RAD52 a longos segmentos de ssDNA cobertos por RPA também pode

desencadear na ativação de vias alternativas de reparo direcionado por

homologia, como a via de SSA (descrita na próxima seção). No entanto, ainda

é desconhecido o mecanismo que direciona e controla essas vias. Acredita-se

que a interação de RAD51 com outras proteínas, como BRCA2, seja um critério

I. INTRODUÇÃO _______________________________________________________________

21

importante, visto que BRCA2 é necessária para a formação e estabilização do

filamento nucleoprotéico de RAD51 (Yang et al, 2005).

A helicase Srs2 de Saccharomyces cerevisiae, ainda sem

correspondente homólogo humano identificado, parece dissociar RAD51 do

ssDNA permitindo o pareamento das bases do segmento ssDNA invasor com

seu molde homólogo intacto (Marini e Krejci, 2010). Em seguida, DNA

polimerases promovem a extensão do filamento. A fita recém estendida pode

dissociar-se e anelar-se com a segunda extremidade processada da fita ssDNA

não invasora ou ambas as extremidades invadem a seqüência homóloga e

formam uma junção Holliday que são resolvidas e em seguida possíveis

lacunas geradas são reparadas por DNA polimerases e DNA ligases

(Shrivastav et al, 2008).

A ilustração esquemática do mecanismo de recombinação homóloga

está representada pela figura 5.

I. INTRODUÇÃO _______________________________________________________________

22

FIGURA 5. Reparo de quebras duplas de DNA através de recombinação homóloga. Uma das cromátides irmãs sofre uma DSB, que é reconhecida por proteínas sensoras e adaptadoras que promovem o processamento das fitas quebradas resultando em fragmentos ssDNA associados à proteína RPA. Esses, são os substratos para a formação de um filamento nucleoprotéico com a associação da proteína RAD51 ao ssDNA formado, um evento controlado por parálogos de RAD51 e a proteína BRCA2. O filamento nucleoprotéico direciona o reconhecimento da homologia e o intercâmbio entre as fitas para a formação de uma junção entre a cromátide lesada e a cromátide-irmã intacta. A resolução desta junção intermediária é feita por polimerases e ligases que preenchem as lacunas resultantes.

I. INTRODUÇÃO _______________________________________________________________

23

2.1.3. Reparo direcionado por homologia – Anelamento de fita simples

Além da recombinação homóloga, o anelamento de fita simples – SSA

– é um processo não conservativo parte integrante das vias de Recombinação

direcionadas por Homologia (HDR), por também envolver a ressecção das

extremidades quebradas do DNA via MRN e CtIP. SSA envolve o anelamento

de fitas simples homólogas que formam pontes entre as extremidades das

DSBs, resultando na deleção de fragmentos entre as seqüências homólogas.

A via SSA vem sendo extensamente elucidada em modelos de

leveduras, porém ainda é pouco compreendida em eucariotos superiores. SSA

compartilha fatores da RH e da NHEJ. Quando duas seqüências adjacentes e

repetitivas estão nas proximidades das regiões de quebra, a via SSA pode ser

utilizada para o reparo da DSB. Nesse caso, fragmentos de ssDNA

previamente processados pela nuclease CtIP alinham-se e anelam-se (Figura

6). Esse processo conta com as proteínas RPA e RAD52, e é independente de

RAD51. O SSA conta com a perda de fragmentos de DNA entre as seqüências

repetitivas, assim como uma das repetições. Dessa forma, o SSA é uma via

sempre associada à mutagênese por permitir a perda permanente de longas

seqüências podendo ser uma conseqüência inevitável e involuntária da

necessidade de se criar fragmentos ssDNA. Apesar de mutagênica, a via SSA

pode ter participação marcante no reparo de DSBs, visto que o genoma

humano está repleto de elementos repetitivos, como por exemplo, elementos

Alu. Assim, SSA é uma opção de reparo de DSBs, porém sua real contribuição

ainda está para ser definida (Valerie e Povirk, 2003).

Após a formação de ssDNA, as vias HDR se divergem. A inibição das

funções de RAD51 promoveria o desvio da via de RH para SSA. Além disso,

NHEJ é ligeiramente inibida por RAD52, proteína chave na promoção de SSA.

Os mecanismos de distinção entre as diferentes vias de reparo de DSBs ainda

não foram totalmente esclarecidos, mas acredita-se que a distância entre as

seqüências homólogas e a extensão das homologias possam influenciar na

“escolha” dos processos (Bennardo et al, 2008). Por exemplo, RAD52 se liga

preferencialmente em longas extensões de ssDNA, sugerindo que RAD52 pode

ter um papel específico no anelamento de longos fragmentos de ssDNA, e logo

I. INTRODUÇÃO _______________________________________________________________

24

promover SSA (Ristic et al, 2003). De fato, RAD52 forma um anel multimérico

que tem papel na promoção da associação entre as seqüências de DNA

complementares. A proteína ERCC1 forma um heterodímero com a

endonuclease XPF que é necessária para uma eficiente SSA, funcionando na

clivagem dos fragmentos heterólogos de ssDNA que se formam em função do

pareamento das seqüencias repetitivas. A finalização do processo se dá pelo

preenchimento das lacunas por uma DNA polimerase (Al-Minawi et al, 2008).

FIGURA 6. Modelo de reparo por anelamento de fita simples – SSA. O SSA ocorre quando a DSB é formada nas proximidades de seqüências de DNA repetitivas. O comprimento dos fragmentos de ssDNA, formados por atividade de nucleases, e a extensão das homologias que vão de microhomologias a centenas de pares de bases, podem determinar a execução do SSA. No caso de longas extensões de homologias entre seqüências repetitivas, as proteínas

I. INTRODUÇÃO _______________________________________________________________

25

RPA e RAD52 promovem o pareamento do DNA, seguido da remoção dos fragmentos não-pareados pela nuclease ERCC1/XPF e pelo preenchimento das lacunas resultantes por uma DNA polimerase.

2.2. Os efeitos de BCR-ABL nos mecanismos de reparo de DNA

Mecanismos de vigilância da integridade do genoma e mecanismos de

reparo de lesões parecem estar alterados na LMC. E a falha nesses

mecanismos pode contribuir para a instabilidade genética não só da LMC, mas

da maioria dos cânceres humanos.

Os mecanismos responsáveis pela transição fase crônica para crise

blástica ainda são pouco compreendidos. Com base em alguns estudos, um

modelo que explique a evolução da LMC sugere que, o aumento da expressão

e da atividade de BCR-ABL promova o surgimento de anomalias genéticas

secundárias tanto moleculares quanto cromossômicas que levariam ao fenótipo

maligno observado nos estágios mais avançados da doença (Calabretta e

Perrotti, 2004). Apesar de algumas alterações serem mais comuns que outras,

as mutações secundárias variam bastante, e mais refletem um estado geral de

instabilidade genômica, do que um efeito focado sob loci particulares.

Anomalias genéticas e cromossômicas estão consistentemente

aumentadas em células BCR-ABL positivas, apesar de serem modestas. Esses

aumentos foram observados tanto espontaneamente, após longos períodos de

expressão de BCR-ABL, quanto pós-indução de lesões por agentes

genotóxicos (Deutsch et al, 2003; Koptyra et al, 2008). E novamente, são

alterações que parecem ser randômicas, condizentes com o fenótipo mutador.

As lesões observadas nas células BCR-ABL positivas podem surgir de

diferentes formas. Alguns estudos já demonstraram que BCR-ABL induz uma

produção elevada de espécies reativas de oxigênio (ROS) que causam lesões

oxidativas que culminam na formação de DSBs (Sattler et al, 2000; Nowicki et

al, 2004). As lesões também podem surgir em virtude de proliferação

desordenada. Como as próprias DNA polimerases podem causar erros durante

I. INTRODUÇÃO _______________________________________________________________

26

a replicação do DNA, o simples aumento da freqüência de replicação eleva a

probabilidade do surgimento de novas aberrações.

As lesões no DNA podem ter como conseqüência mutações pontuais,

alterações de um (ou oligo) nucleotídeo(s), quebras de fita única ou dupla.

Geralmente, quebras de fita única são propensas a culminar na formação de

quebras duplas. Já que o foco da presente tese é o reparo de quebras duplas,

a descrição dos efeitos de BCR-ABL no reparo segue focando nos mecanismos

de reparo deste tipo de lesão.

Como já descrito na seção anterior, DSBs podem ser reparadas tanto

por mecanismos de alta fidelidade – RH, quando há a disponibilidade de uma

cromátide irmã que sirva como molde. O que ocorre entre as fases S e G2 do

ciclo celular. Ou, as quebras podem ser reparadas por mecanismos não

fidedignos como NHEJ e SSA que podem gerar deleções ou mutações entre as

fitas reparadas.

Recentemente, Dierov e colaboradores (2009) mostraram que

linhagens BCR-ABL positivas adquiriram mais translocações e aneuploidias,

em resposta a tratamentos genotóxicos, do que as células controle.

Translocações ocorrem como resultado de reparo errôneo de DSBs. E por isso,

muitos laboratórios vêm focando seus estudos nas formas em que BCR-ABL

participa da alteração da eficiência e/ou fidelidade das vias de reparo de DSBs.

NHEJ já é um mecanismo reconhecidamente não fiel onde o reparo da

maioria das quebras resulta na formação de pequenas deleções ou inserções

entre as extremidades unidas. Ainda, pode ocorrer o surgimento de

translocações quando cromossomos são incorretamente justapostos.

Células de murinos BCR-ABL positivas apresentaram as atividades de

NHEJ e RH aumentadas. Ainda no mesmo estudo, foi averiguado que os

produtos desses reparos apresentaram maiores deleções resultantes da NHEJ

e mutações quando resultantes de RH, o que indica um maior

comprometimento da fidelidade dos mecanismos (Slupianek et al, 2006). Esses

I. INTRODUÇÃO _______________________________________________________________

27

resultados foram ainda confirmados em células de pacientes e na linhagem

LMC, K562 (Gaymes et al, 2002).

Apesar de evidências apontarem que a expressão de BCR-ABL leve ao

aumento das freqüências de NHEJ, os mecanismos pelos quais BCR-ABL

afeta a via ainda não foram esclarecidos. Proteínas-chave da NHEJ, Ku70,

Ku80 não apresentaram diferenças na expressão protéica quando comparadas

células BCR-ABL positivas e negativas. No entanto, a proteína DNA-PK

apresentou níveis de expressão protéica inferiores em células BCR-ABL

positivas (Deutsch et al, 2001). Já o grupo de Slupianek observou aumento da

expressão de Ku70 e Ku80 apenas em resposta a irradiação e os níveis de

DNA-PKs se mostraram similares entre as linhagens BCR-ABL positivas e

negativas. Contudo, essas observações se devem mais ao aumento do número

de DBSs em células BCR-ABL positivas do que propriamente uma regulação

mediada por BCR-ABL. Estudos paralelos mostraram que células CD34+ e

linfócitos de sangue periférico normais quando tratados com irradiação também

apresentaram um padrão similar de NHEJ e misrepair comparáveis com

aqueles observados nas células LMC (Burke e Carroll, 2008). Assim, a

variação na expressão de proteínas da maquinaria da NHEJ seria

conseqüência do aumento nos níveis de lesões.

