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MECANOTRANSDUÇÃO Universidade Federal do Rio de Janeiro Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho Pólo Avançado de Xerém Bruno Rech; Filipe Esteves; João Vitor Belizario; Marcus Aguiar; Tadeu Diniz PROFESSORA: LEANDRA BAPTISTA

Mecanotransdução - Seminário

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MECANOTRANSDUÇÃO

Universidade Federal do Rio de JaneiroInstituto de Biofísica Carlos Chagas Filho

Pólo Avançado de Xerém

Bruno Rech; Filipe Esteves; João Vitor Belizario; Marcus Aguiar; Tadeu Diniz

PROFESSORA: LEANDRA BAPTISTA

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MECANOTRANSDUÇÃO: INTRODUÇÃO

Mecanotransdução:

• Forças mecânicas influenciam o crescimento e aforma de praticamente todos os tecidos e órgãos donosso corpo.

• Sinais mecânicos transduzidos em alterações nabioquímica celular e na expressão gênica.

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Receptores de superfície:

• Integrinas e Caderinas

• Permitem a adesão do citoesqueleto à MatrizExtracelular (ECM)

• A partir dessas proteínas que um estímulomecânico aplicado à superfície da membrana serátransmitido para o interior da célula.

MECANOTRANSDUÇÃO: RECEPTORES DE SINAIS

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Integrinas:

• Glicoproteínas transmembrana heterodiméricasde adesão celular compostas por subunidades α eβ.

• Estão presentes na constituição dohemidesmossomo, de modo que esta, une aplaca de ancoragem com a fibrinina (proteínapresente na lâmina basal).

MECANOTRANSDUÇÃO: INTEGRINAS E CADERINAS

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Caderinas:

• Principais moléculas de adesão celular;

• Moléculas de adesão dependentes de cálcio quepermitem a ligação entre células vizinhas;

• Glicoproteínas transmembrana;

• Responsáveis pela adesão célula-célula nostecidos dos vertebrados.

MECANOTRANSDUÇÃO: INTEGRINAS E CADERINAS

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MECANOTRANSDUÇÃO: INTEGRINAS E CADERINAS

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Matriz Extracelular

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MECANOTRANSDUÇÃO: CASCATA DE SINALIZAÇÕES

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MECANOTRANSDUÇÃO: EFEITOS DE ESTÍMULOS MECÃNICOS EXTERNOS NO NÚCLEO

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MECANOTRANSDUÇÃO: EFEITOS DE ESTÍMULOS MECÃNICOS EXTERNOS NO NÚCLEO

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MECANOTRANSDUÇÃO: EFEITOS DE ESTÍMULOS MECÃNICOS EXTERNOS NO NÚCLEO

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MECANOTRANSDUÇÃO: EFEITOS DE ESTÍMULOS MECÃNICOS EXTERNOS NO NÚCLEO

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Tecido Ósseo

Osteócitos :manutenção da integridade da matriz óssea.

Osteoblastos: Sintetizam a parte orgânica da matriz óssea e origina os osteócitos.

Osteoclastos: participam dos processos de absorção e remodelação do tecido ósseo

ARTIGO: DISCUSSÃO

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Medula Óssea:

• A Medula óssea preenche a cavidade interna deossos longos e é responsável pela produção dehemácias,leucócitos e plaquetas além de possuirreserva de células tronco.

ARTIGO: DISCUSSÃO – MEDULA ÓSSEA

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ARTIGO: MECANOTRANSDUÇÃO MEDIADA POR FAK

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ARTIGO: INTRODUÇÃO

Introdução:

• Células – tronco e sua capacidade dediferenciação;

• Pouca atenção aos estímulos físicos que as células-tronco sofrem ;

•Efeitos dos estímulos nas decisões dos destinosdestas células;

•Os mecanosensores;

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•As questões dessa pesquisa estão voltadas para omicroambiente da cavidade da medula óssea e comoas células-tronco são recrutadas de lá sob efeito deum estímulo mecânico.

•As células-tronco da medula óssea permanecemquiescentes até que ocorra uma lesão ou umadoença afete o organismo. Dessa forma, através demúltiplas vias de sinalização elas são recrutadas prao local da lesão.

