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MESTRADO INTEGRADO EM ENGENHARIA BIOMÉDICA FACULDADE DE CIÊNCIAS E TECNOLOGIA UNIVERSIDADE DE COIMBRA Idenficação das Vias de Sinalização An-apoptócas em Células Estaminais Cancerígenas de Osteossarcoma Cláudia Borges Gonçalves 2012 Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra para obtenção do grau de Mestre em Engenharia Biomédica, realizada sob a orientação da Doutora Célia Maria Freitas Gomes do Instuto Biomédico de Invesgação de Luz e Imagem (IBILI)

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MESTRADO INTEGRADO EM ENGENHARIA BIOMÉDICA

FACULDADE DE CIÊNCIAS E TECNOLOGIA UNIVERSIDADE DE COIMBRA

Identificação das Vias de Sinalização Anti-apoptóticas

em Células Estaminais Cancerígenas de Osteossarcoma

Cláudia Borges Gonçalves

2012

Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra para obtenção do grau de Mestre em Engenharia Biomédica, realizada sob a orientação da Doutora Célia Maria Freitas Gomes do Instituto Biomédico de Investigação de Luz e Imagem (IBILI)

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Aos meus pais

Aos meus irmãos

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Este projecto foi desenvolvido na seguinte instituição:

Farmacologia e Terapêutica Experimental, Instituto Biomédico de Investigação de Luz e

Imagem (IBILI), Faculdade de Medicina, Universidade de Coimbra, Coimbra

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“Aprender é a única coisa de que a mente nunca se cansa, nunca tem medo e nunca se arrepende”

Leonardo da Vinci

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Aos meus pais

Aos meus irmãos

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vii

Agradecimentos

À Doutora Célia Gomes, orientadora deste projecto, e mais que isso, a minha Professora, os

meus sinceros agradecimentos por todo o conhecimento transmitido, pelo apoio, pela confiança,

pela imensa paciência e pelo incentivo demonstrados ao longo deste ano, e especialmente um

grande obrigada pelos “puxões de orelhas” que me fizeram crescer, ir mais além e me tornar mais

perspicaz neste mundo que é a investigação.

Ao Professor Doutor Miguel Morgado, coordenador da disciplina de Projecto de Mestrado, e

coordenador do curso de Engenharia Biomédica, os meus sinceros agradecimentos pelo interesse

apresentado durante este projecto, pela disponibilidade sempre demonstrada e pelo envolvimento

no percurso académico de todos os alunos de Engenharia Biomédica.

Ao Engenheiro Francisco Caramelo, pela disponibilidade, pela atenção e pelas sugestões na

análise estatística.

Ao Professor Doutor Carlos Alberto Fontes Ribeiro, do serviço de Farmacologia e Terapêutica

Experimental, os meus agradecimentos pelo recebimento nestas instalações. E a todo o staff deste

serviço um muito obrigada pelo carinho e simpatia demonstrados.

À Patrícia, minha companheira da “salinha” e dos cafés, por toda a paciência e incentivo,

pelo carinho e pela amizade, e por todos os momentos que vivemos juntas no decorrer deste

projecto que sem dúvida me foram essenciais. À Magui por toda a alegria e entusiasmo, por toda a

ajuda e opiniões, e por me ter salvado tantas vezes ao deixar-me “raptar-lhe” o cartão.

Aos meus amigos de curso, em especial à Licas, à Mónica, à Raquel, à Daniela, à Carla, à

Vanessa e à Cíntia, que sempre estiveram lá quando precisei, e que me deram todo o carinho,

amizade, compreensão e apoio neste percurso feito por todas nós. Ao meu afilhado, Hugo, pelos

lanches e pelo incentivo, e mais importante que isso pela amizade. À minha afilhada, Telma, com a

qual iniciei esta jornada pelo IBILI, pela amizade e pelo apoio.

Aos amigos que fiz ao longo deste percurso académico, em especial à Carla, pelo apoio, pelas

conversas, pela amizade, pelos conselhos, e por todos os sorrisos contagiantes.

Aos meus amigos de infância, em especial à Liliana, à Sofia, ao Pedro, à Fernanda, à Ticha, ao

Júlio, e à Joana, que por mais que a Faculdade nos tenha afastado sempre estiveram lá para me

apoiar, para me dar um ombro amigo e para cultivar esta amizade que sei que vai ser para a vida, um

grande obrigada pela força e pelo carinho.

À minha família, em especial aos meus Pais e aos meus Irmãos, por todos os sacrifícios, pelo

apoio, pelo amor e pelo porto de abrigo. Sem vocês não teria chegado tão longe! Um muito obrigada

por sempre acreditarem no meu potencial!

Ao Diogo que me aturou nos piores momentos, mas que sempre teve uma palavra

animadora para me consolar. Obrigada por todo o amor, pela paciência e pelo apoio incondicional ao

longo deste percurso tão importante da minha vida.

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ix

Índice

Agradecimentos ........................................................................................................................vii

Lista de Figuras .......................................................................................................................... xi

Lista de Tabelas ......................................................................................................................... xii

Lista de Abreviaturas ............................................................................................................... xiii

Resumo ..................................................................................................................................... xv

Abstract ................................................................................................................................... xvii

1. Introdução ........................................................................................................................... 1

1.1 Osteossarcoma .............................................................................................................. 1

1.1.1 Etiologia e Factores de Risco ......................................................................... 1

1.1.2 Células de origem do OS ................................................................................ 2

1.1.3 Tratamento do OS .......................................................................................... 4

1.2 Teoria das Células Estaminais Cancerígenas ................................................................ 5

1.2.1 Identificação de CSCs ..................................................................................... 7

1.3 Implicações Terapêuticas das CSCs ............................................................................... 9

1.3.1 Apoptose ...................................................................................................... 12

1.3.1.1. Apoptose e cancro ...................................................................... 15

1.4 Objectivos .................................................................................................................... 16

2. Materiais e Métodos ......................................................................................................... 17

2.1 Cultura Celular ............................................................................................................. 17

2.1.1 Ensaios de Viabilidade Celular ..................................................................... 17

2.2 Método de formação de esferas ................................................................................. 17

2.3 Estudos de Citotoxicidade com DOX ........................................................................... 18

2.3.1 Preparação das células MNNG/HOS e das CSCs para os estudos de

citotoxicidade com DOX........................................................................................ 19

2.3.2 Estudos de Viabilidade Celular – Ensaio colorimétrico de MTT .................. 19

2.3.3 Estudos de Proliferação Celular – Ensaio colorimétrico de BrdU ................ 20

2.3.4 Ensaio de TUNEL para medição da apoptose .............................................. 21

2.4 Análise da expressão de proteínas por Western blot ................................................. 22

2.4.1 Expressão de proteínas anti- e pró-apoptóticas da família da Bcl-2 e da

caspase- 3 ............................................................................................................. 22

2.4.1.1 Preparação de extractos celulares ............................................... 22

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x

2.4.1.2 Electroforese em gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sódio

(SDS-PAGE) e Electrotransferência ........................................................... 23

2.4.1.3 Immunoblotting e Quantificação ................................................. 23

2.5 Análise Estatística ......................................................................................................... 24

3. Resultados .......................................................................................................................... 25

3.1 Isolamento de CSCs a partir da linha celular humana de OS MNNG/HOS ................... 25

3.2 Sensibilidade das células MNNG/HOS e das CSCs à DOX ............................................. 26

3.2.1 Efeito da DOX na Viabilidade e na Proliferação Celulares ........................... 26

3.2.2 Detecção da apoptose .................................................................................. 29

3.3 Expressão de proteínas pró- e anti-apoptóticas .......................................................... 31

3.3.1 Análise da razão entre as proteínas anti- e pró-apoptóticas ....................... 34

3.4 Expressão da caspase-3 ................................................................................................ 35

4. Discussão ............................................................................................................................ 37

5. Conclusão ........................................................................................................................... 45

6. Trabalhos Futuros .............................................................................................................. 47

7. Referências Bibliográficas .................................................................................................. 49

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xi

Lista de Figuras

Figura 1.1 Diferenciação das MSCs em múltiplas linhagens e alterações na diferenciação

osteogénica ................................................................................................................................ 3

Figura 1.2 Modelos de heterogeneidade tumoral ..................................................................... 7

Figura 1.3 Impacto do modelo das CSCs nos tratamentos anti-tumorais ............................... 12

Figura 1.4 Vias intrínseca e extrínseca da apoptose ............................................................... 14

Figura 3.1 Isolamento de CSCs a partir da linha celular humana de OS MNNG/HOS pelo

método de formação de esferas .............................................................................................. 25

Figura 3.2 Efeito da DOX na viabilidade das células MNNG/HOS e das CSCs .......................... 27

Figura 3.3 Percentagens de células viáveis após exposição das células MNNG/HOS e das CSCs

a diferentes concentrações de DOX (0-100 µM) ..................................................................... 27

Figura 3.4 Efeito da DOX na proliferação das células MNNG/HOS e das CSCs ........................ 28

Figura 3.5 Percentagens de células MNNG/HOS e de CSCs em proliferação após exposição a

diferentes concentrações de DOX (0-100 µM) ........................................................................ 28

Figura 3.6 Imagens de fluorescência representativas de células MNNG/HOS e de CSCs em

apoptose pelo ensaio de TUNEL após incubação com diferentes concentrações de DOX

durante 48h ............................................................................................................................. 30

Figura 3.7 Percentagem de células em apoptose (MNNG/HOS vs. CSCs) após exposição a

diferentes concentrações de DOX durante 48h ...................................................................... 31

Figura 3.8 Imagens representativas da expressão das proteínas Bak e Bax por Western blot

após exposição à DOX .............................................................................................................. 32

Figura 3.9 Imagens representativas da expressão das proteínas Bcl-XL e Bcl-2 por Western

blot após exposição à DOX ....................................................................................................... 33

Figura 3.10 Representação gráfica da razão entre os níveis de expressão das proteínas anti- e

pró-apoptóticas às 48h de incubação com DOX ..................................................................... 34

Figura 3.11 Imagens representativas da expressão da proteína caspase-3 por Western blot

após exposição à DOX .............................................................................................................. 35

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xii

Lista de Tabelas

Tabela 1. Anticorpos primários e secundários usados na técnica de Western Blot, e

respectivas diluições................................................................................................................. 24

Tabela 2. Valores de IC50 obtidos através dos ensaios de MTT e de incorporação com BrdU,

após exposição das células parentais MNNG/HOS e das CSCs a diferentes concentrações de

DOX ........................................................................................................................................... 29

Tabela 3. Percentagem de células em apoptose (MNNG/HOS vs. CSCs) após exposição a

diferentes concentrações de DOX durante 48h ....................................................................... 31

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xiii

Lista de Abreviaturas:

ABC

Akt

ALDH1

APAF-1

ATP

Bak

Bax

BCA

Bcl-2

Bcl-XL

BCRP

bFGF

BrdU

CIS

CoCl2

CSC

DISC

DMEM/F12

DNA

DOX

DTT

ECF

EDTA

EGF

ELISA

EpCAM

Erk (1/2)

EURAMOS-1

FADD

FBS

ATP-binding cassette

Protein kinase B

Aldeído-Desidrogenase 1

Apoptotic Protease Activating Factor-1

Adenosina Trifosfato

Bcl-2 antagonist killer 1

Bcl-2 associated X protein

Ácido Bicinconínico

B-cell lymphoma protein 2

Bcl-2 related protein, long isoform

Breast Cancer Resistance Protein

Factor básico de crescimento de fibroblastos

5-bromo-2’-deoxiuridina

Cisplatina

Cloreto de Cobalto

Célula Estaminal Cancerígena (Cancer Stem Cell)

Complexo de sinalização indutor de morte

Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham

Ácido Desoxirribonucleico

Doxorrubicina

Ditiotreitol

Enhanced Chemifluorescence Substrate

Ácido Etilenodiaminotetracético

Factor de Crescimento Epidérmico (Epidermal Growth Factor)

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

Molécula de Adesão Celular Epitelial

Extracellular signal-Regulated Kinases (1 and 2)

European and American Osteosarcoma Study Group

Fas-associated death domain protein

Soro fetal bovino

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HCl

IC50

LMA

MAPK

Mcl-1

MSC

MTT

MTX

NaOH

Oct4

OS

p53

pAkt

PBS

pErk1/2

Pgp

PI3K

pRb

PVDF

RB1

RIPA

RPMI

SD

SDS

SEM

SP

TBS-T

TdT

TIC

TNF

TUNEL

Ácido Clorídrico

Concentração de fármaco que inibe a viabilidade celular em 50%

Leucemia Mielóide Aguda

Mitogen-Activated Protein Kinases

Induced myeloid leukemia cell differentiation protein

Célula Estaminal Mesenquimal (Mesenchymal Stem Cell)

Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio

Metotrexato

Hidróxido de Sódio

Octamer-binding Transcription Factor 4

Osteossarcoma

Proteína supressora tumoral p53

Phosphorylated Akt

Tampão Salino de Fosfato

Phosphorylated Erk1/2

Glicoproteína-P

Phosphatidylinositol 3-kinase

Proteína de Retinoblastoma

Difluoreto de Polivinildieno

Gene supressor tumoral de retinoblastoma 1

Radioimmuneprecipitation Assay Lysis Buffer

Roswell Park Memorial Institute (Medium)

Desvio-padrão

Dodecil Sulfato de Sódio

Erro-padrão na média

Side Population

Tampão Salino de Tris – Tween 20

Transferase de desoxinucleotidil terminal

Célula iniciadora de tumores (Tumor Initiating Cell)

Factor de Necrose Tumoral

Terminal dUTP Nick-End Labeling

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xv

Resumo

Introdução: O osteossarcoma é o cancro ósseo maligno primário mais frequente em crianças e

adolescentes. Este tumor resulta da ocorrência de mutações genéticas e epigenéticas em células

estaminais mesenquimais durante o processo de diferenciação osteoblática. Estudos recentes

demonstraram que o osteossarcoma contém uma subpopulação de células com características

de células estaminais cancerígenas (CSCs) e que são elas as responsáveis pela iniciação e

progressão do tumor, bem como pela resistência às terapias convencionais incluindo a

quimioterapia e radioterapia. Este trabalho teve por objectivo explorar o papel da via intrínseca

ou mitocondrial da apoptose na resposta das CSCs aos efeitos citotóxicos da doxorubicina (DOX).

Métodos: As CSCs foram isoladas a partir da linha celular humana de OS MNNG/HOS pelo

método de formação de esferas e incubadas com diferentes concentrações de DOX durante 48h.

A citotoxicidade da DOX foi avaliada com base em vários parâmetros: efeitos sobre a viabilidade

celular (método colorimétrico de MTT); proliferação celular (método de incorporação com BrdU)

e indução de apoptose (ensaio de TUNEL). Os níveis de expressão das proteínas anti-apoptóticas

Bcl-2 e Bcl-XL, pró-apoptóticas Bak e Bax, e da caspase-3 foram analisados pela técnica de

Western blot após incubação com DOX.

Resultados: A cultura das células aderentes MNNG/HOS em condições de baixa aderência e na

ausência de soro permitiu fazer o isolamento das CSCs sob a forma de colónias esféricas com

elevada capacidade de auto-renovação. Os estudos de citotoxicidade mostraram que as CSCs

são mais resistentes à DOX do que as células parentais MNNG/HOS. A concentração de DOX

necessária para reduzir a viabilidade celular das CSCs em 50% foi de 2,21±0,50 µM,

significativamente (p<0,05) superior à obtida para as células parentais MNNG/HOS (0,67±0,17

µM). Pelo contrário, a concentração de DOX que reduziu a proliferação celular em 50% foi de

0,03±0,01 µM para as CSCs, significativamente inferior (p<0,05) ao valor observado nas células

parentais MNNG/HOS (0,19±0,06 µM). Nas células parentais MNNG/HOS observou-se um

aumento na percentagem de células em apoptose dependente da dose de DOX variando de 1%

a 21%, enquanto nas CSCs, a percentagem foi aproximadamente constante, nunca

ultrapassando os 3% para o mesmo intervalo de concentrações. A exposição das CSCs à DOX

induziu um aumento significativo nos níveis de expressão das proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 e

Bcl-XL e uma concomitante diminuição na expressão da proteína pró-apoptótica Bak e da

caspase-3.