Mecanismos alternativos de NHEJ têm sido identificados, porém ainda

não foram bem definidos. Eles atuam como um “backup” da via clássica do

NHEJ, porém apresentam maiores freqüências de erros, e apresentam fatores

protéicos distintos. Sallmyr e colaboradores (2008) examinaram se alguns

componentes dessa via alternativa NHEJ poderiam estar envolvidos no reparo

de DSBs alterado pela LMC. Os resultados mostraram níveis reduzidos das

proteínas Artemis e DNA ligaseIV em células BCR-ABL positivas, comparando

com as negativas. Por outro lado, as proteínas WRN e DNA ligaseIIIα se

apresentaram mais expressas e ainda formando complexos em resposta a

DSBs nas células LMC. Resultado que sugere que BCR-ABL também possa

estar atuando sobre as vias de sinalização de NHEJ alternativas.

A recombinação homóloga, um mecanismo de reparo de alta fidelidade,

em células BCR-ABL positivas de murinos, apresentou maior freqüência do que

I. INTRODUÇÃO _______________________________________________________________

28

nas suas contrapartes negativas (Slupianek et al, 2006; Nowicki et al, 2004).

No entanto o envolvimento dos fatores de RH com a atividade de BCR-ABL

ainda foi pouco descrito.

RAD51 apresentou-se com uma expressão elevada em células BCR-

ABL positivas de murinos em resposta a irradiação (Slupianek et al, 2006) e

também em condições não tratadas (Slupianek et al, 2002). Esses estudos

ainda mostraram um aumento na co-focalização de RAD51 com a histona

ɣH2AX por imunofluorescência. No entanto, esse resultado também pode ser

um artefato, devido ao aumento normal já descrito da expressão de RAD51 em

resposta a lesão.

A helicase BLM e o componente do complexo MRN, a proteína NBS1,

tem papeis importantes no reparo de forquilhas de replicação colapsadas, por

RH. Em células BCR-ABL positivas ambas as proteínas apresentaram

expressão mais elevada do que as contrapartes negativas e a ativação de

NBS-1 através da fosforilação da Serina343 em resposta a tratamentos com

drogas genotóxicas também estava mais elevada (Slupianek et al, 2005; Rink

et al, 2007).

O SSA é um mecanismo de reparo que, apesar de ser considerado um

processo de RH não conservativo, envolve diversos fatores comuns às outras

vias, com exceção de RAD51. SSA também parece apresentar uma freqüência

mais elevada em células BCR-ABL positivas do que nas negativas (Fernandes

et al, 2009; Cramer et al, 2008). Entre os fatores que participam do processo,

RAD52 e ERCC1 já tiveram seus níveis de expressão analisados, porém não

foram observadas alterações.

São crescentes as evidências que mostram que as células BCR-ABL

positivas estão sujeitas a acumulação de mutações no DNA como uma

conseqüência dos efeitos de BCR-ABL na fidelidade dos processos de reparo

de DNA. No entanto, ainda são desconhecidos quais processos de reparo de

DNA são críticos para o desenvolvimento da LMC e como BCR-ABL atua na

desregulação dos mesmos.

II. OBJETIVOS _______________________________________________________________

29

II. Objetivos

II. OBJETIVOS _______________________________________________________________

30

O presente trabalho tem como objetivo primordial de avaliar a

importância da sinalização de BCR-ABL nas vias de reparo de quebras duplas

de DNA e na busca de novos alvos de BCR-ABL inseridos nessas vias de

sinalização.

Avaliar o status de ativação dos diferentes tipos de reparo de

quebras duplas de DNA

Esclarecer a participação das proteínas de HDR - MDC1, 53BP1 e

CtIP na possível modulação das vias de reparo promovida BCR-

ABL

Identificação de novos alvos de BCR-ABL envolvidos na

instabilidade genômica através da metodologia proteômica

III. MATERIAL E METODOLOGIAS _______________________________________________________________

31

III. Material &

Metodologias


32

1. Linhagens Celulares

Para entender o papel da expressão de BCR-ABL em células

leucêmicas humanas em cultura, utilizamos as linhagens celulares Mo7e, MBA

(Mo7e.BCR-ABLp210) e K562(Δ3’).

Mo7e é uma linhagem celular leucêmica proveniente de um paciente

com leucemia megacarioblástica aguda, cujo crescimento é dependente de

fatores de crescimento como IL-3 ou GM-CSF. Já a linhagem MBA foi obtida

através da transfecção estável de células Mo7e com o plasmídio pGD210

contendo o gene bcr-abl p210 (Sirard et al,1994; Berman et al, 2000). Ambas

as linhagens foram gentilmente cedidas pelo Dr. John Dick do departamento de

genética médica e molecular da Universidade de Toronto, Canadá.

As linhagens Mo7e e MBA foram cultivadas em meio de cultura

RPMI1640, suplementado com 15% (v/v) de soro fetal bovino, 100 U/mL de

penicilina, 100 ug/mL de estreptomicina e 2 mM L-glutamina. À cultura da

linhagem Mo7e foi adicionado 10 ng/mL de GM-CSF.

A linhagem K562(Δ3’), um sub-clone da linhagem leucêmica K562

transfectado de forma intracromossômica estável com o construto pHR-

EGFP/3’-EGFP (Akyüz et al, 2002) foi cultivada em meio de cultura RPMI1640,

suplementado com 12% (v/v) de soro fetal bovino, 2 mM L-Glutamina e 200

ng/ml de antibiótico Refobacin®.

As culturas foram mantidas em estufa úmida a 37°C e CO2 a 5%.

2. Tratamentos e Verificação da viabilidade celular

As culturas celulares, numa concentração de 4X105 células/mL, foram

incubadas com Mesilato de Imatinib (IM) em concentrações finais que variaram

de 0,1 µM a 2 µM.

Para a geração de lesões no DNA, predominantemente quebras duplas

de DNA, as células foram tratadas em dose de 6 Gy de radiação ionizante em

irradiador de fonte Césio 137. As células também foram submetidas a


33

tratamentos com droga genotóxica formadora de crosslinks no DNA, Mitomicina

C (250 ng/mL) (Sigma) e a droga radio-mimética Bleomicina (20 U/mL)

(Sigma).

A sobrevivência celular foi avaliada através de contagem com Azul de

Tripan nos tempos 48 e 72 horas pós-tratamento, utilizando hemocitometro

e/ou através do método colorimétrico WST-1 (Roche), um substrato que mede

a atividade metabólica de células viáveis, segundo instruções do fabricante.

3. Ensaio EGFP-FACS e Silenciamento

Para a análise dos diferentes mecanismos de reparo de DSBs entre as

células BCR-ABL positivas e negativas, foi utilizado o ensaio EGFP-FACS,

conforme descrito por Akyüz e colaboradores (Akyüz et al, 2002).

No presente estudo, foram utilizados os seguintes substratos

plasmidiais repórteres de reparo de DNA: EJ-EGFP (na avaliação das

freqüências de NHEJ), Δ-EGFP/5’EGFP (para recombinação homóloga, em

seqüências curtas de homologia), HR-EGFP/5’EGFP (para recombinação

homóloga, em seqüências longas de homologia), 5’EGFP/HR-EGFP (para

SSA), e Δ-EGFP/3’EGFP (para SSA e RH) (Figura 7). Mo7e e MBA foram

transfectadas por eletroporação com uma mistura de 10 µg (quando utilizados

5’EGFP/HR-EGFP, Δ-EGFP/3’EGFP ou EJ-EGFP) ou 60 µg (quando utilizados

Δ-EGFP/5’EGFP ou HR-EGFP/5’EGFP) do substrato plasmidial, com 10 µg de

plasmidio de expressão para a meganuclease I-SceI (pCMV-I-SceI) e 10 µg de

pBS, um plasmídio controle de preenchimento. A eletroporação foi feita a 220 V

e 1050 mF. A ilustração esquemática do ensaio EGFP-FACS com a

reconstituição do gene EGFP selvagem pode ser observada na figura 8.


34

FIGURA 7. Ilustração esquemática das construções plasmidiais repórter de reparo utilizados para análise das diferentes vias de reparo de DSBs. O ensaio monitora a reconstituição do gene EGFP selvagem após clivagem mediada pela meganuclease I-SceI. A clivagem ocorre entre os segmentos do gene EGFP mutados, nos sítios de reconhecimento de I-SceI (triângulos) levando a ativação dos processos de reparo e logo, a reconstituição do gene EGFP selvagem, sob o controle do promotor CMV (seta dobrada). No construto EJ-EGFP, o sítio de reconhecimento de I-SceI é flanqueado por regiões de micro-homologia contendo 5 pares de bases e permitindo a quantificação da via de NHEJ. Os segmentos do gene EGFP, 5’EGFP e 3’EGFP representam versões truncadas de EGFP que provêem seqüências para o desencadeamento do reparo de DSB da variante de EGFP clivada. Os construtos Δ-EGFP/5’EGFP (RH, homologias curtas) e HR-EGFP/5’EGFP (RH, homologias longas) foram utilizados para a análise da recombinação homóloga conservativa. 5’EGFP/HR-EGFP foi utilizado para a análise de SSA. Δ-EGFP/3’EGFP permitiu o monitoramento de ambos reparos conservativos – RH; e não conservativos – SSA.

Para analisar a reconstituição do gene selvagem EGFP, num âmbito

intra-cromossomial, a linhagem K562(Δ3’) sofreu eletroporapção, a 200V e

1050 mF, com 10 µg de pCMV-I-SceI e 10 µg pBS.


35

Em seguida às eletroporações, as células eram mantidas em cultivo

nos meios apropriados, desprovidos de antibióticos. Após 48 horas, as células

foram analisadas por citometria de fluxo - FACS® Calibur FACScan (Becton &

Dickinson).

FIGURA 8. Ilustração esquemática do ensaio EGFP-FACS, tomando como exemplo o plasmídeo HR-EGFP/5’EGFP. Com a formação de uma quebra dupla de DNA pela meganuclease I-SceI em seu sítio específico de reconhecimento, a maquinaria de reparo de DSBs presente na célula promove o reparo por recombinação homóloga, que leva à reconstituição da forma selvagem do gene EGFP. As células expressando proteínas EGFP são detectadas por citometria de fluxo dentro de uma população de células não fluorescentes, tornando assim possível detectar as freqüências de reparo de forma quantitativa.

Cada análise de cada linhagem foi acompanhada pelos mesmos

procedimentos de eletroporação e mesmas misturas de plasmídios, exceto por

incluir 10 µg de plasmídio contendo o gene selvagem EGFP no lugar do pBS.

As frações obtidas de células EGFP-positivas nesses controles foram utilizadas

como taxas de eficiência de transfecção.

Para silenciar a expressão de proteínas específicas e avaliar seus

efeitos junto às mensurações do reparo de DNA, foram utilizados construtos de


36

shRNA para CtIP (pRS-CtIP) e MDC1(pRS-MDC1). pRS-CtIP ou pRS-MDC1

foram co-transfectados com os substratos plasmidiais de reparo de DSBs. Para

as linhagens Mo7e e MBA, a mistura de plasmídios a ser transfectada era

constituída de: 60 µg de pRS-shCtIP, 10 µg pCMV-I-SceI, 10 µg pRS

(plasmídio controle de preenchimento) e 10 µg 5’EGFP/HR-EGFP ou Δ-

EGFP/3’EGFP. A linhagem K562(Δ3’), previamente tratada ou não com IM, foi

transfectada com 60 µg de pRS-shCtIP ou pRS-shMDC1, 10 µg pCMV-I-SceI e

10 µg pRS. Para a inativação da proteína RAD51 endógena em Mo7e, MBA e

K562(Δ3’), os mesmos protocolos de transfecção descritos acima para cada

linhagem foram feitos, porém utilizando 30 µg do construto pcDNA3.1-

Rad51SM e seu respectivo controle.

