Mecanismos fisiopatológicos do remodelamento … · MEC Matriz extracelular MEE Membrana elástica externa MGP Proteína ácido glutâmico de matriz ou proteína γ- carboxiglutâmico

LUCIANA SIMÃO DO CARMO

Mecanismos fisiopatológicos do

remodelamento vascular associado à

calcificação em camundongos com obesidade

e resistência à insulina

Tese apresentada à Faculdade de

Medicina da Universidade de São

Paulo para obtenção do título de

Doutor em Ciências

Programa de Nefrologia

Orientador: Prof. Dr. Emmanuel de

Almeida Burdmann

SÃO PAULO

2017

LUCIANA SIMÃO DO CARMO

Mecanismos fisiopatológicos do

remodelamento vascular associado à

calcificação em camundongos com obesidade

e resistência à insulina

Tese apresentada à Faculdade de

Medicina da Universidade de São

Paulo para obtenção do título de

Doutor em Ciências

Programa de Nefrologia

Orientador: Prof. Dr. Emmanuel de

Almeida Burdmann

SÃO PAULO

2017

Dedicatória

v

Aos meus Pais, Ruth e José do Carmo, pelo amor

incondicional e apoio permanente nos

momentos mais difíceis.

Aos meus irmãos, Luisela, Marco Aurélio e Priscila

e ao meu sobrinho, Luiz Phillip

pela fraterna torcida.

AGRADECIMENTOS

vii

Ao Prof. Dr. Doutor Emmanuel de Almeida Burdmann, orientador e

amigo, pela orientação pessoal e profissional. Sempre sereno, generoso e

grande incentivador, a quem tenho profunda admiração e respeito.

Ao Prof. Dr. Marcel Liberman, a quem devo grande parte de minha

formação científica.

Ao Prof. Dr. Francisco Rafael Martins Laurindo, pesquisador

admirável, pelas sugestões na aula de qualificação e nos experimentos que

valorizam ainda mais este trabalho.

Ao grande amigo, Prof. Dr. Alex Yuri Simões Sato, pelo incentivo e

disponibilidade ao longo desses anos.

À Profa. Dra. Vanda Jorgetti pelas conversas e conselhos que foram

muito importantes durante a reta final deste trabalho.

À Profa. Dra. Rita Tostes, pelas sugestões de experimentos que

tornaram este trabalho ainda mais interessante.

Aos Professores Doutores Luiz Vicente Rizzo e Anna Carla Renata

Goldberg pela oportunidade de pesquisar no Instituto de Pesquisa do

Hospital Israelita Albert Einstein, o meu especial agradecimento.

Ao Prof. Dr. Lionel Gamarra, pelo auxílio fundamental na realização

do experimento de calcificação vascular.

viii

À Dra. Claudia Pinto Marques Souza de Oliveira e ao técnico José

Edson Pereira da Costa pela doação dos camundongos.

A toda equipe do Núcleo de Apoio à pesquisa do Hospital Israelita

Albert Einstein (NAP). Especialmente, Aline e Ana Cláudia, sempre

disponíveis e atenciosas, contribuíram na prestação de contas e na submissão

dos relatórios da FAPESP.

Aos colegas do grupo de calcificação vascular: Maria Claudina, Youri,

Elisangêla, Luciana, Gabriel e Melissa pela convivência, discussões científicas

e apoio em alguns experimentos.

À grande amiga, Marta Diniz, sempre presente e disponível, que com

zelo manteve o laboratório em ótimas condições de trabalho.

Aos Assistentes de pesquisa do Instituto de pesquisa do Hospital

Israelita Albert Einstein, Andrea Vieira, Luiz Sardinha e Natália Torres pela

disposição e competência na ajuda aos pós-graduandos.

A todos os funcionários do Centro de Experimentação e treinamento

em cirurgia do Hospital Israelita Albert Einstein, especialmente a

Coordenadora Luciana Cintra que contribuíram para o sucesso desse

projeto.

Ao Dr. Thiago Pinheiro Arrais Aloia pelo auxílio na realização das

imagens em microscópio confocal.

ix

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo pela

concessão da bolsa de doutorado e pelo financiamento desse estudo.

x

Não é sobre ter todas as pessoas do mundo pra si

É sobre saber que em algum lugar alguém zela por ti

É sobre cantar e poder escutar mais do que a própria voz

É sobre dançar na chuva de vida que cai sobre nós

É saber se sentir infinito

Num universo tão vasto e bonito é saber sonhar

Então, fazer valer a pena cada verso

Daquele poema sobre acreditar

Não é sobre chegar no topo do mundo e saber que venceu

É sobre escalar e sentir que o caminho te fortaleceu

É sobre ser abrigo e também ter morada em outros corações

E assim ter amigos contigo em todas as situações

A gente não pode ter tudo

Qual seria a graça do mundo se fosse assim?

Por isso, eu prefiro sorrisos

E os presentes que a vida trouxe pra perto de mim

Não é sobre tudo que o seu dinheiro é capaz de comprar

E sim sobre cada momento sorriso a se compartilhar

Também não é sobre correr contra o tempo pra ter sempre mais

Porque quando menos se espera a vida já ficou pra trás

Segura teu filho no colo

Sorria e abrace teus pais enquanto estão aqui

Que a vida é trem-bala, parceiro

E a gente é só passageiro prestes a partir

Ana Carolina Vilela Da Costa

xi

Normalização Adotada

Esta dissertação está de acordo com as seguintes normas, em vigor no

momento desta publicação:

Referências: adaptado de International Commitee of Medical Journals Editors

(Vancouver)

Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina. Divisão de Biblioteca e

Documentação. Guia de apresentação de dissertações, teses e monografias.

Elaborado por Anneliese Carneiro da Cunha, Maria Julia de A. L. Freddi,

Maria F. Crestana, Marinalva de Souza Aragão, Suely Campos Cardoso,

Valéria Vilhena. 3ª Ed. São Paulo: Divisão de Biblioteca e Documentação;

2011.

Abreviaturas dos títulos dos periódicos de acordo com List of Journals Indexed

in Index Medicus.

xii

Este estudo teve suporte financeiro da:

FAPESP – Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo

(Processo n. 13/09652-0)

xiii

SUMÁRIO

Dedicatória ....................................................................... iv

Agradecimentos................................................................. vi

Lista de Figuras ............................................................... xiv

Lista de Abreviaturas e Símbolos .................................... xvii

Lista de Tabelas............................................................... xix

Resumo ............................................................................ xx

Abstract .......................................................................... xxi

1. INTRODUÇÃO ........................................................................... 22

2. HIPÓTESE ................................................................................. 42

3. OBJETIVOS............................................................................... 44

4. MATERIAIS E MÉTODOS........................................................... 46

5. ESTATÍSTICA ............................................................................ 63

6. RESULTADOS ........................................................................... 65

7. DISCUSSÃO............................................................................... 81

8. CONCLUSÕES ........................................................................... 92

9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................. 94

ANEXO ........................................................................................ 112

xiv

Lista de Figuras

Figura 1. Desdiferenciação de células musculares lisas vasculares

em células com fenótipo osteocondrogênico após

estímulos calcificadores, segundo Giachelli. ......................... 28

Figura 2. Caracterização do remodelamento vascular, segundo

Mulvany et al. ..................................................................... 30

Figura 3. Mecanismos fisiopatológicos do remodelamento

vascular, segundo van Varik et al. ....................................... 31

Figura 4. Delineamento do protocolo experimental in vivo, após 7

dias de estímulo com vitamina D3 em ob/ob e em

C57BL/6. ............................................................................. 49

Figura 5. Delineamento do protocolo experimental in vivo, após 14

dias de estímulo com vitamina D3 em ob/ob e em

C57BL/6 .............................................................................. 50

Figura 6. Gráfico representativo da concentração de cálcio iônico

e fósforo sérico, após 14 dias de protocolo experimental

in vivo. ................................................................................. 66

Figura 7. Segmento da aorta torácica de C57BL/6 e de ob/ob,

após 14 dias de protocolo experimental in vivo ..................... 67

Figura 8. Gráfico representativo da quantificação da

circunferência da lâmina elástica externa e da área da

parede do vaso, após 14 dias de protocolo experimental

in vivo. ................................................................................. 68

Figura 9. Análise histológica após coloração com hematoxicilina

eosina. ................................................................................. 68


circunferência da lâmina elástica interna e da área do

lúmen, após 14 dias de protocolo experimental in vivo ......... 69

xv

Figura 11. Gráfico representativo da quantificação da espessura

da parede do vaso, após 14 dias de protocolo

experimental in vivo. ........................................................... 70

Figura 12. Análise histológica após coloração com masson ................. 71

Figura 13. Gráfico representativo da quantificação da área e da

percentagem de colágeno, após 14 dias de protocolo


Figura 14. Análise histológica após coloração de Verhoeff-Van

Gieson ................................................................................ 72


fragmentação de fibras elásticas, após 14 dias de

protocolo experimental in vivo. ........................................... 73

Figura 16. Análise histológica após coloração por Alizarin Red S. ........ 73

Figura 17. Gráfico representativo da quantificação da área e da

percentagem de calcificação, após 14 dias de protocolo


Figura 18. Detecção da calcificação por OsteoSense® ex vivo .............. 75

Figura 19. Gráfico representativo da correlação entre o

remodelamento vascular e a intensidade de

calcificação, após 14 dias de protocolo experimental in

vivo. ................................................................................... 76

Figura 20. Gráfico representativo da expressão de RNA

mensageiro para Runx2, Msx2 e Fosfatase Alcalina por

RT-PCR em aorta de C57BL/6 e de ob/ob, após 7 dias

de protocolo experimental in vivo. ....................................... 77

Figura 21. Expressão proteica de BMP-2, após 14 dias de


Figura 22. Detecção de radicais livres por adutos de DMPO, após

14 dias de protocolo experimental in vivo. .......................... 79

xvi

Figura 23. Gráfico representativo da quantificação da intensidade

de fluorescência de radicais livres, após 14 dias de


Figura 24. Atividade de metaloproteinases de matriz por confocal

em aortas torácicas de C57BL/6 e de ob/ob, após 14

dias de protocolo experimental in vivo. ............................... 80

xvii

Lista de Abreviaturas e Símbolos

AAA Aneurisma da aorta abdominal

ANOVA Análise de variância univariada

α-SMa Alfa-actina de músculo liso

BMP-2 Proteína morfogênica de osso-2

C57 C57BL/6

cDNA Ácido desoxiribonucléico fita complementar

CMLV Célula muscular lisa vascular

CO2 Dióxido de Carbono

CV Calcificação vascular

CVC Célula vascular calcificadora

DM2 Diabetes mellitus tipo 2

DMPO 5,5 dimetil-1-pirrolina-N-óxido

DNA Ácido desoxiribonucléico

DP Desvio padrão

DRC Doença renal crônica

eNOS Sintase de óxido nítrico endotelial

ERO Espécies reativas de oxigênio

FA Fosfatase alcalina

FAPESP Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo

FAV Fístulas artério-venosas

GAPDH Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase

HAS Hipertensão arterial sistêmica

H2O2 Peróxido de hidrogênio

HE Hematoxicilina e eosina

xviii

IAM Infarto agudo do miocárdio

IGF-1 Fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1

IL-6 Interleucina-6

IP Intraperitoneal

LEE Lâmina elástica externa

LEI Lâmina elástica interna

MEC Matriz extracelular

MEE Membrana elástica externa

MGP Proteína ácido glutâmico de matriz ou proteína γ-

carboxiglutâmico de matriz

miRNA MicroRNA

MMP Metaloproteinase da matriz

Msx2 Msh homeobox 2

NIH National Institute of Health

OB ob/ob

OCT Tissue-Tek®: meio para inclusão tecido em congelação

PXE Pseudoxantoma elástico

RNA Ácido ribonucléico

rpm Rotações por minuto

RT-PCR Reação de polimerase em cadeia por transcriptase

Reversa

Runx2 Fator de transcrição 2 relacionado ao runt

SM22α Proteína 22 alfa de músculo liso

SM-MHC Cadeia pesada de músculo liso

TNF-a Fator de necrose tumoral alfa

https://us.vwr.com/store/jump/product/4692300US/Tissue-Tek%C2%AE+O.C.T.+Compound,+Sakura%C2%AE+Finetek

xix

Lista de Tabelas

Tabela 1. Formas de calcificação vascular, manifestações clínicas

mais frequentes e fatores de risco na população em

geral e com doença renal crônica (DRC) ............................... 25

Tabela 2. Estímulos relacionados à alteração fenotípica das células

musculares lisas vasculares ................................................. 33

Tabela 3. Fatores reguladores da calcificação vascular ........................ 37

xx

Resumo

Carmo LS. Mecanismos fisiopatológicos do remodelamento vascular associado à calcificação em camundongos com obesidade e resistência à insulina [Tese]. São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo; 2017.