Conclusões: A linha celular humana de OS MNNG/HOS contém uma subpopulação de células

com propriedades de células estaminais que são relativamente mais resistentes à DOX do que as

células parentais. A sobreexpressão da Bcl-2 e da Bcl-XL em simultâneo com a diminuição da Bak

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xvi

parecem contribuir para a maior resistência destas células à apoptose induzida pela DOX. A

capacidade que as CSCs têm em reduzirem a sua taxa de proliferação quando expostas a

concentrações não tóxicas de DOX, permite-lhes evadirem efeitos citotóxicos da DOX que tem

como alvo preferencial células com elevada actividade proliferativa.

Palavras-chave: osteossarcoma; células estaminais cancerígenas; doxorrubicina; proteínas

anti- e pró-apoptóticas, apoptose

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xvii

Abstract

Background: Osteosarcoma is the most common primary malignant bone cancer in children

and adolescents. This tumor results from the occurrence of genetic and epigenetic mutations

in mesenchymal stem cells during the osteoblastic differentiation process. Recent studies

demonstrated that osteosarcoma contains a subset of cells with stem cell characteristics

(CSCs), which are the responsible for the initiation and progression of the tumor, as well as for

the resistance to conventional therapies including chemotherapy and radiotherapy. In this

study we purpose to explore the role of the intrinsic or mitochondrial apoptotic pathway in the

response of CSCs to the cytotoxic effects of doxorubicin (DOX).

Methods: CSCs were isolated from the human OS cell line MNNG/HOS using the sphere

formation assay and then incubated with different concentrations of DOX for 48h. The

cytotoxicity of DOX was evaluated considering several parameters: effects on cell viability

(MTT colorimetric assay), cellular proliferation (BrdU Cell Proliferation Assay) and apoptosis

(TUNEL assay). The expression levels of the anti-apoptotic proteins Bcl-2 and Bcl-XL, pro-

apoptotic proteins Bax and Bak, and caspase-3 was analyzed by Western blot after incubation

with DOX.

Results: The culture of adherent MNNG/HOS cells in serum-free medium under non-adherent

conditions allowed isolating CSCs as spherical colonies with higher self-renewal ability. CSCs

were relatively more resistant to DOX than their parental cells MNNG/HOS. The concentration

of DOX required to inhibit cell viability by 50% was of 2.21±0.50 µM for CSCS, significantly

higher (p<0,05) to the one obtained for parental MNNG/HOS cells (0.67±0.17 µM). In opposite,

the drug concentration that inhibited cellular proliferation by 50% was of 0.03±0.01 µM for

CSCs, significantly lower (p<0.05) than that observed for MNNG/HOS cells (0.19±0.06µM). For

MNNG/HOS cells it was observed a dose-dependent increase in the percentage of apoptotic

cells ranging from 1% to 21%, while for CSCs the percentage of apoptotic cells was

approximately constant, never exceeding the 3% for the same range of DOX concentrations.

Exposure of CSCs to DOX induced a significant increase in the expression levels of the anti-

apoptotic proteins Bcl-2 and a Bcl-XL and a concomitant decrease in the expression of the pro-

apoptotic protein Bak and caspase 3.

Conclusions: The human OS cell line MNNG/HOS contains a subpopulation of cells with stem

cell properties which are relatively more resistant to DOX than their parental cells.

Overexpression of Bcl-2 and Bcl-XL simultaneously with the reduction of Bak appears to

contribute to the higher resistance of these cells to apoptosis induced by DOX. The ability of

CSCs to enter in a low proliferation rate when exposed to non-toxic concentrations of DOX

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xviii

allows them to evade the cytotoxic effects of DOX that targets preferentially cells with high

proliferative activity.

Keywords: osteosarcoma; cancer stem cells; doxorubicin; anti- and pro-apoptotic proteins,

apoptosis

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1

1. Introdução

1.1 Osteossarcoma

O osteossarcoma (OS) é o tumor ósseo maligno primário mais comum em crianças e

jovens adolescentes e é o sexto tipo de cancro que mais afecta as crianças com menos de 15

anos de idade. Apesar disso é considerado uma neoplasia relativamente rara com cerca de 400

novos casos a cada ano nos Estados Unidos da América. Este tumor afecta maioritariamente

indivíduos do sexo masculino do que feminino, numa proporção de 1,6:1. No entanto,

manifesta-se mais cedo nos indivíduos do sexo feminino pelo facto de a puberdade, onde ocorre

o surto de crescimento, ser mais precoce. Este cancro apresenta uma distribuição etária

bimodal, em que o primeiro pico de incidência ocorre entre os 10 e os 14 anos, e o segundo pico

ocorre em adultos idosos, com idades acima dos 65 anos. Nestes últimos casos, o aparecimento

da doença está frequentemente relacionada com a doença de Paget do osso (1-3).

O OS pode ocorrer em qualquer tipo de osso, mas é mais frequente na metáfise dos

ossos longos, nomeadamente no fémur distal (40%), tíbia proximal (20%), e úmero proximal

(10%). No entanto, também pode afectar o esqueleto axial, embora tal ocorra em menos de 10%

dos doentes pediátricos, sendo os ossos pélvicos os mais afectados. O OS tem origem na

cavidade medular, invadindo posteriormente o córtex (zona mais periférica do osso) causando

destruição cortical com envolvimento dos tecidos moles adjacentes, músculos, tendões e vasos

sanguíneos (1-2, 4-5).

1.1.1 Etiologia e Factores de Risco

A origem do OS ainda não está completamente esclarecida, no entanto, várias alterações

genéticas já lhe foram associadas. Mutações no gene supressor tumoral de retinoblastoma

(RB1), localizado no cromossoma 13, parecem estar envolvidas na patogénese do OS, uma vez

que nos doentes com retinoblastoma o risco de desenvolver OS, como tumor secundário, é

cerca de 500 vezes superior ao dos indivíduos saudáveis (6). A análise genética de um elevado

número de amostras de doentes com OS identificou alterações genéticas no gene RB1 em cerca

de 70% dos casos, incluindo a perda homozigótica do gene e/ou alterações na expressão da

proteína (7). O produto do gene RB1 é uma proteína fosforilada (pRb) que interage com o factor

de transição celular E2F na fase G1 do ciclo celular, inibindo a transcrição de genes envolvidos na

proliferação e replicação do DNA (6, 8).

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1. Introdução

2

Também mutações no gene supressor tumoral p53 parecem estar associadas ao

desenvolvimento do OS. Tal como o RB1, o gene p53 desempenha funções importantes na

regulação do ciclo celular, pelo que a perda da sua função implica a desregulação de

mecanismos de controlo da proliferação celular, estimulando a proliferação de forma

descontrolada e a incapacidade de activação da apoptose. Este gene codifica uma fosfoproteína

nuclear – p53 – que actua como gene supressor tumoral que previne a replicação de células

sempre que o seu DNA esteja danificado por interrupção do ciclo celular, activação das vias de

reparação de DNA ou por indução da apoptose (6-10).

Também a amplificação ou a sobre-expressão dos genes MDM2 (do inglês, murine

double minute 2) e CDK4 (quinase dependente de ciclina) têm sido observadas no OS, o que

sugere o seu envolvimento na patogénese desta doença. O gene MDM2 codifica a proteína que

se liga e inactiva a fosfoproteína nuclear p53, enquanto o produto do gene CDK4 fosforila e

inactiva a pRb, perturbando desta forma a regulação do ciclo celular. O C-Myc e o C-fos, dois

oncogenes que codificam factores de transcrição que controlam a progressão do ciclo celular e a

diferenciação em osteoblastos e condroblastos, também aparecem regularmente sobre-

expressos em células de OS (6).

Um dos factores exógenos associados ao aparecimento do OS é a exposição a radiação

ionizante, sendo a responsável por 2% dos casos. Mas como a doença só se manifesta após um

longo período de exposição à radiação, está mais associada ao aparecimento do OS em pessoas

na idade adulta (2).

1.1.2 Células de origem do OS

Apesar da origem do OS ainda não estar completamente esclarecida, existem evidências

crescentes de que este tumor resulta da ocorrência de mutações genéticas e epigenéticas em

células estaminais mesenquimais (MSCs, do inglês mesenchymal stem cells) durante o processo

de diferenciação osteoblástica. As MSCs são células indiferenciadas multipotentes de origem

não hematopoiética e com elevada capacidade de auto-renovação (11, 12). Estas células foram

primeiro identificadas na medula óssea (13), embora existam também no sangue do cordão

umbilical (14) e em diversos tecidos do corpo humano, e são também as precursoras das células

do tecido ósseo (osteócitos), do tecido adiposo (adipócitos) e da cartilagem (condroblastos)

(Figura 1.1 A) (7, 14, 15).

As células de OS apresentam algumas semelhanças com os osteoblastos, uma vez que

produzem matriz osteóide, sendo esta a base para o diagnóstico histológico que distingue o OS

de outros tumores ósseos. O OS apresenta uma diversidade de padrões histológicos, cuja

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1. Introdução

3

classificação é feita com base no tipo e quantidade de matriz extracelular produzida e no tipo e

características das células: osteoblástico, condroblástico, fibroblástico, pouco diferenciado,

telangiectásico e de células gigantes, o que indica que as células de origem do OS são

multipotentes (1, 7). Por esta razão o OS é considerado uma doença de diferenciação resultante

de mutações que ocorrem em diferentes fases do processo de diferenciação osteogénica a partir

das MSCs, como ilustrado na Figura 1.1 B. Acredita-se que quanto maior for o estado de

indiferenciação das células em que ocorrem as mutações mais indiferenciado e agressivo será o

tumor daí resultante (7).

MSC

pluripotente

Osteoprogenitora OS pouco diferenciado

OS moderadamente diferenciado

OS mais diferenciado Osteoprogenitora

Osteoprogenitora Pré-osteoblasto

Pré-osteoblasto Osteoblasto

imaturo

MSC

pluripotente

MSC

pluripotente

B.

Figura 1.1 Diferenciação das MSCs em múltiplas linhagens e alterações na diferenciação osteogénica. (A)

Diferenciação osteoblástica. As MSCs podem dar origem a múltiplas linhagens, tais como miócitos, adipócitos,

condrócitos e osteócitos. (B) Alterações na diferenciação osteogénica podem levar ao desenvolvimento do OS.

Os defeitos causados por alterações genéticas (por exemplo, a activação de oncogenes ou a inactivação da p53

e do gene supressor tumoral RB) e epigenéticas podem ocorrer em diferentes fases da diferenciação

osteogénica. Defeitos em fases iniciais da diferenciação dão origem a OS mais agressivos e indiferenciados. As

células a preto indicam TICs. (Adaptado de (7)).

Crescimento e

Diferenciação

Miócitos

Adipócitos

Condrócitos

Pré-osteoblasto Osteoblasto

imaturo Osteoblasto

maduro Osteócito

Proliferação Diferenciação

Osteoprogenitor

comprometido

MSC

pluripotente

Diferenciação das MSCs em múltiplas linhagens

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1. Introdução

4

1.1.3 Tratamento do OS

Antes da década de 70, o prognóstico dos doentes com OS era devastador, sendo a taxa

de sobrevida dos doentes tratados com cirurgias agressivas de apenas 10-20%. Ao longo dos

últimos anos, com a introdução da quimioterapia sistémica neoadjuvante e adjuvante e com os

avanços nas técnicas cirúrgicas, a taxa de sobrevida melhorou consideravelmente para cerca de

65-75% para os doentes sem evidências clínicas de doença metastática na altura do diagnóstico

(1, 16).

O tratamento do OS não-metastático inclui a quimioterapia pré- e pós-operatória. A

quimioterapia pré-operatória ou neoadjuvante induz necrose no tumor primário, o que facilita a

excisão cirúrgica e a eliminação de possíveis micrometastases. Os doentes com uma boa

resposta histológica à quimioterapia pré-operatória, o que corresponde a uma percentagem de

necrose superior a 90%, têm à partida um bom prognóstico, com uma taxa de sobrevida aos 5

anos superior a 65-75%, enquanto que nos doentes com uma resposta histológica de necrose

tumoral inferior a 90%, a taxa de sobrevida é inferior a 15% (2, 17). Contudo, mesmo nos

doentes com doença localizada, aquando do diagnóstico, e com uma resposta histológica

favorável, cerca de 40% acabam por desenvolver doença metastática e morrer da doença, pelo

facto de desenvolverem resistência à terapêutica (2, 6). Vários estudos retrospectivos têm vindo

a demonstrar que a intensificação dos regimes de quimioterapia melhora a resposta histológica

dos doentes, mas não a sua taxa de sobrevida, o que sugere a existência de uma subpopulação

celular capaz de evadir os efeitos citotóxicos das terapêuticas actuais e de dar origem ao

aparecimento de recidivas (17, 18).

Actualmente, de acordo com o European and American Osteosarcoma Study Group

(EURAMOS-1), os protocolos de quimioterapia consistem na administração de doxorrubicina

(DOX), cisplatina (CIS) e de altas doses de metotrexato (MTX) (6, 19-21).

A DOX, também designada por Adriamicina®, é um importante fármaco anticancerígeno

com uma vasta gama de usos terapêuticos, tais como, no tratamento de cancro da mama,

cancro da bexiga e linfomas Hodgkin (22). Este fármaco pertence à classe das antraciclinas e é

normalmente utilizado em conjunto com outros fármacos. A DOX inibe a acção da

topoisomerase II, interferindo com a formação do complexo topoisomerase II-DNA, levando a

quebras na cadeia dupla de DNA ou intercalando-se directamente com a cadeia de DNA, o que

por sua vez inibe a duplicação do DNA e a transcrição do mRNA, levando à morte celular por

apoptose. A produção de espécies reactivas de oxigénio (ROS) também pode ser um efeito

citotóxico da DOX nas células cancerígenas (23).

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1. Introdução

5

A CIS ou cis-diaminodicloroplatina II, é utilizada no tratamento de vários tipos de cancro,

entre os quais, o cancro do ovário (24), do testículo (25), e OS (26), embora o seu mecanismo de

acção ainda não esteja completamente esclarecido. Existem evidências de que o principal

mecanismo de acção da CIS é de que esta se liga de forma covalente ao DNA levando à formação

de aductos, originando ligações intra- e intercadeias causando alterações estruturais na cadeia

de DNA, incluindo o seu desenrolamento e torção culminando com a morte celular por apoptose

(27).

O MTX é um antimetabolito análogo do ácido fólico que inibe de modo competitivo a

actividade da enzima di-hidrofolato redutase (DHFR) que é a responsável pela conversão do

ácido fólico em tetra-hidrofolato (THF) que é um co-factor necessário à transferência de

unidades de carbonos em várias reacções metabólicas, como é o caso da síntese de purinas e

timidinas, percursoras de nucleótidos que integram o DNA e o RNA. A inibição da síntese destas

bases azotadas leva ao bloqueio da replicação do DNA (28), sendo a sua acção mais marcante

em células com maior taxa de divisão celular como as células tumorais.

Apesar dos inquestionáveis avanços alcançados nos últimos anos com as novas

abordagens terapêuticas, o tempo de sobrevida dos doentes com OS estagnou nos 70%, e em

cerca de 40% volta a haver uma recidiva do cancro, o que significa que esta terapêutica nem

sempre é eficaz na remissão completa das células tumorais e que são necessárias novas opções

terapêuticas mais eficazes, que permitam melhorar o prognóstico e a sobrevida destes doentes

(17, 29).