As taxas de eficiência de transfecção e normalização foram obtidas

conforme descrito acima.

As significâncias estatísticas das diferenças foram determinadas por

teste de Student’s T para amostras não pareadas.

4. RT-PCR e PCR em tempo real (QRT-PCR)

Para avaliar quantitativamente os níveis dos transcritos 53BP1, MDC1

e CtIP em Mo7e e MBA em resposta a diferentes condições de tratamento -

1µM Mesilato de Imatinib (IM) e/ou exposição a 6 Gy de radiação ionizante, e

amostras controle não tratadas - foram realizadas reações de PCR em tempo

real (QRT-PCR) utilizando os iniciadores específicos para cada gene: 53BP1

(F: 5’GCAGAACTTCCTGGAGCTCTG3’ R:

5’CTTCAGCACACTTCAGCACCG3’); MDC1(F:

5’ACCTGAGAACTCCACTACCCT3’ R:5’GGTCCCACCCATGTTCCAG3’); CtIP

(F: CCACTCAGACTTGTATGGAAAGAG R: CTATGTCTTCTGCTCCTTGCC);

O gene ACTB foi utilizado como controle endógeno de expressão utilizando os

iniciadores F: 5’CGCCAACACAGTGCTGTCT3’ e R:

CACGGAGTACTTGCGCTCAG.


37

RNAs foram extraídos e processados com reagente TRIzol®

(Invitrogen). Os RNAs totais obtidos foram tratados com DNAse Amplification

Grade I (Invitrogen) e reversamente transcritos com Superscript III Reverse

Transcriptase® (Invitrogen), seguindo instruções do fabricante. As QRT-PCRs

foram feitas com 1 ng de cDNA, 500 μM de cada oligonucleotideo iniciador e

com o corante SYBR GREEN (Power SYBR Green PCR Master Mix® - Applied

Biosystems) no termociclador ABI Prism 7000 termocycler (Applied

Biosystems). Os ciclos das PCRs foram: 95°C por 10 minutos, seguidos de 45

ciclos de 95ºC por 15 segundos e 60ºC por 1 minuto. Os níveis de mRNA foram

normalizados contra os níveis de mRNA para o gene ACTB. A variação dos

níveis de mRNA foi calculada usando o método ΔΔCt.

5. Preparação de extratos protéicos e Immunoblotting

Para verificar possíveis alterações da expressão de proteínas foi

empregada a metodologia Immunoblotting. Os extratos totais de proteínas

foram obtidos através de lise osmótica em tampão 50 mM Tris-HCl, pH 7.6; 150

mM NaCl; 2 mM EGTA; 2 mM EDTA; 25 mM ß-glicerolfosfato; 0,4% (v/v) NP-

40; coquetel de inibidores de protease (Roche Diagnostics). O tampão foi

colocado sob o sedimento celular previamente lavado em tampão fosfato-salino

(PBS), incubado por 30 minutos a 4ºC e, em seguida, foi feita centrifugação a

12000g por 30 minutos a 4ºC. O sobrenadante foi tomado como extrato total.

Para obtenção de extratos enriquecidos de proteínas nucleares, as

células foram submetidas, primeiramente à lise parcial (citoplasmática) com

tampão A (10 mM Tris-HCl pH 8, 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM

DTT, 0,08% (v/v) NP-40). O sedimento de núcleos foi obtido após centrifugação

a 2500 g por 5 minutos a 4ºC, o sobrenadante foi descartado, e foi então

colocado tampão C (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 400 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5

mM EGTA, 1,5 mM MgCl2, 25% (v/v) Glicerol) por 15 minutos a 4ºC. As

amostras foram centrifugadas a 12000 g por 15 minutos a 4ºC. O sobrenadante

foi tomado como extrato protéico enriquecido nuclear.


38

Os extratos protéicos foram quantificados por BCA protein assay kit

(Pierce) ou por reação de Bradford.

As proteínas foram resolvidas em gel de poliacrilamida, sendo em

seguida transferidas para membrana de nitrocelulose - Hybond-C Extra

membrane (GE Healthcare) - em sistema de transferência em tanque. Após

transferência, as membranas foram incubadas com anticorpos de interesse

permitindo identificar variações nos níveis protéicos.

Os anticorpos utilizados foram: anti-MDC1, anti-β-Actina (Santa Cruz

Biotech), anti-53BP1 e anti-S25-53BP1 (ABCAM), anti-CtIP (612L e 14-1,

ambas gentilmente doadas pelo Dr. Richard Baer – Columbia University

Medical Center e Santa Cruz Biotech). Os níveis protéicos foram normalizados

em relação à expressão da proteína β-Actina. A detecção do sinal de

expressão foi feita através da incubação com anticorpos conjugados com HRP

(Horseradish peroxidase) por quimiluminescência (ECL detection reagents® –

GE HealthCare, ou SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate -

Pierce) captada por autoradiograma.

6. Imunofluorescência

As linhagens celulares Mo7e e MBA, não tratadas e as submetidas a

diferentes tratamentos (RI, MMC e Bleomicina), foram fixadas em lâminas

previamente tratadas com poli-L-Lisina (Sigma) através de Cytospin (Shandon

Cytospin3®) a 550 rpm por 5 minutos. Para a visualização dos foci nucleares

de RPA foi necessário incubar as lâminas em solução de pré-extração gelada

(25 mM Hepes 7.4, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 3 mM MgCl2, 300 mM sucrose,

0,5% TritonX-100) por 2 minutos. A fixação foi feita imediatamente após

Cytospin em Metanol/Acetona (1:1) por 10 minutos a -20ºC ou em 3,7% de

solução Formaldeído em PBS em temperatura ambiente. As células foram

lavadas em PBS-T [tampão fosfato-salino adicionado de Triton® a 0,1% (v/v)]

por 3 vezes, 5 minutos cada, e em seguida bloqueadas em Soro Normal de

Cabra a 5%(v/v) em PBS por 1 hora em temperatura ambiente. Os anticorpos


39

primários anti-CtIP (1:20), anti-ɣH2AX (1:300), anti-53BP1 (1:300) e anti-RPA

(1:25) foram diluídos nas proporções indicadas em solução de bloqueio e foram

incubados junto as lâminas por 16 horas a 4ºC. As lâminas foram lavadas em

PBS-T por 3 vezes, 5 minutos cada, e incubadas com anticorpos secundários

conjugados a Cy3, FITC ou Alexa455 (Invitrogen) por 1 hora em temperatura

ambiente. Após lavar as lâminas por mais 3 vezes em PBS-T, os núcleos foram

corados em DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) e as lâminas foram

montadas com meios de montagem PPD (p-paraphenylenediamine) em glicerol

ou Mowiol®:DABCO (1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane) na proporção de 3:1. As

lâminas marcadas para 53BP1 e RPA foram visualizadas em microscópio de

fluorescência Olympus BX51 epifluorescence microscope, fotografadas pela

câmera Olympus XC10 e analisadas por CellF 2.5® analysis software/mFIP

software (Soft imaging system). Visualização, fotografia e análises de lâminas

marcadas para CtIP e ɣH2AX foram conduzidas em microscópio

ApoTome®Carl Zeiss® e no software Axio Vision.

7. Extração e Isolamento de Cromatina

Para obtenção de um extrato protéico nuclear enriquecido com

proteínas associadas à cromatina, as células foram primeiramente lavadas com

PBS e, em seguida, houve adição de Tampão A (10 mM HEPES pH 7,9, 10

mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 0,34 M sucrose, 10% glicerol, 1 mM DTT,

0,1% (v/v) Triton® e inibidores de protease) ao pellet de células que foi deixado

por 10 minutos a 4ºC. Um precipitado de núcleos (P1) foi obtido por

centrifugação a 1300g por 4 minutos a 4ºC. O sobrenadante com proteínas

citoplasmáticas (S1) foi removido. P1 foi lavado com Tampão A sem Triton® e

em seguida foram adicionados 200 µL do mesmo tampão com 25 U de

Microccocal nuclease para a fragmentação da cromatina. P1 foi incubado por

15 minutos a 37ºC. A reação foi interrompida pela adição de 5 mM de EGTA. O

sobrenadante contendo o extrato de cromatina (S3) foi obtido por centrifugação

a 1300g por 5 minutos.


40

8. Eletroforese Bidimensional

Os extratos de cromatina foram submetidos à precipitação mediante o

kit 2D-Clean up (GE Healthcare), segundo as orientações do fabricante. O

precipitado protéico resultante do 2D-Clean up kit, foi ressolubilizado em 200

µL de tampão de amostra/hidratação [7 M Uréia, 2 M Tiouréia, 2% (p/v) NP-40,

0,5% (v/v) Tampão IPG pH 4 – pH 7 (GE Healthcare), 15 mM DDT (ditiotreitol),

0,002% (p/v) azul de bromofenol].

A hidratação e a isoeletrofocalização foram feitas em IPG strips

(Immobilized pH gradient) (GE Healthcare) de matriz de poliacrilamida

contendo gradientes de pH que variam de pH 4 a pH 7 pelo sistema Ettan

IPGphor 3, segundo o programa:

ETAPA TEMPO (h) VOLTAGEM (V)

1 16 14

2 2 100

3 3 250

4 2 500

5 3 1000

6 2 6000

7 2 8000

8 1 6000

Após o término da isoeletrofocalização, as IPG strips foram

equilibradas em tampão de equilíbrio SDS [50 mM de Tris-HCl pH8.8, 6M uréia,

30% (v/v) glicerol, 2% (p/v) SDS, 0,002% (p/v)] em duas etapas:

Primeiramente, as IPG strips foram equilibradas com tampão de equilíbrio 1,


41

contendo 15mM DTT durante 15 minutos. Após esse tempo, o tampão 1 foi

substituído por tampão de equilíbrio 2, contendo 260mM de Iodoacetoamida,

por mais 15 minutos.

Após o equilíbrio, as IPG strips estavam prontas para serem

submetidas à segunda dimensão SDS-PAGE. Esta foi feita através do sistema

Multiphor® II Electrophoresis Unit em géis ExcelGel® (GE Healthcare) de

gradiente de poliacrilamida de 8%-18%.

A coloração empregada foi a Coomasie Coloidal: Imediatamente após a

eletroforese, o gel foi fixado em solução 30% (v/v) Etanol e 3% (v/v) Ácido

fosfórico, durante 40 minutos sob leve agitação. Após a fixação, o gel foi lavado

em solução 3% (v/v) de ácido fosfórico por duas vezes, durante 20 minutos

cada lavagem. Em seguida, o gel foi equilibrado durante 30 minutos em

solução 3% (v/v) ácido fosfórico, 18% (v/v) etanol e 15% (p/v) sulfato de

amônio. Transcorrido esse tempo, foi adicionado ao gel uma solução 3% (p/v)

de Coomassie Brilliant Blue G-250. O gel ficou sob esta condição durante

aproximadamente 48 horas.

Após a eletroforese bidimensional, os géis foram escaneados e

digitalizados pelo programa LabScan® (GE Healthcare), e analisados no

programa ImageMaster 2D Platinum® (Healthcare).

