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FANY SILVA LIMA
MÉTODOS DE CARDIOPROTEÇÃO EM MODELO DE ISQUEMIA E REPERFUSÃO
AGUDA EM PORCINOS
CAMPINAS
2015
ii
iii
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Faculdade de Ciências Médicas
FANY SILVA LIMA
MÉTODOS DE CARDIOPROTEÇÃO EM MODELO DE ISQUEMIA E REPERFUSÃO
AGUDA EM PORCINOS
Dissertação de Mestrado apresentada à Faculdade de Ciências
Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos
requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Ciências.
ORIENTADOR: ORLANDO PETRUCCI JUNIOR
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO
FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA
ALUNA FANY SILVA LIMA, ORIENTADA PELO
PROF. DR. ORLANDO PETRUCCI JUNIOR
CAMPINAS
2015
iv
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vi
vii
RESUMO
O infarto agudo do miocárdio (IAM) ainda permanece como umas das
principais causas de morbimortalidade em indivíduos adultos, ocasionando lesões
miocárdicas pela isquemia seguida da reperfusão. No presente trabalho estudamos a
cardioproteção por meio de três diferentes estratégias: a utilização de um fármaco
denominado - Piracar (Piracetam, L-carnitiva, glutamato e aspartato), a utilização de
uma solução contendo eritropoietina, glicose, insulina e potássio (EG); e por meio da
modulação humoral/neurológica denominada isquemia de pré-condicionamento remoto
(IPCR).
Para esta análise utilizou-se de modelo agudo de isquemia e reperfusão
miocárdica em suínos em que foram avaliadas variáveis hemodinâmicas, quantificação
da área de infarto, quantidade de troponina I liberada (TnI-C) e de adenosina trifosfato
no músculo cardíaco (ATP). Também foram estudadas proteínas relacionadas a
isquemia e reperfusão miocárdicas de duas vias conhecidas como a Survivor Activating
Factor Enhancement (SAFE) e a Reperfusion Injury Salvage Kinase Pathway (RISK)
utilizando Western Blotting.
Foi observado maior ativação das proteínas ERK (p˂0,05) e STAT (p˂0,05)
nos grupos EG e IPCR comparados ao controle, quando comparados entre si o grupo
que se apresentou melhor foi o EG, também com a quantidade de ATP
significativamente maior. No grupo Piracar e IPCR a AKT (p˂0,05) apresentou-se
ativada comparada aos demais grupos. Não encontramos diferença nas análises
viii
hemodinâmicas e na porcentagem de área de infarto. Entretanto, a TnI-C apresentou-
se elevada na fase de reperfusão nos grupo IPCR e EG; e reduzida no grupo Piracar.
Dos tratamentos estudados, o grupo EG foi o que mais se destacou pelo
aumento significativo das proteínas ERK e STAT, e aparente melhora na reserva
metabólica pela quantidade elevada de ATP disponível, enquanto os demais grupos e
nas demais formas de análises foram semelhantes ou com resultados inferiores.
Palavras-chave: Infarto do Miocárdio. Reperfusão Miocárdica.
ix
ABSTRACT
The Acute myocardial infarction (AMI) is yet the major cause of morbidity and
mortality in adults, causing, after myocardial ischemia, damage by reperfusion. In this
study, cardioprotection was researched through 3 different strategies: one using Piracar
(Piracetam, L- carnitiva, glutamate and aspartate), a second using a solution of
erythropoietin, glucose, insulin and potassium (EG); and another with the humoral
and/modulation neurological called remote ischemic preconditioning (IPCR).
For this analysis was used the pig model of acute myocardial ischemia and
reperfusion, evaluating hemodynamic variables, size of infarct area, amount of troponin I
released (cTnI) and adenosine triphosphate in the heart muscle (ATP). As well were
studied proteins related to myocardial ischemia and reperfusion pathways known as the
Survivor Activating Factor Enhancement (SAFE) Reperfusion Injury and Salvage Kinase
Pathway (RISK) through Western blotting.
We found greater activity of ERK (p= 0,05) and STAT (p= 0,05) proteins in the EG
and IPCR groups compared to the control, with the best results in the EG group, which
had also a ATP amount significantly higher. In the Piracar and IPCR groups, AKT was
significantly activated compared to the other groups (p<0,05). There were no
measurable differences concerning the hemodynamic analysis or the infarcted area,
even though there was a higher (not significant) level of cTnI during the reperfusion
phase in IPCR and EG groups, when compared to the Piracar group.
From the proposed treatments, the EG group stood out, with the significant
increase in ERK and STAT protein and apparent improvement in metabolic reserve –a
higher amount of ATP available. The other two groups had inferior results.
x
Key words: Myocardial infaction. Myocardial Reperfusion.
xi
SUMÁRIO
DEDICATÓRIA xiii
AGRADECIMENTOS xv
LISTA DE ILUSTRAÇÕES xviii
LISTA DE TABELAS xix
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS xxi
1. INTRODUÇÃO 1
2. OBJETIVO 8
3. MATERIAL E MÉTODO 9
4. RESULTADOS 20
5. DISCUSSÃO 32
6. CONCLUSÃO 42
REFERÊNCIAS 43
ANEXOS 50
xii
xiii
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho aos meus irmãos Juliana e Gabriel, que os graus que adquiri lhes
sejam fonte de inspiração e renovação de ânimo para a jornada que iniciam.
xiv
xv
AGRADECIMENTOS
Meu primeiro agradecimento é para o meu Pai, meu Deus, que me capacita e
cuida de mim noite e dia. Estudar o coração foi mais um deslumbramento com quem
Ele é.
Ao meu noivo, Pedro, quem diariamente viveu cada etapa comigo e é o meu
maior incentivador.
Aos meus tios Noemi e Paulo Amaral, pois sem o suporte de uma família seria
impossível construir este trabalho.
Ao meu orientador, Dr. Orlando, que soube lidar com as minhas limitações e me
ensinar com muita destreza. Foi um privilégio trabalhar com ele!
Aos meus queridos colegas de trabalho: Anali, Helison, Karla, Carol e Vanessa
que tornavam o dia-a-dia de trabalho além de instrutivo, mais ameno e divertido.
À biologista Daniela pelo suporte técnico, experiência e segurança que
conseguiu me passar nos problemas experimentais que surgiam.
À todos do Núcleo de Medicina e Cirurgia Experimental: Ana, Willian, Cristina,
Miguel e Valdemir que fazem um excelente trabalho na pesquisa experimental e com
certeza os resultados não teriam sido os mesmos sem eles.
À todos da equipe de cirurgia cardíaca da Unicamp: Prof. Dr. Reinaldo, Prof. Dr.
Pedro, Prof. Dr. Karlos, Prof. Dr. Lindemberg, Profa. Dra. Elaine Soraya, aos médicos
residentes Vinícius e Felipe; aos Perfusionistas Biólogo Márcio e Prof. Dr. Nilson, meus
precursores na área; e as instrumentadoras: Dalva, Renata e Lídia.