1.2 Teoria das Células Estaminais Cancerígenas

Os sarcomas ósseos, incluindo o OS, estão inseridos num grupo de doenças malignas de

origem mesenquimal que apresentam heterogeneidade clínica, histológica e molecular (30).

À luz da teoria das células estaminais cancerígenas (CSCs, do inglês Cancer Stem Cells),

esta heterogeneidade fenotípica e funcional é explicada pela existência de uma subpopulação

celular com características de células estaminais que têm a capacidade de se auto-renovar e de

se diferenciar (ainda que de forma aberrante), sendo elas as responsáveis pela iniciação e

progressão dos tumores e por estabelecer a heterogeneidade celular típica dos tumores (31-33).

Dois modelos têm sido propostos para explicar esta heterogeneidade nos tumores: o

modelo de evolução clonal (também designado de modelo estocástico) e o modelo das CSCs

(também designado de modelo hierárquico). Ambos os modelos propõem que apenas um

pequeno número de células dentro de um tumor tem a capacidade de iniciar e suster o

crescimento do tumor. No entanto, o modelo de evolução clonal é um modelo não-hierárquico

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1. Introdução

6

que propõe que todas as células dentro de uma população clonal dominante são biologicamente

homogéneas e, como tal, todas elas possuem um potencial tumorigénico semelhante. Mutações

que possam surgir nas células tumorais desta população conferem-lhes uma vantagem selectiva

de crescimento. Assim sendo, uma série de mutações que possam ocorrer numa única célula

podem torná-la num clone dominante que após sucessivas divisões dá lugar a várias células-

filhas com capacidade tumorigénica semelhante, as restantes células do tumor podem ser não-

tumorigénicas devido a eventos estocásticos. A heterogeneidade tumoral resulta da diversidade

de células presentes no tumor (Figura 1.2) (30-32, 34-36).

Em contraste, o modelo das CSCs sugere que as células estão organizadas

hierarquicamente, em que apenas uma pequena subpopulação das células que constituem a

população tumoral, são as responsáveis pela iniciação e progressão dos tumores e por

estabelecer a heterogeneidade celular típica dos tumores. Essas células também designadas por

células iniciadoras de tumores, do inglês Tumor Initiating Cells – TICs, à semelhança das células

estaminais normais têm capacidade de auto-renovação e de se diferenciar gerando as

populações de células heterogéneas já mais diferenciadas e com um potencial de divisão mais

limitado, razão pela qual se pensa que só as CSCs são tumorigénicas e podem levar ao

aparecimento de tumores (Figura 1.2) (30-32, 34-36).

Ainda está por esclarecer se as mutações ocorrem em células estaminais adultas que

existem nos tecidos normais ou se em células mais diferenciadas que após sofrerem a mutação

adquirem propriedades de células estaminais incluindo a capacidade de auto-renovação e de

diferenciação. No entanto, sabe-se que as células estaminais se podem dividir de forma

simétrica dando origem a duas células-filhas com as mesmas propriedades da célula estaminal

original, mas também de forma assimétrica, dando origem a uma nova célula estaminal e a uma

célula progenitora que pelo processo de diferenciação (altamente regulado), dá origem a uma

célula madura especializada (37).

Dado o paralelismo com as células estaminais normais, e de acordo com a teoria das

CSCs, apenas as CSCs são as células progenitoras dos tumores e as responsáveis pela sua

progressão extensa e heterogeneidade celular, estando na base da hierarquia (30-32, 34-36).

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1. Introdução

7

1.2.1 Identificação de CSCs

As primeiras evidências da existência de CSCs surgiram de estudos em amostras de

Leucemia Mielóide Aguda (LMA) (39, 40), nos quais se verificou que apenas uma pequena

subpopulação das células do tumor, cerca de 0,01-1% da população total, tinha propriedades

tumorigénicas (33). Esta pequena subpopulação de células foi capaz de iniciar e manter o

crescimento do tumor in vivo, o que se comprovou pelo transplante de células primárias de LMA

em ratinhos imunodeprimidos (40). Estas células além de terem a capacidade de se

diferenciarem e de proliferarem também apresentaram uma elevada capacidade de auto-

renovação, como demonstrado in vivo pela sua capacidade de formarem novos tumores quando

foram realizados xenotransplantes sucessivos em ratinhos imunodeprimidos (39, 41).

Estes estudos demonstram que na LMA, tal como no sistema normal hematopoiético, as

células estão organizadas hierarquicamente, e que o tumor é iniciado e mantido por uma

pequena subpopulação de células estaminais leucémicas (39, 41).

Figura 1.2 Modelos de heterogeneidade tumoral. Os tumores são compostos por células funcional e

fenotipicamente heterogéneas. Existem dois modelos que explicam esta heterogeneidade tumoral: o modelo

de evolução clonal e o modelo das CSCs. De acordo com o modelo de evolução clonal, as células tumorais são

biologicamente equivalentes, mas o seu comportamento é influenciado por factores intrínsecos e extrínsecos,

ambos variáveis e imprevisíveis. Em contraste, o modelo das CSCs propõe a existência de classes de células

biologicamente distintas e com capacidades funcionais e comportamentos diferentes. Este modelo pressupõe

que apenas uma pequena subpopulação de células tem a capacidade de iniciar e suster o crescimento do tumor

(as CSCs). Estas células possuem a capacidade de se dividirem assimetricamente, dando origem a uma CSC

idêntica (capacidade de auto-renovação) e a uma outra célula mais diferenciada, o que contribui para a

heterogeneidade do tumor (Adaptado de (38)).

Modelo de

Evolução Clonal

Modelo das

CSCs

Os modelos são

funcionalmente

heterogéneos

Factores

intrínsecos

Factores

extrínsecos

Célula iniciadora de

tumores

Células sem

capacidade de iniciar

tumores

X

X

X

X

X

X

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1. Introdução

8

Desde então, as CSCs têm sido identificadas em diversos tumores, incluindo tumores da

mama (42), cérebro (43), próstata (44), pâncreas (45, 46), ovário (47), e OS (29, 48).

Nesse sentido, um longo painel de marcadores de superfície tem sido avaliado no

sentido de isolar e caracterizar as CSCs. Este painel inclui, entre outros, o CD133, o CD44, o

CD24, o CD20, a molécula de adesão celular epitelial (EpCAM), o transportador ABCG2, e a

aldeído-desidrogenase 1 (ALDH1) (49), esta última pertence ao grupo de enzimas citosólicas que

oxidam aldeídos intracelulares em ácidos carboxílicos (ALDHs) (1, 33, 35, 50). No entanto, e

apesar do largo painel de marcadores utilizados para detectar as CSCs permitirem obter

populações enriquecidas em células com características de células estaminais, ainda não foram

estabelecidos marcadores específicos que permitam identificar inequivocamente as CSCs (1).

O CD133/AC133 foi identificado como um marcador das células estaminais

hematopoiéticas normais e mais tarde verificou-se que também está expresso em células

estaminais de um conjunto variado de tecidos tumorais (51, 52). Este marcador foi usado para

isolar CSCs em glioblastomas (53), em cancros do cólon (54), da próstata (55), entre outros. Nos

tumores do cérebro, verificou-se que as células CD133+, mas não as CD133-, expressam vários

marcadores de células estaminais neuronais, e são altamente tumorigénicas e resistentes à

radiação (56, 57). O CD44 e o CD24 foram propostos como marcadores para as células

estaminais em vários tipos de tumor (58, 59), no entanto, enquanto existem dados na literatura

que indicam a existência de células estaminais CD44+/CD24- em cancro da mama (42), outros

estudos demonstram que a falta de expressão do CD24 não é uma característica essencial das

CSCs. De facto, uma subpopulação de células CD24+ possui características de células estaminais

em cancros do cólon (60) e pancreático (61). O CD20 foi identificado em melanomas (62), e a

ALDH1 foi identificada em cancros da mama (63) e do ovário (64). O transportador ABCG2,

pertencente à família ABC (do inglês, ATP-binding cassette superfamily), que funciona como

bomba de efluxo de uma variedade de compostos endógenos e exógenos, é reconhecido como

um marcador de CSCs e desempenha um papel importante na promoção da proliferação e na

manutenção do fenótipo das células estaminais (65).

Alguns estudos mostraram que as células estaminais tumorais podem ser identificadas

por citometria de fluxo através da identificação de uma side-population (SP) utilizando a sonda

fluorescente Hoechst 33342. A identificação da SP, primeiramente descrita por Goodell et al.

(66), é baseada na capacidade das células em fazerem a exclusão do corante Hoechst 33342,

fenótipo este que está associado à sobre-expressão do transportador BCRP (do inglês, breast

cancer resistance protein) ou ABCG2 que reconhece a sonda como substrato impedindo a sua

acumulação no interior da célula, e que como já descrito anteriormente está sobre-expresso em

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1. Introdução

9

células estaminais (67). Estudos distintos mostraram a presença de SP em amostras de tumores

humanos de diferentes origens, incluindo LMA (68, 69), neuroblastoma (70), glioma (71) e

cancro do pulmão (72), o que sugere que a SP é enriquecida em CSCs.

Outra técnica muito utilizada no isolamento de CSCs é o ensaio de formação de esferas.

Esta técnica baseia-se na capacidade das células indiferenciadas crescerem sob a forma de

colónias esféricas quando cultivadas na ausência de soro e em condições de baixa aderência.

Nestas condições as células mais diferenciadas são incapazes de proliferar acabando por morrer,

o que permite fazer a selecção de populações celulares enriquecidas em células estaminais. Esta

técnica inicialmente desenvolvida para fazer o isolamento de células estaminais neuronais, tem

sido muito utilizada no isolamento de CSCs em diversos tumores incluindo cerebrais, da mama e

também em tumores ósseos (73).

Gibbs et al. foram os primeiros a demonstrar a existência de CSCs em OS pelo método de

formação de esferas (30). Os autores observaram a formação de colónias esféricas, às quais

chamaram sarcosferas, após cultivarem uma linha celular de OS (MG-63) em meio semi-sólido,

na ausência de soro e na presença de factores de crescimento em condições de baixa aderência.

Essas células apresentavam marcadores de pluripotência que apenas estão expressos em células

estaminais embrionárias o que reforça a validade do método no isolamento de células

indiferenciadas.

Estudos realizados por Martins-Neves et al. (29) utilizando a mesma metodologia com

pequenas modificações, isolaram também com sucesso sarcosferas a partir de outra linha celular

humana de OS – MNNG/HOS. Essas células, para além de expressarem marcadores de

pluripotência, diferenciaram-se em adipócitos, osteoblastos e condroblastos que são os tipos

celulares da linhagem mesenquimal da qual estes tumores derivam, o que demonstra que são

multipotentes, o que é outra característica de células estaminais. Além disso verificaram que as

sarcosferas eram mais resistentes tanto à quimioterapia como à radioterapia o que está de

acordo com a teoria de que as CSCs são resistentes às terapias convencionais.

1.3 Implicações Terapêuticas das CSCs

As CSCs possuem determinadas características que as tornam mais resistentes às

terapias convencionais, quando comparadas com as suas células homólogas mais diferenciadas,

o que significa que a sua existência tenha implicações significativas na resposta à terapia e no

tratamento do cancro. As estratégias terapêuticas convencionais partem do princípio de que a

maioria das células num tumor têm uma elevada actividade proliferativa, e utilizam uma

variedade de fármacos que interferem com a maquinaria celular básica como, por exemplo, a

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1. Introdução

10

síntese e replicação de DNA, o ciclo celular e a estrutura do citoesqueleto, causando danos

irreparáveis que levam à morte celular (36). No entanto, apesar da elevada citotoxicidade destes

fármacos, nem todas as células presentes num tumor são sensíveis a estes agentes, o que faz

com que a quimioterapia não seja, muitas das vezes, eficaz na erradicação das células tumorais e

na cura do cancro (74).

Existem evidências que sugerem que as CSCs são de facto as responsáveis pela

propagação do cancro, e como tal devem ser alvo de intensa investigação para o

desenvolvimento de novas terapias que levem à sua erradicação, uma vez que as terapias

actuais são direccionadas às células cancerígenas não estaminais. De facto, já foram

identificados vários mecanismos celulares que estão associados a uma maior resistência das

CSCs, tanto à quimioterapia convencional como à radioterapia. Alguns deles estão relacionados

com propriedades intrínsecas que as CSCs partilham com as suas congéneres estaminais não

tumorais. Uma delas é a sua capacidade de entrar num estado de quiescência durante os

tratamentos, sem no entanto perderem a sua capacidade proliferativa, protegendo-as dos

efeitos citotóxicos dos agentes de quimioterapia que têm como alvo preferencial células com

elevada taxa de proliferação. Uma vez que estas células não perdem a sua capacidade

proliferativa, elas podem voltar a re-entrar no ciclo celular e a iniciar o seu processo de divisão

celular dando origem à formação de novas lesões, uma vez que contêm o programa genético

completo para iniciar e manter o crescimento dos tumores (31, 74). Estudos realizados em CSCs

de LMA comprovam o que foi dito anteriormente (75, 76).

Outra característica destas células, e que lhes confere resistência à quimioterapia, é o

aumento da expressão e da actividade de transportadores membranares pertencentes à

superfamília ABC, que funcionam como bombas de efluxo da maioria dos agentes de

quimioterapia utilizados no tratamento do cancro, impedindo a sua acumulação intracelular.

Dentre estes destacam-se a BCRP e a glicoproteína-P (Pgp), cuja sobre-expressão em células

tumorais conduz ao chamado fenótipo de multi-resistência (74, 77-79). Por exemplo, a DOX e o

MTX, que são dois dos principais agentes de quimioterapia utilizados no tratamento do OS, são

substratos de transporte da BCRP e da Pgp (80). Como já referido anteriormente, a sobre-

expressão da BCRP até é utilizada para pesquisar a existência de CSCs por citometria de fluxo

através da identificação de uma SP que se caracteriza por uma baixa incorporação da sonda

fluorescente Hoechst 33342, facto esse que é atribuído à actividade da BCRP (81, 82).

Além disso, as CSCs parecem ter alterações nas vias que regulam a resposta celular aos

agentes de quimioterapia como por exemplo a activação de mecanismos de reparação de DNA

mais eficientes comparativamente aos das suas células homólogas mais diferenciadas (83, 84).

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1. Introdução

11

As vias de reparação do DNA são necessárias para manter a estabilidade genómica e

cromossómica, bem como as funções normais das células. Nas células normais, danos no DNA

podem levar a duas reacções diferentes: à sua reparação, ou à iniciação de uma cascata de

sinalização que resulta na eliminação das células (cujo DNA não foi reparado) por apoptose.

Estudos recentes demonstraram que CSCs isoladas de gliomas malignos possuem mecanismos

de reparação do DNA capazes de contornar os danos causados no DNA pelos agentes de

quimioterapia (85).

A indução da morte celular por apoptose é um dos principais mecanismos pelo qual a

maioria dos agentes de quimioterapia exerce o seu efeito citotóxico sobre as células tumorais.

Esta via de morte celular é altamente regulada e encontra-se frequentemente alterada em

células tumorais, o que torna possível a sobrevivência e a proliferação de células com DNA

danificado. Inúmeras proteínas reguladoras da apoptose têm a sua expressão alterada em

células tumorais, o que resulta na desregulação do controlo da apoptose, desenvolvimento de

resistência à terapia e progressão do cancro (79, 86, 87). Nas CSCs esta via de sobrevivência

ainda não está completamente caracterizada. No entanto, num estudo recente em células de

glioma foram identificados níveis aumentados de proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 e Bcl-XL numa

fracção de células CD133+ em relação aos níveis de expressão na fracção celular CD133- (88).