9. Espectrometria de massas

Os resultantes da eletroforese bidimensional foram retirados,

cortados em pequenos fragmentos e descorados com 200 µL de solução 40%

(v/v) acetonitrila, 25 mM de bicarbonato de amônio durante 30 minutos. Após

esse tempo, as amostras com solução descorante foram submetidas ao banho

sonicador durante 5 minutos. A solução descorante foi descartada e substituída

por uma nova, e o processo acima foi repetido por mais duas vezes. Os géis

foram então desidratados; foi adicionado Acetonitrila 100% por 10 minutos. A

acetonitrila foi removida. Para digestão trípitca, aos géis desidratados foram

colocados em 10 μL de solução de tripsina (Promega) (20 ng/μL em solução de


42

50 mM de bicarbonato de amônio), e foram mantidos a 4ºC durante 30 minutos.

Após a re-hidratação com a solução de tripsina, foram adicionados 10 μL de

solução 50 mM de bicarbonato de Amônio e as amostras sofreram digestão

durante 20 horas a 37˚C. A extração dos peptídeos resultantes da digestão foi

feita através da adição de solução de extração: 5% TFA, 50% ACN.

Para a identificação por espectrometria de massas, a solução contendo

os peptídeos extraídos foi misturada a uma matriz ácida (α-Cyano-4-

hydroxycinnamic acid) e submetida à espectrometria de massas em MALDI-

TOF-TOF Voyager 4700 (Applied Biosystems).

Os espectros obtidos foram analisados no banco de dados MASCOT.

IV. RESULTADOS _______________________________________________________________

43

IV. Resultados

IV. RESULTADOS _______________________________________________________________

44

1. Estabelecimento do Modelo de Estudo.

1.1 Avaliação da expressão de BCR-ABL.

Com o objetivo de validar os modelos celulares quanto à expressão

transcricional de BCR-ABL, foi feito RT-PCR para as células Mo7e, Mo7e.BCR-

ABL (MBA) e K562. Conforme mostrado na figura 9, a linhagem Mo7e mostrou

expressão negativa para o gene BCR-ABL enquanto as linhagens MBA e K562

mostraram expressão positiva.

FIGURA 9. Análise por RT-PCR da expressão transcricional de BCR-ABL nas linhagens celulares Mo7e, MBA e K562. A expressão transcricional do gene constitutivo GAPDH foi utilizada como controle.

1.2 Verificação da viabilidade celular em resposta ao tratamento com

Mesilato de Imatinib (IM)

Para avaliar e comparar a viabilidade celular entre células BCR-ABL

positivas e negativas ao tratamento com IM, inibidor da atividade cinásica de

BCR-ABL, as linhagens Mo7e, MBA e K562 foram tratadas com IM na

concentração de 1,0 µM. A sobrevivência celular foi determinada conforme

apresentado na figura 10. Foi demonstrada a sensibilidade das células BCR-

ABL positivas - MBA e K562 - ao tratamento com IM, onde essas mostraram

viabilidade em cerca de 10%-30% após 96 horas de tratamento, enquanto as

células BCR-ABL negativas – Mo7e - mantiveram sua viabilidade e

crescimento. Esse experimento foi importante para determinar o tempo ótimo

de tratamento para as futuras abordagens moleculares com estas linhagens, de

modo que se pudesse avaliar a eficácia do tratamento sem que houvesse uma

perda muito significativa da quantidade celular.

IV. RESULTADOS _______________________________________________________________

45

FIGURA 10. Viabilidade celular das linhagens Mo7e, MBA e K562 tratadas com

1 M de Mesilato de Imatinib após 24, 48, 72 e 96 horas.

1.3 Verificação da eficácia do tratamento de irradiação ionizante para

formação de DSBs

Para verificar a geração de DSBs e a eficiência das doses aplicadas,

primeiramente as linhagens Mo7e e MBA foram tratadas com doses crescentes

de radiação ionizante (0, 2, 6, 10 e 12 Gy) e tiveram suas viabilidades

verificadas após 48 e 72 horas. A partir das análises da viabilidade celular em

resposta aos tratamentos, foi escolhida a dose de 6 Gy, pois essa dose não

comprometia a viabilidade da cultura celular. Para verificar a eficiência da dose

escolhida na promoção de quebras duplas de DNA, as células foram irradiadas

a 6 Gy e, em seguida, foram fixadas em lâmina e submetidas ao ensaio de

imunofluorescência para visualização do marcador de DBSs, a histona H2AX

fosforilada em serina 139 em resposta a quebra (Paull et al, 2000). A figura 11

mostra a eficiente promoção da fosforilação de H2AX-Ser 139 após 30 minutos

de irradiação a 6 Gy.

IV. RESULTADOS _______________________________________________________________

46

FIGURA 11. Evidência da fosforilação da histona H2AX em resposta a tratamento com radiação ionizante. Células foram irradiadas a uma dose de 6Gy, deixadas em recuperação por 30 minutos antes de serem imobilizadas e fixadas em lâmina seguida de marcação com anticorpos para H2AX-Ser 139. Núcleos foram corados com DAPI.

2. Comparação das freqüências dos diferentes mecanismos de reparo

de quebras duplas de DNA entre Mo7e e MBA.

Estudos prévios mostraram individualmente o potencial efeito de BCR-

ABL no reparo de DSBs, utilizando em sua maioria, modelos murinos

(Slupianek et al, 2001; Brady et al, 2003; Cramer et al, 2008; Fernandes et al,

2009). Para analisar mais sistematicamente os efeitos da expressão de BCR-

ABL no reparo de DSBs em linhagens humanas, foi utilizado o ensaio EGFP-

FACS que permite a análise comparativa dos diferentes mecanismos de

reparo. O princípio dessa técnica consiste em monitorar a reconstituição do

gene EGFP selvagem, através de citometria de fluxo, pela quantificação de

células marcadas por fluorescência verde dentro de uma população não-

marcada.

O reparo de DNA é iniciado após a formação de DSB in vivo pela

expressão da meganuclease I-SceI que introduz uma quebra dupla única em

uma seqüência específica contida na construção plasmidial repórter de reparo.

IV. RESULTADOS _______________________________________________________________

47

Para discriminar entre as diferentes vias de reparo de DSBs, foram utilizados

diferentes construções plasmidiais que permitem a análise individual de NHEJ

(EJ-EGFP), SSA (5’EGFP/HR-EGFP), HR (HR-EGFP/5’EGFP, Δ-

EGFP/5’EGFP), e também o reparo geral direcionado por homologia (HDR),

isto é, SSA e RH (Δ-EGFP/3’EGFP) (Figura 7).

Para excluir os efeitos indiretos ao reparo relativos a variações na

transfecção, crescimento celular e mortalidade celular, paralelamente às

analises, foram feitas transfecções idênticas incluindo a construção plasmidial

contendo o gene EGFP selvagem. As taxas de transfecções individuais servem

para normalizar cada experimento de análise de freqüências de reparo de

DSBs.

No presente estudo, inicialmente comparamos as freqüências de

reparo de DSBs entre as linhagens humanas isogênicas Mo7e e MBA. Ambas

foram transfectadas com as construções plasmidiais repórter de reparo

individuais, juntamente com a meganuclease I-SceI.

Conforme mostrado na figura 12, as freqüências de reparo de DSBs em

MBA estão aumentadas 3 vezes (P=0.0291) para NHEJ (A), 2.2 vezes

(P=0.0125) para SSA (B), e 2,3 vezes (P=0.0218) para o reparo direcionado

por homologia (HDR) – RH e SSA (C), em comparação com as freqüências

obtidas nas células Mo7e. No entanto, as freqüências para RH conservativa

tanto para homologias curtas (D) (P=0.9913) e longas (E) (P=0.7793)

mostraram-se equivalentes entre Mo7e e MBA.

IV. RESULTADOS _______________________________________________________________

48

FIGURA 12. Freqüências de reparo de DSBs em Mo7e e MBA. As linhagens foram cotransfectadas com plasmídio de expressão de meganuclease pCMV-I-SceI e com as construções repórteres para quantificação das freqüências de reparo de DSBs por (A) NHEJ, (B) SSA, (C) reparo direcionado por homologia (HDR) que compreende os mecanismos SSA e RH, (D) RH em homologias curtas, ou (E) RH em homologias longas. 48 horas após a transfecção as freqüências foram determinadas como as frações de células marcadas por fluorescência em uma população total por citometria de fluxo. *P<0.05.

Para delinear mais profundamente os mecanismos de reparo de DSBs

por HDR afetados por BCR-ABL, foram feitas análises utilizando o substrato Δ-

EGFP/3’EGFP, o qual promove tanto RH quanto SSA, em combinação com a

inativação da proteína RAD51, o elemento central na formação do filamento

nucleoproteico de recombinação. Esse método já bem estabelecido em células

humanas BCR-ABL positivas (Lambert et al 2000; Uhl et al 2010) foi feito a

partir da co-transfecção do vetor pcDNA3.1-Rad51SM, codificante para a

expressão do dominante-negativo de RAD51(RAD51SM), juntamente com o

plasmídio de expressão para I-SceI e o construto Δ-EGFP/3’EGFP, repórter

IV. RESULTADOS _______________________________________________________________

49

para SSA e RH. Os resultados mostrados na figura 13 mostraram que a

expressão de RAD51SM causou redução de cerca de 80% das freqüências de

reparo de DSB em Mo7e (P=0.023). Contudo, não foram observadas

mudanças significativas nas freqüências em MBA. O resultado sugere que a

RH foi a via predominante para o reparo de DSB em Mo7e, enquanto em MBA,

a via de RH demonstrou não contribuir significativamente nas freqüências

aumentadas de reparo nessas células.

FIGURA 13. Freqüências de reparo de DSBs obtidas após 48 horas de co-transfecção de Mo7e e MBA com construções plasmidiais repórteres para quantificação das freqüências de HDR – SSA e RH, pCMV-I-SceI e plasmídio de expressão da forma dominante negativa da proteína RAD51 (RAD51SM). *P<0.05; **P<0.01.; ***P<0.001

Os resultados acima sugerem então que BCR-ABL modula

positivamente as vias de reparo de DSBs não fiéis (SSA e NHEJ), mas não

afeta o mecanismo de alta fidelidade – RH. Ainda, o tratamento de MBA com o

composto inibitório da atividade tirosina quinase de BCR-ABL, o mesilato de

imatinib – IM, extinguiu o aumento das freqüências de SSA detectados em

MBA quando comparadas as freqüências de Mo7e (Figura 14). Essa

observação sugere que a fosforilação de alvos de BCR-ABL é necessária para

o efeito de BCR-ABL nas vias de reparo de DSBs.

IV. RESULTADOS _______________________________________________________________

50

FIGURA 14. Freqüências de SSA foram analisadas conforme descrito na figura 11 em Mo7e e MBA, sendo MBA tratada ou não com IM (0,25 µM) 24 horas antes da transfecção. **P<0.01.

Para verificar e confirmar o papel de BCR-ABL nas vias de HDR foi

utilizado um segundo sistema experimental utilizando a linhagem K562(Δ3’).

Essa é uma derivada da conhecida e bem caracterizada linhagem humana de

leucemia mielóide crônica BCR-ABL positiva (Figura 9), K562, contendo o

construto Δ-EGFP/3’EGFP integrado de forma estável (Akyüz et al, 2002).