À todos minha eterna gratidão!
xvi
xvii
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 – Via RISK e SAFE 4
Figura 2 – Cervicotomia direita 10
Figura 3 – Cateter de medida de volume e pressão 11
Figura 4 – Toracotomia direita 11
Figura 5 – Toracotomia esquerda 12
Figura 6 – Desenho do experimento 13
Figura 7 – Oclusão coronária 15
Figura 8 – Corte transversal ventrículo esquerdo 16
Figura 9 – Gráfica de porcentagem de infarto 25
Figura 10 – Análise densitométrica da AKT 27
Figura 11 – Análise densitométrica da ERK 28
Figura 12 – Análise densitométrica da Pstat 29
Figura 13 – Quantidade de ATP 31
xviii
xix
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Índices de contratilidade 21
Tabela 2 – dP/dt máx e mín 22
Tabela 3 – Débito Cardíaco, Trabalho Sistólico e Volume sistólico 23
Tabela 4 – Pressão sistólica, pressão diastólica e frequência cardíaca 24
Tabela 5 – Mensuração de TnI-c 30
xx
xxi
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
OMS – Organização mundial da saúde
IAM – Infarto Agudo do Miocárdio
ATP – Adenosina Trifosfato
CTE – Cadeira de Transporte de Elétrons
JAK – Janus Activated Kinases
SAFE – Survivor Activating Factor Enhancement
STAT – Signal Transducer and Activator of Transcription
ERK – Extracellular Signal Regulated Kinases
RISK – Reperfusion Injury Salvage Kinase Pathway
PI3K – Phosphoinositide 3-kinase
AKT – Serine-Tirosine Kinase
I/R – Isquemia e Reperfusão
GIK – Glicose, insulina e potássio
Enos – Óxido Nítrico Endotelial Sintase
NO – Óxido nítrico
EPO – Eritropoietina
IPCR – Isquemia de Pré-Condicionamento Remoto
IPERC – Isquemia de Pericondicionamento Remoto
IPOSC – Isquemia de Póscondicionamento Remoto
CEUA – Comissão de Ética no Uso de Animais
SBCAL – Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório
VCI – Veia Cava Inferior
AIA – Artéria Interventricular Anterior
VE – Ventrículo esquerdo
TTC – 2,3,5-trifenil-tetrazólio
TnI-c – troponina I cardíaca
ELISA – Enzype-linked Immunosorbent Assay
EG – Grupo eritropoietina, glicose, insulina e potássio
xxii
ESPVR – End Sistolic Pressure-Volume Relationship
PRSW – Pre-Recruitable Stroke Work
TAU – Constante de relaxamento isovolumétrico
dP/dt – derivada da pressão sobre a derivada do tempo
DC – Débito Cardíaco
TS – Trabalho Sistólico
VS – Volume Sistólico
PS – Pressão Sistólica
PD – Pressão Diastólica
FC – Frequência Cardíaca
1
1. INTRODUÇÃO
A doença coronariana é mundialmente predominante na morbimortalidade da
população ocidental (1). De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), o
óbito anual de homens chega a 3,8 milhões e de mulheres 3,4 milhões (2). Com o
aperfeiçoamento do diagnóstico e do tratamento, a taxa de sobrevivência destes
pacientes tem-se elevado (3). Entretanto, há a necessidade de evolução nos
tratamentos, que resultem tanto em mais benefícios fisiológicos para o miocárdio destes
pacientes bem como na redução dos gastos atuais nos sistemas de saúde (3, 4).
As manifestações do infarto agudo do miocárdio (IAM) são proporcionais à
quantidade de células que morrem na ausência do oxigênio, das quais são
proporcionais ao tempo em que a coronária encontra-se interrompida pela formação de
um êmbolo em sua luz (5, 6). Após o evento isquêmico os cardiomiócitos sobreviventes
desenvolvem um mecanismo compensatório: tornam-se alongados ou hipertrofiados,
para a manutenção do volume sistólico cardíaco (7).
Um coração humano adulto contém aproximadamente de 4 a 5 bilhões de
cardiomiócitos e a sua dificuldade endógena de regeneração leva a perda muscular
sendo substituidos por fibroblastos e tecido extracelular e não por cardiomiócitos viáveis
(7). Este processo que ocorre imediatamente após o IAM é denominado de
remodelamento cardíaco, sendo este um conjunto de alterações estruturais, funcionais
e celulares do ventrículo esquerdo (8). O processo reparativo é também dependente de
uma resposta inflamatória eficiente, tanto para remover as células mortas e os
fragmentos da matriz extracelular, como para sinalizar a ativação de células
reparadoras (8).
2
Existem 3 tipos de morte celular conhecidas nos mamíferos, distinguidas entre si
por critérios morfológicos (9). A morte celular do tipo I é denominada de apoptose.
Apoptose é um mecanismo organizado de remoção de células em mau funcionamento
(10). Ela é também é descrita como “morte celular programada” e morfologicamente é
caracterizada por hipercontração celular, condensação da cromatina, fragmentação do
DNA, endocitose da célula morta pelas células vizinhas sem a liberação do conteúdo
intracelular e nem a ativação da resposta inflamatória (11).
A morte celular do tipo II é conhecida como autofagia, caracterizada pela
eliminação interna de organelas lesadas, que depois de envolvidas em uma membrana
derivada do retículo, sofre a degradação por ação enzimática (12). A morte celular do
tipo III é a necrose celular que é definida como um tipo de morte celular onde não tem
as características da apoptose ou da autofagia (9).
No IAM a quantidade células que morrem são determinantes primários do
resultado tardio do IAM (6). Na escassez de energia provocada pela isquemia, a
mitocôndria não é capaz de gerar a adenosina trifosfato (ATP) para abastecer as
bombas iônicas; em decorrência disso, água e íons como cálcio e sódio acumulam-se
no interior da célula e a membrana celular perde a sua integridade por dissolução. A
liberação do conteúdo intracelular leva à necrose coagulativa e a danos na matriz
extracelular, ambas ativam uma intensa resposta inflamatória através da resposta
imunológica inata (13).
Durante a isquemia, o transporte de elétrons na membrana mitocondrial é
interrompida pela falta do oxigênio, pois o mesmo é um aceptor de elétrons, através de
uma cadeia de transporte de elétrons (CTE) que transforma a energia elétrica em força
motora. O transportador de elétron mais importante é a coenzima Q10 (ubiquinone-
3
ubiquinol) que na falta de oxigênio, fica na forma reduzida e se torna ubisemiquinone,
um radical livre que doa elétron para o oxigênio quando este retorna na reperfusão,
tornando-o um superóxido (6).
O excesso de superóxidos dissipa o potencial elétrico da membrana, abre o
canal de passagem de ânions e faz a mediação da abertura do poro mitocondrial,
aumentando o influxo de cálcio. O excesso de cálcio disponível para o sarcômero causa
hipercontratilidade dos miócitos quando estes são reenergizados durante a reperfusão,
levando à depleção da produção de ATP. A hipercontratilidade se propaga através da
lacuna que existe nas junções intercelulares o que parcialmente explica a apoptose
disseminada ocorrida na reperfusão (13).
Durante a lesão celular, proteínas anti-apoptóticas são ativadas, entre as quais
uma família de tirosinas que regula negativamente as citocinas inflamatórias: Janus
Activated Kinases (JAK) da via Survivor Activating Factor Enhancement Pathway
(SAFE), que ativa a proteína mais importante desta família: a Signal Transducer and
Activator of Transcription (STAT) que quando fosforilada, se transloca para o núcleo
onde inicia transcrição de citocinas endógenas anti-inflamatórias que competem com as
citocinas inflamatórias (8).
Outra via bastante conhecida é a Reperfusion Injury Salvage Kinase Pathway
(RISK) que tem seu efeito de proteção ao impedir a abertura do poro mitocondrial que
leva à apoptose celular, esta via tem diversas quinases tais como a Extracellular Signal
Regulated Kinases (ERK1/2), Phosphoinositide 3-Kinase (PI3K) e Serine-Tirosine
Kinase (Akt). (Figura 1) (14). A ativação destas vias no início ou durante a ocorrência da
isquemia reduz o tamanho do infarto em até 50% (15).
4
Figura 1 - Vias RISK (Reperfusion Injury Salvage Kinase Pathway) e SAFE
(Survivor Activating Factor Enhancement Pathway) são mediadoras de cardioproteção
na isquemia e reperfusão miocárdica modulando a sobrevivência celular (16).