O remodelamento vascular é uma resposta adaptativa a estímulos específicos, participando da fisiopatologia de diversas doenças cardiovasculares. Devido à intersecção de fatores de risco

cardiovasculares relacionados tanto ao remodelamento vascular como à calcificação vascular (CV), propomos a investigação de mecanismos que

inter-relacionam tais condições. Postulamos que camundongos ob/ob com obesidade e resistência à insulina têm resposta exacerbada de

remodelamento vascular associado à CV quando comparado aos camundongos controles C57BL/6 (C57) após estímulo com vitamina D3 (VD) in vivo. Camundongos C57 e ob/ob (OB) machos foram injetados

com 8x103 UI/kg de vitamina D3 intraperitoneal (IP) ou solução fisiológica (CT) durante 14 dias (n=6). Houve aumento da circunferência

da lâmina elástica externa da aorta, determinando aumento da área circunferencial do vaso em camundongos OBVD. A hipervitaminose D

aumentou o comprimento da lâmina elástica interna da aorta, aumentando o lúmen vascular em camundongos OBVD. Ocorreu também diminuição da espessura da parede do vaso em camundongos

OBVD, caracterizando remodelamento vascular positivo hipotrófico. Observamos ainda maior deposição de colágeno na parede do vaso e

elastólise em camundongos OBVD. O remodelamento vascular positivo em camundongos OBVD se correlacionou diretamente com o aumento

da calcificação na aorta (R2=0,8; p<0,003). Aortas de camundongos OBVD apresentaram aumento na expressão de espécies reativas de

oxigênio (ERO), que foi associado ao aumento da atividade de metaloproteinases de matriz (MMP). Estes resultados fornecem evidências que camundongos obesos, insulino-resistentes, e com

diabetes tipo 2 desenvolveram remodelamento vascular positivo hipotrófico correlacionado diretamente com calcificação vascular em

camundongos OBVD após estímulo com vitamina D3. O desenvolvimento do remodelamento vascular positivo hipotrófico neste

modelo murino é possivelmente mediado pela ativação de MMP na parede da aorta e a geração de ERO pode ter contribuído para a ativação de MMP neste modelo.

Descritores: remodelação vascular; calcificação vascular; diabetes mellitus tipo 2; obesidade; resistência à insulina; estresse oxidativo; metaloproteinases da

matriz; colecalciferol; camundongos obesos.

xxi

Abstract

Carmo LS. Mechanisms of vascular remodeling associated with calcification in obesity and insulin resistance [Thesis]. São Paulo:

"Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo"; 2017.

Vascular remodeling is a vessel response to mechanical and

hemodynamic stimuli, which is a major determinant of changes in vessel lumen caliber. The mechanisms that influence arterial remodeling include calcification. We hypothesized that ob/ob mice

develop positive vascular remodeling associated with calcification. We quantify and assess mechanisms of vascular remodeling and vascular

calcification in ob/ob mice (OB) after vitamin D3 stimulation (VD) or phosphate buffered saline (CT), compared with (C57BL/6) mice. Both

ob/ob (OBVD) and C57BL/6 (C57VD) mice received 8x103 IU/day of (IP) vitamin D3 for 14 days. Control ob/ob (OBCT) and C57BL/6 (C57CT) mice received IP phosphate buffered saline (PBS) for 14 days (n=6).

Hypervitaminosis D increased the external and internal elastic length in aortas from OB mice, resulting in increased total vascular area and

lumen vascular area respectively, which characterizes positive vascular remodeling. OBVD mice decreased the aortic wall thickness, resulting in

hypotrophic vascular remodeling. We demonstrated increases in collagen deposition, elastolysis and calcification in the aortas of OBVD mice. These results showed a positive correlation between expansive

vascular remodeling and vascular calcification in OBVD mice (R2=0,8; p<0,003). Furthermore, aorta from OBVD increased oxidative stress,

coincidently with augmented metalloproteinase activity. Our data provide evidence that obese type 2 diabetes mellitus and insulin-resistant

mice (ob/ob) developed positive hypotrophic vascular remodeling correlated directly with increased vascular calcification in OBVD mice after chronic vitamin D3 stimulation. The development of positive

hypotrophic vascular remodeling in this mouse model is possibly mediated by the activation in the aortic wall of MMP and ROS may have

contributed to the activation of MMP in this model. Descriptors: vascular remodeling; vascular calcification; diabetes mellitus, type 2; obesity; insulin resistance; oxidative stress; matrix metalloproteinases;

cholecalciferol; mice, obese.

1. INTRODUÇÃO

I n t r o d u ç ã o 23

1. INTRODUÇÃO

A calcificação vascular (CV) é um fator de risco importante de

morbimortalidade cardiovascular, 1 incidindo especialmente em

pacientes com diabetes mellitus tipo 2 (DM2) 2, 3 e doença renal crônica

(DRC). 4-6 A calcificação está envolvida na fisiopatologia da estenose da

valva aórtica, 7, 8 no desenvolvimento do aneurisma, na hipertensão

arterial sistêmica (por diminuir a complacência vascular), e em doenças

cerebrovasculares. 4

Durante décadas, a calcificação vascular tem sido descrita como

doença degenerativa ou como consequência do envelhecimento. 9, 10 No

entanto, estudos recentes descreveram que a calcificação vascular é um

processo regulado, 9, 11-13 similar à osteocondrogênese do esqueleto. 2, 6

Este processo pode ser amplificado em pacientes com osteodistrofia

renal e osteoporose. 14 Sabidamente, o diabetes mellitus 15 é um fator de

risco multiplicador de complicações cardiovasculares e de morte. 9

A hiperglicemia pode potencializar a calcificação vascular, através

do aumento da produção de espécies reativas de oxigênio 16. 17

Previamente, nosso grupo demonstrou que o comprometimento na

produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) é importante na

fisiopatologia e participa da calcificação valvar aórtica 18 e calcificação

vascular, 19 atuando especificamente na alteração fenotípica das células

musculares lisas vasculares (CMLVs). 9 Ainda, a obesidade associada à

resistência à insulina e ao diabetes mellitus é fator de risco


independente para o desenvolvimento de doenças e calcificação

vascular. 20

Nosso grupo demonstrou que as células musculares lisas

vasculares de camundongos ob/ob têm maior propensão à calcificação

após estímulo com proteína morfogênica de osso-2 (BMP-2), com

expressão precoce de genes osteocondrogênicos. 21

1.1 Calcificação vascular

Apesar de serem processos que ocorrem simultaneamente,

podemos dividir didaticamente a calcificação vascular em

comprometimento da íntima e da média do vaso (Tabela 1). 22


Tabela 1. Formas de calcificação vascular, manifestações clínicas mais

frequentes e fatores de risco na população em geral e com doença renal crônica (DRC), segundo Wolisi e Moe (2005) 22

Lesão Manifestação

clínica

Fatores de risco

na população

geral

Fatores de risco em

pacientes com DRC

Aterosclerose:

placas ou lesões

circunferenciais

(Calcificação da

íntima)

Doença arterial

coronária, arritmia,

morte súbita,

doença vascular

periférica, estenose

da artéria renal

Predisposição

genética,

tabagismo,

hipertensão

arterial, diabetes,

dislipidemia e

inflamação

Os mesmos encontrados

na população geral,

além dos distúrbios do

metabolismo mineral,

produtos de glicação

avançados (AGEs),

estresse oxidativo e

inflamação

Calcificação da

média

Aumento da

pressão de pulso,

isquemia de

múltiplos órgãos 5,

estenose valvar

aórtica

Diabetes,

envelhecimento

Diabetes,

envelhecimento,

distúrbios do


AGEs, estresse oxidativo

e inflamação

Arteríolopatia

calcificante

urêmica

(calcifilaxia)

Lesões isquêmicas

de pele

Não observados Distúrbios do


especialmente

hiperfosfatemia,

obesidade, sexo

feminino e raça branca


A calcificação da camada íntima acontece principalmente

associada à aterosclerose, como consequência à deposição de lipídeos,

aumento da produção de espécies reativas de oxigênio, infiltração de

macrófagos e proliferação de células musculares lisas que,

posteriormente, sinalizam para osteocondrogênese. 23, 24 Enquanto isso,

a calcificação da camada média pode ocorrer independentemente da

aterosclerose e, geralmente, se associa à destruição de fibras elásticas,

aparecendo inicialmente como depósitos lineares ao longo do vaso. 25

Esse tipo de calcificação (também denominada esclerose média, ou

doença de Mönckeberg, 26 é, particularmente, comum nos pacientes com

diabetes mellitus, 24 com doença renal crônica, na hipertensão

essencial, podendo se associar com a osteoporose. 6, 24 A calcificação da

camada média favorece o enrijecimento da parede arterial, com perda

da complacência, aumento na pressão sanguínea, alterações de fluxo

sanguíneo, o que aumenta o risco cardiovascular. 6

A calcificação vascular se assemelha à mineralização do esqueleto

após desdiferenciação das células musculares lisas vasculares em uma

linhagem osteocondrogênica, também descrita como célula vascular

calcificadora (CVC). 27 As células vasculares calcificadoras têm a

capacidade de se diferenciar em outras linhagens mesenquimais, além

do osteoblasto, representando 20% a 30% da população total de células

musculares lisas. 28-30 A diferenciação osteogênica caracteriza-se pela

diminuição de expressão de proteínas de células musculares lisas e

aumento de marcadores osteogênicos, com consequente produção de


vesículas de matriz, que inicia o processo de mineralização e, por fim,

secreção de hidroxiapatita. 2 In vitro, essas células, quando incubadas

com estímulos calcificadores, aumentam a expressão de runx2, osterix

e fosfatase alcalina, e diminuem a expressão de marcadores de

linhagem de célula muscular lisa (cadeia pesada de músculo liso (SM-

MHC), proteína 22 alfa de músculo liso (SM22α), alfa-actina de músculo

liso (α-SMa) e desmina. 5 Estes mecanismos podem ser observados na

Figura 1. A desdiferenciação das células musculares lisas pode ocorrer

após diversos estímulos, como o aumento do estresse oxidativo, 11, 17

aumento da concentração de fosfato inorgânico que pode aumentar o

produto cálcio e fósforo. 5, 31 Além disso, a BMP-2 presente na placa de

aterosclerose é um potente mediador da desdiferenciação das células

musculares lisas vasculares em uma linhagem osteocondrogênica 3, 32-34

(Figura 1).