Primeiramente as células K562(Δ3’) foram tratadas com doses

crescentes de IM, 0,1 µM, 0,25 µM e 0,5 µM, por 24 horas, e em seguida,

foram transfectadas com o plasmídio de expressão para I-SceI. Após mais 24

horas, as freqüências de reparo de DSBs foram obtidas. Os resultados indicam

que o reparo de DSBs declina de forma dose-dependente, atingindo

significância estatística a 0,25 µM IM (P=0.0257); sendo ainda um declínio mais

acentuado observado em 0,5 µM IM (P=0.0089) (Figura 15).

IV. RESULTADOS _______________________________________________________________

51

FIGURA 15. Freqüências de reparo de DSBs na linhagem K562(Δ3’) em resposta ao tratamento com IM. A linhagem derivada de K562, K562(Δ3’) com

o substrato de recombinação -EGFP/3’EGFP integrado ao cromossomo, foi tratada com doses crescentes de IM (0,1 µM, 0,25 µM e 0,5 µM) por 24 horas, e em seguida transfectadas com plasmídio de expressão de meganuclease pCMV-I-SceI. 48 horas depois as freqüências foram determinadas por citometria de fluxo. As diferenças estatísticas marcadas por asteriscos se referem aos valores de amostras tratadas com IM em relação à amostra controle.*P<0.05; **P<0.01.

Visto que BCR-ABL também regula a ativação de pontos de checagem

do ciclo celular e os mecanismos de apoptose (Burke e Carroll, 2010), seria

desejável excluir uma potencial influência indireta desses mecanismos no

reparo de DSBs. Dessa forma, experimentos de mensuração de reparo de

DSBs associados ao aumento das concentrações de IM foram refeitos, agora

na presença da molécula inibidora de caspases, ZVAD-fmk. As freqüências de

reparo não diferem entre as células tratadas ou não com ZVAD-fmk, com ou

sem exposição concomitante ao IM (Figura 16A). A fração de células em sub-

G1 do ciclo celular, um indicativo de apoptose, mostrou significância estatística

entre células tratadas ou não com ZVAD-fmk apenas em virtude de uma mais

alta concentração de IM a 0,5 µM (P=0.0148) (Figura 16B). Já a distribuição

das células de acordo com as fases do ciclo celular não foi alterada

significativamente, nem em resposta a ZVAD-fmk, nem por exposição ao IM

IV. RESULTADOS _______________________________________________________________

52

(Figura 16C). Esses dados fazem dos possíveis efeitos de BCR-ABL por

alteração do crescimento ou morte celular, muito improváveis. Ainda, a dose de

0.25µM de IM foi escolhida para proceder com os experimentos seguintes, pois

o tratamento mostrou significativa alteração das freqüências de reparo de

DSBs, sem mudanças significativas na fração de células em apoptose ou nas

diferentes fases do ciclo G1, S ou G2.

FIGURA 16. Freqüências de reparo de DSBs na linhagem K562(Δ3’) em resposta ao co tratamento de IM com o inibidor de caspase ZVAD-fmk (ZVAD). (A) Células foram tratadas ou não, com IM e ou ZVAD-fmk e, 24 horas após o tratamento, foram transfectadas com pCMV-I-SceI; o reparo de DSB foi analisado conforme descrito na figura 14.(B) Apoptose foi analisada por citometria de fluxo, com a determinação da quantidade de células marcadas por iodeto de propídio, presentes na fase sub-G1. As células foram previamente tratadas com IM e/ou ZVAD-fmk, como descrito em (A). (C)

IV. RESULTADOS _______________________________________________________________

53

Distribuição das fases do ciclo celular em resposta a IM. A análise do ciclo celular foi feita com células processadas como em (B). Células viáveis foram subdivididas em populações nas fases do ciclo celular G1, S e G2 (%). As diferenças estatísticas marcadas por asteriscos em (A) se referem aos valores de amostras tratadas com IM em relação às respectivas amostras controle. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001.

Para determinar a contribuição da via de RH dependente de RAD51

nas vias de HDR estimuladas por BCR-ABL em K562(Δ3’), as células foram

tratadas com IM por 24 horas, ou deixadas sem tratamento. RAD51 dominante

negativa (RAD51SM) foi co-expressada com a meganuclease I-SceI. Conforme

esperado, as freqüências de reparo de DSBs em células tratadas com IM

mostraram-se novamente diminuídas significativamente (P=0.0055) (Figura 16).

A expressão de RAD51SM também causou redução do reparo de DSBs nas

células não tratadas, no entanto, a significância estatística não foi atingida

(P=0.1163). Em resposta ao co-tratamento com IM, as freqüências de reparo

de DSBs não se mostraram mais reduzidas ou alteradas por RAD51SM. Isso

pode ser devido ao fato que os valores prévios já estavam próximos ao limite

de detecção do sistema. A comparação do reparo de DSBs entre as células

K562(Δ3’)/RAD51SM tratadas e não tratadas com IM, mostrou que a inibição

da atividade quinásica, novamente diminuiu significativamente as freqüências

de reparo (P=0.0345) (Figura 17).

FIGURA 17. Freqüências de reparo de DSBs na linhagem K562(Δ3’) em resposta a expressão da forma dominante-negativa de RAD51. As células foram previamente tratadas por 24 horas com IM (0,25 µM), seguida da co-transfecção de pCMV-I-SceI com o plasmídio de expressão da forma dominante-negativa de RAD51 (RAD51SM). As freqüências de reparo foram obtidas após 48 horas.

IV. RESULTADOS _______________________________________________________________

54

Estes resultados suportam para a linhagem K562 as prévias

conclusões obtidas com as linhagens Mo7e e MBA, indicando que BCR-ABL

estimula significativamente o HDR, no entanto o HDR RAD51-independente, ou

seja, os mecanismos mutagênicos parecem ter um papel predominante. Ainda,

o uso de substratos de reparo de DSBs tanto intracromossomiais quanto

extracromossomiais mostram que esse efeito é independente dos

componentes da cromatina, enfatizando o envolvimento das proteínas da

maquinaria de reparo.

3. Avaliação dos níveis transcricionais de genes envolvidos nos

mecanismos de reparo de DNA e controle do ciclo celular

A partir das recentes evidências que BCR-ABL parecer modular

positivamente NHEJ e SSA, processos de reparo de DNA propensos a erros,

através da regulação dos componentes da maquinaria de reparo de DSBs, foi

monitorada a expressão de fatores críticos envolvidos na iniciação dos

mecanismos de reparo e/ou os processos de escolha entre eles (Bennardo et

al 2008, Bartek e Hodny, 2010; Bunting et al, 2010).

A figura 18 mostra as variações dos níveis transcricionais de MDC1

(A), 53BP1 (B), e CtIP (C) em função dos estados controle ou inibidos de BCR-

ABL e em resposta a indução de quebras duplas de DNA.

Para avaliar os níveis de expressão de mRNA por PCR em tempo real

(RT-qPCR) em Mo7e e MBA, essas foram previamente tratadas com radiação

ionizante (RI) e/ou com IM. As células foram irradiadas com uma dose de 6Gy,

tratadas com 1 µM de IM, ou tratadas com IM seguida de irradiação 24 horas

após tratamento (IM+RI). Extratos de RNA totais foram obtidos após 24 horas

de tratamento e em seguida a síntese dos respectivos cDNAs, RT-qPCR foi

realizado. Nestas análises comparativas de níveis de expressão, tomamos

como significativas as variações aumentadas ou diminuídas ao menos 2 vezes.

Os níveis de expressão obtidos correspondentes aos controles em Mo7e foram

tomados como 100% e os níveis de expressão relativos foram calculados.

IV. RESULTADOS _______________________________________________________________

55

FIGURA 18. Análise quantitativa dos níveis transcricionais por PCR em tempo real. As linhagens Mo7e e MBA foram tratadas com radiação ionizante (RI) em uma dose de 6 Gy, 1 µM de IM, com ambos, ou não tratadas. Após 24 horas, RNA foi extraído, cDNAs sintetizados e o nível de expressão dos mRNAs dos genes (A) MDC1, (B) 53BP1 e (C) CtIP, foram determinados por PCR em tempo real. Os níveis de expressão obtidos em Mo7e controle, foram tomados como 100% e níveis de expressão relativos foram calculados.

Enquanto os níveis de mRNA de MDC1 em Mo7e permaneceram

inalterados em resposta às diferentes exposições, foi observado em MBA um

aumento acima de 5 vezes em resposta a IM e IM+RI (Figura 18A). Os níveis

de mRNA de 53BP1 também permaneceram inalterados em resposta aos

tratamentos em Mo7e. No entanto, um aumento de 2 vezes em resposta a RI, 5

vezes em resposta a IM e 2 vezes em resposta a IM+RI foram encontrados em

MBA.

Os níveis transcricionais de CtIP aumentaram 3 vezes em MBA e

diminuíram em 2 vezes em Mo7e, em resposta a RI. Não foram observadas

alterações significativas entre as linhagens em resposta a IM ou IM+RI.

IV. RESULTADOS _______________________________________________________________

56

4. Avaliação dos níveis de proteínas envolvidas nos mecanismos de

reparo de DNA e controle do ciclo celular

Em seguida à avaliação dos níveis trancricionas foram feitas análises

comparativas dos níveis protéicos em extratos enriquecidos de núcleo de Mo7e

e MBA; e em extratos totais obtidos de células K562(Δ3’) (Figura 19). As

células MBA foram sujeitas aos mesmos tratamentos conforme descritos para

ensaios de RT-qPCR e Mo7e foi irradiada a 6 Gy (Figura 19A); e K562(Δ3’) foi

tratada com IM (1 µM) (Figura 19B).

FIGURA 19. Análise da expressão protéica por Immunoblotting. (A) Extratos nucleares enriquecidos foram obtidos de Mo7e e MBA tratadas com radiação ionizante e/ou IM, conforme descrito para a figura 17, e submetidos a immunoblotting utilizando anticorpos contra 53BP1, 53BP1 Fosfo-Serina 25 (S25), CtIP, ou MDC1. (B) K562(Δ3’) foram tratadas com 1 µM de IM por 24 horas ou não tratadas. Os lisados totais foram também submetidos ao immunoblotting, utilizando anticorpos contra 53BP1, MDC1 e CtIP. Β-Actina foi utilizada como controle quantitativo.

Observando a expressão protéica de 53BP1 e MDC1 (Figura 19A),

essas se mostraram aumentadas em Mo7e em comparação a MBA,

indiferentemente ao tratamento com irradiação. O tratamento de MBA com IM,

IV. RESULTADOS _______________________________________________________________

57

também, independentemente, ao tratamento com irradiação, reconstituiu a

expressão de 53BP1 a níveis similares aos observados em Mo7e. Por outro

lado, a recuperação da expressão de MDC1 não foi observada sob as mesmas

condições de tratamento. Ao examinar a fosforilação da serina 25 em 53BP1,

que representa um evento de sinalização catalizado por ATM (Schultz et al,

2000; Ward et al, 2003) com relevância potencial para as funções de 53BP1

em resposta a lesões no DNA, notamos a fosforilação em Mo7e em resposta a

irradiação. Entretanto, essa modificação induzida por lesões estava ausente

em MBA irradiada, tratada ou não com IM, mesmo tendo o tratamento com IM

reconstituído os níveis de 53BP1 em MBA equivalentes a linhagem parental.