Além disso verificou-se que os níveis elevados da expressão da Bcl-2 e Mcl-1 (do inglês, induced

myeloid leukemia cell differentiation protein) estavam associados à resistência das células de

glioma CD133+ ao tratamento com um inibidor da Bcl-2, ABT-737 (89-92). Estas observações

sugerem que as CSCs têm mecanismos que lhes conferem maior capacidade de evadir a

apoptose e sobreviver à terapia e que merecem ser explorados no sentido de contribuir para o

desenvolvimento de novas terapias que sejam eficazes na sua eliminação (85).

Assim, apesar de inicialmente os tumores até responderem favoravelmente às terapias actuais

com reduções significativas na massa tumoral, se a pequena fracção de CSCs não for eliminada

os tumores voltam a recidivar devido à sua capacidade de auto-renovação e elevado potencial

tumorigénico (Figura 1.3 a). Terapias direccionadas às CSCs podem não ser eficazes na rápida

indução da redução da massa tumoral, mas ao limitarem a capacidade de auto-renovação das

CSCs, que está na base da proliferação do tumor, podem tornar-se eficazes a longo prazo (Figura

1.3 b) (1, 59).

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1. Introdução

12

1.3.1 Apoptose

O termo apoptose ou morte celular programada foi proposto em 1972 por Kerr, Wyllie

and Currie (93) para descrever uma forma distinta da morte celular que ocorre de forma

programada. Esta forma de morte celular ocorre normalmente em diversas situações, como por

exemplo, durante o desenvolvimento, na organogénese e hematopoiese normal e patológica, no

envelhecimento, na resposta inflamatória e na eliminação de células após um dano celular,

assumindo uma importância fundamental na homeostasia dos tecidos. Os mecanismos de

apoptose são extremamente complexos e sofisticados, envolvendo uma cascata de

acontecimentos moleculares dependentes de energia (94).

A apoptose pode ser desencadeada por vários estímulos e condições e é activada por

duas vias principais: a via extrínseca ou via do receptor de morte, e a via intrínseca ou via

mitocondrial que convergem mutuamente através da cascata de reacções proteolíticas que

envolvem a activação das caspases que são as executoras centrais da apoptose (94, 95).

O tumor é reduzido em tamanho, mas

eventualmente ocorre uma recidiva devido à

presença das CSCs

Figura 1.3 Impacto do modelo das CSCs nos tratamentos anti-tumorais. a) Os tratamentos anti-tumorais desenvolvidos para uma ampla actividade citotóxica podem eliminar a maior parte das células cancerígenas de um tecido tumoral específico e induzir uma grande, ou mesmo completa, regressão da massa tumoral. No entanto, se algumas CSCs conseguirem sobreviver, estas são capazes de voltar a proliferar e dar lugar a uma recorrência do tumor. b) Em contraste, os tratamentos anti-tumorais que têm por alvo específico as CSCs, embora teoricamente incapazes de levar a uma rápida redução do tumor, a longo prazo podem levar à erradicação do tumor por reduzirem a capacidade de auto-renovação e o potencial de crescimento das CSCs. (Adaptado de (59)).

Tratamento que não tem

por alvo específico as CSCs

Curto prazo Longo prazo

Tratamento que tem por

alvo específico as CSCs O tumor pode não reduzir de tamanho

rapidamente, no entanto, o seu potencial de

crescimento diminui progressivamente

Curto prazo Longo prazo

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1. Introdução

13

A via extrínseca (Figura 1.4) é mediada pela ligação de ligandos a certos receptores

existentes na superfície celular – os receptores de morte (94), pertencentes à família dos

factores de necrose tumoral (TNF). Estes receptores de morte incluem uma subfamília que é

caracterizada por terem domínios extracelulares ricos em cisteína e um domínio intracelular – o

domínio de morte – que é essencial para a transdução do sinal apoptótico (95-97).

Quando estes ligandos se ligam aos receptores de morte, como por exemplo, o CD95, o

TRAIL-R1 (do inglês, TNF-related apoptosis-inducing ligand-R1) ou o TRAIL-R2 (do inglês, TNF-

related apoptosis-inducing ligand-R2), então os domínios de morte recrutam a proteína

adaptadora intracelular FADD (do inglês, Fas-associated death domain protein), formando-se um

complexo de sinalização indutor de morte (DISC), que por sua vez, vai recrutar as formas

inactivas de certos membros da família das caspases, promovendo a sua activação. Quando as

caspase 8 e 10, que são caspases iniciadoras, são activadas vão posteriormente promover o sinal

de morte através da activação das caspases executoras a jusante que vai desencadear o

processo de morte celular (95).

A via intrínseca ou mitocondrial (Figura 1.4) é desencadeada por estímulos que têm

origem no interior da célula: stresse intracelular, lesões no DNA, privação de factores de

crescimento, hipoxia ou activação de oncogenes. Estes insultos convergem normalmente ao

nível da mitocôndria, levando a alterações na permeabilidade da membrana externa permitindo

a libertação de moléculas apoptogénicas, normalmente sequestradas do espaço

intermembranar, para o citoplasma (94, 98). Entre essas proteínas encontra-se o citocromo c,

que é então responsável pela activação desta via de sinalização apoptótica transduzida pela

mitocôndria. No citosol, o citocromo c, na presença de ATP liga-se e activa o complexo APAF-1

(do inglês, Apoptotic Protease Activating Factor-1), que por sua vez recruta uma pró-caspase

iniciadora, a pró-caspase 9, formando-se o complexo molecular denominado de apoptossoma,

que uma vez activado leva à activação da caspase-9 que por sua vez cliva e activa as pró-

caspases efectoras 3, 6 e 7, que podem ainda clivar a activar a pró-caspase 9 num processo de

feed-back positivo. Uma vez activadas, as caspases efectoras clivam uma variedade de

substratos celulares contribuindo para as alterações morfológicas observadas nas células em

apoptose como a fragmentação do núcleo, condensação da cromatina e clivagem do DNA e

ondulação da membrana plasmática (94, 95). Estas caspases clivam também enzimas envolvidas

nos mecanismos de resposta a danos no DNA como a PARP (poly-ADP-ribose polimerase) e

outras, impedindo dessa forma a sua reparação e tornando irreversível o processo apoptótico

(94).

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1. Introdução

14

A regulação destes eventos apoptóticos mitocondriais é efectuada pelos membros da

família Bcl-2, com membros pró- e anti-apóptoticos (94, 100) que controlam directamente a

permeabilidade da membrana externa mitocondrial, e deste modo, regulam a libertação dos

factores apoptogénicos (tais como o citocromo c) para o citoplasma (101, 102). A regulação da

permeabilidade membranar pela família Bcl-2 pode ser pró-apoptótica ou anti-apoptótica. Os

membros anti-apoptóticos desta família inibem a libertação dos factores apoptogénicos,

enquanto os membros pró-apoptóticos promovem a sua libertação (101). Entre as proteínas

pró-apoptóticas destacam-se a Bax (do inglês, Bcl-2 associated X protein), e a Bak (do inglês, Bcl-

2 antagonist killer 1), que sob estímulos apoptóticos induzem a formação de um poro que

medeia a libertação de proteínas apoptogénicas, e entre as proteínas anti-apoptóticas

destacam-se a Bcl-2 (do inglês, B-celllymphomaprotein 2) e a Bcl-XL (do inglês, Bcl-2 related

protein, long isoform) que têm uma acção anti-apoptótica que pode ocorrer através da

Bax/Bak

Bcl-2/Bcl-XL

Bid

t-Bid

Stresse Mitocondrial

Mitocôndria

Citocromo c

APAF-1

Apoptossoma

Pró-caspase 9

Caspase-9

activa

Caspase-3

activa

Cascata das

Caspases

Pró-caspase 3

Caspase-8

activa

Pró-caspase 8

Complexo

DISC

FADD

Via Intrínseca Via Extrínseca

CD95, TRAIL

Ligação

Apoptose

Pró-caspase 3

Figura 1.4 Vias intrínseca e extrínseca da apoptose. Na via extrínseca, os receptores de morte (tal como, o CD95,

o TRAIL-R1 e o TRAIL-R2) são activados pelos receptores da família TNF, o que leva à activação da caspase-8,

logo após a sua ligação ao complexo DISC, a partir da molécula FADD. Na via intrínseca, certos estímulos causam

uma perturbação na mitocôndria que leva à libertação de certas proteínas, tais como, o citocromo c. Esta

libertação de citocromo c é regulada pelos membros da família da Bcl-2, sendo que os membros anti-

apoptóticos (Bcl-2 e Bcl-XL) inibem a libertação e os membros pró-apoptóticos (Bax e Bak) promovem a

libertação. Uma vez libertado, o citocromo c liga-se ao APAF-1 e à pró-caspase 9, formando o apoptossoma, e

levando à activação da caspase-9. Por sua vez, as caspases iniciadoras 8 e 9 activam a caspase efectora 3, o que

leva à activação da cascata das caspases, que culmina com a apoptose (adaptado de (99)).

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1. Introdução

15

interacção com a Bax ou Bak sequestrando-as na mitocôndria ou com proteínas que impeçam a

sua activação. A razão entre os níveis de expressão destas proteínas é de extrema importância

na indução da morte celular por apoptose ou na reversão deste processo (94).

1.3.1.1 Apoptose e cancro

Defeitos a nível da regulação da morte celular podem estar na base do aparecimento de

várias doenças, entre as quais, o cancro e doenças neurodegenerativas, tais como, a doença de

Parkinson, e a doença de Alzheimer (94).

O cancro é um exemplo onde a regulação dos mecanismos normais do ciclo celular está

desregulada, e isso pode ocorrer tanto por um excesso de proliferação como por uma

diminuição da eliminação de células disfuncionais. Aliás, a supressão da apoptose durante a

carcinogénese parece desempenhar um papel importante no desenvolvimento e progressão de

determinados cancros. As células tumorais são capazes de suprimir a apoptose a partir de uma

variedade de mecanismos moleculares. No caso do cancro, o crescimento celular resulta não só

de uma proliferação descontrolada mas também de uma morte celular reduzida (94).

As células tumorais podem adquirir resistência à apoptose tanto pela sobre-expressão

de proteínas anti-apoptóticas, tal como a Bcl-2, como pela diminuição da expressão de proteínas

pró-apoptóticas, tal como a Bax. Tanto a expressão da Bcl-2 como da Bax são reguladas pelo

gene p53 (94). Certas formas de linfoma de células B humanas apresentam uma sobre-expressão

de Bcl-2, sendo esta uma das mais fortes evidências de que defeitos a nível da apoptose

contribuem para o aparecimento do cancro (103).

Além disso, essa desregulação do processo apoptótico tem também implicações na

resposta à terapia uma vez que os tratamentos do cancro se baseiam na aplicação combinada de

estratégias terapêuticas (quimioterapia e radioterapia) que culminam em morte celular por

apoptose (95).

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1. Introdução

16

1.4 Objectivos

O principal objectivo deste trabalho foi explorar o papel da via intrínseca ou

mitocondrial da apoptose na sensibilidade das células estaminais cancerígenas e na sua resposta

aos efeitos citotóxicos da DOX. Com esse objectivo, propusemo-nos:

Isolar uma subpopulação de células estaminais cancerígenas (CSCs) a partir da

linha celular humana de OS MNNG/HOS pelo método de formação de esferas;

Avaliar o efeito da DOX na viabilidade, proliferação celular e indução de

apoptose nas CSCs e nas células parentais MNNG/HOS;

Analisar os níveis de expressão de proteínas envolvidas na activação da via

intrínseca da apoptose após exposição à DOX.

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17

2. Materiais e Métodos

2.1 Cultura Celular

A linha celular humana aderente de OS MNNG/HOS foi adquirida da

AmericanTypeCultureCollection (ATCC, Rockville, MD). As células cresceram em monocamada,

em frascos aderentes T75 (Orange Scientific, Belgium), em meio de cultura RPMI-1640 (R4130,

Sigma-Aldrich®, St. Louis, USA) suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino (FBS, 10270-

106, Gibco® Invitrogen Life Technologies), 1% (v/v) de penicilina/estreptomicina (15070-063,

Gibco® Invitrogen Life Technologies), e 0,1% (v/v) de anfotericina B (5290-018, Gibco® Invitrogen

Life Technologies), a 37°C numa atmosfera humedecida com 5% de CO2 e 95% de ar. As células

foram divididas duas vezes por semana, em condições estéreis, numa câmara de fluxo laminar

sempre que atingiam uma confluência de cerca de 80%. Estas células não receberam qualquer

tipo de tratamento prévio com agentes de quimioterapia.

2.1.1 Ensaios de Viabilidade Celular

Antes de serem realizadas quaisquer experiências, a viabilidade celular foi determinada

pelo método de exclusão com azul de tripano. Este método é baseado no princípio de que as

células viáveis com membranas celulares intactas não coram de azul, surgindo brilhantes quando

observadas ao microscópio, enquanto as células mortas ou danificadas surgem coradas de azul.

Para este procedimento adicionaram-se iguais volumes (20 µl) de suspensão celular e de 0,4% de

azul de tripano, e transferiu-se essa mistura para um hematocitómetro (câmara de Neubauer;

Marienfeld, Germany), sendo as células posteriormente contadas num microscópio invertido

(Nikon, Eclipse TS 100). A viabilidade celular foi calculada como a percentagem de células viáveis

relativa ao número total de células. Apenas células com uma viabilidade superior a 90% foram

utilizadas nos ensaios subsequentes.

As CSCs foram isoladas a partir da linha celular parental MNNG/HOS pelo método de formação

de esferas em superfícies não aderentes descrito por Martins-Neves et al. (29). As células

MNNG/HOS com uma confluência de 70-80% foram destacadas do frasco de cultura com 1 mL

de tripsina-EDTA (T4049, Sigma-Aldrich®), e seguidamente plaqueadas com uma densidade de

60.000 células/poço em placas de cultura de 6 poços (Orange Scientific, Belgium), previamente

revestidas com 0,8 mg/cm2 (0,4 mL/poço) de poly-HEMA (P3932, Sigma-Aldrich®), em meio N2

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2. Materiais e Métodos

18

com 1% de metilcelulose (M0387, Sigma-Aldrich®), sem soro. O meio N2 consiste em meio

DMEM/F12 (Dulbecco’s Modified Eagle Medium/F12-Ham, D2906, Sigma-Aldrich®)

suplementado com 1,2 g/L de bicarbonato de sódio (S6297, Sigma-Aldrich®), progesterona 20

nM (P7556, Sigma-Aldrich®), putrescina 100 µM (P5780, Sigma-Aldrich®), 1% (v/v) de

suplemento insulina (20µg/mL)-transferrina(25µg/mL)-selenite(30nM) (Gibco® Invitrogen Life

Technologies), 1% (v/v) de penicilina/estreptomicina e 0,1% (v/v) de anfotericina B. De dois em

dois dias foram adicionadas alíquotas de factor de crescimento epidermal humano (EGF, Sigma-

Aldrich®) e de factor de crescimento fibroblástico básico humano (bFGF, Peprotech EC, London,

UK), numa concentração final de 10 ng/mL. As células foram mantidas a 37°C numa atmosfera

humedecida com 5% de CO2 e 95% de ar.

Após um período de 7-10 dias, as esferas em suspensão, também denominadas de

sarcosferas, foram recolhidas e transferidas para superfícies aderentes (frascos T25, Orange

Scientific, Belgium) e mantidas em meio RPMI-1640 contendo 10% de FBS, como referido

anteriormente para as células MNNG/HOS. Após atingirem uma confluência de cerca de 70-80%,

as células foram dissociadas e re-plaqueadas em meio N2 em placas não aderentes, como

descrito anteriormente, para isolamento de esferas de 2ª geração. Este procedimento foi

repetido 5-6 vezes para avaliar a capacidade de auto-renovação destas esferas. As sarcosferas

obtidas a partir da 3ª geração foram utilizadas nos estudos subsequentes e foram designadas de

CSCs. A eficiência de formação de esferas foi calculada como percentagem do número de esferas

formado em relação ao número total de células plaqueado.

