MÉTODOS PARA QUANTIFICAÇÃO DA BIOMASSA microbiana do solo

5/8/2018 MÉTODOS PARA QUANTIFICAÇÃO DA BIOMASSA microbiana do solo - slidepdf.com

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Agropecuária Técnica, v.25, n.1, p.1-12, 2004

Agropecuária Técnica, v. 25, n.1, 2004

ISSN 0100-7467 - Areia, PB, CCA/UFPB

MÉTODOS PARA QUANTIFICAÇÃO DA BIOMASSAMICROBIANA DO SOLO

MARINICE O. CARDOSO1

1Doutoranda em Agronomia do CCA/UFPB, Campus II, Areia � PB, CEP: 58397-000

RESUMO

A biomassa microbiana do solo (BMS) é o principal componente do subsistema de decompositores, que regula

a ciclagem de nutrientes, o fluxo de energia, a produtividade das plantas e dos ecossistemas. Portanto, sua

quantificação é de grande importância para estudos sobre a melhoria ou perda da qualidade do solo. Para quantificação

da BMS muitas e diversificadas técnicas foram criadas. Nos métodos pioneiros contavam-se células microbianas

pela observação direta de lâminas de solo ao microscópio. Foram introduzidas, posteriormente, melhorias como o

uso de corantes vitais e o cálculo da biomassa através do biovolume celular e da densidade média das estruturas

vivas. Outros métodos, baseados na extração e determinação de algum componente celular específico (ácido

murâmico para bactérias, quitina para fungos e ATP para a biomassa total, entre outros) surgiram em grande

número. Entretanto, atualmente, os métodos da respiração induzida pelo substrato, da fumigação-incubação e dafumigação-extração são os mais utilizados para a quantificação da BMS. Nesta revisão, os principais métodos são

apresentados e discutidos quanto à utilidade e confiabilidade.

Palavras-chave: microscopia direta, constituintes celulares, respiração induzida, fumigação-incubação, fumigação-extração

METHODS FOR QUANTIFYING SOIL MICROBIAL BIOMASS

ABSTRACT

Soil microbial biomass (SMB) is the main component of the decomposers subsystem that regulates nutrient

cycling, energy flow, and productivity of plants and ecosystems. Thus, its quantification is of great importance for

studies aiming to improve or to prevent loss of quality of soils. SMB quantification can be performed by many and

diverse techniques. In the early methods, microbial cells were counted through direct observation of soil smear

(soil samples spread on a microscope slide), under optical microscopy. Lately, improvements were introduced by

using vital stains and subsequent calculation of biomass from cell biovolume and average density of living structures

Other methods based on extraction and determination of specific cell constituents (muramic acid of bacteria, chitin

of fungi, and ATP of total biomass, among others), appeared to a large extent. However, the current methods of

substrate-induced respiration, and fumigation-incubation and fumigation-extraction, are the most utilized methods

for quantifying SMB. In the present review, the main methods are presented and discussed with respect to their

usefulness and reliability.

Key words: direct microscopy, cellular constituents, induced respiration, fumigation-incubation, fumigation-extraction

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA




2 M. O. CARDOSO

INTRODUÇÃO

A biomassa microbiana do solo (BMS) compreende

a parte viva da matéria orgânica do solo, excluídas as

raízes e organismos maiores do que 5 x 10 3 µm3,

contendo, em média, 2 a 5% do carbono orgânico e 1 a

5% do nitrogênio total do solo (Cerri et al., 1992; De-

Polli e Guerra, 1999). Operacionalmente, a BMS atua

como agente de transformação da matéria orgânica, na

ciclagem de nutrientes e no fluxo de energia (Wardle e

Giller, 1996; Marchiori Júnior e Melo, 1999). A dupla

função da BMS, de fonte/dreno de nutrientes e de

catalisador pela execução de processos enzimáticos no

solo, é amplamente aceita (Duxbury et al., 1989; Templer

et al., 2003). A BMS compreende uma fonte potencial

de N, P, S e outros nutrientes para as plantas, e os fluxos

através do reservatório microbiano podem ser departicular relevância no solo (De-Polli e Guerra, 1999;

Kouno et al., 2002). Através da rápida imobilização de

nutrientes, que pode reduzir a disponibilidade de

nutrientes para as plantas, a BMS funciona como dreno

competitivo (Duxbury et al., 1989).

