IntroduoComo as clulas so pequenas e complexas, difcil ver sua estrutura, descobrir sua composio molecular e, ainda mais difcil, descobrir como seus vrios componentes funcionam. As ferramentas a nossa disposio determinam o que podemos aprender sobre as clulas, e a introduo de novas tcnicas frequentemente tem resultado em maiores avanos na biologia celular. Parar compreender a biologia celular contempornea necessrio conhecer parte de seus mtodos.Visualizao de clulas ao microscpio pticoUma limitao fundamental de todos os microscpios que certo tipo de radiao no pode ser utilizado para examinar detalhes estruturais muito menores do que o seu prprio comprimento de onda. O limite fundamental para a resoluo de um microscpio ptico , portanto, estabelecido pelo comprimento da onda de luz visvel, que varia cerca de 0,4 m (para violeta) at 0,7 m (para vermelho-escuro). Em termos prticos, as bactrias e as mitocndrias, que tem cerca de 500 nm (0,5 m) de largura, geralmente so os menores objetos dos quais o formato pode ser claramente discernido ao microscpio ptico; detalhes menores do que esses so ocultados pelos efeitos resultantes da natureza da onda da luz.O limite de separao pelo qual dois objetos ainda podem ser vistos como distintos, depende tanto do comprimento de onda da luz quanto da abertura numerica do sistema de lentes utilizado. Quanto maior a abertura do microscpio, mais claramente o objeto pode ser visualizado. Com luz violeta e uma abertura numrica de 1,4 o microscpio ptico pode alcanar, um limite de resoluo logo abaixo de 0,2 m. Embora seja possvel aumentar uma imagem o quanto quisermos, jamais ser possvel distinguir dois objetos ao microscpio ptico que esto separados por menos de m, eles aparecero como um nico objeto. As clulas vivas so vistas claramente em um microscpio de contraste de fase ou em um microscpio de contraste de interferncia diferencial. A nica maneira de evitar que alguns componentes da celular sejam perdidos ou alterados durante a preparao da amostra, examina-las enquanto esto vivas, sem fixa-las ou congela-las. Para isso, os microscpios pticos com sistemas pticos especiais so especialmente uteis. O microscpio de contraste de fase e o microscpio de contraste de inferncia diferencial, exploram os efeitos de interferncia produzidos quando esses dois conjuntos de ondas se recombinam, criando uma imagem da estrutura da celular. No microscpio de campo escuro, os raios de luz que iluminam so direcionados pela lateral, de forma que somente a luz difundida passe pelas lentes do microscpio. A clula aparece como um objeto iluminado contra o fundo escuro. Com um microscpio normal de campo claro, a luz que passa atravs de uma clula em cultura, forma a imagem diretamente. As microscopias de contraste de fase, de contraste de interferncia diferencial e de campo escuro tornaram possvel visualizar os movimentos envolvidos em processos como a mitose e a migrao celular. Os sistemas eletrnicos, ou digitais, de imagem e a tecnologia de processamento de imagens associada tiveram um maior impacto na microscopia ptica. Algumas limitaes prticas dos microscpios foram em grande parte superadas. Os sistemas de imagem eletrnica tambm contornaram duas limitaes fundamentais do olho humano: o olho no pode ver bem com luminosidade muito diminuda e no pode perceber pequenas diferenas de intensidade de luz contra um fundo luminoso. Para aumentar nossa capacidade de observar clulas em condies de baixa luminosidade, podemos acoplar uma cmara digital sensvel a um microscpio, ento possvel observar as clulas por longos perodos a nveis muito baixos de luminosidade. Como as imagens produzidas por cmaras esto na forma eletrnica, elas podem ser