Além das alterações intracelulares causadas pela isquemia e reperfusão (I/R),
outro fator igualmente importante é a alteração da composição da matriz extracelular. A
matriz extracelular serve como um suporte mecânico para os miócitos. No infarto
agudo, a matriz se desfragmenta, causando uma acentuada resposta inflamatória:
infiltração de leucócitos e proliferação de fibroblastos (8).
Reduzir o número de células lesadas na isquemia e reperfusão é, portanto, uma
estratégia de suma importância para inibir seus eventos deletérios. Diversas técnicas
visando a cardioproteção durante a reperfusão com a consequente redução da área de
infarto e melhor remodelamento ventricular tem sido descritas nas duas últimas
décadas (5, 17). Encontrar estratégias e/ou drogas que possam minimizar a lesão de
I/R é de fundamental importância durante as síndromes coronarianas agudas, bem
como durante cirurgias cardíacas onde também ocorre a isquemia e a reperfusão do
miocárdio (6).
5
Apesar disso, o melhor tratamento ainda é restauração do fluxo, ou seja,
reperfundir a área isquêmica o mais breve possível através de agentes fibrinolíticos ou
por meio de tratamento cirúrgico (18). O conceito de que a lesão pela I/R pode ser
limitada por manipulações farmacológicas persiste há quase 40 anos. Maroko e
colaboradores introduziram a nova idéia de que a extensão e a gravidade do dano
miocárdico talvez não possam ser predeterminadas, mas podem ser modificadas por
manipulações durante a I/R (19).
O Piracetam (2-(2-Oxopyrrolidino)acetamide) é um medicamento utilizado para
doenças degenerativas neurológicas, sobretudo aquelas decorrentes do avanço da
idade. Essa droga otimiza o metabolismo celular a partir do aumento da fluidez da
membrana facilitando a captação de glicose e, consequentemente, a produção de ATP
em tecidos lesados (20, 21). A L-carnitina (3-Hidróxi-4-trimetilamonio-butanoato) é um
aminoácido quartenário responsável pelo transporte de ácido graxo para a mitocôndria
no processo de produção de energia a partir do metabolismo dos carboidratos (22).
Modulações metabólicas com a administração de aminoácidos como glutamato e
aspartato para elevar a síntese de glicogênio pelo miocárdio na fase de isquemia e
otimizar a recuperação durante a reperfusão também tem sido alvo de estudo (23).
As propriedades de reserva metabólica que a associação dessas drogas
associadas podem conferir aos miócitos durante um período isquêmico seguido da
reperfusão, como no caso de infarto agudo do miocárdio possibilitam investigações
moleculares e hemodinâmicas, e potenciais achados benéficos destas associações.
Outra associação potencialmente benéfica e estudada na I/R é a associação de
insulina, glicose e potássio (GIK). Vários autores chamam a atenção sobre a
6
necessidade da melhora imediata do metabolismo celular logo no início da fase
isquêmica (24, 25).
A insulina é conhecida há aproximadamente 85 anos por regular a homeostase
de glicose, mas mais recentemente foi observado que ao ligar-se nos receptores da
membrana celular de insulina, inicia uma complexa rede de sinais intracelulares que
regula não somente o metabolismo celular, mas também a fisiologia cardiovascular
(26). A insulina que desta maneira, sobretudo ativa a via RISK (27), quando a Akt é
fosforilada e promove a maior captação muscular de glicose, gluconeogênese, síntese
de glicogênio, como também relaxamento ao endotélio vascular ao fosforilar a óxido
nítrico endotelial sintase (eNOS) para a produção de óxido nítrico (NO) (26). Os
resultados em seu uso no tratamento da I/R miocárdica, tem demonstrado benefícios da
redução da área de infarto também quando é associada à glicose e ao potássio (27,
28).
A eritropoietina (EPO), que neste trabalho a estudamos em conjunto com a
solução GIK, é uma glicoproteína em que consiste em 165 aminoácidos de massa
molecular aproximada de 30 kDa (29), que por muitos anos sua função era conhecida
como hormônio estimulante da eritropoiese, entretanto seus receptores tem sido
encontrados em outros tecidos como neurônios, baço e coração (30).
A EPO em modelo e protocolo experimental semelhante tem recuperado a
função contrátil do ventrículo esquerdo e diminuído a taxa de apoptos, reduzindo a área
de infarto e promovendo neovascularização no local lesionado (31).
Diferentemente das estratégias químicas, outros autores tem investigado a
cardioproteção que aqui relacionamos como física: isquemia de pré-condicionamento
7
remoto (IPCR), isquemia de pericondiciomento (IPerC) e isquemia de pós-
condicionamento (IPosC).
Na IPCR, algum órgão que não o coração é submetido a breves episódios de
isquemia não letal antes do episódio isquêmico e reperfusão letal no miocárdio; na
IPerC e IPosC o estímulo protetor é aplicado após aparecimento de isquemia
miocárdica ou na reperfusão do miocárdio, respectivamente (32). A IPCR é um
procedimento não invasivo, onde um manguito medidor de pressão arterial pode
obstruir a passagem de sangue em membro isolado (como membros inferiores ou
superiores, por exemplo) e propiciar neste membro a ativação das vias anti-apoptóticas
e cardioprotetoras (1).
Portanto, pretendemos com este trabalho avaliar estes diferentes meios de
cardioproteção em modelo de isquemia e reperfusão aguda em porcinos. Avaliamos a
técnica de IPCR, a associação dos componentes Piracetam, L-carnitina, Glutamado e
Aspartato que foram denominados de PIRACAR; e a associação de glicose, insulina e
eritropoietina que foi denominada de EG.
8
2. OBJETIVO
A propostas deste estudo é avaliar se os tratamentos: IPCR, Piracar e EG
possui efeitos protetores contra a lesão miocárdica em modelo clinicamente relevante
de isquemia aguda seguida de reperfusão, em corações de suínos adultos jovens nos
seguintes parâmetros:
1. Desempenho cardíaco por meio de índices hemodinâmicos de
contratilidade ventricular.
2. Quantidade de infarto ao final do período de reperfusão
3. Quantidade de TnI-C liberada
4. Quantificar a ativação de proteínas envolvidas na via RISK e SAFE
5. Quantificar o ATP remanescente no miocárdio
9
3. MATERIAL E MÉTODO
O estudo foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais CEUA-
UNICAMP (protocolo nº 2806-1) (ANEXO 1).
Animais: Suínos jovens e machos com pesos entre 25 e 35 kg, da raça
Landrace. Os animais foram adquiridos do produtor rural Geraldo José Vermeulen,
Holambra-SP, seguindo os padrões sanitários de criadouros de animais, e tratados de
acordo com os Princípios Éticos na Experimentação Animal da Sociedade Brasileira de
Ciência em Animais de Laboratório (SBCAL).
Preparação cirúrgica: Os animais foram anestesiados via intramuscular com
quetamina (10mg/kg) e submetidos a intubação orotraqueal. A anestesia foi então
mantida com tiopental sódico (25 mg/kg), cloridrato de fentanila (0,05mg/kg) e
pancurônio (0,1 mg/kg). Os animais foram ventilados com os seguintes parâmetros
ventilatórios: oxigênio inspirado de 100%, 0,76 segundos de tempo inspiratório, relação
tempo inspiratório/tempo expiratório de 1:1,5 e 25 ventilações por minutos utilizando o
respirador mecânico DX 3010 (Dixtal, São Paulo, Brasil).
Uma incisão cervical direita foi realizada e a veia jugular interna direita foi
canulada com cateter 4F. Por meio dela, foram administradas drogas anestésicas, as
drogas escolhidas para serem estudadas, a anticoagulação do animal por uso de
heparina (200 UI/kg) e a reposição hídrica (15 ml/kg/hora) de solução salina fisiológica
à 0,9% (Figura 2).
10
Figura 2 – Cervicotomia direita com acesso a jugular direita e carótida interna
direita.