Fonte: Adaptdado de Giachelli (2005) 5

Figura 1. Desdiferenciação de células musculares lisas vasculares em células com fenótipo osteocondrogênico após estímulos

calcificadores, segundo Giachelli. Abreviaturas: SM-MHC: cadeia pesada de músculo liso, SM22-α:

proteína 22α de músculo liso, α-SMA: alfa-actina de músculo liso, Runx2: fator de transcrição 2 relacionado ao runt e Msx2: Msh

homeobox 2.

1.2 Remodelamento vascular

O remodelamento vascular é uma mudança conformacional e

arquitetural do vaso, como resposta a determinados estímulos,

participando da fisiopatologia de diversas doenças cardiovasculares

como: aneurisma e dissecção vascular, 35 aterosclerose 36 e hipertensão

arterial sistêmica do idoso, caracterizada por aumento da pressão de

pulso, 37 que contribui para aumentar a morbimortalidade

cardiovascular. 1

O remodelamento vascular reflete a adaptação da parede do vaso

a estímulos mecânicos e hemodinâmicos. 35 É definido como qualquer


mudança da área compreendida pela membrana elástica externa (MEE),

16 sendo de fundamental importância para readequação do calibre

vascular em diversas situações fisiopatológicas, como a reestenose pós-

angioplastia, aterosclerose e fístulas arteriovenosas (FAV), caracterizada

por shear stress aumentado. 38 O remodelamento pode, por exemplo,

potencializar a redução do lúmen pela placa neointimal (remodelamento

negativo) ou tamponar tal obstrução (remodelamento excêntrico ou

positivo). 39 O remodelamento vascular excêntrico ou positivo participa

na formação do aneurisma, aterosclerose, fístulas arteriovenosas, 38

além de modificar o fluxo sanguíneo para órgãos e sistemas,

colaborando para a deterioração clínica em diversas doenças

cardiovasculares: doença isquêmica do coração, dissecção de aorta,

isquemia cerebrovascular, doença arterial periférica, hipertensão

arterial sistêmica e insuficiência renal. 35, 40-43

Macroscopicamente, o remodelamento arterial pode ser

didaticamente classificado através de características do vaso como: a

forma e a topografia, podendo ser excêntrico (positivo), normal

(equilibrado) ou concêntrico (negativo), além de hipertrófico (maior

espessamento da parede vascular), eutrófico (espessura mantida da

parede vascular) ou hipotrófico (maior afilamento da parede vascular) 44

(Figura 2).


Fonte: Adaptado de Mulvany et al. (1996) 44

Figura 2. Caracterização do remodelamento vascular, segundo Mulvany et al. 44

Diferentes tipos de remodelamento podem acontecer após lesão: hipotrófico, eutrófico e hipertrófico. Além disso, o remodelamento

pode ser concêntrico ou excêntrico. O remodelamento hipotrófico resulta em afilamento da parede e uma menor proporção da relação

da parede/luz do vaso. O remodelamento hipertrófico é caracterizado pelo espessamento da parede vascular devido à

hiperplasia celular e/ou hipertrofia ou deposição de matriz

extracelular que resulta em aumento da proporção da relação da parede/luz por espessamento da parede do vaso. Denomina-se

remodelamento eutrófico quando ocorre alteração do diâmetro do vaso, mas a proporção da relação da parede/luz do vaso permanece

inalterada.


1.3 Mecanismos do remodelamento vascular

O remodelamento vascular é um processo ativo, muito prevalente,

regulado por inúmeros processos que são inter-relacionados. Os

principais mecanismos potencialmente envolvidos no remodelamento

vascular incluem: 1) proliferação e diferenciação das CMLVs, 2)

degradação e ruptura das fibras elásticas, e 3) calcificação e deposição

de componentes da matriz extracelular (Figura 3). 35

Fonte: Adaptado de van Varik et al. (2012) 35

Figura 3. Mecanismos fisiopatológicos do remodelamento vascular, segundo van Varik et al. 35

Corte transversal da parede do vaso. (A) Situação fisiológica (B) Remodelamento arterial. Exemplo de remodelamento arterial

caracterizado por aumento da espessura da parede do vaso.

Degradação da fibra elástica, calcificação da matriz extracelular e deposição de colágeno resultam em adaptação da parede do vaso.

Abreviações: TGF-β, fator de crescimento transformador beta; IL-1, interleucina-1; MMP, metaloproteinases de matriz; VSMC,

vascular smooth muscle cell ou célula muscular lisa vascular.


1.3.1 Proliferação e diferenciação das células musculares lisas

vasculares

As células musculares vasculares são reguladores importantes do

tônus vascular e entender a sua função é importante para compreender

os mecanismos envolvidos no remodelamento vascular. Em artérias

normais, as células musculares lisas vasculares da camada média

regulam o tônus e o diâmetro do vaso a fim de garantir o balanço

hemodinâmico e a perfusão tecidual. 45 Embora a maioria das células

musculares lisas vasculares da parede vascular apresenta um fenótipo

contrátil, vários estudos têm demonstrado que subtipos específicos de

CMLVs da camada média têm a capacidade de se diferenciar em um

fenótipo sintético que pode ser dividido em fenótipo proliferativo-

migratório, secretor ou osteogênico. 46 A alteração fenotípica das células

musculares lisas vasculares é importante em diversas condições

fisiopatológicas do tecido vascular. Este processo de desdiferenciação

denominado mudança de fenótipo é considerado um dos mecanismos

do remodelamento vascular. 45, 47 Os principais estímulos envolvidos na

alteração fenotípica das células musculares lisas vasculares estão

sumarizados na Tabela 2.


Tabela 2. Estímulos relacionados à alteração fenotípica das células

musculares lisas vasculares, segundo Alexander e Owens (2012) 45

Estímulos relacionados à alteração fenotípica das células musculares lisas

vasculares

Inflamação

Estresse oxidativo

Aumento do produto cálcio e fósforo

Shear stress hemodinâmico

Estiramento mecânico

Produtos de glicação avançada (AGEs)

Estímulo hormonal

Angiotensina 2

Aldosterona

Estímulos parácrinos

Metaloproteinase de matriz (MMP)

Fator de crescimento transformador beta (TGF-β)

Fator de crescimento endotelial (EGF)

Fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF)

Fator de crescimento de fibroblasto (FGF)

1.3.2 Fenótipo osteogênico das células musculares lisas vasculares

As células musculares lisas vasculares podem se desdiferenciar in

vitro em um fenótipo osteogênico e adquirir características semelhantes

aos osteoblastos e condrócitos, após estímulo com altas concentrações

de cálcio e fosfato. 15 Essas células com fenótipo osteogênico são

caracterizadas pela diminuição de proteínas inibitórias de mineralização

e aumento de fosfatase alcalina e de vesículas de matriz. 31 Quando

incubadas in vitro com estímulos calcificadores (por ex., altas


concentrações de fosfato) aumentam a expressão de runx2, osterix e

fosfatase alcalina, diminuindo a expressão de marcadores de célula

contrátil, (cadeia pesada de músculo liso (SM-MHC), proteína 22 alfa de

músculo liso (SM22α), alfa-actina de músculo liso (α-SMa) e desmina),

31 (Figura 1) 5. A diferenciação osteogênica das células musculares

vasculares pode ocorrer após diversos estímulos, como o aumento do

estresse oxidativo 17, 48, aumento da concentração de fosfato inorgânico

que leva ao aumento do produto cálcio e fósforo 5, 27, 31 e de BMP-2 3, 32-

34, que é agonista potente na desdiferenciação de células musculares

lisas vasculares em células osteocondrogênicas (Figura 1).

A desdiferenciação das células musculares lisas vasculares em

fenótipo osteocondrogênico após estímulo calcificador com BMP-2 é

também regulado pela proteína gla de matriz (MGP) que é inibidor

clássico da calcificação. Em camundongos knockout para MGP ocorre

aumento exuberante da calcificação das fibras elásticas, perda das

características do fenótipo contrátil de células musculares lisas

vasculares, resultando em um fenótipo osteocondrogênico. 49 A proteína

MGP sequestra o BMP-2, mantendo as células musculares lisas

vasculares em um fenótipo contrátil impedindo assim a calcificação

vascular. 13, 50

Em 1983, Tanimura e colaboradores descreveram associação

entre partículas encapsuladas com uma membrana pequena,

denominadas vesículas de matriz e calcificação vascular. 51 Essas

estruturas vesiculares são secretadas pelas células musculares lisas


vasculares e estão presentes nas camadas íntima e média do vaso. 52, 53

As vesículas de matriz estão presentes em lesões ateroscleróticas e na

hipertensão arterial. 52, 54 In vitro, as vesículas de matriz formam nicho

para a calcificação. 15

1.3.3 Degradação e ruptura das fibras elásticas

As fibras elásticas consistem em polímeros de tropoelastina

interligados por microfibrilas. A elastina é produzida principalmente

pelas células musculares lisas vasculares durante o período fetal e

neonatal e é um nicho importante para a calcificação. O

pseudoxantoma elástico (PXE) é uma doença genética autossômica

recessiva caracterizada por fragmentação e calcificação das fibras

elásticas. 55 Além disso, processo similar ao que ocorre na PXE, isto é

alteração na função da elastina foi observado no envelhecimento

vascular e na rigidez da aorta. 56 O mecanismo pelo qual ocorre

degradação da fibra elástica associada ao envelhecimento ainda não foi

elucidado. Um dos mecanismos é o alongamento cíclico e consecutivo

das fibras elásticas após cada batimento cardíaco. 57, 58 A hipertensão

sistólica acelera esse processo, aumentando a pressão de pulso (PP),

exercendo tensão e estiramento das fibras na parede vascular.

Suportando esta hipótese, demonstrou-se que alterações estruturais na

elastina ocorrem de maneira inversamente associada ao número de


ciclo total de batimentos cardíacos in vitro. 59 No entanto, a degradação

da elastina in vivo não foi estudada até o momento.

