METODOLOGIA PARA A CONTAGEM DE CIANOBACTÉRIAS EM CÉLULAS/ML. UM NOVO DESAFIO PARA O ANALISTA DE LABORATÓRIO

8/8/2019 METODOLOGIA PARA A CONTAGEM DE CIANOBACTRIAS EM CLULAS/ML. UM NOVO DESAFIO PARA O ANALISTA DE L

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109engenharia sanitria e ambiental

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METODOLOGIA PARA A CONTAGEM DE CIANOBACTRIAS EMCLULAS / ML. UM NOVO DESAFIO PARA O ANALISTA DE LABORATRIO

METHODOLOGY TO CYANOBACTERIA CELLS COUNT IN CELLS / ML. A NEWCHALLENGE FOR THE LABORATORY ANALIST.

F ERNANDOA NTNIOJ ARDIM Mestrado em Saneamento Meio Ambiente e Recursos Hdricos pela Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG); Bilog

formado pelas Faculdades Metodistas Integradas Izabela Hendrix; coordenador do setor de Biologia do Laboratrio Metropolit(L.M.) da COPASA

S IMONI DE O LIVEIRA C AVALIEREI Biloga, formada pelas Faculdades Metodistas Integradas Izabela Hendrix, Belo Horizonte - MG; analista de laboratrio do se

de Biologia do L. M. da COPASA.

P ATRCIA C ASTANHEIRA G ALLINARI Biloga, formada pela Pontifcia Universidade Catlica de Minas Gerais, Belo Horizonte - MG; analista de laboratrio do seto

Biologia do L. M. da COPASA e mestranda do curso de Saneamento Meio Ambiente e Recursos Hdricos da Escola deEngenharia da UFMG.

L ENORA N. LUDOLF V IANNAMestrado em Microbiologia pela Universidade Federal de Minas Gerais; Biloga, formada pela Universidade Federal de Min

Gerais, Belo Horizonte - MG; pesquisadora autnoma do setor de Biologia do L. M. da COPASA.

RESUMOO trabalho apresenta uma metodologia para a contagem decianobactrias (Cyanophyceae) em nmero de clulas por mililitrode amostra face real necessidade exigida pela portaria no. 1469do Ministrio da Sade (12/2000) aos laboratrios dehidrobiologia das companhias de saneamento e institutos depesquisa no Brasil. Com o objetivo de se padronizar a contagemdas clulas de cianobactrias e facilitar a execuo dos trabalhosrotineiros do laboratrio, realizou-se uma adaptao ao clculoda Unidade Padro de rea (UPA), aceita internacionalmente.Aps a padronizao dessa contagem, a tcnica foi ento avaliadaatravs da aplicao nas anlises de rotina, com resultadossatisfatrios.

PALAVRAS-CHAVE: Cianobactrias, metodologia de contagemde clulas.

ABSTRACTThe paper presents a methodology to cyanobacteria cells count innumber per millilitre sampled due to real necessity demanded by new Brazilian drinking water regulation edict n. 1469 from Health Ministry 2000/12 to Brazilians sanitation companyhydrobiological departments and research institute, aiming thestandardisation the cyanobacterias cells counting and improve thelaboratory routine work. An adaptation to Area Standard Unit ( ASU ) , internationally accepted, was carried out. After the standard cells counting, this technique was then valued across the direct application in routine works with good results.

KEYWORDS: Cyanobacteria,cells counting procedures.

INTRODUOA partir da edio da portaria no.

1469 do Ministrio da Sade em 12/ 2000 passou-se a exigir o monitoramentodas cianobactrias em guas deabastecimento, com o objetivo de quefossem implantados monitoramentossistemticos para a tomada de aespreventivas e corretivas que visassem

minimizar os impactos sade humana,

das toxinas produzidas por linhagens dealgumas espcies desses organismos. Essaexigncia legal trouxe um grandedesconforto s companhias estaduais desaneamento, aos servios autnomos e sprefeituras pois, aliada carncia de setoreshidrobiolgicos nos laboratrios dessesrgos existia uma falta de padronizaodas metodologias utilizadas para aenumerao do fitoplncton. De uma

maneira geral, naqueles laboratrios onde

se realizavam as anlises hidrobiolgicas,as unidades utilizadas para a expressodo quantitativo eram aquelas jpadronizadas e propostas por rgoscompetentes. Para tanto, pode-se citar aexpresso dos resultados em organismospor mililitro de acordo com A.P.H.A.(1998) ou por Unidade Padro de rea(UPA/mL), cujo clculo didaticamenteexplicado pela CETESB (1978). Para

ambos os casos a contagem era realizada

Recebido: 04/02/02 Aceito:07/08/02

Vol. 7- N 3 - jul/set 2002 e N 4 - out/dez 2002, 109-111


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Figura 1 - Retculo de Whipple com uma colnia de

cianobactria sobreposta

Tabela 1 - Procedimento operacional padro para a contagem do nmero de clulasde cianobactrias em amost ras de gua.