Em razão da fosforilação em serina 25 em 53BP1 ter sido reportada

como correlacionada com a sua formação de foci (Kang et al, 2009), foram

verificados se a falta da fosforilação da serina 25 em MBA afetaria a formação

de foci de 53BP1 no núcleo. Conforme mostrado na Figura 20, foi testada a

capacidade de formação de foci de 53BP1 em resposta ao agente genotóxico

mitomicina C (MMC), que leva a formação de lesões, predominantemente de

DSBs, através da formação de ligações covalentes entre a droga e as duas

fitas de DNA, que provoca assim a formação de DSBs. Foram contabilizados

14,4 foci por célula em Mo7e e 6,8 em MBA. Assim, o resultado sugere que a

associação de 53BP1 em foci mostrou-se funcional em MBA, porém a evidente

diminuição no número de foci reflete a redução da expressão de 53BP1.

IV. RESULTADOS _______________________________________________________________

58

FIGURA 20. Formação de foci de 53BP1 em Mo7e e MBA. A formação de foci nucleares de 53BP1 foi quantificada em Mo7e e MBA em resposta ao tratamento com o agente genotóxico “cross-linkers” Mitomicina C por 24 horas. Imunufluorescencia foi realizada utilizando anticorpos contra 53BP1. Aproximadamente 200 núcleos foram analisados para cada linhagem, e o número médio de foci foi calculado. Núcleos foram corados com DAPI.

Os níveis protéicos de CtIP (Figura 19A) mostraram-se aumentados em

MBA comparada a Mo7e, particularmente após tratamento com RI,

similarmente aos resultados obtidos pela análise da expressão de CtIP também

em resposta a RI (Figura 18C). Já o tratamento de MBA com IM suprimiu

completamente a expressão protéica de CtIP.

Nas linhagens K562(Δ3’), não foram observadas variações nas

expressões de 53BP1 e MDC1 em resposta ao tratamento com IM. Em

contraste, a expressão de CtIP foi quase extinta em resposta ao IM (Figura

19B).

Como a expressão protéica de CtIP mostrou-se aumentada em MBA,

em especial após a irradiação, e foi eliminada em resposta ao tratamento com

IM tanto em MBA quanto em K562, CtIP tornou-se um candidato a mediador da

regulação de BCR-ABL nos mecanismos de reparo de DSBs.

IV. RESULTADOS _______________________________________________________________

59

5. Análise do possível papel de CtIP na promoção do reparo

mutagênico de DSBs.

Para testar se CtIP está funcionalmente implicada no aumento de SSA

apresentado pelas células BCR-ABL positivas, a expressão de CtIP foi

silenciada por RNA de interferência em Mo7e e MBA. Dessa forma, as células

foram co-transfectadas com o plasmídio repórter para SSA, 5’EGFP/HR-EGFP,

meganuclease I-SceI e plasmídio silenciador pRS-shCtIP, e a avaliação das

freqüências de reparo de DSBs foram feitas após 48 horas. Paralelamente, o

substrato Δ-EGFP/3’EGFP também foi utilizado para análise combinada de RH

e SSA. Controles foram transfectados com plasmídio de preenchimento pRS no

lugar de pRS-shCtIP.

Como já demonstrado anteriormente, para esse experimento, MBA

mostrou novamente sua freqüência de SSA aumentadas em relação a Mo7e

(P=0.0083) (Figura 21A). O silenciamento da expressão de CtIP em MBA levou

a diminuição significativa (P=0.0191) da freqüência de SSA, eliminando

completamente a freqüência vantajosa de SSA em MBA em relação a Mo7e

(P=0.0568). O silenciamento de CtIP não gerou efeito significativo em Mo7e

(P=0.2231).

De forma similar a figura 21A, o silenciamento de CtIP também resultou

no descréscimo das freqüências de reparo em MBA em relação a MBA controle

(P=0.0052), utilizando o substrato Δ-EGFP/3’EGFP(HR+SSA) (Figura 20B).

Não foram observadas diferenças significativas nas freqüências de reparo em

Mo7e em resposta ao silenciamento de CtIP (P=0.2784).O silenciamento de

CtIP foi verificado por immunoblotting, como mostrado na figura 20C.

Estes resultados sugerem que CtIP é necessário no enriquecimento

das freqüências de SSA por BCR-ABL.

IV. RESULTADOS _______________________________________________________________

60

FIGURA 21. Freqüências de reparo de DSBs em Mo7e e MBA após silenciamento de CtIP. As linhagens Mo7e e MBA foram submetidas a análise de reparo de DSBs em resposta a transfecção com shRNA direcionado ao silenciamento de CtIP, pRS-shCtIP. As transfecções ainda incluíram (A) 5’EGFP/HR-EGFP para a análise de SSA ou (B) Δ-EGFP/3’EGFP para análise de SSA e RH, e pCMV-I-SceI. Nos controles, plasmídio de preenchimento vazio pRS foi adicionado a mistura de transfecção no lugar de pRS-shCtIP.As freqüências de reparo de DSBs foram determinadas 48 horas após a transfecção por citometria de fluxo. *P<0.05; **P<0.01. (C) Para verificar a eficiência de silenciamento da expressão de CtIP, extratos protéicos totais foram submetidos a immunoblotting utilizando anticorpos anti-CtIP, 48 horas após os ensaios de silenciamento descritos em (A). β-Actina foi utilizada como controle quantitativo.

Para confirmar os resultados acima em um tipo celular distinto, foram

executados experimentos de silenciamento contra a expressão de CtIP em

K562(Δ3’). Como anteriormente, a atividade quinásica de BCR-ABL foi inibida

pelo tratamento prévio com IM por 24 horas. Em seguida, as células foram

transfectadas com plasmídio de expressão I-SceI e pRS-shCtIP e submetidas

à análise do reparo de DSBs. Amostras controle foram transfectadas com

plasmídio pRS. A avaliação das freqüências de reparo de DSBs foi obtida após

IV. RESULTADOS _______________________________________________________________

61

48 horas (Figura 22) e mostraram que o reparo em K562(Δ3’) apresentou-se

novamente diminuído significativamente em resposta ao tratamento com 0,25

µM de IM (P=0.0289). O silenciamento da expressão de CtIP em K562(Δ3’)

causou uma diminuição no reparo de DSB (P=0.0243) em uma extensão

semelhante a observada nas células tratadas com IM. Não foram observadas

variações entre K562(Δ3’) tratadas por IM, quando silenciadas ou não por CtIP

(P=0.7688).

FIGURA 22. Freqüências de reparo de DSBs em K562(Δ3’) após silenciamento de CtIP. As células K562(Δ3’) foram tratadas com 0.25µM IM, ou não tratadas. 24 horas após tratamento, as células foram co-transfectadas com pCMV-I-SceI e pRS-shCtIP. (A) Freqüências de reparo de DSBs em resposta ao silenciamento de CtIP foram analisadas 48 horas após a transfecção. Nos controles, plasmídio de preenchimento vazio pRS, foi adicionado a mistura de transfecção no lugar de pRS-shCtIP. (B) Para verificar a eficiência de silenciamento da expressão de CtIP, extratos protéicos totais foram submetidos a immunoblotting utilizando anticorpos anti-CtIP, 48 horas após os ensaios de silenciamento descritos em (A). β-Actina foi utilizada como controle quantitativo .*P<0.05.

Estes resultados provêem mais evidências para a importância de CtIP

na promoção de SSA downstream a BCR-ABL. Para estabelecer mais pontos

de comparação, também foram testados experimentos de RNA de interferência

IV. RESULTADOS _______________________________________________________________

62

direcionados a MDC1 ou 53BP1. Para ambos os casos, as freqüências de

reparo de DSBs não mostraram alterações significativas em resposta aos

silenciamentos, e o IM exerceu efeito na diminuição do reparo de DSBs como

observados anteriormente (Figura 23A e B). A eficiência do silenciamento de

CtIP, MDC1 e 53BP1 em K562(Δ3’) foi demonstrada por immunoblots

conforme mostrada na figura 23C.

FIGURA 23. Freqüências de reparo de DSBs em K562(Δ3’) após silenciamento de MDC1 e 53BP1. As células K562(Δ3’) foram tratadas com 0,25 µM IM, ou não tratadas. 24 horas após tratamento, as células foram co-transfectadas com pCMV-I-SceI e pRS-shMDC1 ou pRS-sh53BP1. Freqüências de reparo de DSBs em resposta ao silenciamento de (A) MDC1 e (B) 53BP1 foram analisadas 48 horas após a transfecção. Nos controles, plasmídio de preenchimento vazio pRS, foi adicionado a mistura de transfecção no lugar de pRS-shCtIP. (C) Para verificar a eficiência de silenciamento da expressão de MDC1 E 53BP1, extratos protéicos totais foram submetidos a immunoblotting utilizando anticorpos apropriados, 48 horas após os ensaios de silenciamento descritos acima. β-Actina foi utilizada como controle quantitativo. **P<0.01; ***P<0.001

IV. RESULTADOS _______________________________________________________________

63

Diversas linhas de evidência apontam o papel crítico de CtIP na

promoção do processamento e ressecção das extremidades quebradas de

DNA, necessários para a continuidade do HDR (Takeda et al, 2007; You et al,

2009). O processo de SSA requer a geração de extremidades em fita-simples

por atividade de uma nuclease, e essas extremidades em fita simples são

subseqüentemente recobertas pela proteína RPA. Essa função nucleásica e o

recrutamento de RPA têm sido atribuídos a CtIP (You et al, 2009). Para

investigar a dinâmica da formação de foci RPA em Mo7e e MBA, as linhagens

foram tratadas com a droga radiomimética Bleomicina em uma dose de 40

U/mL. Após, uma, três e seis horas de tratamento, as células foram fixadas e

experimentos de imunofluorescencia utilizando anticorpos contra RPA foram

realizados. Uma hora após tratamento, o número médio de foci foi de 10,7 em

MBA e 16,2 foci em MBA. Três horas após tratamento foram contabilizadas

15,7 versus 27,9, e após seis horas 19,3 versus 27,6 foram quantificadas em

Mo7e e MBA, respectivamente (Figura 24) Concluindo, o aumento das

formações de foci em RPA em MBA em todos os pontos analisados, é

consistente com a sugerida ativação de CtIP por BCR-ABL, sendo também um

pré-requisito para o aumento de SSA.

IV. RESULTADOS _______________________________________________________________

64

FIGURA 24. Formação de foci de RPA em resposta a tratamento radiomimético. As linhagens Mo7e e MBA foram tratadas com 40U/mL da droga radiomimética Bleomicina por 1, 3 e 6 horas antes de serem fixadas e submetidas a ensaio de imunofluorescência utilizando anticorpos anti-RPA. A formação de foci foi analisada e quantificada em pelo menos 30 núcleos. No painel à direita, formação de foci de RPA após 3 horas de tratamento; núcleos foram corados com DAPI

6. Comparação dos perfis proteômicos de extratos de cromatina entre

Mo7e e MBA.

Com o objetivo de identificar possíveis novos alvos de modulação de

BCR-ABL relativos aos processos de reparo de DNA e controle de ciclo celular

em resposta ao reparo, foram comparados perfis proteômicos de extratos

enriquecidos de cromatina das linhagens Mo7e e MBA.

A comparação dos mapas protéicos bidimensionais, mostrados na

figura 25, permitiu encontrar 43 proteínas diferencialmente expressas entre as

linhagens Mo7e e MBA. Sendo 10 em Mo7e e 33 em MBA. As proteínas

diferencialmente expressas foram processadas para análise e identificação por

espectrometria de massas. As proteínas identificadas com sucesso estão

descriminadas na Tabela 1.