1.3.4 Calcificação e deposição de componentes da matriz

extracelular

A desdiferenciação das células musculares lisas vasculares, bem

como a degradação de componentes da matriz extracelular são

importantes fatores que aumentam a progressão da calcificação

vascular. A CV previamente definida como deposição de minerais é um

processo regulado por fatores estimulatórios e inibitórios (Tabela 3). A

calcificação é um importante marcador de algumas doenças genéticas,

como síndrome de Keutel e PXE. 60-63 A síndrome de Keutel é

caracterizada por mutação no gene que codifica a MGP, que é o

principal inibidor da calcificação vascular. A MGP é uma proteína de 14

kD dependente da vitamina K que quando carboxilada torna-se

biologicamente ativa, inibindo a calcificação vascular. 64-66 A PXE é

caracterizada pela mutação no gene abcc6 que codifica uma proteína

transportadora. O substrato da MDRP-6 e o mecanismo pelo qual a

alteração genética aumenta a calcificação vascular ainda são

desconhecidos. Alguns estudos hipotetizaram que ela atue na

desdiferenciação da célula muscular lisa vascular, estresse oxidativo e

interferência com a carboxilação da MGP. 63, 67-70


Tabela 3. Fatores reguladores da calcificação vascular

Fatores estimuladores da calcificação vascular

BMP-2

Produto cálcio e fósforo

TNF-α

IL-6

IGF-1

Hiperglicemia

PTH

MMP

Degradação da elastina

Cristais de hidroxiapatita

Fatores inibidores da calcificação

Fetuína-A

MGP

Osteoprotegerina

1.4 Camundongos deficientes em leptina (ob/ob)

Os camundongos ob/ob são animais hiperfágicos, obesos,

hiperinsulinêmicos e hiperglicêmicos que se caracterizam pela

deficiência completa de leptina, originalmente produzida por células

adiposas, que agem no hipotálamo, inibindo o neuropeptídeo orexigêno

Y (NPY); a leptina aumenta, assim, o sinal anorexigênico. Estes roedores

apresentam aumento no número (hiperplasia) e volume (hipertrofia) de

células-β do pâncreas, que tem capacidade de liberação mais rápida e

de maior quantidade de insulina. A hiperglicemia tem pico entre 3 a 5

meses de vida, enquanto que a hiperinsulinemia máxima ocorre um


pouco mais tarde. Os animais são inférteis, devido ao hipogonadismo

hipogonadotrófico. A hipertensão pode estar presente, mas não é regra e

o colesterol sérico normalmente é elevado, acompanhado de

hipertrigliceridemia modesta quando comparados com camundongos

controles. Além disso, apresentam menor temperatura corpórea e

atividade metabólica mais eficiente e, assim, acumulam mais gordura

(células adiposas). O estudo com camundongos deficientes em leptina,

do ponto de vista fisiológico, também nos é favorável, pois foi

demonstrado que esses camundongos não desenvolvem calcificação

vascular (sem estímulo específico), quando comparados aos

camundongos controles. Ao contrário, apenas o excesso ou a

superexpressão de leptina aumenta a calcificação vascular tanto in vivo

(em camundongos Apo E knockout) 71 quanto in vitro. 72 Quanto à

deficiência de leptina no osso, os camundongos ob/ob demonstraram

aumento da massa óssea. Estudos posteriores, porém, explicitaram que

tais alterações não foram uniformes entre o segmento axial e

apendicular: aumento do comprimento e da massa óssea de vertebrados

lombares e diminuição do comprimento do fêmur, do volume

trabecular, quando comparados aos camundongos controles. Assim, em

níveis fisiológicos, a leptina pode modular o dimorfismo ósseo

dependente do sexo. Camundongos machos deficientes em leptina

perdem algumas características ósseas ligadas ao sexo, possivelmente

devido à alteração de vias de sinalização de andrógenos no osso. 73


1.5 Modelos experimentais de calcificação vascular

A administração aguda ou crônica de vitamina D3 em animais é

um modelo importante e amplamente descrito na literatura para o

estudo da calcificação. 23, 74, 75

Um dos principais efeitos da hipervitaminose D é a hipercalcemia

e a calcificação vascular. 76

A incubação de células musculares lisas bovinas com 1,25

dihidroxivitamina D3 determinou calcificação e aumento da atividade de

fosfatase alcalina. A 1,25 dihidroxivitamina D3 aumentou

coincidentemente a expressão gênica de osteopontina, uma

glicoproteína fosforilada secretada na matriz extracelular óssea que

regula a calcificação vascular em células musculares lisas. 77

Assim, a 1,25 dihidroxivitamina D3 é potente estimulador da

diferenciação osteoblástica por aumentar a expressão gênica de

osteocalcina e osteopontina. 78 Nesse modelo, a 1,25 dihidroxivitamina

D3 diminuiu a expressão de proteínas e genes relacionados com o

hormônio da paratireóide em células musculares lisas bovinas. 78

Outro estudo demonstrou que a 1,25 dihidroxivitamina D3 modulou

também a transcrição de genes relacionados com o hormônio da

paratireóide (PTHrP) em outras linhagens celulares (osteossarcoma de

ratos ROS 17/2.8), células escamosas humanas (NCI H520) e

queratinócitos humanos. 16, 79, 80


Outro modelo de calcificação da aorta envolve a administração de

0,25μg/kg de 1,25 dihidroxivitamina D3 durante seis semanas em ratos

submetidos a nefrectomia. Este modelo demonstrou aumento da

expressão dos marcadores osteoblásticos como osteopontina,

osteocalcina e sialoproteína óssea em aortas dos ratos estimulados com

1,25 dihidroxivitamina D3, quando comparados aos ratos controles.

Além disso, as células musculares lisas vasculares primárias de ratos

foram incubadas com diferentes concentrações de vitamina D3 (10-11 a

10-7 mol/l) demonstrando aumento da expressão de osterix, que é

importante fator de transcrição osteogênico na calcificação vascular. 74

A administração perivascular (aorta abdominal de ratos Sprague-

Dawley) de CaCl2 em altas concentrações (0,2 a 0,5 mol/L) determinou

formações aneurismáticas dos segmentos da aorta envolvidos

associadamente aumento da calcificação e degradação das fibras

elásticas. 23

O desenvolvimento do aneurisma é o resultado de reação

inflamatória intensa aos depósitos calcificados. 81-84 Na análise

estrutural da aorta, a maioria dos depósitos de cálcio aparece como

massas grandes e compactas que abrange toda a espessura da aorta e,

raramente podem ser observadas fibras elásticas. A administração

perivascular de baixa concentração de CaCl2 (0,15 mmol/L) após 7 dias,

permite demonstrar o processo inicial de calcificação, ou seja, níveis

moderados de calcificação das fibras elásticas e degradação da elastina,

bem como ausência de aneurisma e de intensa reação inflamatória. O


processo inicial da calcificação vascular está relacionado à formação de

pequenos depósitos de cálcio intimamente associados às fibras

elásticas, que segue o aspecto ondulado ou normal das mesmas. No

processo final da lesão vascular, os depósitos de cálcio crescem entre as

fibras e conectam-se as estruturas adjacentes resultando em

degradação das fibras elásticas. Além disso, foi demonstrado

desorganização da rede de colágeno, com diminuição da desmosina

acompanhada de perda da ondulação das fibras elásticas,

paralelamente ao aumento de cálcio em aortas calcificadas. As áreas

amplamente calcificadas apresentam características típicas de

depósitos minerais maciços, que aparentemente adquirem a forma

tubular do vaso sanguíneo. 23

Esses aspectos morfológicos e bioquímicos podem ser observados

em pacientes com Síndrome de Marfan 85, 86 e na doença de Monckeberg

ou Esclerose Medial 15, 87 e, possivelmente reflete um processo

degenerativo. Além disso, as MMPs desempenham importante papel e

sabe-se que estão com atividade aumentada em vários processos

degenerativos vasculares. 88

Outro modelo agudo de hipervitaminose D envolve a

administração subcutânea de 500.000 UI/Kg de peso corporal de

vitamina D3 em camundongos fêmeas, diariamente, por três dias, a fim

de estudar calcificação em tecidos moles. 75

2. HIPÓTESE

H i p ó t e s e 43

2. HIPÓTESE

A hipótese deste estudo é que camundongos ob/ob tenham uma

resposta exacerbada de remodelamento vascular quando comparado ao

seu background camundongo controle (C57BL/6), após estímulo com

vitamina D3 in vivo. Tais mecanismos envolveriam aumento do estresse

oxidativo local e da atividade das metaloproteinases de matriz,

ocasionando alterações estruturais vasculares, maior destruição de

fibras elásticas, alterações do colágeno e calcificação, resultando em

remodelamento vascular.

3. OBJETIVOS

O b j e t i v o s 45

3. OBJETIVOS

O objetivo mais amplo deste estudo é entender o efeito da

vitamina D3 no remodelamento vascular associado à calcificação em

camundongos ob/ob (obesos e com resistência à insulina) comparado

aos controles (C57BL/6). Assim, queremos explorar os mecanismos

pelos quais camundongos ob/ob desenvolvem remodelamento vascular

e calcificação in vivo.

Os objetivos específicos deste projeto são:

Objetivo específico 1: caracterizar o remodelamento vascular em

camundongos ob/ob e em C57BL/6, após estímulo calcificador, quanto

a: mudanças na expressão gênica e/ou reguladoras da calcificação

vascular.

Objetivo específico 2: avaliar a produção de radicais livres.

Objetivo específico 3: investigar o remodelamento da matriz

extracelular do vaso, incluindo a destruição de fibras elásticas e a

deposição de colágeno, bem como atividade enzimática de

metaloproteinases de matriz extracelular.

4. MATERIAIS E MÉTODOS

M a t e r i a i s e M é t o d o s 47

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Animais

Foram utilizados 40 camundongos ob/ob (obesos, resistentes à

insulina e deficientes em leptina) e 40 camundongos C57BL/6, machos,

com 16 a 20 semanas de idade. Estes camundongos foram adquiridos

da Jackson Laboratory e do centro de pesquisa da Faculdade de

Medicina da Universidade de São Paulo.

Os camundongos ob/ob e C57BL/6 foram mantidos em gaiolas

de criação, sob condições ambientais controladas com temperatura de

22±2 °C, umidade relativa de 55±10%, ciclo de iluminação 12h

claro/12h escuro e alimentados ad libitum com água e ração,

permanecendo por um período de adaptação aos gaioleiros de 20 a 30

dias.

4.2 Comitê de ética em pesquisa

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da

Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo possuindo o

número de protocolo (129/15).

4.3 Modelo experimental in vivo

O modelo experimental in vivo que mimetiza a calcificação

vascular após injeção intraperitoneal (i.p.) de vitamina D3 8.000 UI/kg


de peso corporal foi realizado em camundongos machos C57BL/6 (20-

25 gramas) e em ob/ob (50 a 60 gramas). A dose de 8.000 UI/Kg peso

corporal de vitamina D3 administrada nos camundongos durante 14

dias foi previamente padronizada em nosso laboratório a fim de estudar

seus efeitos crônicos em um modelo de obesidade e resistência à

insulina e, consequentemente promover calcificação. Os camundongos

foram divididos em 4 grupos: C57CT (n=20) e OBCT (n=20) que

receberam solução fisiológica 0,9% i.p., C57VD (n=20) e OBVD (n=20)

que receberam injeção de vitamina D3 8.000 UI/kg de peso corporal i.p.

diariamente por um período de 7 ou 14 dias com o objetivo de avaliar a

calcificação in vivo em diferentes intervalos de tempo. A mortalidade foi

de aproximadamente 10% tanto em camundongo ob/ob como em C57

após injeção i.p. de vitamina D3 durante 14 dias. Os camundongos

foram eutanasiados com dose letal de ketamina e de xilazina após 7 e

14 dias. Após a eutanásia, algumas aortas foram incluídas em O.C.T.

Tissue-Tek® (n=6), armazenadas em freezer a -80º C e, posteriormente,

utilizadas para análise de radicais livres, imunofluorescência,

calcificação vascular e atividade das metaloproteinases de matriz in situ.

Enquanto aortas de outros camundongos foram incluídas em parafina

(n=6) para caracterização do remodelamento vascular, definido como

qualquer mudança da área compreendida pela lâmina elástica externa

(LEE) e para avaliação da matriz extracelular do vaso: calcificação,

fibrose e fibras elásticas do vaso.


4.4 Delineamento experimental

4.4.1 Avaliação temporal 1

Após sete dias de protocolo experimental in vivo os camundongos

C57CT, C57VD, OBCT e OBVD foram eutanasiados, as aortas torácicas

dissecadas para avaliação da expressão de RNAm de Runx2, Msx2,

Fosfatase Alcalina e GAPDH por RT-PCR.

Figura 4. Delineamento do protocolo experimental in vivo, após 7 dias de

estímulo com vitamina D3 em ob/ob e em C57BL/6.