Etapas Colnias de Cianobactrias Tricomas

Antes da contagemMdia do nmero de clulas (em 30 colnias

aleatrias) contadas no quadrado maior do RW.Mdia do nmero de clulas em 30 tricomas

aleatrios.

Durante a contagemContar quantos quadrados maiores do RW se

sobrepem s colnias encontradas.Contar os tricomas

Estimativa donmero de clulas

Multiplicar o nmero de quadrados maiorescontados pela mdia do nmero de clulas.

Multiplicar a mdia do nmero de clulaspor tricoma pelo nmero de tricomas

contados.

segundo o critrio da contagem por con- juntos ouclump counting(BRANCO,1986), entendendo-se por conjunto aunidade caracterstica do gnero, isto :uma clula, no caso de seres unicelulareslivres; uma colnia, no caso deunicelulares coloniais; um filamento outricoma no caso de cianobactriasfilamentosas. A referida portaria emquesto mencionava que o resultado paraas cianobactrias passasse a ser expressoem nmero de clulas por mililitroamostrado. Alm disso, um pouco antesda publicao da legislao brasileira quesubstituiu a portaria no. 036 (01/90),CHORUS & BARTRAM (1999)elaboraram uma srie de recomendaesoperacionais para se monitorar a presenade cianobactrias na gua aonde aexpresso dos resultados dada emnmero de clulas por mililitro ou pelo

biovolume. Criou-se o seguinte impasse:como manter toda uma rede demonitoramento e tomar medidasoperacionais se os resultados das anlisesno eram expressos em nmero de clulaspor mililitro? JARDIM (1999) fez umaadaptao ao clculo da unidade padrode rea, aceita internacionalmente e

aplicou nos seus trabalhos rotineiros nolaboratrio metropolitano da companhiade saneamento de Minas Gerais comresultados satisfatrios.

METODOLOGIAJARDIM (1999) levou em

considerao para aplicar o novo mtodoo extenso intervalo da margem de erroproposta pela metodologia da contagemestimativa (A.P.H.A., 1998) que possuium limite de confiana de 95 20%quando se contam 100 organismos daespcie predominante. Sendo que esseerro cai para 10% quando se contam 400indivduos da espcie predominante deacordo com a distribuio de Poisson, cujafrmula apresentada na equao 1:

( )2

100% N (1)

onde: N o nmero de organismoscontados da espcie predominante.

Os passos para a utilizao dametodologia foram os seguintes: para as

colnias de Microcystisou outrascianobactrias da famlia Chroococcaceae,contou-se quantas clulas estavamcontidas num quadrado maior do retculode Whipple (R.W) ao se sobrepor pelomenos 30 colnias encontradasaleatoriamente no aumento de 200 vezes.Calculou-se a seguir uma mdia aritmticado nmero de clulas contadas. Durantea contagem, utilizando o mesmo aumento,contou-se quantos quadrados maiores doRW se sobrepunham s colniasencontradas e para se estimar o nmerode clulas, bastou multiplicar o nmerode quadrados maiores contados, pelamdia do nmero de clulas contadasanteriormente. J para as cianobactriasfilamentosas (tricomas) contou-se aquantidade de clulas em pelo menostrinta tricomas encontradosaleatoriamente na amostra. Em ambos os

casos, tanto para a contagem do nmerode clulas nas colnias quanto nostricomas, procurou-se contar um nmerototal por volta de 400 clulas, pois dessaforma, de acordo com a distribuio dePoisson, o limite de confiana foi de 10%. A contagem das clulas para apadronizao foi realizada por trsdiferentes analistas de laboratrio. NaFigura 1 observa-se um desenhoesquemtico da sobreposio de umacolnia em forma de cocos no retculo deWhipple.

RESULTADOSA aplicao da metodologia gerou o

seguinte procedimento descrito na Tabela1.

Aps a realizao de vriosexperimentos verificou-se que o nmerode clulas nos tricomas ou nas colnias(enumeradas dentro de um dos quadradosmaiores do RW) no sofria grandealterao e alm disso, o grau de liberdadedo intervalo proposto era muito amplo

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Jardim, F.A. et al


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Endereo paracorrespondncia:

Fernando Antnio Jardim Companhia de Saneamento de

Minas Gerais - COPASABr 356 - Km 4 - Cercadinho

CEP: 31950-640 Belo Horizonte - MG Tel.: (31) 3250-2340

[email protected]

( 20% para as anlises de rotina). Atra-vs dos resultados das contagens entre ostrs analistas de laboratrio obtiveram-seas mdias aritmticas do nmero de clu-las por tricomas ou colnias apresentadasna Tabela 2.

DISCUSSOApesar do extenso intervalo de con-

fiana permitido pela metodologia (10%) alguns cuidados devem ser toma-dos para se evitar que haja a extrapolao

desse intervalo. De preferncia, a conta-gem das clulas para a padronizao, de-ver ser feita sempre que possvel com omaterialin vivo, pois em amostras fixa-das ou coradas as clulas modificam a suaforma e o tamanho podendo assim ocor-rer uma superestimao no momento dacontagem de amostras nos trabalhos roti-neiros. O contrrio tambm pode ocor-rer, quando se contam indivduos deamostras cultivadas, onde as clulas apa-recem em nmero e tamanho maiores doque as de amostras naturais, nesse casso,pode ocorrer uma subestimao no mo-mento da contagem das amostras de roti-na.

