Métodos Cromatográficos (PG404006) · Cromatografia planar Cromatografia planar, cromatografia em coluna e centrífuga Segundo o modo de separação: adsorção, partição, troca

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Universidade Federal de SergipeCentro de Ciências Exatas e Tecnologia

Departamento de QuímicaNúcleo de Pós-Graduação em Química

Métodos Cromatográficos (PG404006)

Métodos Cromatográficos (PG404006)

Prof: Dr. Marcelo da Rosa Alexandre

Escritório: LCP – Pólo da Física/Química

Horário: a combinar

E-mail: [email protected]

Website: http://mralexandre.wordpress.com

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Informações Gerais

Horário: Terça e Quinta 7:00 até 9:00 (??????)

Local: Sala do NPGQ

Bibliografia: Modern Practice of Gas Chromatography, 4 edição, 2004, Grob and Barry

Basic Gas Chromatography, 1997, McNair and Miller

F d t d C t fi 2006 C lli B B tFundamentos de Cromatografia, 2006, Collins, Braga e Bonato

Informações GeraisRevisão crítica: Serão feitas (em duplas) 4 revisões de artigos científicos de no máximo 2 laudas

“Term paper”: Ao final do curso, cada dupla, deverá escrever um artigo científico (review) sobre um tema à sua escolha

Laboratório: Haverá, no mínimo, uma aula complementar no laboratório de cromatografia

Avaliação: Ao final do curso, em data a ser definida, haverá uma avaliação individual versando sobre o assunto estudado

N t P i l (A li ã *0 4 T P *0 3 Médi RC*0 3)Nota Parcial: (Avaliação*0,4 + Term Paper*0,3 + Média RC*0,3)

Nota Final: (NP Prof. Marcelo + NP Prof. Sandro)/2

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PERGUNTAS ?

CROMATOGRAFIA

1834 – 1903: Runge, Goppelsroeder, Schonbein e Day – Análise de extrato de l l i d ã d plantas com papel picado, separação de

soluções salinas, análise utilizando capilaridade em tira de papel, etc....

Michael Tswett - 1906

Separação da clorofila de uma mistura de pigmentos de planta.

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Carbonato de cálcio em pó

Pequena quantidade de amostra

Éter de petróleo Éter de petróleo

Bandas separadas e de cores distintas.

éter depetróleo

mistura depigmentos

CaCO3 pigmentosseparados

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CROMATOGRAFIA

Kroma = cor Graph = escrever

Escrevendo em cores

Princípio Básico

Separação de misturas por interação diferencial dos seus componentes entre uma FASE ESTACIONÁRIA (líquido ou

sólido) e uma FASE MÓVEL (líquido ou gás).

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USOS E APLICAÇÕES DA CROMATOGRAFIA

A grande variedade de combinações entrefases móveis e estacionárias a torna umatécnica extremamente versátil e de grandegaplicação.

A cromatografia pode ser utilizada para aidentificação de compostos, por comparaçãocom padrões previamente existentes, para a

f d dpurificação de compostos, separando-se assubstâncias indesejáveis e para a separaçãodos componentes de uma mistura.

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CLASSIFICAÇÃOCLASSIFICAÇÃO

Segundo a forma física do sistema cromatográfico:Segundo a forma física do sistema cromatográfico:

Cromatografia planar Cromatografia planar, cromatografia em coluna e centrífuga

Segundo o modo de separação:Segundo o modo de separação:

adsorção, partição, troca iônica, exclusão ou misturas desses mecanismos.