4.4.2 Avaliação temporal 2

Após 14 dias de protocolo experimental in vivo os camundongos

C57CT, C57VD, OBCT e OBVD foram eutanasiados, as aortas torácicas

dissecadas para: a) mensuração da concentração sérica de cálcio e

fósforo; b) análise macroscópica da aorta; c) quantificação do

remodelamento vascular por planimetria; d) análise da matriz


extracelular por microscopia da aorta através da avaliação do conteúdo

de colágeno do vaso por coloração específica tricrômio de masson e das

fibras elásticas, através de coloração verhoeff-van gieson; e) avaliação

da calcificação, através de colaração específica para cálcio Alizarin Red

S e de OsteoSense; f) expressão de genes de calcificação por RT-PCR; g)

detecção de radicais livres por adutos de DMPO in vivo e h) atividade de

metaloproteinase in situ através do kit DQ-gelatinase.

Figura 5. Delineamento do protocolo experimental in vivo, após 14 dias

de estímulo com vitamina D3 em ob/ob e em C57BL/6


4.5 Preparo de vitamina D3

A vitamina D3 foi ressuspensa em 5 mL de etanol absoluto e,

posteriormente, alíquotada em eppendorf de 0,2 mL e acondicionada em

freezer -20oC. Diariamente, a vitamina D3 foi diluída em 500 uL de

solução fisiológica para injeção intraperitoneal nos camundongos

C57VD e OBVD.

4.6 Obtenção das amostras de sangue total

4.6.1 Sangue total

As amostras de sangue total foram obtidas por punção do plexo

axilar em camundongos previamente anestesiados com xilazina (16

mg/kg de peso corporal) e ketamina (120 mg/kg de peso corporal) sem

anticoagulante para dosagem da concentração sérica de cálcio.

4.6.2 Soro

As amostras de sangue permaneceram em repouso durante 20

minutos à temperatura ambiente. Após retração do coágulo, as mesmas

foram centrifugadas a 2000 rpm, durante 15 minutos a 4o C e utilizadas

para dosagem da concentração sérica de fósforo inorgânico. E as outras

alíquotas foram armazenadas a -80oC para experimentos futuros.


4.7 Avaliação bioquímica do sangue

A partir da obtenção de sangue total, conforme descrito no item

4.6.1, foi realizada a dosagem da concentração sérica de cálcio através

do equipamento i-STAT1 CHEM 8+ da Abbott.

4.7.1 Determinação da concentração sérica de fósforo inorgânico

A determinação da concentração sérica de fósforo inorgânico foi

realizada com amostras de soro obtidas de acordo com o descrito no

item 4.6.2 utilizando o kit Fósforo UV Liquiform. O método direto para

determinação de fósforo inorgânico no soro foi desenvolvido por Daly e

Ertingshausen e modificado pela Labtest. O sistema para determinação

do fósforo inorgânico por fotometria em ultravioleta, com reação de

ponto final baseia-se na seguinte reação:

Fósforo inorgânico + H2SO4 + Molibdato de Amônio =

Complexo Fosfomolibdato não reduzido.

O fósforo inorgânico reage com o molibdato de amônio na

presença do ácido sulfúrico resultando na formação de um complexo

fosfomolibdato não reduzido. A absorbância em 340 nm do complexo

formado é proporcional à concentração de fósforo inorgânico na

amostra.

O soro obtido dos camundongos foi separado após 20 minutos da

colheita para minimizar a liberação do fósforo das hemácias. Para

dosagem de fósforo inorgânico, as amostras de soro foram


homogeneizadas e, posteriormente foi pipetado 0,01 mL das amostras

em duplicata na placa de 96 poços. Na mesma placa, foi pipetado 0,01

mL do padrão e 0,01 mL do branco ambos em duplicata. Em seguida, a

placa foi agitada e incubada em banho-maria a 37o C, durante 5

minutos. Após esse período, foi determinada a absorbância do teste e do

padrão em 340 nm, acertando o zero com o branco. A quantificação da

concentração de fósforo inorgânico foi realizada dividindo a absorbância

do teste pela absorbância do padrão e, posteriormente multiplicando

por 5.

4.8 Quantificação do remodelamento vascular através de

planimetria do vaso

Os camundongos foram eutanasiados com dose letal de ketamina

e de xilazina e, posteriormente, perfundidos com solução fisiológica.

Imediatamente, a aorta ascendente após a valva aórtica foi cateterizada

com gelco plástico e mantida sob pressão de 100mmHg através de

sistema de injeção fechada utilizando o manômetro durante 1 hora. O

corte transversal da aorta foi fixado, incluído em parafina e, em

seguida, cortado em micrótomo. A quantificação do remodelamento

vascular foi realizada através de planimetria do vaso utilizando o

programa CellSens Dimension do microscópio Olympus. O

remodelamento vascular positivo foi definido como qualquer aumento

compreendido pela lâmina elástica externa (LEE) quando comparado ao

controle e foi calculado através de quantificação da: a) espessura da


parede vascular: medida linear entre a lâmina elástica externa e

interna; b) área do lúmen do vaso e comprimento da lâmina elástica

interna; c) área total do vaso, compreendida pela lâmina elástica

externa, assim como o comprimento da lâmina elástica externa. As

mensurações foram realizadas em quatro campos diferentes da aorta,

sendo extraída a média a fim de classificar o remodelamento vascular

em excêntrico (positivo), normal (equilibrado) ou concêntrico (negativo),

além de hipertrófico (maior espessamento da parede vascular), eutrófico

(espessura mantida da parede vascular) ou hipotrófico (maior

afilamento da parede vascular). 44

4.9 Morfologia: estudo do remodelamento da matriz extracelular

Para avaliar o remodelamento da matriz extracelular foram

realizadas colorações padrão hematoxicilina e eosina, tricrômio de

masson, verhoeff-van gieson e alizarin red S. As colorações foram

realizadas em tecidos emblocados em parafina e, posteriormente

cortados a 4 μm em micrótomo.

4.9.1 Cálculo de colágeno e das fibras elásticas do vaso

Foi mensurada a área e a percentagem da expressão de colágeno,

através da coloração tricrômio de masson usando o microscópio

Olympus. As fibras elásticas foram avaliadas pela coloração verhoeff-van

gieson e a destruição de fibras elásticas através da interrupção das


fibras em contiguidade na aorta. O resultado de cada grupo foi

interpretado através da área e da percentagem (multiplicado por 100)

demonstrado pela média de cada aorta e pelo desvio padrão.

4.10 Histoquímica: Alizarin Red S

4.10.1 Desparafinização das lâminas

As lâminas silanizadas contendo os cortes da aorta de

aproximadamente 4 μm foram montadas em suporte e mantidas em

estufa a 60oC durante 20 minutos. Em seguida, foram colocadas em 3

banhos de xilol durante 3 minutos em cada banho.

4.10.2 Hidratação

As lâminas foram mergulhadas em etanol absoluto por 1 minuto,

etanol 95% (1 min.), etanol 70% (1 min.) e, posteriormente, lavadas em

água corrente e deionizada.

4.11 Determinação da calcificação vascular por Alizarin Red S

A determinação da calcificação vascular foi realizada através da

coloração Alizarin red S. As lâminas foram desparafinizadas e

hidratadas de acordo com o descrito no item 4.10.1 e 4.10.2,

respectivamente. As lâminas contendo as aortas foram incubadas com

Alizarin Red S 1%, pH=4,1 por aproximadamente 7 minutos. A


coloração foi observada em microscópio após 7 minutos de incubação

com o corante Alizarin Red S. Em seguida, as lâminas foram lavadas

três vezes com água destilada por 3 minutos cada lavagem e,

posteriormente, lavadas com lamínulas. As áreas de calcificação

avermelhadas foram analisadas e o resultado quantificado através da

área e percentagem de calcificação usando o microscópio Olympus

modelo TH4.

4.12 Quantificação da calcificação vascular por OsteoSense® ex

vivo

A calcificação da aorta foi avaliada utilizando o marcador

OsteoSense® 680EX, adaptado de estudos prévios, 89, 90 através do

espectrofluorímetro tecidual com excitação/emissão de 675/720nm,

respectivamente. Após 14 dias de protocolo experimental in vivo, foi

administrado 0,2 μm de OsteoSense diluído em 100 μL de PBS i.p. nos

camundongos C57CT, C57VD, OBCT e OBVD. Após 24 horas de

administração, os animais foram eutanasiados, perfundidos com

solução fisiológica e, em seguida, a aorta foi dissecada. O tecido foi

colocado sobre uma superfície preta para evitar a refletância da

fluorescência, dentro do equipamento de fluorescência IVIS® Lumina LT

Series III da Perkin Elmer, com um tempo de exposição de 4

milisegundos e um campo de visão de 12,5 cm. Os dados foram

analisados após a aquisição das imagens, normalizando o sinal de


fluorescência nas unidades de fótons/s, também utilizando uma região

de interesse de 4,0 cm2 e ângulo sólido estereoradio.

4.13 Detecção proteica por imunofluorêscencia

As aortas congeladas a fresco em O.C.T. Tissue Tek Sakura e

cortadas a 4 μm em criostato foram fixadas em paraformaldeído 4% em

PBS, pH 7,4 durante 15 minutos à temperatura ambiente.

Posteriormente, as lâminas foram lavadas duas vezes em PBS gelado. A

permeabilização foi realizada através da incubação com PBS contendo

0,25% de Triton X-100 durante 15 minutos. Em seguida, as lâminas

foram lavadas três vezes durante 5 minutos. O bloqueio foi realizado

através da incubação das lâminas com 1% de BSA em PBS contendo

Triton (PBS-T) durante 30 minutos. O anticorpos primários específicos

foram incubados por 12 horas a 4o C, diluídos em PBS contendo 1

mg/ml de albumina. Em seguida, foi realizada a incubação com

anticorpo secundário durante 1 hora a temperatura ambiente. As aortas

foram analisadas e quantificadas em microscópio confocal Zeiss LSM

710.

4.14 RT-PCR

4.14.1 Extração de RNA tecidual

A aorta foi coletada, armazenada em RNA later® e mantida a -80o

C. As amostras foram manipuladas com luvas, material estéril tratado


previamente com água DEPC, portanto livre de RNAse. A aorta foi

macerada em gral e pestilo de porcelana contendo nitrogênio líquido.

Foi adicionado 1 mL de Trizol ao tecido que foi macerado novamente e

homogeneizado. A amostra foi transferida para microtubo de 1,5 mL e,

posteriormente, mantida sob agitação, durante 1 hora. Adicionamos

500 uL de clorofórmio em cada microtubo de 1,5 mL que foi agitado por

inversão durante 15 segundos; incubado por 15 minutos à temperatura

ambiente e submetidos à centrifugação de 13000 rpm por 15 minutos,

a 4o C. A fase superior foi, então, transferida para outro microtubo. O

RNA foi precipitado da fase aquosa com a adição de 500 uL de álcool

isopropílico. Depois, agitada e incubada por 10 minutos à temperatura

ambiente. As amostras foram centrifugadas novamente a 13000 rpm, 4o

C por 15 minutos, seguido de remoção do sobrenadante e lavagem do

RNA precipitado com 1 mL de etanol 70% em água DEPC. Em seguida,

foram centrifugadas por 10 minutos, 9500 rpm à 4o C, seguido de

remoção do sobrenadante. Cada amostra foi ressuspensa em 15uL de

água livre de RNase e mantidas em gelo. Após 15 minutos, foi

adicionado 2 uL de EDTA 25mM e incubados em estufa a 65oC, durante

10 minutos. O RNA foi quantificado medindo-se a absorbância em

260nm (NanoVue) e a pureza pela relação da absorbância entre

260/280 nm.