IV. RESULTADOS ________________________________________________________________________________________________________

65

FIGURA 25. Mapas protéicos bidimensionais de extratos enriquecidos de cromatina das linhagens Mo7e e MBA. As proteínas foram resolvidas em gel de gradiente de pH entre 4 e 7 – para primeira dimensão; em seguida submetidas a separação por gel SDS-PAGE de gradiente de 8%-18% - para segunda dimensão. O método de coloração empregado foi Coomassie Coloidal. As proteínas em destaque estão diferencialmente expressas entre os mapas e foram identificados por espectrometria de massas.

IV. RESULTADOS ________________________________________________________________________________________________________

66

# Spot #IPI PM (Da)* PI* Score Nome Função

1 IPI00219839 65156 5.89 33 HIC2 Isoform 2 of Hypermethylated in cancer 2 protein Repressor Transcricional 2 IPI00219839 65156 5.89 56 HIC2 Isoform 2 of Hypermethylated in cancer 2 protein Repressor Transcricional 3 IPI00219839 65156 5.89 45 HIC2 Isoform 2 of Hypermethylated in cancer 2 protein Repressor Transcricional 4 IPI00219839 65156 5.89 47 HIC2 Isoform 2 of Hypermethylated in cancer 2 protein Repressor Transcricional 5 IPI00012048 17309

5.83 298 NME2 Nucleoside diphosphate kinase A

Sinalização celular; proliferação, diferenciação,

desenvolvimento 6 IPI00024919

28017

7.67 113 PRDX3 Thioredoxin-dependent peroxide reductase Regulação redoxi

7 IPI00020436

24588

5.64 62 RAB11B Ras-related protein Rab-11B

GTPase envolvida no trafego endossomal

8 IPI00014230

31742

4.74 88 C1QBP Complement component 1 Q subcomponent-binding protein

Não definida

9 IPI00014230

31472 4.74 130 C1QBP Complement component 1 Q subcomponent-binding protein

Não definida

10 IPI00021263

27899

4.73 297 YWHAZ 14-3-3 protein zeta/delta

Sinalização celular, Proteína adaptadora

11 IPI00021263

27899

4.73 248 YWHAZ 14-3-3 protein zeta/delta

Sinalização celular, Proteína adaptadora

12 IPI00021700

29092

4.57 71 PCNA Proliferating cell nuclear antigen

Sinalização, controle da proliferação celular

13 IPI00010779

28619

4.67 154 TPM4 Isoform 1 of Tropomyosin alpha-4 chain Estabilização do citoesqueleto

14 IPI00019755

27833

6.23 90 GSTO1 Glutathione transferase omega-1

Tiol Transferase dependente de glutationa

15 IPI00015842

38866

4.86 178 RCN1 Reticulocalbin-1 precursor

Regulação do cálcio no lúmen do retículo endoplasmático

16 IPI00020956

26886

4.70 64 HDGF Hepatoma-derived growth factor

Atividade mitogênica; repressor transcricional

17 IPI00302592

282581

5.69 53 FLNA filamin A, alpha isoform 1

Ancora proteínas transmembrana ao citoesqueleto

18 IPI00302592

282581

5.69 76 FLNA filamin A, alpha isoform 1

Ancora proteínas transmembrana ao citoesqueleto

19 IPI00010796 57480 4.76 441 P4HB Protein disulfide-isomerase precursor Cataliza o rearranjo de ligações dissulfeto em

IV. RESULTADOS ________________________________________________________________________________________________________

67

proteínas 20 IPI00008223

43202

4.79 35 RAD23B UV excision repair protein RAD23 homolog B

Envolvida no reparo de DNA por excisão; via de

degradação proteossomica 21 IPI00024502

63869

5.14 36 UBQLN4 Ubiquilin-4

Não conhecida; Alvo de fosforilação de ATM/ATR

em resposta a lesões no DNA 22 IPI00071180 59183 5.01 97 UBQLN1 Isoform 2 of Ubiquilin-1

Metabolismo do Citoesqueleto

23 IPI00013881

49484

5.89 261 HNRNPH1 Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H

Compomente do complexo heterogeneous nuclear ribonucleoprotein (hnRNP)

24 IPI00013068

52587

5.71 64 EIF3E Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit E

Componente do cpmplexo eukaryotic translation initiation factor 3 (eIF-3)

25 IPI00216049

51230

5.39 83 HNRNPK Isoform 1 of Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K


26 IPI00216049

51230

5.39 36 HNRNPK Isoform 1 of Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K


27 IPI00471955

40801

6.07 137 HLA-B;HLA-A;HLA-C;LOC441528;XXbac-BPG181B23.1;LOC728687;MICA;LOC100133382 H

Envolvida na apresentação de antígenos ao sistema imune

28 IPI00604664

80443

5.89 43 NDUFS1 NADH-ubiquinone oxidoreductase 75 kDa subunit, mitochondrial precurs

Regulação redoxi

29 IPI00025252 57146 5.98 127 PDIA3 Protein disulfide-isomerase A3 precursor Cataliza o rearranjo de ligações

dissulfeto em proteínas

30 IPI00257508 62711 5.95 122 DPYSL2 Dihydropyrimidinase-related protein 2

Participa do remodelamento do citoesqueleto

31 IPI00030730 34871 5.57 121 SULT1A4 Phenol sulfotransferase 1A5*1A Sulfotransferase

32 IPI00015018 33095 5.54 118 PPA1 Inorganic pyrophosphatase Fostatase Inorgânica

33 IPI00003815 23250 5.02 90 ARHGDIA Rho GDP-dissociation inhibitor 1 Sinalização Celular; Regula o intercâmbio GDP/GTP

em proteínas Rho

34 IPI00299571

54380

5.17 195 PDIA6 Isoform 2 of Protein disulfide-isomerase A6 precursor

Cataliza o rearranjo de ligações dissulfeto em proteínas

IV. RESULTADOS ________________________________________________________________________________________________________

68

35 IPI00401264 47341 5.09 78 TXNDC4 Thioredoxin domain-containing protein 4 precursor Controle da oxidação do dobramento protéico no RE

36 IPI00414676

83554

4.97 92 HSP90AB1 Heat shock protein HSP 90-beta

Chaperona Molecular

37 IPI00003865

71082

5.37 205 HSPA8 Isoform 1 of Heat shock cognate 71 kDa protein

Chaperona Molecular

38 IPI00011284 30474 5.26 122 COMT Isoform Membrane-bound of Catechol O-

methyltransferase

Cataliza a O-metilação

39 IPI00003865

71082

5.37 91 HSPA8 Isoform 1 of Heat shock cognate 71 kDa protein

Chaperona Molecular

TABELA 1. Proteínas diferencialmente expressas entre os mapas bidimensionais de extratos enriquecidos de cromatina das

linhagens Mo7e e MBA identificadas por espectrometria de massas. As proteínas destacadas em negrito tem suas funções

relacionadas com os mecanismos de manutenção da estabilidade genômica e reparo de DNA.

V. DISCUSSÃO _______________________________________________________________

69

Entre as proteínas identificadas, cabe destacar RAD23B, HNRNPH1 e

HNRNPK. As três proteínas apresentaram-se diferencialmente expressas,

presentes no mapa proteômico nuclear da linhagem MBA, e estão envolvidas

com vias de reparo de DNA.

RAD23B é componente da maquinaria de reparo por excisão de

nucleotídeos (NER) acoplado a transcrição, uma sub-via especializada do

NER. NER é um sistema de reparo capaz de remover uma variedade de

distorções na hélice de DNA. Nesse mecanismo o complexo XPC-RAD23B

está envolvido na formação de segmentos de ssDNA ao redor da lesão, que

facilitam o recrutamento de outros componentes da maquinaria de NER

(Fousteri e Mullenders, 2008).

HNRNPH1 e HNRNPK são componentes do complexo de

Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins – hnRNP. Proteínas desse

complexo estão envolvidas com controle da transcrição gênica através de uma

complexa rede de interações proteína-proteína, proteína-RNA e proteína-DNA,

conectando as principais redes de regulação. Recentemente, componentes de

hnRNP foram associados ao controle de transcritos regulados por p53 em

resposta a radiação ionizante. Além disso, HNRNPK é alvo de fosforilação de

ATR/ATM, o que é mais um indício de seu papel em vias de reparo de DNA

(Haley et al, 2009).

V. DISCUSSÃO _______________________________________________________________

70

V. Discussão

V. DISCUSSÃO _______________________________________________________________

71

São crescentes as evidências que vêm associando a atividade tirosina

quinase constitutiva de BCR-ABL na instabilidade genômica observada em

pacientes em estágios avançados da LMC, assim como nas linhagens

celulares e modelos animais da doença. No entanto, os mecanismos

envolvidos nessa instabilidade ainda são alvo de muita controvérsia e seus

componentes ainda não foram esclarecidos (Burke e Carroll, 2010)

No presente estudo, foram realizados análises do reparo de DNA de

quebras duplas de DNA (DSBs) utilizando uma série de construtos repórteres

de reparo de DNA distintos em linhagens humanas BCR-ABL positivas a fim de

elucidar a influência de BCR-ABL nestas vias de reparo. Os resultados

mostraram um aumento no reparo mutagênico de DSBs, isto é, NHEJ mediado

por micro-homologias e SSA, em célula BCR-ABL positiva, MBA, em

comparação com a contraparte BCR-ABL negativa, Mo7e. Esses resultados

estão de acordo com estudos prévios que indicaram aumento das freqüências

de SSA em células BCR-ABL positivas em modelos murinos (Fernandes et al

2009; Cramer et al, 2008). Os resultados também estão consistentes com

trabalhos que mostraram a diminuição da expressão de fatores pertencentes à

via de NHEJ canônica, DNA-PKs, Artemis e Ligase IV, em células BCR-ABL

positivas humanas, e que foi acompanhada de um estímulo da via alternativa

mutagênica de NHEJ (Deutsch et al, 2001; Brady et al, 2003; Sallmyr et al,

2008). No entanto, em aparente contradição a estudos anteriores que

utilizaram linhagens celulares murinas, onde foi proposto que BCR-ABL

estimularia a recombinação homóloga (Slupianek et al, 2002; Nowicki et al,

2004), o presente estudo encontrou freqüências de RH similares entre Mo7e e

MBA, independentemente da extensão da homologia das seqüências, isto é,

independentemente da fidelidade do processo de RH (Akyüz et al, 2002;

Siehler et al, 2009). Os dados em relação às freqüências de RH e SSA entre as

linhagens foram ainda mais fundamentados com a análise de ambas as vias de

reparo de DSB com a inibição concomitante de RAD51, a transferase de fitas

de DNA que é essencial para RH, mas não para SSA, e que foi previamente

proposta sua super expressão e facilitação do reparo de DNA em células BCR-

ABL positivas (Slupianek et al, 2002). Para ambos os pares do estudo,

Mo7e/MBA e K562 tratada/não tratada com IM, encontramos estimulação de

V. DISCUSSÃO _______________________________________________________________

72

BCR-ABL ao reparo direcionado a homologia, independente de RAD51. Devido

às muitas diferenças entre as atividades de reparo de DSBs e das respostas às

lesões de DNA entre roedores e humanos (Bañuelos et al, 2008; Momcilović et

al, 2009), é possível que diferenças entre as espécies possam explicar os

resultados divergentes.