Segundo a fase estacionária utilizada: Fase estacionárias sólidas, Líquidas e quimicamente ligadas

Segundo a fase estacionária utilizada: Fase estacionárias sólidas, Líquidas e quimicamente ligadas

Segundo a fase móvel empregada:Segundo a fase móvel empregada:Segundo a fase móvel empregada:Segundo a fase móvel empregada:

Cromatografia líquida – LíquidoCromatografia Gasosa – GásCromatografia supercrítica – Fluído supercrítico

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CROMATOGRAFIACROMATOGRAFIA

Pl E lTé i Planar Em coluna

Gás Fluidosupercrítico

LíquidoLíquido

Técnica

Fase

Móvel

L S FL L LS S SFL FL FLFase

Estacionária

L= líquido, S = sólido, FL= fase ligada

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Velocidade de passagem de um soluto

Separação dos Componentes

Velocidade de passagem de um soluto individual na fase estacionária depende da partição da molécula entre as duas fases.

Kd = Ce / Cm

Kd = coeficiente de partição

Ce = concentração do soluto na fase estacionária

Cm = concentração do soluto na fase móvel

Valor de Kd elevado.

O soluto tem maior afinidade com a fase estacionária.

Maior tempo de retenção.

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Tempo de retenção.

Distância percorrida por cada soluto num certo tempo.

Resultado das forças de eluição e resistência.

Substâncias que se movimentam vagarosamente: mais fortemente presas à

fase estacionáriafase estacionária.

Substâncias que se movimentam rapidamente – gastam uma fração de rapidamente gastam uma fração de

tempo menor na fase estacionária devido à menor solubilidade ou

afinidade a essa fase.

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CHROMATOTRON

Chromatotron é umacromatografia em camada delgadag f gpreparativa e aceleradacentrifugamente.

Foi desenvolvida pelos autores do Compendium of Organic Synthetic Methods. Substitue as CCDpreparativas, pequenas colunas e HPLC Com dimensiões 30 cmHPLC. Com dimensiões ~ 30 cm.

Cromatografia em Papel

A cromatografia em papel (CP) é umatécnica de partição líquido–líquido,p ç q qestando um deles fixado a um suportesólido. O suporte é saturado em água e apartição se dá devido à presença de águaem celulose (papel de filtro). Este método,embora menos eficiente que a CCD, émuito útil para a separação de compostospolares, sendo largamente usado embioquímicabioquímica.

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Cromatografia em Camada Delgada

A cromatografia em camada delgada (CCD) é uma técnica deadsorção líquido–sólido. Nesse caso, a separação dosç q p çcomponentes da mistura ocorre em função da migraçãodiferencial sobre uma camada delgada de adsorvente, fixonuma superfície plana, por meio de uma fase móvel (um líquidoou misturas de líquidos).

O parâmetro mais importante a serconsiderado em CCD é o fator deretenção (Rf), o qual é a razão entre adistância percorrida pela substância emquestão e a distância percorrida pela fasemóvel Os valores ideais para Rf estãomóvel. Os valores ideais para Rf estãoentre 0,4 e 0,6

Por ser um método simples, rápido,visual e econômico, a CCD é atécnica predominantementeescolhida para o acompanhamentode reações orgânicas, sendo

bé l dtambém muito utilizada para apurificação de substâncias e para aidentificação de frações coletadasem cromatografia líquida clássica.

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Cromatografia em Coluna

A cromatografia em coluna é uma técnica usadapara a separação de muitos compostos orgânicos.Essa técnica fundamenta-se basicamente napolaridade relativa das moléculas envolvidas.

Utiliza-se tubos de vidro compactado com ummaterial polar finamente dividido (suporte sólidoou fase estacionária), em geral, alumina ousilicagel, empacotado com um solvente orgânicoou uma mistura de solventes.

Uma solução contendo o composto que seUma solução contendo o composto que sedeseja purificar é aplicada na superfície superiorda fase estacionária, e após eluição coletarfrações com volume predeterminados, as quaismuito provavelmente conterão os componentesda mistura separados.

Cromatografia Gasosa (CG) e Cromatografiia Líquida de Alta

Eficiência (CLAE)

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Cromatografia Gasosa (CG)x

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)

GCGC

Em CG, a amostra tem que ser volátil e termicamente estávelnas condições de análise.