ARTIGO: INTRODUÇÃO

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Materiais e Métodos: Procedimento da cirurgia e design do implante:

• Camundongos mantidos em um ambiente com luz etemperatura controladas , alimentados e hidratados;

• Camundongos anestesiados com injeçãointraperitoneal de Ketamina e Xylazina;

• Incisão na tíbia Antero-proximal mantendo asuperfície perióstea preservada;

• Dois buracos foram feitos em ambos córticos com umaferramenta de alta velocidade.

ARTIGO: MATERIAIS E MÉTODOS – PROCEDIMENTO DA CIRURGIA E DESIGN DO IMPLANTE

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• Dispositivo de micromoção posicionado e fixado com dois Retopinos de Titânio;

• Buraco central do dispositivo como guia para a inserção do implante ;

• Um “cap” foi amarrado no dispositivo para ter certeza da posição e proteger do deslocamento acidental por atividade do camundongo;

ARTIGO: MATERIAIS E MÉTODOS – PROCEDIMENTO DA CIRURGIA E DESIGN DO IMPLANTE

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(A) Esquema do dispositivo do implante inserido. Uma placa

subcutânea de fixação seguradas por dois parafusos.

(B) O dispositivo de micromoção in vivo na tíbia de murino.

(C) Gráfico do trandutor diferencial linear variável (LVDT) querelaciona o tempo com o movimento em µm e a força em N

ARTIGO: MATERIAIS E MÉTODOS – PROCEDIMENTO DA CIRURGIA E DESIGN DO IMPLANTE

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Micromoção:

• Gerada por um sistema ativado a mão conectado àcoluna central da placa óssea;

• Placa óssea constituída de um LVDT;

• Uma extremidade conecta com a célula carga e aoutra com uma ponta de 1 mm que passa pelo capda placa óssea;

• Produção da de micromoção axial de frequência 1.0Hz por 60 s em um intervalo de 24h por 3, 7 e 14dias;

ARTIGO: MATERIAIS E MÉTODOS - MICROMOÇÃO

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• Camundongos dissecados, epiderme removida efixada em formaldeído 4% overnight;

• Descalcificação introduzindo as amostras emsolução 19% EDTA-2Na por duas semanas a 4°C;

• Dispositivo do implante gentilmente puxado doosso;

• Desidratação por etanol para parafinizar;

Processamento do tecido, histologia e imunohistoquímica:

ARTIGO: MATERIAIS E MÉTODOS – PROCESSAMENTO DO TECIDO, HISTOLOGIA E IMUNOHISTOQUÍMICA

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ARTIGO: MATERIAIS E MÉTODOS – PROCESSAMENTO DO TECIDO, HISTOLOGIA E IMUNOHISTOQUÍMICA

• Secções longitudinais de todas as amostrascoletadas em lâminas de histologia;

• Imunohistoquímica para PCNA (proliferating cellnuclear antigen ) foi feita em lâminas adjacentesusando DAB como substrato;

• Hibridização foi feita usando sondas marcadascom digoxigenina de forma complementar aoscDNAs para sox9 e col1;

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• Tecidos corados com corante acídico, vermelhode picrosirius;

• Corante discrimina moléculas de colágenomuito empacotadas das alinhadas;

• Sob luz polarizada as moléculas de colágenofibrilar apresentam cores de comprimentos deonda maior para alinhadas e menor paramenos organizadas;

ARTIGO: MATERIAIS E MÉTODOS – PROCESSAMENTO DO TECIDO, HISTOLOGIA E IMUNOHISTOQUÍMICA

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Inativação da FAK:

• Camundongo nocaute da FAK gerado pelocruzamento do Crc com um carregando oalelo floxed fak;

• O genótipo CollCre +/+ ; FAK fl/fl foiconfirmado por PCR;

• Nocaute condicional definido pela ausênciado segundo domínio da FAK;

ARTIGO: MATERIAIS E MÉTODOS – INATIVAÇÃO DA FAK

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Medidas histomorfométricas:

• Tibias coletadas no dia 7 pós-cirurgia paradeterminar o volume do novo osso;

• Tecidos corados com azul de anilina após o“emblocamento”;

• A região do implante nas condiçõesestacionária controle, estimulada ; estacionáriaFAK mutada; estimulada foi representada porcortes de 8 µm de espessura;

ARTIGO: MATERIAIS E MÉTODOS – MEDIDAS HISTOMORFOMÉTRICAS

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ARTIGO: RESULTADOS

• 72h do início dos estímulos. Células da medulaóssea adjacentes ao implante deslocadoexibiram um aumento sutil de proteoglicanosna MEC;

• 7º dia de estímulos mecânicos , células damedula óssea sujeitas a estímulos mecânicosdifereciaram em osteoblastos;

• As células não estimuladas reteram umaaparência fibroblastóide;

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• Cortes histológicos do dia 3 e dia 7 mostrandoos efeitos dos estímulos e a falta deles.