prontamente digitalizadas, transferidas para um computador e processadas de varias maneiras para extrair informaes. O processamento da imagem digital pode superar as limitaes dos olhos. Como a maioria das amostrar de tecido muito espessa para que suas clulas individuais sejam examinadas, elas precisam ser cortadas em fatias transparente muito finas. Para imobilizar, matar e preservar as clulas no tecido elas devem ser tratadas com um fixador, que formam ligaes covalentes com os grupos amino livres das protenas, de modo que sejam estabilizados e imobilizados na posio.Como os tecidos so macios e frgeis, necessitam ser envolvidos em um meio de suporte antes de serem seccionados. Os meios comuns de emblocamento so ceras ou resinas. Ento podem ser endurecidos e seccionados. Depois disso, para impedir a passagem dos feixes de luz, existem trs abordagens principais para trabalhar com as seces.Primeiro, as seces podem ser coradas com corantes orgnicos que tem alguma afinidade especifica por determinados componentes subcelulares. Segundo, tecidos seccionados podem ser utilizados para visualizar padres especficos de expresso genica diferencial. E terceiro, um mtodo utilizado para localizar protenas de interesse, que podem ser localizadas nas clulas por microscopia de fluorescncia. Os corantes fluorescentes utilizados para corar as clulas so detectados por um microscpio de fluorescncia, que semelhante a um microscpio ptico comum, exceto que a luz utilizada para iluminao, passa atravs de dois conjuntos de filtros. O primeiro filtro permite apenas a passagem de comprimentos de onda de excitem um determinado corante fluorescente, j o segundo bloqueia a passagem desta luz, permitindo somente a passagem daqueles comprimentos de onda emitidos quando o corante fluoresce. Os anticorpos, quando marcados com corantes fluorescentes, tem um valor inestimvel para localizar molculas com partculas eletrodensas. Quando utilizamos anticorpos como sondas para detectar e verificar molculas especficas nas clulas, frequentemente aumentamos o sinal fluorescente que eles produzem por mtodos qumicos. O microscpio confocal alcana um resultado similar aquele da deconvoluo, mas o faz pela manipulao da luz antes de ela ser medida; desta maneira, uma tcnica anloga, em vez de digital. Os detalhes pticos do microscpio confocal so complexos, mas a ideia bsica simples, e os resultados so superiores aqueles obtidos por microscopia ptica convencional. O microscpio geralmente utilizado com ptica de fluorescncia, mas em vez de iluminar toda a amostra de uma vez, da maneira usual, o sistema ptico focaliza a qualquer instante um ponto de luz sobre um nico ponto da amostra, a uma profundidade especifica. O microscpio confocal tem sido utilizado para resolver a estrutura de inmeros objetos tridimensionais complexos, como as redes de fibras citoesquelticas no citoplasma e os arranjos de cromossomos e de genes no ncleo. Uma maneira para estudar a qumica de uma nica clula viva inserir a ponta de vidro de um microeltrodo sensvel a ons diretamente no interior da celular, atravs da membrana plasmtica. Essa tcnica utilizada para medir concentraes intracelulares de ons inorgnicos comuns. Em um microscpio TIRF, a luz do laser incide sobre a superfcie da cobertura de vidro no angulo critico preciso no qual a reflexo interna total ocorre. Por causa dessa reflexo, a luz no penetra a amostra, e por isso, a maioria das molculas fluorescentes no iluminada. Entretanto, apenas aquelas molculas na camada mais prxima a superfcie tornam-se excitadas. Quando essas molculas fluorescem, sua luz emitida no esta mais competindo com a luz fora de foco das molculas que esto acima, podendo ento ser detectadas.