Limitada na separação de substância com caráter iônico, fotoe termicamente sensíveis e que apresentam masssa molecularalta.

Dificuldade de ser utilizada como técnica preparativa(normalmente destrutiva)

Cromatografia Gasosa (CG)x

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)

CLAECLAE

O principal requisito é que a amostras seja solúvel na fasemóvel de trabalho

Permite a separação de compostos de alta massa molar ecompostos iônicos

d õ bA maioria das separações ocorre em temperatura ambiente

É uma técnica analítica que pode ser adaptada para a escalapreparativa

Permite posterior caracterização estrutural

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Teoria Básica - Cromatografia Gasosa (CG)

TR´ -Tempo de Retenção Ajustado = O parâmetro diretamente mensurável de retenção de um analito

tRt ’ = t - t

tM

tR = tR - tM

TEMPO

SIN

AL

t = Tempo de Retenção (tempo decorrido entre a in-jeção e otR = Tempo de Retenção (tempo decorrido entre a in-jeção e o ápice do pico cromatográfico)tM = Tempo de Retenção do Composto Não-Retido (tempo mínimo para um composto que não interaja com a FE atravesse a coluna)tR’ = Tempo de Retenção Ajustado (tempo médio que as moléculas do analito passam sorvidas na FE)


VR´ -Volume de Retenção Ajustado = É um parâmetro não diretamente mensurável

vazão do gás de arraste

VR = Volume de Retenção (volume de gás de arraste necessário para eluir um analito)VM = Volume de Fase Móvel (volume de gás de arraste contido na coluna; “volume morto”)

MRR ttt −=′ x CF

VR’ = Volume de Retenção Ajustado (volume de gás de arraste consumido enquanto o analito está sorvido na FE)

VR’ = fFatores termodinâmicos

Parâmetros dimensionais da coluna

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Kc – Constante de Distribuição

Coluna cromatográfica: série de estágios independentes onde acontece o equilíbrio entre o analito dissolvido na fase estacionária e no gás de arraste:arraste:

Ocorre um “quase-equilíbrio” en-tre o analito sorvido na FE e dis-solvido no gás de arraste.


Kc – Constante de Distribuição

[A]S = concentração do analito na FE[ ]SAK [A]M = concentração do analito no gás[ ][ ]M

SC A

K =

MENOR RETENÇÃO !!!

Afinidade pela FE [A]S

Volatilidade [A]M

Nota: Apesar de Kc ser uma constante de equilíbrio, o processo cromatográfico não é, uma vez que que o gás de arraste está continuamente se movendo. No entanto, se a cinética de transferência de massa for rápida o suficiente, o sistema cromatográfico irá operar próximo do equilíbrio

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Escrevendo o equilíbrio em termos de quantidade de matéria (massa)do analito em cada fase, ao invés da concentração, temos:

S

M

VV

=βRAZÃO DE FASES, β: razão entre volumes de FE e gás de arraste na coluna

Onde:


k – Fator de Retenção (capacidade)

SWkFATOR DE RETENÇÃO, k: razão entre as

d lit tid FE (W )

Assim:

M

S

WWk =massas de analito contidas na FE (Ws) e

gás de arraste (WM)

O fator de retenção k depende da constante termodinâmica de distribuição KC e da razão de fases β da coluna

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β – Razão de Fases: Depende das dimensões da coluna:

L = comprimento da colunarC = raioda colunada coluna

df = espessura do filme de FE

( )fC

fC

drdr

2

2−=β

rC >> df


Relação entre VR´ , Kc e β

V ’ pode ser definido em função de K e β:VR pode ser definido em função de KC e β:

VR’ depende diretamente da constante de distribuição do soluto entre a FE e o gás de arraste e das dimensões da coluna.