As amostras devero ser semprecoletadas na superfcie dos mananciais,devendo-se evitar a coleta em profundi-dade ou aps a sada de estaes elevatriasde gua bruta (EEAB), essas amostras, aomicroscpio, apresentaram colnias im-pregnadas de partculas, o que dificulta acontagem das clulas. Alm disso, a pre-sena de tricomas j partidos ou at mes-mo hormognios interferem no resulta-do final.

O aumento utilizado para a conta-gem das clulas no presente trabalho foide 200 vezes, mas para a contagem declulas menores como de algumasChroococcaceae utilizou-se aumentosmaiores, mas para isso, as contagens dasamostras nos trabalhos de rotina foramrealizadas no mesmo aumento utilizadopara se contar as clulas nas colnias. Omesmo procedimento foi utilizado parase contar as clulas das formas tricomiais(filamentosas) com clulas mais largas quelongas (que lembram botes de camisa

sobrepostos) de algumas Oscillatoriaceae,mas nesse caso, depois que foi feita a pa-dronizao do nmero de clulas portricoma, a dimenso do aumento utiliza-do no interferiu em nada ao se contar ostricomas nas amostras dos trabalhos derotina. Outro fator que interferiu muitodurante a contagem das clulas para apadronizao foi a sobreposio das mes-mas, mas quando se contou somente oque estava dentro do quadrado maior doRW, essa interferncia foi menor.

Durante a contagem das amostrasde rotina, desde que tenha-se realizadoum exame qualitativo contento, pos-svel contar separadamente espcies de ummesmo gnero, cuja diferena entre onmero de clulas ultrapasse os 10%,permitido pela metodologia, caso contr-rio o resultado poder ser expresso emgnero. Observou-se tambm durante otrabalho que as clulas podem modificarde tamanho e quantidade nas colniasou nos tricomas de acordo com variaessazonais, por isso, recomenda-se que apadronizao proposta seja realizada pelomenos duas vezes ao ano, uma na estao

seca e fria e outra na estao quente e chu-vosa, para pases de clima predominante-mente tropical como o Brasil.

CONCLUSESA metodologia proposta passvel

de ser aplicada em laboratrios dehidrobiologia podendo sofrer modifica-es de acordo com as condies de cadalaboratrio, mas sugere-se a observaodas consideraes feitas acima, pois atra-vs delas, foi possvel uma adaptao r-pida ao que exigido pela portaria no.1469 do Ministrio da Sade ou seja,expressar os resultados em nmero declulas por mL e promover as medidascabveis de freqncia de monitoramentoe aes operacionais preventivas a fim dese minimizar os efeitos causados pelascianotoxinas em guas de abastecimento.

REFERNCIASBIBLIOGRFICASAMERICAN PUBLIC HEALTHASSOCIATION.Standard methods for theexamination of water and wastewater . 20. ed. Wa-shington: APHA/WEF/AWWA, 1998.

BRANCO, S. M. Hidrobiologia aplicada engenha-ria sanitria. 2. ed. So Paulo: CETESB, 1986. 620p.

BRASIL. Ministrio da Sade- Portaria no. 36/GM- 01/90 - Dirio Oficial, 23/01/1990.BRASIL. Ministrio da Sade- Portaria no. 1.469 -12/2000 - Dirio Oficial, no. 35-E, 19/02/2001.

CETESB , NT 06: L5. 303. Determinao defitoplncton de gua doce - mtodos qualitativo equantitativo. So Paulo, 1978.

CHORUS, I., BARTRAM, J. Toxic Cyanobacteriain water: a guide to public health consequences,monitoring and management.World HealthOrganization. London and New York, 1999. 416p.JARDIM, F. A. Implantao e realizao de anlisesde cianotoxinas com avaliao do potencial txico emestaes de tratamento da COPASA MG. BeloHorizonte, 1999. Dissertao de Mestrado -Departamento de Engenharia Sanitria e Ambiental- Escola de Engenharia - Universidade Federal deMinas Gerais.

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Tabela 2 - Cianobactrias catalogadas com a mdia do nmero de clula encontrada 10% em microscpio invertido no aumento de 200 vezes por ocalidade.

CianobactriasLocalidades emMinas Gerais

Mdia do nmero de clulas encontrada 10%

Anabaena planctonica Pitangui 25 por tricoma

Anabaena circinalis So Simo 98 por tricoma

Anabaena spiroides Pitangui 102 por tricoma

Radiocystis fernandoi Betim 20 por quadrado maior do RW

Microcystis panniformis Betim 40 por quadrado maior do RW

Cylindrospermopsisraciborskii Pedra Azul 10 por tricoma

Aphanizomenon sp. Trs Marias 13 por tricoma

Contagem de cianobactrias
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