4.14.2 Síntese de cDNA

A reação de transcriptase reversa foi feita usando o Kit High

Capacity (Life Technologies). Foi utilizado 0,1μg de RNA que foi

convertido em cDNA pela incubação com 1,0 uL de dNTP (100 mM), 0,8

uL de Tampão RT, 2,0 uL de Random Primers e 1,0 uL de MultiScribe

Reverse Transcriptase a 25º C por 10 minutos, 37 º C por 120 minutos

e 85oC por 5 minutos.

4.14.3 Reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa

(RT-PCR)

Adicionou-se 1μL da amostra de cDNA em microtubos

juntamente com 8μL de Taqman e 1μL primers específicos marcados

com FAM. Como controle negativo da reação foi utilizado 8μL de

Taqman, 1μL primers e 1μL de água DEPC, sem o cDNA. As amostras

foram centrifugadas e normalizadas pelo GAPDH após amplificação por

40 ciclos no equipamento 7500 Real Time PCR System da Applied

Biosystems. Os resultados foram expressos por delta-delta Ct.

4.15 Detecção de radicais livres por adutos de DMPO in vivo

A metodologia empregada na detecção direta de radicais livres foi

realizada através da injeção intraperitoneal de 2g/Kg de peso corporal

de DMPO em camundongos ob/ob e em C57BL/6, após 14 dias de

protocolo experimental in vivo. A aplicação intraperitoneal de DMPO foi


divida em duas doses e administradas 6 e 2 horas anteriores a

eutanásia, de acordo com o método descrito por Khoo et al. 91

Posteriormente, os camundongos foram eutanasiados com dose letal de

xilazina e ketamina e as aortas dissecadas. Imediatamente, as mesmas

foram congeladas a fresco em O.C.T. Tissue Tek Sakura e cortadas a 6

μm em criostato. As aortas foram fixadas em paraformaldeído 4% em

PBS, pH 7,4, durante 15 minutos à temperatura ambiente. Após a

fixação, foram incubadas com anticorpo primário anti-DMPO conjugado

com FITC durante 12 horas para detecção de radicais livres por adutos

de DMPO. As lâminas foram montadas com lamínula, analisadas e

quantificadas em microscópio Confocal Zeiss LSM 710.

4.16 Atividade enzimática da metaloproteinase de matriz in situ

A atividade enzimática da metaloproteinase de matriz in situ foi

avaliada utilizando-se o Kit DQ-gelatinase. Foi utilizado 1 mg/mL de

DQ-gelatinase como substrato que foi diluída em água MiliQ e em

seguida, diluída novamente 1:10 em tampão do kit. Foram utilizadas

aortas congeladas a fresco em O.C.T. Tissue Tek Sakura, cortadas a 6

μm em criostato que foram incubadas com 200 uL da DQ-gelatina

previamente diluída, durante 6 horas à temperatura ambiente. O

controle negativo foi incubado na presença do inibidor de

metaloproteinase de matriz denominado 1,10 fenantrolina contido no

kit. A atividade da metaloproteinase de matriz foi detectada por


microscopia confocal Zeiss LSM 710 através de excitação de 490nm e de

emissão de 530 nm.

4.17 Reagentes

A vitamina D3 ou colecalciferol (código: C1357) e o Alizarin Red S

foram adquiridos da Sigma Chemical, St Louis, MO, EUA. O 5,5 dimetil-

1-pirrolina-N-óxido (DMPO) foi obtido da Enzo Life Science,

Farmingdale, NY, EUA e o anticorpo anti-DMPO da Abcam, Milton,

Cambridge, Reino Unido. O Trizol, Hoechst, DNase, Taqman Universal

PCR Master Mix e os primers (Msx2, Runx2, fosfatase alcalina e GAPDH)

eram da Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, EUA. O

O.C.T. Tissue TEK Compound foi comprado da Sakura Finetek,

Torrance, CA, EUA e o kit DQ-gelatinase da Molecular Probes, Eugene,

Oregon, EUA. O cartucho CHEM8+ do equipamento i-STAT utilizado

para análise bioquímica foi obtido da Abbott Laboratories, Lake Bluff,

Illinois, EUA. A síntese de cDNA foi adquirida através do kit High

Capacity cDNA Reverse Transcription com inibidor de RNase da Applied

Biosystems, Foster, CA, EUA. Para imunofluorescência, foi utilizado o

anticorpo monoclonal anti-BMP-2 e o anticorpo secundário anti-mouse

da Abcam. O kit fósforo UV Liquiform foi adquirido da Labtest

Diagnóstica SA, Lagoa Santa, MG, Brasil e o Osteosense® 680 da Perkin

Elmer, Waltham, Massachusetts, MA, EUA. A Ketamina (100 mg/mL) foi

comprada da Richmond División Veterinaria S.A., Grand Bourg, Buenos

https://www.google.com.br/search?newwindow=1&q=Waltham+Massachusetts&stick=H4sIAAAAAAAAAOPgE-LSz9U3MCooMTBJU-IAsTOqjE21tLKTrfTzi9IT8zKrEksy8_NQOFYZqYkphaWJRSWpRcUAAxikqkQAAAA&sa=X&ved=0ahUKEwicqsfc8JTOAhUDhpAKHadQCSMQmxMImgEoATAS

https://www.google.com.br/search?newwindow=1&q=Waltham+Massachusetts&stick=H4sIAAAAAAAAAOPgE-LUz9U3MMuNLzBS4gAxM6qMTbW0spOt9POL0hPzMqsSSzLz81A4VhmpiSmFpYlFJalFxQApgQyfQwAAAA&sa=X&ved=0ahUKEwithYmG65XXAhWMDZAKHcCpBy4QmxMInQEoATAT


Aires, Argentina e a Xilazina da Syntec, Cotia, São Paulo, Brazil. As

soluções foram preparadas com água purificada em sistema MiliQ.

5. ESTATÍSTICA

E s t a t í s t i c a 64

5. ESTATÍSTICA

Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão 59.

Analisamos os resultados através de ANOVA e, posteriormente, fizemos

o pós-teste de Newman-Keuls. Consideramos significância estatística

quando p<0,05.

O software utilizado foi o Prism GraphPad 5.0 (GraphPad Software

Inc., La Jolla, CA 92037 USA).

6. RESULTADOS

R e s u l t a d o s 66

6. RESULTADOS

6.1 Modelo experimental in vivo

6.1.1 Caracterização do modelo experimental in vivo

Observamos aumento semelhante dos níveis plasmáticos de

cálcio iônico em OBVD e em C57VD, após 14 dias de protocolo quando

comparado aos seus respectivos controles (Figura 6A). Não houve

diferença estatística entre os grupos quando mensuramos os níveis

plasmáticos de fósforo em sangue total (Figura 6B).

Figura 6. Gráfico representativo da concentração de cálcio iônico e fósforo sérico, após 14 dias de protocolo experimental in vivo.

A) Aumento semelhante dos níveis plasmáticos de cálcio iônico em camundongos OBVD e em C57VD. Os valores basais não tiveram

diferença estatística (n=5-6). B) A concentração plasmática de

fósforo não diferiu entre os grupos (n=5). *p<0,05 vs. seus respectivos controles (ANOVA seguido de Newman-Keuls).


6.2 Análise macroscópica da aorta

Durante a manipulação das aortas, as mesmas apresentavam-se

quebradiças, com consistência mais gelatinosa e elasticidade reduzida.

Além disso, houve aumento do diâmetro transversal do vaso em

camundongos OBVD (Figura 7).

Figura 7. Segmento da aorta torácica de C57BL/6 e de ob/ob, após 14

dias de protocolo experimental in vivo A) Não houve diferença entre o segmento da aorta torácica de

camundongos C57VD e o de C57CT. B) Notamos aumento do diâmetro transversal do vaso em aortas de camundongos OBVD

quando comparado aos controles e à C57VD.

6.3 Análise da matriz extracelular e quantificação do

remodelamento vascular por planimetria

A hipervitaminose D contribuiu para aumentar a circunferência

da lâmina elástica externa (LEE) após 14 dias de protocolo experimental

(Figura 8A), determinando um aumento da área circunferencial do vaso

em OBVD quando comparado aos controles e a C57VD (Figura 8B).

Esse resultado foi demonstrado através de microscopia da aorta após

coloração com hematoxicilina e eosina (Figura 9).


Figura 8. Gráfico representativo da quantificação da circunferência da lâmina elástica externa e da área da parede do vaso, após 14

dias de protocolo experimental in vivo. A) Aumento da circunferência da lâmina elástica externa (um) em

aortas de camundongos OBVD (n=6). B) Notamos aumento da área total do vaso (um2) em OBVD (n=6). *p<0,05 vs. todos os grupos

(ANOVA seguido de Newman Keuls).

Figura 9. Análise histológica após coloração com hematoxicilina eosina.

Aumento da circunferência da lâmina elástica externa (seta) e da área da parede do vaso em aortas de camundongos OBVD, após 14

dias de protocolo experimental in vivo (aumento de 5x), n=6.


Nesse contexto, a vitamina D3 também aumentou o comprimento

da lâmina elástica interna ocasionando um aumento do lúmen vascular

em aortas de camundongos OBVD, denotando um processo de

remodelamento vascular positivo ou excêntrico, respectivamente, o que

não ocorreu em C57VD e em seus respectivos controles (Figura 10).

Figura 10. Gráfico representativo da quantificação da circunferência da

lâmina elástica interna e da área do lúmen, após 14 dias de protocolo experimental in vivo

A) Aumento da circunferência da lâmina elástica interna (um) em aortas de camundongos OBVD (n=6). B) Aumento da área do

lúmen (um2) em OBVD (n=6). * p<0,05 vs. todos os grupos


Houve, ainda, diminuição significativa da espessura da parede do

vaso em aortas de camundongos OBVD caracterizando remodelamento

vascular hipotrófico (Figura 11).


Figura 11. Gráfico representativo da quantificação da espessura da parede

do vaso, após 14 dias de protocolo experimental in vivo. Houve diminuição da espessura da parede do vaso (um) em aortas

de camundongos OBVD (n=6). * p<0,05 vs. todos os grupos


6.4 Análise da matriz extracelular por microscopia da aorta

6.4.1 Avaliação do conteúdo de colágeno do vaso

Na Figura 12, observamos maior deposição de colágeno na parede

do vaso de OBVD em comparação a C57VD (um2), quantificada na

Figura 13. Conforme demonstrado na Figura 12, a microtopografia da

fibrose concentrou-se, principalmente ao redor dos núcleos de

calcificação nos camundongos OBVD. Não notamos fibrose significativa

em C57CT e em C57VD.


Figura 12. Análise histológica após coloração com masson Notadamente, observamos ainda maior deposição de colágeno

(seta) em aortas de camundongos OBVD, após 14 dias de protocolo experimental in vivo. Houve discreta fibrose em aortas de

camundongos OBCT (aumento de 20x), n=6.

Figura 13. Gráfico representativo da quantificação da área e da percentagem de colágeno, após 14 dias de protocolo

experimental in vivo.

A) Aumento de colágeno em aortas de camundongos OBVD vs. OBCT demonstrado pela área em um2 (n=6). B) Notamos

aumento da percentagem de colágeno na parede do vaso de camundongos OBVD vs. OBCT (n=6). * p<0,05 vs. OBCT.


6.4.2 Avaliação das fibras elásticas do vaso

Na Figura 14, observamos alteração da arquitetura das fibras

elásticas através de coloração específica, Verhoeff-Van Gieson, em

aortas de camundongos OBVD, após 14 dias. Houve aumento de

elastólise ou rotura das fibras elásticas em aortas de camundongos

OBVD, quantificada na Figura 15. Em contiguidade a áreas de

calcificação vascular houve perda significativa de fibras elásticas. Não

notamos fragmentação das fibras elásticas em C57CT, OBCT e em

C57VD.