Antes da sua utilização nos ensaios de citotoxicidade, as CSCs foram expandidas em

frascos aderentes em meio de cultura apropriado para MSCs que consiste em DMEM de baixa

glicose suplementado com 10% de soro específico para células mesenquimais (MSC-qualified

serum), glutamina 2 mM (59202C, Sigma-Aldrich®), 1% (v/v) de penicilina/estreptomicina e 0,1%

(v/v) de anfotericina B.

2.3 Estudos de Citotoxicidade com DOX

Sendo a DOX o principal agente de quimioterapia utilizado no tratamento do OS

avaliámos a sensibilidade das células parentais MNNG/HOS e das CSCs a este fármaco. Os efeitos

citotóxicos da DOX foram avaliados ao nível da actividade da enzima mitocondrial succinato

desidrogenase utilizando o método colorimétrico de MTT, e da proliferação celular utilizando o

método de incorporação com BrdU. Avaliámos também a morte celular por apoptose utilizando

o ensaio de TUNEL.

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2. Materiais e Métodos

19

2.3.1 Preparação das células MNNG/HOS e das CSCs para os estudos de

citotoxicidade com DOX

As células MNNG/HOS e as CSCs, previamente expandidas com uma confluência de 70%,

foram destacadas com tripsina, contadas e plaqueadas em placas de 96 poços (Orange Scientific,

Belgium) numa densidade de 7500 células/poço nos respectivos meios de cultura. As placas

foram colocadas na incubadora a 37°C durante 24h para as células aderirem à superfície da

placa.

Após este período, as células foram incubadas com diferentes concentrações de DOX

desde 0,001 µM até 100 µM e colocadas novamente na incubadora a 37°C durante um período

de 48h. A DOX foi preparada a partir de uma solução stock (DOXO-cell®, 2 mg/mL) fazendo

diluições apropriadas em PBS de modo a que o volume de DOX adicionado não ultrapassasse os

10% do volume de suspensão celular.

2.3.2 Estudos de Viabilidade Celular – Ensaio colorimétrico de MTT

O efeito da DOX na viabilidade celular foi avaliado pelo método colorimétrico de

brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT). Este método é baseado na

actividade da enzima mitocondrial succinato desidrogenase que se encontra activa apenas em

células viáveis metabolicamente activas. Esta enzima reduz o sal de tetrazólio solúvel e de cor

amarela e converte-o num produto insolúvel de cor violeta (cristais de formazan), cuja

quantidade pode ser determinada por espectrofotometria, onde a intensidade da cor resultante

da dissolução dos cristais de formazan é proporcional à actividade da enzima e por conseguinte

ao número de células viáveis.

Após um período de incubação de 48h das células com a DOX, removeu-se o meio de

cultura e adicionaram-se 50 µl/poço de uma solução de 0,5 mg/mL de MTT (M2128, Sigma-

Aldrich®). As células foram mantidas a 37°C na incubadora durante um período de 4h, que é o

tempo necessário para ocorrer a redução do MTT e levar à formação dos cristais de formazan.

Depois adicionaram-se 50 µl/poço de isopropanol ácido (HCl 0,04M) para dissolver os cristais de

formazan. Por fim, mediram-se as absorvâncias num leitor de microplacas ELISA com filtro de

referência a 620 nm e filtro de leitura a 570 nm.

A percentagem de células viáveis em relação aos respectivos controlos (células sem tratamento

com DOX) foi calculada a partir da seguinte fórmula (1):

( ) ( )

( ) (1)

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2. Materiais e Métodos

20

Com os valores obtidos foram traçadas curvas de dose-resposta numa escala semi-

logarítmica (% da viabilidade celular em função do logaritmo da concentração de DOX). As

curvas foram depois ajustadas a uma função sigmoidal (equação 2) e determinados os valores da

concentração de fármaco necessária para inibir a viabilidade celular em 50% (IC50).

( ) (2)

em que A1 e A2 são os valores mínimo e máximo de y, respectivamente, x0 é o valor do IC50 e p

é o declive da recta. A curva foi ajustada usando o programa OriginPro8 (OriginLab Corporation,

versão 8).

2.3.3 Estudos de Proliferação Celular – Ensaio colorimétrico de BrdU

O efeito da DOX na proliferação celular das células parentais MNNG/HOS e das

sarcosferas foi avaliado utilizando o ensaio de incorporação de 5-bromo-2’-deoxiuridina (BrdU),

que ocorre durante a síntese de DNA em células que estão em proliferação. O BrdU é um

nucleósido sintético análogo da timidina, que após ser metabolizado origina o BrdU-trifosfato, o

qual é incorporado em vez da timidina no DNA de células que estão na fase S do ciclo celular.

Neste estudo foi utilizado o kit comercial CellProliferation ELISA, BrdU(Roche®, Germany)

de acordo com as instruções do fabricante. Em resumo, após um período de incubação de 48h

das células com DOX, como descrito na secção 2.3.1, foram adicionados a cada poço 10 µl de

solução de BrdU (100 µM) e colocaram-se na incubadora de CO2 a 37°C durante 3h. Terminado o

período de incubação, removeu-se o meio de cultura contendo o BrdU, e adicionaram-se 200

µl/poço de solução fixadora (FixDenat), e incubaram-se durante 30 min à temperatura ambiente

para desnaturar o DNA e facilitar o acesso do anticorpo primário ao BrdU previamente

incorporado. De seguida removeu-se o fixador, e incubaram-se as células com 100 µl/poço de

solução anti-BrdU-POD, durante 90 min à temperatura ambiente. Terminado este período,

removeu-se a solução e lavaram-se os poços 3 vezes com 200 µl/poço de solução de lavagem.

Por fim foram adicionados 100 µl/poço de solução de substrato e aguardaram-se 20 min à

temperatura ambiente até à leitura das aborvâncias, num leitor de ELISA com filtro de referência

a 492 nm e filtro de leitura a 370 nm.

Com os valores de absorvância determinou-se a percentagem de células em proliferação

em relação aos respectivos controlos (células sem tratamento com DOX), de acordo com a

equação (1). Com esses valores foram traçadas curvas de dose-resposta, tal como descrito na

secção 2.3.2.As curvas obtidas foram ajustadas a uma função sigmoidal de acordo com a

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2. Materiais e Métodos

21

equação (2) e calculados os valores da concentração de DOX que inibem a proliferação celular

em 50% (IC50).

2.3.4 Ensaio de TUNEL para medição da apoptose

A fragmentação do DNA representa uma característica essencial da morte celular por

apoptose. O ensaio de TUNEL (Terminal dUTP Nick-End Labeling) permite identificar células em

apoptose através da detecção de fragmentos de DNA por microscopia de fluorescência. Os

fragmentos de DNA resultantes da quebra do DNA genómico podem ser identificados por

marcação de terminações 3’-OH livres, através de uma reacção enzimática que catalisa a

incorporação de nucleótidos marcados com fluoresceína. Este ensaio foi realizado nas células

MNNG/HOS e nas sarcosferas após exposição a diferentes concentrações de DOX (1 µM; 2 µM; 5

µM, 10 µM e 25 µM) durante 48h. Como controlo negativo foram utilizadas células em meio de

cultura sem exposição à DOX.

Fixação Celular

Após as 48h de incubação com DOX, recolheu-se o meio de cultura para tubos de

recolha, lavaram-se os poços com PBS e destacaram-se as células com tripsina. Os tubos

contendo as células e o meio de cultura foram depois centrifugados a 1500 rpm durante 10 min.

Depois de removido o sobrenadante, adicionaram-se 500 µl de uma solução de paraformaldeído

4% (P6148, Sigma-Aldrich®), durante 20 min à temperatura ambiente para a fixação das células.

De seguida adicionaram-se 1000 µl de PBS à suspensão celular, centrifugaram-se a 1500 rpm

durante 10 min e removeram-se 1000 µl do sobrenadante. Os restantes 500 µl de suspensão

celular foram depois centrifugados a 1000 rpm durante 5 min numa centrífuga de Cytospin

(Cellspin I, Tharmac GmbH, Waldsolms, Germany) para a deposição das células em lâminas de

vidro.

Ensaio de TUNEL

As células foram seguidamente permeabilizadas com Triton 0,25%. Depois de lavadas

com PBS depositaram-se sobre as células 30 µl de uma solução contendo Tris-Cacodilato 30 mM

contendo a enzima transferase desoxinucleotidil terminal (TdT, 03333574001, Roche®,

Germany), o nucleótido (dUTP, 11093070910, Roche®, Germany) e cloreto de cobalto (CoCl2,

11243306001, Roche®, Germany), e incubaram-se 1h a 37°C numa câmara humedecida.

Terminada a reacção, as lâminas foram lavadas com tampão TB (citrato de sódio 30 mM e NaCl

300 mM), e com PBS, e depois incubadas com fluoresceína (numa diluição de 1:100) (Vector

Laboratories Inc.), durante 1h à temperatura ambiente e protegidas da luz. Por fim, lavaram-se

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2. Materiais e Métodos

22

as células com PBS e incubaram-se com uma solução de 5 µg/mL de Hoechst (Hoechst 33258,

861405, Sigma-Aldrich®) para a marcação dos núcleos durante 5 min, seguida de 2 lavagens com

PBS. As células foram depois cobertas com uma lamela com o meio de montagem (Vectashield

Mounting Medium for fluorescence, Vector Laboratories, Inc. Burlingame, CA). As lâminas foram

observadas ao microscópio de fluorescência (Leica DFC350 FX, Leica Microsystems,

Bannockburn, IL, EUA). A percentagem de células apoptóticas foi determinada como

percentagem de células TUNEL-positivas em relação ao número total de células.

2.4 Análise da expressão de proteínas por Western blot

2.4.1 Expressão de proteínas anti- e pró-apoptóticas da família Bcl-2 e da

caspase- 3

A análise dos níveis de expressão das proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 e Bcl-XL, das

proteínas pró-apoptóticas Bax e Bak, e de uma caspase executora (caspase-3) foi determinada

por Western blot após exposição das células a 0,7 µM de DOX a diferentes intervalos de tempo

(6h, 24h e 48h). Esta concentração de DOX corresponde ao valor do IC50 das células parentais

MNNG/HOS, obtido a partir dos estudos de viabilidade celular com MTT.

2.4.1.1 Preparação de extractos celulares

Foram preparados extractos totais a partir das células parentais MNNG/HOS e das CSCs

na situação de controlo e após exposição à DOX nos intervalos de tempo acima referidos.

Depois de recolhidas as células e lavadas com PBS, os pellets celulares obtidos foram

incubados com tampão de lise - RIPA (50mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100,

0,5% deoxicolato de sódio e 0,1% de dodecil sulfato de sódio), suplementado com uma mistura

de inibidores de proteases (Roche®) e inibidores de fosfatases (Roche®), e 1mM ditiotreitol

(DTT). As amostras foram mantidas a 4°C durante 30 min com agitação regular e depois

sonicadas num aparelho de ultra-sons (Vibra cell Sonics and Materials Inc. Danbury, CT USA) a 40

MHz, com 3-5 pulsos durante 5 segundos.

A quantificação da proteína dos lisados celulares foi realizada a partir do método do

ácido bicinconínico (BCA, B9643, Sigma-Aldrich®) que permite fazer a detecção colorimétrica e a

quantificação da proteína. Este procedimento é baseado na formação de complexos

proteína/Cu2+, em condições alcalinas, seguido da redução de Cu2+ a Cu1+. Esta redução é

proporcional à quantidade de proteína existente na amostra. Em condições alcalinas, a quelação

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2. Materiais e Métodos

23

de BCA com o Cu1+ forma um complexo azul/roxo que pode ser medido no medidor automático

de ELISA num comprimento de onda de 562 nm.

As amostras foram depois diluídas com igual volume de solução desnaturante 2 vezes

concentrada [Tris-HCl 0,25 M (pH 6,8), DTT 200 mM, glicerol 20% (m/v) (G5516, Sigma-Aldrich®),

SDS 4% (m/v) e de azul de bromofenol 0,05% (m/v)], e foram desnaturadas a 95°C durante 5

min. As amostras foram guardadas a -20°C até à sua utilização.

2.4.1.2 Electroforese em gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sódio (SDS-

PAGE) e Electrotransferência

As amostras foram resolvidas por SDS-PAGE em géis de acrilamida (161-0148, Bio-Rad

Laboratories, Inc.) numa concentração de 12% (w/v) durante 60 min a 110V em solução tampão

de electroforese [Tris-HCl 50 mM (pH 8,0-8,5) contendo bicina 50 mM (B3876, Sigma-Aldrich®) e

0,1% (m/v) de SDS].

Para a análise por imunodetecção foram utilizados 20-40 µg de proteína total. Em todas

as eletroforeses foi utilizado um marcador de proteínas com peso molecular conhecido –

Precision Plus ProteinTM Standards (161-0373, Bio-RadTM).

Depois de terminada a electroforese, as proteínas foram transferidas do gel de

electroforese para membranas hidrofóbicas de difluoreto de polivinildieno (PVDF, Boehringer

Mannheim, Alemanha), previamente activadas com metanol (Merck, Germany). A

electrotransferência foi realizada em tampão de electrotransferência [Tris-HCl 12,5mM (pH 8,0-

8,5) contendo glicina 96 mM (G8898, Sigma-Aldrich®) e 20 % (v/v) de metanol], a 110V durante

90 min, a 4°C.

2.4.1.3 Immunoblotting e Quantificação

Uma vez terminada a electrotransferência, as membranas foram bloqueadas com uma

solução de 5% (m/v) de leite magro em tampão salino de Tris (TBS: Tris 20 mM, pH 7,6;NaCl 137

mM) contendo 0,1% (v/v) de Tween20 (437082, VWR®) (TBS-T), durante 1h à temperatura

ambiente com agitação suave de modo a evitar a ligação inespecífica aos locais livres na

membrana. De seguida, as membranas foram incubadas overnight, a 4°C, com o anticorpo

primário na diluição desejada (Tabela 1) em TBS-T com 1% (m/v) de leite magro, contendo 0,02%

(v/v) de azida de sódio. Terminada a incubação, as membranas foram lavadas com TBS-T 5 vezes

durante 5 min cada lavagem, e em seguida foram incubadas com o respectivo anticorpo

secundário conjugado com a fosfatase alcalina [anti-mouse ou anti-rabbit] durante 1h à

temperatura ambiente, e com agitação. Por fim, as membranas foram novamente lavadas com

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2. Materiais e Métodos

24

TBS-T (5 vezes, 5 min), e depois reveladas com o reagente ECF (Enhanced Chemifluorescence,

Western blotting Reagent Pack, GE Lifesciences, Pittsburg, PA).

As bandas reactivas foram visualizadas no Typhoon FLA 9000 (GE Healthcare Bioscience

AB, Uppsala, Sweden) e foram quantificadas utilizando o programa ImageJ (Research Service

Branch).

As membranas foram depois utilizadas para marcação posterior com o anticorpo contra

uma proteína constitutiva (β-actina). Para isso procedeu-se ao stripping das membranas durante

5 min com NaOH 0,2M. Depois de lavadas com TBS-T procedeu-se à incubação das membranas

com o anticorpo contra actina, seguido de incubação com o anticorpo secundário e revelação,

tal como descrito anteriormente para as proteínas de interesse.

Os níveis de expressão das proteínas de interesse foram normalizados para a expressão

da β-actina. Com os valores normalizados calculou-se a razão entre os níveis de expressão da

proteína de interesse obtida após a exposição à DOX para os diferentes intervalos de tempo, em

relação à situação de controlo.

Tabela 1. Anticorpos primários e secundários usados na técnica de Western Blot, e respectivas diluições.