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Relação entre VR´ , Kc e β

Outra combinação possível:

É possível estimar tanto o fator detanto o fator de

retenção quanto a constante de

distribuição a partir do cromatograma e das

informações da coluna

Teoria Básica – Formato de picos

a) Normalb) Alargado (broad)b) Alargado (broad)c) Assimetria – frontal (fronting)d) Assimetria – posterior (tailing)e) Picos dobrados (doubled peaks)

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Teoria Básica – assimetria

Fator de Assimetria

Fator de alargamento

Teoria Básica – Eficiência de sistemas cromatográficos

A migração um analito pela coluna provoca

inevitavelmente o alargamento do pico

TEMPO

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Teoria Básica – Eficiência de sistemas cromatográficos

Efeitos do alargamento excessivo de picos:

Separação deficiente de lit t õ

Picos mais largos e i tanalitos com retenções

próximas.menos intensos = menor

detectabilidade

EFICIÊNCIA Capacidade de eluição com o mínimo de dispersão do analito.

Teoria Básica – Quantificação da Eficiência

Supondo a coluna cromatográfica como uma série de estágios separados onde ocorre o equilíbrio entre o analito, a FE e o gás de arraste:

Cada “estágio” de equilíbrio éequilíbrio é

chamado de PRATO TEÓRICO

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O número de pratos teó-ricos de uma coluna (N) pode ser calculado por:

Coluna mais eficiente

tR

wb

N


Altura equivalente de uma prato teórico (H) : é o tamanho de cada estágio de equilibrio

dC df H N

(L = comprimento da coluna)

C f H N0.10 0.25 0.081 3703700.25 0.25 0.156 1923080.32 0.32 0.200 1500000.32 0.50 0.228 1315790.32 1.00 0.294 1020410.32 5.00 0.435 689660.53 1.00 0.426 70423

Capilares, L = 30 m

0.53 5.00 0.683 439242.16 10% 0.549 36432.16 5% 0.500 4000

Empacotadas, L = 2 m

Nota: Valores de H para colunas capilares e empacotadas são próximos, mas como L para capilares é MUITO maior tipicamente elas são mais eficientes

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Fator de separacação/seletividade (α): é uma medida da separação de picos

Se α = 1: Os picos possuem a mesma retenção (co-eluição)

Resolução (Rs): é uma medida da separação tendo em conta a largura dos picos

)()(2

21 wwdRs+

=d


Resolução

Rs ≥ 1,5 – Significa picos totalmente separados

Rs < 1 5 – Significa picos com sobreposiçãoRs < 1,5 Significa picos com sobreposição

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Resolução (Rs) versus Seletividade (α)

A Seletividade (α) tem pouco significado se a Resolução (Rs) não for considerada

Em Cromatografia, o objetivo é a resolução dos picos


Equação de van Deemter: Relaciona a alturaequivalente a um prato, velocidade linear do gás dearraste e fatores que provocam o alargamento depicosp

Onde

A : Refere-se ao alargamento dos picos devido aos diferentescaminhos seguidos pelas moléculas da amostra (eddy diffusion)

uCuBAH ++=

B : Está relacionado com a difusão do soluto na fase móvel(longitudinal molecular diffsusion)

C : Está relacionado com a facilidade de transferência demoléculas do soluto da fase estacionária para a fase móvel(mass transfer in the stationary liquid phase).

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Equação de Golay: Equação de van Deemtermodificada para colunas capilares (tubulares)

Onde

B : Está relacionado com a difusão do soluto na fase móvel(longitudinal molecular diffsusion)

( )uCCuBH MS ++=

CS e CM : Está relacionado as transferências de massa na fasegasosa (CM) e na fase estacionária (CS)


N2 : Maior massa molar => provoca diminuição na difusão dosoluto diminuindo o termo B => permite baixa velocidade linearsoluto, diminuindo o termo B > permite baixa velocidade lineardo gás de arraste.

He e H2 : Possibilitam maiores velocidades de fluxo sem perdade eficiência, minimizando tempo de análise.

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