Por meio da artéria carótida interna direita, um cateter de 5F – para mensuração
de volume e pressão ventricular por bioimpendância intraventricular. (Millar Instruments
Inc., Houston, Texas, Estados Unidos) - foi introduzido e locado no ventrículo esquerdo
(Figura 3). Este cateter tem 7 segmentos que pode ser ligados/desligados e fornece de
forma simultânea diversos parâmetros hemodinâmicos e eletrocardiograma
intracavitário.
11
Figura 3 – Cateter de volume e pressão inserido no ventrículo esquerdo pela
artéria carótida direita e locado no ventrículo esquerdo.
Uma pequena incisão foi feita no tórax à direita, para passagem de fita cardíaca
ao redor da veia cava inferior (Figura 4).
Figura 4 – Toracotomia para cadarçamento da veia cava inferior.
12
À esquerda, foi feita outra incisão para acessar o coração e por meio de um
torniquete ao redor da artéria interventricular anterior causar a isquemia miocárdica
(Figura 5).
Figura 5 – Toracotomia esquerda para acesso à artéria interventricular
anterior.
Em diferentes tempos, conforme demonstrado na figura 6, a veia cava inferior
(VCI) foi ocluída temporariamente por meio de fita cardíaca previamente inserida, que
por ocasionar diferenças de pré-carga, possibilita medidas de contratilidade a partir de
curvas de volume-pressão do ventrículo esquerdo. A partir desses dados, foram
calculados índices de contratilidade, volume ventricular e parâmetros de função
diastólica (33-35).
13
tempo variável nãomaior que 45 minutos. 45 min de isquemia 90 min de reperfusão
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Figura 6 – Desenho do experimento com os diferentes tempos e períodos de isquemia
e reperfusão do miocárdio.
Protocolo Experimental: Os animais foram randomizados em sorteio por meio de
uma ferramenta online (http://graphpad.com/quickcalcs/randomize2/). A randomização
foi feita previamente ao dia do experimento e os animais foram distribuídos em quatro
grupos:
Grupo Controle (n= 8): cada animal recebeu 150 ml de solução fisiológica de NaCl
a 0,9% antes da e imediatamente após a isquemia, simulando o recebimento de
medicação.
Grupo Piracar (n= 8): cada animal recebeu 100 ml de solução composta de 100 mg
(L-carnitina) e 80 mg (Piracetam) acrescido de 50 ml da solução de aspartato
(15mg) e glutamato (15mg). Os momentos da administração também estão
demonstrados na Figura 6.
14
Grupo IPCR (n=8): A artéria femoral esquerda era previamente dissecada e uma fita
cardíaca passada ao seu redor com um torniquete. Quatro ciclos de oclusão e
reabertura da artéria femural foram feitos sendo cada período de 5 minutos
totalizando, portanto, um período de 40 minutos de IPCR antes da oclusão da
coronária (1).
Grupo EG (n=8): Cada animal recebeu imediatamente antes do início da isquemia
1000 UI/Kg de eritropoietina humana recombinante (Eritromax - Blausiegel - Cotia,
SP, Brasil) administrada na veia jugular previamente descrita (4).
Concomitantemente, iniciou-se a infusão contínua de 1,5 ml/kg/hora até o final na
reperfusão uma solução contendo glicose: 300g /L, insulina: 50 UI/L e Cloreto de
potássio: 80mEq/L denominado solução GIK (24).
A artéria coronária interventricular anterior (AIA) foi reversivelmente ocluída por
45 minutos, com fio de polipropileno 4.0 fixado com um torniquete de silicone,
ocasionando isquemia regional do coração seguido por 90 minutos de reperfusão
(Figura 7). Ao final da reperfusão, os animais foram eutanasiados por meio de
aprofundamento da anestesia e exsanguinação.
15
Figura 7 – Foto demonstrativa da artéria interventricular ocluída e reperfundida.
Análise Hemodinâmica: As variáveis hemodinâmicas foram registradas durante
todo o experimento, para cálculo de índices de contratilidade a veia cava inferior era
ocluída antes do evento isquêmico, após os 45 minutos de isquemia e a cada 30
minutos durante a fase de reperfusão. O registro foi obtido continuamente durante todo
o experimento e foi analisado de modo off-line utilizando o software LABCHART 7 Pro
(ADInstruments Pty Ltd, Bella Vista, Austrália).
Determinação do tamanho do infarto: Ao final do protocolo experimental a artéria
coronária interventricular anterior era novamente ocluída. Na ponta do ventrículo
esquerdo era injetado 60 mL de solução composta de azul de Evans à 1%.
Simultaneamente era também pinçada a aorta de forma a promover a coloração da
região não relacionada a artéria ocluída (área remota), conforme exemplificado na
figura 8.
Após esta etapa, os animais tinham seu plano anestésico aprofundado e eram
eutanasiados por exsanguinação, o coração era excisado e o ventrículo esquerdo (VE)
16
dissecado. Os tecidos correspondentes às áreas consideradas de isquemia/reperfusão
(área de risco) e área remota (não risco) foram imediatamente congelados
separadamente em nitrogênio líquido e armazenados a - 80°C. Secções transversais do
VE foram utilizadas para mensurar o tamanho de infarto incubando o tecido, em uma
solução contendo 1% de cloreto de 2, 3, 5- trifenil-tetrazólio (TTC) (Sigma – Aldrich
Ltda, São Paulo, Brasil) à 37°C por 10 minutos. Após o período de incubação, o tecido
foi mantido por 1 hora em formaldeído tamponado com pH 7,2. Esse corte foi então
fotografado para mensurar a porcentagem de infarto, a área remota e a área de risco no
software Image Pro-Plus por planimetria. Essa metodologia é uma forma
semiquantitativa de avaliar a área infartada no ventrículo esquerdo (36). A Figura 8
demonstra os achados representativos dessa coloração.
a
a
b
bc
c
a
Figura 8: Corte transversal do ventrículo esquerdo. A área em vermelho vivo é a
área corada com o TTC e representa músculo isquêmico durante a isquemia regional
(A). A área escura acima representa a área com perfusão miocárdica durante a
isquemia regional (B). A área pálida representa músculo isquêmico com lesão
miocárdica definitiva (C).
17
As amostras sanguíneas obtidas durante o protocolo conforme demonstrado
na Figura 6 foram centrifugadas com 1100 rpm à 4°C por 10 minutos para a separação
do plasma e parte sólida sendo armazenado à - 80°C.
Análise Molecular: o método empregado para a quantificação da expressão de
proteínas da área de risco foi o Western Blotting. Inicialmente as proteínas foram
extraídas dos tecidos com tampão RIPA e homogeinizadas com o auxílio do
equipamento politron modelo TE-102 (Turratec-Tecnal, Piracicaba, São Paulo). Foi
acrescentado TritonX 10% e mantido por 40 minutos em banho de gelo. A seguir as
amostras foram centrifugadas durante 40 minutos à 11.000 rpm com temperatura de
4°C. Logo após, o sobrenadante foi separado em alíquotas. A concentração de
proteínas foram dosadas por espectrofotometria utilizando o kit BCA e seguindo as
orientações do fabricante (Thermo Scientific, Rockford, Estados Unidos).
As amostras preparadas foram estocadas em -80°C até o momento de sua
análise. No dia da análise, as amostras foram descongeladas em banho de gelo e de
acordo com a concentração de proteína correspondente à amostra, 40 µg de proteína
foram adicionadas ao tampão Laemmli 3X concentrado. Em seguida foram fervidas
durante 5 minutos em banho-maria a uma temperatura de 95°C. A eletroforese das
amostras iniciou-se com a aplicação em gel de dodecil-sulfato de sódio de
poliacrilamida à 10% (SDS-PAGE) com 1,0 mm de espessura preparado também no
dia do experimento. Para a realização da eletroforese no gel de SDS-PAGE foi utilizado
uma cuba de corrida (Mini-PROTEAN II, BioRad, São Paulo, Brasil). Após a
eletroforese, transferimos as proteínas do gel para uma membrana de nitrocelulose
(BioRad, São Paulo, Brasil) utilizando sistema semi seco de transferência (Trans-Blot®
18
Turbo, BioRad, São Paulo, Brasil), a transferência foi realizada por trinta minutos com a
diferença de potencial mantida constante em 25V.