ARTIGO: RESULTADOS

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• 14 dias de estímulos mecânicos as células damedula óssea estimuladas diferenciaram emosteócitos;

• Encoberta em um corpo maduro de matrizóssea interlaçadas com vasos sanguíneos;

• Células de um ambiente não estimuladodiferenciaram em osteoblastos com um atrasoconsiderável;

ARTIGO: RESULTADOS

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• Cortes histológicos do dia 14 de estímulos (esquerda) pelo implante (im) e estacionário (direita).

ARTIGO: RESULTADOS

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• Hipótese inicial: osteogênese induzida porestímulos mecânicos é a proliferação celularaumentada na medula óssea;

• Análise de PCNA não confirmaram a hipótese;

• Número de células PCNA-positivas foram quaseequivalente na hora 72 do início dos estímulos.

ARTIGO: RESULTADOS

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• Fatores de transcrição Sox9 e Runx2responsáveis pelo destino osteogênico dascélulas.

• Sox9 expresso em todas as célulasosteocondroprogenitoras;

• Runx2 “up” regulado em células que iniciaram adiferenciação em osteoblastos.

ARTIGO: RESULTADOS

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• Sox9 foi largamente expresso nas cavidades damedula óssea estacionárias e estimuladas;

• Presença de células osteocondroprogenitoras emambos os sítios;

• Conjunto de células sox9-positivas expressaramrunx2;

• Runx2 expresso por poucas células adjacentes aoimplante estacionário;

• Runx2 expresso por células ao longo da cavidade damedula óssea estimulada;

ARTIGO: RESULTADOS

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• Células localizadas distantes do estímulo doimplante expressaram runx2;

• Capacidade de sentir o estímulo a distância;

• Matriz extracelular deformada pelodeslocamento do implante;

• Maior deformação em torno das fendascircunferenciais e na base do implante

ARTIGO: RESULTADOS

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• Respostas moleculares e celulares . (A,B) Nenhumadiferença na proliferação das células. Ambienteestimulado (C) e estacionário (D) expressam sox9 portoda a cavidade.

ARTIGO: RESULTADOS

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(E) Runx2 é fortemente expresso na região do periimplante enquanto que (F) estímulos físicos induzem arestrição dos transcritos de runx2 às células adjacentesao implante.

ARTIGO: RESULTADOS

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• Um estímulo breve é suficiente para induzir a reorganização da MEC da cavidade da medula óssea;

• Em resposta ao deslocamento do implante as células da medula óssea up regularam o runx2;

• Em poucos dias diferenciaram em osteoblastos

ARTIGO: RESULTADOS

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• Feito um teste se o sinal da integrina foiessencial para a mecanotransdução das célulasda cavidade da medula óssea;

• Não houve deleção de integrina;

• Inativação da tirosina kinase (FAK) involvidana transdução do sinal de sítios ricos emintegrina

ARTIGO: RESULTADOS

Page 39: Mecanotransdução - Seminário

• Camundongos mutantes de FAK formaram ossoem torno do implante tanto quanto oscamundongos controle;

• Foram submetidos ao protocolo do deslocamentodo implante;

• Camundongos controle tiveram respostaosteogênica alta;

• Camundongos mutados de FAK não tiveramnenhuma resposta osteogênica.

ARTIGO: RESULTADOS

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• 93 % menos matriz de osso depositadas emcomparação com o controle;

• Deposição evidente na superfície periósteadistante do estímulo mecânico;

• Nenhuma evidência de matriz mineralizada nacavidade da medula óssea;

ARTIGO: RESULTADOS

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• Marcadores de diferenciação de osteoblasto como colágeno I e osteocalcina expressos em mutantes FAK;

• Deleção de FAK não preveniu a diferenciação em osteoblasto;

• Bloqueio da sensação do estímulo das células da medula óssea;

• Repressão rápida da deposição de matriz mineralizada em osteoblastos;

ARTIGO: RESULTADOS

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A

Inativação da FAK bloqueiaespecíficamente a osteogênesemecânicamente induzida in vivo.