A indução da resistência a drogas genotóxicas e a radiação ionizante,

através do prolongamento das paradas de checagem do ciclo celular e pelo

aumento da expressão da proteína anti-apoptótica Bcl-xl, foram previamente

associados à atividade quinásica de BCR-ABL (Slupianek et al, 2002, Burke e

Carroll, 2010). Por essa razão examinamos se a indução da apoptose poderia

explicar a diminuição do reparo de DSBs após a inibição farmacológica de

BCR-ABL por IM. O tratamento da linhagem K562 com uma dose mínima de IM

(0,25 µM) permitiu a discriminação entre a repressão do reparo de DSBs e

indução da apoptose. A inclusão de tratamentos com a molécula inibidora de

pan-caspases, ZVAD-fmk, não afetou as mensurações de reparo de DSBs, o

que faz de uma possível influencia da apoptose nessas atividades pouco

provável. Também foram excluídas possíveis influencias das variações do ciclo

celular que podem afetar o reparo homologo de DSBs através da extensão da

duração de alguma fase do ciclo (Rothkamm et al, 2003). É notável frisar que

as linhagens K562 são p53-negativas, de forma que não apresentam parada do

ciclo celular e atividades pro-apoptóticas desempenhadas por esse supressor

de tumor multi-funcional (Akyüz et al, 2002).

Uma vez estabelecido que o reparo de DSB direcionado a homologia

estava enriquecido pela via mutagênica de SSA em células BCR-ABL positivas,

buscamos por fatores protéicos que são necessários nesses processos e

poderiam ser candidatos a mediadores da atividade de BCR-ABL no reparo.

Baseado em nossas e em descobertas prévias (Deutsch et al, 2001; Brady et

al, 2003; Sallmyr et al, 2008; Cramer et al, 2008;Fernandes et al 2009),

indicando que BCR-ABL promove mecanismos de reparo de DNA propensos a

erros em particular, escolhemos investigar proteínas que atuem nos pontos

iniciais de resposta a DSBs. Nesse contexto, MDC1 e 53BP1 tornaram-se

interessantes devido aos seus papéis distintos no recrutamento de proteínas de

V. DISCUSSÃO _______________________________________________________________

73

RH e NHEJ, respectivamente, aos sítios de DSBs.(Xie et al, 2007; Wilson e

Stern, 2008). Além disso, 53BP1 mostrou-se presente na regulação da escolha

entre os processos canônicos e alternativos de NHEJ (Bothmer et al, 2010). Já

CtIP se posiciona na inserção entre as vias de NHEJ canônica, NHEJ

alternativa e reparo de DSB direcionado por homologia, sendo o ultimo

dependente da atividade nucleásica de CtIP na promoção de extensiva

ressecção das extremidades de DNA e formação de segmentos de DNA fita

simples. (Sartori et al, 2007; Bennardo et al, 2008; Yun e Hiom, 2009)

Quando monitorados os níveis de mRNA na linhagem BCR-ABL

negativa, Mo7e, e na linhagem BCR-ABL positiva, MBA, em resposta a

irradiação e/ou pela inibição farmacológica da atividade quinásica de BCR-ABL

por IM, a expressão de MDC1, 53BP1 e CtIP não foram alteradas em Mo7e,

mas o contrário foi observado para MBA. Os níveis de mRNA de CtIP em MBA

se mostraram elevados após tratamento com RI e as análises da expressão

protéica por immunoblotting mostraram uma correspondente acumulação da

proteína CtIP. Esse efeito correspondendo mRNA e expressão protéica não foi

observado em virtude do tratamento com IM, visto que a expressão protéica de

CtIP foi praticamente anulada e não foram observadas alterações significativas

a nível de mRNA. Essas observações sugerem que em resposta a irradiação

BCR-ABL regula a expressão de CtIP positivamente a nível transcricional. No

entanto, uma gama de diferentes mecanismos de regulação, que englobam

desde a transcrição gênica à estabilidade da proteína codificada, podem, em

algum ponto, estar regulando a expressão de CtIP por BCR-ABL. Os níveis

protéicos basais em K562 sofreram uma diminuição dramática em resposta ao

tratamento com IM, o que provém uma evidência adicional indicando que a

atividade quinásica de BCR-ABL possa estar envolvida no controle positivo da

expressão de CtIP.

Através de experimentos de silenciamento gênico através de RNA de

interferência, descobrimos que CtIP é necessário para a estimulação de SSA

em células BCR-ABL positivas humanas MBA e K562. As freqüências de SSA

em Mo7e ou em K562 tratadas com IM não se alteraram, sugerindo que CtIP

medeia especificamente o reparo mutagênico gerado por BCR-ABL.

V. DISCUSSÃO _______________________________________________________________

74

Experimentos paralelos não mostrados que silenciaram ERCC1, uma proteína

chave na via de SSA, mostraram diminuição das freqüências de SSA em Mo7e,

isto é, independentemente de BCR-ABL.

Através da análise constitutiva da acumulação de foci de RPA como

forma de mensurar a geração de segmentos de fita simples de DNA, pudemos

demonstrar um aumento no processamento das extremidades quebradas de

DNA em MBA versus Mo7e em resposta a tratamento com droga radiomimetica

bleomicina. O processamento e a ressecção das extremidades de DNA

quebradas são atividades atribuídas a CtIP (Sartori et al, 2007), o que provém

mais uma evidência funcional da ativação de CtIP por BCR-ABL.

Essas observações sustentam ainda mais os resultados que mostram o

aumento da regulação de mecanismos de reparo de DNA mutagênicos, SSA e

NHEJ mediado por microhomologias (também conhecido como micro-NHEJ),

via BCR-ABL, visto que ambos os mecanismos requerem os processamentos

iniciais promovidos por CtIP (Bennardo et al, 2008). No entanto, surge o

questionamento do por que a RH, um processo que também depende do

processamento de CtIP, parece menos afetada por BCR-ABL que o

mecanismo de SSA. Nesse contexto, é interessante ressaltar que BRCA1

interage e ubiquitina CtIP em resposta a DSBs, recrutando CtIP para os sítios

de lesão e promovendo a RH. (Yun e Hiom, 2009; Yu et al, 2006). No entanto,

dependendo das modificações pos-traducionais, CtIP pode exercer diferentes

funções. A falta da fosforilação da serina 327 de CtIP por CDK abole sua

interação com BRCA1 e direciona funcionalmente CtIP para o micro-NHEJ

(Bennardo et al, 2008, Yun e Hiom,2009). Como BRCA1 tem sua expressão

diminuída em células BCR-ABL positivas humanas (Deutsch et al, 2003; e

confirmado em nosso modelo celular) e por isso a via escolhida para o reparo

de DSBs muda da RH para as vias mutagênicas de SSA (Keimling et al, 2008),

o estudo propõe que a falta de BRCA1 e logo do complexo BRCA1-CtIP pode

levar ao comprometimento do prévio sugerido aumento das freqüências de RH

pro BCR-ABL.

O presente trabalho também buscou estabelecer conexões entre BCR-

ABL com as proteínas MDC1 e 53BP1. Ambas mostraram diminuição nos seus

V. DISCUSSÃO _______________________________________________________________

75

níveis em MBA, em comparação com Mo7e, mas que não puderam ser

relacionados ou explicados por uma inibição transcricional mediada por BCR-

ABL dos genes correspondentes. Nas linhagens K562, o tratamento com IM

não causou mudanças significativas nos níveis protéicos, apesar de que em

MBA o tratamento com IM recuperou o acúmulo de 53BP1. Mesmo tendo sua

expressão recuperada pela inibição da atividade quinásica de BCR-ABL, a

fosforilação na Serina 25 de 53BP1 em resposta a irradiação, não foi

recuperada. A formação de foci nucleares de 53BP1 nos sítios de DSBs foi

correlacionada na literatura com a fosforilação da serina 25, evento catalizado

pela proteína ATM (Kang et al, 2009). Porém, nossos resultados detectaram a

formação de foci de 53BP1 em resposta a lesões em células MBA, em uma

extensão esperada por seus níveis de 53BP1 reduzidos. Os estudos de Munoz

e colaboradores mostraram ainda que a fosforilação da serina 25 em 53BP1 é

necessária para que 53BP1 funcione como uma proteína adaptadora para ATM

e para interagir com hPTIP, um regulador de respostas a stress celular e lesões

de DNA (Munoz et al, 2007). Um efeito de BCR-ABL independente da sua

atividade quinásica na desestabilização do genoma via repressão da

fosforilação da Serina 25 de 53BP1 é possível, mas requer futuro foco de

investigação. Apesar do silenciamento de 53BP1 não ter apresentado

influência no efeito estimulatório de BCR-ABL em células K562, há a

possibilidade que a inibição de 53BP1 em MBA possa estar de alguma forma

relacionada com o aumento de CtIP, para reforçar o reparo de DSBs pelas vias

propensas a erros. De forma similar, o silenciamento de MDC1 em K562 não

causou mudanças significativas no enriquecimento das freqüências de reparo

de DSBs via BCR-ABL. No entanto, MDC1 é necessária para o recrutamento

de BRCA1 para os sítios de DSBs (Xie et al, 2007), de modo que a redução de

MDC1 por BCR-ABL podem exacerbar as conseqüências da inibição de

BRCA1 na promoção de vias de reparo de DSBs mutagênicas em detrimento

da RH.

No presente trabalho foi demonstrado que BCR-ABL promove o reparo

mutagênico de DSBs em detrimento dos mecanismos de alta fidelidade como

RH, podendo assim acelerar os processos de transformação maligna. A

nuclease CtIP foi identificada como uma peça chave na sinalização

V. DISCUSSÃO _______________________________________________________________

76

downstream a BCR-ABL na promoção do reparo mutagênico por SSA. Ainda,

foram descritas as diminuições de expressão de 53BP1 e MDC1, que em

células normais, suportam os mecanismos de reparo de DSBs livres de erro

juntamente com BRCA1, uma proteína chave na RH e já descrita previamente

como tendo sua expressão reprimida por BCR-ABL (Deutsch et al, 2003).

Nossos resultados provêem novos embasamentos para o fenótipo mutador

observado em células BCR-ABL positivas e podem abrir novas áreas para

investigações que visam alvos terapêuticos.

Em relação à busca de novos alvos de modulação da expressão

protéica por BCR-ABL, através da metodologia proteômica foram analisados

mapas bidimensionais de extratos enriquecidos de cromatina, visto que muitas

proteínas envolvidas na manutenção da estabilidade genômica encontram-se

associados à cromatina, e é o foco do presente trabalho. Os extratos foram

obtidos de linhagens isogênicas Mo7e e MBA que diferenciavam apenas pela

presença de BCR-ABL na última. Foram identificadas proteínas envolvidas em

diversas vias/funções celulares diferencialmente expressas entre extratos,

destacando-se as proteínas RAD23B, HNRNPH1 e HNRNPK por seus recentes

papeis descritos na promoção do reparo por NER e RH, respectivamente.

Contudo o possível papel dessas proteínas na evolução da LMC e/ou na

instabilidade genômica promovida por BCR-ABL, requer extensivos estudos

futuros.

VI. BIBLIOGRAFIA _______________________________________________________________

77

VI. Bibliografia

VI. BIBLIOGRAFIA _______________________________________________________________

78

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VII. ANEXO _______________________________________________________________

91

VII. ANEXO

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