Depois de transferidas as proteínas, a membrana foi bloqueada com solução
bloqueadora com agitação contínua durante 2 horas em temperatura ambiente. Após o
bloqueio, o anticorpo primário de interesse foi adicionado, pelo período de
aproximadamente 18 horas, em agitação constante e em temperatura de 4°C. Em
seguida, o anticorpo primário foi removido e acrescentado uma solução contendo o
anticorpo secundário. Este foi mantido durante 2 horas em agitação e temperatura
ambiente. Após isso, uma solução quimioluminescente foi adicionada Super Signal
West Pico (Pierce, Rockford, Estados Unidos). As imagens das bandas
correspondentes às proteínas de interesse foram adquiridas com fotodocumentadora
com câmera digital (Gel Logic Imaging System, Carestream, Miami, Estados Unidos).
As soluções de tampão foram preparadas no dia dos experimentos, seguindo um
protocolo já padronizado no laboratório: tampão de extração, solução basal, tampão de
corrida, tampão de transferência, solução para bloqueio, solução para anticorpo primário,
solução para anticorpo secundário, e solução de revelação.
Utilizamos esta metodologia para detectar proteínas das vias anti-apoptóticas já
anteriormente abordadas: STAT, Akt e ERK.
A mensuração de TnI-C (suína) no plasma foi realizada através de técnica de
enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), utilizando preparação comercial para
TnI-C porcina segundo orientações do fabricante (Life Diagnostics, West Chester,
Estados Unidos).
19
Todos os dados hemodinâmicos foram expressos em média e desvio padrão. A
área de infarto foi expressa como porcentagem em relação à área com isquemia sob
risco de infarto. Os dados foram analisados por análise de variância (ANOVA-One way)
para medidas seriadas com pós teste de Bonferroni ou com análise de variância com
dois fatores para medidas seriadas(ANOVA-Two way) quando apropriado. Foi utilizado
o pacote estatístico GraphPad Prism versão 6.0 for Windows (GraphPad Software, La
Jolla, California USA, www.graphpad.com) . Foi considerado P<0,05 como
estatisticamente significativo.
20
4. RESULTADOS
Variáveis hemodinâmicas: Medidas hemodinâmicas durante todo o
procedimento foram obtidas para avaliar o desempenho ventricular sistólico e diastólico.
Aqui reportamos índices de contratilidade analisando suas diferenças durante o tempo
de observação, o efeito intergrupo e a interação do tempo e os grupos. Estes dados
seguem que nas tabelas 1, 2, 3 e 4.
21
Tabela 1. Índices de contratilidade miocárdica obtidas durante todo o protolocolo experimental.
ESPVR: end sistólic pressure-volume relationship; PRSW: pre recruitable stroke work. TAU: time-constant of isovolumic relaxation. Análise utilizando
análise de variância para medidas repetidas com dois fatores (ANOVA-Two way). (*) efeito durante o tempo, (**) efeito intergrupo, (***) efeito interação
tempo X grupo.
Variável Grupo Inicial 45min isq 30min rep 60min rep 90min rep P* P** P***
ESPVR, ângulo da
regressão
Controle 2,2 ± 1,4 2,2 ± 1,2 1,2 ± 0,7 1,0 ± 0,8 2,0 ± 1,8
0,05 0,28 0,16
IPCR 2,2 ± 0,9
2,5 ± 1,0
3,1 ± 2,4 2,1 ± 1,2 2,8 ± 1,7
Piracar
2,4 ± 0,8
2,1 ± 0,9 1,3 ± 0,4 1,3 ± 0,9 2,6 ± 2,0
EG
2,1 ± 1,1
1,9 ± 0,8 1,8 ± 1,0 2,7 ± 1,6 3,2 ± 1,7
PRSW, ângulo da
regressão
Controle 59,0 ± 29,9 56,5 ± 12,8 51,2 ± 19,5 66,6 ± 16,1 41,6 ± 16,7
0,46 0,09 0,16
IPCR
48,3 ± 18,8
51,2 ± 23,7
42,6 ± 10,8
36,7 ± 16,0
42,3 ± 15,2
Piracar
53,4 ± 19,9
32,8 ± 15,1
31,5 ± 18,7
38,4 ± 28,0
40,2 ± 25,2
EG 44,3 ± 14,2 53,5 ± 24,3 41,9 ± 17,7
46,9 ± 17,0
45,4 ± 18,3
TAU, ms
Controle 29,3 ± 5,0 29,6 ± 6,2 27,0 ± 4,2 26,9 ± 5,4 25,8 ± 4,6
0,07 0,12 0,67
IPCR 23,9 ± 4,4 24,4 ± 2,8 23,9 ± 6,7 21,0 ± 5,9 21,2 ± 6,1
Piracar 22,9 ± 2,5 21,2 ± 5,0 26,7 ± 8,7 23,4 ± 6,2 20,9 ± 3,6
EG 25,7 ± 3,7 28,9 ± 9,9 27,9 ± 10,9 26.4 ± 5,6 22.4 ± 3,7
22
Tabela 2. dP/dt máxima e mínima obtidas durante todo o protolocolo experimental.
Análise utilizando análise de variância para medidas repetidas com dois fatores (ANOVA-Two way). (*) efeito durante o tempo, (**) efeito intergrupo,
(***) efeito interação tempo X grupo. (∞) P < 0,05 vs. Grupo Controle utilizando teste de Bonferroni para múltiplas comparações.
Variável Grupo Inicial 45min isq 30min rep 60min rep 90min rep P* P** P***
dP/dt máx, mmHg/s
Controle 2061,3±650,3 1955,4±538,8 1521,1±271,8 1638,6±343,9 1666,3±365,4
0,02 0,21 0,46
IPCR 1947,4±718,0 1818,0±826,6 1759,3±359,7 1852,4±516,6 1806,3±376,3
Piracar 2168,1±690,6 2071,7±1353,3 1574,4±642,5 2180,1±1129,5 2197,7±956,9
EG 2536,9±593,4 2665,7±880,8 2471,3±786,4 2063,3±670,3 2099,9±388,7
dP/dt min, mmHg/s
Controle -2710,7±697,6 -2421,7±542,8 -1951,4±557,2 -1896,3±656,4 -1947,7±569,8
<0,01 0,56 0,01
IPCR -2960,7±496,7 -2098,0±656,0 -2246,1±830,5 -2474,1±938,4 -2750,9±901,8∞
Piracar -3168,3±873,7 -1952,0±630,2 -1547,2±564,3 -1906,6±829,4 -1953,6±785,3
EG -3108,1±820,8 -2595,6±820,5 -2549,8±1364,1∞ -2220,6±1103,1 -2096,4±555,6
23
Tabela 3. Débito Cardíaco, Trabalho Sistólico e Volume Sistólico.
DC: débito cardíaco; TS: trabalho sistólico; VS: volume sistólico. Análise utilizando análise de variância para medidas repetidas com dois fatores
(ANOVA-Two way). (*) efeito durante o tempo, (**) efeito intergrupo, (***) efeito interação tempo X grupo.
Variável Grupo Inicial 45min isq 30min rep 60min rep 90min rep P* P** P***
DC, mL/min
Controle 2758,9±770,1 3015,3±1007,9 3046,3±1036,7 3058,0±1198,5 3035,4±1091,0
0,66 0,64 0,72
IPCR 2818,4±1429,4 2829,7±777,1 2466,9±810,7 2227,7±700,5 2299,9±709,4
Piracar 2748,3±424,2 2729,1±464,8 2550,7±564,5 2809,4±842,3 2786,4±622,0
EG 2774,6±903,7 3104,7±772,0 3163,7±1397,6 2969,7±1386,2 2672,0±656,0
TS,
mmHg.mL
Controle 2192,3±537,7 2064,7±686,0 1087,0±570,3 917,1±572,9 1201,4±912,3
<0,01 0,05
0,50
IPCR 1622,0±506,3 1329,3±588,7 759,1±478,7 690,2±381,9 762,0±458,0
Piracar 2291,0±446,7 1585,3±306,2 1087,1±395,3 1035,4±415,6 1080,5±408,2
EG 1938,4±481,7 1927,1±562,0 1267,0±637,6 1034,7±427,1 1047,7±404,0
VS, mL
Controle 27,6±7,4 27,1±10,2 20,9±7,1 19,2±6,8 19,8±7,7
<0,01 0,17 0,96
IPCR 21,8±6,0 22,3±4,5 15,4±6,8 13,4±6,0 13,0±5,2
Piracar 26,3±2,9 23,0±3,5 20,0±4,4 17,1±2,8 17,6±1,9
EG 23,1±6,2
24,1±6,6
19,7±7,7 17,1±6,0 15,4±3,8
24
Tabela 4. Pressão sistólica, pressão diástolica final e frequência cardíaca
PS: pressão sistólica; PD: pressão diastólica; FC: frequência cardíaca. Análise utilizando análise de variância para medidas repetidas com dois
fatores (ANOVA-Two way). (*) efeito durante o tempo, (**) efeito intergrupo, (***) efeito interação tempo X grupo.
Variável Grupo Inicial 45min isq 30min rep 60min rep 90min rep P* P** P***
PS
Controle 115,1±10,7 105,7±5,9 88,4±12,3 91,1±8,9 93,6±13,8
<0,01 0,08 0,15
IPCR 107,6±12,4 80,2±12,9 77,4±13,9 81,2±18,7 79,8±14,2
Piracar 109,7±9,2 84,1±25,8 66,2±9,9 83,9±20,5 84,1±14,6
EG 116,0±22,2 98,0±16,5 86,8±12,2 82,5±9,3 86,6±10,2
PD
Controle 10,9±2,9 10,3±3,6 7,8±3,0 6,6±4,8 7,5±5,5
<0,01 0,33 0,59
IPCR 7,1±3,8 7,1±1,8 5,4±4,2 4,6±3,0 4,7±2,7
Piracar 6,7±1,4 8,9±4,3 4,7±3,0 5,6±4,3 6,4±5,5
EG 6,4±3,8 7,8±2,8 6,1±2,9 4,4±2,1 4,7±2,7
FC
Controle 104,7±24,1 114,0±19,9 148,2±20,3 157,2±12,4 157,3±10,4
˂0,01 0,10 0,68
IPCR 123,8±30,2 130,1±28,4 180,2±32,5 188,4±51,5 191,8±53,4
Piracar 104,9±15,9 121,9±33,2 129.0±17.2 169,4±67,4 158,3±32,8
EG 121,2±23,6 132,5±35,9 159,8±19,0 171,7±31,5 174,9±25,3
25
Área de infarto avaliada pelo TTC: A avaliação semiquantitativa pelo
método de TTC permite avaliar a área de infarto em relação à área com isquemia
e risco de morte celular durante o procedimento.
Figura 9: Porcentagem de infarto da área sob-risco do ventrículo esquerdo ao final do
experimento. Valores expressos em média e erro padrão da média (n=8 em cada grupo). Avaliação
estatística utilizando análise de variância com um fator (p=0,06).
26
Vias Moleculares envolvidas em cardioproteção: Foram estudadas
proteínas conhecidas como cardioprotetoras, tais como as vias Reperfusion Injury
Salvage Kinase Pathway (RISK): Extracellular Signal Regulated Kinases (ERK1/2),
Phosphoinositide 3-Kinase (PI3K) e Serine-Tirosine Kinase (Akt). A Signal
Transducer and Activator of Transcription (STAT) da via Survivor Activating Factor
Enhancement Pathway (SAFE). O gráfico de relação entre AKT (figura 10), ERK
(figura 11) e pSTAT (figura 12).
.
27
0
50
100
150
pAKT
AKT
p < 0,01
p = 0,01
p = 0,01
p = 0,01
Con
trole
Pira
car
IPCR
EG
Un
idad
es R
ela
tivas
Figura 10: Análise por densitometria correspondente a banda de interesse da quantidade de
proteínas normalizadas. Valores expressos em medida e 1 erro padrão da média (n=6).
28
0
5
10
15
pERK
ERK
p = 0,04
p = 0,01
p < 0,01
Con
trole
Pira
car
IPCR
EG
Un
idad
es R
ela
tivas
Figura 11: Análise por densitometria correspondente a banda de interesse da quantidade
de proteínas normalizadas. Valores expressos em medida e 1 erro padrão da média (n=6).
29
Figura 12: Análise por densitometria correspondente a banda de interesse da quantidade
de proteínas normalizadas. Valores expressos em medida e 1 erro padrão da média (n=6).
0
1
2
3
pSTAT
ponceau
p < 0,01
p < 0,01
Con
trole
Piraca
r
IPCR
EG
Un
ida
de
s R
ela
tiv
as
30
A quantificação da TnI-C nos diferentes períodos de coleta é
demonstrada na tabela 5.
Tabela 5: Mensuração da TnI-C suína no plasma, nos tempos pré isquemia, imediatamente antes
da reperfusão (Isquemia) e após 90 minutos de reperfusão
Grupo Controle Piracar IPCR EG p
Pré isquemia 0,23 ± 0,43 0,02 ± 0,01 0,15 ± 0,10 0,10 ± 0,05 0,56
Isquemia 0,38 ± 0,36 0,20 ± 0,12 0,69 ± 0,69 0,45 ± 0,39 0,40
Reperfusão 10,15 ± 6,00 10,91 ± 3,14 27,00 ± 0,86 *
19,38 ± 3,93* p<0,01
Valores de 5 animais em cada grupo. Valores expressos em média e o desvio padrão. Análise de
variância com um fator. (*) P < 0,05 vs. grupo Controle utilizando pós teste de Bonferroni para
múltiplas comparações.
31
A quantificação de ATP, a partir do método de ELISA, está
representada na Figura 13. O grupo EG obteve a maior concentração de ATP
quando comparado aos demais grupos.
Figura 13: Mensuração de quantidade de ATP disponível no tecido cardíaco obtidos
ao final do protocolo (n = 4 animais). Análise de variância com um fator e pós teste de Bonferroni
para múltiplas comparações.
Con
trole
Pira
car
IPCR
EG
0.0
5.0×10-7
1.0×10-6
1.5×10-6
p < 0,01
p < 0,01
p < 0,01
mM
ol d
e A
TP
po
r 1
00
g d
e mú
scu
lo
32
4. DISCUSSÃO
A prevalência e os gastos com pacientes que apresentam falência
cardíaca seguida do infarto agudo do miocárdio continuam altos e justificam o
interesse em pesquisas translacionais que busquem o tratamento
cardiorregenerativo (37).
O presente estudo demonstrou que a utilização da isquemia de
precondicionamento remoto (IPCR) e a solução com insulina/ potássio/ glicose/
eritropoietina (EG) proporcionaram maior expressão da via SAFE pela STAT (com
diferença entre os grupos e não comparado ao grupo controle) e também ativação
da via RISK pela expressão da ERK, apesar de nenhuma das estratégias ter sido
capaz de elevar a Akt.. Por outro lado, o grupo Piracar mostrou maior fosforilação
da Akt que também faz parte da via RISK.
Nenhuma das estratégias utilizadas foi capaz de diminuir a área de
infarto, proporcionar melhoras hemodinâmicas ou melhorar os índices de
contratilidade cardíaca. Entretanto, foi observado pico precoce da TnI-C nos
grupos IPCR e EG, o que pode demonstrar menor quantidade de músculo lesado,
similarmente aos pacientes submetidos a trombólise química ou mecânica com
reperfusão (38).
Nosso modelo e protocolo experimental tem validade translacional para
o desenvolvimento de terapias no tratamento do infarto agudo do miocárdio, o
modelo desenvolvido visou investigar o efeito da associação de diferentes
estratégias cardioprotetoras ao coração infartado (36).
33
O uso de porcinos para o estudo cardiovascular tem crescido pela sua
similaridade anatômica e funcional em relação ao coração humano; bem como
pela proporção entre coração e superfície corpórea, à frequência cardíaca basal e
à pressão arterial, consideravelmente mais próximas do que outros modelos
experimentais, como os roedores. Nesse modelo, a reação ao insulto isquêmico
também é bom parâmetro, proporcional à resposta metabólica, eletrofisiológica, e
ao desenvolvimento espacial e temporal da lesão miocárdica. São animais
capazes de tolerar longos e variados protocolos, como desenvolvimento de
aterosclerose, dieta, crescimento de circulação colateral, neovascularização por
transplante de células tronco, hipernação miocárdica e situações agudas de
estresse, como exercício (36).
A análise dos índices de contratilidade, como a relação entre a pressão
sistólica e volume ao final da sístole (ESPVR), o trabalho sistólico pré recrutável
(PRSW) e a dP/dt máxima não foram capazes de demonstrar diferença entre as
três diferentes estratégias de cardioproteção em estudo. A ESPVR é um índice de
contratilidade que depende pouco da pré carga e fornece uma noção de como a
função sistólica do ventrículo esquerdo se comporta (39, 40). A PRSW é um
parâmetro de contratilidade que é uma relação entre o volume diastólico final e o
trabalho sistólico. Este índice tem boa correlação linear independente da pré carga
(4, 41-43). A dP/dt máxima é uma medida de velocidade de aumento da pressão
intraventricular, é um parâmetro muito utilizado na literatura, mas sofre grande
influência da frequência cardíaca (4, 43, 44).
34
Esses achados foram inesperados, possivelmente explicados pela
grande área de infarto provocada ao ventrículo esquerdo, como será discutido
mais abaixo.
Quanto a função diastólica que foi avaliada com a dP/dt mínina e o
tempo de relaxamento isovolumétrico do ventrículo esquerdo (TAU) não foi
observado diferença entre os grupos estudados.
A dP/dt mínima é uma medida de velocidade de descida da pressão
intraventricular esquerda durante a diástole, é um índice muito utilizado na
literatura, apesar de, semelhantemente à dP/ dT máxima, sofrer forte dependência
da frequência cardíaca (4, 43, 44).
O índice TAU, por sua vez, é uma regressão logarítmica da última fase
do ciclo cardíaco e retrata a velocidade de relaxamento do ventrículo, é bastante
fidedigno à função diastólica(4, 43, 44).
Nos diferentes grupos não observamos diferenças na função diastólica
muito provavelmente devida à grande lesão miocárdica provocada pelo protocolo.
Além dos citados, observamos que o débito cardíaco, trabalho sistólico,
volume sistólico, pressões de enchimento e frequência cardíaca também não
demonstraram diferenças entre os grupos durante todo o protocolo. O que era de
se esperar e foi observado é que a frequência cardíaca subiu em todos os grupos,
enquanto a pressão sistólica e diastólica caíram, no período de observação.
Para mensurar a área de infarto do ventrículo esquedo, foi utilizado um
método bastante empregado na literatura que mensura de forma semiquantativa o
músculo cardíaco sem viabilidade, através da imersão do tecido miocárdico em
35
TTC (cloreto de 2, 3, 5 - trifenil-tetrazólio).(36, 37). O sal utilizado é solúvel, não
corante e com propriedades receptoras de prótons. Ao entrar em contato com as
desidrogenases celulares, esse sal sofre uma oxirredução (45). Na forma
reduzida, ele se torna um composto denominado formazam que, em tecido
cardíaco viável, assume cor vermelha viva, separando a área saudável da área
em viabilidade celular (46). Neste estudo, as estratégias cardioprotetoras
utilizadas não propiciaram diminuição da área de infarto ao final do protocolo
proposto. Isso vai contra dois relatos de Moon et al (47, 48) que demonstraram a
forma como a EPO diminui a área de infarto em modelo de ratos avaliados após 4
ou 8 semanas do insulto inicial. Essa discordância de achados provavelmente se
deve ao momento da avaliação: no presente trabalho foi agudo e nos dois relatos
de Moon et al após 4 ou 8 semanas. A IPCR tem na literatura diversos trabalhos
demonstrando diminuição da área de infarto. Um interessante trabalho descrito por
Hausenloy et al em modelo semelhante ao utilizado no presente estudo, ou seja,
suínos submetidos a ligadura da artéria interventricular anterior por 60 minutos e
reperfundidos por 180 minutos conseguiu demonstrar que a IPCR diminuiu a área
de infarto (49). Apesar das similaridades com o estudo de Hausenloy não foi
observada redução da área infartada no presente trabalho. Uma das possíveis
causas, não demonstrável, é que no presente trabalho o tempo de reperfusão foi
de 90 minutos, enquanto no de Hausenloy o dobro do tempo. Esse maior tempo
de reperfusão está relacionado à maior agressão por reperfusão miocárdica (50).
O Piracar tem efeitos protetores no tecido cerebral em modelos
experimentais de acidente vascular cerebral, por essas propriedades poderia
36
proporcionar menor área de infarto (51). Contudo, não há na literatura da língua
inglesa disponível a utilização deste fármaco para proteção miocárdica.
Outra forma de avaliar a lesão miocárdica é quantificar a TnI-C sérica,
uma proteína parte do mecanismo de contração da célula muscular estriada.
Quando há morte celular, seus elementos estruturais são degradados e a TnI-C
liberada na corrente sanguínea. (52). A TnI-C é bastante utilizada na prática
clínica com boa correlação entre a quantidade de músculo lesado e reperfundido
durante o infarto agudo do miocárdio e a eventos adversos no pós operatório de
cirurgia cardíaca (53, 54). Leal et al demonstrou correlação da TnI-C no pós
operatório e a ocorrência de fibrilação atrial definindo um valor de corte ao redor
de 0,90 ng/mL (54).
A análise da TnI-C neste estudo demonstrou que os grupos Controle e
Piracar mantiveram valores séricos semelhantes e menores que os grupos IPCR e
EG ao final dos 90 minutos de reperfusão miocárdica. Esta maior concentração
sérica da TnI-C nos grupos IPCR e EG pode ser interpretada como a elevação
mais precoce deste marcador que é observada clinicamente (55). Em outras
palavras, os grupos IPCR e EG proporcionam melhor reperfusão miocárdica,
demonstrada pela elevação precoce da TnI-C. A prova definitiva seria possível
apenas com um protocolo semelhante, com um tempo de reperfusão maior.
Talvez esta mesma assertiva responda aos achados da área de infarto,
avaliados pelo TTC, pois não observamos correlação entre a área de infarto e os
maiores níveis de TnI-C dos grupos IPCR e EG. Protocolos com tempo de
reperfusão menor podem não permitir a retirada das desidrogenases da área
37
isquêmica, o que produziria áreas de infarto menores do que as reais (56). O
tempo de reperfusão empregado por alguns autores é maior que 90 minutos o que
poderia justificar a discordância entre os resultados (36, 49).
A avaliação de vias intracelulares envolvidas na isquemia e reperfusão
do miocárdio é importante, pois permite avaliar a resposta deste a longo prazo
mesmo que não sejam observadas diferenças fisiológicas no presente modelo (36,
57). Analisamos algumas proteínas que estão relacionadas às vias SAFE e RISK.
Essas duas vias tem sido extensamente estudadas na literatura e a sua ativação
tem efeito protetor a longo prazo no remodelamento ventricular por meio da
fosforilação de quinases que minimizam a lesão celular ou diminuem a ocorrência
de apoptose em modelos crônicos (57-59).
Dentre as proteínas da via RISK, a Akt é muito estudada, se relaciona à
redução da apoptose de cardiomiócitos protegendo-os durante I/R (59). Os
mecanismos cardioprotetores da Akt, já foram demonstrados em outros estudos
como não apenas a sua função anti-apoptótica, mas também em relação a
redução da área de infarto e melhora da função ventricular após isquemia aguda
(60). Alguns autores verificaram uma proporcionalidade entre a redução da área
de infarto e a fosforilação da Akt (61). Ravingerova et al utilizando corações
isolados de ratos e induzindo isquemia global por 20 minutos e reperfundido por
180 minutos demonstrou a importância da Akt. Foi utilizado um inibidor da PI3K, o
LY294002, a primeira proteína envolvida na via RISK, o que termina por inibir a
Akt e observaram um aumento da área de infarto no grupo com esse inibidor
comparado a um grupo controle (61).
38
Duas estratégias utilizadas no presente trabalho proporcionaram maior
ativação da Akt, o grupo Piracar e IPCR. Este achado de fosforilação maior da Akt
com o composto Piracar não apresenta relato na literatura inglesa até o presente
momento.
O grupo IPCR que também proporcionou maior fosforilação da Akt
comparado ao grupo controle é um achado semelhante a outros estudos (62). Tu
et al (62) estudaram uma série de repetições de isquemia e reperfusão no cérebro
de ratos e conseguiram demonstrar efeito protetor na isquemia e reperfusão
cerebral com maior ativação da Akt (62). Outro interessante e elegante trabalho
descrito por Giricz et al utilizando corações isolados demonstra que o perfusato de
corações submetidos a períodos de isquemia e reperfusão eram capazes de
promover cardioproteção a outro coração que fosse perfundidos por este líquido.
Neste trabalho eles removem microvesículas do perfusato proveniente do coração
submetido a isquemia e reperfusão repetida tentando demonstrar como o
precondicionamento remoto isquêmico pode funcionar em outros tecidos. Estas
microvesículas são secretadas por diferentes tipos de células e contém altas
concentrações de RNA e proteínas. A retirada destas microvesículas do perfusato
resultou em corações com maior área infartada (63).
O grupo EG demonstrou maior fosforilação das proteínas ERK e STAT
ao final do tempo de reperfusão. Isso condiz com os achados de outros estudos
em que a eritropoietina produz maior ativação das proteínas citadas (64-66). O
efeito cardioprotetor da solução de insulina/glicose/potássio já é bastante antigo e
conhecido (67, 68), contudo, na prática clínica os resultados não são tão
39
evidentes. Um estudo recente de Selker et al demonstrou diminuição da área de
infarto 30 dias após o evento e menor mortalidade após um ano de seguimento
nos pacientes que receberam esta solução (24). A eritropoietina tem sabidamente
efeito cardioprotetor com ativação da ERK e JAK/STAT (66). Miljus et al observou
que a EPO modula positivamente a via JAK/STAT na I/R por meio de genes que
estimulam fatores de transcrição desta via, mas não para a PI3K/AKT em
preparação utilizando neurônios de gafanhotos (66).
A sinalização da JAK/STAT é um mecanismo de proteção em resposta
ao estresse celular, e as suas evidências no processo isquêmico foi primeiro
descrito por Negoro et al (69, 70). Em seu trabalho, Negoro observou um
constante aumento da STAT3 de 1 hora até 24 horas em coração de ratos com a
coronária permanentemente ocluída. A citoproteção promovida pela JAK/STAT
parece estar mais ligada à adaptação celular a um ambiente hostil como o
ambiente isquêmico do que na fase de recuperação celular (69).
A atividade da EPO sobre a ERK foi encontrada em alguns trabalhos
também, Aguilar et al (64) recentemente publicou um trabalho que referiu que a
ativação da ERK ocorrer modestamente pela EPO, mas quando esta se associa
ao fator de crescimento de célula-tronco, a ativação ocorre fortemente – e isto
acrescenta aos nossos resultados.
Vilarinho et al utilizando preparação de coração in situ de suínos
neonatais demonstrou que a EPO ativa parcialmente a via RISK havendo
fosforilação da ERK da mesma forma como foi observada no presente trabalho (4)
40
Outro aspecto interessante que encontramos foram os nossos
resultados em relação ao grupo IPCR. Muito se tem publicado sobre a menor área
de infarto que a IPCR confere ao miocárdio (71), alguns trabalhos tem
demonstrado uma redução de 80 a 90% da área de infarto, e nos últimos 15 anos
muito tem se divulgado a cerca desta técnica descrita como segura e eficaz.
A preservação de ATP ao final do período de reperfusão é um fator
importante para os processos regenerativos que ocorrem durante este período. A
preservação da função mitocondrial permite maiores níveis de ATP e uma
restauração mais rápida do pH intracelular (50). A maior concentração de ATP
observada no grupo EG nos permite inferir que este grupo tem potencialmente
melhor proteção mitocondrial.
Sumarizando, o grupo EG mostrou maior fosforilação ERK, STAT e
maiores níveis celulares de ATP quando comparado ao controle, o que
potencialmente tem um melhor efeito biológico.
Como limitações do nosso modelo podemos ressaltar que o tempo de
reperfusão pode ter sido curto para detecção mais evidente da elevação da TnI-C.
A ligadura da artéria ventricular anterior foi sempre feita pela mesma pessoa, mas
acreditamos que o infarto causado foi muito extenso o que pode ter impedido a
detecção de diferenças entre os grupos, com animais em estado hemodinâmico
grave. Em nenhum dos grupos foi utilizado qualquer tipo de suporte inotrópico
durante os experimentos.
De forma geral, várias estratégias podem ativar diferentes vias de
sinalização, contudo, uma estratégia isoladamente é incapaz de estimular todas as
41
vias intracelulares conhecidas que proporcionam cardioproteção. Acreditamos que
uma estratégia conjunta possa trazer benefícios mais evidentes em modelos
experimentais ou na prática clínica.
Porém, outros estudos são necessários para compreender melhor os
efeitos destes tratamento.
42
6. CONCLUSÃO
O presente trabalho se comprometeu a estudar formas de propiciar ao
coração uma forma de reserva metabólica e de proteínas cardioprotetoras a fim de
condicioná-lo para que miócitos sobrevivessem ao período de I/R em um protocolo
agudo. Podemos concluir que:
1. Nenhuma das estratégias utilizadas melhorou de forma significativa o
desempenho hemodinâmico e de contratilidade cardíaca.
2. A quantidade de infarto em todas as estratégias de proteção foi
semelhante.
3. A quantidade de TnI-C I liberada foi maior no grupo IPCR e EG, que
interpretamos como sendo um pico precoce e, portanto, demonstrando efeito
benéfico da mesma.
4. Todas as estratégias utilizadas interferiram de alguma forma sobre as
vias RISK sendo que:
a. Akt foi marcadamente ativada pelo Piracar e IPCR quando
comparados ao controle;
b. ERK foi marcadamente ativada pelo IPCR e EG quando comparados
ao grupo controle;
c. Stat foi marcadamente ativada pelo IPCR e EG quando comparados
ao grupo Piracar, entretanto não foi diferente quando comparado ao grupo
Controle;
5. O ATP foi mais preservado no grupo EG quando comparado a todos
os outros grupos
43
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50
ANEXO