Figura 14. Análise histológica após coloração de Verhoeff-Van Gieson

Observamos destruição de fibras elásticas (seta) apenas em aortas de OBVD, principalmente em regiões do vaso próximas a núcleos

de calcificação (seta), após 14 dias de protocolo experimental in

vivo (aumento de 20x), n=6.


Figura 15. Gráfico representativo da quantificação da fragmentação de

fibras elásticas, após 14 dias de protocolo experimental in

vivo. Aumento da fragmentação de fibras elásticas em aortas de OBVD

(n=6).

6.4.3 Avaliação da calcificação vascular por Alizarin Red S

Aortas de camundongos ob/ob submetidos ao estímulo

calcificador (OBVD) apresentaram aumento significante da calcificação

vascular em comparação com C57VD, o qual demonstrou discreta

mineralização da aorta (Figura 9). Os camundongos OBCT e C57CT não

demonstraram calcificação detectável por Alizarin Red S (Figuras 16 e

17).

Figura 16. Análise histológica após coloração por Alizarin Red S. Demonstramos calcificação aumentada (setas) em OBVD vs. C57VD e seus respectivos controles, após 14 dias de protocolo experimental in vivo (aumento de 20x), n=6.


Figura 17. Gráfico representativo da quantificação da área e da percentagem de calcificação, após 14 dias de protocolo

experimental in vivo.

A) Aumento de calcificação em OBVD demonstrado pela área em um2 vs. C57VD. B) Aumento da percentagem de calcificação em

relação à parede do vaso de OBVD vs. C57VD. * p<0,05 vs. C57VD, (n=6).

6.5 Avaliação da calcificação vascular por OsteoSense® ex vivo

Na figura 18, demonstramos aumento da calcificação em aortas

de OBVD em comparação com OBCT, o qual demonstrou discreta

calcificação da aorta. Os camundongos C57CT e C57VD não

demonstraram calcificação detectável por OsteoSense.


Figura 18. Detecção da calcificação por OsteoSense® ex vivo

Demonstramos calcificação aumentada (amarelo) em OBVD vs. todos os grupos após 14 dias de protocolo experimental in vivo, (n=3).

6.6 Avaliação do remodelamento vascular associado à calcificação

após protocolo experimental in vivo

Observamos notadamente que o remodelamento vascular positivo

em OBVD se correlacionou diretamente com o aumento da calcificação

na aorta R2=0,80 (p=0,0027), Figura 19. Em paralelo, houve maior

fragmentação das fibras elásticas (Figura 14) e maior fibrose em OBVD,

conforme demonstrado anteriormente na Figura 12.


Figura 19. Gráfico representativo da correlação entre o remodelamento vascular e a intensidade de calcificação, após 14 dias de

protocolo experimental in vivo. Observamos forte correlação entre o aumento do remodelamento

vascular positivo representado pela área total do vaso e pelo aumento da intensidade de calcificação em OBVD. R2=0,8006,

p=0,0027 (n=8).

6.7 Expressão de RNAm de Runx2, Msx2 e de Fosfatase alcalina

O RT-PCR da aorta mostrou diminuição da expressão gênica de

Runx2, Msx2 e de Fosfatase Alcalina em ob/ob após sete dias de

estímulo com Vitamina D3 (OBVD) normalizado pelo GAPDH (Figura

20). Por outro lado, observamos aumento da expressão gênica de Msx2,

Runx2 e de Fosfatase Alcalina em ob/ob na condição basal (sem

estímulo).


Figura 20. Gráfico representativo da expressão de RNA mensageiro para

Runx2, Msx2 e Fosfatase Alcalina por RT-PCR em aorta de

C57BL/6 e de ob/ob, após 7 dias de protocolo experimental in vivo.

A) Observamos diminuição da expressão de RNAm para Msx2 em aortas de OBVD (n=4). B) Notamos diminuição da expressão de

RNAm para MSX2 em aortas de OBVD (n=5). C) Demonstramos diminuição da expressão de RNAm para fosfatase alcalina em

aortas de OBVD (n=5). Houve aumento da expressão de RNAm de Runx2, Msx2 e de fosfatase alcalina na condição basal. * p<0,05


6.8 Avaliação da expressão protéica de BMP-2

Notamos aumento exuberante da expressão de proteína

morfogênica de osso-2 (BMP-2) em aortas de camundongos OBVD

(seta), denotando “transativação” do BMP-2 um dos mais importantes

fatores estimulatórios da calcificação vascular descritos na literatura

(Figura 21). O aumento do BMP-2 resultou em desdiferenciação da

CMLV em nosso modelo de diabetes/resistência à insulina.


Figura 21. Expressão proteica de BMP-2, após 14 dias de protocolo experimental in vivo.

Demonstramos aumento da expressão proteica de BMP-2 em

aortas de camundongos OBVD (setas). Aumento de 400x, n=5.

6.9 Detecção de radicais livres por adutos de DMPO in vivo

Por meio de “imunospintrapping”, notamos aumento da formação

de radicais livres em aortas de camundongos OBVD que possivelmente

potencializa o remodelamento vascular associado à calcificação em

nosso modelo de diabetes/resistência à insulina. O aumento de radicais

livres foi demonstrado em vermelho (seta) por microscopia confocal

(Figuras 22 e 23).


Figura 22. Detecção de radicais livres por adutos de DMPO, após 14 dias

de protocolo experimental in vivo.

Houve aumento da produção de espécies reativas de oxigênio em aortas de camundongos OBVD (setas). Aumento de 400x, n=6.

Figura 23. Gráfico representativo da quantificação da intensidade de

fluorescência de radicais livres, após 14 dias de protocolo experimental in vivo.

Aumento da intensidade de fluorescência de radicais livres em OBVD, (n=6).


6.10 Avaliação da atividade das metaloproteinases de matriz

Na Figura 24, observamos aumento da atividade de

metaloproteinases de matriz (MMP) in situ em aortas de camundongos

OBVD, demonstrado através do aumento da fluorescência em verde

(seta).

Figura 24. Atividade de metaloproteinases de matriz por confocal em aortas torácicas de C57BL/6 e de ob/ob, após 14 dias de

protocolo experimental in vivo.

Atividade das metaloproteinases de matriz aumentada em aorta de OBVD (verde). Aumento de 400x, n=4.

7. DISCUSSÃO

D i s c u s s ã o 82

7. DISCUSSÃO

Usamos um modelo experimental de calcificação vascular

consagrado na literatura 77, 92-95 através de hipervitaminose D, visando

compreender as alterações fisiopatológicas como o enrijecimento

vascular, caracterizado por calcificação e elastólise, e assim investigar

os mecanismos envolvidos no remodelamento vascular e na calcificação

vascular. Tal modelo assemelha-se ao do envelhecimento do vaso 96 e é

relevante em diversas condições patológicas como aneurismas,

aterosclerose, fístula arteriovenosa e no desbalanço de fluxo. 35 Em

humanos, tal processo determina: a) rigidez vascular com aumento da

pressão de pulso e da velocidade da onda de pulso, presentes na

hipertensão arterial sistêmica, por exemplo; b) perda da autorregulação

de fluxo, corroborando para isquemia de órgãos e tecidos distais; c)

lesão de órgãos alvo (coração, cérebro, rins e retina). Além disso, a

rigidez vascular pode complicar procedimentos vasculares e

endovasculares e de revascularização. 97

Neste trabalho, analisamos a resposta a estímulo calcificador com

vitamina D3 e o remodelamento vascular em camundongos

diabéticos/com resistência à insulina (ob/ob) comparados aos

controles. Especialmente, neste grupo de diabetes/resistência à

insulina, em que a doença/risco cardiovascular é exacerbada, há

grande interesse científico em entender tais mecanismos e avaliar

possíveis alvos terapêuticos. Ainda não se sabe como o diabetes mellitus

pode modular o remodelamento vascular, e de forma complementar,


como a calcificação pode influenciar este processo. Postulamos que o

aumento da desdiferenciação da célula muscular lisa vascular, a

calcificação vascular, a alteração de componentes da matriz extracelular

como a destruição de fibras elásticas observada no modelo de diabetes

contribuem para a fisiopatologia do remodelamento vascular em aorta

de camundongo OBVD.

Em nosso modelo, a hipervitaminose D aumentou de maneira

semelhante os níveis séricos de cálcio iônico em camundongos ob/ob e

em C57BL/6. Um dos marcadores séricos da hipervitaminose D é a

hipercalcemia, devido a maior absorção intestinal de cálcio e a redução

de sua excreção pela urina. 77 Desse modo, as diferenças de

remodelamento vascular e alterações da matriz extracelular

(calcificação, elastólise e fibrose) encontradas em aortas de OBVD não

podem ser explicadas unicamente por diferenças do aumento do cálcio

iônico, mas por uma resposta individual do vaso. Desta forma, nosso

objetivo foi entender tal processo, através de investigação dos

mecanismos que determinaram remodelamento e calcificação vascular

neste modelo.

Na prática clínica, conforme consenso de 2011, a Sociedade de

Endocrinologia dos Estados Unidos, determinou que a concentração

sérica desejável de 25 (OH) vitamina D é >75 nmol/L (>30ng/ml).

Segundo o National Institute of Health, a ingesta de 700-800 UI/dia de

vitamina D3 e de 500-1.200 mg/dia de cálcio é recomendada para

pessoas entre 62 e 85 anos de idade e é importante para tentar


diminuir o risco de fratura e perda óssea, principalmente em mulheres

na pós-menopausa que apresentam risco aumentado de osteoporose.

No entanto, é importante ressaltar que o uso indiscriminado de

suplementos de cálcio (1,000 mg/dia) e de vitamina D3 (400 UI) por

mulheres na pós-menopausa durante 7 anos associou-se com um

aumento de 17% no risco de desenvolver cálculo renal. 98

A suplementação de cálcio aumentou em 31% o risco de infarto

agudo do miocárdio (IAM) em cinco estudos clínicos que incluíram

81.151 participantes. 99 Em outro estudo, envolvendo 11921 pacientes,

houve aumento de 27% em IAM, sendo esse estudo a análise de outros

11 publicados. 99 Porém, o Women’s Health Initiative CaD mostrou que

não houve aumento de eventos cardiovasculares em pacientes

suplementados com 1 g de cálcio e de 400 UI de vitamina D/dia

(n=36.282) seguidos por 7 anos. 98, 100 Assim, diante desses dados, a

reposição de cálcio e vitamina D3 deve ser individualizada e realizada

com parcimônia, nunca de forma indiscriminada ou prolongada, a fim

de não determinar efeitos de calcificação ectópica, como a mineralização

vascular e suas consequências clínicas.