Quatro tipos de microscopia ptica. Quatro imagens da mesma clulas de fibroblasto em cultura. Todas as imagens podem ser obtidas com os mais modernos microscpios pela troca dos componentes pticos. (A) Microscopia de campo claro. (B) Microscopia de contraste de fase. (C) Microscopia de constraste de interferncia diferencial de Nomarski. (D) Microscopia de campo escuro.

Imunofluorescncia. (A) Uma micrografia eletrnica de transmisso da periferia de clulas epiteliais em cultura, mostrando a distribuio dos microtbulos e de outros filamentos. (B) A mesma rea corada com anticorpos fluorescentes contra tubulina, a protena que se monta para formar os microtbulos, utilizando a tcnica de imunocitoqumica indireta.

Comparao da microscopia de fluorescncia convencional com a microscopia de fluorescncia confocal. (A) A imagem convencional no-processada borrada pela presena de estruturas fluorescentes acima e abaixo do plano de foco. (B) Na imagem confocal, essa informao fora de foco removida, resultando em uma seco ptica ntida das clulas no embrio.

Visualizao de clulas ao microscpio eletrnicoA microscopia ptica limitada na fineza dos detalhes que ela pode revelar. Microscpios que utilizam outros tipos de radiao podem resolver estruturas muito menores do que as possveis com luz visvel. Essa resoluo mais alta tem um custo: a preparao da amostra para microscopia eletrnica muito mais complexa e muito mais difcil de ter certeza de que a imagem visualizada corresponde precisamente a estrutura real sendo examinada. Entretanto, possvel usar um congelamento muito rpido para preservar fielmente estruturas para microscopia eletrnica. O microscpio eletrnico de transmisso semelhante a um microscpio ptico, embora seja muito maior e "invertido". A fonte de iluminao um filamento ou ctodo que emite eltrons do topo de uma coluna cilndrica de cerca de 2 m de altura. Como os eltrons so espalhados por colises com molculas de ar, o ar precisa primeiro ser bombeado para fora da coluna para criar vcuo. A amostra colocada no vcuo, por meio de uma cmara de compresso, na trajetria do feixe de eltrons. Como na miscrocopia ptica, a amostra em geral corada. Alguns dos eltrons que atravessam a amostra so espalhados pelas estruturas coradas com material eletrodenso; o restante focado para formar uma imagem de uma maneira anloga ao processo de formao de uma imagem no microscpio ptico. A imagem pode ser observada em uma tela fosforescente ou grava tanto em uma placa fotogrfica como em uma cmera digital de alta resoluo. O contraste no microscpio eletrnico depende do numero atmico dos tomos na amostra: quanto mais alto numero atmico, mais eltrons espalhados e maior o contraste. O Microscpio eletrnico de varredura, produz diretamente uma imagem da estrutura tridimensional da superfcie de uma amostra. Normalmente um aparelho menor, mais simples e mais barato do que um microscpio eletrnico de transmisso. Ele utiliza os eltrons que so espalhados ou emitidos a partir da superfcie da amostra. A amostra a ser examinada fixada, desidratada e coberta com uma camada fina de metal pesado. Ela pode ser congelada rapidamente e ento transferida para um estgio resfriado da amostra, para exame direto no microscpio.

O microscpio eletrnico resolve a estrutura fina da clula. Esta seco fina de uma clula de levedura que foi rapidamente congelada e teve seu gelo vtreo substitudo por solventes orgnicos e ento por resina plstica. Ncleo, mitocndrias, parede celular, pilhas de Golgi e ribossomos podem ser todos prontamente visualizados em um estado que provavelmente seja o mais parecido possvel com o real.