(A) Marcas da expressão de Col1(colágeno I) nas células peri-impalnte.

(B) Incluindo as justaposicionadasao implante (im).

ARTIGO: RESULTADOS

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C) Animais controle em 7 dias deestímulo resultaram formação de ossoabundante.

(D) Matriz óssea recém depositadacorada com azul de anilina interlaçadapor vasos sanguíneos

ARTIGO: RESULTADOS

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(E) Estímulos mecânicos falharam em induzir a osteogênese nocamundongos FAK mutados. (F) O azul de Anilina mostra a completaausência de tecido mineralizado no sítio peri-implante. (G) Crescimentovascular interno não impediu a deleção da FAK. (H,I,J,K) Mutantes de FAKexpressam sox9 , runx2, col I e osteocalcina indicando que a perda da FAKnão acaba com o recrutamento de células osteocondroprogenitoras pra osítio peri-implante.

ARTIGO: RESULTADOS

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(L) Ensaio quantitativo histomorfométrico da matriz recém depositadanas cavidades da medula óssea não estimuladado controle (wt) (branco),na estimulada (cinza claro) , medula óssea FAK mutada estacionária(cinza) e estimulada (preto)

ARTIGO: RESULTADOS

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Discussão:

• Foi investigado a base genética paramecanotransdução usando como modelo acavidade da medula óssea por conter altasquantidades de células tronco.

• Forças físicas ativaram a expressão de doisfatores de transcrição(sox9 e runx2)requeridas para tornar células tronco em umalinhagem esquelética

ARTIGO: DISCUSSÃO

Page 47: Mecanotransdução - Seminário

• Desativação da FAK(kinase de adesão focal)

– A resposta a estímulos físicos foi eliminada devido a falta de sinalização de integrinas com o ambiente intracelular .

• A falta da mecanotransdução teve como conseqüência:

– Falta de up-regulagem de genes esqueletogênicos;

– Fíbrilas de colágenos permaneciam; desorganizadas;

– Resposta osteogênica induzida mecanicamente foi perdida;

ARTIGO: DISCUSSÃO

Page 48: Mecanotransdução - Seminário

• Micromoção:

O ambiente mecânico tem um papel críticono reparo do tecido ósseo e a micromoção évista como um estímulo oesteoindutivo;

A micrimoção descontrolada leva a umatraso no reparo de uma fratura, falhas noenxerto ósseos e perda de implante;

ARTIGO: DISCUSSÃO: MICROMOÇÃO

Page 49: Mecanotransdução - Seminário

• A mecanosensibilidade do esqueleto é atribuído empartes a variedade das células do esqueleto e aresposta destas influenciadas por estímulos físicos;

• Diversas respostas em diversas células para omesmo estímulo mecânico;

• O estimulo físico é uma fonte de incertezas devido avariáveis de transmissão de força como: tipo emagnitude da tensão resultante e rigidez dosubstrato;

ARTIGO: DISCUSSÃO

Page 50: Mecanotransdução - Seminário

• O modelo da regeneração óssea possui visõesde como as células progenitores do tecidoósseo sentem,interpretam e responde a umaforça mecânica alterando o seucomportamento

ARTIGO: DISCUSSÃO

Page 51: Mecanotransdução - Seminário

• O deslocamento do implante faz com quecélulas migrem e se alinhem ao longo damatriz extracelular tensionada e fibras decolágenos secretadas por essas células tambémtornem-se orientadas paralelas às trajetóriasda tensão.

ARTIGO: DISCUSSÃO

Page 52: Mecanotransdução - Seminário

• Parte dessas células são osteoprogenitoras eparecem explorar a matriz rica em colágenopara sentir seu ambiente mecânico.

• Se encaixam na MEC via integrinas desuperfície que são dependentes da FAK paratransduzir este estímulo em um sinal biológico

ARTIGO: DISCUSSÃO

Page 53: Mecanotransdução - Seminário

OBRIGADO!!!