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Métodos de Pesquisa e
Diagnóstico dos Vírus
Estratégias
Isolamento em sistemas vivos
Pesquisa de antígeno viral
Pesquisa de anticorpos
Pesquisa do ácido nucléico viral (DNA ou
RNA)
Pré requisitos para um diagnóstico
Escolha do espécime adequado
Colheita no momento adequado
Encaminhamento ao laboratório
Exemplos de espécimes para o diagnóstico de vírus
Colheita de espécimes, transporte e
processamento
Colher o mais cedo possível (fase aguda da doença)
Usar containeres adequados (à prova de
vazamento) com identificação (tipo material, data colheita, nome do paciente, etc)
Refrigerar todos os espécimes até o diagnóstico [imediatamente após a colheita – geladeira (4oC); freezer (-20oC); [existem algumas
restrições dependendo do vírus]
Material usado para colheita
Parasita intracelular obrigatório
Necessita de um sistema vivo para o isolamento: cultura de células; ovos embrionados de galinha; animais de laboratório.
Sistemas de Hospedeiro Vivos
Cultura de células
Ovos embrionados
de galinha
Animais de laboratório
Vírus: o menor microrganismo conhecido
Detecção direta do vírus (Ag) Microscopia eletrônica
Princípio da coloração negativa
A. Vaporização do metal
pesado
B. Formação de camada
na superfície do vírus
C. Qualquer objeto no
caminho do vapor de
metal formará uma
sombra.
D. Detalhe da sombra com
dois ângulos de luz
Microscópio
eletrônico
Detecção direta do vírus (Ag) Microscopia eletrônica
Detecção direta do vírus (Ag) Microscopia eletrônica
Pesquisa de antígeno viral
Usando-se um anticorpo (Ac) obtido após a
inoculação de um animal com um antígeno (Ag)
purificado conhecido.
Ligação do Ac conhecido com o Ag na amostra
clínica.
Visualização dessa ligação através de marcação
de um segundo Ac com substâncias cromogênicas
(fluoresceína, peroxidase) ou radioativas (isótopos
radioativos).
ELISA (p/ Ag)
Pesquisa de antígeno viral
Pesquisa do Ag viral em células infectadas
(reação de imunofluorescência)
Reações de aglutinação (aglutinação de
hemácias, aglutinação de látex)
Western blot (pesquisa de proteínas virais)
Reação de imunofluorescência
Hemadsorção
Hemadsorção
Hemadsorção
Reação de hemaglutinação
Reação de hemaglutinação
Coaglutinação
Aglutinação Passiva
Aglutinação
Western blot
Pesquisa do DNA ou RNA viral
Pesquisa de DNA viral (Southern blot)
Pesquisa de RNA viral (Northern blot)
PCR (Reação em cadeia da polimerase)
Sequenciamento
Eletroforese em Gel
Eletroforese em gel
Eletroforese em Gel
Southern blot
Northern blot
HPV DNA Chip
Thermus
acquaticus
JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Aug. 1969,
p. 289-297 Vol. 98, No. I
Thermus aquaticus gen. n. and sp. n., a
Nonsporulating Extreme Thermophile
THOMAS D. BROCK AND HUDSON FREEZE
Department of Microbiology, Indiana
University, Bloomington, Indiana 47401
The isolation of a new thermophilic bacterium,
Thermus aquaticus gen. n. And sp. n., is
described. Successful enrichment requires
incubation at 70 to 75 C, and the use of
nutrient media relatively dilute with respect to
the organic components.
Strains of T. aquaticus have been isolated
from a variety of thermal springs in
Yellowstone National Park and from a thermal
spring in California. The organism has also
been isolated from man-made thermal
habitats, such as hot tap water, in
geographical locations quite distant from
thermal springs. Isolates of T. Aquaticus are
gram-negative nonsporulating nonmotile rods
which frequently form long filaments at
supraoptimal temperatures or in the stationary
phase. The optimum temperature for
growth is 70 C, the maximum 79 C, and the
minimum about 40 C. The generation time at
the optimum is about 50 min.
Quem inventou a PCR
Kary Mullis, geneticista
Nobel Prize em Química (1993)
pelo desenvolvimento de um método
que permite sintetizar, em poucas
horas e in vitro, uma grande
quantidade de um determinado
fragmento de DNA
Seus estudos em 1985 permitiram
amplificar o DNA
Saiki, R., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K., Horn, G., and Erlich, H. (1985).
Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site
analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230: 1350-54
Mullis, K. and Faloona, F. (1987). Specific synthesis of DNA in vitro via a
polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol 155: 335-35
PCR
PCR
Princípio: amplificação “in vitro” de segmentos
definidos de DNA
Acúmulo exponencial da sequência alvo ~2n
Reagentes: sais - Tris pH 8,3-8,9 - KCl
- MgCl2
dNTPs (ATCG)
TaqDNA polimerase
“Primers” (iniciadores da reação)
PCR (Polymerase chain reaction)
PCR
CÉLULAS OU TECIDOS
PRODUTO
AMPLIFICADO
ELETROFORESE EM GEL
DNA de HPV
Controle
Sequenciamento
Pesquisa de anticorpos (sorologia)
Usando-se um antígeno (Ag) viral purificado e conhecido, obtido após a inoculação do vírus em um sistema vivo (cultura de células, ovos embrionados de galinha ou um animal).
O Ag produzido é usado em reações para a pesquisa de anticorpos (Ac) específicos contra este Ag no sangue do paciente.
Ligação do Ag conhecido com o Ac na amostra clínica.
Visualização dessa ligação através de marcação de um segundo Ac com substâncias cromogênicas (fluoresceína, peroxidase) ou radioativas (isótopos radioativos).
Sorologia
Detecção do aumento do título de anticorpos entre as fases agudas e convalescentes da infecção, ou a detecção de infecção primária pela detecção de IgM.
Perfil sorológico típico após uma infecção aguda
Verificar que durante a reinfecção, IgM pode estar ausente ou presente em baixos
níveis
Testes de Neutralização
Inibição da hemaglutinação
ELISA (p/ Ac)
ELISA para sorologia de HIV
Microplaca de ELISA para sorologia de HIV: poços coloridos indicam
reatividade
http://www.biology.arizona.edu/immunology/activities/elisa/elisa_intro.html
Western Blot para pesquisa de Acs – HIV
1: Controle Negativo
2: Controle Positivo
3: dia 0
4: dia 2
5: dia 3
6: dia 5
7: dia 7
8: dia 12
9: dia 22
10: dia 30
Western Blot para pesquisa de Acs
Western Blot HIV-1
Lane1: Controle Positivo
Lane 2: Controle Negativo
Paciente A: Negativo
Paciente B: Indeterminado
Paciente C: Positivo
Uso dos métodos diagnósticos
Identificação/confirmação da presença do agente.
Relação do agente com determinado quadro clínico.
Monitoramento
O que a nossa mente vê?
As coisas são o que parecem ser.
As coisas são e não parecem ser.
As coisas não são, mas parecem ser.
As coisas não são nem parecem ser.
Epiteto (filósofo grego). Século II D.C.
Relação entre SER e PARECER
SER
PARECER
+ -
+ As coisas são o que
parecem ser
As coisas são são,
mas parecem ser
- As coisas são mas
não parecem ser
As coisas não são
nem parecem ser
Relação entre teste diagnóstico e
agente microbiano pesquisado
AGENTE MICROBIANO (vírus)
TESTE
+ -
+ Verdadeiro positivo Falso positivo
- Falso negativo Verdadeiro negativo
Sensibilidade e Especificidade
AGENTE MICROBIANO (vírus)
Presente Ausente TOTAL
TESTE
+
(a)
verdadeiro
positivo
(b)
falso
positivo
a + b
-
(c)
falso
negativo
(d)
verdadeiro
negativo
c + d
TOTAL a + c b + d a + b + c +
d
Sensibilidade = a / (a + c)
Especificidade = d / (b + d)
Sensibilidade: é a probabilidade de um teste dar positivo na presença do vírus, isto é, avalia a capacidade do teste detectar o vírus quando este está presente.
Especificidade: é probabilidade de um teste dar negativo na ausência do vírus, isto é, avalia a capacidade do teste negativar quando o vírus está ausente
Qual teste diagnóstico devo usar?
Sensíveis
Usados para o diagnóstico de vírus associados a
doenças potencialmente graves
Usado no rastreamento de doenças em uma
população
Específicos
Usados para os casos quando um resultado falso
positivo pode ser muito prejudicial
Confirma um diagnóstico sugerido por outros
testes
VANTAGENS DESVANTAGENS
Isolamento do
vírus
- permite futuro estudo do
agente.
- geralmente sensível para
alguns vírus.
- demora no diagnóstico.
- alguns vírus não são
cultiváveis.
Pesquisa de
antígeno
-ME: diagnóstico rápido e
detecta vírus não cultiváveis.
-Permite distinguir sorotipos
diferentes.
-não é aplicável a todos os
vírus.
Pesquisa de
ácidos
nucléicos
-PCR: método rápido e sensível.
- potencialmente aplicável a
todos os vírus.
- PCR: risco de contaminação
por DNA (falsos positivos).
-PCR: requer conhecimento da
sequência alvo a ser
amplificada.
Pesquisa de
anticorpos
-método rápido.
-útil em acompanhamento de
surtos na população.
- podem ocorrer falsos
positivos.