Estudos in vitro com célula muscular lisa estimulada com altas

concentrações de fosfato apresentaram aumento da expressão de

marcadores osteogênicos (fosfatase alcalina, Runx2 e osterix) e

diminuição da expressão de marcadores de célula contrátil, como α-

actina de músculo liso (α-SMa), proteína 22α de músculo liso (SM22α),

desmina e cadeia pesada de músculo liso (SM-MHC). 9, 47, 101-103


Nosso grupo demonstrou que as células musculares lisas de

aortas de ob/ob são mais propensas à osteocondrogênese. 21 Neste

trabalho, observamos que a expressão gênica de fosfatase alcalina,

Msx2 e de Runx2 aumentou em ob/ob vs. C57BL/6 em situação basal

ou controle (sem estímulo calcificador). As células musculares lisas

vasculares de ob/ob apresentaram aumento da expressão gênica e

proteica de marcadores osteogênicos como a fosfatase alcalina, Msx2 e

Runx2 também após incubação com BMP-2 quando comparado ao

C57BL/6 sob as mesmas condições. 21

Em nosso modelo in vivo demonstramos também aumento da

expressão gênica de fosfatase alcalina, Msx2 e de Runx2 em aortas de

ob/ob e em C57BL/6. Porém, o RNAm de tais marcadores diminuiu

após 7 dias de estímulo com vitamina D3 in vivo. Este resultado,

entretanto, não afasta a possibilidade de expressão aumentada do

RNAm destes marcadores em avaliações temporais distintas, seja mais

precoce ou tardia. Ainda, outras formas de regulação gênica podem

estar envolvidas neste processo: pós-translacional, exercida por

microRNA 85 que atuam como reguladores da expressão gênica como

“feedback” regulatório à ossificação ectópica. Por exemplo, estudos

mostraram que o miR-204 regula a calcificação in vivo, em modelo

murino de calcificação vascular após injeção de 500.000 Ul/kg de

vitamina D3 subcutâneo, durante 3 dias. 104 Nesse modelo, a

calcificação vascular foi associada com aumento da expressão gênica de

Runx2 na aorta. 104 Estudos de outros grupos mostraram que células

musculares lisas vasculares estimuladas com BMP-2 apresentaram


diminuição da concentração de miR-30b e de miR-30c, com

consequente aumento da expressão de Runx2 estimulando a

mineralização ectópica. 105

Em nosso modelo de calcificação vascular associado à

diabetes/resistência à insulina, demonstramos que a hipervitaminose D

aumentou a expressão proteica de BMP-2 em aorta de ob/ob, que

possivelmente ativa o programa osteocondrogênico de células

musculares lisas vasculares, potencializando assim, a calcificação

vascular. O BMP-2 é uma proteína morfogenética óssea-2 que está

aumentada em lesões ateroscleróticas humanas ocasionando

desdiferenciação da CMLV. 32, 33 De acordo com publicação recente do

nosso grupo, CMLVs de ob/ob aumentaram a mineralização in vitro

após estímulo com BMP-2. 21 Outro mecanismo que pode explicar o

aumento da calcificação vascular é através do aumento do estresse

oxidativo. Notamos aumento exuberante de radicais livres em aorta de

OBVD detectado por DMPO e respectivo anticorpo. O DMPO é um aduto

que detecta radicais livres in vivo. A hiperglicemia em ob/ob pode

potencializar a calcificação vascular através do aumento do estresse

oxidativo. 9, 18, 19 O estresse oxidativo e nitrosativo, assim como a

diminuição da biodisponibilidade do óxido nítrico sabidamente

participam da calcificação valvar aórtica, 106 e estão aumentados ao

redor de núcleos de calcificação. 18 O H2O2 aumenta a expressão de

Runx2 resultando na desdiferenciação da CMLV em um fenótipo

osteogênico. 107


De acordo com nossos resultados, verificamos que camundongos

OBVD desenvolveram remodelamento vascular positivo ou excêntrico da

aorta, com aumento de 1,5 vezes o diâmetro do vaso. O remodelamento

vascular positivo em OBVD foi caracterizado pelo aumento do lúmen e

da área total do vaso, bem como pela diminuição da espessura da

parede do vaso denotando remodelamento vascular positivo hipotrófico.

Em nosso modelo de calcificação vascular in vivo, demonstramos

que o remodelamento vascular positivo em OBVD se correlacionou

diretamente com o aumento da calcificação na aorta, R2=0,80

(p=0,0027).

Sabidamente, o remodelamento vascular pode ocorrer juntamente

com mudanças na arquitetura da matriz extracelular da parede

vascular como a calcificação, a fibrose, hiperplasia das camadas íntima

e média, mudanças do colágeno e de fibras elásticas do vaso, assim com

a disfunção endotelial. 35 Nosso modelo demonstra alterações da

microarquitetura do vaso, relevantes em uma miríade de doenças

cardiovasculares, além da calcificação vascular como: remodelamento

vascular e da matriz extracelular com a deposição de colágeno, rotura

de fibras elásticas, secreção, determinando a perda de elasticidade e

rigidez vascular. Tais achados estão exacerbados em OBVD. A

elastocalcinose demonstrada em aorta de OBVD é caracterizada pela

deposição de hidroxiapatita nas lâminas elásticas das artérias, em

geral, um processo inicial de calcificação vascular. A elastocalcinose é

uma alteração da parede do vaso, também demonstrada em modelo de


calcificação vascular em camundongos deficientes em proteína ácido

glutâmico de matriz (MGP), uma proteína inibidora da calcificação

vascular, que necessita de gama-carboxilação para ser funcionalmente

ativa. Esta proteína também é funcionalmente deficiente em pacientes

anticoagulados cronicamente com Varfarina, um inibidor da vitamina K

101, 108 Em paralelo, a calcificação vascular pode ser acompanhada por

elastólise. 35 Em nosso modelo, observamos alteração da arquitetura

das fibras elásticas com aumento de elastólise ou rotura das fibras

elásticas em contiguidade a áreas de calcificação vascular em aortas de

OBVD. Isto também poderia explicar o remodelamento vascular

positivo, devido à perda de propriedades elásticas do vaso que

determina mudanças na capacidade de acomodação e ”recoil” do vaso,

além do aumento do shear stress. Por sua vez, a elastina degradada tem

alta afinidade pelo cálcio, o que facilita a progressão da calcificação

vascular. 109, 110 Em outros modelos de remodelamento vascular e

aneurisma, tais como a Síndrome de Marfan, as fibras elásticas estão

propensas à rotura, devido à mutação do gene da fibrilina-1. 78, 85, 111

Ainda, a degradação da elastina é causada por ativação de elastase e

metaloproteinases que têm um papel importante no remodelamento

vascular e na progressão da calcificação. 109, 110 Isto ocorre através de

peptídeos derivados da elastina que se ligam aos receptores laminina e

da elastina na superfície das CMLVs e através da transformação da

sinalização do fator de crescimento β podem aumentar a expressão de

Runx-2 que é importante na desdiferenciação osteocondrogênica e na

proliferação celular. 109, 110


Em nosso modelo, também demonstramos intenso depósito de

colágeno principalmente em torno dos núcleos de calcificação em aortas

de OBVD, favorecendo o remodelamento da matriz extracelular o que

pode influenciar a conformação geométrica do vaso associadamente à

maior calcificação vascular.

Para melhor entender este processo, investigamos mecanismos

que poderiam exacerbar o remodelamento positivo do vaso, tais como

aumento da atividade das metaloproteinases de matriz e fibrose, que

estavam aumentados em aorta de OBVD. Tal aumento da atividade de

metaloproteinase de matriz na parede do vaso com consequente

degradação de fibras elásticas corrobora para o remodelamento

vascular positivo. O diabetes mellitus aumenta a atividade das

metaloproteinases de matriz em células vasculares. 112

O estresse oxidativo aumentado na aorta de camundongos obesos

e com resistência à insulina in vivo também pode ter contribuído para

ativação das metaloproteinases de matriz. 111 Podemos fazer um

paralelo com a fisiopatologia da progressão de aneurisma da aorta

abdominal em que a degradação da matriz extracelular mediada por

proteases como MMPs é um mecanismo relevante. 113, 114 Neste

processo, alguns subtipos de metaloproteinases de matriz são expressos

na parede vascular como, MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-9 e MMP-12.

115 Para demonstrar a importância das metaloproteinases de matriz no

desenvolvimento de aneurisma da aorta abdominal, camundongos

“knockout” para as enzimas proteolíticas MMP-9 e MMP-2 não


desenvolvem a doença. 84 Além disso, existe um desequilíbrio entre

MMPs e TIMPs, culminando com a degradação da matriz extracelular

em aneurisma da aorta abdominal, hipertensão, aterosclerose e

calcificação. 116 Fazendo um paralelo com nosso modelo postulamos que

possa existir também um desequilíbrio entre MMPs e TIMPs

determinando, por fim, a degradação das proteínas da matriz

extracelular e, consequentemente, remodelamento vascular em OBVD.

Ainda, consideramos que o processo de desdiferenciação das células

musculares lisas vasculares em fenótipo osteocondrogênico que inicia a

calcificação vascular possa também ser um mecanismo de intersecção

que favoreça o remodelamento vascular positivo em OBVD, através da

regulação de expressão e atividade de MMP e TIMP. 14, 18 Ainda, células

vasculares podem secretar proteínas da família das metaloproteinases

de matriz in vitro, que desempenham papel importante no

remodelamento vascular 78, 117-120 e que degradam componentes da

matriz extracelular em pH fisiológico. 78

Estudos recentes têm demonstrado que o estresse oxidativo

participa do desenvolvimento do aneurisma da aorta abdominal. 121, 122

O aumento de radicais livres pode, posteriormente, promover a

inflamação, a atividade de metaloproteinases de matriz, a apoptose de

células musculares lisas ou alterações do colágeno. 122 Estudos

realizados em modelos de murinos de aneurisma da aorta abdominal

demonstraram que a NADPH oxidase e a eNOS são importantes à

síntese de radicais livres e progressão do aneurisma. 123 A inibição

destas enzimas impede o desenvolvimento do aneurisma da aorta


abdominal, através da diminuição da expressão de MMP-2 e MMP-9 em

tecidos da aorta. 123 O aumento do estresse oxidativo neste modelo de

diabetes e calcificação vascular com vitamina D3 poderia aumentar

atividade MMPs.

Por fim, nossos achados experimentais mais relevantes são:

camundongos ob/ob têm calcificação vascular aumentada após

estímulo calcificador com vitamina D3 in vivo e apresentaram

associadamente remodelamento vascular positivo hipotrófico. Ainda, a

obesidade e a resistência à insulina promovem mudanças estruturais

da parede vascular neste modelo como: deposição de colágeno e rotura

de fibras elásticas, aumento do estresse oxidativo e da atividade de

metaloproteinases, determinando a perda de elasticidade e aumento da

rigidez vascular, implicado em diversas doenças cardiovasculares e

envelhecimento.

8. CONCLUSÕES

C o n c l u s õ e s 93

8. CONCLUSÕES

Nossos resultados sugerem que a resposta vascular, nesse

modelo de obesidade e resistência à insulina, após estímulo calcificador

in vivo, está exarcebada e culmina com aumento da mineralização

ectópica do vaso por ativação de programa osteocondrogênico específico,

além de simultâneo remodelamento vascular positivo e hipotrófico. Essa

mudança conformacional e estrutural do vaso provavelmente tem

intersecção fisiopatológica comum com a ativação de genes osteogênicos

ativados pelo BMP-2, com aumento do estresse oxidativo e da atividade

metaloproteinase vascular. Esses resultados são importantes para

melhor conhecimento dessas vias de sinalização, e têm potencial de

identificar alvos terapêuticos para atenuar a progressão da calcificação

vascular associada à elastólise, aumento da rigidez vascular e

remodelamento vascular, marcadores de alta morbimortalidade durante

o envelhecimento e, especialmente, em pacientes com obesidade,

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R e f e r ê n c i a s B i b l i o g r á f i c a s 95

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ANEXO

ANEXO A – Aprovação do Comitê de Ética

Documents

Mecanismos fisiopatológicos do remodelamento … · MEC Matriz extracelular MEE Membrana elástica externa MGP Proteína ácido glutâmico de matriz ou proteína γ- carboxiglutâmico