Anticorpo

Primário

Peso Molecular Diluição Marca Anticorpo

Secundário

Diluição

Bcl-2 26 kDa 1:200 Santa Cruz Biotechnology Anti-Mouse 1:20000

Bcl-XL 30 kDa 1:200 Santa Cruz Biotechnology Anti-Mouse 1:20000

Bak 30 kDa 1:200 Santa Cruz Biotechnology Anti-Rabbit 1:20000

Bax 23 kDa 1:100 Santa Cruz Biotechnology Anti-Rabbit 1:20000

Caspase 3 35 kDa 1:1000 Cell Signaling Technology® Anti-Rabbit 1:20000

β-actina 43 kDa 1:10000 MiliporeTM

Anti-Mouse 1:20000

2.5 Análise Estatística

Todos os dados são apresentados como média ± desvio-padrão (SD) ou como média ±

erro padrão na média (SEM), com n a indicar o número de experiências realizadas. O teste não-

paramétrico Mann-Whitney foi utilizado para comparações entre duas populações celulares

diferentes sob a mesma condição. O mesmo teste foi utilizado para comparações na mesma

população celular sob diferentes condições. O valor de p<0,05 foi considerado estatisticamente

significativo. Os resultados obtidos foram estatisticamente tratados utilizando o software

GraphPad Prism, Version 5.0.

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25

3. Resultados

3.1 Isolamento de CSCs a partir da linha celular humana de OS MNNG/HOS

A existência de uma subpopulação de células com propriedades de células estaminais na

linha celular humana aderente de OS MNNG/HOS foi demonstrada pelo método de formação de

esferas. As células parentais aderentes MNNG/HOS com uma confluência de cerca de 70%

(Figura 3.1 A) foram cultivadas em meio DMEM/F12 com 1% de metilcelulose, sem soro, e em

superfícies não aderentes. Nestas condições, e após um período de cerca de 7 dias, as células

começaram a crescer em suspensão formando colónias esféricas com cerca de 50-100 µm de

diâmetro, as quais foram designadas de sarcosferas ou esferas de 1ª geração (Figura 3.1 B). A

eficiência de formação de esferas foi de aproximadamente 5,0 ± 0,2% (n=3). A presença da

metilcelulose no meio, tornando-o viscoso, previne a reagregação celular pelo que cada colónia

esférica deriva em princípio de uma única célula.

E.

Esferas de 2ª geração Esferas de 6ª geração

Meio sem soro com

metilcelulose

7 dias em superfícies

não aderentes

MNNG/HOS Esferas de 1ª geração

2-3 dias em condições

de cultura standard

Condições de

cultura Standard

Figura 3.1 Isolamento de CSCs a partir da linha celular humana de OS MNNG/HOS pelo método de formação de

esferas. A. Linha celular parental aderente MNNG/HOS. B. Esferas derivadas da linha celular parental

MNNG/HOS após 7 dias em meio sem soro e em superfícies não aderentes. C. CSCs removidas da cultura em

suspensão, colocadas em superfícies aderentes e cultivadas em meio RPMI contendo soro. As células aderentes

começaram a expandir a partir de cada colónia esférica. D. Formação de esferas de 2ª geração a partir das

células aderentes isoladas em meio sem soro e com metilcelulose, em superfícies não aderentes. E. Formação

de esferas de 6ª geração, a partir do mesmo protocolo usado para formar esferas de 2ª geração. (Ampliação

original: 200x).

Meio sem soro com

metilcelulose

7 dias em

superfícies não

aderentes

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3. Resultados

26

As esferas de 1ª geração foram posteriormente recolhidas e transferidas para frascos de

cultura aderentes com meio de cultura RPMI suplementado com 10% de FBS. As células

provenientes destas esferas começaram a migrar e a aderir à superfície do frasco, adquirindo

uma morfologia semelhante à das células parentais MNNG/HOS (Figura 3.1 C). Assim que

atingiram uma confluência de cerca de 70%, estas células foram novamente isoladas em meio de

cultura DMEM/F12 sem soro e com 1% de metilcelulose, como descrito anteriormente, dando

então origem às esferas de 2ª geração (Figura 3.1 D), com uma eficiência de formação

semelhante à da formação de esferas de 1ª geração. Este processo de formação de esferas,

passando de células aderentes a esferas em suspensão, foi repetido várias vezes tendo-se

observado a formação de esferas pelo menos até à 6ª geração (Figura 3.1 E), o que demonstra a

capacidade de auto-renovação destas células, que é uma característica de células estaminais. As

sarcosferas a partir da 3ª geração foram usadas em estudos subsequentes, e foram

denominadas de células estaminais cancerígenas (CSCs).

3.2 Sensibilidade das células MNNG/HOS e das CSCs à DOX

3.2.1 Efeito da DOX na Viabilidade e na Proliferação Celulares

Avaliou-se o efeito da citotoxicidade da DOX na viabilidade e na proliferação celulares

das células parentais MNNG/HOS e das CSCs, utilizando o método colorimétrico de MTT e de

incorporação com BrdU, respectivamente. Para tal, ambas as populações celulares foram

incubadas durante um período de 48h com diferentes concentrações de DOX (0-100 µM), que é

o fármaco principal utilizado no tratamento do OS.

As curvas de dose-resposta obtidas após exposição das células MNNG/HOS e das CSCs à

DOX foram ajustadas a uma função sigmoidal para se calcular o valor do IC50, que corresponde à

concentração de fármaco que inibe a viabilidade/proliferação celular em 50% e estão

representadas nas Figuras 3.6 e 3.7, respectivamente. Os respectivos valores de IC50 estão

descritos na Tabela 2.

O tratamento com DOX induziu uma diminuição na viabilidade celular, dependente da

dose, tanto nas células MNNG/HOS como nas CSCs. No entanto, esse efeito foi menos

acentuado para as CSCs do que para as MNNG/HOS, como demonstrado pela curva de dose-

resposta que está mais deslocada para a direita (Figura 3.2) e pelo gráfico de barras apresentado

na Figura 3.3. Para concentrações de DOX superiores a 0,5 µM, a percentagem de CSCs viáveis é

significativamente superior (p<0,05) à percentagem de células parentais MNNG/HOS. O valor

médio de IC50 obtido, após o ajuste exponencial das curvas de dose-resposta, para as CSCs foi de

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3. Resultados

27

2,21 ± 0,50 µM, significativamente superior (p<0,001), cerca de 3 vezes, ao valor calculado para

as células parentais MNNG/HOS que foi de 0,67 ± 0,17 µM (Tabela 2), o que demonstra que as

CSCs são mais resistentes à DOX do que as células parentais MNNG/HOS.

0

50

100

150

MNNG/HOS

CSC

CTR 50 M0,5 M0,25 M 5 M1 M

**

*

*Via

bili

dad

e C

elu

lar

(%)

O efeito da DOX na proliferação das células MNNG/HOS e das CSCs está ilustrado na

Figura 3.4. À semelhança dos resultados obtidos com o teste de MTT, observou-se uma

diminuição da proliferação celular com o aumento da concentração da DOX em ambas as

populações celulares. No entanto, essa diminuição foi mais acentuada para as CSCs do que para

Via

bili

dad

e C

elu

lar

(%)

Log [DOX, µM]

Figura 3.2 Efeito da DOX na viabilidade das células MNNG/HOS e das CSCs. Os valores correspondem à média

± desvio-padrão (SD) de 5 experiências independentes realizadas em triplicado.

Figura 3.3 Percentagens de células viáveis após exposição das células MNNG/HOS e das CSCs a diferentes concentrações de DOX (0-100 µM). Os resultados foram apresentados como média ± desvio-padrão (SD) de 5 ensaios independentes (n=5) realizados em triplicado. *p<0,05 quando comparadas com as células MNNG/HOS expostas à mesma concentração de DOX

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3. Resultados

28

as células parentais MNNG/HOS, contrariamente ao observado com o ensaio de MTT, como

evidenciado pela curva de dose-resposta das CSCs que neste caso está mais deslocada para a

esquerda.

De facto, a exposição a 0,1 µM de DOX resultou numa diminuição de aproximadamente

80% da taxa de proliferação celular das CSCs em relação à situação de controlo, enquanto que

nas células MNNG/HOS essa diminuição foi de apenas 20% (Figura 3.5).

0

50

100

150

**

* *

MNNG/HOS

CSC

CTR 0,1 M0,01 M 1 M0,5 M

Pro

lifer

ação

Ce

lula

r (%

)

Pro

lifer

ação

Cel

ula

r (%

)

Log [DOX, µM]

Figura 3.4 Efeito da DOX na proliferação das células MNNG/HOS e das CSCs. Os valores correspondem à média

± desvio-padrão (SD) de 5 experiências independentes realizadas em triplicado no caso das células parentais

MNNG/HOS, e de 3 experiências independentes realizadas em triplicado no caso das CSCs.

Figura 3.5 Percentagens de células MNNG/HOS e de CSCs em proliferação após exposição a diferentes concentrações de DOX (0-100 µM). Os resultados foram expressos como média ± desvio-padrão (SD) de 5 ensaios independentes (n=5) realizados em triplicado no caso das MNNG/HOS e 3 ensaios independentes (n=3) realizados em triplicado no caso das CSCs. *p<0,05, **p<0,001 quando comparadas com as MNNG/HOS expostas à mesma concentração de DOX

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3. Resultados

29

O valor médio do IC50 obtido através do ensaio de incorporação com BrdU para as CSCs

foi de 0,03 ± 0,01 µM, significativamente inferior (p<0,001), aproximadamente 6 vezes, ao

calculado para as células MNNG/HOS, que foi de 0,19 ± 0,06 µM (Tabela 2), o que sugere que

para concentrações não tóxicas (0,03 ± 0,01 µM), a DOX reduz de forma significativa a taxa de

proliferação das CSCs, mas não das células parentais MNNG/HOS.

Tabela 2. Valores de IC50 obtidos através dos ensaios de MTT e de incorporação com BrdU, após exposição das células

parentais MNNG/HOS e das CSCs a diferentes concentrações de DOX.

**p<0,001 quando comparadas com as células parentais MNNG/HOS.

Abreviaturas: IC50, concentração de fármaco que inibe a viabilidade/proliferação celular em 50%; DOX, doxorrubicina.

As células foram incubadas com concentrações crescentes de DOX (0-100µM) durante 48h. A citotoxicidade da DOX

na viabilidade e proliferação celulares foi avaliada utilizando o método colorimétrico de MTT e de incorporação com

BrdU, respectivamente. Os valores do IC50 foram obtidos a partir do ajuste das curvas dose-resposta a uma função do

tipo sigmoidal. Os resultados foram expressos como média ± desvio-padrão (SD) do número indicado de experiências

realizadas em triplicado.

3.2.2 Detecção da apoptose

A morte celular programada por apoptose foi medida pelo ensaio de TUNEL que permite

identificar, por microscopia de fluorescência, as células que estão em apoptose, baseado na

marcação fluorescente de fragmentos de DNA obtidos especificamente pela acção de

endonucleases que são activadas durante o processo de apoptose. Este ensaio foi realizado nas

duas populações celulares MNNG/HOS e CSCs após exposição a diferentes concentrações de

DOX (1 µM, 2 µM, 5 µM, 10 µM e 25 µM) durante um período de 48h. Os resultados revelaram

diferenças significativas entre as células parentais MNNG/HOS e as CSCs, à excepção da situação

em que foram expostas a 1 µM de DOX, onde a percentagem de células mortas foi equivalente

nas duas populações celulares ( 1%). Para as restantes concentrações de DOX, a percentagem

de células em apoptose foi significativamente superior (p<0,05) nas células parentais

MNNG/HOS em relação aos valores observados para as CSCs, como evidenciado nas Figuras 3.7

e 3.8. A partir dos 2 µM e até aos 25 µM, a análise microscópica revelou um aumento

IC50 (µM)

DOX MNNG/HOS CSC

MTT 0,67 ± 0,17 (n=5) 2,21 ± 0,50** (n=5)

BrdU 0,19 ± 0,06 (n=5) 0,03 ± 0,01** (n=3)

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3. Resultados

30

progressivo na percentagem de células parentais em apoptose como indicado pelo crescente

número de núcleos fluorescentes visualizados na Figura 3.6 A. A percentagem média de células

mortas aumentou para aproximadamente 9% após exposição a 2 µM de DOX, chegando a atingir

os 21% para uma concentração de DOX de 25 µM (Tabela 3).

No caso das CSCs, a percentagem de células mortas foi significativamente inferior

(p<0,05) ao observado nas células parentais, no intervalo de concentrações de DOX testadas, à

excepção da concentração de 1 µM, nunca chegando a ultrapassar os 3% mesmo para uma

concentração de 25 µM de DOX (Figura 3.7). De realçar que para esta concentração a

percentagem de CSCs em apoptose foi de apenas 1,5%, cerca de 14 vezes inferior à percentagem

observada nas células parentais MNNG/HOS que foi de 21%. Estes resultados sugerem que as

CSCs possuem mecanismos que as tornam mais resistentes à indução de morte por apoptose do

que as células parentais a partir das quais foram derivadas.

Controlo 1 µM

2 µM 5 µM

10 µM 25 µM

Controlo 1 µM

2 µM 5 µM

10 µM 25 µM

1. 2.

3. 4.

5. 6.

1. 2.

3. 4.

5. 6.

MNNG/HOS CSC A. B.

Figura 3.6 Imagens de fluorescência representativas de células MNNG/HOS (A) e de CSCs (B) em apoptose

pelo ensaio de TUNEL após incubação com diferentes concentrações de DOX durante 48h: 0 µM (1.), 1 µM

(2.), 2 µM (3.), 5 µM (4.), 10 µM (5.) e 25 µM (6.).

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3. Resultados

31

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

* ** *

MNNG/HOS

CSC

2 M1 M 10 M5 M 25 M

% d

e cé

lula

s m

ort

as

Tabela 3. Percentagem de células em apoptose (MNNG/HOS vs. CSCs) após exposição a diferentes concentrações de

DOX durante 48h.

3.3 Expressão de proteínas pró- e anti-apoptóticas

Na tentativa de explicar os resultados apresentados na secção anterior, nomeadamente

a maior resistência das CSCs à morte celular por apoptose após exposição à DOX, analisámos os

níveis de expressão de alguns membros da família Bcl-2 com participação activa na regulação da

apoptose. Avaliámos a expressão de proteínas anti-apoptóticas (Bcl-2 e Bcl-XL) e pró-apoptóticas

(Bax e Bak) por Western blot nas células parentais MNNG/HOS e nas CSCs, às 6h, 24h, e 48h após

incubação com 0,7 µM de DOX, que corresponde à concentração de DOX que reduz a viabilidade

celular das células parentais em 50%. A expressão das proteínas depois de normalizadas pela

expressão da β-actina foi apresentada em relação aos níveis de expressão obtidos nas

respectivas amostras de controlo que não foram expostas à DOX.

Células em apoptose (%)

Concentração de DOX (µM) MNNG/HOS CSC

1 µM 1,21 ± 0,15 1,25 ± 0,07

2 µM 8,61 ± 0,76 2,76 ± 0,79

5 µM 9,70 ± 0,45 3,01 ± 0,97

10 µM 14,7 ± 0,55 1,48 ± 0,12

25 µM 20,9 ± 1,09 1,72 ± 0,12

Figura 3.7 Percentagem de células em apoptose (MNNG/HOS vs. CSCs) após exposição a diferentes concentrações de DOX durante 48h. Os resultados foram apresentados como média ± desvio-padrão (SD). *p<0,05 quando comparadas com as células MNNG/HOS expostas à mesma concentração de DOX

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3. Resultados

32

Os nossos resultados mostraram alterações nos níveis de expressão da proteína pró-

apoptótica Bak nas duas amostras celulares, embora discordantes. Enquanto que nas células

parentais MNNG/HOS se observou um aumento significativo (p<0,05) nos níveis de expressão da

Bak em relação à situação de controlo para as 24h e 48h de exposição à DOX, nas CSCs verificou-

se uma diminuição significativa (p<0,05) nos níveis de expressão desta mesma proteína para os

mesmos períodos de exposição, com indicado na Figura 3.8 A.