Microscopia eletrnica de varredura. (A) Uma micrografia eletrnica de varredura dos estereoclios que se projetam de uma clula ciliada do ouvido interno de um sapo-boi. Para comparao, a mesma estrutura mostrada em (B) por microscopia ptica de contraste de interferncia diferencial e em (C) por microscopia eletrnica de transmisso a partir de seces finas.CitoqumicaUsado para identificar diferentes compostos qumicos das clulas. Reaes qumicas ajudam a mostrar estruturas intracelulares com coloraes especficas. Podem ser usadas amostras frescas. Pode ser aplicada em nvel de microscopia ptica e de microscopia eletrnica. No primeiro, o produto da reao citoqumica deve ser corado e no segundo, deve dispersar eltrons. Os mtodos citoqumicos tm por base reaes qumicas especficas, ou a interao macromolecular de alta afinidade. Nos dois casos, o resultado final usualmente, a produo de compostos insolveis, corados, ou eltron-densos, que possibilitam a localizao de substncias especficas nos cortes de tecidos atravs do uso do microscpio ptico ou eletrnico. Algumas reaes qumicas so:Azul da Prssia - Identificao de ferroPeroxidase - Deteco da enzima mieloperoxidaseSudan Black B - Revelao de lipdioscido reativo de Schiff (PAS) - Evidenciao de carboidratosFostatase Acalina - Neutrfilos maduros, osso, fgado, rins, placenta. Ajuda a determinar a atividade da clula.CentrifugaoAs tcnicas que permitem o fracionamento celular e a obteno de fraes relativamente puras de organelas contriburam muito para o desenvolvimento da biologia celular. As organelas so separadas pela centrifugao de um homogeneizado de clulas em que as membranas plasmticas so rompidas e os constituintes celulares dispersos em um meio lquido, geralmente contendo sacarose (este glicdio muito utilizado porque mantm a integridade dos componentes celulares e evita a tendncia de as organelas aglutinarem-se quando as clulas se rompem). O isolamento de uma organela atravs de centrifugao depende de seu coeficiente de sedimentao, isto , do seu tamanho, forma e densidade, bem como da densidade e a viscosidade da soluo em que est sendo centrifugada. A centrifugao fracionada consiste em uma srie de centrifugaes a velocidades crescentes. As organelas ou incluses maiores e mais densas sedimentam primeiro, o sobrenadante de cada centrifugao centrifugado de novo, porm em maior velocidade. Desse modo, os componentes celulares vo sendo sucessivamente separados. Em geral o sobrenadante que permanece aps a ltima centrifugao denominado frao solvel. Na centrifugao contragradiente as partculas so separadas por suas diferenas de densidade. O gradiente consiste em uma soluo cuja concentrao mxima na parte profunda do tubo de centrifugao e mnima na superfcie, apresentando um aumento gradual de concentrao de cima para baixo. Sobre esse gradiente estabilizado coloca-se o homogeneizado celular e faz-se a centrifugao. As partculas migram em direo centrfuga e param onde ocorre um equilbrio entre a ao da fora centrfuga e a tendncia de flutuao da partcula. Tais etapas e tcnicas so realizadas em baixas temperaturas, para impedir que os sistemas enzimticos funcionem, o que lesaria as organelas durante sua separao.Romatografia em colunaAs protenas e os cidos nuclicos isolados das clulas so frequentemente separados por esta tcnica. Ela baseia-se no fato de que, quando se faz uma mistura de protenas dissolvidas em gua passar por uma coluna constituda por uma matriz slida e porosa, contida num tubo de vidro, a velocidade de migrao das diferentes protenas varia conforme a interao de cada uma delas com a matriz. Mandando-se um fluxo contnuo de protenas, que sai pela parte inferior da coluna, pode-se coletar separadamente as protenas contidas na amostra inicial. A tcnica muito usada para purificao de anticorpos. AutoradiografiaPode ser aplicada como uma tcnica citoqumica para a deteco de istopos radioativos no interior do tecido. Baseia-se na sensibilidade das emulses fotogrficas s radiaes ionizantes. Como no existem tomos radioativos nas clulas, pode-se seguir a incorporao e a migrao de compostos radioativos introduzidos nas clulas com finalidades experimentais.Eletroforese em gelEssa tcnica tem diversas variantes para esclarecer diversos problemas. Uma delas para determinar o tamanho das molculas proteicas. Colocando a mistura de protenas sobre o gel e subtendo a um campo eltrico, faz com que todas as molculas migram na direo do plo positivo. A velocidade dessa migrao depender exclusivamente do tamanho da molcula de cada cadeia polipeptdica.

ConclusoVrias tcnicas de microscopia esto disponveis para observar as clulas e cada uma tem um propsito diferente. Essas tcnicas contribuem muito para o conhecimento sobre elas, mas as que foram citadas so apenas algumas das utilizadas. Atualmente existem tcnicas disponveis para detectar, medir e seguir quase que qualquer molcula em uma clula viva, ajudando cada vez mais o estudo das mesmas.

Referncias:ALBERTS, Bruce. Biologia Molecular da Clula. 5 Ed. Artmed, 2010.Em: