Métodos de transformação

Aplicações da Biotecnologia na Agricultura

Cultura de Células e Tecidos

Anticorpos Monoclonais e Sondas de Ácidos Nucléicos para diagnóstico

Engenharia genética de plantas para a introdução de novas características

Mapeamento de genes

Genômica

Usos da Transformação de Plantas

A. Testar a função de genes ou partes de genes

B. Modificar a expressão de genes endógenos- Desligar genes- Aumentar a expressão- Modificar a expressão

C. Mover genes entre organismos

Tecnologia Multidisciplinar

•Biologia Celular – cultura de tecidos

•Biologia Molecular – clonagem, estrutura e função de genes

•Melhoramento – desenvolvimento e testes de produtos

•Direito- temas regulatórios

•Marketing – aceitação pública

Requerimentos para produção de plantas Requerimentos para produção de plantas transformadastransformadas

A. DNA a ser introduzido1. gene marcador2. promotor (constitutivo ou induzido),

região codificadora e sítio de poliadenilação

B. Cultura de células e protocolo de regeneração

C. Método de introdução do DNA na célula

D. Prova da transformação da planta

Produção de Plantas Transgênicas

Isolar e clonar o gene de interesse

Adicionar segmentos de DNA para iniciar ou aumentar expressão do gene

Introduzir a construção gênica em células de plantas (transformação)

Seleção de células ou tecidos transformados

Regeneração de plantas

86 Genomas microbianos:

Archaea - 16 espécies Bacteria - 70 espécies

42 Genomas de eucariontes:

Completos - 8 espécies Em andamento - 35 espécies

Isolamento de genesIsolamento de genes

GENEBANK já incorporou seqüências de mais de 105.000 organismos

Período de um ano - 4,6 milhões de novas seqüências

Seqüenciamento de DNA Seqüenciamento de DNA

Construíndo vetores: genes, promotores, terminadores e marcadores

Enzimas de restrição

Nathaus, Smith, Arber 1971,

Engenharia GenéticaBerg, Boyer, Cohen 1973

Estrutura molecular do gene

Exon Exon Exon

Intron

Região codificadora

Exon Exon ExonGppp Poly AhnRNA

Gppp Poly A

Translação

mRNAORF

Terminador

CCAAT TATA

Região promotora

Específicos Gerais

Construção de vetores para transformação

35S promoterACC oxi

35S polyA

35S promoter

35S polyAbar

EcoRIHindIIIT-Border T-Border

pIBI 23

Hind III KpnI BamHI

EcoRI NcoI 35S e + 35S pr ACC oxi 35S polyA

pIBI 21

Kpn I BamHI

SacI SacI HindIII

pIBI 11

ACC oxi

Promotores constitutivos

CaMV 35S : expressão de genes exógenos em dicots. Ubiquitin: promotor constitutivo em monocots.

Promotores Orgão/ tecido específico

Vicilina, glutenina: específicos para expressão em sementes -amilase: aleurona de cereais Patatin: tubérculos de batata RuBisCo: tecido clorofilado

Promotores mais comumente utilizados

Alguns transgenes têm impacto negativo; portanto transcrição somente quando necessário.

Indução de macho-esterilidade para produção de híbridos

Genes de resistência a doenças quando patógeno aparecer

Atraso na expressão de genes quando interfere com desenvolvimento inicial da planta

Induzido: alcool desidrogenase Etanol Transiente: Vírus do Mosaico do Tabaco (TMV)

Promotores induzidos e expressão transiente

FATORES INFLUENCIANDO A TRANSFORMAÇÃO DE PLANTAS

Protocolo de cultura de tecidos

Fisiologia do explante

Método de introdução do DNA

Genes marcadores e indicadores

Protocolo de seleção

Cultura de Tecidos❧ Microprogação❧ Cultura de células❧ Variação somaclonal❧ Cultura de haplóides ❧ Transformação

❧ Sementes artificiais❧ Híbridos Interespecíficos

● Resgate de embriões● Fusão de protoplastos

PROTOCOLOS DE CULTURA DE TECIDOS

Protoplastos

Calos

Meristemas

Brotos adventícios

Embriões somáticos

CULTURA DE CALOS

MERISTEMA

BROTOS ADVENTÍCIOS

BROTOS ADVENTÍCIOS (Citrus spp.)

EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA (C. arabica)

MÉTODOS DE TRANSFORMAÇÃO

CARACTERÍSTICAS DESEJÁVEIS EM MÉTODOS DE TRANSFORMAÇÃO DE PLANTAS

•Reprodutibilidade

•Eficiência

•Rapidez

•Baixo custo

•Simplicidade

•Ampla aplicação

Transformação via vetor natural

Agrobacteriumtumefaciens

rhizogenes

Agrobacterium

❧ Bactéria de solo❧ Transferência natural

de DNA para plantas, causando doença

❧ Substituição de DNA da bactéria (T-DNA) por DNA de interesse

❧ Agrobacterium transferirá novo DNA

Agrobacterium tumefaciens

Bactéria com o Ti -plasmídio

Ti -plasmídio (responsável pela virulência)

Infecção de plantas feridas e transferência do DNA para as células

Planta com agrobactérias vivendo em galhas

Indução pelo T-DNA de: 1 - crescimento independente de hormônios, 2 - síntese de opinas (compostos de carbono e N

dos quais a bactéria se alimenta


Transferência de DNA da Agrobacterium


AGROBACTERIUM

Método bastante conhecido e estudado

Eficiente

Plantas com limitado número de transgenes

Vantagens

AGROBACTERIUM

Genótipo-específico (planta-bactéria)

Monocot X Dicot

Dependência do sistema de regeneração

Desvantagens

MÉTODOS DE TRANSFERÊNCIA DIRETA

PROTOPLASTO

Eletroporação

Transferência de DNA via química

Microinjeção

ELETROPORAÇÃO

Bio-Rad®

Vantagens

Rápido e eficiente

Grande controle das condições experimentais

Desvantagens

Necessidade de protoplastos

Custo equipamento


MICROINJEÇÃO



Parede Celular Intacta

Vácuo

Biobalística

Vortex (fibras)

Sonicação

Embebição de sementes

Eletroforese

Infiltração de DNA à vácuo

Antes Depois

Tubo de aceleraçãoDisco de ruptura

MacrocarrierPartículas + DNA

Tela

Tecido vegetal

BIOBALÍSTICA

PDS-1000/HeBio-Rad

Parâmetros Físicos

Velocidade das partículas

Tipo de partícula

Propelente e vácuo

Precipitação do DNA

Parâmetros Biológicos

Fisiologia do explante

Tamanho e densidade das células

Parede celular

Osmolaridade

VantagensDiversos protocolos de cultura de tecidos

Não exige vetores especializadosTransformação de organelas

Rapidez e simplicidade

DesvantagensEquipamento especializado

Integração múltipla de transgenesVariabilidade do processo

Agrobacterium65%

Biolística21%

Outros7%Peg + Eletrop.

7%

Métodos utilizados para transformação

Seleção de Plantas Transgênicas

GENES MARCADORES E INDICADORES

-GlucuronidaseLuciferaseGFPAntocianina

NPT IIbar - glufosinatoBXN - bromoxinilEPSPS - glifosatoALS - sulfonilureias, imidazolinonas

Indicadores

Marcadores

Identificação e seleção de explantes

Genes indicadores

gus A- glucuronidase

gfpproteína de

fluorescência verde

Imidazolinonas - AHAS

Genes marcadores

Glifosato - EPSPS

Genes marcadores

Crescimento e enraizamento

Transferência para solo em condições controladas

Explantes em meio seletivo

Aclimatação

Casa-de-vegetação

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