Em relação à Bax não foram observadas alterações significativas nos níveis de expressão

desta proteína para nenhum dos períodos de exposição à DOX em relação à situação de

controlo, quer para as células MNNG/HOS como para as CSCs (Figura 3.8 B).

Bak

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5*

0,7 M

**

*

CTR 48h24h6h

Exp

ress

ão r

elat

iva

da

Bak

Bax

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Exp

ress

ão r

elat

iva

da

Bax

0,7 M

CTR 48h24h6h

CSC

Bak

β-Actina

30 kDa

43 kDa

CTR 24h 48h 6h

CSC

Bax

β-Actina

23 kDa

43 kDa

CTR 24h 48h 6h

A.

.

B.

Bak

β-Actina

MNNG/HOS

30 kDa

43 kDa

CTR 24h 48h

6h

Bax

β-Actina

MNNG/HOS

23 kDa

43 kDa

CTR 24h 48h 6h

Figura 3.8 Imagens representativas da expressão das proteínas Bak (A) e Bax (B) por Western blot e dos correspondentes níveis de expressão apresentados em relação à situação de controlo, após normalização para a β-actina. As células foram expostas a uma concentração de 0,7µM de DOX. A expressão das proteínas foi analisada às 6h, 24h e 48h após incubação. Os resultados foram apresentados como média ± erro-padrão na média (SEM) de três experiências independentes (n=3). *p<0,05 em relação aos respectivos controlos

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3. Resultados

33

Os resultados da análise da expressão das proteínas anti-apoptóticas Bcl-XL e Bcl-2, estão

representados na Figura 3.9. Os níveis de expressão da Bcl-XL aumentaram de forma significativa

(p<0,05) nas CSCs às 24h e 48h de exposição com DOX em relação à situação de controlo,

enquanto nas células parentais MNNG/HOS se observou uma diminuição (p<0,05) na expressão

desta proteína, que apenas foi significativa para as 48h (Figura 3.9 A).

Resultados semelhantes foram observados em relação à expressão da Bcl-2. Os níveis de

expressão desta proteína anti-apoptótica aumentaram de forma significativa (p<0,05) nas CSCs

às 24h e às 48h. Contrariamente, nas células MNNG/HOS observou-se uma diminuição

significativa nos níveis de expressão desta proteína (p<0,05) para os mesmos períodos de

incubação com DOX (Figura 3.9 B).

Bcl-XL

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

*

0,7 M

CTR 48h24h6h

**

Exp

ress

ão r

elat

iva

da

Bcl

-XL

Bcl-2

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

**

0,7 M

CTR 48h24h6h

*

*

Exp

ress

ão r

elat

iva

da

Bcl

-2

Bcl-XL

β Actina

MNNG/HOS

30 kDa

43 kDa

CTR 6h 24h 48h

Bcl-XL

β Actina

CSC

CTR 6h 24h 48h

30 kDa

43 kDa

Bcl-2

β Actina

MNNG/HOS

26 kDa

43 kDa

CTR 6h 24h 48h

CSC

Bcl-2

β Actina

26 kDa

43 kDa

CTR 6h 24h 48h

A. B.

Figura 3.9 Imagens representativas da expressão das proteínas Bcl-XL (A) e Bcl-2 (B) por Western blot e dos correspondentes níveis de expressão apresentados em relação à situação de controlo, após normalização para a β-actina. As células foram expostas a uma concentração de 0,7µM de DOX. A expressão das proteínas foi analisada às 6h, 24h e 48h após incubação. Os resultados foram apresentados como média ± erro-padrão na média (SEM) de três experiências independentes (n=3). *p<0,05 em relação aos respectivos controlos

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3. Resultados

34

3.3.1 Análise da razão entre as proteínas anti- e pró-apoptóticas

Uma vez que a razão entre os níveis de expressão das proteínas anti- e pró-apoptóticas

determina a resposta a um sinal de morte celular, sendo considerado um indicador da

susceptibilidade celular a um estímulo apoptótico (104), determinámos a razão entre os níveis

de expressão relativos das proteínas anti- e das pró-apoptóticas tanto para as células parentais

MNNG/HOS como para as CSCs após 48h de incubação com DOX. Uma vez que esta razão

determina a sobrevivência versus morte celular, um aumento desta indica uma menor

susceptibilidade para a morte celular por apoptose. Os resultados mostraram que a razão entre

a expressão anti-/pró-apóptoticas é significativamente superior (p<0,05) nas CSCs quando

comparada com as células parentais. No entanto, essa diferença é maior quando se considera a

razão entre as duas proteínas anti-apóptoticas Bcl-2 ou Bcl-XL e a pró-apoptótica Bak (Figura 3.10

A e B), pois a razão é cerca de 11 vezes maior nas CSCs do que nas células MNNG/HOS, do que

quando se considera a razão entre as duas proteínas anti-apoptóticas e a pró-apoptótica Bax

(Figura 3.10 C e D), que foi cerca de 3 vezes superior nas CSCs, o que sugere que a maior

resistência exibida pelas CSCs é resultante de um aumento significativo (p<0,05) da proteína Bcl-

2 ou da Bcl-XL acompanhado de uma diminuição significativa (p<0,05) da proteína pró-

apoptótica Bak.

A. B.

C. D.

Figura 3.10 Representação gráfica da razão entre os níveis de expressão das proteínas anti- e pró-apoptóticas às 48h de incubação com DOX. A. Razão entre a Bcl-2 e a Bak. B. Razão entre a Bcl-XL e a Bak. C. Razão entre a Bcl-2 e a Bax. D. Razão entre a Bcl-XL e a Bax. Os valores estão apresentados como média ± desvio-padrão (SD) de três experiências independentes (n=3). p<0,05 quando comparadas com as células MNNG/HOS

Bcl-2/Bak

MNNG/HOS CSC0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

*

Bcl-XL/Bak

MNNG/HOS CSC0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

*

Bcl-2/Bax

MNNG/HOS CSC0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

*

Bcl-XL/Bax

MNNG/HOS CSC0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

*

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3. Resultados

35

3.4 Expressão da caspase-3

Além da expressão das proteínas pró- e anti-apoptóticas analisámos também os níveis

de expressão da caspase-3 activa que é a principal caspase executora da apoptose. Esta enzima é

activada na fase final do processo apoptótico e a responsável pelos eventos proteolíticos

associados à morte celular por apoptose. A caspase-3 activa corresponde ao fragmento 17 kDa

resultante da clivagem da pró-caspase 3 pela caspase-9 activa (105).

Os resultados de Western blot nas CSCs mostraram uma diminuição significativa (p<0,05)

nos níveis de expressão da caspase-3 às 48h após tratamento com DOX em relação à situação de

controlo (Figura 3.11). Já nas células parentais MNNG/HOS observou-se um aumento

significativo (p<0,05) nos níveis de expressão desta proteína para o mesmo período de

incubação (Figura 3.11).

Caspase-3

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

*

0,7 M

CTR 48h24h6h

*

Exp

ress

ão r

elat

iva

da

Cas

pas

e-3

CSC

43 kDa

17 kDa Caspase 3

β Actina

CTR 6h 24h 48h

17 kDa

MNNG/HOS

43 kDa

Caspase 3

β Actina

CTR 6h 24h 48h

Figura 3.11 Imagens representativas da expressão da proteína caspase-3 por Western blot e dos correspondentes níveis de expressão apresentados em relação à situação de controlo, após normalização para a β-actina. As células foram expostas a uma concentração de 0,7 µM de DOX. A expressão da proteína foi analisada às 6h, 24h e 48h após incubação. Os resultados foram apresentados como média ± erro-padrão na média (SEM) de três experiências independentes (n=3). *p<0,05 em relação aos respectivos controlos

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37

4. Discussão

Este trabalho teve como principal objectivo explorar o papel da via intrínseca da

apoptose na resistência evidenciada pelas CSCs isoladas de uma linha celular humana de OS

(MNNG/HOS) ao tratamento com DOX. Estudos anteriores mostraram a existência de CSCs nesta

mesma linha celular utilizando o método de formação de esferas. Essas células apresentaram

características de células estaminais, incluindo a sobre-expressão de marcadores de

pluripotência Oct-4 e Nanog e a capacidade de diferenciação em linhagens mesenquimais

(osteoblástica, condroblástica e adipogénica) quando cultivadas em condições apropriadas (29).

Além disso, revelaram ser mais resistentes às terapias convencionais, quimioterapia e radiação

ionizante, do que as células parentais das quais foram derivadas. Estes resultados estão de

acordo com a teoria das CSCs que defende que os tumores contêm uma subpopulação de células

com características de células estaminais, e que são elas as células iniciadoras deste tumor e as

responsáveis pelo desenvolvimento de resistência à terapia e ao aparecimento de recidivas. Esta

constatação, frequentemente observada noutros tumores tanto sólidos como hematológicos,

tem vindo a alterar o paradigma sobre a origem do cancro e sugere a necessidade de

desenvolver novas abordagens terapêuticas que tenham em conta a existência das CSCs. Nesse

sentido um conhecimento mais aprofundado sobre estas células, em particular sobre os

mecanismos que elas têm em desenvolver resistência à terapia é de extrema importância para o

desenvolvimento e planeamento de novos regimes terapêuticos.

Depois da cirurgia, a quimioterapia é a principal abordagem terapêutica utilizada no

tratamento do OS, dependendo o sucesso dos tratamentos da resposta tumoral aos fármacos

utilizados. A DOX, um potente agente citotóxico, é um dos principais agentes de quimioterapia

utilizado no tratamento do OS, sendo o seu principal efeito anti-tumoral a indução da morte

celular por apoptose. Estudos anteriores mostraram que as CSCs no OS possuem mecanismos

que lhes conferem vantagens de sobrevivência sobre as células parentais mais diferenciadas,

permitindo-lhes evadir os efeitos citotóxicos da DOX (29, 106). No seguimento deste trabalho,

propusemo-nos investigar a expressão das proteínas envolvidas na via apoptótica intrínseca nas

CSCs e a sua relação com a menor sensibilidade dessas células aos efeitos citotóxicos da DOX.

Com esse objectivo começámos por isolar as CSCs a partir da linha celular humana de OS

MNNG/HOS, utilizando o método de formação de esferas e analisar a sua sensibilidade à DOX. A

citotoxicidade da DOX tanto nas CSCs como nas células parentais foi avaliado considerando os

seus efeitos sobre a viabilidade e proliferação celulares e indução da apoptose.

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4. Discussão

38

Como já demonstrado por Martins-Neves et al. (29), a cultura das células MNNG/HOS

em condições de baixa aderência, com privação de soro e na presença de factores de

crescimento, permitiu fazer o isolamento das CSCs sob a forma de colónias esféricas

(sarcosferas). Nestas condições de cultura, apenas células com propriedades de células

estaminais têm a capacidade de proliferar e de se auto-renovarem enquanto que células mais

diferenciadas são incapazes de proliferar, acabando por morrer. Esta capacidade de formação de

esferas foi observada durante pelo menos 6 gerações consecutivas, o que demonstra a sua

capacidade de auto-renovação que é uma propriedade fundamental das células estaminais.

Além disso, quando transferidas para superfícies aderentes e cultivadas em meio de cultura

contendo soro, as células começaram a expandir em monocamada e a adquirir uma morfologia

semelhante à das células parentais, o que mostra a sua capacidade de diferenciação que é outra

característica de células indiferenciadas.

A citotoxicidade da DOX nas células parentais MNNG/HOS e nas CSCs foi avaliada

considerando o seu efeito na viabilidade celular, na proliferação celular e na indução da

apoptose. A viabilidade celular, que é um dos parâmetros mais usados na avaliação da

citotoxicidade, foi avaliada utilizando o método colorimétrico de MTT que dá indicação da

quantidade de células viáveis com base na actividade da enzima mitocondrial succinato

desidrogenase que apenas está activa em células metabolicamente activas com cadeia

respiratória intacta. Os resultados apresentados na Figura 3.2 mostraram que as CSCs são mais

resistentes à DOX do que as células parentais MNNG/HOS. A concentração de fármaco

necessária para inibir a viabilidade celular em 50% nas CSCs (IC50= 2,21 ± 0,50 µM) foi cerca de 3

vezes superior ao valor observado nas células MNNG/HOS (IC50= 0,67 ± 0,17 µM) (Tabela 2). A

DOX é substrato de transporte da BCRP e da Pgp, dois transportadores membranares

pertencentes à superfamília ABC, que estão sobre-expressos em células estaminais como

mecanismo de defesa contra exposição a citotóxicos (107).Estas proteínas conferem um

fenótipo de resistência a múltiplos fármacos, devido à sua capacidade de diminuir a acumulação

intracelular de agentes de quimioterapia. A sobre-expressão da Pgp e de BCRP está também

associada ao fraco prognóstico e à resistência à terapia evidenciada por vários tipos de cancro,

entre os quais o OS (108). A sobre-expressão destas proteínas já foi comprovada em CSCs de OS

por Martins-Neves et al. (29), o que sugere a sua participação activa no desenvolvimento de

resistência das CSCs à DOX. Além disso, a co-administração de verapamil, um inibidor da

actividade funcional destas proteínas, reverteu a resistência das CSCs à DOX, o que reforça a

hipótese destes transportadores fazerem a extrusão da DOX prevenindo a sua acumulação

intracelular em concentrações tóxicas capazes de induzir apoptose (29).

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4. Discussão

39

Os resultados da análise da citotoxicidade da DOX sobre a proliferação celular, utilizando

o ensaio de incorporação com BrdU, foram contraditórios. Neste caso, a DOX diminuiu a

proliferação celular das CSCs a uma baixa concentração (IC50=0,03±0,01µM), e significativamente

inferior, cerca de 6 vezes, à observada nas células parentais MNNG/HOS (IC50=0,19 ± 0,06 µM). O

facto de se ter observado uma redução na taxa de proliferação das CSCs, para uma concentração

não tóxica de DOX (0,03 ± 0,01 µM) para a qual não foram observadas alterações na viabilidade

celular de acordo com o ensaio de MTT, sugere que as CSCs interrompem o processo de divisão

celular ao serem expostas à DOX, entrando num estado de quiescência que as protege da DOX,

que se sabe ser tóxica para células em proliferação. Desta forma, as CSCs podem re-entrar no

ciclo celular e iniciar o seu processo de divisão celular assim que encontrarem as condições

ideais. Esta capacidade de entrarem num estado quiescente ou de baixa actividade proliferativa

é considerada um mecanismo de defesa intrínseco de células mais indiferenciadas, que assim

ficam protegidas dos efeitos dos agentes de quimioterapia que afectam essencialmente células

em rápida divisão celular, induzindo a morte celular (109).

Os resultados obtidos com o ensaio de TUNEL, para avaliação do processo de morte

celular por apoptose, reforçam esta hipótese. A percentagem de células MNNG/HOS em

apoptose após a exposição à DOX foi significativamente superior ao valor observado nas CSCs

(Tabela 3), o que revela claramente que as CSCs possuem mecanismos eficazes que lhes

conferem a capacidade de resistir aos efeitos citotóxicos mediados pela DOX. Nas CSCs a

percentagem de células em apoptose não ultrapassou os 1,5% para a concentração máxima de

DOX testada (25 µM), enquanto na população parental MNNG/HOS, a percentagem de células

em apoptose para essa mesma concentração foi de 21%.