Constituindo a maior parte da fração ativa da matéria

orgânica, a BMS pode ser enquadrada como o

compartimento central do ciclo do carbono, sendo mais

sensível que o resultado quantitativo do C orgânico e do

N total para aferir alterações na matéria orgânica do

solo (Gama-Rodrigues, 1999). A relação Cmicrorganismos :C

orgânicototal do solo aumenta e diminui rapidamente

conforme ocorram elevação ou redução da matéria

orgânica do solo num sistema ecológico, e a constância

dessa relação indica o novo equilíbrio desse sistema

(Anderson e Domsch, 1989). O estudo quantitativo da

BMS é de fundamental importância para o estudo da

extensão dos processos no solo em que atua, bem como

para monitoramento e aplicação de modelagens (Leal e

De-Polli, 1999; Turner et al., 2001; Wang et al., 2003).

Como parâmetro ecológico, a avaliação da BMS permite

obter informações rápidas sobre mudanças nas

propriedades orgânicas do solo, detectar mudanças

causadas por cultivos ou por devastação de florestas,

medir regeneração dos solos após a remoção da camada

superficial, e avaliar os efeitos dos poluentes como

metais pesados e pesticidas entre outros (Frighetto,

2000).

Até o início da década de 90, os trabalhos sobre BMS

tratavam, principalmente, de ajustes metodológicos

(Gama-Rodrigues, 1999). Neste sentido, deve-se

distinguir a biomassa de sua atividade (Siqueira et al.,

1994), visto que a BMS não é uma estimativa da

atividade dos microrganismos do solo, mas da massa

microbiana viva total do solo, com base na concentração

de algum elemento ou de alguma substância celular,

considerando-se a população microbiana como umaentidade única (De-Polli e Guerra, 1999). Ressalva-se

que as atividades de algumas enzimas podem ser

relacionadas com a BMS e são auxiliares na

interpretação da condição funcional da BMS total ou de

algum compartimento (Marchiori Júnior e Melo, 1999;

Taylor et al., 2002; Matsuoka et al., 2003).

As possibilidades metodológicas existentes para

avaliação da BMS são várias e contemplam diferentes

abordagens. Alguns métodos bastante utilizados têm sua

confiabilidade questionada, porque sofrem influência das

condições experimentais (Rodrigues et al., 1994;Gonçalves et al., 2002). Neste trabalho, foi realizada

uma revisão de literatura sobre esses métodos, que são

discutidos quanto aos vários aspectos de sua utilidade e

limitações.

Antecedentes

O aumento do interesse em microrganismos de solo

e, paralelamente, a necessidade de isolamento,

identificação e enumeração desses agentes

transformadores da matéria orgânica do solo, resultaram

na criação e diversificação de muitas técnicas.Inicialmente, as investigações em bacteriologia de solo

foram realizadas com métodos desenvolvidos em

bacteriologia médica: amostras de solo eram diluídas com

água esterilizada, disseminadas em placas com gelatina

e, após incubação, determinava-se o número de bactérias

(Grisi, 1984).

Posteriormente, foi introduzido o método de diluição

em placas para contagem de bactérias do solo. Nessa

técnica, diluições da amostra do solo são adicionadas a

tubos contendo meio liquefeito e resfriado, e

posteriormente o conteúdo desses tubos é distribuídoem placas de Petri, e a partir do número de colônias

desenvolvidas na placa, é calculado o número de

organismos vivos por grama de solo (Jackson e Raw,

1975; Pelczar Jr. et al., 1996; Melloni et al., 2001). Em

seguida, por adaptação, foi introduzida a técnica de

plaqueamento para isolamento de fungos de solo

(Jackson e Raw, 1975; Grisi, 1984). O método de

plaqueamento por gotas é recomendado por Jahnel et

al. (1999) para determinação do número mais provável

de fungos e bactérias do solo.



3

O desenvolvimento de técnicas microscópicas paraexame de microrganismos provenientes de amostras dosambientes naturais ocorreu no início do século XX. Osprimeiros métodos utilizados consistiam na contagem donúmero de células microbianas pela observação diretade lâminas de solo ao microscópio, sendo introduzidodepois o uso de corantes vitais, bem como o cálculo dabiomassa através da determinação dos volumes celularese da densidade média das estruturas vivas (Grisi, 1984;Grisi e Gray, 1985).

Na impossibilidade da obtenção de uma medidaquantitativa exata da população microbiana total em umecossistema, por métodos culturais ou por meio da

observação microscópica direta, foram desenvolvidas

outras técnicas capazes de avaliar a massa dos

microrganismos, ou seja, a BMS (Pelczar et al., 1980;

Haubensak et al., 2002).

Métodos para quantificação da biomassa

microbiana

Os métodos da microscopia direta, do trifosfato de

adenosina, da respiração induzida pelo substrato, da

fumigação-incubação e da fumigação-extração são os

mais utilizados para quantificação da BMS, destacando-

se os dois últimos. Convém mencionar a técnica de análise

de PLFAs (phospholipid fatty acids) totais extraídos para

estimar a BMS, que tem gerado valores proporcionais

aos obtidos por outros métodos (Fritze et al., 2000; Bailey

et al., 2002; Fierer et al., 2003). Os métodos de extração

dos componentes celulares baseiam-se no fato de que a

célula microbiana quiescente mantém as seguintes

relações, segundo Paul e Clark (1989): ATP: C: N: P: S,

respectivamente, 1: 250: 40: 9: 2,6.

- Microscopia direta

No exame microscópico direto, uma diluição da

amostra do solo é espalhada em camada fina sobre uma

lâmina de vidro, e após fixação e coloração do esfregaço,os microrganismos podem ser contados pelo exame

microscópico (Pelczar Jr. et al., 1996). Como o princípio

básico da metodologia é estimar a biomassa microbiana

através do biovolume dos microrganismos, há

necessidade da estimativa da densidade específica e do

conteúdo de umidade dos microrganismos, para

conversão de biovolume a biomassa (Alexander, 1977;

Grisi e Gray, 1985; De-Polli e Guerra, 1999). Embora

esse método possa ser utilizado para estimar a população

microbiana total, técnicas de colorações especiais são

necessárias para discriminar microrganismos vivos de

mortos, bem como muitas vezes é difícil distinguir

partículas microscópicas do solo de células microbianas

(Casida, 1976; Grisi e Gray, 1985; Scheu e Parkinson

1994). Na microscopia direta, os microrganismos podemser corados por várias formas e observados por

diferentes técnicas ópticas (Casida, 1971). Para solos

bem drenados, este método é freqüentemente utilizado

como padrão, sendo a expectativa geral de que todos os

demais métodos apresentem boa correlação com o

mesmo (Seganfredo, 1999).

- Método do trifosfato de adenosina (ATP)

Este método inclui-se num grupo de métodos que se

baseia, para estimar a BMS, na extração e determinação

de constituintes celulares específicos de microrganismos,como por exemplo, o ácido murâmico, a quitina, a

clorofila, ácidos nucléicos e outros, bem como, no caso

o trifosfato de adenosina (Grisi, 1984). A técnica do ATP

vem sendo utilizada para estimar a BMS (Tate e

Jenkinson, 1982), em razão de algumas características

favoráveis deste constituinte celular: é degradado

rapidamente após a morte das células dos

microrganismos, facilitando a separação entre

microrganismos vivos e mortos, além de não ser

confundido com as moléculas de ATP provenientes de

fragmentos de raízes; está presente nas diferentes célulasmicrobianas (bactérias, fungos, algas e protozoários); e,

a sua concentração nas células é razoavelmente

uniforme em relação à concentração de carbono celular

(De-Polli e Guerra, 1999), apontada como sendo de 1:

250 (Paul e Clark, 1989). O método está fundamentado

no princípio de que o ATP pode ser quantificado através

do sistema enzimático luciferina-luciferase (Oades e

Jenkinson, 1979), tendo sido melhorado por Tate e

Jenkinson (1982). O ATP oriundo das células vivas é

extraído com solução de H2SO

40,3 mol L-1, ou outros

extratores com eficiências de recuperação variáveis, e

a emissão luminosa do material, na presença do sistemaenzimático, é medida através de fotômetros comerciais

disponíveis para esta situação, sendo a quantidade de

luz emitida proporcional à concentração de ATP noextrato (De-Polli e Guerra, 1999).

- Respiração induzida pelo substrato ou fisiologia

da taxa de respiração

Esse método, proposto por Anderson e Domsch

(1978), é baseado no aumento inicial da taxa de

MÉTODOS PARA QUANTIFICAÇÃO DA BIOMASSA MICROBIANA DO SOLO




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respiração da população microbiana, até um máximo,

quando uma fonte de carbono, prontamente

decomponível, é adicionada em excesso ao solo. A fonte

usual é a glicose porque a maioria dos microrganismos

pode utilizá-la imediatamente como fonte de carbono(Grisi, 1984; Lin e Brookes, 1999). O aumento da taxa

respiratória (liberação de CO2), antes que o crescimento

microbiano ocorra, é acompanhado por algumas horas,

realizando-se em seguida, a conversão para a biomassa.

Entretanto, há necessidade de calibração, com um

método padrão, para a determinação da biomassa

(Anderson e Domsch, 1978). Originalmente, o flush de

CO2, gerado durante um período de incubação

predeterminado, foi correlacionado com a BMS, mas a

equação obtida é válida somente nas condições de

proposição, isto é, mineralização entre 0,35 e 6,5 ml de

CO2

100 g de solo-1 h-1 e temperatura de 22 ± 0,5oC(Anderson e Domsch, 1978). Alternativamente à

proposta original, o uso da glicose sólida foi substituído

por solução de glicose e o analisador de gás para medir

o CO2

respirado por cromatógrafo a gás (Sparling e

West, 1988; Lin e Brookes, 1999) ou respirômetro

automatizado a partir de microcompensação de O2

eletrolítico (Tiunov e Scheu, 2000). Este método facilita

de modo particular a avaliação do quociente metabólico

ou taxa de respiração específica, que permite verificar

o estado de equilíbrio do solo (Wardle, 1994; Mercante,

2001). O quociente metabólico microbiano (qCO2) écalculado como a razão da respiração microbiana em

relação à biomassa, ou seja, como a quantidade de C-

CO2produzido por unidade de C da biomassa microbiana

(Thirukkumaran e Parkinson, 2000; Tiunov e Scheu,

2000; Mercante, 2001).

De acordo com Wardle (1994) é esperado que

apenas os microrganismos ativos respondam à adição

de glicose, que é justamente o componente de maior

interesse para os microbiologistas do solo, pois é esse

componente que está reciclando ativamente os nutrientes

e é responsável pela decomposição dos restos culturais.Por esta razão, esse método pode ser extremamente

útil como medida relativa da biomassa microbiana. A

quantidade de glicose requerida para ativar a máxima

taxa respiratória inicial varia grandemente, dependendo

das propriedades físicas e químicas dos solos, devendo

ser determinada para cada tipo de solo (Lin e Brookes,

1999; Fisk et al., 2003). Um grave erro técnico quanto a

este método é a realização de medidas de taxas derespiração após o crescimento microbiano, devendo-se

atentar para o fato de que há variações na resposta à

adição da glicose em diferentes solos, visto que em alguns

ocorre um aumento rápido na respiração, enquanto em

outros verifica-se inicialmente uma queda e depois uma

elevação da respiração (Anderson e Domsch, 1978; Lin

e Brookes, 1999).

- Fumigação-incubação

O método de fumigação-incubação se fundamenta

na ocorrência dos seguintes eventos: interrupção da

atividade microbiana de uma dada amostra de solo pela

fumigação com clorofórmio (CHCl3), livre de álcool, que

provoca o rompimento da célula, seguido por um pico

de CO2, devido à decomposição dos organismos mortos

pelos sobreviventes à fumigação, ou pelas novas

populações a partir de um inóculo de solo fresco

introduzido na amostra fumigada (Jenkinson, 1966).Os procedimentos envolvem a medida da emanação

de CO2

devido à decomposição da população microbiana

na amostra fumigada, e em uma amostra testemunha,

não-fumigada (Rodrigues et al., 1994). A biomassa,

representada pelo carbono microbiano, pode ser

estimada pela relação B = CI

/ kCI

, onde CI

= C-CO2

liberado do solo fumigado no período de 10 dias de

incubação menos o C-CO2liberado do solo testemunha

(Pfenning et al., 1992; Wang et al., 2003). Este termo

(kC1

) corresponde ao fator de mineralização do C, isto

é, à proporção de carbono microbiano liberado na formade CO2

nos 10 dias de incubação, e é de 0,41 à

temperatura de 22oC e 0,45 a 25oC (Anderson e Domsch,

1978; Siqueira et al., 1994).

No método de fumigação-incubação, o fator kC1

não

é precisamente o mesmo para todos os solos (Stevenson

e Elliott, 1989), e no caso de solos muito diferentes

daqueles utilizados na determinação dos valores de kC1

tradicionalmente usados, ele deverá ser determinado para

cada tipo de solo (Wardle, 1994). Entretanto, um fator

médio de 0,41 foi proposto para amostras de alguns solos

no Brasil, visto que o mesmo tende a ser mais baixo em

solos ácidos e de textura argilosa das zonas tropicais

(Sampaio et al., 1986; De-Polli e Guerra, 1999). A

respeito do fator de correção, Voroney e Paul (1984)

estudaram sua determinação �in situ� para calibração

desse método. Os procedimentos sobre o método de

fumigação-incubação encontram-se descritos

detalhadamente em De-Polli e Guerra (1999) e

Matsuoka et al. (2003).

Brookes et al. (1985) e Stevenson e Elliott (1989)

explicam a determinação do N da BMS pelo método de

M. O. CARDOSO




5

fumigação-incubação e afirmam que o maior problema

para sua estimativa é a desnitrificação ou imobilização

poder alterar as quantidades de N calculadas para as

formas solúveis após a incubação. Portanto, é mais

conveniente mensurar o N da BMS pela fumigação-extração 24 horas após a fumigação (Brookes et al.,

1985).

- Fumigação-extração

� Carbono da biomassa microbiana

Como alternativa promissora à técnica de fumigação-

incubação, Vance et al. (1987a) propuseram a

substituição da incubação por uma extração do carbono

da biomassa, que é igualmente liberado pela ação do

agente fumigante clorofórmio. Segundo esses autores,a biomassa microbiana é proporcional ao aumento de

carbono orgânico que se torna extraível do solo após

uma fumigação. Convém ressaltar que a correção da

umidade do solo para 40% da sua capacidade de

saturação é parte do procedimento metodológico, quando

da preparação das amostras de solo para fumigação

(Grisi, 1997), o que é adotado também no método de

fumigação-incubação, antes comentado. A fumigação

do solo com o clorofórmio, além de matar, rompe as

células microbianas liberando o constituinte microbiano

para o solo e permitindo assim sua extração (Frighetto,

2000). O carbono representa cerca de 47% do peso

seco da célula microbiana.

Em termos de procedimento, a amostra é dividida

em subamostras que sofrerão extração imediata (o

controle, sem fumigação) ou fumigação seguida de

extração. O extrato da amostra não-fumigada contém

somente a matéria orgânica extracelular e o extrato

fumigado contém ambos, matéria orgânica intracelular

(biomassa) e matéria orgânica extracelular (Hofman e

Dusek, 2003). O material celular liberado pelo

rompimento das células microbianas é recuperado com

um extrator fraco como o K2SO

40,5 M (Tate et al.,

1988) logo após a fumigação, eliminando-se os dez dias

de incubação do método anterior; e a determinação do

carbono nos extratos fumigado e não-fumigado é feita

por dicromatometria a partir da retirada de uma alíquota

do extrato (Vance et al., 1987a; De-Polli e Guerra, 1999).

Numa modificação do procedimento de fumigação-

extração originalmente proposto, o analisador de carbono

Dohrman DC-180 é utilizado para quantificação do C

extraído (Wu et al., 1990; Aoyama et al., 2000;

Hargreaves et al., 2003), ou o analisador de C solúve

Shimadzu TOC-5000A (Bailey et al., 2002; Zimmermann

e Frey, 2002).

A biomassa, representada pelo carbono microbiano

pode ser estimada pela relação B = CE x 2,64 ouB = C

E / 0,38, onde C

Erepresenta o carbono extraído

do solo fumigado menos o carbono extraído do solo

controle (Pfenning et al., 1992), sendo 2,64 ou 0,38, o

fator kCE

para conversão do carbono extraído em

biomassa microbiana (Vance et al., 1987b). Este último

valor de kCE

encontra-se no intervalo proposto (0,33 ±

0,08) por Sparling e West (1988) para solos minerais

com baixo pH e menos de 10% de carbono orgânico

recomendação correntemente utilizada (Tate et al.

1988), inclusive em solos do Brasil para os quais o fator

kCE não foi determinado (De-Polli e Guerra, 1999).Os procedimentos para execução da técnica de

fumigação-extração foram explicados detalhadamente

por De-Polli e Guerra (1999) e Frighetto (2000). Naetapa de fumigação, Ferreira et al. (1999) utilizaram airradiação do forno de microondas em substituição aoclorofórmio, e concluíram que a irradiação durante doisminutos foi suficiente para estimar o C, e também o Npresente na biomassa microbiana nos procedimentos de

incubação e extração. Na fase de pré-condicionamentopara estimar o C e o N da BMS, Roy e Sing (2003)deixaram as amostras de solo com a umidade do campo

em um recipiente fechado com 100% de umidade, ecom o CO

2removido, por sete dias em temperatura

ambiente, sendo o mesmo aberto diariamente por alguns

minutos para aeração.

� Nitrogênio, fósforo e enxofre da biomassa

microbiana do solo

Os métodos de quantificação da BMS geralmentebaseiam-se na estimativa do C microbiano, pela maiorfacilidade na quantificação devido ao seu teor ser maiselevado na célula. O N, P e S microbianos também

podem ser determinados por fumigação-extração nomesmo extrato de solo (Brookes et al., 1985; De-Polli eGuerra, 1999; Roy e Sing, 2003). De acordo com Turneret al. (2001), a técnica de absorvância ultravioleta (UV)em 280 nm de extratos de K

2SO

4 0,5 M de solos

fumigados e não-fumigados, para estimar a concentração

de C, N e P da biomassa microbiana, revelou-se rápidasimples, precisa e relativamente barata para estimar aBMS, visto que os resultados foram fortementecorrelacionados com aqueles determinados pelosmétodos convencionais.





6

Na metodologia convencional, o N da biomassa é

avaliado à maneira do C da biomassa, mas usando o

fator kEN

, que tem dois valores amplamente utilizados,

0,45 e 0,54 (Wardle, 1994), sendo 0,54 o do método

original. O conteúdo de N microbiano é quantificadoem extrato de K2SO

40,5 M (relação solo:extrator de

1:4, extração por 30 minutos e análise após digestão de

Kjeldahl) a partir do fluxo de N solúvel total de amostras

fumigadas e não-fumigadas, e o cálculo é dado pela

seguinte fórmula: Nmic

(mg kg-1) = FNt

/ k N

, sendo Nmic

-

nitrogênio microbiano do solo; FNt

- fluxo obtido da

diferença entre a quantidade de N total recuperado no

extrato da amostra fumigada e o recuperado na amostra

não fumigada; e k N

-

fator de correção (0,54), que

expressa a fração do N da biomassa microbiana do solo

recuperada após os processos de fumigação-extração

(Brookes et al., 1985; Joergensen e Mueller, 1996). Aoxidação de persulfato alcalino para determinação

automática do N total em extratos da biomassa

microbiana, através do autoanalisador Scalar-UV, é

também utilizada (Cabrera e Beare, 1993; Friedel e

Scheller, 2002).

Procedimentos similares de fumigação-extração,

acima mencionados, têm sido usados para determinação

do P e S da BMS. Para o P da biomassa, o método

prevê a extração do P inorgânico disponível com resina,

antes do processo de fumigação com clorofórmio e

extração com NaHCO3

0,5 M em pH=8,5; e, fator de

correção kp=0,4, para compensar a incompleta liberação

do P microbiano pela fumigação com clorofórmio e a

incompleta extração do P microbiano liberado pelo

extrator, que é somente de 40%; bem como requer o

ajuste na capacidade de adsorção de P pelo solo

(Stevenson e Elliott, 1989; Guerra et al., 1995; Morel et

al., 1996; Rheinheimer et al., 2000; Conte et al., 2002).

Uma proposição adaptada para medida do P da BMS,

para solos com alta capacidade de fixação de P, foi a da

membrana de troca de ânions (Kuono et al., 1995). E,

dois extratores têm sido utilizados para determinar o Sda biomassa, NaHCO

30,1 M e CaCl

20,01 M, com

valores de ksde 0,41 e 0,35, respectivamente (Saggar

et al., 1981; Stevenson e Elliott, 1989).

Limitações associadas aos métodos

Muito se discute ainda sobre a confiabilidade dos

atuais métodos, principalmente quando se deseja estimar

a biomassa dos microrganismos �in situ�, de maneira

mais próxima da realidade, ou seja, estimando-se seu

valor absoluto, em diferentes condições edafoecológicas.

Dessa forma, é mais conveniente, sempre que possível,

a utilização de mais de um método para estudos sobre a

biomassa microbiana (Gama-Rodrigues, 1999). Os

métodos extrativos não apresentam os problemasdaqueles que dependem do crescimento microbiano, mas

estão muitas vezes sujeitos à variabilidade da eficiência

de extração e rompimento das células (Frighetto e

Schneider, 2000). Entre pares de métodos, as

correlações através de diferentes amostras de solos, ou

tipos de solos, são altamente variáveis, sendo razoável

esperar que equações de calibração derivadas a partir

de ampla faixa de valores abrangendo maior área

geográfica sejam mais consistentes do que na faixa

estreita de pequena área geográfica (Wardle e Ghani,

1985). Smolander et al. (1994) e Fierer et al. (2003)

discutem em suas pesquisas as razões de estimativasdistintas da BMS com os métodos que utilizaram:

respiração induzida pelo substrato, fumigação-extração

e PLFAs totais.

Algumas críticas específicas sobre esses métodos

são apresentadas abaixo:

Microscopia direta. Este método pioneiro é raramente

utilizado em amostras naturais de solo porque apresenta

enorme dificuldade operacional e maior tempo de

execução dos procedimentos. Entretanto, é útil quando

se comparam diferentes metodologias para aferição dabiomassa (Martens, 1995; De-Polli e Guerra, 1999). A

dificuldade para discriminação entre microrganismos

vivos e mortos se torna uma limitação, visto que na

estimativa da biomassa microbiana do solo deve ser

considerada a massa viva de microrganismos, além de

ser difícil diferenciar partículas microscópicas do solo

de células microbianas (Casida, 1976; Pelczar Jr. et al.,

1996).

Método do trifosfato de adenosina (ATP). Apesar da

variação entre o conteúdo do ATP e o do C da BMS,

tem possibilitado resultados válidos quando sua execução

é cuidadosa. Algumas dificuldades estão a ele associadas

como a extração incompleta de ATP das células, a

decomposição enzimática, ou a hidrólise química do ATP

durante o processo de extração, bem como a adsorção

dessa molécula pelos colóides inorgânicos do solo

(Martens, 1995). Também, Brookes e Jenkinson (1989)

consideram que os valores de ATP podem não ser

indicadores fiéis do estado metabólico de um organismo

ou de uma população, visto que apenas uma parte da

população poderá estar em crescimento, e admitem como

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melhor indicador a carga energética de adenilato, dadapor [(ATP) + 0,5 (ADP)] / [(ATP) + (ADP) + (AMP)].Seu valor, a partir de dados de vários autores é na faixade 0,8 a 0,95 (Grisi, 1996).

Respiração induzida pelo substrato. É consideradoum método prático e rápido para estimar a quantidadede microrganismos vivos do solo. A principaldesvantagem deste método está relacionada com o fatorde conversão, que pode variar sensivelmente emdiferentes tipos de solo (Grisi, 1984). Por outro lado,quantifica preferencialmente o rápido crescimentomicrobiano, ou seja, a porção zimógena da comunidademicrobiana, visto que é aceito ser a BMS proporcionalà taxa de respiração de curto prazo, medida após a adiçãode um substrato lábil, como a glicose, ao solo (Fierer etal., 2003). Também, o seu emprego requer adisponibilidade de equipamento que possa determinaracuradamente o CO

2respirado (Wardle, 1994). Sobre

isto, Hashimoto (2002) descreveu um método simplespara medição de um volume pequeno do gás CO

2 usando

um analisador de gás infravermelho, tanto paralaboratório como para condições de campo.

Fumigação-incubação. Diferentes autores fazemreferência à marcante influência dos fatores ambientaisneste método. Ele não é recomendado para solos ácidoscom elevado teor de Al (Siqueira et al., 1994), ou soloscom recente adição de matéria orgânica, que provocauma subestimativa da biomassa microbiana do solo(Jenkinson, 1966; Sampaio et al., 1986; De-Polli e Guerra,1999), bem como aqueles da rizosfera de pastagempermanente e solos sob encharcamento ou seca (Tateet al., 1988). Em solos muito secos, a fumigação afetapouco os microrganismos (Frighetto, 2000), e em solosencharcados a água poderá proteger os microrganismos,que não são destruídos pelo clorofórmio (Siqueira et al.,1994). Neste sentido, Stevenson e Elliott (1989) afirmamque o mesmo é inadequado para análises de solos secosao ar. Por outro lado, quando uma grande proporção de

massa microbiana do solo foi morta pela seca, antes daamostragem, ocorrerá um fluxo de CO2

no período dezero a 10 dias (estabelecido no método), devido àdecomposição dos microrganismos mortos, sendoessencial uma testemunha não-fumigada (Wardle, 1994).Igualmente, em solos com alto teor de argila aliado àumidade foram encontradas dificuldades paradeterminação da biomassa microbiana com o uso dessatécnica, onde, provavelmente, as aludidas condições dossolos tenham interferido na homogeneidade dafumigação e na capacidade de reconstituição da

população microbiana (Pfenning et al., 1992; Messiaset al., 1999). O alto teor de argila protege a matériaorgânica da decomposição e torna os microrganismosmenos ativos pelo confinamento em pequenos poros

(Wang et al., 2003), o que pode interferir nareconstituição da população microbiana. Também foisugerido que as populações microbianas inoculadas nasamostras fumigadas não são capazes de metabolizarmatéria orgânica não-microbiana tão rapidamentequanto as nativas do solo não-fumigado, o que leva àsubestimação da biomassa microbiana (Siqueira et al.1994). Esse método, na sua forma padrão, não éadequado para solos alagados, porém Inubushi et al(1984) sugeriram algumas adaptações para solos sobestas condições.

Fumigação-extração. Neste método, pelo fato dafumigação ser seguida, de imediato, pela extração docarbono das amostras, são evitados os fatores químicose/ou biológicos que interferem na reconstituição dapopulação microbiana, responsável pelo aumento daliberação de CO

2das amostras fumigadas, como ocorre

na fumigação-incubação; os resultados são, portantoobtidos mais rapidamente e com menores variações entreas repetições, o que se reflete em coeficientes de

variação baixos (Pfenning et al., 1992). Os valores dofator de correção do carbono extraído (k

CE)

não foram

exatamente determinados para solos tropicais (Pfenning

et al., 1992; De-Polli e Guerra, 1999). Esse método éparticularmente útil em solos ácidos e orgânicos deflorestas e em solos secos reidratados, onde o métodode fumigação-incubação mostra limitações (Wardle,1994). O método encontra-se bem padronizado em seuprotocolo laboratorial por diferentes usuários (Frighetto2000; Gonçalves et al., 2002). Contudo, Haubensak etal. (2002) concluíram pela necessidade de mais estudosquanto ao tempo de exposição ao clorofórmio, emdiferentes condições de umidade, para soloscontrastantes de florestas, pois o tempo de exposiçãoafeta a extração de C e N de distintos compartimentos

da matéria orgânica do solo. Em relação à condição detransporte, armazenagem e pré-condicionamento daamostra anteriormente à fumigação, as regras não estãobem definidas (Gonçalves et al., 2002). Por exemplo, osefeitos da secagem ao ar sobre bactérias e fungosdependem dos materiais do solo (Scheu e Parkinson,1994). E o pré-condicionamento de curta duração deamostras, como terra fina secada ao ar (TFSA), teveresultados promissores somente quando níveis e períodosadequados de reumedecimento foram adotados(Gonçalves et al., 2002).





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CONSIDERAÇÕES FINAIS

Embora as possibilidades metodológicas existentes,

para avaliação da BMS, sejam várias e com diferentes

abordagens, ainda não são técnicas de fácil manipulação.Os métodos mais recentes, da fumigação-incubação e

fumigação-extração, têm sido preferidos por serem, de

certa forma, de uso mais fácil e de possibilitarem o

acesso às quantidades dos elementos contidos dentro

da BMS. No entanto, não deve ser esperado que esses

métodos apresentem a precisão e exatidão dos métodos

de análises químicas. As informações sobre calibração

desses métodos para solos tropicais ainda são

insuficientes, e em muitos trabalhos de pesquisa

continuam sendo utilizados fatores de correção dos

métodos originais, gerados em condições temperadas.Comumente são identificadas dificuldades técnicas dos

métodos mais utilizados para quantificação da BMS que

necessitam ser superadas. Portanto, ainda existem

lacunas que devem ser preenchidas no tocante à

melhoria das metodologias para determinação da BMS.

Existe uma expectativa de que, posteriormente, as

informações quantitativas fornecidas por esses métodos

sejam complementadas por aquelas de natureza

qualitativa referentes à diversidade e funcionamento da

BMS, com o aperfeiçoamento das técnicas de biologia

molecular aplicadas ao solo.

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