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Métodos de inoculação e
avaliação de doenças em plantas
Métodos Mais Comuns Para Inoculação Artificial De
Bactérias Fitopatogênicas
a) Atomização
Penetração ocorrerá,
principalmente, através de
estômatos (em maior
número, distribuídos por
todo o filoplano) e de outras
aberturas naturais.
O controle da umidade
relativa torna-se crítico por
ser condicionante da
abertura estomatal e da
congestão de água na
câmara sub-estomática e
nos hidatódios.
Existem muitos aparelhos
passíveis de serem usados
ou adaptados como
atomizadores
Tipos de atomizadores utilizáveis para a inoculação de bactériasfitopatogênicas: (A) - Manual, tipo "De Vilbiss; (B) - Improvisado comuma agulha de injeção; (C) - Manual, comum; (D) - Acoplado a umcompressor
Procedimento
Utilizar mudas jovens,
sadias, em bom estado
nutricional, livres de
insetos e ácaros.
Manter as mudas em
câmara úmida (UR =
100%) por 24 horas
como pré-tratamento,
antes da inoculação.
Preparar suspensão de inóculo de OD550 =
0,1 a 0,2, a partir de cultura na fase
exponencial de crescimento.
http://bervieira.sites.uol.com.br/grafico.gif
Atomização
Atomizar o filoplano de maneira uniforme, tendo o cuidado de aplicar o inóculo em ambas as faces das folhas.
A atomização deve ser interrompida imediatamente antes do ponto de escorrimento.
Atomizador manual ou motorizado, sendo que, no último caso, a distribuição de inóculo tende a ser mais uniforme.
b) Uso de abrasivos
Trata-se de bom método para o caso de fitobactérias que preferencialmente penetram por ferimentos.
Desvantagem: por falta de prática, o pesquisador super-estimar a força de seus dedos e causar injúrias mecânicas muito extensas aos tecidos.
Se isto acontecer, essas injúrias vão se manifestar visualmente sob forma de necroses facilmente confundíveis com sintomas necróticos incitados pelo patógeno.
O abrasivo mais comumente usado é
carborundum“
Uso rotineiro para inoculação de certos vírus
de plantas.
PepYMV
Procedimento
Utilizar mudas jovens, sadias, em bom estado nutricional, livres de insetos e ácaros, cultivadas em vasos ou sacos de polietileno.
Polvilhar na superfície do órgão a ser inoculado pequena quantidade de carborundum, finíssimamente granulado.
Proceder à imersão de um chumaço de gaze na suspensão de inóculo e, o mais suavemente possível, passe o chumaço na superfície do órgão a ser inoculado.
O próprio dedo indicador de quem procede à inoculação pode substituir, com igual eficiência, o chumaço de gaze.
Imediatamente, transferir as plantas para câmara úmida e lá mantê-las por 24-48 horas.
c) Injeção
Esse método é muito eficiente porém muito drástico pois as células bacterianas são introduzidas diretamente no interior dos tecidos.
É usado principalmente para a condução de testes de hipersensibilidade em folhas.
O uso de câmara úmida como tratamento pós-inoculação pode ser benéfico mas não é essencial.
Mesmo no caso de associações compatíveis podem ocorrer sintomas atípicos ou sintomas semelhantes aos de hipersensibilidade.
d) Inoculação de folhas pelo uso de
tesoura Imergir uma tesoura
previamente esterilizada na suspensão de inóculo bacteriano e fazer cortes a partir dos bordos do limbo foliar.
Ao mesmo tempo que se faz o ferimento que serve de porta de entrada para o patógeno, o inóculo é depositado, sem excessos, no sítio de infecção.
Imediatamente após a inoculação, manter as plantas em câmara úmida por 24 horas.
Escala de avaliação de resistência de variedades de feijoeiro a X.
axonopodis pv. phaseoli, em que a inoculação é feita pelo
seccionamento do limbo com tesoura
e) Inoculação por picada
Utilizando um estilete,
alfinete ou outro
instrumento perfurante
previamente mergulhado
em suspensão de inóculo
Este método pode ser
usado, com eficiência, para
qualquer órgão.
O instrumento pode
perfeitamente ser
esterilizado por
autoclavagem, sempre que
necessário.
Acoplamento de um alfinete entomológico a um pincel
comum de pintura permite improvisar um ótimo e
eficiente instrumento para inoculação por picada
f) Inoculação por pressão
Este tipo de inoculação pode ser usado em situações especiais, quando o encharcamento de folhas com suspensão de inóculo se faz necessário.
Assim como a inoculação por injeção, este método é também muito drástico.
Como consequência, é um método muito empregado para testes de HR em plantas cujas folhas, por serem muito coriáceas, são praticamente impossíveis de serem infiltradas de outra forma como mandioca, eucalipto, ipê.
Compressor de ar acoplado a uma pistola de pintura ou equipamento similar, consegue-se mais uniformidade na dispensa do inóculo e mais eficiência bem como tem-se a possibilidade de padronizar a pressão.
Exemplo de inoculação por pressão, em que se usa uma pistola
comum de pintura para encharcamento de folhas de eucalipto com
suspensão de células de Acidovorax avenae.
g) Seccionamento da parte aérea
Geralmente para inocular monocotiledôneas
Consiste em seccionar, com lâmina de barbear, a parte aérea de plântulas e despositar uma gota de inóculo na área seccionada.
As folhas novas que surgem, quando a inoculação tem sucesso, já o fazem exibindo sintomas.
Dependendo do patógeno (E. carotovora, por exemplo) não há surgimento de folhas novas - a planta seccionada simplesmente não mais emite folhas e morre.
Esse método já foi usado, por exemplo, para inocular Erwinia stewartii em milho doce (Coplin, 1978) e A. avenae em arroz
Câmara úmida
h) Inoculação com palito
Palitos comuns de madeira são previamente esterilizados, imersos em suspensão de inóculo e introduzidos no caule da planta ou no ponto de inserção da folha no caule.
Consegue-se assim, sem a drasticidade do método de injeção, introduzir o patógeno profundamente nos tecidos.
i) Inoculação via hidatódios
Os hidatódios geralmente
situam-se nos bordos do
limbo foliar e são
importante porta de entrada
para as fitobactérias.
Xanthomonas campestris
pv. campestris é um típico
patógeno que penetra, em
condições de campo, via
hidatódios. Daí os sintomas
de lesão cuneiforme nos
bordos da folha.
Procedimento
Colocar as plantas a serem inoculadas em câmara úmida por 24 horas.
Passar suavemente um cotonete ou pincel depintura previamente imersos em suspensão deinóculo pelos bordos da folha, sem permitirescorrimento.
As plantas inoculadas não devem retornar à câmara úmida e sim serem mantidas, se possível, em local ventilado.
A temperatura de incubação deve estar entre 25oC e 30oC e nunca ultrapassar 30oC.
j) Inoculação de raízes lavadas
Colocar as sementes para germinar de preferência em leito devermiculita ou areia.
Quando as plântulas apresentarem o primeiro par de folhasdefinitivas, remover cuidadosamente a planta e lavar seu sistemaradicular sob água corrente.
Com tesoura estéril, seccionar as extremidades de algumas raizes.
Imergir o sistema radicular em suspensão de inóculo por algunsminutos
Replantar a muda em vasos com solo estéril. Aguarmoderadamente.
Sintomas podem demorar de dias a semanas para surgir,dependendo do patossistema em estudo
l) Inoculação de raizes "in situ"
Esta é uma variação do método anterior, em
que a planta não é arrancada. Estando a
planta no vaso, inserir um escalpelo no
substrato e fazer vários cortes no sistema
radicular.
Irrigar o vaso com a suspensão de inóculo.
m) Infestação do solo
Pode-se infestar o solo com uma quantidade
conhecida de inóculo.
A infestação pode ser feita misturando-se a
suspensão de inóculo e o solo usado para
preparar os vasos ou, já estando as plantas
em vasos, simplesmente proceder à irrigação
com a suspensão bacteriana, ferindo e, ou,
não ferindo o sistema radicular
n) Inoculação por seccionamento do
pecíolo
Este método foi usado, por exemplo, por
Pine et al. (1955) especificamente para
estudar a translocação de C. michiganense
subsp. michiganense via xilema de plântulas
de tomateiro.
O método consiste em seccionar o pecíolo
foliar próximo ao seu ponto de inserção no
caule e, na área seccionada, depositar uma
gota de inóculo.
http://www.esf.edu/chestnut/web_photos/inoculation.jpg
Escalas Diagrámaticas
Pimentão x Xanthomonas campestris pv. vesicatoria
1 2 3 4 5
Feijão x Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli
Análise de Imagens
Tese: Análise de Gerações para Reação à Mancha-
Bacteriana e Outros Caracteres Agronômicos em
Capsicum annuum L. (Elaine Manelli Riva)
Contagem do número
de pústulas/cm2 de
área inoculada,
obtendo-se média de
três contagens
Contagem de pústulas – Análise de Sintomas
Conversão da média do número de pústulas/cm2 em
uma escala de notas proposta a seguir, onde x é a
média do número de pústulas/cm2:
nota 1 = 0 x 15;
nota 2 = 15 < x 30;
nota 3 = 30 < x 45;
nota 4 = 45 < x 60;
nota 5 = 60 > x 75;
nota 6 = 75 > x 90;
nota 7 = 90 > x 105;
nota 8 = 105 > x 120;
nota 9 = 120 > x 135;
nota 10 = x > 135.
Tese: Fontes de resistência, métodos de inoculação e capacidade de combinação para a resistência à murcha-de-curtobacterium em feijão-de-vagem (Willian Krause)
Resistência à murcha-de-Curtobacterium
SINTOMAS
Murcha gradual das folhas,aparecendo áreasamareladas e irregulares,seguindo para o interior dafolha
Os sintomas são devido afalha no transporte deseiva provocada pelacolonização e degradaçãodas paredes dos vasos doxilema (Dinensem, 1978)
Os sintomas são maisagudos em períodos deestresse hídrico,temperaturas elevadas eem plantas jovens (5-8 cmde altura)
Microscopia eletrônica de varredura de secções de vasos de xilema de caules de feijoeiro comum(Phaseolus vulgaris) das cultivares Carioquinha (A) e IAC Carioca (B) colonizados por Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens, aos 28 dias após a inoculação (Maringoni, 2002)
Para Cff, diversos métodos de inoculação já foram utilizados,
como:
hilo da semente por meio de agulha;
via raízes;
picada de agulha ou palito no caule;
1 5432Notas
Resultados
Não houve interação significativa entre métodos e genótipos.
O método ‘hilo da semente’ além de não conseguir discriminar
genótipos resistentes e suscetíveis, foi muito drástico não
permitindo a germinação de muitas sementes
Os métodos de inoculação ‘hilo da semente’ e ‘raízes in situ’
proporcionaram notas de reação dos genótipos à murcha-de-
curtobacterium mais baixas
Conclusões
Os genótipos ‘Novirex’, ‘IAC Carioca Tybatã’ e
‘Amarelo Baixo’ foram identificados com os
maiores níveis de resistência;
O método de ‘palito de dente’, além da boa
discriminação entre os genótipos resistentes e
suscetíveis, apresenta rapidez e facilidade na
execução, sendo o método de inoculação mais
indicado.
Tese: Marcadores de DNA no Melhoramento do Feijoeiro
(Phaseolus vulgaris L.) Visando a Resistência a Xanthomonas
axonopodis pv. phaseoli (Amaury da Silva dos Santos)
Testou três diferentes métodos de inoculação:
Agulhas múltiplas
Corte com tesoura
Lâminas paralelas