O facto da DOX praticamente não induzir a apoptose nas CSCs sugere que possa haver

uma desregulação no mecanismo de activação da apoptose nestas células, neste caso em

particular na via intrínseca ou mitocondrial, uma vez que é a via de activação da apoptose

induzida pela DOX. Esta via envolve a activação das proteínas pró-apoptóticas que inclui a Bak e

Bax e a inactivação dos membros anti-apoptóticos Bcl-2 e Bcl-XL, que culmina na activação das

caspases efectoras como a caspase-3, levando à morte celular. A activação desta via é altamente

dependente do balanço entre os membros pró- e os anti-apoptóticos, sendo que os primeiros

tendem a destabilizar a membrana externa da mitocôndria com consequente libertação de

mediadores apoptóticos (tais como o citocromo c) que irão activar as caspases, enquanto os

segundos tendem a prevenir este efeito mantendo intacta a permeabilidade mitocondrial. Os

nossos resultados revelaram haver um desequilíbrio na regulação da expressão dessas proteínas

nas CSCs às 24h e 48h após exposição à DOX.

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4. Discussão

40

Os níveis de expressão da proteína pró-apoptótica Bak diminuíram de forma significativa

(p<0,05) nas CSCs em relação à situação de controlo, enquanto nas células parentais MNNG/HOS

se observou um aumento significativo (p<0,05) na expressão dessa mesma proteína (Figura 3.8

A). A Bak é uma proteína pró-apoptótica com um papel importante na via mitocondrial da

apoptose, e que é estimulada pela acção de agentes de quimioterapia. Dada a sua importância

na indução da apoptose, os níveis de expressão desta proteína aumentam nas células de tecidos

normais quando estas são sujeitas a estímulos nocivos. Nas células cancerígenas esta situação

nem sempre se verifica. Há estudos que mostram que as células tumorais apresentam níveis de

expressão diminuídos desta proteína pró-apoptótica, como é o caso de células cancerígenas de

adenocarcinomas colo-rectais (110) e gástricos (111), comparativamente aos níveis encontrados

no tecido normal, o que sugere que esta proteína desempenha um papel importante nas fases

iniciais da progressão destes tumores. Além disso, também já foram encontradas mutações na

Bak nestes tipos de cancro (112), o que sugere que perturbações na apoptose mediada pela Bak

possam contribuir para a patogénese deste tipo de tumores e contribuir para a maior resistência

aos agentes de quimioterapia (113).

Os níveis de expressão da outra proteína pró-apoptótica Bax não sofreram alterações

significativas após exposição à DOX nem nas CSCs nem nas células parentais MNNG/HOS (Figura

3.8 B), o que sugere que esta proteína não é recrutada/activada pela exposição à DOX nesta

linhagem celular. Apesar de ser uma proteína relevante na indução da apoptose uma vez que

juntamente com a Bak forma poros homo- ou hetero-oligoméricos na membrana mitocondrial,

que permitem a libertação do citocromoc e consequente activação da cascata proteolítica, não é

condição obrigatória que esteja activada para que a apoptose prossiga. Há estudos que sugerem

que a sua função pode ser parcialmente substituída pela Bak, e que é necessário que haja uma

deficiência na expressão das duas proteínas pró-apoptóticas para que as células se tornem

completamente resistentes à apoptose induzida pela DOX (114). Além disso, a expressão desta

proteína pode ainda, em certas circunstâncias, ser essencial para a sobrevivência celular (110),

daí que a manutenção dos seus níveis de expressão possam ser cruciais mesmo nas CSCs para a

manutenção da homeostasia. Na literatura encontramos casos em que os níveis de expressão

desta proteína se mantêm relativamente constantes em adenocarcinomas colo-rectais (110) e

gástricos (111), comparativamente ao tecido normal.

Os nossos resultados também mostraram diferenças significativas na expressão das

proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 e Bcl-XL entre as CSCs e as MNNG/HOS após exposição à DOX

(Figura 3.9 A e B). O aumento significativo (p<0,05) da expressão das proteínas anti-apoptóticas

Bcl-2 e Bcl-XL observado nas CSCs explicam a sua menor susceptibilidade à apoptose em

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4. Discussão

41

comparação com as células parentais MNNG/HOS, nas quais se verificou um decréscimo na

expressão tanto da Bcl-2 como da Bcl-XL.

A Bcl-XL é capaz de inibir a libertação do citocromo c, impedindo desta forma a activação

do complexo APAF-1 e a consequente activação da cascata das caspases, inibindo a apoptose em

condições de stresse celular. Vários estudos na literatura indicam que asobre-expressão da Bcl-

XLem células tumorais as tornam menos susceptíveis à acção de agentes de quimioterapia que

induzem a morte celular pela via apoptótica (115). De facto, a Bcl-XL encontra-se sobre-expressa

em cancros da próstata (116) e da mama (117), em carcinomas hepatocelulares (115), e em

adenocarcinomas colo-rectais (110), o que promove a resistência à quimioterapia

frequentemente observada nestes tumores. Ainda no estudo realizado nos adenocarcinomas

colo-rectais (110), os autores mostraram que expressão da Bcl-XL está mais aumentada nos

adenocarcinomas mais indiferenciados, o que sugere que as alterações na expressão desta

proteína são desencadeadas durante fases iniciais do desenvolvimento destes tumores.

Os nossos resultados estão de acordo com estudos prévios que mostram igualmente um

aumento na expressão das proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 ou Bcl-XL em CSCs isoladas de

diferentes tumores que apresentam um fenótipo de resistência à quimioterapia ou radioterapia.

Konopleva et al. (118) num estudo realizado em amostras de LMA observaram um aumento na

expressão das duas proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 e Bcl-XL em células CD34+ em estado

quiescente versus células proliferativas e sugerem o seu envolvimento no desenvolvimento da

quimioresistência e na regulação do ciclo celular. Num outro estudo, Wang et al. (119)

demonstraram que as CSCs isoladas de cancro de mama expressam níveis mais elevados de Bcl-

XL, e que por isso se apresentam mais resistentes a vários agentes de quimioterapia e à radiação.

Resultados semelhantes foram observados em CSCs CD133+ isoladas de glioblastoma (88).

Também nesta patologia, os autores verificaram que as CSCs eram mais resistentes a vários

agentes de quimioterapia e apresentavam níveis de expressão aumentados da Bcl-XLe da Bcl-2

comparativamente aos níveis de expressão encontrados nas células CD133- (88).

Há evidências de que as várias proteínas pró- e anti-apoptóticas se ligam entre si por

homo- ou heterodimerização, regulando a sua actividade mutuamente (110). Por exemplo, a

acção anti-apoptótica da Bcl-2 pode ocorrer por interacção com a Bax, sequestrando-a na

mitocôndria, induzindo-lhe alterações conformacionais ou competindo por locais que seriam

ocupados pela Bax na mitocôndria, impedindo-a de exercer o seu efeito pró-apoptótico. Assim,

as proporções relativas de proteínas anti-apoptóticas e pró-apoptóticas da família Bcl-2

determinam a sensibilidade das células aos diferentes estímulos que podem levar à morte

celular por apoptose (110). Num estudo realizado envolvendo 256 doentes com LMA, os autores

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4. Discussão

42

concluíram que um valor elevado para a razão Bcl-2/Bax é considerado um factor de mau

prognóstico (120).

Os nossos resultados mostraram que a razão entre as proteínas anti-apoptóticas Bcl-2

ou Bcl-XL, e a proteína pró-apoptótica Bak, está aumentada nas CSCs (cerca de 11 vezes)

comparativamente às células parentais MNNG/HOS, para o período de 48h de incubação com

0,7µM de DOX (Figura 3.10A e B). Este resultado é explicado pelo facto de nas CSCs o aumento

na expressão das proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 ou Bcl-XLter sido acompanhado de uma

diminuição na expressão da proteína pró-apoptótica Bak.

O aumento da razão entre as proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 e Bcl-XL e a proteína pró-

apoptótica Bax, nas CSCs comparativamente às MNNG/HOS, apesar de significativo, não foi tão

pronunciado (Figura 3.10 C e D), uma vez que não foram observadas alterações significativas nos

níveis de expressão da Bax após o tratamento com a DOX.

Nas CSCs, em adição à desregulação na expressão das proteínas reguladoras da

apoptose foi observada uma diminuição nos níveis de expressão da caspase-3 (Figura 3.11) que

corresponde ao fragmento de 17 kDa resultante da clivagem da pró-caspase 3 que na sua forma

inactiva tem um peso molecular de 32 kDa. Sendo a caspase-3 a principal caspase efectora da

apoptose, uma diminuição na sua expressão/actividade é indicador de resistência à apoptose, o

que é demonstrado pelos nossos resultados do ensaio de TUNEL, que mostram que apenas um

pequeno número de CSCs entra em apoptose mesmo para exposição a concentrações elevadas

de DOX. Já no caso das células parentais MNNG/HOS, em que foi observado um aumento na

expressão da caspase-3 após as 48h de exposição à DOX (Figura 3.11), observou-se um aumento

progressivo na percentagem de células em apoptose com o aumento da concentração da DOX.

Estes resultados mostraram que as CSCs são mais resistente do que células MNNG/HOS à

indução da apoptose pela DOX, e que essa resistência está associada a uma desregulação nas

vias de sinalização anti- e pró-apoptóticas.

Na literatura já foi observada a activação das vias de sinalização MAPK/ERK e PI3K/Akt

em vários tipos de cancro humanos, e que estas desempenham um papel importante na

resistência às terapias anti-cancro, o que pode ser explicado pela importância destas vias de

sinalização no controlo da apoptose e nos mecanismos de resistência evidenciados pelas células

tumorais (121, 122). De facto, Dreesen et al. (123) propuseram que ambas as vias de sinalização

estão constitutivamente activadas e/ou sobre-expressas em células de vários tipos de cancro. Os

autores associaram a desregulação destas vias à actividade de hiperproliferação demonstrada

por inúmeros tipos de cancro, entre os quais, cancro do cólon e do pâncreas, e com a

manutenção do estado indiferenciado pelas células estaminais embrionárias. No nosso

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4. Discussão

43

laboratório já foram efectuados estudos que nos mostraram que as vias de sinalização

MAPK/ERK e PI3K/Akt se encontram significativamente aumentadas nas CSCs após exposição à

DOX, uma vez que se verificou um aumento dos níveis de expressão da pERK e da pAkt nas CSCs

para concentrações reduzidas deste fármaco (cerca de 0,25 µM), enquanto que nas células

parentais MNNG/HOS o aumento dos níveis de expressão da pERK e da pAkt se verificaram para

concentrações mais elevadas de DOX (concentrações mais próximas de 0,58 µM), o que nos

indica que as CSCs activam estas vias mais precocemente do que as células parentais

MNNG/HOS, o que lhes confere vantagens de sobrevivência face aos agentes de quimioterapia

que induzem a apoptose (106).

Já foi evidenciado na literatura que certas quinases envolvidas nas vias de sobrevivência,

tais como a Akt, são capazes de fosforilar e inactivar proteínas pró-apoptóticas da família Bcl-2

(124, 125), bloqueando desta forma a morte celular por apoptose. Além disso, a inibição da via

MAPK/ERK pode levar à morte celular e à diferenciação celular (126). Lee et al. (127) mostraram

que essa inibição pode estar relacionada com a diminuição da actividade da ERK1/2 e dos níveis

da proteína Bcl-2 em células cancerígenas. Outro estudo demonstrou ainda que a forma activa

da caspase-3 (proteína executora da apoptose) se encontra sobre-expressa em células de

hepatocarcinoma após a inibição da via de sinalização da ERK (128), o que nos indica que a

inibição desta via de sobrevivência leva à indução da apoptose nas células deste tipo de cancro.

Em conjunto, estes estudos sugerem que as CSCs podem activar as vias de sinalização

PI3K/Akt e MAPK/ERK em resposta ao tratamento com DOX ou outro agente antineoplásico, e

que estas por sua vez vão fosforilar proteínas pró-apoptóticas e comprometer a regulação do

processo apoptótico.

A evasão da apoptose apresenta-se assim como um dos mecanismos pelo qual as CSCs

conseguem evadir os efeitos citotóxicos da DOX e resistir à terapia, o que sugere a necessidade

de desenvolver novas estratégias terapêuticas direccionadas às CSCs capazes reverter a

resistência à apoptose. A sobreexpressão dos níveis de expressão das proteínas anti-apoptóticas

Bcl-2 e Bcl-XL e a diminuição da proteína pró-apóptotica Bak induzidas pela DOX mostram

claramente que há uma desregulação na via intrínseca ou mitocondrial da apoptose nas CSCs. A

administração de inibidores de proteínas anti-apoptóticas, bem como de fármacos que

promovam a actividade das caspases e das proteínas pró-apoptóticas tornam-se numa potencial

estratégia terapêutica no combate à resistência das CSCs e por conseguinte numa melhoria da

taxa de sobrevida dos doentes com OS.

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5. Conclusão

Este trabalho teve como principal objectivo explorar o papel da via mitocondrial ou

intrínseca da apoptose na resistência de CSCs de OS aos efeitos citotóxicos da DOX.

Os resultados obtidos permitiram-nos concluir que o OS contém uma subpopulação de

células tumorais com características de células estaminais (CSCs) que podem ser isoladas pelo

método de formação de esferas.

Os estudos de citotoxicidade mostraram que essa subpopulação celular é mais resistente

á apoptose induzida pela DOX do que as células parentais MNNG/HOS, como demonstrado pelo

ensaio de TUNEL e de viabilidade celular com MTT.

A desregulação da via intrínseca ou mitocondrial da apoptose parece estar implicada na

resistência das CSCs à DOX como demonstrado pelo aumento observado nas das duas proteínas

anti-apoptóticas Bcl-2 e Bcl-XL e uma concomitante diminuição da expressão da proteína pró-

apoptótica Bak e da actividade da caspase-3 após exposição à DOX.

A redução na taxa de proliferação observada nas CSCs para concentrações não tóxicas

de DOX, sugere que estas células entram num estado de quiescência ou de baixa taxa de

proliferação protegendo-se assim dos efeitos citotóxicos da DOX que é mais eficaz para as

células com elevada actividade proliferativa.

Em conjunto, estes resultados sugerem fortemente que a existência de CSCs no OS contribui

para o desenvolvimento de resistência às terapias actuais utilizadas no tratamento desta

doença, o que reforça a necessidade de desenvolver novas abordagens terapêuticas que

contemplem a eliminação dessas células.

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6. Trabalhos Futuros

Para complementar os estudos realizados nas CSCs isoladas da linha celular humana de

OS MNNG/HOS outros trabalhos poderão ser realizados. O estudo da acção de inibidores das

proteínas anti-apoptóticas (como por exemplo o ABT-737, um inibidor da Bcl-2), e de

potenciadores das proteínas pró-apoptóticas, bem como das caspases torna-se numa

importante estratégia terapêutica no combate ao cancro. Pelo que estudos nas CSCs e nas

células parentais MNNG/HOS expostas à DOX e na presença destes inibidores podem ser

efectuados para complementar os estudos por nós realizados, e assim estabelecer a relação

entre a resistência das CSCs aos agentes de quimioterapia e a desregulação da via mitocondrial

da apoptose.

Estudos sobre os efeitos sinergéticos dos principais agentes de quimioterapia utilizados

actualmente com outros fármacos não tóxicos já existentes no mercado podem ser efectuados

para encontrar uma forma de diminuir as doses administradas nos doentes que padecem de OS,

uma vez que estes agentes de quimioterapia apresentam variados efeitos secundários que

devem ser contornados para melhorar a resposta à terapia.

Estudos sobre a interacção entre a via da apoptose e as vias de sinalização MAPK/ERK e

PI3K/Akt devem ser efectuados, no sentido de estudar se o facto de inibir estas vias de

sobrevivência se torna num método mais eficaz na inibição da apoptose nas CSCs, que

apresentam uma maior resistência a este tipo de morte celular.

Além disso, novas vias de sinalização envolvidas na resistência das CSCs à terapia devem

ser aprofundadas, no sentido de encontrar novos agentes de quimioterapia mais eficazes na

erradicação destas células.

Progressos nos estudos in vivo também são de extrema importância no entendimento

das CSCs como células responsáveis pelo desenvolvimento do OS.

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